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CN1596303A - 利用基质细胞支持胚胎干细胞和成体干细胞的方法和组合物 - Google Patents

利用基质细胞支持胚胎干细胞和成体干细胞的方法和组合物 Download PDF

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CN1596303A CNA028235827A CN02823582A CN1596303A CN 1596303 A CN1596303 A CN 1596303A CN A028235827 A CNA028235827 A CN A028235827A CN 02823582 A CN02823582 A CN 02823582A CN 1596303 A CN1596303 A CN 1596303A
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Abstract

本发明提供了基于利用基质细胞支持体外未分化的胚胎干细胞或成体干细胞增殖的细胞、组合物和方法。该方法产生的干细胞可用于提供未定型的或分化的和有功能的细胞的来源用于研究、移植和形成组织工程产品，用来治疗人类疾病以及体内任何组织或器官部位的创伤性组织损伤修复。

Description

利用基质细胞支持胚胎干细胞和成体干细胞的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2001年11月9日递交的美国序列号No.60/344,555的优先权。
发明领域
本发明提供了利用来源于脂肪组织、骨、骨髓、软骨、结缔组织、包皮、韧带、外周血、胎盘、平滑肌、骨骼肌、腱、脐带或其它部位的基质细胞分离、培养及维持胚胎干细胞或成体干细胞的方法和组合物及其用途。
发明背景
胚胎干细胞来自于胚泡期胚胎的内细胞团[Odorico等2001，StemCells 19：193-204；Thomson等1995.Proc Natl Acad Sci USA.92：7844-7848；Thomson等1998.Science 282：1145-1147]。这些细胞被不同地描述为多能和全能干细胞。它们的区别特点在于它们产生分化的子细胞的能力，所述子细胞代表了胚胎所有三个胚层以及支持发育的胚胎外细胞。已从胚胎其它部位和成体组织中分离到干细胞。能够分化为反映胚胎所有三个胚层的细胞的多能或全能干细胞可从发育胚胎的原生殖嵴中分离、从畸胎癌中分离以及从非胚胎组织中分离，所述非胚胎组织包括但不限于骨髓、脑、肝、胰腺、外周血、胎盘、骨骼肌和脐带血。这些细胞表现出许多共性。它们表现出高水平的碱性磷酸酶活性[Shamblott等1998，Proc Natl Acad Sci USA 95：13726-13731]。它们也表达高水平的端粒酶-一种催化向染色体末端添加端粒重复单位的核糖核蛋白。这种活性维持染色体的长度并与细胞的永生有关[Odorico等2001，Stem Cells 19：193-204]。
人类来源的胚胎干细胞表达细胞表面标志，包括但不限于阶段特异性胚胎抗原3和4(SSEA-3和SSEA-4)、高分子量糖蛋白TRA-1-60和RA-1-81以及碱性磷酸酶[Amit M等2000，Dev Biol 227：271-278；Odorico等，Stem Cells 19：193-204]。在它们的未分化状态，胚胎干细胞保留其表达转录因子Oct 4的能力；随着分化定型，Oct 4的水平下降[Reubinoff等，2000，Nature Biotechnology 18：399-404.；Schuldiner等2000，Proc Natl Acad Sci USA 97：11307-11312]。
胚胎干细胞响应一组细胞因子而经历细胞系特异性分化。来自文献的代表性的实例引用如下，但这种列举并非全面或穷尽的。转化生长因子β1和活化素A抑制内胚层和外胚层分化而促进中胚层细胞系例如骨骼肌和心肌[Schuldiner等2000，Proc Natl Acad Sci USA 97：11307-11312]。视黄酸、碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白4以及表皮生长因子诱导外胚层(皮肤、脑)和中胚层(软骨细胞、造血)细胞系[Schuldiner等2000]。其它因子，例如神经生长因子和肝生长因子，促进沿所有三个胚胎细胞系(外胚层、内胚层、中胚层)的分化。还有其它因子例如血小板衍生生长因子促进胶质细胞分化[Brustle等1999，Science 285(5428)：754-6]。将胚胎干细胞移植到免疫缺陷小鼠的骨骼肌组织或其它组织部位引起畸胎癌的形成，呈现出肠样结构、神经上皮、软骨、横纹肌、肾小球及其它组织类型的分化[Thomson等1998，Curr Top Dev Biol 38：133-165；Amit等2000，DevBiol 227：271-278；Reubinoff等2000，Nature Biotechnology 18：399-404]。备选地，胚胎干细胞在体外作为胚状体培养时分化成为来自所有三个胚层的细胞[Itskovitz-Eldor J等2000，Mol Med 6：88-95；Reubinoff等2000，Nature Biotechnology 18：399-404]。
目前分离和维持胚胎干细胞和其它干细胞细胞系的方法依赖于鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的应用。在共培养之前，MEF被辐照(辐照水平在35-50戈瑞之间)以减少细胞增殖而不损害代谢功能[Shamblott等1998，Proc Natl Acad Sci USA 95：13726-13731；Amit等2000，DevBiol 227：271-278]。胚胎干细胞通过免疫切除法分离自胚泡期胚胎的内细胞团[Reubinoff等2000，Nature Biotechnology 18：399-404；Thomson等1998，Science 282：1145-1147；Odorico等2001，Stem Cells19：193-204]。用链霉蛋白酶消化透明带，利用抗-人血清抗体接着暴露于豚鼠补体通过免疫切除术分离内细胞团，并将所得的细胞涂布到辐照的MEF饲养层培养物上[Reubinoff等2000，NatureBiotechnology 18：399-404；Thomson等1998，Science 282：1145-1147]。备选地，机械解聚以及胰蛋白酶/EDTA消化或者透明质酸酶/胶原酶IV/DNA酶消化后，从5到9周的受精后人胚胎的生殖嵴和肠系膜中分离细胞，随后涂布到MEF饲养层上[Shamblott等1998，Proc Natl Acad Sci USA 95：13726-13731]。培养物在Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(无丙酮酸，高葡萄糖配方)、敲除Dulbecco′s改良Eagle′s培养基或补充有15-20％胎牛血清或15-20％敲除SR(Gibco/BRL，Gaithersburg MD)、对胚胎干细胞生长优化的血清替代品[Price等WO98/30679]、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM 2-巯基乙醇、2mM谷氨酰胺、抗生素并添加高达2,000单位/ml的人重组白血病抑制因子(LIF)、高达4ng/ml的人重组碱性成纤维细胞生长因子和高达10μM的毛喉素的等价培养基的存在下维持[Amit等2000，Dev Biol 227：271-278；Reubinoff等2000，Nature Biotechnology18：399-404；Shamblott等1998，Proc Natl Acad Sci USA 95：13726-13731；Thomson等1998，Science 282：1145-1147]。
注意到用血清替代品时胚胎干细胞克隆的频率升高数倍[Amit等2000，Dev Biol 227：271-278]。碱性成纤维细胞生长因子的存在对于克隆胚胎干细胞的持续非分化增殖是必需的。bFGF、LIF和毛喉素的组合存在与形成紧凑致密的多细胞人胚胎干细胞集落有关，这与其它灵长类动物(恒河猴)中观察到的平展松散的集落相反[Shamblott等1998，Proc Natl Acad Sci USA 95：13726-13731]。9到15天后，通过暴露于具有1mM EDTA或其它二价阳离子螯合剂的无钙无镁磷酸缓冲盐溶液、通过暴露于分散酶(10mg/ml)、或者通过用微量移液器机械分离而将单个集落分离成块[Thomson JA，Itskovitz-Eldor J，Shapiro SS，等1998.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.Science 282：1145-1147]。所得的细胞或细胞块序贯涂布到新鲜培养基中辐照的小鼠胚胎成纤维细胞上[Thomson JA等1998，Science 282：1145-1147；Reubinoff等2000，Nature Biotechnology 18：399-404]。克隆按每7天的数量级扩增，并表现出大约36小时的倍增时间[Amit等2000，Dev Biol 227：271-278]。克隆随后的传代通过重复细胞解体操作(消化、微量移液器处理)以及通过将所得的细胞涂布到辐照的MEF上来进行[Amit等2000，Dev Biol 227：271-278]。
目前分离、培养和扩增人胚胎干细胞的方法受到它们对鼠胚胎成纤维细胞饲养层的依赖性的限制。这种鼠MEF被用来分离现有的60种人干细胞克隆的事实对于在临床治疗中利用这些细胞构成障碍[Gillis J，Connolly C.August 24，2001.″Taint of mouse cells mighthinder stem researchers″.Washington Post]。虽然研究者或许已经开始探索利用细胞因子和胞外基质补充物来避免在人胚胎干细胞以及来自其它组织和供体部位的干细胞的生长中利用鼠胚胎成纤维细胞饲养层，这种研究还处于初期[Carpenter等，Exp Neurol 158：265-278；Odorico 2001，Stem Cells 19：193-204]。不过，Schiff的国际专利WO01/51616公开了在缺乏饲养细胞例如MEF时培养人多能干细胞的方法。全能干细胞能在缺乏饲养细胞时无限地维持于未分化的状态仍待证明[Odorico 2001，Stem Cells 19：193-204]。
因此，本发明的目的在于提供协助分离、培养和维持干细胞的方法及组合物。
发明概述
本发明提供了包括利用组织来源的基质细胞(包括脂肪来源的基质细胞)作为饲养层以分离、培养和维持成体干细胞、胚胎干细胞和其它干细胞的方法和组合物。提供了通过辐照的脂肪来源的基质细胞而稳定可靠地支持干细胞的方法和组合物。
在本发明的一个方面，向分离的组织来源的细胞补充额外的生长因子、细胞因子和趋化因子以分离、培养和维持干细胞。
在本发明的另一个方面，分离的组织来源的细胞(包括脂肪来源的组织细胞)在培养基补充额外的生长因子、细胞因子和/或趋化因子之前被辐照。或者，分离的组织来源的细胞在培养基补充额外的生长因子、细胞因子和/或趋化因子之后被辐照。
又在本发明的另一个方面，组织来源的基质细胞被基因工程化以表达能够促进培养和维持干细胞的一种或多种蛋白或者生长因子。备选地，组织来源的基质细胞在被基因工程化表达此类蛋白或生长因子之后被辐照。这种因子用于维持干细胞处于未分化状态或者备选地指导它们的分化。
根据本文描述的本发明细节，组织来源的基质细胞(包括脂肪来源的基质细胞)被用来培养和维持胚胎干细胞。辐照的组织来源的基质细胞也被用来培养和维持胚胎干细胞。
又在本发明的另一方面，组织来源的基质细胞(包括脂肪来源的基质细胞)被用来培养和维持各种类型的干细胞，所述干细胞包括但不限于，神经元干细胞、肝干细胞、造血干细胞、脐带血干细胞、表皮干细胞、胃肠干细胞、内皮干细胞、肌肉干细胞、间充质干细胞和胰腺干细胞。辐照的组织来源的基质细胞也被用来培养和维持此类干细胞。
在本发明的另一个方面，分离的组织来源的基质细胞(包括脂肪来源的基质细胞)补充有交替地用来增强增殖、维持以及促进共培养的干细胞定向分化的生长因子、细胞因子和趋化因子。备选地，分离的组织来源的基质细胞首先被辐照，然后补充交替地用来增强增殖、维持以及促进共培养的干细胞定向分化的生长因子、细胞因子和趋化因子。
本发明的其它目的和特点由于下述公开及所依附的权利要求将会更加充分明显。
附图的简要说明
图1为代表性的人类脂肪来源的基质细胞的流式细胞仪分析。分离自单个供体的未分化的基质细胞用针对所示抗原的单克隆抗体(实线，每个图表的右侧)或同种型单克隆对照抗体(虚线，每个图表的左侧)染色。代表n＝5个供体。条柱表示荧光强度＞99％对照。脂肪来源的基质细胞表达多种粘附蛋白和表面蛋白。许多这些蛋白具有行使造血支持功能的潜力，并且它们全都为骨髓基质细胞共同享有。
图2显示了脂多糖(LPS)诱导细胞因子mRNA的PCR分析。脂肪来源的基质细胞用100ng/ml LPS诱导0或4小时并收集总RNA。反转录的cDNA用对白介素6和8、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子及粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子、flt-3配体和白血病抑制因子特异性的引物对进行扩增。肌动蛋白信号在每个反应中作为相等cDNA水平的对照。PCR产物经序列确认。与鼠和人骨髓来源的基质细胞共同的是，脂肪来源的基质细胞表达下列细胞因子mRNA：白介素6、7、8和11(IL-6，-7，-8，-11)、白血病抑制因子(LIF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、flt-3配体、干细胞因子、肿瘤坏死因子α(TNFα)以及骨形态发生蛋白2和4t(BMP-2，-4)。
图3显示了各种共培养物的总细胞扩增数据。对来自12天脂肪基质共培养物的造血细胞检查总细胞扩增(左表)、CD34+细胞扩增(中表)或者将其种植在MS5细胞上5周并检查髓样长期培养引发(LTC)细胞的扩增。在缺乏外源细胞因子时，脂肪来源的基质细胞支持总造血细胞数目的5.1-倍扩增(平均，n＝4个基质供体，n＝2个UCB供体；范围2-9.4)。这相应于CD34+UCB细胞群的2.4-倍扩增(平均，n＝4个基质供体，n＝2个UCB供体；范围1.4-3.3)。
发明详述
本发明提供了包括利用组织来源的基质细胞(包括脂肪来源的基质细胞)作为饲养层以分离、培养和维持成体干细胞、胚胎干细胞和其它干细胞的方法和组合物。在本发明的一个实施方案中，提供了通过辐照的来源于皮下、乳腺、性腺、网膜或其它脂肪组织部位的基质细胞而稳定可靠地支持干细胞的方法和组合物。
在本发明的另一个实施方案中，分离的组织来源的细胞(包括脂肪来源的基质细胞)补充有额外的生长因子、细胞因子和趋化因子，所述因子包括但不限于，白血病抑制因子、IL-1到IL-13、IL-15到IL-17、IL-19到IL-22、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素(Epo)、血小板生成素(Tpo)、Flt3配体、BAFF(B细胞活化因子的TNF家族的新配体)、artemin(属于GDNF家族的神经营养因子)、骨形态发生蛋白因子、表皮生长因子(EGF)、神经胶质衍生神经营养因子、lymphotactin、巨噬细胞炎性蛋白(α和β)、肌抑制素(也被称为生长分化因子-8)、neurturin、神经生长因子、血小板衍生生长因子、胎盘生长因子、多效蛋白、干细胞因子、干细胞生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子、血管内皮细胞生长因子以及成纤维细胞生长因子(包括FGF-4到FGF-10、FGF-16到FGF-20、FGF-酸性和碱性成纤维细胞生长因子)，以分离、培养和维持干细胞。在本发明的另一个实施方案中，分离的组织来源的细胞在培养基补充这种额外的生长因子、细胞因子和/或趋化因子之前被辐照。或者，分离的组织来源的细胞在培养基补充额外的生长因子、细胞因子和/或趋化因子之后被辐照。
在本发明另一个实施方案中，组织来源的基质细胞(包括脂肪来源的基质细胞)被基因工程化以表达蛋白，所述蛋白包括但不限于，白血病抑制因子、IL-1到IL-13、IL-15到IL-17、IL-19到IL-22、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素(Epo)、血小板生成素(Tpo)、Flt3配体、BAFF(B细胞活化因子的TNF家族的新配体)、artemin(属于GDNF家族的神经营养因子)、骨形态发生蛋白因子、表皮生长因子(EGF)、神经胶质衍生神经营养因子、lymphotactin、巨噬细胞炎性蛋白(α和β)、肌抑制素(也被称为生长分化因子-8)、neurturin、神经生长因子、血小板衍生生长因子、胎盘生长因子、多效蛋白、干细胞因子、干细胞生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子、血管内皮细胞生长因子以及成纤维细胞生长因子(包括FGF-4到FGF-10、FGF-16到FGF-20、FGF-酸性和碱性成纤维细胞生长因子)，以分离、培养和维持干细胞。在备选的实施方案中，组织来源的细胞在被如此基因工程化之后被辐照。又在该实施方案的另一种修饰中，此工程化的细胞被用来指导干细胞的分化。或者，工程化的细胞被用来维持干细胞处于未分化状态。
在本发明的另一实施方案中，组织来源的基质细胞(包括脂肪来源的基质细胞)被用于培养和维持胚胎干细胞。在备选的实施方案中，辐照的组织来源的基质细胞被用于培养和维持胚胎干细胞。
又在本发明的另一实施方案中，组织来源的基质细胞(包括脂肪来源的基质细胞)被用来分离、培养和维持源自成体组织的干细胞，所述干细胞包括但不限于，神经元干细胞、肝干细胞、造血干细胞、表皮干细胞、胃肠干细胞、内皮干细胞、肌肉干细胞、间充质干细胞和胰腺干细胞。在备选的实施方案中，组织来源的基质细胞被辐照。
在本发明的另一个实施方案中，分离的组织来源的基质细胞(包括脂肪来源的基质细胞)补充有交替地用来增强增殖、维持以及促进共培养的干细胞定向分化的生长因子、细胞因子和趋化因子。备选地，分离的组织来源的基质细胞首先被辐照，然后补充此类生长因子、细胞因子和趋化因子。
具有与脂肪组织来源的基质细胞相似特点的细胞得自于其它组织部位。这些组织包括但不限于，骨、骨髓、软骨、结缔组织、包皮、韧带、外周血、胎盘、骨骼肌、平滑肌、腱以及脐带血[见Caplan和Haynesworth的专利US 5,226914；Erices等2000，Br.J.Haematol.109：235-242；Gimble 1990，New Biologist 2：304-312；Gimble等1996，Bone 19：421-428]。虽然来自任何或所有这些组织的基质细胞没有一个是相同的，有可能它们共同享有足够的特点以允许它们在体外行使相似的功能。尤其是，得自这些不同组织部位的基质细胞可作为饲养层支持胚胎干细胞或成体干细胞的增殖并维持在未分化的状态。而且，根据这些类型的基质细胞中每一种的独特特征，它们可能各自对于特定类型干细胞的生长和维持是最佳的。
I. 定义
“胚胎干细胞”是指来源于胚胎(胚泡内细胞团)具有变成广泛种类的特化细胞的潜能的任何原始(未分化的)细胞。胚胎干细胞能够进行无限次的对称分裂而不分化(长期自我更新)。它们还呈现并维持稳定、完整(二倍体)、正常互补的染色体。该细胞表达高水平的端粒酶活性，并以特定的细胞表面蛋白和转录因子为区别。
“成体干细胞”是指见于分化的胚后期组织的任何未分化细胞，它能够自我更新并(具有某些局限)分化产生其所源自的组织的所有特化细胞类型以及分化成为广泛种类的其它细胞类型。
“白血病抑制因子”(LIF)是指具有众多生物学功能的白介素-6细胞因子家族中的22kDa蛋白成员。LIF具有诱导白血病细胞终末分化、诱导正常和髓样白血病细胞造血分化、诱导神经元细胞分化、并刺激肝细胞中急性期蛋白合成的能力。LIF也已经被证明对于维持胚胎干细胞处于增殖未分化状态是必需的。
“饲养层”是指通过化学或放射手段失活的细胞，从而它们不能分裂但依然产生生长因子、细胞因子以及共培养中所必需的其它细胞来源的产物，以维持未分化的多能干细胞。历史上，小鼠胚胎成纤维细胞被用作为饲养层支持胚胎干细胞。
“成纤维细胞生长因子-碱性”(FGF-b)是17.2kDa的蛋白，它是肝素结合生长因子，刺激广泛种类的细胞增殖，包括间充质细胞、神经外胚层细胞和内皮细胞。人类FGF-b是有力的造血细胞因子并在体内发挥强大的血管生成活性。FGF-b也拮抗细胞因子介导的人类白血病细胞系的分化。因此，bFGF能够通过拮抗先祖细胞的分化促进它们的增殖。
“多能胚胎干细胞”是能够产生许多分化的胚胎或成体细胞类型的细胞，包括生殖细胞(精子和卵子)。多能胚胎干细胞也能够自我更新。从而，这些细胞不仅繁殖种系并产生多数构成成体特化器官的终末分化细胞，而且自身能够再生。
术语“转基因的”用于描述任何动物或其任何部分，包括但不限于在其细胞内包括外源遗传材料的细胞、培养物或组织。本发明的细胞可以向其添加DNA，然后这些细胞能够用于移植或者用于体外产生激素、细胞或组织。
“转基因”是指通过技术手段插入到细胞中的任何DNA片段，其成为由该细胞发育而来的细胞、细胞系、组织或生物体基因组的一部分(即稳定地整合或作为稳定的染色体外元件)。这种转基因可包括对于引入异源基因的细胞或生物体来说部分或完全异源或者外来的基因，或者可代表与该生物体内源基因同源的基因。包括在该定义中的是通过提供RNA序列，转录成为DNA，然后掺入基因组中所创建的转基因。术语“转基因的”还另外包括任何生物体或其部分，包括但不限于细胞、细胞系、细胞培养物或组织，通过体外操作或通过任何转基因技术改变了其基因组。
“转化生长因子β”(TGFβ)是55kDa、391个氨基酸(aa)的前蛋白原，其由23个aa的信号序列，256个aa的蛋白原(pro)-区域以及112个aa的成熟区段组成。分泌前，蛋白原-区域由弗林蛋白酶样蛋白酶在RxxR位点处切割。这产生非糖基化的25kDa二硫键交联的成熟二聚体，其与它先前连接的二硫键交联的蛋白原-区域非共价结合，形成“隐性复合物”。该复合物被分泌。活化在胞外在各种条件下发生，极有可能是通过跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶引发由转录因子Smad家族介导的胞内信号级联反应。
“碱性成纤维细胞生长因子”(bFGF)，也被称为FGF-2，为18kDa非糖基化的多肽，其既表现出胞内活性又表现出胞外活性。BFGF作为单体分泌。分泌后，bFGF被隔绝到细胞表面硫酸肝素(HS)或基质糖胺聚糖上。虽然bFGF作为单体分泌，细胞表面HS似乎使单体bFGF以非共价侧对侧的构型二聚化，其随后能够二聚化并活化FGF受体。
“血小板衍生生长因子”(PDGF)为30kDa的命名为A和B的两个基因上不同而结构上相关的多肽链的同二聚体或异二聚体组合。它最初在血清中被鉴定为血小板衍生的成纤维细胞有丝分裂原。后来的研究证明许多细胞类型分泌PDGF，并且该细胞因子是中胚层细胞系(肌肉、骨、结缔组织)细胞的有丝分裂原。
II. 分离脂肪来源的干细胞
脂肪组织提供了多能基质细胞的来源。脂肪组织容易得到并且许多个体富含脂肪组织。肥胖在美国为流行病比例的状况，其中大于50％的成人超过了推荐的基于他们身高的BMI。脂肪细胞可以通过基于门诊病人的吸脂术收获。这是一个具有美容效果的相对非侵入性的操作，为大多数患者所接受。已经充分证明脂肪细胞是可补充的细胞群。即使是通过吸脂术或其它操作在外科手术除去后，常见个体中脂肪细胞随着时间的重现。这提示脂肪组织含有能够自我更新的基质干细胞。
“脂肪组织来源的基质细胞”通过胶原酶消化和差速离心从切碎的人脂肪组织中获得[Halvorsen等2001，Tissue Eng.7(6)：729-41；Hauner等1989，J Clin Invest 84：1663-1670；Rodbell 1966，.J BiolChem 241：130-139]。已经证明人类脂肪组织来源的基质细胞能够沿着脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞细胞系途径分化[Erickson等2002，Biochem Biophys Res Commun.290(2)：763-9；Gronthos等2001，Journal of Cellular Physiology，89(1)：54-63；Halvorsen等2001，Metabolism 50：407-413；Harp等2001，Biochem Biophys ResCommun 281：907-912；Saladin等1999，Cell Growth & Diff 10：43-48；Sen等2001，Journal of Cenular Biochemistry 81：312-319；Zhou等1999，Biotechnol.Techniques 13：513-517；Zuk等2001，Tissue Eng.7：211-228]。
脂肪组织为组织工程应用提供了许多实用的优势。首先，它很丰富。其次，它能以对患者最小风险的方法获得。第三，它是可补充的。虽然基质细胞代表小于0.01％的骨髓有核细胞群，但每克脂肪组织存在高达8.6×104个基质细胞[Sen等2001，Journal of CellularBiochemistry 81：312-319]。0.5千克脂肪组织离体扩增2到4周可产生高达500,000,000个基质细胞。这些细胞可即刻使用，或者冷藏以备将来的自体或同种异体应用。
脂肪来源的基质细胞表达许多粘附蛋白和表面蛋白，包括但不限于下列细胞表面标志：CD29(β1整联蛋白)、CD44(透明质酸受体)、CD49d(α4整联蛋白)、CD54-ICAM1 CD105-endoglin；CD106-VCAM-1CD166-ALCAM；以及下列细胞因子：白介素6、7、8、11、巨噬细胞集落刺激因子、GM集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子以及骨形态发生蛋白。许多这些蛋白具有行使造血支持功能的潜能，并且它们共同为骨髓基质细胞所享有。
具有与脂肪组织来源的基质细胞相似特点的细胞可得自于其它组织部位。这些组织包括但不限于，骨、骨髓、软骨、结缔组织、包皮、韧带、外周血、胎盘、骨骼肌、平滑肌、腱以及脐带血[见Caplan和Haynesworth的专利US 5,226,914；Erices等2000，Br.J.Haematol.109：235-242；Gimble JM 1990，The New Biologist 2：304-3 12；Gimble等1996，Bone 19：421-428]。虽然来自任何或所有这些组织的基质细胞没有一个是相同的，有可能它们共同享有足够的特点以允许它们在体外行使相似的功能。尤其是，得自这些不同组织部位的基质细胞也可作为饲养层支持胚胎干细胞或成体干细胞的增殖并维持在未分化的状态。
匹兹堡大学(University of Pittsburgh)和加州大学董事会(TheRegents of the University of California)的WO 00/53795公开了脂肪来源的干细胞，它能够生长并扩增以提供支持其它细胞群生长和扩增的激素和条件培养基，其能够进一步被基因改造以阻遏或表达某些基因。在一个实例中，人类脂肪来源的干细胞与来自脐带血的造血干细胞共培养。在2周的周期内，人类脂肪来源的基质细胞维持人类造血干细胞的存活并支持其生长，由此阐明了此类系统在维持干细胞生长中的用途。
Verfaillie的美国专利US 5,922,597公开了涉及利用基质细胞提供条件培养基以支持干细胞的生长和维持的方法。教导了基质细胞和干细胞可以组合在共培养物中。
可用于本发明的方法的脂肪组织来源的基质细胞是通过本领域技术人员公知的各种方法分离的，例如象匹兹堡大学等的WO 00/53795中所描述的。在优选的方法中，脂肪组织分离自哺乳动物受试者，优选为人类受试者。优选的脂肪组织来源是网膜脂肪。在人类中，脂肪典型地通过吸脂术分离。如果本发明的细胞要移植到人类受试者中，优选脂肪组织分离自同一个受试者，以便提供自体移植。或者，移植的组织可以是同种异体的。
作为非限制性实例，在分离脂肪组织来源的基质细胞的一个方法中，脂肪组织用0.01到0.5％之间，优选0.04到0.2％，最优选0.1％浓度的胶原酶、用0.01到0.5％之间，优选0.04到0.04％，最优选0.2％浓度的胰蛋白酶在25°到50℃之间，优选在33°到40℃之间，最优选在37℃的温度下处理10分钟到3小时，优选30分钟到1小时，最优选45分钟。细胞通过20微米到800微米之间，更优选40微米到400微米之间，最优选70微米的尼龙或粗棉布网孔过滤器。然后将细胞直接在培养基中或在Ficoll或Percoll或其它粒子梯度中进行差速离心。细胞在4到50℃之间，优选在20到40℃之间，最优选在25℃的温度下以100到3000Xg之间，更优选200到1500Xg，最优选以500Xg的速度离心1分钟到1小时，更优选2到15分钟，最优选5分钟。
又在另一种分离脂肪组织来源的基质细胞的方法中，利用了诸如在Katz等的US 5,786,207中所描述的机械系统。使用系统将脂肪组织样品引入到自动化装置中，使其进入洗涤阶段和分离阶段，其中组织被搅拌并旋转，从而在离心预备状态的容器中收集所得的细胞悬液。以这种方式，从组织样品中分离脂肪来源的细胞，保持目的细胞的细胞完整性。
脂肪来源的细胞可以通过美国专利No.6,153,432(特此引用作为参考)中公开的方法培养。从其它组织分离基质细胞的类似技术对本领域技术人员将会是显而易见的，包括但不限于来源于骨、骨髓、软骨、结缔组织、包皮、韧带、外周血、胎盘、平滑肌、骨骼肌、腱、脐带血和其它部位的基质细胞。
III. 辐照脂肪来源的基质细胞
脂肪组织来源的基质细胞可以被辐照。细胞必须以抑制增殖但允许合成支持胚胎干细胞的重要因子的剂量辐照。此类方案的细节是本领域技术人员所熟知的。
IV. 培养基增强
已进一步确认可以向培养基中添加额外的组分。此类组分包括抗生素、白蛋白、氨基酸及本领公知的用于培养细胞的其它组分。
培养基中的其它添加物可以包括IL-1到IL-13、IL-15到IL-17、IL-19到IL-22、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素(Epo)、血小板生成素(Tpo)、Flt3配体、BAFF(B细胞活化因子的TNF家族的新配体)、artemin(属于GDNF家族的神经营养因子)、骨形态发生蛋白因子、表皮生长因子(EGF)、神经胶质衍生神经营养因子、lymphotactin、巨噬细胞炎性蛋白(α和β)、肌抑制素(也被称为生长分化因子-8)、neurturin、神经生长因子、血小板衍生生长因子、胎盘生长因子、多效蛋白、干细胞因子、干细胞生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子、血管内皮细胞生长因子以及成纤维细胞生长因子(包括FGF-4到FGF-10、FGF-16到FGF-20、FGF-酸性、FGF-碱性)、LIF及细胞培养领域公知的并且交替地用于增强增殖、维持和促进干细胞定向分化的其它生长因子、细胞因子和趋化因子。生长和增殖增强量可根据细胞的种或株以及因子的类型或纯度而变化。一般而言，培养液内每种因子0.5到500ng/ml足够了。在更窄的范围内，FGFb和LIF含量为10到20ng/ml。不论实际的含量是否已知，每种因子的最佳浓度可以由本领域技术人员常规地确定。这种确定通过个别地以及组合地滴定各因子直到获得最佳生长而进行。另外，也可以测试其它因子以确定它们增强FGFb和LIF对ES细胞增殖的效果的能力。如下文所述，用于增强ES细胞增殖的这种其它因子或因子组合包括在上述组合物中。并且，模拟这些因子功能的化合物及FGFb和LIF的片段被用于增强细胞生长和增殖变为ES细胞，并且包括在本发明的范围之内。
备选地，FGFb和LIF被用于维持ES细胞。维持ES细胞必需的FGFb和LIF的量比增强生长或增殖变成ES细胞所需的量要小得多。不过，细胞可以维持在饲养层上而不添加生长因子。最佳地，添加LIF以增强维持。
一般而言，利用来自不同于ES、原生殖细胞、生殖细胞或胚胎外胚层细胞的来源的物种的FGFb或LIF。然而，所用的所有因子特别是所用的SF优选来自与所用的细胞类型相同的物种。不过，来自各物种的FGFb或LIF常规地用来自不同物种的细胞进行功效筛选和选择。FGFb或LIF的重组片段也可以象来自如化学文库的有机化合物一样进行功效筛选。
本发明也提供了制备多能ES细胞的方法，包括在细胞生长条件下施加生长增强量的FGFb、LIF和/或胚胎外胚层细胞，由此制备多能ES细胞。因此，原生殖细胞以及胚胎外胚层细胞作为组合物在这些因子存在下培养，以产生多能ES细胞。如上文所指出的那样，典型地该组合物包括脂肪组织来源的基质细胞饲养层。
V. 基因修饰组织来源的基质细胞
本发明的另一方面涉及将外来基因引入到组织来源的基质细胞中，从而所述组织来源的基质细胞携带该新的遗传材料，并可表达目的基因产物。用于转导到脂肪组织来源的基质细胞中的遗传材料的实例包括那些表达在该饲养层支持的特定干细胞的生长和增殖中具有作用的任何基因产物的遗传材料。
从而组织来源的基质细胞由感兴趣的遗传材料修饰(被转导或转化或转染)。这些修饰的细胞接着可以与胚胎干细胞或成体干细胞共培养以使之增殖。
组织来源的基质细胞可以通过向细胞掺入遗传材料，例如利用重组表达载体来进行基因修饰。
如本文所用，“重组表达载体”是指包含以下装配组件的转录单位：(1)在基因表达中具有调控作用的遗传元件，例如启动子或增强子，(2)被转录为mRNA并被翻译成蛋白的结构或编码序列，和(3)合适的转录起始和终止序列。用于真核表达系统的结构单位优选包括能够使宿主细胞胞外分泌翻译蛋白的前导序列。备选地，当表达的重组蛋白没有前导或转运序列时，它可以包括N-端甲硫氨酸残基。该残基可以或可以不随后从表达的重组蛋白中切除以提供终产物。
组织来源的基质细胞因而可以在染色体DNA中整合了重组转录单位，或者携带该重组转录单位作为定居质粒组分。例如，细胞可以离体用编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)进行改造。细胞可以利用含有编码多肽的RNA的反转录病毒颗粒通过本领域公知的操作进行改造。
本文所述的反转录病毒质粒载体所来自的反转录病毒包括但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒、脾坏死病毒、反转录病毒例如罗斯肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒、髓增殖肉瘤病毒以及哺乳动物肿瘤病毒。在一个实施方案中，反转录病毒质粒载体为来自于鼠胚胎干细胞的MGIN。
编码多肽的核酸序列处于合适的启动子的控制之下。可以使用的合适的启动子包括但不限于TRAP启动子，腺病毒启动子，例如腺病毒主要晚期启动子；巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；罗斯肉瘤启动子；诱导型启动子例如MMT启动子，金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人类珠蛋白启动子；病毒胸苷激酶启动子，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；反转录病毒LTR；ITR；β-肌动蛋白启动子以及人类生长激素启动子。启动子也可以是调控编码多肽的基因的天然启动子。这些载体也使得调节经工程化的先祖细胞产生多肽成为可能。合适启动子的选择对于本领域技术人员将是显而易见的。
除反转录病毒以外的载体可以用来基因工程化或者修饰组织来源的基质细胞。感兴趣的遗传信息通过任何可在这种细胞中表达新遗传材料的任何病毒引入。例如，SV40、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒以及人乳头瘤状病毒被用于此目的。也可以利用其它方法将克隆的真核DNA引入到培养的哺乳动物细胞中，例如，待转移到干细胞中的遗传材料可以是病毒核酸的形式。
另外，表达载体可以含有一个或多个可选择的标记基因，以提供筛选转化细胞的表型特征，例如二氢叶酸还原酶或新霉素抗性。
组织来源的基质细胞可以通过本领域公知的其它方法转移。这样的方法包括但不限于磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染；聚阳离子Polybrene介导的转染；原生质体融合；电穿孔；脂质体，或者通过将DNA或RNA包囊在脂质体里面，接着使脂质体与细胞膜融合，或者将包被有合成的阳离子脂质的DNA通过融合引入到细胞中。
本发明进一步使得以这样的方式基因改造组织来源的基质细胞，以便它们可在体外或体内产生在天然组织来源的基质细胞中通常不以生物学有意义量产生或者小量产生的多肽、激素和蛋白成为可能。然后这些产物将分泌到周围培养基中或者从细胞中纯化。以这种方式形成的组织来源的基质细胞可以作为表达的物质的持续的短期或长期产生系统。这些基因可以表达如激素、生长因子、基质蛋白、细胞膜蛋白、细胞因子和/或粘附分子。
现在将通过下列实施例更加充分地描述本发明。不过，本发明可具体体现为许多不同的形式，而不应当理解为限于本文所列的实施方案；确切地讲，提供这些实施方案，从而使公开更加彻底和完整，并将充分地向本领域技术人员传达本发明的范围。
实施例
实施例1
辐照的人类脂肪来源的基质细胞对胚胎干细胞的体外支持
辐照脂肪组织来源的基质细胞使得它们可用来在体外支持人类胚胎干细胞的增殖。在外源生长因子不存在或存在时进行研究，所述生长因子包括但不限于，白血病抑制因子、IL-1到IL-13、IL-15到IL-17、IL-19到IL-22、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素(Epo)、血小板生成素(Tpo)、Flt3-配体、BAFF(B细胞活化因子的TNF家族的新配体)、artemin(属于GDNF家族的神经营养因子)、骨形态发生蛋白因子、表皮生长因子(EGF)、神经胶质衍生神经营养因子、lymphotactin、巨噬细胞炎性蛋白(α和β)、肌抑制素(也被称为生长分化因子-8)、neurturin、神经生长因子、血小板衍生生长因子、胎盘生长因子、多效蛋白、干细胞因子、干细胞生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子、血管内皮细胞生长因子以及成纤维细胞生长因子(包括FGF-4到FGF-10、FGF-16到FGF-20、FGF-酸性和碱性成纤维细胞生长因子)。还对胚胎干细胞的功能进行检测。
在任何实验之前，脂肪组织来源的基质细胞以103到105细胞/cm2之间的密度平板接种在基质培养基中[Halvorsen等，2001，Metabolism50：407-413]。细胞在培养物中维持直至铺满，这时候用3500到5000拉德(1拉德＝0.01戈瑞)的γ辐射进行有丝分裂灭活。胚胎干细胞根据已经建立的方法通过免疫切除术分离自胚泡期胚胎的内细胞团[Reubinoff等2000，Nature Biotechnology 18：399-404；Thomson等1998，Science 282：1145-1147；Odorico等2001，Stem Cells 19：193-204]。用链霉蛋白酶消化透明带，并利用合适的抗-物种特异性血清抗体接着暴露于豚鼠补体通过免疫切除术分离内细胞团。将所得的ICM细胞涂布到辐照的脂肪组织来源的基质细胞层上。
培养物在Dulbecco′S改良Eagle′s培养基(无丙酮酸，高葡萄糖配制)、敲除Dulbecco′s改良Eagle′s培养基或补充有15-20％胎牛血清或15-20％敲除SR(Gibco/BRL，Gaithersburg MD)、对胚胎干细胞生长优化的血清替代品[Price等1998，WO98/30679]、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM 2-巯基乙醇、2mM谷氨酰胺、抗生素并添加高达2,000单位/ml的人重组白血病抑制因子(LIF)、高达4ng/ml的人重组碱性成纤维细胞生长因子和高达10μM的毛喉素的等价培养基的存在下维持[Amit等2000，Dev Biol 227：271-278；Reubinoff等2000，NatureBiotechnology 18：399-404；Shamblott等1998，Proc Natl Acad SciUSA 95：13726-13731；Thomson等1998，Science 282：1145-1147]。
9到15天后，通过暴露于具有1mM EDTA或其它二价阳离子螯合剂的无钙无镁磷酸缓冲盐溶液、通过暴露于分散酶(10mg/ml)、或者通过微量移液器机械分离将单个集落分离而成块[Thomson等1998，Science 282：1145-1147]。
所得的细胞或细胞块序贯平板接种到新鲜培养基中辐照的人类脂肪组织来源的基质细胞上。克隆按每7天的数量级扩增并传代，并表现出大约36小时的倍增时间。克隆随后的传代通过重复细胞解体操作(消化、微量移液器处理)以及通过将所得的细胞涂布到辐照的MEF上进行。
胚胎干细胞的维持通过将假定的细胞植入到免疫缺陷小鼠的骨骼肌中进行评估。随后畸胎癌的生长(显示了衍生自所有三个胚层的组织的存在)提供了脂肪组织来源的基质层增殖多能干细胞的功能证据。
实施例2
辐照的人类脂肪来源的基质细胞对人类胚胎干细胞细胞系的体外支持
如实施例1中那样，在任何实验之前，将人类脂肪组织来源的基质细胞以103到105细胞/cm2之间的密度平板接种在基质培养基中[Halvorsen等，2001，Tissue Eng.7(6)：729-41]。细胞在培养物中维持直至铺满，这时候用3500到5000拉德(1拉德＝0.01戈瑞)的γ辐射进行有丝分裂灭活。现有的人胚胎干细胞细胞系通过暴露于具有1mM EDTA或其它二价阳离子螯合剂的无钙无镁磷酸缓冲盐溶液、通过暴露于分散酶(10mg/ml)、或者通过微量移液器机械分离而从鼠胚胎成纤维细胞饲养层中解离[Thomson等1998，Science 282：1145-1147]。将所得的单个细胞和细胞块涂布到已建立的辐照的人脂肪组织来源的基质细胞饲养层上。培养物在Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(无丙酮酸，高葡萄糖配制)、敲除Dulbecco′s改良Eagle′s培养基或补充有15-20％胎牛血清或15-20％敲除SR(Gibco/BRL，Gaithersburg MD)、对胚胎干细胞生长优化的血清替代品[Price等，WO98/30679]、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM 2-巯基乙醇、2mM谷氨酰胺、抗生素并添加高达2,000单位/ml的人重组白血病抑制因子(LIF)、高达4ng/ml的人重组碱性成纤维细胞生长因子和高达10μM的毛喉素的等价培养基的存在下维持[Amit等2000，Dev Biol 227：271-278；Reubinoff等2000，Nature Biotechnology 18：399-404；Shamblott等1998，Proc Natl Acad Sci USA 95：13726-13731；Thomson等1998，Curr Top Dev Biol 38：133-165]。
克隆按大约每7天扩增并传代，并表现出大约36小时的倍增时间[Amit等2000，Dev Biol 227：271-278]。克隆随后的传代通过重复细胞解体操作(消化、微量移液器处理)以及通过将所得的细胞涂布到辐照的MEF上进行。
胚胎干细胞的维持通过将假定的细胞植入到免疫缺陷小鼠的骨骼肌中进行评估。随后畸胎癌的生长(显示了衍生自所有三个胚层的组织的存在)提供了脂肪组织来源的基质层增殖多能干细胞的功能证据。
实施例3
基因治疗修饰
以下实验概要描述了将脂肪组织来源的基质细胞转变为表达因子的细胞的方法，所述因子包括但不限于，白血病抑制因子、IL-1到IL-13、IL-15到IL-17、IL-19到IL-22、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素(Epo)、血小板生成素(Tpo)、Flt3-配体、BAFF(B细胞活化因子的TNF家族的新配体)、artemin(属于GDNF家族的神经营养因子)、骨形态发生蛋白因子、表皮生长因子(EGF)、神经胶质衍生神经营养因子、lymphotactin、巨噬细胞炎性蛋白(α和β)、肌抑制素(也被称为生长分化因子-8)、neurturin、神经生长因子、血小板衍生生长因子、胎盘生长因子、多效蛋白、干细胞因子、干细胞生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子、血管内皮细胞生长因子以及成纤维细胞生长因子(包括FGF-4到FGF-10、FGF-16到FGF-20、FGF-酸性或碱性成纤维细胞生长因子)，以提高它们在共培养系统中的胚胎干细胞支持能力。也包括对胚胎干细胞的功能进行检测。
人类脂肪组织来源的基质细胞被基因工程化以表达外源基因，增强它们支持人类胚胎干细胞在体外增殖和维持的能力。人类脂肪组织来源的基质细胞的原代培养物用合适的载体转导或转染，所述载体编码人类白血病抑制因子(LIF)、人类碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)或鉴定为支持胚胎干细胞增殖的相关细胞因子或生长因子的cDNA。
转导或转染的人类脂肪来源的基质细胞如上文实施例1和2中所示用于制备饲养层。基因修饰饲养层的存在预期可减少在体外共培养维持胚胎干细胞中添加外源生长因子的需要。
实施例4
人类脂肪来源的基质细胞的流式细胞仪分析
脂肪来源的基质细胞表达许多粘附蛋白和表面蛋白；这些蛋白总结于表1。许多这些蛋白具有行使造血支持功能的潜力，并且它们全都为骨髓基质细胞共同享有。还显示了对CD9、CD29(β1整联蛋白)、CD44(透明质酸受体)、CD49d(α4整联蛋白)、CD55(衰变加速因子)和HLA-ABC(I类组织相容性抗原)的代表性的流式细胞分析柱状图(图1)。
分离自单个供体的未分化的人类脂肪来源的基质细胞用针对所示抗原的单克隆抗体(实线，每个图表的右侧)或同种型单克隆对照抗体(虚线，每个图表的左侧)染色。代表n＝5个供体。条柱表示荧光强度＞99％对照。
表1：脂肪来源的基质细胞表面标志和细胞因子
    细胞表面标志     细胞因子
    CD29-整联蛋白β1     白介素6、7、8、11
    CD44-透明质酸受体     巨噬细胞集落刺激因子
    CD49d、e-整联蛋白α4、5     GM集落刺激因子
    CD54-ICAM1     粒细胞集落刺激因子
    CD105-Endoglin     白血病抑制因子
    CD106-VCAM-1     干细胞因子
    CD166-ALCAM     骨形态发生蛋白
实施例5
脂多糖(LPS)诱导细胞因子mRNA的PCR分析
脂肪来源的基质细胞用100ng/ml LPS诱导0或4小时并收集总RNA。反转录的cDNA用对白介素6和8、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子及粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、flt-3配体和白血病抑制因子特异性的引物对进行扩增(图2)。肌动蛋白信号在每个反应中作为相等cDNA水平的对照。PCR产物经序列确认。
PCR结果通过ELISA分析在蛋白质水平得到了证实(表2)。如表中所示，基质细胞在LPS诱导后的24小时之内显著增加它们分泌IL-6、IL-7、IL-8、M-CSF、GM-CSF和TNFα。
测定了来自多个供体的人类脂肪来源的基质细胞的细胞因子表达特征(表2)。在这些实验中，用脂多糖(LPS，100ng/ml)和条件培养基诱导铺满的静止的脂肪来源的基质细胞培养物，并在1到24小时的周期之后收集总RNA。与鼠和人骨髓来源的基质细胞共同的是，脂肪来源的基质细胞表达下列细胞因子mRNA：白介素6、7、8和11(IL-6，-7，-8，-11)、白血病抑制因子(LIF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、flt-3配体、干细胞因子、肿瘤坏死因子α(TNFα)以及骨形态发生蛋白2和4t(BMP-2，-4)(图2)。
表2.脂多糖诱导分泌的细胞因子(ELISA，pg/ml)
  时间LPS   0小时   1小时   2小时   4小时   8小时     24小时
  GM-CSF*   1±1   1±0   3±1   7±2   17±3     76*±28
  M-CSF*   4±3   76±14   161±29   304±62   512±98     977*±285
  TNFα*   0±0   0±0   5±8   38±33   112*±82     30±22
  IL-1α/β   N.D.   N.D.   N.D.   N.D.   N.D.     N.D.
  IL-6*   1±1   287±73   674±51   2649±495   6083±956     9204*±2676
  IL-7*   0.4±0.2   0.4±0.2   0.3±0.3   0.3±0.3   0.9±0.2     3.4*±0.7
  IL-8*   0±0   88±42   225±82   1343±224   4924±1046     9710*±2483
  IL-11   2±2   2±1   13±6   14±6   16±6     19±8
  IL-12   N.D.   N.D.   N.D.   N.D.   N.D.     N.D.
(表2中的数值为来自n＝5到8个基质细胞供体的平均值±S.E.M.。在向100ng脂多糖/ml培养基暴露所示的时间后用未稀释的、1∶25或1∶125稀释的条件培养基进行ELISA。IL-7 ELISA在0.16到10pg/ml之间是线性的。星号表示根据单向ANOVA，在8或24小时与0小时时间点之间的*p＜0.05。缩略语：N.D.，不可检测。)
实施例6
倍数扩增
检查了人类脂肪来源的基质细胞在体外支持人类脐带血CD34+造血先祖细胞增殖和分化的能力。在24孔板上建立铺满的脂肪来源的基质细胞的培养物(6×104细胞/孔)。脐带血标本通过用羟乙基淀粉(hetastarch)处理排除污染的红细胞，并通过Ficoll密度离心排除污染的粒细胞。余下的UCB单核的细胞根据StemSepTM(StemCells，Vancouver，BC)方案进行细胞系耗竭(lineage depleted)；这有赖于利用针对CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b以及血型糖蛋白A的抗体的混合物的免疫磁性阴性细胞选择。在最后的纯化步骤中，lin-UCB细胞用CD34抗体染色，并通过流式细胞仪分类。多达10,000个终末CD34+UCB细胞在单孔中与铺满的脂肪来源的基质细胞层共培养。培养物在缺乏外源细胞因子下维持12天、3周或6周。在这些周期结束时，通过胰蛋白酶/EDTA消化收集单孔，并利用下列抗体组合的组合(荧光标记显示在括号中)通过流式细胞仪进行分析：CD45(FITC)、CD34(APC)以及CD7、CD10或者CD38(PE)。图3显示对来自12天脂肪基质共培养物的造血细胞检查总细胞扩增(左表)、CD34+细胞扩增(中表)或者将其种植在MS5细胞上5周并检查髓样长期培养引发(LTC)细胞的扩增。
在缺乏外源细胞因子的情况下，脂肪来源的基质细胞支持总造血细胞数目的5.1-倍扩增(平均，n＝4个基质供体，n＝2个UCB供体；范围2-9.4)(图3)。这相应于CD34+UCB细胞群的2.4-倍扩增(平均，n＝4个基质供体，n＝2个UCB供体；范围1.4-3.3)(图3)。
对于得益于前述说明书和相关附图中呈现的教导的本发明所属技术领域的技术人员来说，本发明的修饰和其它实施方案将是显而易见的。因而，应当理解本发明不局限于所公开的具体实施方案，并且修饰和其它实施方案旨在包括在所附的权利要求书的范围之内。虽然本文使用了具体术语，它们仅仅是以通称和描述性的意义使用的，而并非用于限制目的。

Claims (37)

1.组合物，包括能够支持干细胞在体外增殖和维持的分离的基质细胞，与干细胞组合。
2.权利要求1的组合物，其中基质细胞是人类的。
3.权利要求1的组合物，其中向基质细胞中引入了外源遗传材料。
4.权利要求1的组合物，其中基质细胞分泌蛋白。
5.权利要求1的组合物，其中分泌的蛋白是生长因子、细胞因子或促进干细胞增殖的任何蛋白。
6.权利要求1的组合物，其中基质细胞被辐照。
7.权利要求1的组合物，其中基质细胞来源于脂肪组织。
8.权利要求1的组合物，其中基质细胞来源于骨髓。
9.权利要求1的组合物，其中基质细胞来源于韧带组织或腱。
10.权利要求1的组合物，其中基质细胞来源于骨骼肌。
11.权利要求1的组合物，其中基质细胞来源于平滑肌。
12.权利要求1的组合物，其中基质细胞来源于骨。
13.权利要求1的组合物，其中基质细胞来源于软骨。
14.权利要求1的组合物，其中基质细胞来源于结缔组织。
15.权利要求1的组合物，其中基质细胞来源于外周血。
16.权利要求1的组合物，其中基质细胞来源于皮肤。
17.权利要求1的组合物，其中基质细胞来源于脐带血。
18.权利要求1的组合物，其中基质细胞来源于胎盘。
19.权利要求1的组合物，其中干细胞是胚胎来源的。
20.权利要求1的组合物，其中干细胞是成体来源的。
21.权利要求1的组合物，其中干细胞表达端粒酶。
22.权利要求1的组合物，其中干细胞选自包括神经元干细胞、肝干细胞、造血干细胞、脐带血干细胞、表皮干细胞、胃肠干细胞、内皮干细胞、肌肉干细胞、间充质干细胞和胰腺干细胞的组。
23.权利要求1的组合物，其中干细胞保持未分化。
24.生长和维持培养的干细胞的方法，包括：
i)分离组织来源的基质细胞；和
ii)在培养基中与干细胞一起培养该基质细胞。
25.权利要求24的方法，进一步包括补充生长因子、细胞因子和趋化因子培养。
26.权利要求26的方法，其中生长因子、细胞因子和趋化因子选自：白血病抑制因子、IL-1到IL-13、IL-15到IL-17、IL-19到IL-22、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素(Epo)、血小板生成素(Tpo)、Flt3-配体、B细胞活化因子、artemin、骨形态发生蛋白因子、表皮生长因子(EGF)、神经胶质衍生神经营养因子、lymphotactin、巨噬细胞炎性蛋白、肌抑制素、neurturin、神经生长因子、血小板衍生生长因子、胎盘生长因子、多效蛋白、干细胞因子、干细胞生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子、血管内皮细胞生长因子以及成纤维细胞生长因子，FGF-酸性和碱性成纤维细胞生长因子。
27.权利要求25的方法，其中生长因子、细胞因子和趋化因子促进干细胞的分化。
28.权利要求25的方法，其中生长因子、细胞因子和趋化因子抑制干细胞的分化。
29.权利要求24-28中任一项的方法，其中分离的基质细胞在与干细胞一起培养前被辐照。
30.权利要求24-29中任一项的方法，其中干细胞是胚胎来源的。
31.权利要求24-29中任一项的方法，其中干细胞是成体来源的。
32.权利要求24-29中任一项的方法，其中干细胞选自包括神经元干细胞、肝干细胞、造血干细胞、脐带血干细胞、表皮干细胞、胃肠干细胞、内皮干细胞、肌肉干细胞、间充质干细胞和胰腺干细胞的组。
33.权利要求24-29的方法，其中基质细胞分离自包括脂肪组织、骨髓、韧带组织或腱、骨骼肌、平滑肌、骨、软骨、结缔组织、外周血、皮肤、脐带血和胎盘的来源。
34.权利要求24-33中任一项的方法，其中分离的基质细胞被基因工程化以表达生长因子、细胞因子或趋化因子。
35.权利要求34的方法，其中生长因子、细胞因子和趋化因子选自：白血病抑制因子、IL-1到IL-13、IL-15到IL-17、IL-19到IL-22、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素(Epo)、血小板生成素(Tpo)、Flt3-配体、B细胞活化因子、artemin、骨形态发生蛋白因子、表皮生长因子(EGF)、神经胶质衍生神经营养因子、lymphotactin、巨噬细胞炎性蛋白、肌抑制素、neurturin、神经生长因子、血小板衍生生长因子、胎盘生长因子、多效蛋白、干细胞因子、干细胞生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子、血管内皮细胞生长因子以及成纤维细胞生长因子，FGF-酸性和碱性成纤维细胞生长因子。
36.权利要求32的方法，其中干细胞维持在未分化的状态。
37.权利要求32的方法，其中干细胞在培养中分化。
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