CN108823160B - 一种脐带间充质干细胞原代培养基及其原代培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞培养技术领域，特别涉及一种脐带间充质干细胞原代培养基及其原代培养方法。该原代培养基包括氨甲环酸、G‑CSF、EGF和基础培养基；脐带间充质干细胞原代培养基中各组分的浓度为：氨甲环酸：500～15000mg/L；G‑CSF：10～50ng/L；EGF：5～30ng/mL；基础培养基：补足。本发明将氨甲环酸、G‑CSF、EGF添加入基础培养基，能缩短原代培养时间，效果好于常规培养基及添加单一因子的培养基；同时可以避免异源性物质的引入，具有更高的临床安全性。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，特别涉及一种脐带间充质干细胞原代培养基及其原代培养方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪、羊膜液、胎盘、脐带血及脐带组织中。脐带间充质干细胞(UC-MSCs)是存在于脐带华尔通胶(Wharton's jelly)和血管周围组织中的一种干细胞，来源广泛，便于取材，在体外易于分离扩增。
脐带间充质干细胞比来源于胚胎、骨髓、脂肪以及其他组织的MSCs更具有优势。首先，脐带来源不受伦理争议，并且成本较低；其次，hUC-MSCs不会引起畸胎瘤，并且具有抑癌性，由于hUC-MSCs还具有低免疫原性、免疫调节、基质支持、旁分泌、迁移和基因稳定性，故具有良好的临床治疗潜能。常用的脐带原代分离方法有：组织块贴壁培养法、脐带匀浆胶原酶消化法与改良胶原酶消化法3种方法。
现有常规培养技术采用外源血清(如胎牛血清)促进脐带间充质干细胞增殖虽然能达到增殖目的，但是原代培养费时较长，且外源血清其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。
因此，需要寻求一种可替代胎牛血清用于脐带间充质干细胞的体外快速扩增方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种脐带间充质干细胞原代培养基及其原代培养方法。本发明将氨甲环酸、G-CSF、EGF添加入基础培养基，能缩短原代培养时间，效果好于常规培养基及添加单一因子的培养基；同时可以避免异源性物质的引入，具有更高的临床安全性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种脐带间充质干细胞原代培养基，包括氨甲环酸、G-CSF、EGF和基础培养基；脐带间充质干细胞原代培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：500～15000mg/L；
G-CSF：10～50ng/L；
EGF：5～30ng/mL；
基础培养基：补足。
作为优选，脐带间充质干细胞原代培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：500～10000mg/L；
G-CSF：10～20ng/L；
EGF：10～20ng/mL；
基础培养基：补足。
优选地，脐带间充质干细胞原代培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：10000mg/L；
G-CSF：10～20ng/L；
EGF：20ng/mL；
基础培养基：补足。
更优选地，脐带间充质干细胞原代培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：10000mg/L；
G-CSF：10ng/L；
EGF：20ng/mL；
基础培养基：补足。
更优选地，脐带间充质干细胞原代培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：10000mg/L；
G-CSF：20ng/L；
EGF：20ng/mL；
基础培养基：补足。
作为优选，基础培养基为DMEM/F12培养基。
本发明还提供了一种脐带间充质干细胞原代培养方法，包括如下步骤：
剥离脐带外膜、静脉和动脉，得到华通氏胶；
剪碎华通氏胶，将剪碎的华通氏胶接种于上述脐带间充质干细胞原代培养基中，进行原代培养。
作为优选，剪碎华通氏胶至1～2mm3。
作为优选，接种密度为2.5～3mL/15cm皿。
作为优选，原代培养的条件为37℃、5％CO2。
本发明提供了一种脐带间充质干细胞原代培养基及其原代培养方法。该原代培养基包括氨甲环酸、G-CSF、EGF和基础培养基；脐带间充质干细胞原代培养基中各组分的浓度为：氨甲环酸：500～15000mg/L；G-CSF：10～50ng/L；EGF：5～30ng/mL；基础培养基：补足。本发明具有的技术效果为：
本发明将氨甲环酸、G-CSF、EGF添加入基础培养基，能缩短原代培养时间，效果好于常规培养基及添加单一因子的培养基；
本发明将氨甲环酸、G-CSF、EGF的混合物代替胎牛血清，可以避免异源性物质的引入，具有更高的临床安全性。
附图说明
图1示脐带间充质干细胞的成骨效果；
图2示脐带间充质干细胞表面标志物的表达情况。
具体实施方式
本发明公开了一种脐带间充质干细胞原代培养基及其原代培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
脐带：是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构，其外被羊膜，内含2条脐动脉、1条脐静脉，在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织-华尔通氏胶(Whartonps Jelly)。
人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)：从华尔通氏胶分离得到的基质细胞，是一种具有多项分化潜能的成纤维样细胞，于1991年由McElreavery首次分离培养出来。hUC-MSCs比来源于骨髓、脂肪以及其他组织的MSCs更具有优势，首先，脐带来源不受伦理争议，并且成本较低；其次，hUC-MSCs不会引起畸胎瘤，并且具有抑癌性，由于hUC-MSCs还具有低免疫原性、免疫调节、基质支持、旁分泌、迁移和基因稳定性，故具有良好的临床治疗潜能。
DMEM/F12培养基：F12培养基成分丰富，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基(DME/F12medium)，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。
氨甲环酸，英文名称：Tranexamic Acid，化学名称：对氨甲基环己烷甲酸、反式－4－氨甲基－环己烷甲酸。氨甲环酸可抑制纤溶酶的作用，从而显示出止血、抗变态反应、消炎的效果。主要用于急性或慢性、局限性或全身性纤维蛋白溶解亢进所致的各种出血。
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种糖蛋白，含有174个氨基酸，分子量约为20000。G-CSF主要作用于中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化和活化。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。
表皮细胞生长因子(EGF)，又名人寡肽-1，是人体内的一种活性物质，由53个氨基组成的活性多肽，藉由刺激表皮细胞生长因子受体之酪氨酸磷酸化，达到修补增生肌肤表层细胞，据说对受伤、受损之表皮肌肤拥有绝佳之疗效。其最大特点是能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。EGF还能止血，并具有加速皮肤和粘膜创伤愈合，消炎镇痛，防止溃疡的功效。EGF的稳定性能极好，在常温下不易失散流动，能与人体内各种酶形成良好的协调效应。最初的EGF主要被运用于医学领域，主要用于促进受损表皮的修复与再生，如治疗烧伤、烫伤等。
本发明提供的脐带间充质干细胞原代培养基及其原代培养方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1、混合物配比
混合物工作浓度：
(1)氨甲环酸工作浓度为500mg/mL、10000mg/mL；
(2)G-CSF工作浓度为10ng/mL、20ng/mL；
(3)EGF工作浓度为10ng/mL、20ng/mL。
配制两种培养基：
实验组：命名为A组，为DMEM/F12+混合物；
对照组：命名为B组，为DMEM/F12+10％FBS。
具体分组如下：
表1 A组培养基中各组分浓度配比
实施例2、观察比较原代细胞爬出情况
(1)剥离脐带外膜、1条静脉和2条动脉，得到华通氏胶；
(2)剪碎华通氏胶至1～2mm3，3ml/15cm皿接种华通氏胶；
(3)用实施例1中两类培养基培养华通氏胶；培养条件为：37℃，5％CO2培养箱中培养，每三天换液一次。
(4)每3天观察，比较爬出细胞情况。
爬出细胞情况如下表所示：
表2 各组爬出细胞情况
| 天数 | 3d | 6d | 9d | 12d |
| A1 | 0CFU | 1CFU | 3CFU | 5CFU |
| A2 | 0CFU | 1CFU | 5CFU | 7CFU |
| A3 | 1CFU | 3CFU | 6CFU | 8CFU |
| A4 | 1CFU | 2CFU | 5CFU | 9CFU |
| A5 | 1CFU | 3CFU | 7CFU | 10CFU |
| A6 | 3CFU | 6CFU | 15CFU | 16CFU |
| A7 | 1CFU | 4CFU | 12CFU | 13CFU |
| A8 | 2CFU | 6CFU | 16CFU | 17CFU |
| B | 0CFU | 1CFU | 5CFU | 9CFU |
由此表可见，在添加了混合物(A6/A8)的情况下，原代脐带间充质干细胞增殖速度明显优于添加FBS的培养基。
实施例3、AB组分化能力比较
取配方A8、B第3代细胞，按2.5×104细胞/mL浓度接种于含有DMEM/F12+20％FBS培养基的24孔板中，至细胞80％融合时，更换为含有1nmol/L地塞米松、10mg/L胰岛素、0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100μmol/L吲哚美辛的培养液，每周换液2次，3周后用多聚甲醛固定，油红O染色。染色结果见图1。可见清晰被染色脂滴，证明本发明A8组培养得到的脐带间充质干细胞具有成脂分化能力。
实施例4、细胞免疫表型分析
取配方A8、B组第3代细胞，消化后清洗3次，制成细胞悬液，加入抗体，流式细胞仪检测分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表达情况。试验结果见表3、图2。
表3 脐带间充质干细胞表面标志物的表达情况
上述检测结果表明该细胞是脐带间充质干细胞。
实施例5、效果对比试验
实验组：A8组；
对照组：命名为C组，为DMEM/F12+单一因子。
表4 试验组和对照组中各组分浓度配比
(1)剥离脐带外膜、1条静脉和2条动脉，得到华通氏胶；
(2)剪碎华通氏胶至1～2mm3，2.5～3ml/15cm皿接种华通氏胶；
(3)用上述两类培养基培养华通氏胶；
(4)每3天观察，比较爬出细胞情况。
爬出细胞情况如下表所示：
表5 各组爬出细胞情况
由上述结果可以看出，加了混合物培养基A8的原代脐带间充质干细胞增殖速度明显优于添加单一因子的常规培养基。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种脐带间充质干细胞原代培养基，其特征在于，由氨甲环酸、G-CSF、EGF和DMEM/F12培养基组成；所述脐带间充质干细胞原代培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：10000mg/L；
G-CSF：20ng/L；
EGF：20ng/mL；
DMEM/F12培养基：补足；
或者，所述脐带间充质干细胞原代培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：10000mg/L；
G-CSF：20ng/L；
EGF：10ng/mL；
DMEM/F12培养基：补足。
2.一种脐带间充质干细胞原代培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
剥离脐带外膜、静脉和动脉，得到华通氏胶；
剪碎华通氏胶，将剪碎的华通氏胶接种于权利要求1所述脐带间充质干细胞原代培养基中，进行原代培养。
3.根据权利要求2所述的原代培养方法，其特征在于，所述剪碎华通氏胶至1～2mm3。
4.根据权利要求2所述的原代培养方法，其特征在于，所述接种密度为2.5～3mL/15cm皿。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的原代培养方法，其特征在于，所述原代培养的条件为37℃、5％CO2。
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