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CN1675551A - 用于确定微生物的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及确定至少一种微生物和/或微生物种类的方法和装置，并从样本测量至少一种微生物和/或微生物种类所占部分。本方法包括使用两种不同的荧光剂并以两种不同波长的光激发。使样本流动。此外，本发明涉及使用前述方法和装置，确定微生物和测量它们所占部分。

Description

用于确定微生物的方法和装置
技术领域
本发明涉及确定一种或多种微生物和/或微生物种类的方法和装置，和从样本测量至少一种微生物和/或微生物种类所占部分的方法，以及前述方法与装置的使用。
背景技术
在混合的微生物样本中，微生物种类特异性的确定和计算，用目前使用的方法是缓慢而烦琐的。混合微生物样本，在本文中，是指包含若干微生物和微生物种类的样本。混合微生物样本的典型例子，包括粪便和污水。例如，已经发现，人类粪便包含300到400种不同细菌种类，在该样本中的细菌密度，为每克样本1011个细菌细胞的量级(人类粪便菌丛：20个日本-夏威夷人的正常菌丛；W.E.C.Moore和L.V.Holdeman，Applied Microbiology，1974，Vol.27，p.961-979)。目前，在混合细菌样本中，用于确定和计算细菌种类最合适的方法，是利用荧光显微镜的显微镜FISH(扩大的基于16S rRNA的探针组，用于人类粪便细菌的检测；H.J.M.Harmsen等人，Applied andEnvironmental Microbiology，2002，Vol.68，p.2982-2990)。缩写FISH源自fluorescence In Situ Hybridization(荧光原位杂化)。FISH一般用于分子生物技术，它把顺序特异探针粘附在要确定的细胞上，也就是与要确定的细胞杂化为细胞的核酸顺序。探针是有规定基本次序的短核酸顺序，作为粘附于细胞自身互补碱基上的引进细胞的粘附物。探针的特异性，是基于探针的基本顺序与互补的基本顺序的相容性。作为细菌FISH技术中使用的探针目标顺序，是起细菌核蛋白体16SrRNA或23S rRNA结构单元的核酸的作用。在杂化中，仅在形成探针16S rRNA或23S rRNA顺序的碱基，与目标细胞的相容时，探针才与目标细胞顺序结合。对16S rRNA和23S rRNA分子编码的基因面积，作为已经发展的进化中，几乎保持不变。讨论中的基因和核蛋白体的结构，对那些进化历史接近的细菌种类，它们的顺序是相同的。由于这一点，能够制备与16S rRNA和23S rRNA结合的探针，以便使它们仅与彼此有关的某些细菌群的16S rRNA和23S rRNA核酸顺序结合(种系发生的确定和个别微生物细胞的不加培养的原位检测；R.I.Amarnn等人，Microbiological Reviews，1995，Vol.59，p.143-169)。因此，例如能够对双歧杆菌属建立探针特异性。在16S rRNA的杂化中，在一个细菌细胞内，有成千成万的16S rRNA分子碎片适合探针的顺序，所以当有足够的探针数时，有成百成千的探针与一个细菌细胞结合。
在FISH技术中，杂化细菌的确定根据的事实是，粘附在探针上的是荧光分子，就是说，是荧光染料。当荧光染料在它们的吸收光谱特征波长上吸收能量时，被激发。激发态的建立，要求荧光分子的电子吸收，即接收能量量子并移到外电子层上。随着激发态的解除，电子发射，即产生能量量子并瓦解，回到它的基态。在每一种荧光染料的吸收光谱中，存在吸收极大，即荧光染料吸收最多的波长。随着激发态的解除，荧光染料发射波长比激发波长更长的光子，即发出荧光。发射光的波长同样形成分布，即发射谱。发射谱的极大就是荧光染料发射最多的波长。吸收和发射极大之差，称为Stokes偏移。FISH方法中使用使用的典型荧光染料是荧光素，它的吸收极大是494nm，发射极大是520nm，因而它的Stokes偏移是26nm(Handbook ofFluorescent Probes and Research Products，Molecular Probes)。为了历史的理由，荧光素是使用最多的荧光染料，且一般是用作参考荧光染料。使用它的缺点包括：相对快的强度下降(光漂白)，以致难于在显微镜FISH方法中计算细菌。此外，荧光素发光强度的pH灵敏度，使它难以用于许多应用。因此，试剂的产量缓慢下降。荧光素还有宽的发射谱，使它难以在利用多种荧光素的应用中使用。通常在显微镜FISH方法中，样本被有宽波长光谱的光源照明，在这种情形中，与探针结合的标记，在相对于它们发射谱的波长中被激发和发射光。当在显微镜FISH方法中，通过适当的波长滤波器，用荧光显微镜装置仔细观察样本时，单独的杂化细菌作为发射粒子是可见的，就是说，作为黑的显微镜视场中的有色光点是可见的。
一般与FISH技术结合的是DNA染色法，用于计算所有细菌，即样本中细菌总数。自然混合的细菌样本，除包含细菌外，还常常包含非细菌起源的物质。这些物质的例子包括粪便纤维和污水等非有机物质。使用的DNA颜料，一般是嵌入DNA双螺旋体的荧光染料，该荧光染料的强度，作为结合的结果而变强若干次。DNA颜料的例子，包括丙炔碘化物(propidium iodide)和本胆碘化物(etidium iodide)。DNA颜料还与杂化细菌结合。为了能够从所有DNA染色细菌中，作为不同颜色而区分与探针杂化的细菌，DNA颜料的光谱必须与粘附在探针上的荧光染料不同。常常还要求DNA颜料的吸收光谱，不同于探针颜料的吸收光谱。通过结合FISH使用DNA染色法，有可能把杂化并染色DNA的目标细菌，与其余的只有染色DNA的样本细菌区分，和与不包含DNA的无染色DNA的粒子区分。
在显微镜FISH方法中，用荧光显微镜仔细观察杂化混合的细菌样本。在此方法中，粘附在显微镜载玻片上的样本，用有宽波长光谱的光源照明，在这种情形中，样本中的荧光染料吸收能量，并按照它们发射光谱的波长分布发射光。对样本的仔细观察，是通过对样本反射光中的不同波长，经过滤波得到的光分量进行的。为了计算杂化细菌总数，使用只让探针荧光染料发射的光通过的滤波器。为了计算细菌总数，使用只让DNA颜料发射的光通过的滤波器。通过获得的样本中目标细菌总数和总细菌数，可以计算目标细菌所占部分。
显微镜FISH方法的缺点，包括缓慢和对非特异性杂化结果的解释的性质。在非特异性的杂化中，杂化探针粘附在那些与真正目标细菌不同的核酸上，甚至还粘附在细菌的表面结构上。非特异地与细菌杂化的探针数，通常少于真正杂化目标细菌中的探针数，甚至有少量探针使细菌看来比它的背景还亮。这一现象导致显微镜FISH中解释的困难。非常熟识该方法的人，能够每小时计算高达数千细菌细胞。能够以合理的时间，从混合细菌样本中包含的巨大数量细菌，计算非常小的部分，以便保持少的样本数(种系发生的确定和个别微生物细胞的不加培养的原位检测；R.I.Amarnn等人，MicrobiologicalReviews，1995，Vol.59，p.143-169)。由于这些理由，显微镜FISH方法获得的结果的可重复性，常常是不能令人满意的。
由于伴随显微镜FISH的缺点，已经有人尝试发展更快速和可靠的方法来取代它。作为另一种方案，已经提出一种方法，它把视频的或数字的摄像机，附于显微镜的目镜上。摄像机拍摄的像，用计算机图像处理程序分析，该程序能确定比调节的亮度极限更亮的每一像粒子，并把这些粒子分类为要检查的细菌(在原位杂化图像的荧光中自动信号分选；B.Lerner等人，Cytometer，2001，Vol.43，p.87-93)。使用该方法，分析速度略有改进，但样本分析无论如何仍然是慢。如同手工显微镜FISH一样，自动显微镜FISH的问题，在于要确定的照度极限的规定，和对非特异性杂化细菌与杂化目标细菌的区分。自动显微镜FISH没有被广泛使用。
流式细胞计量术是一种用了数十年的方法，它能快速分析并计算液体中的粒子。许多粒子可以悬浮在液体中。借助流式细胞计，能够同时从样本粒子中测量若干个参数。流式细胞计应用于各种临床和工业上，特别是在生物医学领域。流式细胞计是目前最重要的液体真核细胞样本的定量确定和计算方法。尤其是，人类血液中白细胞照例用自动流式细胞计仔细观察。与之相反，原核细胞，即细菌的流式细胞计分析方法，没有被广泛使用。流式细胞计设备的技术水平，和流式细胞计的知识水平，成为以流式细胞计为基础的细菌学分析和计算方法普遍化的障碍，目前的水平不能实现比白细胞小得多的原核细胞的可靠分析。然而，在最近的十年中，随着流式细胞计设备的进展，已经公开了以流式细胞计为基础的用于分析细菌的方法(异形微生物群体的流式细胞计及细胞分选：单细胞分析的重要性；H.M.Davey和D.B.Kell，Microbiological Reviews，1996，Vol.60，p.641-696)。现在已知该方法不适合例行的使用，且它们不能用于计算混合微生物样本中的微生物浓度。分析的样本也不是与粪便同类的、涉及整个种类未知的混合微生物样本范围。给出的方法不是根据同时使用流式细胞计和荧光杂化探针(如公开的US 2002/076,743，US 6,165,740，DE19608320，DE 19945553，EP 337 189)。在科学论文中，人们把注意力主要集中在包含一种细菌种的纯培养样本的分析，检查细菌与血液中白细胞的相互作用、代谢过程、和细菌的生长，还有从死去的细菌中分离活的细菌(用多色荧光流式细胞计分析细菌的功能和单细胞分选；G.Nebe-von-Caron等人，Journal of Microbial methods，2000，Vol.42，p.97-114)。人们曾经尝试借助流式细胞计，使用粘附在细菌上的抗体，检查混合细菌样本(细菌的多参数流式细胞计：用于诊断和治疗；H.M.Shapiro，Cytometry，2001，vol.43，pp.223-226，和应用荧光抗体和流式细胞计，对植物病原体细菌Xanthomas campestris pv.，Brassica sp.种子浸出物campestris的检测；L.G.Chitarra等人，Cytometry，2002，vol.47，p.118-126，和D.Vail的专利US6225046，和L.Terstappen的专利EP0347039。但是，基于使用抗体的方法不是一种混合细菌样本的可靠的种特异性检查方法，因为抗体不是细菌的种特异性。抗体粘附在细菌表面结构上，它们不是种的或基因的特异性，且它们能与各种细菌种结合。相同的表面结构可以在非常不同的细菌上发现，相反，相同菌株的细菌可以有非常不同的表面分子(什么决定细菌细胞壁的关节性(arthritogenicity)；X.Zhang，博士论文，2001 University of Turku)。
流式细胞计的主要部件包括：加压的样本供给系统、激光和信号识别设备。使用流式细胞计获得的待检查的粒子数据，通过与流式细胞计连接的计算机分析。流式细胞计的加压样本供给系统，把待检查的样本泵浦进样本供给针。样本从针头上的孔流进包含壳层流体的流体室。作为壳层流体的是类似于样本溶液的液体，利用其在光学方面的性质。包围从样本供给针来的样本溶液，形成薄的流体的壳层流体，强迫样本溶液中流动的粒子彼此分离，形成均匀的线。该事件称为流体动力学聚焦。粒子线已经与流式细胞计中包含的激光对准，使激光束与粒子以直角相遇。除了样本供给设备和激光器外，流式细胞计还有第三个重要硬件部件，是信号识别设备。要检查的样本中的粒子，引起激光束的散射。以小角度沿激光运动方向的激光束散射，被对着激光入射方向的光电检测器识别。散射角的大小，作为前向散射参数被测量(FSC)。以更大角度相对于激光运动方向的激光束散射，作为侧向散射参数(SSC)被光电倍增管测量。在这种大粒子碰撞激光束而散射的激光束比小粒子更多方式中，FSC粗略与待识别的粒子大小相关。SSC参数与粒子的形状和粒度相关。除了SSC及FSC检测器外，信号识别设备还包括识别样本荧光的光电倍增管。激光的高能光子激发荧光剂，例如待检查粒子中的荧光染料。随着荧光染料激发态的解除，它们按照它们的发射光谱发光。荧光被识别适当波长的光电倍增管测量。荧光检测器一般与SSC检测器同一方向相对于激光器放置。发射的光在相对于激光和液体流动方向上，被识别适当波长的光电倍增管记录。在最普通的流式细胞计中，荧光由4个光电倍增管识别，它们相应地缩写成FL1、FL2、FL3、和FL4。放在FL检测器照明序列上的波长滤波器，各用于单独识别一规定的波长区。为了从设备背景噪声中和样本溶液杂质中，区分要检查的粒子，可以对一个或多个散射的或荧光通道，规定阈值。一旦粒子在讨论的通道上产生超过阈值的信号，流式细胞计的电子线路对讨论的粒子参数进行测量。一旦粒子在阈值通道上传送的信号，小于阈值，粒子的参数维持不测量。阈值应当设定为，没有要检查的粒子时，维持不测量，就是说，要分析的样本是有代表性的且不失真。从流式细胞计不同检测器收集的测量信号，被引进信号处理设备，获得的数据借助计算机软件程序分析。要检查样本中包含的粒子，最一般的是用两维的点图表示，图上两根轴中，一根是要识别的参数：FSC、SSC之一，或荧光通道之一。被识别的粒子在图中以点表示，在这种情形中，相同类型的粒子形成点群，即群体。当使用点图时，每次能够分析只有两个变数的样本。如果希望根据多于两个变数对群体完成分类，则分析必须在比只用一个点图更多的点图上进行。
在根据显微镜与流式细胞计的FISH应用之间值得考虑的差别，是用于激发样本中荧光剂如荧光染料的光源的差别。在显微镜FISH中，样本是用宽光谱光照明，能同时激发有各种受激波长的荧光染料。通过改变波长滤波器，能够每一次从相同样本中计算包含需要的荧光染料的微生物群体。在流式细胞计中，荧光染料的激发，常常用包含一种波长的激光进行。在用装备一种激光器的流式细胞计，同时检查一种或多种荧光染料的情形中，使用的荧光染料，它们必须是能以同一波长激发，但它们的发射彼此不同，以便能够通过它们各自的FL检测器确定每一群体。这样的荧光染料组合的使用，一般是用在真核细胞的分析中，但就目前所知，尚没有荧光染料的组合适合FISH技术(Handbook of fluorescent Probes and Research Products，Molecular Probes)。实际上，这一点已经表明，在同一分析中，使用流式细胞计FISH，不能从包含其他微生物样本的单独染色DNA群体中，以及从非微生物起源粒子形成的背景群体中，区分并计算与探针杂化及染色DNA的目标群体。
到目前为止，只见在研究中使用流式细胞计FISH方法，根据若干非同时的分析和使用不同于荧光参数的参数，从样本的其余细菌和从背景群体中，区分16S rRNA杂化目标群体。未见在同一分析中，能计算样本包含的微生物细胞数及杂化目标微生物所占部分。为了荧光的差别，在迄今最好的流式细胞计FISH方法中，目标细菌已经与两种不同探针杂化(用荧光原位杂化和使用16S rRNA目标探针的流式细胞计，在人类粪便样本中未加培养的类Ruminococcus obeum细菌的量化，E.G.Zoetendal等人的博士论文，人类胃肠道中细菌群落的分子特征，2001，E.G.Zoetendal，University of Wageningen，Holland)。这两种探针已经用不同的荧光染料标记，从不同的荧光通道观察。在只用一种激光器激发荧光染料时，迄今尚未成功使探针荧光染料的激发和发射波长谱彼此分离足够远，相反，人们必须用有不同波长的两种激光器，两种激光器的光束在不同时间照射在样本粒子上。在该方法中，必须用两种激光器把目标群体与样本的其余细菌区分。按相同方式，用点图的两根轴来区分目标群体与样本其余的细菌，但它不能同时区分总的细菌群体与背景群体。为了计算细菌总数，人们必须进行另外的分析，其中样本不杂化但仅对DNA染色。在Zoetendal的方法中，例如由于该方法使用的荧光染料是弱强度的，和由于大的背景，目标群体与细菌的区分同样也是弱的。
在使用的另外一个实施例中，目标群体已经与一种有一种荧光染料的探针杂化(以rRNA目标探针活化的沉淀物的流式细胞计分析；G.Wallner等人，Applied and Environmental Microbiology，1995，Vol.61，p.1859-1866)。要区分包含DNA的粒子与不包含DNA的粒子，杂化样本已经用DNA颜料染色，该DNA颜料不能被激发荧光染料的相同激光器激发，所以在该方法中也使用两种激光器。这里，Wallner的目的，是要同时检测样本中包含其余细菌的目标细菌群体，和在同一图上背景群体中的目标群体。作为DNA颜料，Wallner选择吸收和发射紫外波长区的光的荧光染料(Hoechst蓝，分子探针)，且粘附在探针上的荧光染料，是蓝绿波长区的荧光素。虽然已经有人在该方法中使用了非常强和昂贵的水冷激光器，功率达数百毫瓦，但使用的荧光染料强度仍然弱，不能在一次分析中满意地把群体彼此区分。为了区分染色的DNA粒子与不染色的DNA粒子，Wallner不得不使用另外的应用程序，把不染色粒子全部放在分析以外，也不能说明同一点图中的染色DNA粒子与不染色DNA粒子。这一点减弱了该方法的可靠性。Wallner没有计算每单位体积的任一细菌的浓度，而只是细菌种类的比例。
在科学出版物中，第三种分析16S rRNA杂化混合细菌样本的流式细胞计方法，是基于使用一种激光器和与DNA相配的DNA颜料及粘附在探针上的荧光染料(16S rRNA目标寡核苷酸探针与流式细胞计的组合，用于分析混合微生物群体；R.Amann等人，Applied andEnvironmental Microbiology，1990，Vol.56，p.1919-1925)。同样，在该方法中，探针使用的荧光染料在有低的荧光强度时，它不能把目标细菌，即要分析的细菌，与样本中包含的其余细菌区分。使用的DNA颜料的吸收极大，与探针荧光染料的发射极大在相同的波长上。用于区分目标细菌与样本中包含的其余细菌的探针荧光染料，使用它发射能量来激发DNA颜料，从而，目标细菌的荧光，不能充分用于把它们从样本中其余细菌可靠地区分。在DNA颜料和以荧光染料标记的探针彼此结合足够紧密的情形，在它们之间也可以出现能量传输，这是分子间没有光子的能量传输，如FRET(荧光共振能量传输)现象(藻红蛋白和别藻蓝蛋白用于流式细胞计的荧光共振能量传输分析，优点和限制；P.Batard，Cytometer，2002，vol.48，pp.97-105)。目标群体与样本中其余细菌形成的群体，在点图上重叠，因而不能从细菌总数计算细菌细胞数和目标细菌所占部分。
从以上给出的可见，在Zoetendal、Wallner、和Amann的方法中，所有三种群体：目标细菌、样本中其余细菌、和非染色DNA粒子，不能可靠地区分。细菌浓度和样本中目标细菌不能可靠地计算。因此，这些方法不能用于计算复杂混合细菌样本，例如粪便中包含的细菌浓度，以及对分开的细菌种类，进行特异的和可靠的确定及计算。因此，混合细菌的流式细胞计分析，是不可靠的，而显微镜FISH，仍然被认为是用于混合细菌样本中包含的细菌进行种类特异性确定和计算的唯一方法。
因此，本发明的目的，是实现一种方法和装置，通过该方法和装置，能够分析混合微生物样本，确定其中包含的微生物和/或微生物种类，以及测量它们在样本中所占部分。本发明的另一个目的，是实现一种方法和装置，通过该方法和装置，还能够测量样本中的微生物和/或微生物种类的浓度。本发明的再一个目的，是以快速的、不昂贵的、和可靠的方式，实施该方法。
发明内容
上面所述目的，已经通过本发明的方法和装置取得。
本发明涉及确定一种或多种微生物和/或微生物种类的方法和装置，和从样本测量至少一种微生物和/或微生物种类所占部分的方法。本发明还涉及如何使用按照本发明的确定微生物和测量它们所占部分的方法与装置。
样本可以是，例如取自哺乳动物生物体的样本、污水样本、或任何其他包含如一种或多种微生物或微生物种类和/或非微生物起源物质的样本。非微生物起源的物质，包括纤维、非有机物质、杂质、和其他散射和/或发荧光的单元。微生物可以是，例如细菌、原生动物、菌类、或病毒。本发明的特征由后面所附权利要求书给出。
按照本发明的方法：
a)与如下结构结合，该结构对至少一种微生物种类或群个别化，并能识别在第一波长区吸收光的第一荧光剂，
b)与如下结构结合，该结构以第二波长区吸收光的第二荧光剂表征所有微生物，
c)使样本流动，
d)以第一波长区的单色光，激发所述流动中的所述第一荧光剂，
e)以第二波长区的单色光，激发所述流动中的所述第二荧光剂，
f)通过分析与样本粒子结合的荧光剂的荧光，确定目标微生物，
且其中的荧光剂和单色光波长的选择，要能获得可测量的两种荧光剂荧光之间的强度差。
按照本发明的装置，包括：
a)流体室(5)，把待分析的包含样本的溶液(6)，引进该流体室，其中，溶于能对至少一种微生物种类或群进行确定并个别化结构的溶液，与在第一波长区吸收光的第一荧光剂结合，且其中，表征所有微生物的结构，与在第二波长区吸收光的第二荧光剂结合，
b)光源(1、3)，用于在不同的波长上产生单色光，
c)一个或多个检测器(14、15、16、17)，用于测量构成荧光剂的信号，以便确定目标微生物，
且在该装置中，样本的荧光剂和单色光波长，已经按能获得可测量的两种荧光剂荧光之间的强度差选择。
此外，按照本发明的方法和装置，可以包括，用于计算被确定的目标微生物占样本总数的部分的步骤和相应装置。
通过本发明的方法和装置，获得的可测量的强度差，可以是，例如至少约对数标尺上的两倍，最好是对数标尺上的四倍。
在本发明的一个实施例中，第一荧光剂，如荧光染料，粘附在探针上，探针与能对至少一种微生物种类或群进行确定并个别化的结构结合。讨论中的结构，可以是任何表征某种微生物种类或群的单元，通过它，能够从其他微生物中确定前述的种类或群。该特征结构可以是，例如DNA或RNA和/或某些其他表征某种微生物种类或群的一部分。该特征结构最好是16S蛋白体RNA分子和/或23S蛋白体RNA分子。
在上面给出的本发明该实施例中，第二荧光剂，如荧光染料，与表征所有微生物的结构结合。一种表征所有微生物的结构，可以是任何代表能在样本中区分微生物的结构。该特征结构最好是DNA。
按照本发明的装置，可以是任何能区分样本中粒子，和能测量它们所占部分的装置。按照本发明的一个实施例，该装置是流式细胞计。
按照本发明的方法和装置，能使人们解决以上所述的问题。用于确定微生物种类特异性，和用于测量混合细菌样本中它们所占部分的按照本发明的方法，与前述各方法的显著差别是，能在一次分析中，区分目标微生物、样本中其余的微生物、和背景群体，以及计算样本中包含的微生物细胞的精确数，和目标微生物所占部分。
与Zoetendal使用两种激光器的方法的基本差别是，在Zoetendal的方法中，用两种激光器激发荧光染料，即区分目标细菌与样本中其余的细菌，但不能在同一分析中，从背景群体区分细菌的染色DNA总群体。在Zoetendal方法中，需要对FSC参数调节被分析粒子的阈值。这样导致样本失真，因为大部分细菌细胞的FSC值小于调节后的阈值。弱的样本能够从Zoetendal公开的图中看到。两种不同的分析和样本的使用，削弱了结果的可靠性。两种探针的使用，增加了费用，且它的部件还削弱该方法的可靠性，因为两种探针不一定使同一细菌种类杂化。在Zoetendal的方法中，根本不能证明探针将真正与包含DNA的粒子结合，因为染色的DNA和杂化的粒子是根据两种不同的样本检查的。
与Wallner方法相比的基本差别是，例如，Wallner用作DNA颜料的是UV波长区的荧光染料，和用作杂化探针的是蓝绿波长区荧光染料。Wallner使用的荧光染料有如此低的强度，以致样本的不同群体不能可靠地区分。Wallner用SSC参数作为阈值，导致样本失真。Wallner通过计算机软件程序，从分析中消除无染色DNA粒子，这样导致样本另外的失真。由于Wallner在涉及方法的安排中，使用高功率和昂贵的数百瓦水冷氩离子激光器，但目标细菌无论如何仍不能从样本的其余细菌区分。在Wallner公开的内容中，作为混合的细菌样本，是在水净化中使用的活性沉淀物，该活性沉淀物是人工混合细菌的样本。活性沉淀物中包含的细菌，包含比自然状态中的细菌更多的rRNA，所以Wallner使用的样本不能与复杂的生态系统如肠内细菌丛相比。Wallner本人在他的论文中声明，他的方法在比活性沉淀物更复杂的混合细菌样本，例如在粪便检查中，是不起作用的。
在Amann的方法中，样本是培养的细菌构成的人工混合物。杂化的目标细菌群体、总的细菌群体、和背景群体，不能在同一分析中区分，所以该Amann的方法，与现在说明的方法比较，也基本上是不同的。此外，Amann在他的方法中，必须使用高功率的昂贵的激光器。
通过本专利申请的方法和装置，可以获得的显著优点是，它能可靠地、同时地区分所有三种群体：目标微生物群体、样本中其余微生物形成的群体、和背景群体。这样能使样本的分析更快，和使混合细菌生物样本中包含的微生物种类特异性的确定及计算，比以前的更为可靠，还能实现样本中微生物浓度的快速阐明。
按照本发明的方法中，能够确实证明杂化探针是在微生物之中，而不是在例如背景群体之中，因为杂化粒子可以作为同一分析中和点图中的染色DNA被检测。通过使用(例如借助杂化的探针)一种充分吸收和发射红波长区的光的荧光染料，作为被结合的荧光染料，和使用(例如DNA颜料)一种充分吸收和发射橙色或更短波长区的光的荧光染料，作为被检查的所有微生物结合的荧光染料，在该两种荧光染料之间将不存在有妨碍作用的能量传输。如果荧光染料的使用方式是，使吸收和发射更短波长区的光的荧光染料，粘附在杂化探针上，和使用吸收和发射更长波长区的光的荧光染料，作为DNA颜料，则在该两种荧光染料之间，将存在妨碍从样本的其余微生物到被区分的目标微生物的能量传输。
作为既快速又自动，并能自动化的方法，按照本发明以FISH技术杂化的微生物的分析，与用于种类特异性检查及复杂混合细菌微生物样本计算的显微镜FISH相比，是一种显著更好的方法。按照本发明的装置，能使人们每秒可靠地确定甚至数千粒子。因而在单位时间中被确定的微生物数量，与显微镜比较，增长数倍。该装置能准确给出的信息，是明确的，该信息降低因人的因素产生的误差。按照本发明的方法，还能使人们对样本中包含的微生物，比其他方法更精确地和更迅速地计数。
微生物和/或微生物种类所占部分的测量，是指比例的或绝对的部分的测量。平均荧光强度，是按计数方式或几何方式之一计算的。最好使用几何平均值。本领域熟练人员显然清楚，在分布基本上服从Gauss曲线的情形中，两种方式获得相同的结果，但在不是这种情形的情形中，使用几何平均，可以获得更有代表性的结果。
如上所述，在本发明的一个实施例中，第一荧光剂，如荧光染料，粘附在探针上，探针是与能实现个别化确定的结构结合的。探针的结合作用，是指把过量的探针添加到样本中，且探针只与能实现个别化确定的结构，如RNA分子(rRNA分子)结合，结合就是指这一情况。在本方法中，特别有利的做法是，使用特异性的探针和荧光剂，例如已知的若干种。探针的例子，例如在下面的公开的论文中给出：种系发生的确定和个别微生物细胞的不加培养的原位检测；R.I.Amarnn等人，Microbiological Reviews，1995，Vol.59，p.143-169，而荧光染料的例子，例如在下面的出版物中给出：Handbook of Fluorescent Probesand Research Products，Molecular Probes。过量的探针或从样本中被洗去，或留在样本中，因为它的荧光强度和散射不足以达到干扰对结果解释的强度。
荧光剂通常是在把探针与结构如RNA分子结合之前，已经粘附在探针上，该结构能实现微生物的个别化的确定。荧光染料应在购买探针时尽量早地粘附在探针上，或者应在按照本方法开始处理前粘附在探针上。
按照本发明的一个实施例，在本方法的步骤d)，在送至流动的样本中，还包含微粒子，它们是通过它们的散射性质和/或荧光性质而被区分的。此外，在按照本发明的方法和装置中，可以使用供给装置分出一部分标准量的样本，本领域熟练人员周知，可以用流量计或一些其他装置测量该要分析的量。以此方式，可以决定样本中待分析的微生物和微生物种类的浓度。为了计算待分析样本中包含的微生物细胞、微生物浓度、和目标微生物的精确数，可以使用例如发荧光的微粒子，或者用供给装置，分出一部分标准量的样本。
微生物的碎片数因而能够用商业的样本管(如，TruCountTM，Becton Dickinson生产)决定。微粒子能够根据它们的荧光和散射性质，与混合细菌样本的其余粒子可靠地区分。样本管中包含已知量的微粒子，同时已知量的要检查的样本被分出，送进样本管。均匀地分布进样本的一部分微粒子被识别。从管内全部微粒子中被识别的微粒子的该部分，直接与同一时刻从样本内全部微生物中被识别的微生物成正比。因此，这样就能容易计算样本中微生物的浓度。另一种计算样本中微生物数的方法，是用供给装置(如，Particle Analysing SystemPAS，Partec)分出标准量的样本。该供给装置分出样本的已知体积。从样本总体积中被剂量测定的体积部分，直接与从样本微生物总数中被识别的微生物部分成正比。
当使用前述微粒子时，这些微粒子就它们的散射和/或荧光性质上，与样本粒子不同，所以在按照步骤a)到c)或相反地处理时，可以把这些微粒子添加到样本中。按同样方式，也可以在步骤d)，就是使样本流动前的任何步骤中，例如在供给进流式细胞计前，把前述粒子添加到样本中。特别有利的是，用其中有预定数量微粒子的现成的样本管。该种管由例如Becton Dickinson公司生产。
前述位于第一和第二波长区的单色光，能够由一个、两个、三个、或更多光源产生。在前述光由多于只用一个光源产生的情形，这些光源的安排方式，要使它们产生光束，在装置的一个点、两个点、或更多点上被引导。在光源被多于只有一个点引导的情形，在该方法中最好使用信号延迟设备，以便延迟第一和任选的后来光源产生的测量信号。
按照本发明的一个实施例，第一波长区是600-650nm，而第二波长区是350-600nm。上述第一和第二波长区，最好是不同的波长区；要基本满足如下条件“选择荧光剂和单色光的波长区，使在荧光剂的荧光之间获得可测量的强度差”，以便能获得可靠的结果。在光源被多于只有一个点引导的情形，样本首先遇到的光束的波长区波长，可以高于或低于样本其次遇到的波长区波长。在使用荧光剂，如荧光染料的情形，荧光剂要有显著不同的荧光性质，波长也同样。显著差别是指满足上述条件的差别。前述的差别可以是，例如对数标尺上的两倍，最好是对数标尺上的四倍。本领域熟练人员显然知道，一对快速的测试使它能够找出被使用的是什么波长。
本文后面在实验部分，给出波长区选择的例子。
按照本发明的一个实施例，光源从一组包含635nm的二极管激光器和488nm的氩离子激光器中选择。
按照本发明的一个实施例，要检查的样本，是来自哺乳动物消化系统的样本。该类样本可以是人类或哺乳动物的粪便。按照本发明的另一个实施例，要检查的样本，是废水样本。还有，按照本发明的方法和装置，能使人们检查就其原始成分而言是固体的微生物样本，但为了分析，已经悬浮在液体中。
按照本发明一个优选实施例的方法，是基于同时使用两个不同波长的激光器，相对于被分析样本流的流动方向，和荧光剂如与激光器相配的荧光染料流动方向，连续地排列。一个激光器是红波长区(600-650nm)激光器，另一个是橙色或更短波长区(450-600nm)的激光器。该方法使用的一种荧光剂如荧光染料，粘附在杂化探针上，而另一种是DNA颜料。杂化探针使用的荧光染料的吸收谱，与较长波长的激光器相配，而DNA颜料的吸收谱，相应地与较短波长的激光器相配。为了区分被检查种类的微生物，在目标微生物核酸中杂化的探针的荧光染料，被红波长区的激光激发。为了区分不包含DNA的粒子与包含DNA的粒子，与包含DNA样本中的粒子结合的DNA颜料，被橙色或更短波长区的激光激发。
样本中包含的微生物细胞的准确数，和全部微生物中目标微生物所占部分，是用均匀悬浮在样本中的荧光微粒子计算的。本方法的功能，已经通过计算人类粪便样本中双歧杆菌属的细菌数测试，和通过从相同分析中计算人类粪便细菌总数测试，以及通过从粪便样本包含的全部细菌中，计算双歧杆菌属所占部分的测试，如在本文后面的实验部分所示。作为对比的方法，只使用广泛使用的混合细菌样本分析方法，即显微镜FISH。费力的显微镜FISH是倍加小心并准确地进行的，该方法给出相同的结果，证明了按照本发明上面给出的方法的功能。这里出示的例子因此是按照本发明的方法的例子。
此外，本发明涉及把该方法和装置，用于确定微生物，如细菌菌株，和用于测量它们所占部分。按照本发明的一个实施例，前述微生物是益生菌(probiotic)菌株。本领域熟练人员显然清楚，按照本发明的发明，可以用于确定任何其他微生物菌株，要求对被确定的微生物菌株，获得探针和荧光剂，如适合本方法的荧光染料。按照本发明的方法，能够用于检查如前生物素(prebiotes，或益生素)。
本发明因此具有工业和科学的可应用性，如在食品和饲料工业，以及在医药诊断方面。但是，在医药诊断方面，人们使用本方法，不是直接获得可以诊断某种疾病的结果，而是获得对结果的解释，人们需要了解医药。功能食品的制造，需要可靠和快速的混合细菌样本分析方法，以便能说明食品对细菌菌株的作用，和它们在肠道中的固定量。饲料工业通过发展能促进非恶性细菌在动物肠道中的生长，努力对抗例如家禽的沙门菌感染。这样能降低动物饲养中使用抗体的需求，并降低抵抗抗体的细菌的产生。在医药研究和临床诊断中，对混合细菌样本的新颖的种类特异性分析和计算方法，存在不断增强的需求。
已知人类肠道菌丛包含比人类自身具有的真核细胞更多的细菌细胞，所以微生物与宿主生物之间的互作用范围广泛，且大部分是未知的(人类粪便菌丛：20个日本-夏威夷人的正常菌丛；W.E.C.Moore和L.V.Holdeman，Applied Microbiology，1974，Vol.27，p.961-979)。已经确信，若干种仍然在它们的病原学方面是未知的疾病，根源是生物的微生物移地发育。这类疾病的例子，包括变态反应和类风湿性关节炎；R.Peltonen，博士论文，1994，University of Turku，和变态反应卫生学假说中消化道微生物群的作用；M.Kalliom_ki，博士论文，2001，University of Turku)。
在下面部分，本发明将参照附图作更详细的说明。
附图说明
附图包括：
图1按照本发明，示意画出用于本发明方法中的流式细胞计。
图2是示意图，画出图1所示流式细胞计的截面图。
图3a、3b、和3c示意画出在按照本发明的方法中，信号形成的原理。
图4示意画出信号延迟设备的操作原理。
图5画出例子的结果。
具体实施方式
图1示意画出按照本发明的装置，在本例中，该装置是流式细胞计。图1中画出激光器1和它出射的激光束2。此外图中还画出激光器3，从它出射的激光束4的波长，比激光束2的波长更短。此外，可以使用能测定剂量的样本标准量的供给装置。还有，图中画出流体室5，其中，样本溶液6和包围它的壳层流体7沿箭头8所示方向流动。样本溶液6通过样本供给针9，送进壳层流体7内。在样本溶液6中，有待分析的粒子10，这些粒子可以是，例如杂化和染色DNA微生物，例如细菌，非杂化的染色DNA微生物，如细菌，不包含DNA的无染色DNA的粒子，或在计算微生物数中使用的微粒子。样本溶液6流经激光束2和4，由于太细，所以它包含的粒子形成粒子线11。粒子线11与激光束2和4的交点，分别以参考数字12和13标记。
装置中，还有光电二极管14，起FSC检测器的作用，光电倍增管15，起FL2检测器的作用，和光电倍增管17，起SSC检测器的作用。此外，装置中还有光学滤波器和反射镜18，包括在流式细胞计的光学系统之中，借助它们，从粒子散射的某一波长的荧光，经过滤波并被引向检测器14、15、16、和17。装置中还可以有废物容器19，样本在分析之后被引入该容器。为使图简化，这里没有画出FL1和FL3检测器。此外，该装置可以包括计算装置，用于计算样本总数中被确定的微生物所占部分。
图2画出图1所示同一设备的截面图。在图中，参考数字20表示在激光束与样本溶液交点处的一个粒子，该粒子散射并发出荧光。散射并发出的荧光，示意地用线21表示。
图3a、3b、和3c示意画出信号形成的原理。图3a中画出步骤1，在该步骤中，一个粒子22随液体流动从下向上运动，与激光束23相遇。激光束23被粒子22散射，且荧光染料被激发并按照它们的发射谱发射光。流式细胞计的光电二极管和光电倍增管，连同流式细胞计的其余电子线路，把光信号改变为模拟电压脉冲，如在坐标图中所示，其中，x轴上画出时间，y轴是电压。电压脉冲的峰电压，是当粒子完全在激光束23内时，如图3b所示的步骤2中获得。激光束23的散射和发射的荧光染料数，是在该瞬间达到它们的极大。图3c表示步骤3，随着粒子22离开激光束23，电压开始相应地下降。电压脉冲形成所需时间，依赖于粒子22的大小和流动速度，实际上为数微秒。
图4按照本发明，示意画出使用两个装置的装置中信号延迟的原理。图上画出形成样本溶液粒子线的粒子10，以及第一激光束13与粒子线的交点13，与图1所示相同。此外，在x轴上画出电压脉冲。第一电压脉冲是在粒子10与第一激光束，即在光束交点12的较长波长的激光束相遇时产生，以参考数字24标记。在本例中，由激光器以较长波长在粒子10中引起的荧光，被FL4检测器检测，即电压脉冲24是由FL4光电倍增管产生的。
参考数字25画出的电压脉冲，是当粒子10在稍后的点上与第二激光器，即在激光器交点13上较短波长的激光束相遇时产生。在本例中，由激光器以较短波长在粒子10中引起的荧光，被FL2检测器检测，激光束在低角度的散射被FSC检测器检测，和激光束在更大角度的散射被SSC检测器检测。在x轴上，从第一电压脉冲的建立到第二电压脉冲的建立之间的时间t，是粒子10走过第一和第二激光器之间距离所用时间。为了使该粒子10在不同时间和不同状态产生的信号的测量，能被识别为发自同一粒子的信号，在电路26中，第一电压脉冲必须延迟时间t。该延迟的电压脉冲用参考数字27标记。两个激光器对同一粒子10在不同时间点产生的荧光和散射信号，被信号延迟而同步为同一时间点，从而使同一粒子10由两个激光器产生的参数，将作为发自同一粒子10的参数。
图5画出的点图，是用流式细胞计分析获得的，样本是用16SrRNA技术杂化，把DNA染色，并均匀分散在包含微粒子的样本管中的粪便样本。图中每一点与一个测量点对应。x轴的对数标尺，用于测量粘附在探针上的荧光染料的相对荧光强度(在通道FL4)，而y轴用于测量DNA颜料的荧光的相对强度(在通道FL2)。图中x轴画出电压脉冲的高度(FL4 H，其中H表示高度)，按相同方式，y轴画出电压脉冲的高度。该图也可以用于表明电压脉冲的宽度或面积。在点图中可以区别四种不同的群体：
1.仅包含DNA颜料的粒子，即，样本中除目标细菌之外的细菌，以参考数字28标记，
2.在两个荧光参数上发出弱荧光的粒子，即背景群体，以参考数字29标记，
3.包含探针与DNA颜料的粒子，即目标细菌，以参考数字30标记，
4.在两个荧光通道上都强的微粒子，以参考数字31标记。
群体1和3一起，形成样本内细菌的总群体。在粪便样本中，背景群体主要由消化道中未消化的纤维物质构成。在本例中，将更详细解释如何获得该图。
实验部分
举例
用按照本发明的方法和装置，检查人类粪便样本中包含的细菌，样本用16S rRNA技术杂化和DNA染色法(公开在下面的文献中：以属特异的16S rRNA目标探针双歧杆菌属原位杂化的定量荧光分析及其在粪便样本中的应用；P.S.Langendijk等人，Applied andEnvironmental Microbiology，1995，vol.61，p.3069-3075)。作为探针的是双歧杆菌属特异探针，已经用红色波长区的Cy5标记(制造商Eurogentec)作了标记，该Cy5标记的吸收极大约643nm，发射极大约667nm，故能用FL4检测器识别。作为DNA颜料，使用橙色波长区的SYTOXTM Orange颜料，它的吸收极大约547nm，发射极大约570nm，故能用FL2检测器识别。SYTOXTM Orange的吸收极大足够宽，可以用488nm的激光激发。杂化的粪便样本均匀分散在包含TruCountTM微粒子的样本管(制造商Becton Dickinson公司)中。随着被液体的流动携带，样本的杂化双歧杆菌属，到达波长635nm红色二极管光学聚焦束与粒子流体动力学聚焦线的交点。杂化在细菌中的探针的Cy5荧光染料，吸收激光束的能量并发出荧光，即以比它们的激发波长更长的波长，以光的形式发射它们吸收的能量，所发射的光被FL4光电倍增管识别，开始产生电压脉冲，如图3a所示。因为细菌只有部分在第一激光器的光束中，所以只有包含在细菌内的小部分探针的荧光染料形式并发射光，故FL4光电倍增管的电压脉冲尚未达到它的峰值。激光束激发荧光染料的作用，在粒子位于光束焦点的交点中心，使电压脉冲到达它的峰值时，达到它的极大(如在图3b中所示)。随着细菌离开激光束，粘附在探针上的荧光染料数，和形式并发射的能量随之下降，于是电压脉冲下降(图3c)。产生的电压脉冲在电路中被延迟22±1微秒。在延迟时，细菌到达波长488nm氩离子激光器光束与粒子线的交点。激光器488nm的光，激发细菌的与DNA结合的DNA颜料，而DNA颜料发出波长比激发它的波长更长的荧光，被FL2光电倍增管识别。这样就产生第二电压脉冲。本方法使用两个阈值，以便确认被作为细菌分类的粒子，确实是细菌。为保证样本的范围足够大，SSC参数的阈值设置得很低，使所有细菌都能被确定。但是，在样本中也有非细菌粒子的情形中，这些粒子的SSC信号会超过该阈值。为了解决该问题，要使用第二个阈值，设置在FL2通道上，即用于确定DNA颜料的通道。在测量前，超过SSC阈值的粒子必须也超过FL2阈值，这样，通过使用两个阈值，可以可靠地从样本内包含的粒子中区分细菌。电压脉冲用对数放大器放大，借助与流式细胞计连接的计算机进行数字化和分析。电压的极大高度正比于细菌内包含的荧光染料的荧光强度。细菌在FL2和FL4通道上产生的测量信号，经过计算机处理并描绘在点图中(图5)。作为按上述方式杂化的双歧杆菌属细菌，在图上被描绘成包括在目标细菌群体内(图5的参考数字30)。在细菌是某些没有杂化的细菌情形下，它被描绘成包括在样本包含的其余细菌群体内(图5的参考数字28)。没有染色的DNA粒子，被描绘成包括在背景群体内(图5的参考数字29)，而为细菌细胞的准确计数使用的荧光微粒子，则形成它们自身的群体(图5的参考数字31)。
表1出示了从5个志愿测试者以3周为间隔，收集的三种粪便样本的分析结果。粪便样本按一般熟知的附着方法处理，并以双歧杆菌属特异探针及染色DNA杂化(如公开在下面的文献中：以属特异的16S rRNA目标探针双歧杆菌属原位杂化的定量荧光分析及其在粪便样本中的应用；P.S.Langendijk等人，Applied and EnvironmentalMicrobiology，1995，vol.61，p.3069-3075)。样本内包含的细菌总数，和样本内包含的全部细菌中，杂化双歧杆菌属按百分比的数量及所占部分，已经用按照本发明的流式细胞计计算和用荧光显微镜计算。流式细胞计量术的分析，是用本发明的方法进行的，而荧光显微镜的分析，是按照Langendijk公开的方法进行的。从表1可见，两种方法就双歧杆菌属所占部分及细菌总数两方面，非常类似。在用流式细胞计进行的计算中，从每一样本计数的细菌数约为20000，一个样本的分析时间约半分钟。在用荧光显微镜进行的计算中，从每一样本计数的细菌数约为2000，一个样本的分析时间约一小时。
表1
     细菌(1010/克)     双歧杆菌属所占部分
  测试者  时间(周)   显微镜  流式细胞计    显微镜  流式细胞计
    I     0     2.3     2.1     2.2％     2.3％
    1     2.9     2.2     3.7％     3.5％
    2     3.0     3.1     1.4％     0.9％
    II     0     1.0     1.1     6.9％     7.8％
    1     1.2     1.5     4.5％     4.3％
    2     1.8     1.5     4.5％     3.9％
    III     0     2.0     2.1     0.31％     0.0％
    1     2.8     2.2     0.63％     0.0％
    2     2.7     2.5     0.59％     0.0％
    IV     0     2.8     2.7     1.7％     1.3％
    1     2.0     2.6     3.5％     3.0％
    2     3.2     2.4     2.9％     2.3％
    V     0     2.3     3.1     6.1％     5.9％
    1     3.3     2.9     7.4％     8.0％
    2     2.6     2.8     5.5％     6.0％

Claims (36)

1.一种用于确定一种或多种微生物，和/或微生物种类的方法，并用于从样本中测量至少一种微生物，和/或微生物种类所占部分，本方法的特征在于：
a)与如下结构结合，该结构对至少一种微生物种类或群个别化，并能识别在第一波长区吸收光的第一荧光剂，
b)与如下结构结合，该结构以第二波长区吸收光的第二荧光剂表征所有微生物，
c)使样本流动，
d)以第一波长区的单色光，激发前述流动中的前述第一荧光剂，
e)以第二波长区的单色光，激发前述流动中的前述第二荧光剂，
f)通过分析与粒子结合的荧光剂的荧光，确定目标微生物，
且其中的荧光剂和单色光波长的选择，要能获得可测量的荧光剂荧光之间的强度差。
2.按照权利要求1的方法，特征在于，该方法还包括如下步骤：从样本总量中计算被确定的目标微生物所占部分。
3.按照权利要求1或2的方法，特征在于，荧光剂和单色光波长的选择，要能使荧光剂发出的平均荧光强度之差，至少约对数标尺上的两倍。
4.按照权利要求1-3任何一项的方法，特征在于，可测量的荧光剂荧光之间的强度差，是在第一波长区上获得的。
5.按照权利要求1-4任何一项的方法，特征在于，该样本被引入流式细胞计。
6.按照权利要求1-5任何一项的方法，特征在于，第一荧光剂粘附在探针上，探针与样本内对至少一种微生物种类或群个别化的结构结合，并能实现该确定。
7.按照权利要求1-6任何一项的方法，特征在于，对至少一种微生物种类或群个别化并能实现该确定的结构，是蛋白体RNA分子。
8.按照权利要求1-7任何一项的方法，特征在于，表征所有微生物的结构，是DNA。
9.按照权利要求1-8任何一项的方法，特征在于，对每一种微生物每一参数专门设置阈值，且微生物是根据它们的阈值分类的。
10.按照权利要求1-9任何一项的方法，特征在于，该荧光剂是荧光染料。
11.按照权利要求1-10任何一项的方法，特征在于，该微生物是细菌和/或细菌种类。
12.按照权利要求11的方法，特征在于，前述蛋白体RNA分子，是从包含16S蛋白体RNA分子和23S蛋白体RNA分子的一组中选择的。
13.按照权利要求1-12任何一项的方法，特征在于，检测从样本粒子散射的光。
14.按照权利要求1-13任何一项的方法，特征在于，还根据微粒子的散射和/或荧光性质，把它们从样本中分离。
15.按照权利要求1-14任何一项的方法，特征在于，该第一波长区是600-650nm。
16.按照权利要求1-14任何一项的方法，特征在于，该第二波长区是350-600nm。
17.按照权利要求1-16任何一项的方法，特征在于，安排在第一和第二波长区的单色光，是由一个光源形成的。
18.按照权利要求1-16任何一项的方法，特征在于，安排在前述第一和第二波长区的单色光，至少由两个光源形成。
19.按照权利要求18的方法，特征在于，前述至少两个光源的至少两个，按一定距离彼此分开安排，并在于，在该方法中，使用信号延迟设备，延迟通过第一和任选的后来光源产生的测量信号。
20.按照权利要求1-19任何一项的方法，特征在于，该样本是来自哺乳动物的生物液体的样本。
21.按照权利要求20的方法，特征在于，该样本是源自哺乳动物的消化系统的样本。
22.按照权利要求1-19任何一项的方法，特征在于，该样本是废水样本。
23.一种用于确定一种或多种微生物，和/或微生物种类的装置，并用于从样本中测量至少一种微生物，和/或微生物种类所占部分，特征在于本装置包括：
a)流体室(5)，把待分析的包含样本的溶液(6)，引进该流体室，其中，对至少一种微生物种类或群个别化并进行确定的结构，与在第一波长区吸收光的第一荧光剂结合，且其中，表征所有微生物的结构，与在第二波长区吸收光的第二荧光剂结合，
b)光源(1、3)，用于在不同的波长上产生单色光，
c)一个或多个检测器(14、15、16、17)，用于测量构成荧光剂的信号，以便确定目标微生物，
且在该装置中，样本的荧光剂和单色光波长的选择，要能获得可测量的荧光剂荧光之间的强度差。
24.按照权利要求23的装置，特征在于，该装置还包括计算装置，用于从样本总量中计算被确定的微生物所占部分。
25.按照权利要求23或24的装置，特征在于，荧光剂和单色光波长的选择，要能使荧光剂发出的平均荧光强度之差，至少是对数标尺上的两倍。
26.按照权利要求23-25任何一项的装置，特征在于，可测量的荧光剂荧光之间的强度差，是在第一波长区上获得的。
27.按照权利要求23-26任何一项的装置，特征在于，该装置是流式细胞计。
28.按照权利要求23-27任何一项的装置，特征在于，检测器(14、15、16、17)用于检测样本中粒子散射的光。
29.按照权利要求23-28任何一项的装置，特征在于，该装置还包括供给装置，用于对样本的标准量测定剂量。
30.按照权利要求23-29任何一项的装置，特征在于，该光源(1、3)包括至少两个光源，用于产生安排在第一和第二波长区的前述单色光。
31.按照权利要求30的装置，特征在于，前述至少两个光源的至少两个，按一定距离彼此分开安排，并在于，该装置还包括信号延迟设备，用于延迟通过第一和任选的后来光源产生的测量信号。
32.按照权利要求23-31任何一项的装置，特征在于，前述光源(1、3)是从包含635nm的二极管激光器和488nm的氩离子激光器的一组中选择的。
33.按照权利要求1-22任何一项的方法的使用，是用于确定微生物和用于测量它们所占部分的。
34.按照权利要求33的使用，特征在于，该微生物是益生菌probiotic菌株。
35.按照权利要求23-32任何一项的装置的使用，是用于确定微生物和用于测量它们所占部分的。
36.按照权利要求35的使用，特征在于，该微生物是益生菌probiotic菌株。
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