CN1644709A

CN1644709A - 一种用短串联重复序列位点等位基因阶梯的个体识别dna鉴定方法及其检测试剂盒

Info

Publication number: CN1644709A
Application number: CN 200410025157
Authority: CN
Inventors: 陈光辉; 李莉; 王亚新
Original assignee: EXPERT TESTIMONY SCIENCE-TECHNOLOGY INST JUDICAL DEPARTMENT; SHANGHAI SHENYOU JIANHAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY LLC
Current assignee: EXPERT TESTIMONY SCIENCE-TECHNOLOGY INST JUDICAL DEPARTMENT; SHANGHAI SHENYOU JIANHAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY LLC
Priority date: 2004-06-15
Filing date: 2004-06-15
Publication date: 2005-07-27

Abstract

本发明公开一种用短串联重复序列位点等位基因阶梯的个体识别DNA鉴定方法及其检测试剂盒，其特征是采用三色荧光标记STR位点等位基因阶梯的制备技术，步骤如下：筛选用于个体识别DNA检测的STR位点；设计合成特异PCR扩增普通引物和分组荧光标记引物；收集人体组织样本；提取人基因组DNA；进行PCR反应；电泳检测扩增片段，割胶纯化；将PCR产物连接到载体上，得到各不同等位基因的克隆；用对应的荧光标记引物对每个等位基因进行PCR，制备不同的各等位基因；根据扩增产物的荧光值检测定量各等位基因；混合各STR位点的各等位基因的PCR扩增产物，加入试剂稳定剂，即可得到等位基因阶梯，该等位基因阶梯用于个体识别DNA荧光检测试剂盒，达到基因分型识别的功能。本发明无需反复收集具有不同基因型个体的血标本，具有制作简便、成本低、稳定性好。

Description

一种用短串联重复序列位点等位基因阶梯的个体识别DNA鉴定方法及其检测试剂盒

一、技术领域：

本发明涉及基因工程技术领域，可用于法医物证生物学、人类学、遗传学和肿瘤学等领域的个体识别、亲权鉴定以及遗传和肿瘤的诊断方面，特别属于应用基因工程方法制备的一种适用于荧光检测多重复合STR基因位点，对其进行基因分型的STR等位基因阶梯，用于个体识别DNA检测鉴定。

二、背景技术：

人类基因组DNA有3×10⁹bp，其中10％是串联重复序列，被称为卫星DNA。按重复单位的长短，又可分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星。其中重复单位仅由2～7bp组成的微卫星，又称为短串联重复序列(short tandem repeat，STR)。不同个体基因组的卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此形成了极其复杂的等位基因片段长度多态性。根据这一规律，近几年在法医学法、考古学、遗传学和肿瘤学领域建立了一种崭新的对个体进行个体识别、亲权鉴定以及对遗传和肿瘤进行诊断的STR-PCR(短串联重复序列聚合酶链反应)技术。在这一技术中，为了准确的给各等位基因进行定位和识别，必须设置与各等位基因相对应的等位基因阶梯(Allelic ladder，AL)为标准参照物(Markers)。因等位基因阶梯中的每一基因片段的长度均是已知的，将它与各待测样品的扩增产物在相同电泳条件下的泳道上进行电泳分离，进行对比，就很容易判断待测样品的基因型，所以，等位基因阶梯在STR-PCR的结果判断中至关重要。

目前国内制备各STR位点等位基因阶梯的方法有两种：一种是从人基因组的每个位点上筛选能代表各等位基因片段的不同基因型样本扩增，得到的不同片段产物混合后直接用于等位基因阶梯；另一种方法是将能代表某位点上所有等位基因的扩增产物混合物，稀释后再次扩增，将再次扩增的产物用作等位基因阶梯。该两种方法的不足之处：

1、有些STR遗传标记位点在中国人群(蒙古人种)中遗传多样性较低，多态性信息量较少，在个体识别DNA检测时不适合于东亚和东南亚人。

2、直接选择人基因组DNA作为扩增模板时，由于各等位基因的长度不同，易出现优势扩增现象，即长度较短的等位基因容易被扩增，而长度较长的等位基因则不易被扩增，使扩增产物的量不同，由此制备的等位基因阶梯的各等位基因的量不一，甚至出现不扩增，即无扩增产物，无法检测到的现象。

3、要批量生产，必须要经常去挑选和制备能代表所有等位基因片段的模板，不但工作量大，而且每次用的同一模板的纯度及含量等均有出入，使其扩增条件难以标准化。

4、人基因组DNA的分子量大，结构及其复杂，极容易出现非特异扩增更加严重，不适合批量生产。

5、人基因组DNA扩增产物混合后再次进行扩增，由于PCR产物相对于细菌培养和组织中的DNA片段生物活性降低，其非特异扩增更加严重。此法不适合批量生产。

6、扩增产物的混合物直接用于等位基因时，在短时间内可能出现降解，使其各条带模糊不清，或者构型有所改变使其电泳迁移发生变化。由于这些原因引起的质量变化均不能作为标准参照物使用。

7、目前国内生产的等位基因阶梯使用的检测方法主要是银染法，该方法操作繁杂，背景高，检测灵敏度和分辨率都较低，易产生不确定甚至误判的结果。对于法医鉴定等高要求、严肃性的工作技术手段相对落伍。

8、制备的等位基因阶梯均为一至三个STR位点各等位基因的混合，没有实现更多个STR位点的同时检测。

三、发明内容：

为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供一种用短串联重复序列位点等位基因阶梯的个体识别DNA鉴定方法及其检测试剂盒。它无需反复收集具有不同基因型个体的血标本，能有效地降低成本。

本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明方法采用三色荧光标记STR位点等位基因阶梯的制备技术的步骤：

调查STR位点在中国人群及其他人群中的等位基因分布及其频率；

筛选16至20个STR位点用于个体识别DNA检测；

设计合成所选各STR位点的特异PCR扩增普通引物和分组荧光标记引物，荧光标记分三组，分别为蓝色、绿色、黄色；

调查收集含有所选各STR位点的不同等位基因的人体组织样本；

从人有核细胞中提取人基因组DNA；

利用提取的DNA和合成的普通引物分别对各STR位点进行PCR反应；

电泳检测扩增片段，割胶纯化；

将PCR产物连接到载体上，得到各STR位点不同等位基因的克隆；

将单克隆转化到大肠杆菌中，得到含有各等位基因的质粒；

利用质粒模板将每个等位基因用对应的荧光标记引物分别进行PCR，制备不同的各等位基因；

根据各个PCR扩增产物的荧光值检测定量各等位基因；

按比例等摩尔量混合各STR位点的各等位基因的PCR扩增产物，用荧光检测法测定，调节各产物的比例，加入试剂稳定剂，即可得到等位基因阶梯。

上述所述电泳系统采用遗传分析仪(测序仪)毛细管电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，激光激发荧光信号，CCD检测收集信号。

上述STR位点可以涉及人类46条染色体上的所有STR位点，即包括常染色体、X染色体及Y染色体上的STR位点。

上述引物为荧光染料标记的引物及非荧光染料标记的引物，这些引物的长度为15～40个核苷酸。

一种用短串联重复序列位点等位基因阶梯的个体识别DNA鉴定方法形成的检测试剂盒，该盒内设有：

多组荧光标记等位基因阶梯；

一套与各STR位点对应的三色荧光染料标记的引物及未标记的引物；

红色荧光标记DNA分子量内参照标准；

PCR反应各组分；

金牌Taq酶；

阳性对照DNA。

本发明具有以下的特点：

1、本发明选择在中国人群和其它人群中有高度多态性的16至20个STR位点，有很高的针对性、特异性，联合分辨率和个体识别能力高。

2、本发明制备的等位基因阶梯为多色荧光标记。

3、本发明自建多重PCR复合扩增体系，具有稳定性、高效性、重复性。

4、多色荧光标记和多重PCR复合扩增体系实现了多个STR位点的同时检测分析。

5、对于所选择的16至20个位点，有自己独特的引物设计和荧光标记制造工艺。

6、用于扩增各等位基因的模板是通过分子克隆技术制备的，该模板的DNA序列经测序验证，与人基因组DNA上同一位点的序列完全相同，因此用这两种不同的模板得到的扩增产物的DNA序列及构型完全一致，从而使这两种扩增产物的电泳迁移率保持一致，确保了基因分型结果更加科学准确。

7、通过分子克隆技术得到的模板长度远远小于人基因组DNA的长度，容易线性化和解链，在相同条件下，得到的扩增产物远高于人基因组DNA扩增的量，而且非特异性扩增产物也远少于人基因组DNA的扩增产物，所以容易批量生产。

8、各等位基因片段是一条一条制备的，然后分别测定其含量，再按比例等摩尔量混合后制成等位基因阶梯，这样就确保了各等位基因峰高的一致性。

9、用分子克隆技术制备的模板更容易做到定性定量测定，一次标准化的模板可以用好多年，这不但大大地简化了反复从人的有核细胞中去寻找核提取各等位基因模板的烦琐工作，更主要的使尽可能地避免了因为每批模板质量的差异，使生产的更加容易标准化和产品质量更加稳定。

10、本发明采用了独特的荧光分子量内标制备方法，用PCR方法，提高了产品的稳定性和产量。

本发明除了具有现有技术的优点之外，还具有如下的优点：

1、无需反复收集具有不同基因型个体的血标本；

2、制作流程简便，周期短，操作简单；

3、制作成本低，经济实用；

4、试剂盒能批量生产，稳定性好。

四、具体实施方式：

一种用短串联重复序列位点等位基因阶梯的个体识别DNA鉴定方法，采用三色荧光标记STR位点等位基因阶梯的制备技术的具体步骤：

1、从人的有核细胞中提取DNA：取抗凝血20ul，加红细胞裂解液0.5ul左右，充分混匀后，5000rpm离心5分钟，再用红细胞裂解液洗两遍，沉淀加20ul白细胞裂解液，混匀后，100℃煮10分钟，取1ul进行PCR扩增。

2、设计合成所选各STR位点的特异PCR扩增普通引物和分组荧光标记引物，荧光标记分三组，分别为蓝色、绿色、黄色。

3、按照国内外公开发表的各STR位点PCR方法进行扩增，以寻找各位点的等位基因型。

4、PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、EB染色。

5、用透析袋电洗脱法回收DNA片段，用酚-氯仿抽提纯化DNA片段。

6、用TAKARA T-Vector试剂盒将DNA连接到载体上，将含有DNA片段的载体转化到大肠杆菌中，过夜培养，即PMD18-T Vector 0.5ul，Solution 1 2.5ul，经纯化的PCR产物适量，加水至20ul，4℃过夜，再转化到大肠杆菌中，然后从选择培养基平板上挑取单菌落，从中选择所需要的重组菌。

7、按照申友试剂盒(或其他公司的同类产品)说明书提取质粒：即将LB液体培养基培养的重组菌转移到2ml离心管中，最高速度离心30秒，弃上清，加250ulS1液，振荡至彻底悬浮；加入250ulS2溶液，立即温和地上下翻转离心管5～10次以混匀，；加入400ul4oC预冷的S3液，立即温和并充分地上下翻转离心管5～10次以混匀，室温静置2min，最高速离心10min；将上清转移到DNA吸附柱中，离心2min，弃虑液；加入500ulW1溶液，离心30s，弃虑液；加入700ulW2液，离心30s，弃虑液；再加入700ulW2液，离心30s，弃虑液；将吸附柱放入同一收集管中，最高速离心1min；移入新的1.5ml离心管中，在DNA吸附膜中央加60ul洗脱液，室温静置1min，离心1min洗脱DNA，保存备用。

8、利用质粒模板将每个等位基因用对应的荧光标记引物分别进行PCR，制备不同的各等位基因。

9、根据各个PCR扩增产物的荧光值检测定量各等位基因。

10、摩尔量混合各STR位点的各等位基因的PCR扩增产物，用荧光检测法测定，调节各产物的比例，加入试剂稳定剂，即可得到等位基因阶梯。

由上述方法制备的具有三色荧光标记STR位点等位基因阶梯用于个体识别DNA荧光检测试剂盒，该试剂盒装有如下组分：

多组荧光标记等位基因阶梯；

红色荧光标记DNA分子量内参照标准；

PCR反应各组分；

金牌Taq酶；

阳性对照DNA。

以上各组分独立分装，前两种本发明已说明，其他四种组分均为市场商品，使用时按常规PCR方法进行，在遗传分析仪上电泳检测，收集信号，分析结果。

Claims

1.一种用短串联重复序列位点等位基因阶梯的个体识别DNA鉴定方法，其特征在于采用三色荧光标记STR位点等位基因阶梯的制备技术的步骤：

筛选16至20个STR位点用于个体识别DNA检测；

从人有核细胞中提取人基因组DNA；

电泳检测扩增片段，割胶纯化；

将单克隆转化到大肠杆菌中，得到含有各等位基因的质粒；

根据各个PCR扩增产物的荧光值检测定量各等位基因；

按比列等摩尔量混合各STR位点的各等位基因的PCR扩增产物，用荧光检测法测定，调节各产物的比例，加入试剂稳定剂，即可得到等位基因阶梯。

2.根据权利要求1所述的用短串联重复序列位点等位基因阶梯的个体识别DNA鉴定方法，其特征是：所述电泳系统采用遗传分析仪(测序仪)毛细管电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，激光激发荧光信号，CCD检测收集信号。

3.根据权利要求1所述的用短串联重复序列位点等位基因阶梯的个体识别DNA鉴定方法，其特征是：所述的STR位点可以涉及人类46条染色体上的所有STR位点，即包括常染色体、X染色体及Y染色体上的STR位点。

4.根据权利要求1所述的用短串联重复序列位点等位基因阶梯的个体识别DNA鉴定方法，其特征是：引物为荧光染料标记的引物及非荧光染料标记的引物，这些引物的长度为15～40个核苷酸。

5.一种由权利要求1个体识别DNA鉴定方法形成的检测试剂盒，其特征是：该三色荧光标记STR位点等位基因阶梯的个体识别DNA荧光检测试剂盒内设有如下组分：

多组荧光标记等位基因阶梯；

红色荧光标记DNA分子量内参照标准；

PCR反应各组分；

金牌Tag酶；

阳性对照DNA。