CN1155720C

CN1155720C - 鉴别蓝藻的核酸分子探针和方法

Info

Publication number: CN1155720C
Application number: CNB001172417A
Authority: CN
Inventors: 陈月琴; 周惠; 屈良鹄
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2000-07-07
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2004-06-30
Anticipated expiration: 2020-07-07
Also published as: CN1275717A

Abstract

本发明属于利用分子生物学方法检测环境微生物的技术领域。本发明提供了来源于蓝藻rDNA间隔区核苷酸序列的核酸分子探针，以及利用该探针鉴别蓝藻的方法。利用本发明，可方便、快速、准确地鉴别蓝藻(包括淡水水华蓝藻、海洋赤潮蓝藻等)，具有客观、准确、自动化等特点。

Description

鉴别蓝藻的核酸分子探针和方法

技术领域

本发明属于利用分子生物学方法检测环境(水域)微型生物的技术领域，具体地说，是涉及一种用于鉴别蓝藻的核苷酸序列以及核酸分子探针和用其鉴别蓝藻的方法。

背景技术

蓝藻(Cyanophyta)，又称蓝细菌，是引起全球淡水水体有害有毒水华及海洋有害赤潮的主要类群之一。有毒种类所产生毒素不仅可造成神经毒害，而且可诱发肝癌。蓝藻毒素引起的野生动物、家畜中毒甚至死亡的事例世界各地已有许多报导，因此，对这些有毒种类及其分布进行迅速准确的鉴定已成为目前环境微生物学研究的热点之一。

属蓝藻的种类繁多，迄今为止，发现数十种是引发淡水水华的常见种类，且产生毒素。有毒蓝藻是鱼业进出口的必检项目。然而，蓝藻许多种类，其形态具有多变性，某些种类还含有只有真核细胞才具有的色素，表现出真核藻的特性，造成了鉴定上的混乱，加上其个体微细，分离培养较为困难，传统分类鉴别难度较大。

迄今为止，国际上有关蓝藻水华控制方法等方面的研究和专利已有不少报导，但是尚未见有关于蓝藻基因鉴别的标准和技术的研究报导。近年来，随着海洋及内陆水体富营养化的加剧，蓝藻水华分布范围及出现频率明显增加，对蓝藻的研究已引起人们的高度重视。鉴于蓝藻分类鉴定中存在的问题，采用新方法新技术快速识别蓝藻资源具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供蓝藻基因鉴别的标准和技术，它可以从遗传本质上客观准确地鉴别蓝藻类群。具体包括：1.提供用于蓝藻鉴定的基因片段；2.提供来源于上述基因片段的蓝藻专一性核酸分子探针；3.提供利用上述核酸分子探针鉴别蓝藻的方法。

本发明的发明人在对蓝藻不同种类的研究中发现，蓝藻的rDNA间隔区具有与其它生物完全不同的一段20个寡核苷酸长的核苷酸序列，该段核苷酸序列在蓝藻中具高度保守性，可作为蓝藻的特征性核苷酸序列，用于鉴别蓝藻类群。根据该特征性核苷酸序列，可以制备出蓝藻rDNA间隔区的专一性核酸分子探针，建立快速、准确鉴别蓝藻的分子生物学方法。

本发明提供的用于鉴别蓝藻的核苷酸序列来源于铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa，蓝藻中的一种，为97年诱发我国厦门西海域的赤潮藻之一)的rDNA间隔区(即核糖体rRNA基因转录间隔区)序列，该序列的位置及结构特征如图1和序列表1所示。

该序列(SEQ ID NO1)可通过如实施例1所述的方法得到；或者按已知的该序列核苷酸组成与排列，在商业化的DNA自动合成仪上按常规方法合成而得到。

本发明的蓝藻专一性核酸分子探针是以上述铜绿微囊藻rDNA间隔区核苷酸序列为基础，并通过Internet(因特网)与国际分子生物学数据库中的其它蓝藻种类比较设计出来的。该分子探针为rDNA间隔区2(tRNA基因与23S rRNA基因之间)中的一段20个核苷酸组成的寡核苷酸序列或其互补序列，或者是上述寡核苷酸序列再经修饰、变化，且其核苷酸变化量不超过总核苷酸量的10％的序列。

本发明的上述蓝藻专一性核酸分子探针为序列表2所示的序列(简称Cyano 20)或者为该序列的互补序列：5’CTATGCAGTTTTCAAGGTTC 3’。

本发明的上述蓝藻专一性核酸分子探针，可按照预先根据铜绿微囊藻rDNA间隔区序列设计好的序列，通过常规的DNA合成方法合成而得到(例如可以使用商业化的DNA自动合成仪进行合成)。该探针可以通过放射性同位素、酶、生物素、荧光剂或化学荧光素结合进行标记。

本发明上述的蓝藻专一性核酸分子探针，具有极高的蓝藻专一性，能与蓝藻种类专一性反应，但不与其它真核藻或原核细菌的DNA发生反应。所以，利用该核酸分子探针，通过PCR方法或核酸分子杂交法可以快速、准确地鉴别蓝藻(包括诱发淡水水华或海洋赤潮的种类，或者具有真核藻色素的海洋超微型种类等)。

本发明所提供的蓝藻鉴别方法，可采用核酸分子杂交法或PCR方法，分述如下：

核酸分子杂交法：采用前面所述的本发明的核酸分子探针，以通用的核酸分子杂交方法(例如Southern杂交或点杂交)对蓝藻进行鉴定。具体步骤和过程(包括探针的标记和待测样品的预处理)，按常规的分子生物学方法进行。

该方法可以对淡水或海水自然生长的蓝藻样品直接检测，也可以先将样品中的蓝藻DNA提取扩增，再加以检验。

PCR方法：以前面所述的本发明的核酸分子探针为一个PCR引物，与另一个原核生物通用PCR引物(例如16N6：5’GAAGTCGTAACAAGGTAGCCG3’或23R：5’NNGGGTTTCCCCATTCGGAAA3’，其中N代表碱基A，C，G或T)或某一蓝藻种类的专一性引物配对，进行PCR反应。具体步骤和过程按常规PCR方法的操作过程进行。

采用该PCR方法可快速、准确地检测鉴别蓝藻，而且样品用量少。

由于本发明所提供的蓝藻核酸分子探针为蓝藻的专一性序列，因此在样品未知的前提下，可以通过检测样品中是否存在该段寡核苷酸序列，快速方便检测样品，如可准确快速检测发生水华或赤潮时鱼、虾、贝类体内是否含有有毒蓝藻，并且通过探针的标记，定量检测蓝藻的个体数，起到预防预报的作用，避免人类中毒事件发生。

附图说明

图1是核糖体rRNA基因结构示意图，其中ISR2(间隔区2)为本发明所涉及的核苷酸序列(包括蓝藻专一性探针)存在的区域。

图2是铜绿微囊藻rDNA间隔区多核苷酸序列结构示意图，其中带上划线的黑体部分(306-325bp)为本发明的蓝藻专一性寡核苷酸分子探针Cyano 20。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步说明：

实施例1 铜绿微囊藻rDNA间隔区多核苷酸序列的制备

用牙签或枪尖挑取少量铜绿微囊藻藻体，放入含100微升提取缓冲液(1％SDS，10mM EDTA pH8.0，10mM Tris-Hcl pH7.6)的小指管中，摇匀，65℃保温0.5-2小时，用DPS纯化试剂[包括玻璃粉，6M NaI，洗液(84mM Tris-Hcl，40uM EDTA，60％乙醇，80mM KAC)]纯化后，凉干，加入50-100微升PCR反应液(100微升PCR反应液成份：10X Taq DNA聚合酶缓冲液10微升；2mM dNTP溶液10微升；引物为M16：5’GGGGATGCCTAAGGCAGGGCT3’0.5 微升；引物为M23：5’CCACGTCCTTCTTCGCCTCTG3’0.5微克；Taq DNA聚合酶2.5单位，加无菌水定容至100微升)，加50微升矿物油，放于PCR仪上，按下列程序进行PCR反应：94℃ 5min，94℃、55℃和72℃各1min，30个循环，然后是72℃5min。反应完成后，除去矿物油，用PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Germany)纯化PCR产物，得到所需的核苷酸序列。纯化后的PCR产物于商业化的DNA自动测序仪上测定，得到如序列表1的核苷酸组成与排列。

实施例2 蓝藻专一性核酸分子探针的制备

在获得微囊藻rDNA间隔区核苷酸序列的基础上，将所得序列与其它蓝藻或真核藻及原核细菌同源序列进行排列比较，得出Cyano 20(如图2所示的306-325bp)或其互补序列的核苷酸组成和排列是用于蓝藻类群鉴别的良好寡核苷酸片段。根据Cyano 20或其互补序列的核苷酸组成的排列，在商业化的DNA自动合成仪上进行化学合成，得到如序列表2所示的核苷酸序列或其互补序列。

实施例3蓝藻的鉴别(常规PCR方法)

(1)样品预处理

用牙签或枪尖挑取少量样品(例如水样或鱼、虾、贝类消化道内的内含物)，放入含20微升提取缓冲液中(1％ SDS，10mM EDTA pH8.0，10mM Tris-Hcl pH7.6)，摇匀，用DPS纯化试剂[包括玻璃粉，6M NaI，洗液(84mM Tris-Hcl，40uM EDTA，60％乙醇，80mM Kac)]纯化后，凉干、备用。

(2)100微升PCR混合液中成份

蓝藻专一性探针Cyano 20 0.5微克

原核生物通用引物16N6 0.5微克

10X Taq DNA聚合酶缓冲液 10微升

2mM dNTP溶液 10微升

Taq DNA聚合酶 2.5单位

以上用无菌水定容为100微升

(3)PCR操作

取2个0.5毫升小指管，分别加入20微升PCR混合液，然后一管加入样品DNA，另一管仅加PCR混合液(对照)，各管中加50微升矿物油，放于PCR仪上，按下列程序进行PCR反应：94℃5分钟，94℃、55℃和72℃各1分钟，并且连续循环30次，然后72℃5分钟。反应完成后，每管加入5微升载样液(30％Fcol，0.25％溴酚兰)。取4微升点样于2％的琼脂糖凝胶中，电泳结果显示：采用引物Cyano 20/通用引物进行PCR检测，若样品中含有蓝藻为阳性反应(1-多条PCR扩增带，扩增带数目多少取决于样品中蓝藻种类数量)，不含蓝藻则为阴性反应(无PCR扩增带)，说明了Cyano 20的专一性。

本方法具有如下优点：

(1)简便快速。常规DNA制备需1至数小时，该方法在样品预处理时只需求20-30分钟即可(扩增时间除外)。

(2)样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作。

(3)准确、灵敏度高，Cyano 20为蓝藻专一性核酸分子针，若为其它藻类，为阴性反应。

(4)不使用有毒试剂。

序列表1

1.序列特征：长度：359bp，类型：核酸，链数：双链，几何结构：线性；

2.分子类型：核糖体DNA

3.来源：铜绿微囊藻

4.序列描述：SEQ ID NO.1

AGGGAGACCT AATTCAGGTA GGAGACGAAA AAAAAGTAGT CGCTACCAAG 50

AATCAATCCC AAAAGGTCGG AGCGAGGCGA AATTGGCTTT CAAACTAGGT 100

TCTGGGCTCA TAAAAGACCT GAATCAGGAA CAAGGGCTAT TAGCTCAGGT 150

GGTTAGAGCC GCCACCCCTG ATAAGGGTGA GGTCCCTGGT TCGAGTCCAG 200

GATGGCCCAC CTGCACAGGT GGCAAAAACA AAGAAGCGAG GAATCAGCAC 250

CTTATCTTAC TGACATAGTA AGAGAGAATG CTGGCTCTGA GTAAAGAGTC 300

CAGAGGAACC TTGAAAACTG CATAGAGCTA GGTGAAAAAG CCAAAAAAGA 350

AGACCGCAA 359

序列表2

1.序列特征：长度：22bp，类型：核酸，链数：单链，几何结构：线性；

2.分子类型：DNA

3.来源：蓝藻

4.序列描述：SEQ ID NO.2

GAACCTTGAAAACTGCATAG

Claims

1.一种鉴别蓝藻的核酸分子探针，其特征是其核苷酸序列为：

Cyano20：5’GAACCTTGAAAACTGCATAG 3’或其互补序列：5’CTATGCAGTTTTCAAGGTTC 3’。

2.一种蓝藻分子生物学鉴别方法，其特征是采用核苷酸序列为：5’GAACCTTGAAAACTGCATAG 3’或其互补序列：5’CTATGCAGTTTTCAAGGTTC 3’的核酸分子探针，以通用的核酸分子探针杂交方法进行检验鉴定。

3.一种蓝藻的分子生物学鉴别方法，其特征是采用聚合酶链式反应方法，以核苷酸序列为：5’GAACCTTGAAAACTGCATAG 3’或其互补序列：5’CTATGCAGTTTTCAAGGTTC 3’的核酸分子探针为一个聚合酶链式反应引物，再与另一个原核生物或真核生物通用聚合酶链式反应引物配对，进行聚合酶链式反应。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征是所说的核酸分子探针的核苷酸序列为：5’GAACCTTGAAAACTGCATAG 3’或其互补序列：5’CTATGCAGTTTTCAAGGTTC 3’，所说的原核生物或真核生物通用聚合酶链式反应引物为16N6：5’GAAGTCGTAACAAGGTAGCCG3’或23R：5’NNGGGTTTCCCCATTCGGAAA3’，其中N代表碱基A，C，G或T。