CN104089937B - 基于激光诱导荧光的海洋细菌原位丰度和多样性的检测方法 - Google Patents
基于激光诱导荧光的海洋细菌原位丰度和多样性的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种应用范围广泛、分析快速简便以及利于环保的基于激光诱导荧光的海洋细菌原位丰度和多样性的检测方法。技术方案是：其特征在于包括下列步骤：（1）通过泵输送被测水样溶液；（2）水样溶液流经过滤柱；（3）流经过滤柱后的水样进入荧光池；（4）利用高频的脉冲激发光源‑深紫外激光二极管泵浦固体激光器产生连续波段的光源，照射荧光池，利用在荧光池探测一侧的光谱分光器件‑光栅进行空间分光，色散后形成λ1‑λ2的光谱带；（5）位于探测窗口处的CCD光电探测器同时采集λ1‑λ2的光谱数据，通过内部转变和时间序列积分得到波长‑光强二维光谱；（6）数据处理系统经过海洋细菌荧光识别模式计算分析海洋细菌丰度和多样性。
Description
技术领域
本发明属于海洋细菌原位丰度和多样性检测方法领域，尤其是一种应用范围广泛、分析快速简便以及利于环保的基于激光诱导荧光的海洋细菌原位丰度和多样性的检测方法。本方法利用激光诱导荧光过程产生的荧光光谱与各种海洋细菌本身具有的“特征光谱”的光学特性－即各种海洋细菌在激光诱导荧光过程中产生的荧光光谱在不同波段上进行比对，结合海洋细菌荧光识别模式，分析海洋细菌丰度和多样性。
背景技术
海洋细菌是海洋生态系统的的重要组成部分。对海洋环境中细菌的研究不仅是目前生命科学前沿的领域之一，也是对海洋生态系统结构研究的重要组成部分。海洋细菌参与降解各种海洋污染物和毒物的过程，有助于保持海洋生态系的平衡和促进海洋自净能力；海洋细菌是产生新抗菌素、氨基酸、维生素和其他生理活性物质的重要生产者；细菌参与海洋的沉积成岩作用，如参与硫矿和深海锰结核的形成等；在海洋成油、成气的过程中，细菌起着重要作用；海水具有杀菌效果，是由于海洋细菌的拮抗和溶菌作用，致使陆源致病菌迅速死亡；海洋细菌可直接作为海洋经济动物的饵料；细菌参与对各种海洋物质的腐蚀、变性、污秽和破坏过程；某些海洋细菌是人体或海洋生物的致病菌；在特定条件下，海洋细菌代谢产物的积累会毒化养殖环境，如氨和硫化氢的积累危害生物养殖；也可以利用细菌的代谢活动来改善被毒化的养殖环境，如氨的氧化等，因此对海洋细菌丰度和多样性检测方法研究，对于进一步了解海洋细菌的生态结构以及在海洋碳循环中的作用具有相当重要的意义。
在研究方法上，目前主要采用海洋现场采样，实验室分离培养、基因测序的方法以及荧光显微镜技术来观察和研究海洋细菌的多样性。荧光检测技术由于其具有较高的灵敏度在细菌研究中一直处于相当重要的位置。目前常用的荧光检测技术在细菌中的应用主要有荧光显微技术、流式细胞荧光计数法、ATP荧光快速检测法以及荧光蛋白 标记等等。由于这些技术存在需要对样品进行采集和制片，进样要求严格，需要制作荧光标记物等缺陷，很难应用在海洋现场对细菌进行检测。同时荧光显微镜技术和平板培养法研究证明，在大洋环境中，只有少量的海洋细菌能通过传统的固定平板技术形成菌落，一些细菌处于活的非可培养状态，应用常规的分离培养方法无法全面反映海洋细菌资源状态以及生态功能，很难全面了解细菌的丰度和多样性及其生态学意义和在海洋碳循环中的作用。
另外方法采用现场取样后到实验室分析的模式，即不能实现现场、实时测量的方式，样品运输过程以及处理过程易引入其他干扰物质，影响分析的准确性。海洋细菌丰度和多样性检测涉及一定的环境条件以及复杂的过程，因此这个过程不可能保证不会出现二次受污的可能性，最重要的是由于海洋细菌的难培养性以及对高氧环境的不适应性，加上实验室环境与海洋环境之间差别较大，导致测量结果与实际情况之间有很大的差别，其结果的准确性和可靠性受到质疑。
上述方法不同程度存在着以下缺陷：1、必须在实验室中完成，应用不能现场实时，范围受到限制。2、分析持续时间长，至少需要几天时间。3、分析过程繁杂，条件苛刻、能耗大，对实验人员的技术水平要求高。
由于海洋环境的特殊性以及海洋细菌的不可培养性，采取现场检测可以更为真实地反映海洋细菌的状况。而荧光测量具有快速、便捷、连续测量、不需要培养等优势，可以更好地对细菌进行现场测量。
近年来，激光诱导荧光(laser induced fluorescence，LIF)检测法作为一种新型的高灵敏度检测方式，近年来得到了快速发展和广泛的应用，是迄今为止灵敏度最高的光学检测方法，激光诱导荧光检测技术的灵敏度比普通荧光高1-3个数量级，其对荧光物质的检测限可以达到年nmol数量级，在适当的条件下甚至可以实现单分子检测，由于其具有灵敏度高、快速、便捷、连续测量、不需要培养等优势，因此，采用原位激光诱导荧光技术可以较好地对海洋细菌的丰度和多样性进行检测，可以作为海洋细菌丰度和多样性原位检测的一种重要方法。
发明内容
本发明提供了一种应用范围广泛、分析快速简便以及利于环保的基于激光诱导荧光的海洋细菌原位丰度和多样性的检测方法。该方法 将激光诱导荧光技术与细菌体内荧光物质的不同种类、含量以及比例有机地结合起来，建立基于激光诱导荧光的海洋细菌丰度和多样性检测模式，为现场、快速监测海洋细菌丰度和多样性提供了手段。
为了达到解决上述技术问题的目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于激光诱导荧光的海洋细菌原位丰度和多样性检测方法，其特征在于本发明的方法步骤如下：
(1)通过泵输送被测水样溶液；
(2)水样溶液在泵的作用下，流经过滤柱，过滤柱内部填充氧化镁负载钴铁金属磁性纳米材料，并且具有控温装置，由于水体中含有粒径较大浮游植物，因此通过过滤柱可以过滤掉粒径大的浮游植物。
(3)流经过滤柱后的水样，进入荧光池，荧光池的窗口材料，靠近激发光源侧的采用纳米金刚石材料，主要消除水体拉曼散射，靠近探测窗口一侧的采用贴有石墨烯薄膜材料的硅玻璃，主要消除水体的荧光散射。
(4)利用高频的脉冲激发光源-深紫外激光二极管泵浦固体激光器产生连续波段，照射荧光池，利用在荧光池探测一侧的光谱分光器件-光栅进行空间分光，色散后形成λ1-λ2的光谱带；
(5)位于探测窗口处的CCD光电探测器同时采集λ1-λ2的光谱数据，通过内部转变和时间序列积分得到波长-光强二维光谱；
(6)首先，针对水体中微微型藻类可能带来的检测误差，利用高频的脉冲激发光源，激发采用400nm，发射采用685nm，CCD光电探测器采集光谱数据，作为水体藻类影响因子；
(7)其次，针对水体中CDOM的影响，根据CDOM有着自己的特征荧光(激发340/发射430)，同样利用利用高频的脉冲激发光源，激发采用340nm，发射采用430nm，CCD光电探测器采集光谱数据，作为水体CDOM影响因子；
(8)最后，利用高频的脉冲激发光源-深紫外激光二极管泵浦固体激光器产生连续波段的光源275-450nm，照射荧光池，利用在荧光池探测一侧的光谱分光器件-光栅进行空间分光，色散后收集280-535nm的光谱带，位于探测窗口处的CCD光电探测器同时采集280-535nm的光谱数据，通过内部转变和时间序列积分得到波长-光强二维光谱；
(9)数据处理系统中采用建立的海洋细菌多样性荧光识别模式，经过海洋细菌荧光识别模式计算分析海洋细菌丰度和多样性。
在本发明中，还具有以下技术特征：水样流量为5.0-10.0ml/min。
在本发明中，还具有以下技术特征：过滤柱内部填充氧化镁负载钴铁金属磁性纳米材料，控温装置的温度范围10-15℃。
在本发明中，还具有以下技术特征：利用高频的脉冲激发光源-深紫外激光二极管泵浦固体激光器，具有体积小、无需水冷、波动噪音小、供电简单等特征，高频范围100-150KHz。另外采用连续激发式脉冲激发光源，在一定程度上提高了测量精度，同时采用深紫外激发可以激发细菌体内典型的荧光物质，不需要进行染色等步骤。
在本发明中，还具有以下技术特征：所述的建立的海洋细菌多样性荧光识别模式是基于细菌体内含有一些可以激发产生荧光的成分，采用激光诱导荧光方法检测海洋细菌的过程当中，都会发出“特征光谱”，这些成分的不同类别、含量或比例的不同，导致荧光峰出现较大的差别，通过对荧光信号的采集和分析，采用主成分荧光矩阵的方法对细菌多样性进行鉴别，同时考虑到环境因素如藻类、CDOM、以及无机颗粒对荧光有可能产生影响，采用主成分荧光光谱分析方法，建立海洋细菌多样性荧光识别模式。
在本发明中，还具有以下技术特征：泵为蠕动泵，管路采用聚四氟乙烯材料制成。
在本发明中，还具有以下技术特征：CCD探测元件采用美国海洋光学背照式二维面阵CCD光谱仪。
在本发明中，还具有以下技术特征：微型计算机数据分析处理系统中采用海洋细菌多样性荧光识别模式，该模型针对藻类以及CDOM等影响因子具有很好的修正作用，可以消除这些影响因子对计算分析海洋细菌丰度和多样性的影响。
本发明的效果是：
本发明采用激光诱导荧光方法检测海洋细菌丰度和多样性，是目前海洋生态环境监测系统中的重要组成部分，方法利用海洋细菌体内荧光物质都会发出“特征光谱”的现象，通过激光诱导荧光技术与细菌体内荧光物质的不同种类、含量以及比例有机地结合起来，通过分光系统得到以波长为横坐标和以光谱序列为纵坐标的平面色散图，导 入CCD探测元件，光信号经光电探测处理转换为电信号输出，输出电信号经微弱信号放大电路进行转换，放大到一定电压幅度送数据处理部分的A/D转换通道进行量化，时间序列积分处理后得到全谱。
通过时间序列积分处理后得到的全谱，根据各种细菌体内荧光物质的“特征光谱”，经经海洋细菌多样性荧光识别模式软件对全谱进行分析得到海洋细菌丰度和多样性。
本发明利用激光诱导荧光方法检测海洋细菌丰度和多样性，方法能够准确、连续、快速的分析测试海洋细菌丰度和多样性，可在恶劣的环境中长期可靠工作。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
附图说明
图1是本发明方法工作原理流程图；
图2是本发明方法所采用的检测装置结构示意图；
图3是海洋细菌多样性的激光诱导荧光识别模式图。
图中标号说明：1.水样；2.水样泵；3.脉冲激发光源；4.纳米金刚石；5.荧光池；6.贴有石墨烯的硅玻璃；7.CCD光电探测器；8.控制部分；9.数据处理部分；10.废液收集；11.过滤柱；12.谱分光器件。
具体实施方式
参见图1、图2，
本发明的方法步骤如下：
(1)通过泵2输送被测水样溶液；
(2)水样溶液在泵2的作用下，流经过滤柱11，过滤柱11内部填充氧化镁负载钴铁金属磁性纳米材料，并且具有控温装置，由于水体中含有粒径较大浮游植物，因此通过过滤柱可以过滤掉粒径大的浮游植物。
(3)流经过滤柱后的水样，进入荧光池5，荧光池的窗口材料，靠近激发光源侧的采用纳米金刚石4材料，主要消除水体拉曼散射，靠近探测窗口一侧的采用贴有石墨烯薄膜材料的硅玻璃6，主要消除水体的荧光散射。
(4)利用100KHz的脉冲激发光源3-深紫外激光二极管泵浦固 体激光器产生连续波段，照射荧光池5，利用在荧光池探测一侧的光谱分光器件-光栅进行空间分光，色散后形成λ1-λ2的光谱带；
(5)位于探测窗口处的CCD光电探测器7同时采集λ1-λ2的光谱数据，通过内部转变和时间序列积分得到波长-光强二维光谱；
(6)首先，针对水体中微微型藻类可能带来的检测误差，利用100KHz的脉冲激发光源3，激发采用400nm，发射采用685nm，CCD光电探测器7采集光谱数据，作为水体藻类影响因子；
(7)其次，针对水体中CDOM的影响，根据CDOM有着自己的特征荧光(激发340/发射430)，同样利用利用100KHz的脉冲激发光源3，激发采用340nm，发射采用430nm，CCD光电探测器7采集光谱数据，作为水体CDOM影响因子；
(8)最后，利用100KHz的脉冲激发光源3-深紫外激光二极管泵浦固体激光器产生连续波段的光源275-450nm，照射荧光池，利用在荧光池5探测一侧的光谱分光器件12-光栅进行空间分光，色散后收集280-535nm的光谱带，位于探测窗口处的CCD光电探测器7同时采集280-535nm的光谱数据，通过内部转变和时间序列积分得到波长-光强二维光谱；
(9)数据处理系统中采用建立的海洋细菌多样性荧光识别模式，经过海洋细菌荧光识别模式计算分析海洋细菌丰度和多样性。
所述方法水样流量为5.0-10.0ml/min。
所述方法过滤柱内部填充氧化镁负载钴铁金属磁性纳米材料，并且具有控温装置，温度范围10-15℃。
所述方法利用100KHz的脉冲激发光源-深紫外激光二极管泵浦固体激光器，具有体积小、无需水冷、波动噪音小、供电简单等特征，另外采用连续激发式100KHz脉冲激发光源，在一定程度上提高了测量精度，同时采用深紫外激发可以激发细菌体内典型的荧光物质，不需要进行染色等步骤。
所述方法荧光池的窗口材料，靠近激发光源侧的采用纳米金刚石材料，主要消除水体拉曼散射，靠近探测窗口一侧的采用贴有薄膜材料-石墨烯的硅玻璃，主要消除水体的荧光散射。
所述的建立的海洋细菌多样性荧光识别模式是基于细菌体内含有一些可以激发产生荧光的成分，采用激光诱导荧光方法检测海洋细菌的过程当中，都会发出“特征光谱”，这些成分的不同类别、含量或 比例的不同，导致荧光峰出现较大的差别，通过对荧光信号的采集和分析，采用主成分荧光矩阵的方法对细菌多样性进行鉴别，同时考虑到环境因素如藻类、CDOM、以及无机颗粒对荧光有可能产生影响，采用主成分荧光光谱分析方法，建立海洋细菌多样性荧光识别模式。
所述方法泵为蠕动泵，管路采用聚四氟乙烯材料制成。
所述方法CCD探测元件采用美国海洋光学背照式二维面阵CCD光谱仪。
所述方法微型计算机数据分析处理系统中采用海洋细菌多样性荧光识别模式，该模型针对藻类以及CDOM等影响因子具有很好的修正作用，可以消除这些影响因子对计算分析海洋细菌丰度和多样性的影响。
本发明的工作原理是：
采用激光诱导荧光方法对细菌类别进行鉴别，主要因为细菌体内含有一些可以激发产生荧光的成分，如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、DNA，RNA，NADH，NADPH，FAD以及胞外酶等，这些成分的不同类别、含量或比例的不同，导致荧光峰出现较大的差别。这些物质的激发波长范围从250-450nm，而产生荧光的发射波长最大峰值出现在280-540nm之间。
海洋细菌体内外不同荧光目标物的最大激发波长和发射波长，如表1：
表1：荧光目标物光学特征
通过采用紫外激光诱导荧光技术检测海洋细菌在不同波长激发下产生的特征荧光信号，通过对荧光信号的采集和分析，找出不同细菌之间的荧光差异，实现对海洋细菌的多样性检测。检测需要建立海 洋细菌多样性荧光识别模式，海洋细菌荧光识别模式主要采用主成分荧光矩阵的方法对细菌多样性进行鉴别。
主要采用如下的计算方法：
If＝φ·I0·(1-10- ε· l · c)
式中，If是荧光强度，φ是量子产量，I0是入射光强度，ε是摩尔吸收度，l是样品的光径，c是荧光物质的摩尔浓度。
同时，考虑到环境因素如藻类、CDOM、以及无机颗粒对荧光有可能产生影响，采用主成分荧光光谱分析方法，对采集的荧光信号进行分析处理，寻找海洋细菌荧光分类的最佳识别指标，建立海洋细菌多样性的激光诱导荧光识别模式(如图3)。
根据上述反应原理可知，采用激光诱导荧光方法检测海洋细菌的过程当中，都会发出“特征光谱”。激光诱导荧光技术与细菌体内荧光物质的不同种类、含量以及比例有机地结合起来，通过分光系统得到以波长为横坐标和以光谱序列为纵坐标的平面色散图，再通过CCD探测元件，以光谱直读方式一次得到全谱，经软件对全谱进行分析可以检测到海洋细菌丰度和多样性。
近年来，激光诱导荧光(laser induced fluorescence，LIF)检测法作为一种新型的高灵敏度检测方式，近年来得到了快速发展和广泛的应用，是迄今为止灵敏度最高的光学检测方法，激光诱导荧光检测技术的灵敏度比普通荧光高1-3个数量级，其对荧光物质的检测限可以达到年nmol数量级，在适当的条件下甚至可以实现单分子检测，由于其具有灵敏度高、快速、便捷、连续测量、不需要培养等优势，因此，采用原位激光诱导荧光技术可以较好地对海洋细菌的丰度和多样性进行检测，可以作为海洋细菌丰度和多样性原位检测的一种重要方法，是一种非常理想的手段，具有现场、快速，简便，灵敏的特点。
CCD(Charge Coupled Devices)即电荷耦合阵列检测器，是一种以电荷量表示光强大小，用藕合方式传输电荷量的器件，它具有自扫描、光谱范围宽、动态范围大、体积小、功耗低、寿命长、可靠性高等优点.将CCD二维线阵放在光谱面上，一次曝光就可获得整个光谱.它具有的特点：
1.光谱范围宽，量子效率高(可达90％以上)，暗电流小，噪声低，可实现多道同时采集数据，它的结构特点，可作为光谱分析仪中的全谱直读探测元件，同时采集数据，获得波长—强度二维谱图。
2.通过时间序列积分可以探测非常微弱的光谱信号。获取时间分辨的光谱信号，进而实现光谱的快速分析。通过与激光诱导荧光光路系统结合CCD探测元件可以对光谱信号进行采集，时间序列积分后，可获得光谱强度随波长变化的二维光谱图，通过处理软件结合采用海洋细菌多样性荧光识别模式可以分析海洋细菌丰度和多样性。
CCD探测元件优点是所有的像元(N个)同时曝光，整个光谱可同时取得，比一般的单通道光谱系统检测同一段光谱的总时间快N倍，在摄取整个光谱的过程中不需要光谱仪进行机械扫描，不存在由于机械系统引起的波长不重复的误差；减少了光源强度不稳定引起的谱线相对强度误差；可测量光谱变化的动态过程。
整个系统是光、机、电、算一体化的光电探测系统。按工作模块可分成六部分：第一部分是激光诱导荧光，主要是针对细菌体内含有一些可以激发产生荧光的成分；第二部分是光学分光系统部分，主要通过分光器件将荧光波段在空间上分离开，遵循光色散原理；第三部分是光电转换和放大部分，以光电效应原理为基础，将空间上分开的光信号转变成电信号，我们主要采用CCD探测元件；第四部分是数据采集、记录部分，该部分完成电信号的采集、A/D转换、传输和存储：第五部分是控制部分，主要负责光电信号采集过程中的时序控制；第六部分是软件处理部分，主要结合海洋细菌多样性荧光识别模式进行分析和计算。
通过集成激光诱导荧光、光路系统、CCD检测元件对细菌体内含有一些可以激发产生荧光的成分进行实时定性、定量分析的方法是目前非常有效的海洋细菌丰度和多样性原位检测方法，是重要的发展方向。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (7)
1.一种基于激光诱导荧光的海洋细菌原位丰度和多样性的检测方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)通过泵输送被测水样溶液；
(2)水样溶液在泵的作用下，流经过滤柱，过滤柱内部填充氧化镁负载钴铁金属磁性纳米材料，并且具有控温装置，由于水体中含有粒径较大浮游植物，因此通过过滤柱可以过滤掉粒径大的浮游植物；
(3)流经过滤柱后的水样，进入荧光池，荧光池的窗口材料，靠近激发光源侧的采用纳米金刚石材料，主要消除水体拉曼散射，靠近探测窗口一侧的采用贴有石墨烯薄膜材料的硅玻璃，主要消除水体的荧光散射；
(4)利用高频的脉冲激发光源-深紫外激光二极管泵浦固体激光器产生连续波段，照射荧光池，利用在荧光池探测一侧的光谱分光器件-光栅进行空间分光，色散后形成λ1-λ2的光谱带；
(5)位于探测窗口处的CCD光电探测器同时采集λ1-λ2的光谱数据，通过内部转变和时间序列积分得到波长-光强二维光谱；
(6)数据处理系统中采用建立的海洋细菌多样性荧光识别模式，经过海洋细菌荧光识别模式计算分析海洋细菌丰度和多样性，所述海洋细菌多样性荧光识别模式是考虑到环境因素对荧光有可能产生影响，采用主成分荧光光谱分析方法，对采集的荧光信号进行分析处理，寻找海洋细菌荧光分类的最佳识别指标，建立海洋细菌多样性的激光诱导荧光识别模式。
2.根据权利要求1所述的基于激光诱导荧光的海洋细菌原位丰度和多样性的检测方法，其特征在于所述高频的脉冲激发光源，激发采用400nm，发射采用685nm，CCD光电探测器采集光谱数据，作为水体藻类影响因子；
所述高频的脉冲激发光源，激发采用340nm，发射采用430nm，CCD光电探测器采集光谱数据，作为水体CDOM影响因子；
所述高频的脉冲激发光源-深紫外激光二极管泵浦固体激光器产生连续波段275-450nm，照射荧光池，利用在荧光池探测一侧的光谱分光器件-光栅进行空间分光，色散后收集280-535nm的光谱带，位于探测窗口处的CCD光电探测器同时采集280-535nm的光谱数据，通过内部转变和时间序列积分得到波长-光强二维光谱。
3.根据权利要求1所述的基于激光诱导荧光的海洋细菌原位丰度和多样性的检测方法，其特征在于所述的水样流量为5.0-10.0ml/min。
4.根据权利要求1所述的基于激光诱导荧光的海洋细菌原位丰度和多样性的检测方法，其特征在于所述过滤柱内部填充氧化镁负载钴铁金属磁性纳米材料，控温装置的温度范围10-15℃。
5.根据权利要求1所述的基于激光诱导荧光的海洋细菌原位丰度和多样性的检测方法，所述的利用高频的脉冲激发光源-深紫外激光二极管泵浦固体激光器的高频范围100-150KHz。
6.根据权利要求1所述的基于激光诱导荧光的海洋细菌原位丰度和多样性的检测方法，其特征在于所述的泵为蠕动泵，管路采用聚四氟乙烯材料制成。
7.根据权利要求1所述的基于激光诱导荧光的海洋细菌原位丰度和多样性的检测方法，其技术特征在于CCD探测元件采用美国海洋光学背照式二维面阵CCD光谱仪。
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