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CN1678744A - 人的抗人白细胞介素－6抗体以及所述抗体的片段 - Google Patents

人的抗人白细胞介素－6抗体以及所述抗体的片段 Download PDF

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CN1678744A CNA038203340A CN03820334A CN1678744A CN 1678744 A CN1678744 A CN 1678744A CN A038203340 A CNA038203340 A CN A038203340A CN 03820334 A CN03820334 A CN 03820334A CN 1678744 A CN1678744 A CN 1678744A
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Abstract

提供治疗涉及白细胞介素－6(IL－6)的免疫性疾病的活性物质。使用噬菌体抗体技术，可获得对人IL－6高度亲合的人的抗人IL－6抗体和人的抗人IL－6抗体的片段。可以预期所述抗体和抗体片段可作为治疗由IL－6引起的炎症和免疫性疾病的药物。

Description

人的抗人白细胞介素-6抗体以及所述抗体的片段
技术领域
本发明涉及结合人IL-6从而抑制1L-6与其受体之间的结合的人抗人白细胞介素-6(以下称作“IL-6”)抗体，所述抗体的片段，和编码它们的基因片段。可以预期根据本发明的抗体及其片段可作为治疗由IL-6引起的炎症和免疫性疾病的药物。
背景技术
IL-6是分子量为21,000的糖蛋白，其可由受到促分裂素、病毒感染或IL-1刺激的T细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、肌细胞等生成。人IL-6由184个氨基酸组成，其基因位于第7染色体。IL-6具有多种生物活性，包括(1)诱导细胞增殖(杂交瘤、T细胞、角质形成细胞、肾小球系膜细胞)，(2)抑制细胞增殖(骨髓性白血病细胞系、恶性黑素瘤细胞系)，和(3)诱导细胞分化和诱导细胞特殊蛋白质的生成(黑素细胞瘤细胞系的神经分化、杀伤T细胞的分化、巨核细胞的成熟、骨髓性白血病细胞分化成巨噬细胞、B细胞生成抗体、肝细胞中的急性期蛋白质生成)。由于其具有多种生物活性，已经表明IL-6与一些疾病有关。近年来，人们已知IL-6与疾病发作相关，包括(1)类风湿性关节炎、心房粘液肿、Castleman病、高γ-球蛋白血症或艾滋病中的自身免疫症，(2)肾小球系膜肾炎，(3)牛皮癣，和(4)艾滋病中Kaposi肉瘤。最近，还已知在运动后，在骨骼肌中立即产生大量的IL-6，其刺激下丘脑分泌多种神经激素，从而影响免疫系统(免疫学词典，第一版，第49页，1993年)。
在涉及IL-6的疾病中，类风湿性关节炎(RA)折磨着全日本约70万人，该数目还逐步地增加，连同老年患者数目的增加，正成为社会问题(Ogata A.等，Rinsho Byori(临床病理学)，1999年四月；47(4)：321-326[白细胞介素-6治疗的进展])。
RA的起因不为人所知。RA是一种在关节腔里持续发生自身免疫反应并且变成慢性的自身免疫性疾病，被定义为一种顽固性特殊病。对RA与IL-6的关联性的研究表明在RA患者的关节液中存在大量的IL-6，以及IL-6不仅涉及诱导炎症而且参与滑膜中的成纤维细胞的增殖。IL-6也有可能促进自身抗体的生成(Nishimoto N.等，白细胞介素-6受体抗体的临床应用，日本免疫学学会学报，1997，20：87-94)。
因此，抑制IL-6生物活性的抗-IL-6抗体将成为用于治疗一些包括RA的免疫性疾病的候选抗病药物，事实上其已在研究之中(Mihara M.等，Br.J.Rheumatol。1985年4月；34(4)；321-325；Mihara M.等， Clin.Immunol。2001年，98；319-326)。
发明内容
(本发明解决的技术问题)
已经对RA患者应用了各种治疗方法，根据患者的疾病阶段包括用非甾族抗炎药、镇痛剂、甾族剂、免疫抑制剂或代谢拮抗剂的药物疗法，和外科疗法例如人造关节。然而，这些疗法不能根除RA，而且由于所述应用的疗法时间长、药物剂量大而存在不利的副作用的问题。IL-6在炎症加重中发挥作用，因此是RA患者所遭受的疼痛的主要原因。因此表明抑制IL-6的活性将缓解疼痛。作为候选物，已经对人源化的抗-IL-6抗体进行研究(Montero-Julian F.A.等，Blood，1995年2月15日；85(4)：917-924；Monier S.等， Clin.Exp.Rheumatcl.，1994年11月-12月；12(6)；595-602；Wendling D.等， J.Rheumatcl，1993年2月；20(2)：259-262)。
另一方面，IL-6对骨髓瘤细胞有生长因子的活性(免疫学词典，第一版，第49页，1993年；同前)，由此带来的问题是：即使获得了可生成高亲和力地结合IL-6的抗体的杂交瘤，由于所生成的抗体与培养基中IL-6的中和作用阻碍了杂交瘤的增殖，结果很难获得具有高亲合力的抗-IL-6抗体。Sato等报道了从小鼠中获得的抗人IL-6抗体显示出11nM的高亲合力，但也具有3×10-2秒的高离解率。(Sato K等 Hum.Antibodies Hybridomas。1996；7(4)；175-183)。由于通过现有技术获得所述抗体具有高离解率，需要保持高浓度的抗体来抑制IL-6活性。更不用说具有此活性的完全的人类抗体了。
此外，不同于完全人的抗体，不能否定的可能性是：将心源化抗体施用于患者将导致患者体内生成抑制抗-IL-6抗体活性的抗体(封闭性抗体)。
(解决问题的方法)
在此情况下，发明者设计了应用噬菌体抗体技术的筛选系统，从而获得完全人的抗人-IL-6抗体的单链Fv(scFV)分子并阐明了所述抗体的VH和VL链。发明者进一步分析了所述scFv的性质，发现与那些从多种动物中获得的抗人IL-6的常规抗体相比，所述scFv显示极低的缔合速率(约为10-3秒；离解率低于常规抗体的离解率约40倍)，与同常规抗体相比具有相等的或更高的对IL-6的亲和力，以及以浓度依赖性方式抑制IL-6依赖细胞系的增殖。
(比现有技术更有效的作用)
可以预计通过利用完全来源于人的和对IL-6有高亲和力的所述的抗体，以低于嵌合抗体或人源化抗体的抗体浓度来发挥疗效，仅仅生成极低水平的抗所述抗体的抗独特型抗体，因此提供作为抗-IL-6拮抗剂的、疗效显著的抗-人IL-6抗体药物，来治疗例如IL-6依赖性白血病和类风湿性关节炎的自身免疫性疾病。也可预期将根据本发明的抗体用作副作用降低和具有有效活性的治疗急性炎症的药物。
附图简述
图1显示测量来自IL-6gk系列的IL6gk3-2scFv和重组IL-6、人血清蛋白(HSA)、AB血型血清、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和MIP-1α(巨嗜细胞炎性蛋白-1α)反应的ELISA结果图。
图2显示测量IL6gk3-2scFv与IL-6的结合亲和性的BIA CORE的结果图。
图3显示IL6gk3-2 scFv抑制IL-6依赖性细胞株KT-3的IL-6依赖性增殖应答的结果图。
实施发明的最佳方式
从20位健康供体中取样的外周B淋巴细胞中，通过RT-PCR扩增每条免疫球蛋白重链(H和轻链(L)的cDNA，并用接头DNA连接来制备单链Fv(scFv)DNA，其中随机结合来自健康供体的淋巴细胞的VH链和VL链的DNA。
将scFv DNA插入噬菌粒载体pCANTAB5E来制备scFV噬菌体展示文库，其由来自健康供体的109个克隆组成。然后将该文库与固定在固相的人IL-6连接，并回收、浓缩和筛选抗-人IL-6 Fv展示噬菌体克隆。结果，所筛选的scFv克隆(IL6gk3-2)生成可结合人IL-6的scFv抗体。
尽管是单链，通过IL6gk3-2克隆而生成的scFv抗体，以与常规的完全抗体相等的亲和力特异性结合配体(IL-6)。
当被添加到以人IL-6依赖性方式增殖的KT-3细胞系时，由IL6gk3-2克隆生成的scFv抗体，以浓度依赖性方式抑制所述细胞系的IL-6依赖性增殖应答。
SEQ ID NO：1和2(VH链)和SEQ ID NO：3和4(VL链)分别表示具有抑制活性的上述scFv克隆的VH和VL链的氨基酸序列及其编码核酸序列。
此外，包含于上述氨基酸序列的VH和VL链的互补决定区(CDR1至CDR3)的氨基酸序列如下：
[VH链]
CDR1：Lys Tyr Tyr Met Ala(SEQ ID NO：5)
CDR2：Thr Ile Ser Asn Ser Gly Asp Ile Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Arg Gly(SEQ ID NO：6)
CDR3：Glu Tyr Phe Phe Ser Phe Asp Val(SEQ ID NO：7)
[VL链]
CDR1：Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Trp Val Ala(SEQ ID NO：8)
CDR2：Asp Gly Ser Ser Leu Gln Ser(SEQ ID NO：9)
CDR3：Gln Gln Ser Asp Ser Thr Pro Ile Thr Phe(SEQ ID NO：10)
具有上述的VH链或VL链的可变区，或具有上述VH链和VL链的可变区的抗体片段，具有人的抗-人IL-6抗体的可变区，强烈作用于人IL-6，从而对在IL-6和IL-6之间的结合发挥抑制活性。
尽管描述的人的抗-人IL-6抗体的VH链和/或VL链是通过噬菌体抗体技术以scFv的形式而获得，本发明也包括所述的VH链和/或VL链结合于人免疫球蛋白的恒定区的完整分子的形式人的抗-人IL-6抗体；所述的VH链和/或VL链与人免疫球蛋白的部分恒定区结合的人的抗-人IL-6抗体片段，例如Fab、Fab’或F(ab’)2；以及其中的scFv与人免疫球蛋白的恒定区结合的其他的人的抗-人IL-6抗体片段，例如人抗-人IL-6单链抗体(scAb)；以及编码这些抗体和抗体片段的基因片段。本发明进一步包括修饰过的蛋白质分子，其中将高分子量改性剂结合到这些抗体和抗体片段蛋白质分子上。
工业实用性
如上所述，根据本发明的人的抗人IL-6抗体和所述抗体的片段分子可抑制多种由IL-6和IL-6受体的结合诱导的免疫应答，因此可用作抗炎、镇痛剂或治疗和预防自身免疫性疾病的药物。
此外，根据本发明的人的抗人IL-6抗体和所述抗体的片段分子，鉴于它们的性质，可以提供免疫学测量法来检测或测量人外周血或肌肉中的IL-6表达细胞。
此外，根据本发明的人的抗人IL-6抗体和所述抗体的片段分子，当其与由免疫惰性吸附物质组成的免疫吸附剂复合时，可进一步提供许多其他应用。例如，可通过免疫亲合层析法来纯化存在于人外周血的IL-6。所述的免疫吸附剂复合物也可用于纯化通过培养遗传重组转化的细胞而生成的培养上清液中的IL-6。
此外，本发明的人的抗人IL-6抗体的可变区的肽和所述肽的衍生物，可提供从文库中分离识别本发明的人的抗人IL-6抗体的肽或抗独特型的新方法。可以预期所获得肽和抗独特型及其衍生物，能有效治疗由IL-6的中和作用或自身免疫性疾病引起的急性炎症(Vreugdenhil G.等，Rheumatol.Int.1990；10(3)：127-130；Hirano T.等， Ric.Clin.Lab.1989年1-3月；19(1)：1-10)。
通过以下实施例对本发明作更详细地描述，但本发明不应被解释为限制于所述实施例。
实施例1：构建来自健康供体的噬菌体文库
根据J.D.Marks等( J.Mol.Biol.，222；581-591，1991)的报道作一些修改，来构建噬菌体文库。
通过菲可沉淀离心法，从取自20位健康供体的外周血中分离淋巴细胞，用PBS彻底洗涤，然后用ISOGEN(NIPPO GENE CO.，LTD)处理来制备总RNA。所获得的总RNA分为四份，使用第一链cDNA合成试剂盒(Pharmaciabiotech)，以人的IgM、IgM、к链或λ链中任一项的恒定区的特异性引物，来从每份样品中制备cDNA。将获得的每份cDNA作为模板，如Marks等所描述，使用VH(γ或μ)和JH、VK和JK、或Vλ和Jλ中任一组合的特异性引物，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增各个抗体V区基因。
然后，用接头DNA通过装配PCR将VH(γ或μ)和VK、VH(γ或μ)和Vλ相互连接(McCafferty，J.等。Antibody.Engineering.A practical ApproachIRL出版社，牛津大学，1996)，来制备单链scFv DNA。所获得的scFv DNA通过PCR来引入Not I和Sfi I酶切位点，经琼脂糖电泳，然后纯化。用限制性酶Not I(Takara)和Sfi I(Takara)酶切所纯化的scFv DNA，然后克隆至噬菌粒pCANTAB5E(Pharmacia)。对于VH(γ)-VK、VH(γ)-Vλ、VH(μ)-VK和VH(μ)-Vλ中的每一个，通过电穿孔，将获得的、结合了scFv DNA的噬菌粒pCANTAB5E导入大肠杆菌TG1细胞。对于被转化的TG1细胞的数量，可评定出VH(γ)-VK、VH(γ)-Vλ、VH(μ)-VK和VH(μ)-Vλ分别显示1.1×108、2.1×108、8.4×107和5.3×107克隆的多样性。通过M13KO7辅助噬菌体，在被转化的TG1细胞表达噬菌体抗体，从而制备源自健康供体的scFv展示噬菌体文库。
实施例2：淘选
以1mL 0.1M NaHCO3溶解人IL-6，将溶液置于35mm培养皿(Iwaki)中，4℃过夜温育来固定IL-6。往培养皿中加入用于封闭的0.5％明胶/PBS，置于20℃中2小时，然后用0.1％Tween20-PBS将培养皿洗涤六次。然后，往培养皿中加入0.9mL的单链抗体展示噬菌体溶液(源自健康供体的、1×1012tu/mL的抗体噬菌体文库)进行反应。
以0.1％Tween20-PBS洗涤培养皿十次后，加入1.0mL甘氨酸缓冲液(pH2.2)来洗脱结合到IL-6上的单链抗体展示噬菌体。通过加入1M pH9.1的Tris(羟甲基)-氨基甲烷-HCl来调整pH，然后将洗脱的噬菌体侵染处于对数生长期的大肠杆菌TG1细胞。将被侵染的TG1细胞以3,000×g离心10分钟。除去上清液，用200uL 2×YT培养基悬浮，在SOBAG平板(SOB平板含有2％葡萄糖、100ug/mL氨苄青霉素)上铺板，然后在恒温箱中30℃过夜温育。悬浮所得到的克隆，并用刮刀(Coastor)回收于适宜量的2×YT培养基。
将获得的TG1溶液(50μL)接种于30mL的2×YT培养基上，筛选之后用辅助噬菌体进行 恢复(rescue)来制备噬菌体文库。
对于每个源自健康供体的VH(γ)-VK、VH(γ)-Vλ、VH(μ)-VK和VH(μ)-Vλ的噬菌体文库，用固定有IL-6的平板实施总数四次淘选。第四次淘选后，从SOBAG平板任意提取任何克隆。确定scFv的表达，通过IL-6的ELISA确定特异性及分析核酸序列。
实施例3：IL-6的ELISA筛选
为筛选分离的克隆，按以下实施ELISA：将人IL-6和对照蛋白质固定在ELISA筛选平板上。将每个40uL/孔的人重组IL-6(1.25ug/mL)、人血清蛋白(HAS；2.5ug/mL)、人单核细胞趋化蛋白1(MCP-1；1.25ug/mL)、人MIP-1α(巨噬细胞炎症蛋白1-α；1.25ug/mL)或人AB血型血清(1.25ug/mL)置入于ELISA平板(Nunc)中，平板在4℃静置16小时来固定。将含有0.5％的BSA、0.5％的明胶和5％的脱脂乳的PBS溶液，以400ul/孔加到固定化平板中，并于4℃保持2小时来封闭。
将含有用于反应的scFv展示噬菌体的样品溶液以40ul/孔加到平板中。弃去样品溶液，并用洗液洗涤平板五次。将平板和生物素标记的抗-M13单克隆抗体(Pharmacia biotech)反应，然后和碱性磷酸酶(AP)标记的抗-鼠IgG抗体反应。用洗液洗涤五次后，将底物显影液，即含有1g/mL的p-硝基苯磷酸盐(Wako)和10％的二乙醇胺(Wako)的PBS溶液，以50ul/孔加到平板中，屏蔽光，并于室温至37℃下显影5至10分钟。使用多盘自动读数计(Multiplate Autoreader)NJ-2001(Inter Med)测量405nm下的吸光度。结果，确定所有被评定的克隆都是IL-6特异性的(图1)。
实施例4：克隆的序列分析
通过染料终止循环测序FS简便反应试剂盒(Ready Reaction kit)(AppliedBiosystems)，测定分离的克隆中的scFv基因VH和VL的DNA核酸序列。作为ELISA和序列分析的结果，将分离的克隆分为四类。这些之中，克隆IL6gk3-2具有分别如SEQ ID NOs：1和3所示的VH和VL的核酸序列。
实施例5：scFv的表达和回收
以大肠杆菌HB2151表达、从大肠杆菌细胞质组分回收并粗纯化可溶性scFv。如果需要进一步纯化，用RAPAS纯化模块(Purification Module)(PharmaciaBiotech)进行亲合纯化。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和以在scFv蛋白的C-末端的Etag抗原决定簇带为靶的Western杂交来确定纯化的scFv蛋白的纯度。使用蛋白质分析试剂盒(Protein Assay kit)(BIO-RAD)，来确定纯化的scFv蛋白产物的蛋白质浓度。
实施例6：通过SPR测量纯化的scFv的亲和力
使用BIAcore(BIAcore)，通过SPR测量纯化的scFv的亲和力。结果测定出，作为在分离的克隆中有最高亲和力的克隆IL6gk3-2，具有13×10-9M的解离常数(图2)。
实施例7：对IL-6依赖性细胞系的增殖应答的影响
对于纯化的scFv，评定其对细胞系KT-3的IL-6依赖性增殖应答的抑制活性，细胞系KT-3以IL-6依赖性方式进行增殖。在1.25至20ug/ml、来自克隆IL6gk3-2的纯化scFv和IL-6(80pg/ml)的存在下，将以2×104细胞/200ul/孔制备的KT-3细胞培养四天，以通过胸腺嘧啶摄入来评估其DNA合成。结果显示来自克隆IL6gk3-2的scFv，以浓度依赖性方式抑制KT-3细胞的增殖应答(图3)。
                            序列表
<110>Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
<120>人的抗人白细胞介素-6抗体以及所述抗体的片段
<130>663984
<150>JP 2002-253036
<151>2002-08-30
<160>10
<210>1
<211>251
<212>DNA
<213>人源
<400>1
cag gtc aac tta agg gag tct ggg gga gac ttg gtc aag ccc gga ggg   48
Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
                5                   10                  15
tcc cta aga ctc tca tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc aga aag tat    96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Tyr
            20                  25                  30
tac atg gcc tgg atc cgc cag gct cca ggg aag ggg ccg gag tgg ctt    144
Tyr Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Leu
        35                  40                  45
tca acc att agt aac agc ggt gat ate ata gac tat gca gac tct gtg    192
Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Asp Ile Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
agg ggc cgg ttc tcc atc tcc agg gac aat gcc cag aag tca ctg tat    240
Arg Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Lys Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
ctg caa atg acc tcc ctg aga ccc gac gac tcg gcc atc tat tac tgt    288
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Pro Asp Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
gcg agg gaa tat ttc ttt tct ttt gat gtg tgg ggc cga ggg aca atg    336
Ala Arg Glu Tyr Phe Phe Ser Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Met
            100                 105                 110
gtc acc gtc tcc tea                                                351
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>2
<211>117
<212>PRT
<213>人源
<400>2
Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
                5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Lys Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met Ala Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Leu
        35                  40                  45
Ser Thr Ile Ser Asn Ser Gly Asp Ile Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Arg Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Ash Ala Gln Lys Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Met Thr Ser Leu Arg Pro Asp Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Tyr Phe Phe Ser Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Met
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<10>3
<211>324
<212>DNA
<213>人源
<400>3
gac atc gtg atg acc cag tct cca tct tct gtg tct gea teg gtg gga    48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
                5                   10                  15
gac aga gtc acc atc ttt tgt cgg gcg agt cag gat att agg aat tgg    96
Asp Arg Val Thr Ile Phe Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Trp
            20                  25                  30
gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggt gag gcc cct aaa tta ttg atc  144
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
tat gat gga tcg agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc  192
Tyr Asp Gly Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                   60
agt gga tct ggg aca gaa ttc act ctc aca atc agc agc ctg cag cct  240
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt gac agt acc cct att  288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Thr Pro Ile
                85                  90                  95
acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa cgt                  324
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>4
<211>108
<212>PRT
<213>人源
<400>4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
                5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Phe Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Trp
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Gly Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Thr Pro Ile
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
            100                  105
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人源
<220>
<223>CDR1相应于SEQ ID NO：2中的31-35位氨基酸
<400>5
Lys Tyr Tyr Met Ala
1               5
<210>6
<211>17
<212>PRT
<213>人源
<220>
<223>CDR2相应于SEQ ID NO：2中的50-66位氨基酸
<400>6
Thr Ile Ser Asn Ser Gly Asp Ile Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Arg Gly
1               5                   10                  15
<210>7
<211>8
<212>PRT
<213>人源
<220>
<223>CDR3相应于SEQ ID NO：2中的99-106位氨基酸
<400>7
Glu Tyr Phe Phe Ser Phe Asp Val
1               5
<210>8
<211>11
<212>PRT
<213>人源
<220>
<223>CDR1相应于SEQ ID NO：4中的24-34位氨基酸
<400>8
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Trp Val Ala
1               5                   10
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>人源
<220>
<223>CDR2相应于SEQ ID NO：4中的50-56位氨基酸
<400>9
Asp Gly Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>10
<211>10
<212>PRT
<213>人源
<220>
<223>CDR3相应于SEQ ID NO：4中的89-98位氨基酸
<400>10
Gln Glu Ser Asp Ser Thr Pro Ile Thr Phe
1               5                   10

Claims (19)

1.结合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗-人白细胞介素-6(以下称作“IL-6”)抗体，或所述抗体的片段。
2.权利要求1的人的抗-人IL-6抗体或所述抗体的片段，其具有1.0×10-8或更低的解离常数。
3.编码结合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗-人IL-6抗体VH链的基因片段。
4.权利要求3的基因片段，其中所述VH链的互补决定区(CDR1至CDR3)具有以下氨基酸序列：
CDR1：Lys Tyr Tyr Met Ala(SEQ ID NO：5)
CDR2：Thr Ile Ser Asn Ser Gly Asp Ile Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Arg Gly(SEQ ID NO：6)
CDR3：Glu Tyr Phe Phe Ser Phe Asp Val(SEQ ID NO：7)
5.权利要求3或4的基因片段，其中所述VH链具有SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。
6.权利要求4或5的基因片段，其中在所述VH链的氨基酸序列上，缺失、取代或添加一个或几个氨基酸。
7.编码结合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗人IL-6抗体VL链的基因片段。
8.权利要求7的基因片段，其中所述VL链的互补决定区(CDR1至CDR3)具有以下氨基酸序列：
CDR1：Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Trp Val Ala(SEQ ID NO：8)
CDR2：Asp Gly Ser Ser Leu Gln Ser(SEQ ID NO：9)
CDR3：Gln Gln Ser Asp Ser Thr Pro Ile Thr Phe(SEQ ID NO：10)
9.权利要求7或8的基因片段，其中所述VL链具有SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列。
10.权利要求8或9的基因片段，其中在所述VL链的氨基酸序列上，缺失、取代或添加一个或几个氨基酸。
11.编码结合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗人IL-6抗体单链Fv(以下称作“scFv”)的基因片段，所述的基因片段由与编码权利要求7至10任一项的VL链的基因片段结合的编码权利要求3至6任一项的VH链的基因片段组成。
12.编码结合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗人IL-6抗体的基因片段，所述的基因片段由与人抗体CH链基因结合的编码权利要求3至6任一项的VH链的基因片段，及与人抗体CL链基因结合的编码权利要求7至10任一项的VL链的基因片段组成。
13.编码结合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗人IL-6抗体的基因片段，所述的基因片段由与部分人抗体CH链基因结合的编码权利要求3至6任一项的VH链的基因片段，及与部分人抗体CL链基因结合的编码权利要求7至10任一项的VL链的基因片段组成。
14.权利要求13的基因片段，其中所述抗体片段选自Fab、Fab’或F(ab’)2。
15.编码结合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗人IL-6抗体的基因片段，所述的基因片段由与部分人抗体CH链基因或部分人抗体CL链基因结合的编码权利要求11的scFv的基因片段组成。
16.结合人IL-6并抑制其生物活性的人的抗人IL-6抗体或所述抗体的片段，其通过遗传重组技术由表达载体表达，所述表达载体中插入了权利要求3至15任一项的基因片段。
17.权利要求16的人的抗人IL-6抗体或所述抗体的片段，其具有1.0×10-8M或更低的解离常数。
18.用于抑制IL-6和IL-6受体之间的结合的试剂，所述试剂包括作为活性成分的权利要求1至17任一项的人的抗人IL-6抗体或所述抗体的片段。
19.用于预防或治疗由人IL-6与人IL-6受体之间的结合引起的炎症或免疫性疾病的药物，所述药物利用权利要求18的抑制结合的试剂。
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