CN1568193A - Il－18抑制剂在过敏反应疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及IL－18抑制剂在制备治疗和/或预防过敏反应疾病，特别是迟发型过敏反应的药物中的应用。

Description

IL-18抑制剂在过敏反应疾病中的应用

技术领域

本发明属于过敏症领域。更具体地说，本发明涉及IL-18抑制剂在治疗和/或预防过敏疾病，特别是与人体迟发型过敏反应有关的疾病中的应用。

发明背景

当过继性免疫反应以不适当形式发生时，就用到术语变态反应或过敏反应。变态或过敏反应是正常有益的免疫反应，即对外来抗原(通常是环境大分子)作出不适当动作的结果，有时会引起炎症反应和组织受损。在此情况下，变应原(在正常情况下是无害的环境刺激物)触发免疫反应，当再次接触变应原之后，免疫反应被重新激活，造成病理损害。

过敏反应是对外源性抗原的破坏性免疫反应。过敏反应有许多不同分类。有一些分类基于与抗原接触之后出现症状或皮肤测试反应所需的时间(例如速发型和迟发型过敏反应)，其取决于抗原类型(例如药物反应)，或者受累器官的本质。一般来说，这样的分类方法过于简单，没有考虑到发生的免疫反应可能不止一种，或者产生免疫损伤可能不止一种免疫反应。以下是最普遍采用的分类：

I型或速发型过敏反应由IgE介导。它也称为普通变态反应(common allergy)。速发型过敏反应(I型)是由抗原与IgE在肥大细胞或嗜碱性粒细胞上结合引起的。

I型过敏反应疾病也称特异质应性疾病，例如，它们包括过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、特应性皮炎、过敏性外源性哮喘、风疹、全身性过敏症。哮喘的发病率明显增加，虽然病因很大程度上尚未为人所知。最近，我们注意到I型反应的大幅上升与接触乳胶产品(例如胶手套、牙科用橡皮布、避孕套、呼吸设备管子、导管，特别是与乳胶接触的医疗人员和患者以及脊柱裂和泌尿生殖先天缺陷小孩的人群中间)中的水溶性蛋白质有关。对乳胶的常见反应是风疹、血管性水肿、结膜炎、鼻炎、支气管痉挛和过敏症。

一般来说，一些物质(抗原)对不具有特应反应性的人是无害的，但特应性疾病患者(包括特应性皮炎)吸入或摄取之后有发展为IgE抗体介导的过敏反应的遗传易感倾向。除特应性皮炎之外，过敏反应通常由IgE抗体介导。

II型或细胞毒性过敏反应涉及由抗体、补体和/或细胞机制介导的细胞溶解作用。II型反应的目标是细胞表面，其结果是细胞损害或死亡。抗细胞结合抗原的抗体(II型)通过激活补体或促进噬菌作用破坏细胞。由于抗体与细胞的抗原补体反应而引起的细胞损害的例子是库姆氏阳性溶血性贫血(Coombs′-positive hemolyticanemias)、抗体诱导的血小板减少性紫癜、白血球减少症、天疱疮、类天疱疮、古德帕斯彻综合征(Goodpasture′s syndrome)和恶性贫血。这些反应常见于下列患者：接受血型不符的输血反应、新生儿溶血症、新生儿血小板减少症，它们在多系统过敏反应疾病(例如全身性红斑狼疮)中也起一定作用。

损害机制最好以对红血球细胞的影响来加以说明。在溶血性贫血中，红血球细胞受血管外溶血作用或巨噬细胞吞噬作用而遭到破坏，主要是在肾内。体外研究显示，在补体存在下，一些补体结合抗体(例如血型抗体抗A和抗B)引起快速溶血作用。其他一些抗体(例如抗LE抗体)使细胞溶解减慢；仍然有一些抗体，它们不是直接破坏细胞，但会使细胞与噬菌细胞粘附而被噬菌细胞破坏。相比之下，红血球细胞上的Rh抗体不能激活补体，它们主要通过血管外噬菌作用来破坏细胞。抗原是组织补体的例子是由于存在抗血管内皮的抗体引起移植肾早期急性(超急性)移植排斥、由于抗体与肾小球及肺泡基底膜内皮反应引起古德帕斯彻综合征。在实验性古德帕斯彻综合征中，补体是一种重要的损害介导剂，但补体在早期急性移植排斥中的作用尚未得到清楚的确定。

由于半抗原与细胞或组织偶联而引起的反应例子包括许多药物过敏反应(如青霉素诱导的溶血性贫血，见下文)。

抗体与膜受体结合的结果是抗受体过敏反应改变细胞功能。据报，许多疾病(例如重肌症无力、格雷夫斯病(Graves′disease)、胰岛素抗性糖尿病)都有抗细胞膜受体的抗体。一些有极度胰岛素抗性的糖尿病患者被发现有抗胰岛素受体的抗体，因此能阻止胰岛素与其受体结合。在一些格雷夫斯病患者中，鉴定了抗促甲状腺激素(TSH)的抗体，它刺激TSH对其受体的作用，引起甲状腺机能亢进。

III型机制主要涉及与抗原形成免疫复合物的抗体。循环复合物激活补体，粘附在红血球细胞上(红血球细胞再在脾中被吞噬)，离开循环系统，并触发组织间隙发炎(Arthus反应)，或者循环复合物被递呈抗原的巨噬细胞所吞噬，释放出细胞因子，激活B和T细胞。IgE、IgA、IgG和IgM都与抗原形成复合物。免疫复合物沉积于组织，特别是沉积于皮肤、关节和肾上，进而引起III型反应。人肾小球性肾炎大部分病例是慢性免疫复合物肾炎。免疫复合物似乎在其中发挥一定作用的疾病是由血清、药物或病毒性肝炎抗原引起的血清病(serum sickness)；全身性红斑性狼疮；类风湿性关节炎；多动脉炎；冷球蛋白血症；过敏性肺炎；支气管肺曲菌病；急性肾小球性肾炎；慢性膜增生性肾小球性肾炎；以及相关的肾病。一般认为，在支气管肺曲菌病、由药物或血清诱导的血清病以及某些形式的肾病中，IgE介导的反应先于III型反应。

III型反应的标准动物模型是局部Arthus反应和实验性血清病。在Arthus反应(通常是局部皮肤反应)中，首先使动物超免疫，以诱导大量循环IgG抗体，再皮内给予小量抗原。IgG过量，抗原就会沉积，激活补体，以致很快(4至6小时)出现高度炎症水肿性局部疼痛损伤，可进而发展为含有许多多形核细胞的无菌性脓肿，再变为组织损伤。借助显微镜可观察到小动脉腔被阻塞的坏死性血管炎。因为抗体已经存在，所以反应之前无时滞。

I、II和III型反应都是由抗体引起的。IV型反应是由T淋巴细胞引起的。

IV型过敏反应涉及细胞介导的反应，一般要12小时或以上的时间才发生，基于活化的免疫细胞网络。基本组织模式是炎症，结果可能是慢性炎症疾病。IV型过敏反应又名迟发型过敏反应(IV型)或DTH。反应由T淋巴细胞释放出的白介素-2、干扰素-γ和其他细胞因子介导。在迟发型过敏反应中，T淋巴细胞与抗原反应，释放出白介素-9、干扰素-γ和其他细胞因子。一旦T细胞首次接触被致敏之后，进行第二次攻击就会发生迟发型过敏反应，这一局部炎症反应在临床上需要2至3天才发生。在组织学上说，这些反应由T淋巴细胞、巨噬细胞和偶然嗜曙红细胞的浸润构成。从实验上看，T淋巴细胞可转移DTH，但血清不能转移DTH，即不涉及抗体。

DTH可由对病毒、真菌和某些细菌，主要是结核分支杆菌和痳疯分支杆菌的感染所作的正常细胞介导的免疫反应所致。如果巨噬细胞不能破坏摄取的有机体，它们可分化为上皮样细胞或者多形核巨细胞。这些细胞聚集形成肉芽肿。局部组织受损是此保护性免疫反应的一种不希望的副作用。如果DTH不存在或减弱，但T淋巴细胞不能使侵入的微生物定位，则患者会发展为侵入性攻击性播散性疾病，如急性肺结核。

由职业或其他抗原引起的接触性皮炎也是IV型反应。引起IV型反应的物质通常具有较低分子量(＜1kD)，而且自身不具有免疫原性，相反，它们是反应性很高的分子，能与皮肤或组织蛋白共价结合。众所周知，致敏化学药品称为半抗原，与其结合的宿主蛋白作为载体。可能的致敏抗原范围很宽。普遍认为发病有2个阶段：诱导阶段和激发阶段。在诱导阶段中，皮肤内的抗原呈递细胞被称为郎格罕细胞(Langerhans’cells)，其与半抗原-载体蛋白复合物结合，使其呈递给与MHC II类抗原缔合的T淋巴细胞。T细胞的诱导可在接触小量抗原数月后才进行。再次接触相关抗原触发激发阶段，其中效应细胞迁移到皮肤，与表皮内由郎格罕细胞呈递的蛋白质复合物相遇，随后释放细胞因子，导致皮肤发炎。以斑片试验(patchtesting)诊断激怒物。将疑似接触致敏剂贴在患者背上，达48小时。在2小时和24小时后检查反应部位。测试部位出现炎症和硬结表示阳性反应。

迟发型过敏反应也是判断移植试验器官是否排斥的一个主要手段。

IV型反应在其中起重要作用的一些临床疾病有接触性皮炎、过敏性肺炎、同种异体移植排斥、因细胞内生物体引起的肉芽肿、某些形式的药物敏感性、甲状腺炎及狂犬病免疫后发生的脑脊髓炎。最后2种疾病的证据是基于实验模型，以及人患病后甲状腺和脑的炎性分泌物中出现淋巴细胞。

皮炎又名湿疹。它指表皮发炎，组织症状是表皮水肿，临床症状是起泡(急性)、轻微的边缘发红、水肿、渗液、结痂、有鳞，通常还有瘙痒，以及由刮痕或揉搓造成的苔藓样硬化。

水肿一般指小泡性皮炎，但有时该术语也限于一般慢性皮炎的水肿。有些还指皮肤棘细胞层水肿皮炎，这是因为皮肤棘细胞层水肿(表皮内水肿)是一种组织特征。

接触性皮炎是一种急性或慢性炎症，通常呈不均匀或奇怪形状，由接触皮肤并引起毒性(刺激性)或过敏反应的物质产生。

过敏反应的诊断取决于所涉及的反应类型。

当炎症反应的组织表征是血管周淋巴细胞和巨噬细胞时，可疑似IV型反应。迟发型过敏反应的最简便测试方法是迟发型过敏反应皮肤测试和斑片测试。

为了防止接触性皮炎恶化，在清除接触性皮炎之后进行斑片测试。将(适当浓度的)疑似变应原放在一块非吸收性贴片下置于皮肤上，达48小时。如果这之前感到有灼热或发痒，即可撕去贴片。若呈现一些硬结红斑，偶然还形成小泡则测试为阳性。因为一些反应在撕去贴片之后才出现，所以在72小时和96小时重新检查反应部位。

过敏反应也可以是对药物的反应。在确定为对药物的给定反应之前，需要注意安慰剂也可引起各种各样症状，甚至客观征象，如皮疹。不过，真正的药物反应构成一个主要医学问题。

在药物不耐症中，第一次使用药物后产生不良反应。较高剂量时通常可推断是同一个毒性反应，或者它可能导致常见的轻微副作用(例如抗组氨酸镇静作用)加重。特异质反应是这样一种情况：首次服用药物后不良反应是药理学上不能预测的，并且是唯一的。

药物过敏反应的特点包括仅在患者已受到药物一次或多次影响(不一定为了治疗)而平安无事之后才发生的IgE介导的反应。一旦发生过敏反应，远低于治疗量的剂量，通常为低于引起特异质反应的剂量也可以引起反应。临床特征限于它们的表面症状。在药物治疗过程中出现皮疹(特别是风疹)、类血清病综合征、非预想的发烧、过敏反应和嗜酸性肺部浸润通常是由过敏反应引起的；但有些情况为贫血、血小板减少症、或粒细胞缺乏症。与药物(例如磺酰胺、碘化物、青霉素)反复接触之后形成血管炎的情况较少，据报，在发生特异性过敏反应的情况中伴有间质肾炎(如二甲氧苯青霉素)和肝脏受损(如氟烷)。

药物过敏反应最严重的情形是过敏症。不过，到现在为止，最常见的药物反应是不明病因的麻疹样皮疹。发烧和风疹反应也是药物过敏的较常见后果。当以动物血清进行治疗，会有血清病并发症，但今天已很少用动物血清了。特别是接触诸如青霉素等药物时，有可能发生不明发病机理的重度类血清病综合征，其循环IgG抗体水平不高，但通常与IgE抗体有关。

药物过敏反应基于蛋白质和大的多肽药物的含量，它们通过直接免疫机理刺激特异性抗体产生。具有潜在抗原性的最小分子可能是胰高血糖素，其分子量约3500。大部分分子都是极小的，不能单独起抗原的作用。然而，作为半抗原，其中一些与蛋白质共价结合，所得的共轭物刺激对药物具有特异性的抗体产生。该药物，或它的其中一种代谢物，与蛋白质起化学反应。通常血清蛋白与许多药物结合弱得多，其抗原性强度不足。

现时仅测定了苄青霉素的特异性免疫反应。这种药物与组织或血清蛋白的结合稳固性不足以形成抗原复合物，但它的主要降解产物苄青霉素酸(benzylpenicillenic acid)能结合组织蛋白形成青霉素的主要抗原决定簇苄青霉噻唑基(BPO)。通过一些尚未明确的机制形成相对小量的一些次要抗原决定簇。过敏反应(I、II、III、IV)涉及最多的是BPO决定簇。抗次要决定簇的IgE抗体可能是一些患者过敏反应和风疹的发病原因。业已发现一些抗主要决定簇而非抗次要决定簇的IgG抗体。它们可能作为BPO的“阻断抗体”，修饰或者甚至阻止与BPO反应，而次要决定簇的阻断IgG抗体的不存在可以解释这些决定簇诱导过敏反应的能力。

所有半合成青霉素(例如，阿莫西林(amoxicillin)、羧苄西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin))可能与青霉素起交叉反应，所以对青霉素敏感的患者通常对它们也有反应。与头孢菌素发生交叉反应的机会稍微少一些。如果患者有对青霉素的严重反应(如过敏反应)病史，则开始头孢菌素治疗时要极为小心谨慎。

利用三种机理中任何一种都可发生血液学抗体介导的(细胞毒性，II型)药物反应：在青霉素诱导的贫血中，抗体与稳固地结合红血球细胞膜的半抗原反应，产生凝集，增加红血球细胞的破坏。在睇波芬(Stibophen)和奎尼丁(Quinidine)诱导的血小板减少症中，药物与其特异性抗体形成可溶性复合物。该复合物再与附近的血小板(“无辜旁观者”靶细胞)反应，激活单独留在血小板膜上并诱导细胞溶解的补体。在其他溶血性贫血中，药物(例如甲基多巴)似乎在化学方面改变红血球细胞表面，揭示了一种诱导后再与自身抗体反应的抗原，其通常具有Rh特异性。

毒性-特异质反应和过敏反应在性质或时间上都是极为独特的，所以通常很容易鉴定激怒药物。最常见的是由青霉素引起的血清病型反应，但有时磺酰胺、肼苯哒嗪、磺酰脲类或噻嗪也能引起血清病反应。氯丙嗪、肥皂中的某些防腐剂、磺酰胺、补骨脂素、去甲环素和灰黄霉素具有光敏作用的特点。除了被认为是绝对不可缺少的那些药物外，应该停止所有药物。当怀疑是药物发烧时，要停用最有可能的药物(例如，别嘌呤醇、青霉素、异烟肼、磺酰胺、巴比妥酸盐和奎尼丁)。48小时内退烧，极可能是该药物。如果发烧伴随粒细胞减少，较可能是药物中毒，而非过敏，这种情况更为严重。

对药物的过敏性肺部反应通常是浸润性的，伴随嗜酸细胞增多，由金盐(goldsalts)、青霉素和磺酰胺等所致。急性浸润性肺部反应的最常见起因是硝基呋喃妥因(nitrofurantoin)。这可能是过敏性的，但通常不是嗜酸性的。

肝反应可能主要是胆汗郁积(最普遍是吩噻嗪和无味红霉素)或者涉及肝细胞(别嘌呤醇、乙内酰脲、金盐、异烟肼、磺酰胺、丙戊酸等)。常见的过敏性肾反应是间质肾炎，多数由二甲氧苯青霉素引起；也包括其他一些抗菌剂和甲氰咪胍。

有一些药物通常是肼苯哒嗪和普鲁卡因胺，可引起类似全身性红斑狼疮的综合征。该综合征对抗核抗体的测试呈阳性，相对而言属于良性，不损害肾和中枢神经系统。青霉胺能引起全身性红斑狼疮和其他自身免疫疾病，特别是重肌症无力。

1989年有人叙述了一种内毒素诱导的血清活性，该活性能诱导由小鼠脾细胞获得的干扰素-γ(IFN-γ)(Nakamura等人，1989)。这种血清活性的作用不是IFN-γ的直接诱导剂，而是与IL-2或有丝分裂原一起作为共刺激剂。有人尝试由内毒素后小鼠血清纯化这种活性，结果揭示了一种分子量为50-55kDa表观均一的蛋白质。由于其他细胞因子可以作为产生IFN-γ的共刺激剂，所以无法通过中和抗IL-1、IL-4、IL-5、IL-6或TNF的抗体来中和该血清活性，提示它是一种截然不同的因子。1995年同一批科学家证实了以疮疱棒状杆菌(P.acnes)预处理的小鼠肝脏提取物中含有由内毒素诱导产生IFN-γ的共刺激剂(Okamura等人，1995)。此模型中肝脏巨噬细胞群(Kupffer细胞)扩展，低剂量细菌脂多糖(LPS)对这些小鼠来说是可致命的，但对于未经预处理的小鼠是不致命的。该因子被命名为IFN-γ诱导因子(IGIF)，后来又被称为白细胞介素-18(IL-18)，由1,200克经疮疱棒状杆菌处理过的小鼠肝脏提纯至均浆。采用由纯化IL-18的氨基酸序列所产生的简并寡核苷酸来克隆小鼠IL-18cDNA。IL-18是18-19kDa蛋白质，含有157个氨基酸，与数据库中任何一种肽没有明显的相似性。在Kupffer细胞与活化的巨噬细胞中不难检测到IL-18和白细胞介素-12(IL-12)的信使RNAs。重组IL-18似乎通过一个独立的途径诱导IFN-γ，比IL-12更有效力(Micallef等人，1996)。与由内毒素诱导的血清活性相似，IL-18本身不会诱导IFN-γ，但其主要功能是与有丝分裂原或IL-12一起作为共刺激剂。IL-18似乎通过一条依赖于IL-12的途径来增强T细胞增殖，在体外增强Th1细胞因子的产生，并且当与IL-12结合时对增强IFN-γ的产生具有协同作用(Maliszewski等人，1990)。

在克隆小鼠之后，1996年已有了IL-18的人cDNA序列的报导(Ushio等人，1996)。

用受感染的组织克隆IL-18，并对IL-18基因表达进行了研究，发现这个细胞因子与自身免疫疾病之间有密切联系。非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠会自发地发展为自身免疫胰岛炎和糖尿病，单次注射环磷酰胺可使这些病加快或同步发展。在胰岛炎早期的非肥胖型糖尿病小鼠的胰腺中通过逆转录酶PCR技术证实了IL-18mRNA。经过环磷酰胺治疗后，IL-18mRNA水平很快上升，先于IFN-γmRNA的增加，然后再发展为糖尿病。有趣的是，这些动力学酷似IL-12-p40mRNA的动力学，致使各种mRNA水平有密切联系。由胰腺RNA克隆IL-18cDNA，再作序列分析，结果发现与由Kupffer细胞及体内预活化的巨噬细胞克隆的IL-18序列相同。另外，非肥胖型糖尿病小鼠的巨噬细胞以IL-18基因表达应答环磷酰胺，而经过平行处理的Balb/c小鼠却不会作这样的应答。所以，IL-18表达在自身免疫非肥胖型糖尿病小鼠中是反常调节的，与糖尿病的发展有密切关系(Rothe等人，1997)。

IL-18可能通过增加Fas配体对Th1细胞的功能活性而对免疫调节和炎症发挥作用(Conti等人，1997)。IL-18也在肾上腺皮质中表达，因而可能是一种分泌型神经免疫调节剂，受压后在使免疫系统和谐配合上发挥重要作用(Chater，1986)。

在体内切割pro-IL-18形成IL-18，它的内源活性似乎解释了在疮疱棒状杆菌中产生IFN-γ以及LPS介导的致死现象。成熟IL-18通过IL-1β转化酶(IL-1β转化酶、ICE、半胱天冬蛋白酶(caspase)-1)由它的前体产生。

IL-18受体由至少两种成分组成，共同操作配体的结合。在由小鼠IL-12刺激的T细胞中发现了IL-18的高亲和力和低亲和力结合位点(Yoshimoto等人，1998)，提示存在着一个多链受体复合物。迄今为止鉴定了两个受体亚基，二者均属于IL-1受体家族(Parnet等人，1996)。IL-18的信号转导涉及NF-κB的活化(DiDonato等人，1997)。

最近，从人尿液分离出对IL-18有高亲和力的可溶性蛋白质，并且叙述了人和小鼠cDNAs(Novick等人，1999；WO99/09063)。该蛋白被命名为IL-18结合蛋白(IL-18BP)。

IL-18BP不是已知的IL-18受体之一的胞外结构域，而是一种分泌型天然循环蛋白。它属于分泌型蛋白的一个新家族，该家族还包括几种痘病毒编码的蛋白质，其与IL-18BP高度同源(Novick等人，1999)。IL-18BP在脾中固有地表达，属于免疫球蛋白超家族，与IL-1II型受体具有有限同源性。它的基因位于人染色体11q13上，在8.3kb的基因组序列中没发现编码跨膜结构域的外显子(Novick等人，1999)。

业已对由mRNA剪接产生以及在各种cDNA库中发现的四种人IL-18BP同种型和两种小鼠IL-18BP同种型进行了表达、纯化，并评估其结合与中和IL-18生物活性的能力(Kim等人，2000)。人IL-18BP同种型a(IL-18BPa)对IL-18的亲和力最高，结合速率快，解离速率慢，解离常数(K(d))为399pM。除了29个C末端氨基酸外，IL-18BPc与IL-18BPa都有Ig结构域；IL-18BPc的K(d)低10倍(2.94nM)。然而，过量2摩尔时IL-18BPa和IL-18BPc均能中和95％以上的IL-18。IL-18BPb和IL-18BPd同种型缺少完整的Ig结构域，因而不能结合或中和IL-18。小鼠IL-18BPc和IL-18BPd同种型具有完全一样的Ig结构域，过量2摩尔时能中和95％以上的小鼠IL-18。不过，小鼠IL-18BPd的C-末端基序与人IL-18BPa相同，故也能中和人IL-18。分子模型鉴定了IL-18BP的Ig结构域中一个较大的静电疏水混合结合位点，这可解释它与配体能以高亲和力结合的现象(Kim等人，2000)。

1998年有人提出，小鼠接触性过敏反应的发病机理涉及白介素-18(IL-18)的表达(Xu等人，1998)。Xu等人利用一个以恶唑酮为接触变应原的接触性过敏反应小鼠模型，结果发现诱导IL-18在皮肤损伤中表达。以变应原攻击后24小时发现上调最高，然后IL-18的表达逐渐下降。

Kitching等人在2000年发表了另一项报导，是关于IL-18不受IL-18影响而诱导DTH反应的能力。然而，IL-18的作用尚未清楚，这是因为据报，IL-18本身对特质性皮炎患者也可能是一种有效的治疗(Habu等人，2001)，这与临床试验相一致，提示IFN-γ能改善特质性皮炎征状(Reinhold等人，1990；Hanifin等人，1993)。

发明内容

本发明基于这样的研究结果：以IL-18抑制剂治疗IV型过敏反应小鼠模型，与对照动物相比可减轻动物的过敏反应。所以，本发明涉及IL-18抑制剂在制备治疗和/或预防过敏反应疾病的药物中的应用。根据本发明，也可考虑使用IL-18抑制剂与干扰素和/或TNF抑制剂和/或炎症抑制剂和/或抗过敏药的组合。本发明另一方面内容涉及包括IL-18抑制剂编码序列的表达载体在治疗和/或预防过敏反应疾病中的应用。本发明还涉及经过基因改造表达IL-18抑制剂的细胞在治疗和/或预防过敏反应疾病中的应用。

附图说明

图1所示为在攻击期间用IL-18BP处理以免受接触性过敏反应(CHS)。第0天在小鼠背部以DNFB致敏，5天后在耳朵上攻击。每天测量耳朵的肿胀程度，并以DNFB攻击与经介质处理的对照耳朵的的耳朵肿胀增量来表示。在第5至8天每只小鼠每天腹膜内给予250μg IL-18BP，耳朵肿胀明显减轻(A)，而同一实验设定在第0至2天给予IL-18BP则没有起到保护作用(B)(n＝每组5只小鼠)。方形：以IL-18处理的小鼠，三角形：对照小鼠，即以盐水处理的小鼠。

图2所示为迟发型过敏反应模型第5至30天耳朵肿胀的程度，其中第5天给予第一次半抗原攻击，第19天给予第二次攻击，第19至22天每只小鼠每天全身性给予250μg IL-18BP(空心方形)或介质(实心方形)。

图3所示为IL-18BP通过中和IL-18来防止发生CHS。比较IL-18缺损敲除(KO)小鼠和野生型C57BL/6小鼠对建立CHS反应的能力。IL-18缺损小鼠以DNFB产生CHS，但不如野生型小鼠明显。然而，发现对IL-18缺损小鼠以IL-18BP处理没有效果，这表明IL-18BP在CHS中的抗炎效果是中和IL-18所致。(n＝每组5只小鼠)。圆形：给予盐水的IL-18敲除小鼠；菱形：给予IL-18BP的IL-18敲除小鼠；方形：给予IL-18BP的野生型(WT)小鼠；三角形：给予盐水的野生型小鼠。

图4所示为IL-18BP不能减少CHS期间的血管渗漏。在C57BL/6小鼠中诱导发生CHS。为了监测CHS引起的水肿，在用DNFB攻击之前2小时静脉注射伊文氏蓝。24小时后处死小鼠并对耳朵处理，提取血管系统渗出并积聚在周围组织中的染料。以收集到的每毫克干燥耳朵组织所含的染料量来评估血管渗漏，分析血清中的伊文氏蓝浓度，以攻击耳朵与对照耳朵之比表示。在第4和5天给予IL-18BP处理，耳朵肿胀减至以介质处理的对照耳朵的56％(左图，p＜0.01)，而两组之间血管渗漏无显著差异。与未致敏的对照组相比两组动物的水肿明显增大(p＜0.05和p＜0.01)。作为另一个对照，每只小鼠每天给予250μg无关的蛋白质BSA。这些小鼠与以介质处理的对照小鼠一样，发生CHS。(n＝每组10只小鼠)。

图5所示为IL-18BP处理减少DNFB攻击的耳朵的炎症浸润。如上所述，在C57BL/6小鼠中诱导发生CHS。在第4至6天以IL-18BP或介质处理动物。在第7天以IL-18BP处理使肿胀减至介质对照小鼠的58％。在第7天处死小鼠，收集攻击后的耳朵，按组别合并(n＝8)，以酶消化得到单细胞悬浮液。随后用对CD45阳性活细胞选通的荧光激活细胞拣选(FACS)对细胞作特性分析。在耳朵标本中发现的αβT细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞数以占分析细胞总数的百分比来表示(上方数字)。下方数字表示这些类型的细胞在IL-18BP处理后相对于介质对照组的减少量。

图6所示为经IL-18BP处理后T细胞活化被削弱。以附在板上的抗CD3抗体再刺激经DNFB攻击后的耳朵得到的细胞，每孔2×10⁵个细胞。在随后24小时培养期间不再加入IL-18BP。利用ELISA测量3次IFNγ的产生。来自IL-18BP处理过的小鼠细胞所产生的IFNγ是用介质处理过的对照动物细胞培养液的45％。

图7所示为IL-18BP处理减少在耳朵炎症浸润中产生IFNγ的细胞数目。用50ng/ml PMA^*和500ng/ml离子霉素(Ionomycin)刺激经DNFB攻击耳朵的细胞标本，刺激时间为4小时。培养的最后2小时加入2μg/ml布雷菲德菌素A(brefeldin A)阻断细胞因子分泌。然后使细胞进行多色免疫萤光染色，分析细胞内IFNγ和表面抗原。IL-18BP处理使对IFNγ染色呈阳性的细胞数目减至介质对照组的78％。IFNγ由CD8T细胞产生，而CD4T细胞产生的IFNγ相对较少。在NK细胞和αβT细胞中检测不到IFNγ。(n.d.表示检测不到；^*荳蔻酰佛波醇乙酯)。

图8所示为IL-18BP不会妨碍郎格罕细胞到引流淋巴结的募集。给小鼠左右两侧分别涂上半抗原FITC或介质丙酮/苯二甲酸二丁酯(1∶1)。涂抹后24小时收集腹股沟淋巴结。用FACS可检测到半抗原结合的郎格罕细胞是FITC+、CD11c+细胞，它们在涂有FITC侧引流的淋巴结内而不是在仅涂有介质侧引流的对侧淋巴结内。对于涂抹前24小时和1小时用IL-18BP处理的动物，在引流淋巴结内携带半抗原的郎格罕细胞占总淋巴结细胞的1.2％。这一比例与对照处理的动物所获得的数目相差不大。(n＝每组5个引流淋巴结)。

具体实施方式

本发明基于IL-18抑制剂对IV型过敏反应小鼠模型中半抗原攻击的复原具有有益效果的研究结果。

所以，本发明涉及IL-18抑制剂在制备治疗和/或预防过敏反应疾病的药物中的应用。

本发明上下文的术语“过敏反应疾病”和“变态性疾病”是同义的。二者均指由不适当的过继性免疫反应引起的疾病或反应。过敏反应是正常有益的免疫反应对外来抗原，例如通常是环境大分子，作出不适当动作的结果，可导致炎症反应和组织受损。在过敏反应疾病中，一种正常无害的刺激物即变应原触发免疫反应，再次接触变应原之后，免疫反应被重新激活，造成病理损害。

在“发明背景”中已详细叙述了过敏反应疾病以及它们的临床症状和含义，本发明的应用涉及但不限于其中所提到的过敏反应疾病。

在本发明的一优选实施例中，过敏反应疾病选自I型过敏反应疾病、II型过敏反应疾病、III型过敏反应疾病或IV型过敏反应疾病。

I型过敏反应疾病又名速发型过敏反应或普通变态反应。I型过敏反应由IgE介导。速发型过敏反应(I型)是由抗原与IgE在肥大细胞或嗜碱性粒细胞上结合引起的。特应性疾病在I型过敏反应疾病的意义内，例如，但不限于过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、特应性皮炎、过敏性外源性哮喘、风疹、全身性过敏症。由I型(速发型)过敏反应引起的过敏症是严重的过敏反应，危及生命。

II型或细胞毒性过敏反应涉及由抗体、补体和/或细胞机制介导的细胞溶解作用。抗细胞结合抗原的抗体(II型)通过激活补体或促进噬菌作用而破坏细胞。本发明范围内的II型过敏反应疾病包括例如库姆氏阳性溶血性贫血、抗体诱导的血小板减少性紫癜、白血球减少症、天疱疮、类天疱疮、古德帕斯彻综合征和恶性贫血。这些反应发生于接受血型不符的输血、新生儿溶血症、新生儿血小板减少症的患者，它们在多系统过敏反应疾病(例如全身性红斑狼疮)中也起一定作用。

III型过敏反应疾病涉及其中抗体与抗原形成免疫复合物的反应。循环复合物激活补体，粘附在红血球细胞上，红血球细胞再在脾中被吞噬，之后复合物离开循环系统，触发组织间隙发炎。这种反应称为Arthus反应。另一种情况是复合物被递呈抗原的巨噬细胞所吞噬，释放出细胞因子，激活B和T细胞。IgE、IgA、IgG和IgM都与抗原形成复合物。III型反应通常因免疫复合物沉积于组织，特别是沉积于皮肤、关节和肾上所致。人肾小球性肾炎大部分病例是慢性免疫复合物肾炎。本发明的III型过敏反应疾病包括例如由血清、药物或病毒性肝炎抗原引起的血清病；全身性红斑性狼疮；类风湿性关节炎；多动脉炎；冷球蛋白血症；过敏性肺炎；支气管肺曲菌病；急性肾小球性肾炎；慢性膜增生性肾小球性肾炎；以及相关的肾病。

IV型过敏反应疾病涉及细胞介导的反应，一般要12小时或以上的时间才发生。IV型过敏反应疾病可包括炎症，结果可能是慢性炎症疾病。IV型过敏反应又名迟发型过敏反应或DTH。一旦T细胞经过首次接触被致敏之后，进行第二次攻击就会发生迟发型过敏反应。这个反应是一种局部炎症反应，在临床上需要2至3天才发生。

在本发明一优选实施例中，过敏反应疾病是迟发型过敏反应。所以，本发明优选涉及所有各种临床病，其中IV型反应对例如迟发型接触性过敏反应、皮炎、接触性皮炎、过敏性肺炎、同种异体移植排斥、因细胞内生物体引起的肉芽肿、某些形式的药物敏感、甲状腺炎和狂犬病免疫后发生的脑脊髓炎起重要作用。

DTH可由对病毒、真菌和某些细菌，主要是结核分支杆菌和痳疯分支杆菌的感染所作的正常细胞介导的免疫反应所致。引起DTH的其他一些外来物质可以是植物、动物、昆虫或爬虫分泌物、化学或生化物质。它们可来自合成或天然资源。各种纤维、织物等，如手术套用乳胶可在某些个体身上引起T细胞介导的过敏反应。外来激怒物可以是水性物质，例如在环境、采矿、治金和化学制造作业中找到的溶解盐或矿物质。

在本发明另一优选实施例中，过敏反应疾病是接触性皮炎或接触性过敏反应。接触性皮炎也称IV型反应，是对职业或其他抗原的一种反应。引起接触性皮炎的物质通常具有较低分子量(＜1kD)，而且自身不具有免疫原性，相反，它们是反应性很高的分子，能与皮肤或组织蛋白共价结合。致敏化合物称为半抗原，与其结合的宿主蛋白称为载体。许多引起接触性皮炎的半抗原已为人所知。为了判断个体是否对一给定的致敏物可能发展为接触性皮炎，将一疑似接触致敏物置于患者背，达48小时。在2小时和24小时后检查反应部位。测试部位出现炎症和硬结现象表示阳性反应。

迟发型过敏反应也是判断移植测试器官排斥的一个主要手段，所以，本发明还涉及IL-18抑制剂在预防移植排斥中的应用。

本发明上下文中的术语“IL-18抑制剂”，指能以减弱、降低或部分地、基本上或完全地防止或阻断IL-18产生和/或作用的方式来调节IL-18的产生和/或作用的任何分子。术语“IL-18抑制剂”包括IL-18产生的抑制剂与IL-18作用的抑制剂。

IL-18产生的抑制剂是任何一种对IL-18合成、加工或成熟有负面影响的分子。本发明考虑的抑制剂可以是，例如，白介素IL-18基因表达的抑制剂、降低或阻止IL-18mRNA转录或导致该mRNA降解的反义mRNA、损害正确折迭或部分或基本上阻止IL-18分泌的蛋白质、IL-18一旦合成后能降解它的蛋白酶、切割pro-IL-18产生成熟的IL-18的蛋白酶的抑制剂，如Caspase-1抑制剂等。

IL-18作用的抑制剂可以是IL-18拮抗剂，例如IL-18BP。拮抗剂可以以足够亲和力和特异性结合或隔离IL-18分子本身而部分或基本上中和负责IL-18与其配体结合的IL-18或IL-18结合位(例如，与其受体)。拮抗剂也可抑制在IL-18与其受体结合后细胞中所激活的IL-18信号通道。

IL-18作用的抑制剂也可以是可溶性IL-18受体或仿真受体的分子，或阻断IL-18受体的物质、IL-18抗体，如多克隆或单克隆抗体，或阻止IL-18与其靶结合，从而减弱或阻止由IL-18介导的细胞内外反应的触发的其它物质或分子。

在本发明一优选实施例中，IL-18抑制剂选自Caspase-1(ICE)抑制剂、抗IL-18抗体、抗任何IL-18受体亚基的抗体、IL-18信号通道抑制剂、能与IL-18竞争或结合与阻断IL-18受体的IL-18拮抗剂、以及IL-18结合蛋白、其具有相同活性的同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物、或盐类。

本文所用的术语“IL-18结合蛋白”与“IL-18BP”同义。它包括WO 99/09063或Novick等人(1999)所确定的IL-18结合蛋白，包括Kim等人(2000)所确定的剪接变体和/或同种型。具体地说，人IL-18BP同种型a和c可用在本发明中。本发明所用的蛋白质可以糖基化或非糖基化，它们可来自天然资源，如尿液，或者它们最好是重组产生的。可在原核生物表达系统如大肠杆菌，或真核生物最好是在哺乳动物表达系统中进行重组表达。

本文所用的术语“突变蛋白”指IL-18BP的同类物，或病毒性IL-18BP的同类物，其中天然IL-18BP或病毒性IL-18BP的一个或多个氨基酸残基被不同氨基酸残基所取代，或缺失，或者IL-18BP或病毒性IL-18BP的天然序列中加入了一个或多个氨基酸残基，但所产生的产物的活性与野生型IL-18BP或病毒性IL-18BP相比无显着降低。这些突变型蛋白可用已知的合成和/或定点诱变技术，或任何适合的其它已知技术制备。

本发明的突变蛋白包括由核酸如DNA或RNA编码的蛋白质，所述的核酸在中等或高度严谨条件下能与编码本发明的IL-18抑制剂的DNA或RNA杂交。术语“严谨条件”指杂交和随后的洗涤条件，这些条件是本领域普通技术人员常规所指“严谨的”条件。参见上述文献Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，Interscience，N.Y.，§§6.3和6.4(1987，1992)，以及Sambrook等人(Sambrook，J.C.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.(1989)，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。没有限制作用的严谨条件的例子包括以下洗涤条件：例如在比研究中计算的杂交温度Tm低12-20℃的温度下用2xSSC和0.5％SDS洗5分钟，用2xSSC和0.1％SDS洗15分钟；37℃用0.1xSSC和0.5％SDS洗30-60分钟，然后在68℃用0.1xSSC和0.5％SDS洗30-60分钟。本领域普通技术人员知道严谨条件还取决于DNA序列的长度、寡核苷酸探针(如10-40个碱基)或混合的寡核苷酸探针。如果采用混合的探针，最好用四甲基氯化铵(TMAC)代替SSC。参见上述引用的文献Ausubel。

同一性反映两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系，通过比较这些序列而确定。通常，同一性指两个多核苷酸或两个多肽序列在各自要比较的序列长度中，它们的核苷酸与核苷酸或者氨基酸与氨基酸之间的对应是完全一样的。

对于其对应不是完全一样的序列，可以确定“同一性百分比”。通常把待比较的两个序列进行序列对比，得出这两个序列之间的最大相关性。这可包括在其中一个或两个序列中插入“缺口(gap)”以增加对比度。比较每一个序列的整个长度(所谓的全域性对比(global alignment))，或者比较它们的较短的限定长度(所谓的区域性对比(local alignment))可确定同一性百分比，前者特别适合长度相等或长度差不多的序列，后者更适合长度不相等的序列。

两个或多个序列同一性和同源性的比较方法已为本领域技术人员所熟知。例如，Wisconsin序列分析软件包9.1版(Devereux J等人，1984)所提供的程序，又例如程序BESTFIT和GAP均可用于确定两个多核苷酸之间的同一性百分比与两个多肽序列之间的同一性百分比及同源性百分比。BESTFIT采用Smith和Waterman的“区域性同源性”算法(1981)，找出两个序列间最佳的单个相似区域。其它确定两个序列间同一性和/或相似性的程序也已为本领域所知，例如BLAST程序家族(Altschul S F等人，1990，Altschul S F等人，1997，登入NCBI主页www.ncbi.nlm.nih.gov可查询得到)与FASTA(Pearson W R，1990，Pearson 1988)。

任何这样一种突变蛋白最好具有IL-18BP充分复制、或病毒性IL-18BP充分复制的氨基酸序列，从而具有与IL-18BP基本上相似的活性。IL-18BP的一种活性是它能结合IL-18。只要该突变蛋白对IL-18具有很大的结合活性。它就可用于纯化IL-18，如借助亲和层析法，从而认为其具有与IL-18BP基本上相似的活性。因此，可借助常规实验方法来确定任何一个给定突变蛋白是否具有与IL-18BP基本相同的活性，实验方法包括对这样一种突变蛋白进行例如简单的夹心竞争试验(simplesandwich competition assay)，以确定它是否能与被适当标记的IL-18结合，如放射免疫试验或酶联免疫吸附试验(ELISA)。

在一优选实施例中，任何这样一种突变蛋白与IL-18BP或病毒性编码的IL-18BP同类物的序列具有至少40％同一性或同源性。更优选具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％，最优选至少90％同一性或同源性。

可用于本发明的IL-18BP多肽突变蛋白或病毒性IL-18BP突变蛋白，或编码它们的核酸，包括一组有限的基本上与取代肽或多核苷酸相应的序列，本领域普通技术人员可根据本文所述和提供的指南用常规方法获得，而无须进行过多实验。

本发明突变蛋白中的优选变化是称为“保守性”取代。IL-18BP多肽或蛋白或病毒性IL-18BP的保守性氨基酸取代可包括一组内的同义氨基酸，其具有足够相似的生理化学特性，该组成员之间的取代将保留该分子的生物功能(Grantham，1974)。显然，在上述序列中也可进行氨基酸的插入和缺失而不改变其功能，特别是如果这种插入或缺失只涉及少数氨基酸时，如30个以下，最好为10个以下，而且不除去或取代对功能性构型起关键作用的氨基酸，如半胱氨酸残基。这类缺失和/或插入所产生的蛋白质和突变蛋白属于本发明范围。

优选同义氨基酸组是表1列出的那些组；更好的同义氨基酸组是表2列出的那些组；最好的同义氨基酸组是表3列出的那些组。

表1    优选同义氨基酸组

氨基酸    同义组

Ser       Ser，Thr，Gly，Asn

Arg       Arg，Gln，Lys，Glu，His

Leu       Ile，Phe，Tyr，Met，Val，Leu

Pro       Gly，Ala，Thr，Pro

Thr       Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，Thr

Ala       Gly，Thr，Pro，Ala

Val       Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，Val

Gly       Ala，Thr，Pro，Ser，Gly

Ile       Met，Tyr，Phe，Val，Leu，Ile

Phe       Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，Phe

Tyr       Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，Tyr

Cys       Ser，Thr，Cys

His       Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，His

Gln       Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，Gln

Asn       Gln，Asp，Ser，Asn

Lys       Glu，Gln，His，Arg，Lys

Asp       Glu，Asn，Asp

Glu       Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，Glu

Met       Phe，Ile，Val，Leu，Met

Trp       Trp

表2    更好的同义氨基酸组

氨基酸    同义组

Ser       Ser

Arg       His，Lys，Arg

Leu       Leu，Ile，Phe，Met

Pro       Ala，Pro

Thr       Thr

Ala       Pro，Ala

Val       Val，Met，Ile

Gly       Gly

Ile       Ile，Met，Phe，Val，Leu

Phe       Met，Tyr，Ile，Leu，Phe

Tyr       Phe，Tyr

Cys       Cys，Ser

His       His，Gln，Arg

Gln       Glu，Gln，His

Asn       Asp，Asn

Lys       Lys，Arg

Asp       Asp，Asn

Glu       Glu，Gln

Met         Met，Phe，Ile，Val，Leu

Trp         Trp

表3      最好的同义氨基酸组

氨基酸      同义组

Ser         Ser

Arg         Arg

Leu         Leu，Ile，Met

Pro         Pro

Thr         Thr

Ala         Ala

Val         Val

Gly         Gly

Ile         Ile，Met，Leu

Phe         Phe

Tyr         Tyr

Cys         Cys，Ser

His         His

Gln         Gln

Asn         Asn

Lys         Lys

Asp         Asp

Glu         Glu

Met         Met，Ile，Leu

Trp         Met

在蛋白质中产生氨基酸取代的实施例可用来获得本发明中所用的IL-18BP多肽或蛋白质的突变蛋白，或病毒性IL-18BP的突变蛋白，其包括任何已知的方法步骤，如Mark等人的美国专利4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等人的5,116,943；Namen等人的4,965,195；Chong等人的4,879,111和Lee等人的5,017,691专利中提出的方法，以及美国专利4,904,584(Shaw等人)中提出的赖氨酸取代蛋白质。

术语“融合蛋白”指一多肽包含IL-18BP或病毒性IL-18BP或其突变蛋白或片段与另一蛋白质，如在体液中停留时间延长的蛋白质，融合。故IL-18BP或病毒性IL-18BP可与另一蛋白质、多肽等，如免疫球蛋白或其片段，融合。

本文使用的“功能性衍生物”，包括IL-18BP或病毒性IL-18BP衍生物及其突变蛋白和融合蛋白，它们可用本领域已知方法从残基或N端或C端基团上以侧链存在的功能性基团制备。只要它们仍然在药学上可接受，即它们没有破坏与IL-18BP或病毒性IL-18BP活性基本上相似的蛋白质活性，并且不会使含它的组合物具有毒性，均包括在本发明中。

这些衍生物例如可以包括聚乙二醇侧链，其可遮蔽抗原位并延长IL-18BP或病毒性IL-18BP在体液中的停留时间。其它衍生物包括羧基脂肪酯，羧基与氨或伯胺或仲胺反应产生的酰胺、氨基酸残基的游离氨基与酰基部分分子(如烷酰基或碳环芳酰基)形成的N-酰基衍生物、或游离羟基(如丝氨酰或苏氨酰残基的游离羟基)与酰基部分分子形成的O-酰基衍生物。

本发明的IL-18BP或病毒性IL-18BP、突变蛋白和融合蛋白的“活性部分”包括单独蛋白分子多肽链的任何片段或前体，或蛋白分子与相关分子或与其相连的残基，如糖或磷酸根残基一起，或蛋白分子或糖残基自身的聚集物，只要所述部分具有与IL-18BP基本上相似的活性。

本文所用的术语“盐”指羧基盐和IL-18抑制剂分子中氨基的酸加成盐，或其类似物。羧基盐可通过本技术领域公知的方法形成，包括无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等，以及有机碱盐，例如三乙醇胺等胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶、普鲁卡因(procaine)等形成的盐。酸加成盐包括例如无机酸盐，如盐酸盐或硫酸盐，有机酸盐，如乙酸盐或草酸盐。当然，任何这样的一种盐必须保留与本发明有关的IL-18抑制剂的生物活性，例如，对DHT具有有益的效果。

在本发明另一优选实施例中，IL-18抑制剂是抗IL-18抗体。抗IL-18抗体可以是多克隆或单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或甚至完全人抗体。重组抗体及其片段的特点是在体内能与IL-18高亲和力结合，而且毒性低。可用于本发明的抗体应具有的特征是对患者进行足够时间的治疗，它们能良好至优异地减退或缓解病情或与病情相关的任何一种症状或一组症状，并且毒性低。

通过以IL-18免疫不难在家兔、山羊或小鼠等动物中产生中和抗体。免疫小鼠特别适用于提供B细胞来源以制备杂交瘤细胞，进而培养杂交瘤细胞产生大量抗IL-18单克隆抗体。

嵌合抗体是具有衍生自不同种动物的二个或多个节段或部分的免疫球蛋白分子。通常嵌合抗体的可变区来自非人哺乳动物抗体，如小鼠单克隆抗体，而该免疫球蛋白的恒定区来自人免疫球蛋白分子。这两个区及其组合最好如常规方法测定那样具有低免疫原性(Elliott等人，1994)。人源化抗体是用基因工程技术构建的免疫球蛋白分子，其中用人的恒定区置换小鼠恒定区，而保留小鼠抗原结合区。所产生的小鼠-人嵌合抗体宜具有降低的免疫原性，和改善的人体中的药物动力学(Knight等人，1993)。

因此，在另一优选实施例中，IL-18抗体是人源化IL-18抗体，例如，欧洲专利申请EP0974600叙述了人源化抗IL-18抗体的优选例子。

在另一优选实施例中，IL-18抗体是全人抗体。在WO 00/76310，WO 99/53049，US6,162,963或AU5336100中详细叙述了产生人抗体的技术。全人抗体优选是在转基因动物中，例如在包括全部或部分功能性人Ig基因座的异种小鼠中产生的重组抗体。

在本发明的一个高度优选实施例中，IL-18抑制剂是IL-18BP，或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物。这些同种型、突变蛋白、融合蛋白或功能性衍生物保留了IL-18BP的生物活性，特别是结合IL-18的活性，优选具有至少基本上类似于IL-18BP的活性。理想的话，这些蛋白质具有的生物活性比未修饰的IL-18BP更高。优选的活性组分具有的活性比IL-18BP的活性更好或具有其他优点，如稳定性更好，毒性或免疫原性更低，或它们更易大量生产，或更易提纯。

IL-18BP及其剪接变体/同种型的序列可从WO 99/09063或Novick等人(1999)以及Kim等人(2000)所述的方法获得。

可将IL-18BP的功能性衍生物与聚合物偶联以改进该蛋白质的性能，如稳定性、半衰期、生物利用性、人体耐受性、或免疫原性。为达到此目的，IL-18BP可与例如聚乙二醇(PEG)连接。例如，可按WO92/13095所述的已知方法进行聚乙二醇化。

因此，在本发明的一优选实施例中，功能性衍生物可包含至少一部分连接于一个或多个官能团，所述官能团以氨基酸残基上一个或多个侧链的形式出现。该分子部分是聚乙二醇(PEG)的实施例是高度优选的。

在本发明另一优选实施例中，IL-18抑制剂包含一个免疫球蛋白，即IL-18抑制剂是一种融合蛋白，含有IL-18结合蛋白的全部或一部分，其与免疫球蛋白全部或一部分融合。制备免疫球蛋白融合蛋白的方法已为本领域公知，如WO 01/03737所述的方法。本领域技术人员知道本发明所得到的融合蛋白保留了IL-18BP的生物活性，特别是结合IL-18的活性。这种融合可以是直接的，或通过一个短接头肽相融合，短接头肽长度短至1-3个氨基酸残基或较长，如13到20个氨基酸残基。例如，所述接头可以是E-F-M(Glu-Phe-Met)序列的三肽或含有13个氨基酸的接头序列，其包含导入在IL-18BP序列和免疫球蛋白序列之间的Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met。所产生的融合蛋白具有改进的性能，如在体液的停留期(半衰期)延长，比活性提高，表达水平增加或有利于该融合蛋白的纯化。

在一优选实施例中，将IL-18BP融合于Ig分子的恒定区。优选融合于重链区，例如，人IgG1的CH2和CH3区。产生的特异性融合蛋白包含有WO 99/09063的实施例11所述的IL-18BP和免疫球蛋白的一部分。Ig分子的其它同种型也适合用来产生本发明的融合蛋白，例如，同种型IgG₂或IgG₄，或其它Ig类，如IgM或IgA。融合蛋白可以是单体或多聚体，异质或同质多聚体。

干扰素主要因其对病毒复制和细胞增殖有抑制作用而为人所认知。例如，干扰素-γ在促进免疫和炎症应答中起重要作用。据说干扰素β(IFN-β，I型干扰素)有抗炎症作用。

所以，本发明还涉及IL-18抑制剂与干扰素的组合在制备治疗过敏反应疾病的药物中的应用。

也可将干扰素与聚合物结合以改进该蛋白质的稳定性，例如，WO99/55377叙述了干扰素β和多元醇聚乙二醇(PEG)之间的共轭物。

在本发明另一优选实施例中，干扰素是干扰素-β(IFN-β)，更优选是IFN-β1a。

IL-18产生和/或作用的抑制剂最好与干扰素同时、先后或分开使用。

在本发明另一实施例中，IL-18抑制剂与TNF拮抗剂联合使用。TNF拮抗剂以几种方式发挥其活性。首先，拮抗剂能以足够的亲和力和特异性结合或封蔽TNF分子本身，以致部分或基本上中和了TNF表位或负责与TNF受体结合的表位(下文称为“遮蔽性拮抗剂”)。例如，一种遮蔽性拮抗剂可以是抗TNF的抗体。

另一方面，TNF拮抗剂可抑制TNF结合后由细胞表面受体所激活的TNF信号传递通道(以下称为“信号传递拮抗剂”)。这二组拮抗剂可单独或一起，与IL-18抑制剂联合应用来治疗过敏反应疾病。

TNF拮抗剂不难鉴定并通过常规筛选方法评价，即在体外敏感细胞系中，例如TNF能引起其增殖和分泌免疫球蛋白的人B细胞中，筛选候选拮抗剂对天然TNF活性的作用来评价。该试验包括不同稀释度的候选拮抗剂的TNF制剂，例如，试验所用的TNF摩尔量的0.1倍到100倍，对照组无TNF或只有拮抗剂(Tucci等人，1992)。

封蔽拮抗剂是本发明优选使用的TNF拮抗剂。在封蔽拮抗剂中，优选使用那些以高亲和力结合TNF并具有低免疫原性的多肽。特别优选可溶性TNF受体分子和抗TNF的中和抗体。例如，可溶性TNF-RI和TNF-RII可用于本发明中。这些截短型受体是本发明更优选的拮抗剂，其包含该受体的细胞外结构域或其功能性部分，例如，EP914431叙述了截短的可溶性TNF-I型和II型受体。

截短型TNF受体是可溶的并在尿和血清中检测到30kDa和40kDa的TNF抑制性结合蛋白，这两种TNF抑制性结合蛋白分别称为TBPI和TBPII(Engelmann等人，1990)。根据本发明，IL-18抑制剂与TNF拮抗剂可同时、先后或分开使用。

根据本发明，优选TNF拮抗剂是TBPI和TBPII，与IL-18抑制剂联合使用。该受体分子的衍生物、片段、区段和生物活性部分，按功能装配成本发明用的受体分子。受体分子的这种生物活性等价物或衍生物，指多肽部分或编码该受体分子的序列部分，其大小足够并能以亲和力结合TNF，以致抑制或阻断与膜结合的TNF受体的相互作用。

本发明另一优选实施例中，可溶性人TNF-RI(TBPI)是本发明采用的TNF拮抗剂。欧洲专利EP 308378、EP 398327和EP 433900叙述了天然和重组的可溶性TNF受体分子及其制备方法。

IL-18抑制剂可与TNF抑制剂同时、先后或分开使用。

在本发明另一优选实施例中，这种药物还包括抗炎药，如非类固醇抗炎药(NSAID)。在一优选实施例中，IL-18抑制剂与COX-抑制剂最好与COX-2抑制剂联用。COX-抑制剂在本领域中已公知。例如，WO 01/00229公开了一些具体COX-2抑制剂。活性成分可同时、先后或分开使用。

过敏反应疾病通常以抗过敏药治疗，例如抗组胺剂、色甘酸、糖皮质激素或抑交感神经剂。所以，本发明还涉及包括IL-18抑制剂与抗过敏药的组合治疗。根据本发明，抗组胺剂和/或色甘酸和/或糖皮质激素和/或抑交感神经剂最好与IL-18抑制剂分开、先后或同时使用。

在本发明另一优选实施例中，IL-18抑制剂的用量约为0.0001-1000mg/kg体重，或约0.001-100mg/kg体重，或约0.01-10mg/kg体重，或约0.1-5mg/kg体重，或约1-3mg/kg体重。

本发明的IL-18抑制剂最好局部给予。例如，对于接触性皮炎，IL-18抑制剂可直接施加在皮肤的感染部位上。

在本发明另一实施例中，IL-18抑制剂是全身给予的，优选皮下或肌内给予。

本发明还涉及一种含有IL-18抑制剂编码序列的表达载体在制备预防和/或治疗过敏反应疾病的药物中的应用。所以，考虑用基因疗法将IL-18抑制剂输送到需要该抑制剂的部位。为了治疗和/或预防过敏反应疾病，可将包含IL-18产生和/或作用抑制剂的序列的基因治疗载体直接注射在患病组织中，例如以避免全身性给予基因治疗载体所涉及的问题，如载体的稀释、到达与靶向靶细胞或组织，以及产生副作用。

本发明还考虑在正常沉默表达IL-18抑制剂或表达抑制剂的量不充分的细胞中能诱导和/或增强内源性产生IL-18抑制剂的载体的应用。该载体可包括在所需表达IL-18抑制剂的细胞中起作用的调控序列。例如，这类调控序列可以是启动子或增强子。然后，可通过同源重组将该调控序列导入基因组的正确基因座中，使调控序列与基因作可操作性相连，所需要的表达即被诱导或被增强。该技术通常称为“内源性基因激活”(EGA)，在WO91/09955中有所叙述。

本领域技术人员知道，也可用同一技术直接关闭IL-18的表达，而无需用到IL-18抑制剂。为此，可将一个负调节元件如沉默元件导入到IL-18的基因座中，从而导致下调或防止IL-18的表达。本领域技术人员懂得，IL-18表达的这种下调或沉默与使用IL-18抑制剂的效果相同，用于预防和/或治疗疾病。

本发明还涉及经过基因改造产生IL-18抑制剂的细胞在制备预防和/或治疗过敏反应疾病的药物中的应用。

本发明还涉及药物组合物，特别是用于预防和/或治疗过敏反应疾病的药物组合物，其包括治疗有效量的IL-18抑制剂和/或治疗有效量的干扰素和/或药学上有效量的TNF抑制剂和/或药学上有效量的抗炎药和/或药学上有效量的抗过敏药，特别是抗组胺。

作为IL-18抑制剂，该组合物可包括caspase-1抑制剂、抗IL-18抗体、抗任何IL-18受体亚基的抗体、IL-18信号通道抑制剂、与IL-18竞争并阻断IL-18受体的IL-18拮抗剂、以及IL-18结合蛋白、其具有相同活性的同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物。

该药物组合物的优选活性成分是上述IL-18BP及其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物。

该药物组合物的干扰素优选IFN-β。

另一优选实施例的药物组合物含有治疗有效量的TNF-α抑制剂。本发明的药物组合物还可包含一种或多种COX-抑制剂。

定义“药学上可接受的”指包含不会干扰活性成分的生物活性效果，并对给予的宿主无毒性的任何载体。例如，为了在肠胃外给药，可将这些活性蛋白以注射用单位剂量形式配制在载体中，如盐水，葡萄糖液，血清白蛋白和林格(Ringer)溶液。

本发明药物组合物的活性成分可以以各种途径给予个体。给药途径包括皮内、透皮(如缓释制剂)、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、口服、颅内、硬膜外、局部、直肠和鼻内等途径。也可采用其它有效治疗途径给药，例如通过上皮或内皮组织吸收或通过基因疗法将编码活性药物的DNA分子给予患者(如通过载体)，导致该活性药物在体内表达和分泌。此外，可将本发明的蛋白质与生物活性药物的其它组分，如药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、载体、稀释剂和介质等，一起给予。

对于肠胃外(如静脉内、皮下、肌内)给药，可将活性蛋白质配制成溶液、悬浮液、乳液或与药学上可接受的肠胃外介质(如水、盐水、葡萄糖液)以及能维持等渗性(如甘露糖醇)或化学稳定性(如防腐剂和缓冲液)的添加剂一起制成冻干粉末。以常规技术给制剂灭菌。

本发明的活性蛋白质也可用共轭方法增加分子在人体内的半衰期而改善其生物利用性。例如，如PCT专利申请WO 92/13095所述那样，使分子与聚乙二醇连接。

活性蛋白的治疗有效量是很多变量的函数，包括拮抗剂类型、拮抗剂对IL-18的亲和力、拮抗剂显示的残留毒性、给药途径、患者的临床状态(包括维持内源性IL-18活性的非毒性水平是否合乎需要)。

“治疗有效量”是给予时IL-18抑制剂抑制IL-18生物活性的量。给予个体单剂或多剂的剂量取决于各种因素，包括IL-18抑制剂的药物动力学性能、给药途径、患者的病情和身体特征(性别、年龄、体重、健康状况和身型大小)、症状轻重程度、并行治疗、治疗频度和所要求的效果。本领域技术人员都掌握了调整和操作已确定的剂量范围以及在体内外测定个体中IL-18被抑制的方法。

按照本发明，IL-18抑制剂的用量约为0.001-100mg/kg体重，或约0.01-10mg/kg体重，或约0.1-5mg/kg体重，或约1-3mg/kg体重，或约2mg/kg体重。

本发明优选的给药途径是皮下途径，本发明更优选的是肌内给药。为了将IL-18抑制剂直接加在它作用的地方，最好局部给予。

在另一优选实施例中，IL-18抑制剂是每天或每隔一天给予。

每日剂量通常分成几剂或以缓释形式给予，能有效地获得所希望的效果。第二次或随后给药可以与首次或原先给予该个体的相同剂量、少于或多于此剂量进行。可在发病时或发病前进行第二次或随后给药。

按照本发明，IL-18抑制剂可以以治疗有效量特别是与干扰和/或TNF和/或另一种抗炎药如COX抑制剂和/或抗过敏药先于、同时或依次与其它治疗方案或药物(如多种药物方案)预防性或治疗性地给予个体。与其它治疗药物同时给予的活性药物可在相同或不同的组合物中。

本发明还涉及一种药物组合物的制备方法，包括将有效量的IL-18抑制剂和/或干扰素和/或TNF拮抗剂和/或COX抑制剂与药学上可接受的载体混合。

本发明还涉及一种治疗过敏反应疾病的方法，包括把药学上有效量的IL-18抑制剂给予有需要的患者。

以上对本发明进行了完整的叙述，本领域技术人员在不脱离本发明的思路和范围内，可以在宽范围的等效参数、浓度和条件内进行相同的工作，而无需作多余的实验。

虽然结合具体实施例对本发明进行了叙述，但应明白，它能够作其它改进。总之，本申请包括遵循本发明的原理而对本发明作出的任何改变、应用或适应性变化，包括那些本发明没有公开的内容，其通过与本发明相关的本领域所公知或常规技术推导出的并可应用于上文所述的在所附权利要求书范围内的基本专题。

本文所引用的全部文献，包括期刊文章或摘要、公开或未公开的美国或外国专利申请、已授权的美国或外国专利或其它文献，均纳入本文参考文献中。包括引用文献中提供的全部数据、表格、图形及文字。此外，本文引用文献内所引用的内容也整体纳入作为参考。

总之，参考已知的方法步骤、常规的方法步骤、已知方法或常规方法并不是承认本发明的任何方面、叙述或实施例均已在相关技术领域中公开得到、启发或者暗示。

上述对具体实施例的叙述将完整地揭示本发明的总体特征，其他人运用本领域的一般技术的常识(包括本文引用的参考文献的内容)可在无需过多的实验和不脱离本发明总体概念的条件下，不难对这些具体实施例的各种应用作出改变和/或调整。所以，根据本文所述和指引，意味着这样一些改变和/或调整在本发明所公开的实施例相等的范围内。需要知道的是，本文的用语或术语是为了说明而不具有限制性，因此这些术语或用语可由本领域技术人员根据本文所述和提供的指引，并结合本领域普通技术人员所知道的常识作出解释。

实施例

实施例1  IL-18BP处理能减轻接触性过敏反应

方法

以下实施例所用的是实验诱导的接触性过敏反应(CHS)小鼠模型。以局部给予致敏剂之后耳朵肿胀的情况来衡量CHS程度。

有人详细叙述了小鼠耳朵肿胀试验(Garrigue等人，1994)，由这些试验所得到的数据示于图1至3(见下文)。简言之，通过在小鼠刮过的腹部局部施加25微升0.5％2，4-二硝基氟苯(DNFB；Sigma Chemical Co.)在丙酮/橄榄油中的溶液使小鼠致敏(第0天)。5天后，在右耳给予20微升0.2％DNFB在同一种介质中的溶液，左耳仅给予介质。

每只小鼠从第5至8天每日腹膜内接受250微克rhIL-18BP(重组人18BP)，或者对照组每只动物从第5至8天每日腹膜内接受250微克盐水(图1A)，或者它们在第0至2天接受IL-18BP(图1B)。

用厚度计(Mitutoyo Corp.，Kawasaki，Japan)测量耳朵厚度，将攻击后厚度减去攻击前厚度，再减去介质攻击的对侧耳朵的任何肿胀，据此来估计耳朵肿胀。

在第0、5、6、7、8、9、12、14、16天测量耳朵肿胀。

由另一个模型得到的数据示于图4至6，见以下实施例。在实验诱导对2，4-二硝基氟苯(DNFB)的接触性过敏反应过程中，，用IL-18结合蛋白(IL-18BP)中和IL-18。实验方案如下：

1.第0天：致敏将25微升DNFB(0.5％，介质为丙酮/橄榄油(4/1))施加在小鼠刮过的背上。

2.第5天：攻击  小鼠右耳的背侧和腹侧各施加5微升DNFB(0.2％)，左耳的背侧和腹侧各施加5微升丙酮/橄榄油介质。

3.第6天：读数监测耳朵厚度，作为炎症的衡量，以攻击后耳朵与对照耳朵的肿胀(微米)增量来表示分值。

4.第6或7天：对耳朵作分析在此模型中，在第6天和第7天之间的肿胀最严重。在第0、1和2天的致敏期间或在第4、5、6天的攻击期间，每只动物通过每日注射250微克IL-18BP(在盐水中)中和IL-18。

结果

接触性过敏反应(CHS)是由T细胞介导的半抗原特异性皮肤炎症。大多数半抗原引起主要由CD8+效应T细胞组成的少克隆T细胞反应，而CD4+T细胞在CHS反应中具有下调的作用(Bour，H.，等人，1995；Grabbe等人，1998)。为了测试IL-18在CHS中的作用，用DNFB使小鼠上表皮致敏，再在5天后对耳朵皮肤施加半抗原进行攻击。与半抗原攻击相对应的是，每只小鼠每日腹膜内注射250μg rhIL-18BP或盐水。在第一次DNFB致敏(第0天)后第5至8天，每日给予IL-18BP或作为对照的盐水。第5天的DNFB攻击诱导两组动物的耳朵明显肿胀(图1A)。用盐水处理的小鼠(三角形)肿胀程度较IL-18BP处理的小鼠(方形)更加显著，在第9天回复到差不多正常的状态。

由此可见，第0至2天以IL-18BP处理的小鼠耳朵肿胀变化不具有统计学意义(图1B)。给予IL-18BP的时间似乎是IL-18BP处理获得有益效果的一个重要因素。

结论

在此建立的接触性过敏反应/接触性皮炎小鼠模型中，用IL-18抑制剂处理3天对由给予半抗原引起的肿胀/炎症程度具有明显有益的效果。

实施例2  IL-18BP处理能减轻第2次攻击后的接触性过敏反应

方法

在小鼠刮过的腹部上表皮施加25微升0.5％DNFB溶液使C57BL/6小鼠致敏(第0天)。在第5天给予小鼠耳朵20微升0.2％DNFB，接受第1次攻击。在第19天给予小鼠DNFB，接受第2次攻击。第0天(半抗原致敏)、第5天(第1次半抗原攻击)、第6、7、8、9、12、14、16、19天(第2次半抗原攻击)、第20、21、22、23、26、28、30天测量耳朵肿胀。每组动物的平均值与标准方差见图2。每只小鼠从第19天至23天每日腹膜内接受250微克IL-18BP(n＝5；图2，空心方形)或盐水(n＝5；图2，实心方形)。

结果

如图2所示，IL-18BP处理使耳朵肿胀大大减轻，特别在第2次半抗原攻击之后。

所以，IL-18BP治疗特别适合过敏反应疾病的治疗，其中患者通常用同一种致敏原反复攻击，需要接受治疗以消除由攻击引起的炎症反应。

实施例3  IL-18BP通过中和IL-18来防止发生CHS

为了证明用IL-18BP处理中和IL-18可防止发生肿胀，故而比较了IL-18缺损敲除小鼠和野生型C57BL/6小鼠对建立CHS应答的能力。IL-18缺损小鼠确实对DNFB攻击产生CHS，虽然不如野生型小鼠明显。然而，发现对IL-18缺损小鼠以IL-18BP处理没有效果，如图3所示，这表明IL-18BP在CHS中的抗炎效果是中和IL-18所致。(n＝每组5只小鼠)。

实施例4  IL-18BP并不减少血管渗漏

方法

如上所述，诱导C57BL/6小鼠发生CHS。为了监测由CHS反应引起的水肿，在用DNFB攻击之前2小时静脉注射伊文氏蓝。24小时后处死小鼠，对耳朵处理，提取从血管系统渗出并积聚在周围组织中的染料。以收集到的每毫克干燥耳朵组织所含的染料量来评估血管渗漏，分析血清中的伊文氏蓝浓度，以攻击耳朵与对照耳朵之比表示。在第4和5天给予IL-18BP处理，耳朵肿胀减至以介质处理的对照耳朵的56％(图4，左部分，p＜0.01)，而两组之间血管渗漏无显著差异(图4，右部分)。两组动物的水肿与未致敏的对照组相比明显增加(p＜0.05和p＜0.01)。作为另一个对照，每只小鼠每天给予250微克无关的蛋白质BSA。这些小鼠与以介质处理的对照小鼠一样，发生CHS。(n＝每组10只小鼠)。

血管渗漏的体外测定(伊文氏蓝)

原则：注射(静脉)伊文氏蓝，从靶组织(耳朵)中提取

评估的原始数据：

·伊文氏蓝标准曲线(OD₆₂₀/纳克)

·血液中的伊文氏蓝浓度(分别是OD₆₂₀/毫升或微克/毫升)

·耳朵组织干重(lpsi，对侧，毫克)

·耳朵中的伊文氏蓝含量(lpsi，对侧，分别是OD₆₂₀/微克或纳克/毫克)结合DNFB诱导CHS的方案

·在实验诱导CHS的第5天，用DNFB攻击之前2小时在小鼠眼眶后静脉注射100微升伊文氏蓝α

·攻击前1小时腹膜内注射IL-18BP

·在第6天(用DNFB攻击耳朵后24小时)测量肿胀程度，并处死动物

·抽取血液样本，作以下处理：

·在970微升甲酰胺中加入30微升血清(→1/33稀释)

·测定620nm处的光密度值(OD)(→1OD₆₂₀等于33OD₆₂₀/毫升)

·收获同侧和对侧耳朵，作以下处理：

·在80℃干燥24小时

·测定干重

·切碎和以1毫升甲酰胺提取染料，55℃轻摇24小时

·滤出碎片β，装入小玻璃管，室温静置数小时，使脂质浮在上部

·测定620nm处的OD值

待计算的数值

结果：

基本上说，两种处理都促使在CHS反应过程中所见的肿胀：从血管系统渗漏的液体进入造成水肿的周围组织，以及血管的炎症细胞外渗到受损组织部位。

用伊文氏蓝作为跟踪剂，证实了虽然从整体上看肿胀是减轻的，但IL-18BP处理不能减少血管渗漏(图4)。

实施例5 IL-18BP处理能减少DNFB攻击耳朵的炎症浸润和IFNγ的产生

方法

如上所述，诱导C57BL/6小鼠发生CHS。在第4至6天以IL-18BP或介质处理动物。IL-18BP处理使肿胀在第7天减至介质对照小鼠的58％。在第7天处死小鼠，收集攻击后的耳朵，按组别合并(n＝8)，以酶消化得到单细胞悬浮液。随后用对CD45阳性活细胞选通的FACS对细胞作特性分析。在耳朵标本中发现的αβT细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞数以占分析细胞总数的百分比来表示。同时计算这些类型的细胞在给予IL-18BP处理后相对于介质对照组的减少量。

为了测量IFNγ的产生，以附在板上的抗CD3抗体再刺激经DNFB攻击后的耳朵得到的细胞，每孔2×10⁵个细胞。在随后24小时培养期间不再加入IL-18BP。通过ELISA试验测量IFNγ的产生。

由DNFB攻击耳朵的细胞标本以50ng/ml PMA^*和500ng/ml离子霉素刺激4小时。培养的最后2小时加入2μg/ml布雷菲德菌素A阻断细胞因子分泌。然后使细胞进行多色免疫萤光染色，分析细胞内IFNγ和表面抗原。IFNγ由CD8T细胞产生，而CD4T细胞产生的IFNγ相对较少。在NK细胞和γδT细胞中检测不到IFNγ。(n.d.表示检测不到；^*荳蔻酰佛波醇乙酯)。

单细胞悬浮液的制备方法

根据Schuler，G.和Steinman，R.M.(1985)以及Stingl等人(1983)的方案用酶消化小鼠耳朵，得到单细胞悬浮液。

1.切除耳朵，每一标本共5只耳朵

2.用70％乙醇清洗

3.用钳子撕开

4. 37℃下将真皮侧向下置于7.5毫升HBSS¹上

5.加入5毫升2.5％胰岛素²(10x)，得到终浓度1％

6. 37℃下培育35分钟

7.将耳朵真皮侧向下转移到置于冰上的10毫升HBSS/80％FCS中的尼龙筛(细胞过滤器)上，轻轻振动筛出细胞外基质的细胞。

8.移去筛网和大碎片

9.用冷HBSS/10％FCS洗2次

10.计算细胞

FACS分析

1.将细胞重悬于FACS染色悬浮液中，所有后续步骤都在冰上进行

2.每次染色用10⁶个细胞

3.加入1微克FC阻断液，10分钟

4.加入抗CD45抗体与抗感兴趣的标记物的抗体，各1微克，30分钟

5.洗2次

6.通过FACS获得总细胞0.5×10⁶个

7.分析对CD45+活细胞选通后的特异性标记物

结果

为了检查攻击部位的炎症浸润，通过对CD45+活细胞选通的FACS法分析由原耳朵和攻击耳朵制成的单细胞悬浮液(图5)。原耳朵所含的CD45+细胞主要是皮肤的γδT细胞和树突状细胞。攻击后24小时炎症浸润由CD8和CD4T细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和NK细胞组成，耳朵中CD45+细胞的总数增加约2倍。与耳朵肿胀减轻相对应的是，IL-18BP处理导致浸润攻击部位的白细胞总数减少。这影响到炎症浸润的全部不同类型的细胞。减少量在20％至40％之间，取决于细胞类型。

对由IL-18BP处理过的小鼠耳朵提取的浸润液的质量作进一步的特性分析，结果显示在抗CD3再刺激之后IFNγ的产生减少了(图6)。FACS分析显示，IFNγ主要由CD8T细胞产生，而CD4T细胞产生的IFNγ相对较少。有趣的是，NK细胞和γ&T细胞无助于IFNγ的产生(图7)。

实施例6 IL-18BP不妨碍郎格罕细胞的募集

方法

给小鼠左右两侧分别涂上半抗原FITC(50微升4毫克/毫升溶液)或介质丙酮/苯二甲酸二丁酯(1∶1)。涂抹后24小时收集腹股沟淋巴结。用FACS可检测到半抗原结合的郎格罕细胞是FITC+、CD11c+细胞，它们在涂有FITC侧引流的淋巴结内而不是在仅涂有介质侧引流的对侧淋巴结内。(n＝每组5个引流淋巴结)。

结果

在引流淋巴结内携带半抗原的郎格罕细胞(LC)的迁移取决于促炎细胞因子IL-1β和TNFα，由caspase-1调节(Antonopoulos等人，2001；Kimber等人，1992)。这意味着IL-18有助郎格罕细胞运输(Cumberbatch等人，2001)。所以，IL-18BP处理可能会妨碍郎格罕细胞的募集，致使在攻击相期间对DNFB的免疫反应减少。为了测试这一推论，在小鼠左右两侧分别涂上半抗原FITC或介质。涂抹后24小时收集引流腹股沟淋巴结的皮肤，评估每个淋巴结的FITC+细胞数。对于在涂抹之前24小时和1小时用IL-18BP处理的动物，其在涂抹后24小时在引流淋巴结内携带半抗原的郎格罕细胞数不变(图8)。所以，在此模型中，IL-18对郎格罕细胞的运输并非起主要作用。

实施例7：IL-18BP能使另一个DHT小鼠模型的迟发型过敏反应程度减少

方法：

迟发型过敏反应

给小鼠静脉注射10⁶个BALB/C脾细胞使其致敏，第5天在右足垫注射13×10⁶个BALB/C脾细胞(50微升PBS)进行攻击。对照左足垫接受50微升PBS。在不同天数，以攻击后数值减去攻击前数值，再减去左足垫测到的任何肿胀来计算右足垫肿胀。

对于过继性转移(adoptive transfer)实验，使BALB/C脾细胞致敏的动物或未处理过的对照动物的淋巴结细胞悬浮液与大鼠抗小鼠B220-FITC和CD8-FITC一起培养，再用顺磁性抗FITC微珠粒(Miltenyi Biotech，Auburn，California，USA)在MACS柱内分离而除去B220+和CD8+细胞。将富含CD4+T细胞的洗脱制剂注射入受体小鼠的尾静脉中(每只小鼠2×10⁷个细胞)。16小时后，在右足垫上注射13×10⁶个BALB/C脾细胞(不含红血球细胞)攻击小鼠，监测接下来数天的肿胀程度。

结果

迟发型过敏反应(DHT)是由CD4+T细胞引发的，具有使CD8+T细胞明显下调的作用(Grabbe等人，1998)。在DHT模型中，研究IL-18BP处理小鼠的CD4+T细胞的行为。C57BL/6动物经静脉注射10⁶个同种异源BALB/C脾细胞而致敏。5天后，在右足垫注射13×10⁶个BALB/C脾细胞，以及腹膜内给予10毫克/千克重组人IL-18BP或对照介质。在24小时测定足垫肿胀来衡量局部发炎。

α 7.5毫克/毫升伊文氏蓝(∑2129)，在生理氯化钠中100微升，静脉输注)

β 样本制剂过滤器Whatman 5μm PTFE筛目，#6984.0350

1. 不含Ca2+和Mg2+的Hanks平衡盐溶液(GIBCO#14170.070)

2. 2.5％胰岛素/EDTA(10x)(GIBCO#35400-027)

3. 1％在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的牛血清白蛋白

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21.Okamura H，Nagata K，Komatsu T，Tanimoto T，Nukata Y，Tanabe F，Akita K，Torigoe K，Okura T，Fukuda S，et al.Infect Immun 1995 Oct；63(10)：3966-72

22.Parnet，P，Garka，K E，Bonnert，T P，Dower，S K，and Sims，J E.(1996)，J.Biol.Chem.271，3967-3970.

23.Reinhold et al.(1990).Lancet 335：1282.

24.Rothe H，Jenkins NA，Copeland NG，Kolb H.J Clin Invest 1997 Feb 1；99(3)：469-74

25.Schuler，G.and Steinman，R.M.(1985).Murine epidermal Langerhans cells mature intopotent immunostimulatory dendritic cells in vitro.J Exp.Med.161，526-546.

26.Stingl，L.A.，Sauder，D.N.，Iijima，M.，Wolff，K.，Pehamberger，H.，and Stingl，G.(1983).Mechanism of UV-B-induced impairment of the antigen-presenting capacity of murineepidermal cells.J Immunol 130，1586-1591.

27.Tucci，A.，James，H.，Chicheportiche，R.，Bonnefoy，J.Y.，Dayer，J.M.，and Zubler，R.H.，1992，J.Immunol.148，2778-2784.

28.Ushio S，Namba M，Okura T，Hattori K，Nukada Y，Akita K，Tanabe F，Konishi K，MicallefM，Fujii M，Torigoe K，Tanimoto T，Fukuda S，Ikeda M，Okamura H，Kurimoto M.JImmunol 1996 Jun 1；156(11)：4274-9

29.Yoshimoto T，Takeda，K，Tanaka，T，Ohkusu，K，Kashiwamura，S，Okamura，H，Akira，Sand Nakanishi，K(1998)，J.Immunol.161，3400-3407.

30.Xu et al.(1998).J.of Interferon and Cytokine Research 18：653-659.

Claims (27)

1.IL-18抑制剂在制备治疗和/或预防过敏反应疾病的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的过敏反应疾病选自由I型过敏反应疾病、II型过敏反应疾病、III型过敏反应疾病或IV型过敏反应疾病组成的组。

3.如权利要求2中所述的应用，其特征在于：所述的过敏反应疾病是迟发型过敏反应疾病。

4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述的过敏反应疾病是接触性过敏反应。

5.如权利要求1至4中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂选自Caspase-1(ICE)抑制剂、抗IL-18抗体、抗任何IL-18受体亚基的抗体、IL-18信号传递通道抑制剂、能与IL-18竞争并阻断IL-18受体的IL-18拮抗剂、以及IL-18结合蛋白、其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物、或盐类。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂是IL-18抗体。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抗体是人源化IL-18抗体。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抗体是人IL-18抗体。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂是IL-18结合蛋白、或其盐、同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂是包含一个免疫球蛋白融合的融合蛋白，其中所述融合蛋白与IL-18结合。

11.如权利要求5至10中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的功能性衍生物包含至少一部分连接于一个或多个官能团，所述官能团以氨基酸残基上一个或多个侧链的形式出现。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于：所述的部分是聚乙二醇(PEG)部分。

13.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的药物还包括干扰素，可同时、先后或分开使用。

14.如权利要求13所述的应用，其特征在于：所述的干扰素是干扰素-β。

15.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的药物还包括肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂，可同时、先后或分开使用。

16.如权利要求15所述的应用，其特征在于：所述的TNF是TBPI和/或TBPII。

17.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的药物还包括抗炎药，可同时、先后或分开使用。

18.如权利要求17所述的应用，其特征在于：所述的抗炎药是COX-抑制剂。

19.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的药物还包括抗过敏药，可同时、先后或分开使用。

20.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂的用量约为0.001至1000mg/kg体重，或约0.01至100mg/kg体重，或约0.1至10mg/kg体重，或约5mg/kg体重。

21.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂经皮下给予。

22.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂经肌内给予。

23.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂经局部给予。

24.一种含有IL-18抑制剂编码序列的表达载体在制备治疗/和预防过敏反应疾病的药物中的应用。

25.一种能诱导和/或增强细胞中内源性产生IL-18抑制剂的载体在制备治疗和/或预防过敏反应疾病的药物中的应用。

26.一种经基因改造产生IL-18抑制剂的细胞在制备治疗和/或预防过敏反应疾病的药物中的应用。

27.一种过敏性疾病的治疗和/或预防方法，其特征在于：所述的方法包括将有效抑制量的IL-18抑制剂给予有需要的人。

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