BRPI0211827B1

BRPI0211827B1 - Uso de proteína de ligação a il-18 (il-18bp) para fabricação de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de um distúrbio de hipersensibilidade do tipo iv

Info

Publication number: BRPI0211827B1
Application number: BRPI0211827-0A
Authority: BR
Inventors: Yolande Chvatchko; Marie Kosco-Vilbois
Original assignee: Merck Serono S.A.
Priority date: 2001-08-10
Filing date: 2002-08-01
Publication date: 2019-07-23
Also published as: CA2456247C; DK1423138T3; HRP20040071B1; MXPA04001230A; JP2005501080A; WO2003013577A2; NO335688B1; CN100500210C; JP4301942B2; BR0211827A; IL160230A0; EP1423138B1; CY1116137T1; ES2533253T3; NO20040370L; PL227130B1; SI1423138T1; PL368231A1; CN1568193A; KR20040030948A

Abstract

uso de inibidores de il-18 em distúrbios de hipersensibilidade. a invenção refere-se ao uso de inibidores de il-18 na preparação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de distúrbios de hipersensibilidade e em particular de hipersensibilidade do tipo tardia.

Description

A presente invenção se refere ao campo de alergias. Mais especificamente, ela se refere ao uso de um inibidor de IL-18 para o tratamento e/ou prevenção de distúrbios de hipersensibilidade e em particular de distúrbios envolvendo reações de hipersensibilidade do tipo tardia do corpo humano. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O termo alergia ou hipersensibilidade é aplicado quando uma resposta imune adaptativa acontece em uma forma inapropriada. Reações alérgicas ou hipersensíveis são o resultado de respostas imunes normalmente benéficas que agem inapropriadamente para antígenos estrangeiros (geralmente macromoléculas ambientais) e algumas vezes causam reações inflamatórias e dano de tecido. Nessas situações, um estímulo ambiental normalmente não-prejudicial, chamado um alérgeno, dispara uma resposta imune, que quando de nova exposição, é reativada para gerar dano patológico.

Reações de hipersensibilidade são reações imunológicas prejudicais a antígenos extrínsecos. Muitas classificações de hipersensibilidade existem. Algumas são baseadas no tempo necessário para que sintomas e reações de teste da pele apareçam após exposição a um antígeno (por exemplo, hipersensibilidade imediata ou tardia), no tipo de antígeno (por exemplo, reações de droga) ou da natureza de envolvimento do órgão. As classificações são geralmente muito simplificadas e não levam em conta que mais de um tipo de resposta imune pode acontecer ou que mais de um tipo pode ser necessário para produzir dano imunológico. A classificação mais amplamente usada é a que segue:

Hipersensibilidade do Tipo 1 ou imediata é mediada por IgE. Ela é também chamada alergia comum. Reações de hipersensibilidade imediata (tipo I) são devido à ligação entre o antígeno e IgE em mastócitos ou basófilos.

Petição 870190008513, de 25/01/2019, pág. 9/20

Distúrbios com reações de hipersensibilidade do Tipo I são também chamados doenças atópicas, eles incluem rinite alérgica, conjuntivite alérgica, dermatite atópica, asma extrínseca alérgica, urticária, anafilaxia sistêmica, por exemplo. A incidência de asma tem aumentado acentuada5 mente, embora as causas sejam bastante desconhecidas. Recentemente, um aumento acentuado em reações do tipo I foi notado em relação à exposição a proteínas solúveis em água em produtos de látex (por exemplo, luvas de borracha, diques dentais, preservativos, tubo para equipamento respirató-

rio, cateteres, particularmente dentre pessoal médico e pacientes expostos ao látex e crianças com espinha bífica e defeitos urogenitais de nascença.

Reações comuns ao látex são urticária, angioedema, conjuntivite, rinite, broncoespasmos e anafilaxia.

Pacientes com doenças atópicas (incluindo dermatite atópica) geralmente têm uma predisposição herdada a desenvolver hipersensibilida15 de mediada pelo anticorpo IgE a substâncias inaladas e ingeridas (alérgenos) que são inofensivos a pessoas que não são atópicas. Exceto na dermatite atópica, anticorpos IgE geralmente fazem a mediação de hipersensibilidade.

Hipersensibilidade do tipo II ou citotóxica envolve ações citolíti20 cas mediadas por anticorpo, complemento e/ou mecanismos celulares. O

alvo em reações do tipo II é uma superfície celular, e dano celular ou morte é o resultado. Anticorpo para antígeno ligado à célula (tipo II) causa destruição celular através da ativação de complemento ou promoção de fagocitose. Exemplos de dano celular onde o anticorpo reage com componentes antigê25 nicos de uma célula são anemias hemolíticas Coombs’s positivas, púrpura trombocitopênica induzida por anticorpo, leucopenia, pênfigo, penfigóide, síndrome de Goodpasture e anemia perniciosa. Essas reações acontecem em pacientes que recebem transfusões incompatíveis, em doença hemolítica do recém-nascido e em trombocitopenia neonatal, e elas também podem desempenhar um papel em doenças de hipersensibilidade multissistema (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, SLE).

O mecanismo de dano é melhor exemplificado através do efeito

sobre as células sangüíneas vermelhas. Em anemias hemolíticas, as células sangüíneas vermelhas são destruídas ou através de hemólise intravascular ou através de fagocitose de macrófago, predominantemente dentro do baço. Estudos in vitro mostraram que na presença de complemento alguns anti-

corpos de ligação de complemento (por exemplo, os anticorpos do grupo sangüíneo anti-A e anti-B) causam hemólise rápida. Outros (por exemplo, anticorpos anti-LE) causam uma lise celular lenta; outros ainda não danificam células diretamente, mas causam sua aderência a e destruição por fagócitos. Em contraste, anticorpos Rh em células sangüíneas vermelhas não 10 ativam complemento, e eles destroem as células predominantemente através de fagocitose extravascular. Exemplos onde o antígeno é um componente de tecido são rejeição de enxerto aguda precoce (hiperaguda) de um rim transplantado, que é devido à presença de anticorpo no endotélio vascular, e síndrome de Goodpasture, que é devido à reação de anticorpo com 15 endotélio de membrana de base glomerular e alveolar. Na síndrome de Goodpasture experimental, o complemento é um mediador importante de dano, mas o papel do complemento não foi claramente determinado em rejeição de enxerto aguda precoce.

Exemplos de reação devido a acoplamento haptênico com célu20 Ias ou tecido incluem muitas das reações de hipersensibilidade à droga (por

exemplo, anemia hemolítica induzida por penicilina, vide abaixo).

Reações de hipersensibilidade a anti-receptor alteram o funcionamento celular como resultado da ligação de anticorpo a receptores de membrana. Em muitas doenças (por exemplo, miastenia grave, doença de 25 Grave, diabetes resistente à insulina), anticorpos para receptores de membrana celular foram descritos. Em alguns pacientes diabéticos com resistência à insulina extrema, anticorpos para receptores de insulina foram mostrados, desse modo prevenindo a ligação de insulina a seu receptor. Em pacientes com doença de Grave, um anticorpo para o receptor de hormônio de estimulação da tireóide (TSH) foi identificado, o qual estimula o efeito do

TSH sobre seu receptor, resultando em hipertiroidismo.

Os mecanismos do tipo III envolvem a maior parte dos anticor5 por célula, geralmente leva 12 ou mais horas para se desenvolver e é base-

ada em redes celulares imunes ativadas. Inflamação é o padrão de tecido básico e doença inflamatória crônica pode ser o resultado. Hipersensibilidade do tipo IV é também chamada hipersensibilidade do tipo tardia (tipo IV) ou 5 DTH. As reações são mediadas por interleucina-2, interferon-γ e outras citocinas liberadas por linfócitos T. Em DTH, os linfócitos T reagem com antígeno e liberam interleucina-9, interferon-γ e outras citocinas. Uma vez as células T terem sido sensibilizadas através de exposição primária, provocação secundária é seguida por uma reação de hipersensibilidade do tipo tardia, 10 uma resposta inflamatória local que leva 2-3 dias para se desenvolver clinicamente. Histologicamente, essas reações consistem em infiltração de linfócitos T, macrófagos e eosinófilos ocasionais. Experimentalmente, DTH pode ser transferida para linfócitos T mas não através do soro, isto é, anticorpos não estão envolvidos.

DTH pode resultar da resposta imune mediada por célula normal à infecção com vírus, fungos e certas bactérias, notavelmente Mycobacteríum tuberculosis e Mycobacteríum leprae. Se os macrófagos forem incapazes de destruir organismos ingeridos, eles podem sofrer diferenciação em células epitelóides ou células gigantes multinucleadas. Uma coleção dessas células forma um granuloma. Dano de tecido local é um efeito colateral inde-

sejado desta outra resposta imunoprotetora. Se a resposta de DTH for ausente ou danificada, no entanto, linfócitos T são incapazes de localizar o microorganismo invasor e os pacientes desenvolvem doença disseminada agressiva invasiva, tal como tuberculose aguda.

Dermatite de contato para antígenos ocupacionais e outros é também uma reação do tipo IV. Agentes que causam isso são geralmente de peso molecular comparativamente baixo (<1 kD) e não-imunogênicos por si só, pelo contrário, eles são moléculas altamente reativas que se ligam covalentemente a proteínas da pele ou tecido. O agente químico de sensibili30 zação é conhecido como hapteno e a proteína hospedeiro com a qual ele combina como o veículo. A faixa de antígenos de sensibilização potenciais é ampla. Duas fases de patogênese são reconhecidas: a fase de indução e a

fase de elicitação. Na fase de indução, células apresentando antígeno na pele, conhecidas como células de Langerhan, ligam-se ao complexo de proteína hapteno-veículo e o apresenta aos linfócitos T em associação com antígeno da classe II MHC. A indução de células T pode acontecer após me5 ses de exposição a pequenas quantidades de antígenos. Nova exposição ao antígeno relevante dispara a fase de elicitação onde as células efetoras migram para a pele para encontrar o complexo de proteína apresentado pelas células de Langerhans na epiderme com consequente liberação de citocina e inflamação da pele. O diagnóstico do agente ofensivo é feito através de 10 teste do emplastro. Um agente de sensibilização de contato suspeito é aplicado sobre as costas do paciente e coberto por 48 horas. O sítio de reação é inspecionado após 2 e 24 horas. Em uma resposta positiva há inflamação e enrijecimento no sítio de teste.

Hipersensibilidade do tipo tardia é também um mecanismo15 chave na determinação da rejeição de órgãos de teste transplantados.

Algumas condições clínicas onde reações do tipo IV são acreditadas ser importantes são dermatite de contato, pneumonite de hipersensibilidade, rejeição de aloenxerto, granuloma devido a organismos intracelulares, algumas formas de sensibilidade à droga, tiroidite e encefalomielite após 20 vacinação de raiva. Evidência quanto às duas últimas é baseada em mode-

los experimentais, e em doença humana no aparecimento de linfócitos no exsudato inflamatório da tireóide e cérebro.

A dermatite é também chamada eczema. Ela refere-se a uma inflamação superficial na pele, caracterizada histologicamente por edema 25 epidermal e clinicamente por vesículas (quando aguda), vermelhidão pobremente marginada, edema, gotejamento, criação de crosta, escamação, geralmente prurido e liquenificação causada por coceira ou irritação.

Muitas vezes, eczema refere-se à dermatite vesicular, mas algumas vezes o termo é eczema restrito para significar dermatite crônica. 30 Algumas vezes também refere-se à dermatite como dermatite espongiótica porque espongiose (edema intra-epidermal) é uma característica histológica.

Dermatite de contato é uma inflamação aguda ou crônica, muitas

vezes assimétrica ou de formato estranho, produzida por substâncias que contatam a pele e causam reações tóxicas (irritantes) ou alérgicas.

O diagnóstico de reações de hipersensibilidade depende do tipo de reação envolvida.

Uma reação do tipo IV pode ser suspeitada quando uma reação de inflamação é caracterizada histologicamente por linfócitos e macrófagos perivasculares. Testes de pele e testes do emplastro para hipersensibilidade tardia são os métodos mais imediatos disponíveis de teste para hipersensibilidade tardia.

Para prevenir exacerbação da dermatite de contato, testes do emplastro são realizados após a dermatite de contato ter melhorado. O alérgeno suspeito (em concentração apropriada) é aplicado à pele sob um emplastro adesivo não-absorvente e deixado por 48 horas. Se queimação ou coceira aparecer logo, o emplastro é removido. Um teste positivo consiste 15 em eritema com alguma duração e, ocasionalmente, formação de vesícula.

Devido ao fato de algumas reações não aparecerem até após os emplastros serem removidos, os sítios são novamente inspecionados em 72 e 96 horas.

Hipersensibilidade pode também acontecer como uma reação a drogas. Antes de atribuir uma dada reação à droga, deve ser notado que 20 placebos podem também causar uma ampla variedade de sintomas e até

mesmo sinais objetivos, tal como exantema da pele. Não obstante, reações de droga verdadeiras constituem um problema médico grande.

Em intolerância à droga, a reação adversa se desenvolve no primeiro uso da droga. Pode ser a mesma reação tóxica comumente espe25 rada em doses maiores, ou pode ser o exagero de efeitos colaterais suaves comuns (por exemplo, sedação anti-histamínica). Idiossincrasia é uma condição onde a reação adversa no primeiro uso da droga é farmacologicamente inesperada e única.

Características de reações alérgicas a drogas incluem reações mediadas por IgE que acontecem apenas após o paciente ter sido exposto à droga (não necessariamente para terapia) uma ou mais vezes sem incidente. Uma vez a hipersensibilidade ter se desenvolvido, a reação pode ser pro-

duzida por doses muito abaixo das quantidades terapêuticas, e geralmente abaixo daqueles níveis que produzem reações idiossincráticas. As características clínicas são restritas em suas manifestações. Exantemas na pele (particularmente urticária), síndrome do tipo doença no soro; febre inespera5 da, anafilaxia e infiltrações pulmonares eosinófilas que aparecem durante a terapia de droga são geralmente devido à hipersensibilidade; alguns casos

de anemia, trombocitopenia ou agranulocitose. Raramente vasculite se desenvolve após exposição repetida à droga (por exemplo, sulfonamidas, iodetos, penicilina) e nefrite intersticial (por exemplo, meticilina) e dano ao fígado 10 (por exemplo, halotano) foram descritos em circunstâncias de acordo com o desenvolvimento de hipersensibilidade específica.

O exemplo mais sério de hipersensibilidade à droga é anafilaxia.

No entanto, a reação de droga mais comum, de longe, é um exantema morbiliforme, novamente de etiologia desconhecida. Reações de febre e urticária 15 são também conseqüências relativamente comuns de alergia à droga.

Quando soros de animais foram usados para terapia, doença do soro foi uma complicação, mas os soros dos animais são raramente usados hoje. Uma síndrome do tipo doença do soro séria de patogênese desconhecida sem altos níveis de anticorpo IgG circulante mas geralmente associada a anticorpos IgE pode acontecer, especialmente com drogas tal como penicili-

na.

Reações de hipersensibilidade à droga são baseadas na capacidade das proteínas e drogas de polipeptídeo grande em estimular a produção de anticorpo específica através de mecanismos imunológicos diretos.

Talvez a menor molécula que é potencialmente antigênica seja glucagon, com um peso molecular de cerca de 3500. A maioria das moléculas da dro ga é muito menor e não pode agir sozinha como antígeno. No entanto, como haptenos, algumas se ligam covalentemente a proteínas, e os conjugados resultantes estimulam a produção de anticorpo específico para a droga. A droga, ou um dos seus metabólitos, é quimicamente reativa com proteína. A ligação de soro-proteína comum a muitas drogas é muito mais fraca e de resistência insuficiente para antigenicidade.

A reação imunológica específica foi determinada apenas para benzilpenicilina. Esta droga não se liga firmemente o suficiente às proteínas do tecido ou soro para formarem um complexo antigênico, mas seu principal produto de degradação, ácido benzilpenicilênico, pode combinar com proteí5 nas de tecido para formar benzilpeniciloíla (BPO), o determinante antigênico principal da penicilina. Vários determinantes antigênicos menores são formados em quantidades relativamente pequenas através de mecanismos que são menos bem-defínidos. Reações de hipersensibilidade (I, II, III, IV) mais comumentemente envolvem o determinante BPO. Anticorpos IgE para de-

terminantes menores podem ser responsáveis em alguns pacientes por anafilaxia e urticária. Anticorpos IgG foram verificados para os determinantes principais, mas não para os menores. Eles podem agir como anticorpos de bloqueio para BPO, modificando ou até mesmo prevenindo uma reação para BPO, enquanto a falta de anticorpos IgG de bloqueio para os determi15 nantes menores pode explicar a habilidade desses determinantes em induzir anafilaxia.

Todas as penicilinas semi-sintéticas (por exemplo, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina) potencialmente reagem em cruzamento com penicilina, de modo que pacientes sensíveis à penicilina muitas vezes reagem com elas também. Reações cruzadas acontecem com cefalosporinas em um grau

menor. Tratamento com uma cefalosporina deve ser iniciado com grande cuidado se o paciente tiver uma história de uma reação grave (por exemplo, anafilaxia) à penicilina.

Reações de droga mediadas por anticorpo hematológico (citotó25 xito, tipo II) podem se desenvolver através de qualquer um de três mecanismos: em anemia induzida por penicilina, o anticorpo reage com o hapteno, que está firmemente ligado à membrana da célula sangüínea vermelha, produzindo aglutinação e maior destruição das células sangüíneas vermelhas. Em trombocitopenia induzida por estibofeno e quinidina a droga forma um 30 complexo solúvel com seu anticorpo específico. O complexo então reage com plaquetas vizinhas (as células alvo assistentes inocentes) e ativa o complemento, que sozinho permanece na membrana da plaqueta e induz lise celular. Em outras anemias hemolíticas, a droga (por exemplo, metildopa) parece alterar quimicamente a superfície das células sanguíneas vermelhas, desse modo descobrindo um antígeno que induz e então reage com um auto-anticorpo, geralmente de especificidade Rh.

Reações idiossincráticas e anafiláticas tóxicas são suficientemente únicas em tipo ou em tempo de modo que a droga ofensiva é geralmente facilmente identificada. Reações do tipo doença do soro são mais freqüentemente devido a penicilinas, mas ocasionalmente sulfonamidas, hidralazina, sulfoniluréias ou tiazidas são responsáveis. Fotossensibilização é

característica de clorpromazina, certos anti-sépticos em sabões, sulfonamidas, psoralenos, demeclociclina e griseofulvina. Todas as drogas exceto aquelas consideradas absolutamente essenciais devem ser paradas. Quando febre de droga é suspeita, a droga mais provável é parada (por exemplo, alopurinol, penicilina, isoniazida, sulfonamidas, barbituratos, quinidina). Re15 dução na febre dentro de 48 horas sugere fortemente essa droga. Se acompanhada por granulocitopenia, a toxicidade da droga é mais provável do que alergia e é muito mais séria.

Reações alérgicas pulmonares a drogas são geralmente infiltrantes, com eosinofilia, e podem ser produzidas por sais de ouro, penicilina, e sulfonamidas, dentre outros. A causa mais comum de uma reação pulmo-

nar infiltrante aguda é nitrofurantoína. Esta é provavelmente alérgica mas geralmente não-eosinofílica.

Reações hepáticas podem ser principalmente colestáticas (fenotiazinas e estolato de eritromicina estão mais freqüentemente envolvidos) ou 25 hepatocelulares (alopurinol, hidantoínas, sais de ouro, isoniazida, sulfonamidas, ácido valpróico e muitos outros). A reação renal alérgica comum é nefrite intersticial, mais comumente devido à meticilina; outros antimicrobianos e cimetidina também estavam implicados.

Uma síndrome similar a lúpus eritematoso sistêmico pode ser produzida por várias drogas, mais comumente hidralazina e procainamida. A síndrome está associada a um teste positivo para anticorpo antinuclear e é relativamente benigna, poupando os rins e o SNC. Penicilamina pode produ • · ·

zir SLE e outras doenças auto-imunes, mais notavelmente miastenia grave.

Em 1989, uma atividade de soro induzida por endotoxina que induzia interferon-γ (IFN-γ) obtido de células do baço de camundongos foi descrita (Nakamura e outros, 1989). Esta atividade de soro funcionava não 5 como um indutor direto de IFN-γ, mas pelo contrário como um co-estimulante junto com IL-2 ou mitógenos. Uma tentativa de purificar a atividade de soro de camundongo pós-endotoxina revelou uma proteína de 50-55 kDa aparentemente homogênea. Uma vez que outras citocinas podem agir como co-

estimulantes para produção de IFN-γ, a falha de anticorpos de neutralização para IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 ou TNF em neutralizar a atividade do soro sugeriu que ele era um fator distinto. Em 1995, os mesmos cientistas demonstraram que o co-estimulante induzido por endotoxina para produção de IFN-γ estava presente em extratos de fígados de camundongos pré-condicionados com P. acnes (Okamura e outros, 1995). Neste modelo, a população macrófaga he15 pática (células Kupffer) expande e nesses camundongos uma baixa dose de lipossacarídeo bacteriano (LPS), que em camundongos não précondicionados não é letal, torna-se letal. O fator, chamado fator de indução de INF-γ (IGIF) e mais tarde chamado interleucina-18 (IL-18), foi purificado até homogeneidade de 1.200 gramas de fígados de camundongos tratados 20 com P. acnes. Oligonucleotídeos degenerados derivados de seqüências de

aminoácido de IL-18 purificada foram usados para clonar um cDNA de IL-18 de murino. IL-18 é uma proteína de 18-19 kDa de 157 aminoácidos, que não tem quaisquer similaridades óbvias com nenhum peptídeo na base de dados. RNAs mensageiros para IL-18 e interleucina-12 (IL-12) são imediata25 mente detectados em células Kupffer e macrófagos ativados. IL-18 recombinante induz IFN-gama mais potentemente do que faz a IL-12, aparentemente através de um curso separado (Micallef e outros, 1996). Similar à atividade de soro induzida por endotoxina, a IL-18 não induz IFN-γ por si só, mas funciona principalmente como um co-estimulante com mitógenos ou IL30 2. IL-18 realça a proliferação de célula T, aparentemente através de um curso dependente de IL-2, e realça a produção de citocina Th1 in vitro e exibe sinergismo quando combinada com IL-12 em termos de produção de IFN-γ

realçada (Maliszewski e outros, 1990).

Após a forma de murino ter sido clonada, a seqüência de cDNA humano para IL-18 foi descrita em 1996 (Ushio e outros, 1996).

Ao clonar IL-18 de tecidos afetados e estudar a expressão do gene de IL-18, uma associação de clone desta citocina com uma doença auto-imune foi encontrada. O camundongo diabético não-obeso (NOD) espontaneamente desenvolve insulite auto-imune e diabetes, que podem ser aceleradas e sincronizadas por uma única injeção de ciclofosfamida. mRNA de IL-18 foi demonstrado através de PCR de transcriptase reversa em pân-

creas de camundongo NOD durante os estágios iniciais de insulite. Os níveis de mRNA de IL-18 aumentaram rapidamente após tratamento com ciclofosfamida e precederam um aumento em mRNA de IFN-γ, e subseqüentemente diabetes. Interessantemente, essas cinéticas imitam aquela do mRNA de IL12-p40, resultando em uma relação íntima de níveis de mRNA individuais.

Clonagem de cDNA de IL-18 de RNA do pâncreas seguido por seqüenciamento revelou identidade com a seqüência de IL-18 clonada de célula Kupffer e em macrófagos pré-ativados in vivo. Também macrófagos de camundongo NOD responderam à ciclofosfamida com expressão de gene de IL-18 enquanto que macrófagos de camundongo Balb/c tratado em paralelo não.

Desse modo, a expressão de IL-18 é anormalmente regulada em camun-

dongo NOD auto-imune e intimamente associada com desenvolvimento do diabetes (Rothe e outros, 1997).

A IL-18 desempenha um papel potencial na imuno-regulagem ou em inflamação através do aumento da atividade funcional do ligante Fas so25 bre as células Th1 (Conti e outros, 1997). IL-18 é também expressa no córtex adrenal e desse modo poderia ser um neuroimunomodulador secretado, desempenhando um importante papel na regência do sistema imune seguindo uma experiência estressante (Chater, 1986).

In vivo, a IL-18 é formada através de divagem de pró-IL-18, e sua atividade endógena parece ser responsável pela produção de IFN-γ em letalidade mediada por P. acnes e LPS. A IL-18 madura é produzida a partir de seu precursor pela enzima de conversão IL-1 β (enzima de conversão IL-

beta, ICE, caspase-1).

O receptor de IL-18 consiste em pelo menos dois componentes, cooperando em ligação de ligante. Sítios de ligação de alta e baixa afinidade para IL-18 foram encontrados em células T estimuladas com IL-12 de murino (Yoshimoto e outros, 1998), sugerindo um complexo de receptor de cadeia múltipla. Duas subunidades de receptor foram identificadas até agora, ambas pertencentes à família de receptor de IL-1 (Parnet e outros, 1996). A transdução de sinal de IL-18 envolve a ativação de NF-κΒ (DiDonato e outros, 1997).

Recentemente, uma proteína solúvel tendo uma alta afinidade para IL-18 foi isolada de urina humana, e os cDNAs humanos e de camun dongo foram descritos (Novick e outros, 1999; WO 99/09063). A proteína foi chamada proteína de ligação de IL-18 (IL-18BP).

A IL-18BP não é o domínio extracelular de um dos receptores de

IL-18 conhecidos, mas uma proteína secretada, de circulação natural. Ela pertence a uma nova família de proteínas secretadas. A família ainda inclui várias proteínas codificadas por Poxvírus que têm uma alta homologia com IL-18P (Novick e outros, 1999). A IL-18BP é constitutiva mente expressa no baço, pertence à superfamília da imunoglobulina e tem homologia limitada com o receptor do tipo II de IL-1. Seu gene foi localizado no cromossoma

humano 11 q13, e nenhum éxon codificando para um domínio de transmembrana foi encontrado em uma seqüência genômica de 8,3 kb (Novick e outros, 1999).

Quatro isoformas humanas e duas de camundongo de IL-18BP, resultantes de união de mRNA e encontradas em várias bibliotecas de cDNA, foram expressas, purificadas e avaliadas quanto à ligação e neutralização das atividades biológicas da IL-18 (Kim e outros, 2000). A isoforma de

IL-18BP humana (IL-18BPa) exibiu a maior afinidade para IL-18 com uma rápida taxa de iniciação (on-rate), uma baixa taxa de terminação (off-rate) e 30 uma constante de dissociação (K(d)) de 399 pM. A IL-18BPc compartilha o domínio de Ig da IL-18BPa exceto pelo aminoácido 29 C-terminal; a K(d) da

IL-18BPc é 10 vezes menor (2,94 nM). Não obstante, a IL-18BPa e a IL14

18BPc neutralizam IL-18 >95% em um excesso molar de dois. As isoformas

IL-18BPb e IL-18BPd não têm um domínio de Ig completo e não têm a habilidade de se ligarem ou neutralizar IL-18. As isoformas IL-18BPc e IL-18BPd de murino, possuindo o domínio Ig idêntico, também neutralizam >95% de 5 IL-18 de murino em um excesso molar de dois. No entanto, IL-18BPd de murino, que compartilha um motivo C-terminal comum com IL-18BPa humana, também neutraliza IL-18 humana. Modelagem molecular identificou um sítio de ligação eletrostático e hidrofóbico misto grande no domínio Ig de IL-18BP,

que podería ser responsável pela ligação de alta afinidade com o ligante 10 (Kim e outros, 2000).

Em 1998, a expressão de interleucina-18 (IL-18) foi proposta estar implicada na patogênese de hipersensibilidade de contato de murino (Xu e outros, 1998). Xu e outros usaram um modelo de hipersensibilidade de contato de murino com oxazolona como alérgeno de contato e mostraram uma indução da expressão de IL-18 em lesões na pele. A supra-regulação mais alta foi encontrada 24 horas após provocação com alérgeno, então a expressão de IL-18 declinou gradualmente.

Uma descrição adicional da habilidade da IL-18 em induzir uma resposta de DTH independentemente da IL-18 foi publicada por Kitching e outros, 2000. No entanto, o papel da IL-18 permaneceu não muito claro uma

vez que a IL-18 também foi descrita ser ela própria uma terapia potencialmente eficaz para pacientes com dermatite atópica (Habu e outros, 2001), que estava de acordo com vários testes clínicos sugerindo que IFN-γ melho ra os sintomas de dermatite atópica (Reinhold e outros, 1990; Hanifin e ou tros, 1993).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada na constatação que o tratamento de camundongos com inibidores de IL-18 em um modelo do tipo IV de hipersensibilidade resulta em uma atenuação da reação de hipersensibilida30 dê no animal conforme comparado com animais de controle. A invenção refere-se então ao uso de um inibidor de IL-18 para a fabricação de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de distúrbios de hipersensibilidade.

O uso de combinações de um inibidor de IL-18 com um interferon e/ou um inibidor de TNF e/ou inibidores de inflamação e/ou drogas antialérgicas é também contemplado de acordo com a invenção. Em um aspecto adicional, a invenção refere-se ao uso de um vetor de expressão compreendendo a 5 seqüência de codificação de um inibidor de IL-18 para o tratamento e/ou prevenção de condições de hipersensibilidade. A invenção refere-se ainda ao uso de células geneticamente engenheiradas para expressar inibidores de IL-18 para a prevenção e/ou tratamento de distúrbios de hipersensibilidade.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra que tratamento com IL-18BP durante a provocação protege de hipersensibilidade de contato (CHS). Os camundongos foram sensibilizados com DNFB nas costas no dia 0 e provocados cinco dias mais tarde nas orelhas. O inchaço na orelha foi medido diariamente e ex15 presso como o aumento no inchaço da provocação de DNFB versus a orelha de controle tratada com veículo. Tratamento com 250 pg de IL-18BP i.p. por camundongo diariamente nos dias 5 a 8 reduziu acentuadamente o inchaço na orelha (A), enquanto que tratamento nos dias 0 a 2 não foi protetor neste conjunto experimental (B) (n = 5 camundongos por grupo). Quadrados: ca20 mundongos tratados com IL-18BP, Triângulos: controle, isto é, animais tra-

tados com solução salina.

A Figura 2 mostra a extensão do inchaço da orelha do dia 5 ao dia 30 após a primeira provocação com hapteno no dia 5 e segunda provocação no dia 19 em um modelo de hipersensibilidade do tipo tardia com ad25 ministração sistêmica de 250 pg/camundongo/dia de IL-18BP (quadrados abertos) ou veículo (quadrados cheios) dos dias 19 a 22.

A Figura 3 mostra que a IL-18BP protege de CHS através da neutralização da IL-18. Camundongos deficientes em IL-18 (KO) e do tipo selvagem C57BL/6 foram comparados quanto à sua habilidade em estabele30 cer uma resposta de CHS. Camundongos deficientes de IL-18 realmente desenvolveram CHS para DNFB, embora menos pronunciado do que os camundongos do tipo selvagem. No entanto, nenhum efeito do tratamento de IL-18BP foi observado em camundongos deficientes de IL-18, indicando que o efeito antiinflamatório da IL-18BP em CHS era devido à neutralização da IL-18. (n = 5 camundongos por grupo). Círculos: Solução salina em camundongos KO para IL-18; diamantes: IL-18BP em camundongos KO para 5 IL-18; quadrados: IL-18BP em camundongos do tipo selvagem (WT); triângulos: solução salina em camundongos WT.

A Figura 4 mostra que a IL-18BP não reduz o derrame vascular durante CHS. CHS foi induzida em camundongos C57BL/6. Para monitorar o edema causado pela reação de CHS, Evans Blue foi injetado i.v. 2 horas

antes da provocação com DNFB. Os camundongos foram sacrificados 24 horas depois e as orelhas processadas para extrair o corante que tinha vazado da vasculatura e acumulado no tecido circundante. Derrame vascular foi avaliado como a quantidade de corante por mg de tecido da orelha seco corrigida para a concentração de Evans Blue no soro e expressa como a 15 razão de orelha provocada versus de controle. Enquanto tratamento com IL18BP no dia 4 e dia 5 reduziu o inchaço para 56% do controle tratado com veículo (painel da esquerda, p<0,01), não houve nenhuma diferença significante no derrame de vasculatura entre esses dois grupos. Ambos grupos mostraram edema significantemente maior comparado com o grupo de con trole não-sensibilizado (p < 0,05 e p < 0,01). Como um controle adicional, os

camundongos foram tratados com 250 pg da proteína BSA irrelevante por animal e dia. Esses camundongos desenvolveram CHS tal como os animais de controle tratados com veículo (n = 10 camundongos por grupo).

Figura 5 Tratamento com IL-18BP reduz a infiltração inflamatória da orelha provocada com DNFB. CHS foi induzida em camundongos

C57BL/6 conforme descrito. Os animais foram tratados com IL-18BP ou veículo nos dias 4 a 6. O tratamento com IL-18BP reduziu o inchaço para 58% do controle de veículo no dia 7. Os camundongos foram sacrificados no dia

7, as orelhas provocadas coletadas, postas juntas em grupo (n = 8) e digeri30 das com enzima para se obter suspensões de célula únicas. As células fo- ram caracterizadas através de análise FACS subsequente retendo (gating on) as células vivas CD45 positivas. O número de células αβΤ, células NK,

neutrófilos e monócitos/macrófagos encontrado nas preparações de orelha é expresso como a porcentagem de células totais analisadas (valores superiores). A redução desses tipos celulares após tratamento com IL-18BP relativo ao controle de veículo é dada em figuras menores.

A Figura 6 mostra que a ativação de célula T é prejudicada quando do tratamento com IL-18BP. As células obtidas das orelhas provocadas com DNFB foram reestimuladas a 2 x 10⁵ por cavidade com anticorpo anti-CD3 ligado à placa. Nenhuma IL-18BP a mais foi adicionada durante o período de cultura de 24 horas subseqüente. A produção de IFNy foi medida 10 em triplicata através de ELISA. As células obtidas de camundongos tratados com IL-18BP produziram apenas 45% do IFNy encontrado nas culturas de célula de animais de controle tratados com veículo.

A Figura 7 mostra que tratamento com IL-18BP reduz o número de células produtoras de IFNy no infiltrado inflamatório da orelha. Prepara15 ções de célula de orelhas provocadas com DNFB foram estimuladas com 50 ng/ml de PMA* e 500 ng/ml de lonomicina por 4 horas. Secreção de citocina foi bloqueada através da adição de 2 pg/ml de brefeldina A durante as 2 últimas horas de incubação. As células foram então submetidas a tingimento imunofluorescente multicolorido quanto a IFNy intracelular e antígenos de 20 superfície. O tratamento com IL-18BP reduziu o número total de células po-

sitivas para tingimento de IFNy para 78% do controle de veículo. O IFNy foi produzido pelas células CD8 T e em um grau menor pelas células CD4 T.

Nenhum IFNy foi detectado em células NK e células αβΤ. (n.d., nãodetectado; * 13-Acetato de 12-Miristato de Forbol)

Figura 8 O tratamento com IL-18BP não prejudica o recrutamento de células Langerhans para drenagem do linfonodo. Os camundongos foram pintados com o FITC de hapteno ou a acetona/dibutilftalato veículo (1:1) no flanco direito e esquerdo, respectivamente. Células Langerhans conjugadas com hapteno podiam ser detectadas através de FACS como células FITC+, CD11c+ no linfonodo drenando o flanco pintado com FITC, mas não no linfonodo contralateral drenando o flanco pintado com veículo apenas. A proporção de células Langerhans carregando hapteno no linfono do de drenagem era 1,2% das células do linfonodo totais em animais tratados com IL-18BP 24 horas e 1 hora antes da pintura. Isso não difere significantemente do número obtido com animais tratados com controle, (n = 5 linfonodos de drenagem por grupo).

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada na constatação de que um inibidor de IL-18 exerce um efeito benéfico sobre a recuperação de provocação de hapteno em um modelo de murino de hipersensibilidade do tipo IV.

Desse modo, a invenção refere-se ao uso de um inibidor de IL-

18 para a fabricação de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de distúrbios de hipersensibilidade.

Dentro do contexto da presente invenção, as expressões distúrbio de hipersensibilidade e distúrbio alérgico são usados como sinônimos.

Ambos termos referem-se a distúrbios ou reações causados por uma res15 posta imune adaptativa inapropriada. Reações de hipersensibilidade são o resultado de respostas imune normalmente benéficas que agem inapropriadamente para antígenos estrangeiros, tal como, por exemplo, macromoléculas ambientais, que podem levar a reações inflamatórias e dano de tecido. Em distúrbios de hipersensibilidade, um estímulo normalmente prejudicial, o 20 alérgeno, dispara uma resposta imune, que quando de nova exposição, é

reativada para gerar dano patológico.

Distúrbios de hipersensibilidade, bem como seus sintomas e implicações clínicas, foram descritos em detalhes no Antecedentes da Invenção e o uso de acordo com a invenção refere-se, mas não está limitado, a distúrbios de hipersensibilidade aqui mencionados.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, o distúrbio de hipersensibilidade é selecionado do grupo consistindo em distúrbios com reações de hipersensibilidade do tipo I, distúrbios com reações de hipersensibilidade do tipo II, distúrbios com hipersensibilidade do tipo III ou distúrbios com reações de hipersensibilidade do tipo IV.

Distúrbios com hipersensibilidade do tipo I são também chamados hipersensibilidade imediata ou alergia comum. A hipersensibilidade é

A) mediada por IgE. Reações de hipersensibilidade imediata (tipo I) são devido à ligação entre antígeno e IgE em mastócitos ou basófilos. Dentro do significado de distúrbios com reações de hipersensibilidade do tipo I estão as doenças atópicas, tal como, mas não limitadas a, rinite alérgica, conjuntivite 5 alérgica, dermatite atópica, asma extrínseca alérgica, de urticária, anafilaxia sistêmica. Anafilaxia é reação alérgica grave, de risco de vida devido à hipersensibilidade do tipo 1 (imediata).

A hipersensibilidade do tipo II ou citotóxica envolve ações citolíticas mediadas por anticorpo, complemento e/ou mecanismos celulares. Anti-

corpo para antígeno ligado à célula (tipo II) causa destruição celular ativando complemento ou promovendo fagocitose. Distúrbios com hipersensibilidade do tipo II dentro do escopo da presente invenção compreendem, por exemplo, anemias hemolíticas positivas de Coombs, púrpura trombocitopênica induzida por anticorpo, leucopenia, pênfigo, penfigóide, síndrome de Goo15 dpasture e anemia perniciosa. Essas reações podem ocorrer em pacientes recebendo transfusões incompatíveis, em doença hemolítica do recémnascido e em trombocitopenia neonatal e elas também podem desempenhar um papel em doenças de hipersensibilidade de multissistema (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, SLE), por exemplo.

Distúrbios com hipersensibilidade do tipo III envolvem reações

onde anticorpos formam complexos imunológicos com antígeno. Complexos circulantes ativam complemento, ligam-se a células sangüíneas vermelhas, que então sofrem fagocitose no baço, deixam a circulação e disparam inflamação em espaços de tecido. Esta reação é chamada reação Arthus. Alter25 nativamente, complexos sofrem fagocitose pelos macrófagos que apresentam antígenos, liberam citocinas e ativam células B e T. IgE, IgA, IgG e IgM todos formam complexos com antígeno. Reações do tipo III geralmente resultam da deposição de complexos imunológicos em tecidos, particularmente a pele, juntas e rins. Nefrite complexa imune crônica é responsável pela maior parte dos casos de glomerulonefrite em seres humanos. De acordo com a invenção, distúrbios de hipersensibilidade do tipo III compreendem, por exemplo, doença do soro devido ao soro, drogas ou antígeno de hepatite

viral; SLE; artrite reumatóide (RA); poliartrite; crioglobulinemia; pneumonite por hipersensibilidade; aspergilose broncopulmonar; glomerulonefrite aguda; glomerulonefrite membranoproliferativa crônica; e doença renal associada.

Distúrbios com hipersensibilidade do tipo IV envolvem reações 5 mediadas por célula e geralmente levam 12 ou mais horas para se desenvolverem. Distúrbios de hipersensibilidade do tipo IV podem envolver inflamação, e doença inflamatória crônica pode ser o resultado. Hipersensibilidade do tipo IV é também chamada hipersensibilidade do tipo tardia ou DTH.

Uma vez as células T terem sido sensibilizadas através de exposição primá-

ria, provocação secundária é seguida por uma reação de hipersensibilidade do tipo tardia. Esta reação é uma resposta inflamatória local, que algumas vezes leva 2-3 dias para se desenvolver clinicamente.

Em uma modalidade preferida da invenção, o distúrbio de hipersensibilidade é hipersensibilidade do tipo tardia. Desse modo, a invenção 15 refere-se de preferência a todos os tipos de condições clínicas onde reações do tipo IV são importantes, tal como hipersensibilidade de contato do tipo tardia, dermatite, dermatite de contato, pneumonite de hipersensibilidade, rejeição de aloenxerto, granulomas devido a organismos intracelulares, algumas formas de sensibilidade à droga, tiroidite e encefalomielite após vaci20 nação de raiva.

DTH pode resultar de resposta imune mediada por célula normal à infecção, com vírus, fungos e certas bactérias, de forma especial Mycobacterium tuberculosis e Mycobacteríum leprae. Agentes externos adicionais que elicitam DTH podem ser secreções de plantas, animais, insetos ou rép25 teis, antígenos químicos ou bioquímicos. Eles podem ser derivados de fontes sintéticas ou naturais. Vários tipos de fibras, tecido e similar, tal como látex usado em luvas cirúrgicas, podem dar origem à reação de hipersensibilidade mediada por célula T em certos indivíduos. Os agentes externos ofensivos podem ser agentes de origem aquosa tal como sais e minerais dissol30 vidos, encontrados, por exemplo, em operações de fabricação ambiental, de mineração, metalúrgica e química.

Em uma outra modalidade preferida da invenção, o distúrbio de res de caspase-1 e similar.

Um inibidor da ação de IL-18 pode ser um antagonista de IL-18, por exemplo. Antagonistas podem ou se ligar a ou seqüestrar a própria molécula de IL-18 com afinidade e especificidade suficientes para parcialmente ou substancialmente neutralizar a IL-18 ou o(s) sítio(s) de ligação IL-18 responsáveis pela ligação de IL-18 a seus ligantes (tal como, por exemplo, seus

receptores). Um antagonista pode também inibir o curso de sinalização de IL-18, que é ativado dentro das células quando da ligação de IL-18/receptor.

Inibidores da ação de IL-18 podem ser também receptores de IL10 18 solúveis ou moléculas imitando os receptores, ou agentes bloqueando os receptores de IL-18, ou anticorpos de IL-18, tal como anticorpos policlonais ou monoclonais, ou qualquer outro agente ou molécula que previna a ligação de IL-18 a seus alvos, desse modo diminuindo ou prevenindo o início das reações intra- ou extracelulares mediadas por IL-18.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, o inibidor de IL-18 é selecionado de inibidores de caspase-1 (ICE), anticorpos direcionados contra IL-18, anticorpos direcionados contra qualquer uma das subunidades de receptor de IL-18, inibidores do curso de sinalização de IL-18, antagonistas de IL-18 que competem com IL-18 e bloqueiam o receptor de II20 18, e proteínas de ligação de IL-18, isoformas, muteínas, proteínas fundidas,

derivados funcionais, frações ativas ou seus derivados circularmente permutados tendo a mesma atividade.

O termo proteínas de ligação de IL-18 é usado aqui como sinônimo com proteína de ligação de IL-18 ou IL-18BP. Ele compreende 25 proteínas de ligação de IL-18 conforme definido no WO 99/09063 ou em Novick e outros, 1999, incluindo variantes de união e/ou isoformas de proteínas de ligação de IL-18, conforme definido em Kim e outros, 2000, que se ligam a IL-18. Em particular, as isoformas humanas a e c de IL-18BP são úteis de acordo com presente invenção. As proteínas úteis de acordo com a presente 30 invenção podem ser glicosiladas ou não-glicosiladas, elas podem ser derivadas de fontes naturais, tal como urina, ou elas podem ser de preferência produzidas recombinantemente. Expressão recombinante pode ser realizada

em sistemas de expressão procarióticos tal como E. coli, ou em eucarióticos, e de preferência em sistemas de expressão de mamíferos.

Conforme aqui usado, o termo muteínas refere-se a análogos de uma IL-18BP, ou análogos de uma IL-18BP viral, onde um ou mais dos resíduos de aminoácido de uma IL-18BP natural ou IL-18BP viral são substituídos por resíduos de aminoácido diferentes, ou são deletados, ou um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados à seqüência natural de uma IL-18BP, ou uma IL-18BP viral, sem mudar consideravelmente a atividade dos produtos resultantes conforme comparado com a IL-18BP do tipo selva-

gem ou IL-18BP viral. Essas muteínas são preparadas através de síntese conhecida e/ou através de técnicas de mutagênese direcionadas ao sítio, ou qualquer outra técnica conhecida adequada para isso.

Muteínas de acordo com a presente invenção incluem proteínas codificadas por um ácido nucléico, tal como DNA ou RNA, que hibridiza para

DNA ou RNA, que codifica uma IL-18BP ou codifica uma IL-18BP, de acordo com a presente invenção, sob condições estringentes. O termo condições estringentes refere-se à hibridização e subseqüentes condições de lavagem, às quais aqueles de habilidade comum na técnica convencionalmente referem-se como estringentes. Vide Ausubel e outros, Current Protocols in

Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§ 6,3 e 6,4 (1987, 1992) e

Sambrook e outros, supra. Sem limitação, exemplos de condições estringentes incluem condições de lavagem de 12-20°C abaixo da Tm calculada do híbrido sob estudo em, por exemplo, 2 x SSC e SDS 5% por 5 minutos, 2 x SSC e SDS 0,1% por 15 minutos; 0,1 x SSC e SDS 0,5% a 37° C por 3025 60 minutos e então 0,1 x SSC e SDS 0,5% a 68° C por 30-60 minutos.

Aqueles versados na técnica entendem que condições de estringência também dependem do comprimento das seqüências de DNA, sondas de nucleotídeo (tal como 10-40 bases) ou sondas de oligonucleotídeo mistas. Se sondas mistas forem usadas, é preferível usar cloreto de tetrametil amônio 30 (TMAC) ao invés de SSC. Vide Ausubel, supra.

A identidade reflete uma relação entre duas ou mais seqüências de polipeptídeo ou duas ou mais seqüências de polinucleotídeo, determina cidade de se ligar à IL-18. Uma vez que a muteína tem substancialmente atividade de ligação com IL-18, ela pode ser usada na purificação de IL-18, tal como por meio de cromatografia de afinidade, e desse modo pode ser considerada ter atividade substancialmente similar à IL-18BP. Desse modo, pode ser determinado se qualquer dada muteína tem substancialmente a mesma atividade que IL-18BP por meio de experimentação de rotina compreendendo submeter tal muteína, por exemplo, a um ensaio de competição de sanduíche simples para determinar se ela se liga ou não a uma IL-18 apropriadamente marcada, tal como ensaio de radioimunoensaio ou ELISA.

Em uma modalidade preferida, qualquer tal muteína tem pelo menos 40% de identidade ou homologia com a seqüência ou de uma IL18BP ou um homólogo de IL-18BP viralmente codificado, conforme definido no WO 99/09063. Com mais preferência, ela tem pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou, com mais preferência, pelo menos 90% de identidade ou homologia.

As muteínas de polipeptídeos de IL-18BP ou muteínas de IL18BPs virais, que podem ser usadas de acordo com a presente invenção, ou ácido nucléico codificando para elas, incluem um conjunto finito de seqüências substancialmente correspondentes como peptídeos ou polinucleotídeos de substituição que podem ser rotineiramente obtidas por uma pessoa ver-

sada na técnica, sem experimentação indevida, com base em ensinamentos e guia apresentados aqui.

Mudanças preferidas para muteínas de acordo com a presente invenção^_são o que são conhecidas como substituições conservativas. 25 Substituições de aminoácido conservativas de polipeptídeos ou proteínas de IL-18BP ou IL-18BP virais podem incluir aminoácidos sinônimos dentro de um grupo que tem propriedades físico-químicas suficientemente similares que a substituição entre membros do grupo vai preservar o funcionamento biológico da molécula (Grantham, 1974). É claro que inserções e deleções 30 de aminoácidos podem ser também feitas nas seqüências acima definidas sem alterar seu funcionamento, particularmente se as inserções ou deleções apenas envolverem alguns aminoácidos, por exemplo, sob trinta, e de prefe

rência sob dez, e não removerem ou deslocarem aminoácidos que são críticos para uma conformação funcional, por exemplo, resíduos de cisteína. Proteínas e muteínas produzidas por tais deleções e/ou inserções estão ao alcance da presente invenção.

5	De preferência, os grupos de aminoácido sinônimos são aqueles
		definidos na Tabela 1. Com mais preferência, os grupos de aminoácido si-
		nônimos são aqueles definidos na Tabela 2; e com mais preferência os gru-
		pos aminoácidos sinônimos são aqueles definidos na Tabela 3.
		TABELA 1
•	10		Grupos Preferidos de Aminoácidos Sinônimos
	Aminoácido	Grupo Sinônimo
		Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
		Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
		Leu	lie, Phe, Tyr, Met, Vai, Leu
	15	Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
*		Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
		Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
		Vai	Met, Tyr, Phe, lie, Leu, Vai
		Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
	20	lie	Met, Tyr, Phe, Vai, Leu, lie
		Phe	Trp, Met, Tyr, lie, Vai, Leu, Phe
		Tyr	Trp, Met, Phe, lie, Vai, Leu, Tyr
		Cys	Ser, Thr, Cys
		His	Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
	25	Gin	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
		Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
		Lys	Glu, Gin, His, Arg, Lys
		Asp	Glu, Asn, Asp
		Glu	Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
	30	Met	Phe, lie, Vai, Leu, Met
		Trp	Trp

Vai

Gly lie

Phe

Tyr

Cys

His

Gin

Asn

Lys

Asp

Glu

Met

Trp

Gly lie, Met, Leu

Phe

Tyr

Cys, Ser

His

Gin

Asn

Lys

Asp

Glu

Met, lie, Leu

Met

Exemplos de produção de substituição de aminoácido em proteínas que podem ser usados para' obtenção de muteínas de polipeptídeos ou proteínas de IL-18BP, ou muteínas de IL-18BPs virais, para uso na presente invenção incluem quaisquer etapas de método conhecidas, tal como apresentado nas patentes U.S. N°s 4.959.314, 4.588.585 e 4.737.462 para Mark e outros; 5.116.943 para Koths e outros, 4.965.195 para Namen e outros; 4.879.111 para Chong e outros; e 5.017.691 para Lee e outros; e proteínas substituídas com lisina apresentadas na Patente N° 4.904.584 (Shaw e outros).

O termo proteína fundida refere-se a um polipeptídeo compreendendo uma IL-18BP, ou uma IL-18BP viral, ou uma muteína ou seu fragmento, fundido com uma outra proteína, que, por exemplo, tem um tempo de residência prolongado nos fluidos do corpo. Uma IL-18BP ou uma IL-18BP viral pode então ser fundida em uma outra proteína, polipeptídeo ou similar, por exemplo, uma imunoglobulina ou um seu fragmento.

Derivados funcionais conforme aqui usado cobre todos os derivados de IL-18BPs ou de uma IL-18BP viral, e suas muteínas e proteínas fundidas, que podem ser preparadas a partir de grupos funcionais que ocor30

rem como cadeias laterais nos resíduos ou dos grupos N- ou C-terminais, através de meios conhecidos na técnica, e são incluídos na invenção contanto que eles permaneçam farmaceuticamente aceitáveis, isto é, não destruam a atividade da proteína que é substancialmente similar à atividade da 5 IL-18BP, ou IL-18BPs viral, e não confiram propriedades tóxicas às composições que os contêm.

Esses derivados podem, por exemplo, incluir cadeias laterais de polietileno-glicol, que podem mascarar sítios antigênicos e estender a residência de uma IL-18BP ou uma IL-18BP viral nos fluidos corporais. Outros 10 derivados incluem ésteres alifáticos dos grupos carboxila, amidas dos grupos carboxila através de reação com amônia ou com aminas primárias ou secundárias, derivados de N-acila de grupos amino livres dos resíduos de aminoácido formados com porções acila (por exemplo, grupos alcanoíla ou aroíla carbocíclicos) ou derivados O-acila de grupos hidroxila livres (por 15 exemplo, aqueles de resíduos serila ou treonila) formados com porções acila.

Como frações ativas de uma IL-18BP, ou uma IL-18BP viral, muteínas e proteínas fundidas, a presente invenção abrange quaisquer fragmento ou precursores da cadeia de polipeptídeo da molécula de proteína 20 sozinhos ou juntos com moléculas ou resíduos associados ligados a ela, por exemplo, resíduos de açúcar ou fosfato, ou agregados da molécula de proteína ou os próprios resíduos de açúcar, contanto que a dita fração tenha atividade substancialmente similar à IL-18BP.

O termo sais aqui refere-se a ambos sais de grupos carboxila e 25 a sais de adição ácidos de grupos amino da molécula inibidora de IL-18, ou seus análogos. Sais de um grupo carboxila podem ser formados através de meios conhecidos na técnica e incluem sais inorgânicos, por exemplo, sais de sódio, cálcio, amônio, férricos ou de zinco, e similar, e sais com bases orgânicas tal como aqueles formados, por exemplo, com aminas, tal como 30 trietanolamina, arginina ou lisina, piperidina, procaína e similar. Sais de adição ácidos incluem, por exemplo, sais com ácidos minerais tal como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico, e sais com ácidos orgânicos, tal

como, por exemplo, ácido acético ou ácido oxálico. Por certo, qualquer um de tais sais deve reter a atividade biológica do inibidor de IL-18 relevante para a presente invenção, de modo a exercer um efeito benéfico sobre DHT, por exemplo.

Em uma modalidade preferida da invenção, o inibidor de IL-18 é um anticorpo de IL-18. Anticorpos anti-IL-18 podem ser policlonais ou monoclonais, quiméricos, humanizados, ou até mesmo completamente humanos.

Anticorpos recombinantes e seus fragmentos são caracterizados por ligação de alta afinidade com IL-18 in vivo e baixa toxidez. Os anticorpos que podem 10 ser usados na invenção são caracterizados por sua habilidade em tratar pacientes por um período suficiente para ter regressão ou alívio bom a excelente da condição patogênica ou qualquer sintoma ou grupo de sintomas relacionado a uma condição patogênica, e uma baixa toxidez.

Anticorpos de neutralização são imediatamente produzidos em 15 animais tal como coelhos, cabras ou camundongos através de imunização com IL-18. Camundongos imunizados são particularmente úteis para prover fontes de células B para a fabricação de hibridomas, que. por sua vez são postos em cultura para produzir grandes quantidades de anticorpos monoclonais anti-IL-18.

Anticorpos quiméricos são moléculas de imunoglobulina caracterizadas por dois ou mais segmentos ou porções derivadas de espécies de animais diferentes. Em geral, a região variável do anticorpo quimérico é derivada de um anticorpo de mamífero não-humano, tal como anticorpo monoclonal de murino, e a região constante de imunoglobulina é derivada de uma molécula de imunoglobulina humana. De preferência, ambas regiões e a combinação têm baixa imunogenicidade conforme rotineiramente determinado (Elliott e outros, 1994). Anticorpos humanizados são moléculas de imunoglobulina criadas através de técnicas de engenharia genética onde as regiões constantes de murino são substituídas com duplicatas humanas en30 quanto retendo as regiões de ligação de antígeno de murino. O anticorpo quimérico camundongo-humano resultante tem de preferência imunogenicidade reduzida e farmacocinética aperfeiçoada em seres humanos (Knight e

outros, 1993).

Desse modo, em uma modalidade preferida adicional, anticorpo de IL-18 é um anticorpo de IL-18 humanizado. Exemplos preferidos de anticorpos anti-IL-18 humanizados são descritos no Pedido de Patente Europeu 5 EP 0 974 600, por exemplo.

Em ainda uma modalidade preferida, o anticorpo de IL-18 é completamente humano. A tecnologia para produção de anticorpos humanos é descrita em detalhes no, por exemplo, WO 00/76310, WO 99/53049, US

6.162.963 ou AU 5336100. Anticorpos completamente humanos são anticor-

pos recombinantes, de preferência produzidos em animais transgênicos, por exemplo, xenocamundongos, compreendendo todos ou partes de locais de imunoglobulina humanos funcionais.

Em uma modalidade altamente preferida da presente invenção, o inibidor de IL-18 é uma IL-18BP, ou uma isoforma, uma muteína, proteína 15 fundida, derivado funcional, fração ativa ou derivado circularmente permutado dela. Essas isoformas, muteínas, proteínas fundidas ou derivados funcionais retêm a atividade biológica da IL-18BP, em particular a ligação à IL-18, e de preferência têm essencialmente pelo menos uma atividade similar à IL18BP. Idealmente, tais proteínas têm uma atividade biológica acentuada

comparado com IL-18BP não-modificada. Frações ativas preferidas têm uma atividade que é melhor do que a atividade de IL-18BP, ou que têm vantagens adicionais, tal como uma melhor estabilidade ou uma menor toxidez ou imunogenicidade, ou elas são mais fáceis de produzir em quantidades maiores, ou mais fáceis de purificar.

As seqüências de IL-18BP e suas variantes/isoformas unidas podem ser tomadas do WO 99/09063 ou de Novick e outros, 1999, bem como de Kim e outros, 2000.

Derivados funcionais de IL-18BP podem ser conjugados a polímeros a fim de melhorar as propriedades da proteína, tal como a estabilida30 de, meia-vida, biodisponibilidade, tolerância ao corpo humano ou imunogenicidade. Para atingir esse objetivo, a IL-18BP pode ser ligada, por exemplo, a polietilenoglicol (PEG). PEGilação pode ser realizada através de métodos

conhecidos descritos no WO 92/13095, por exemplo.

Desse modo, em uma modalidade preferida, o derivado funcional compreende pelo menos uma porção ligada a um ou mais grupos funcionais, que acontecem como uma ou mais cadeias laterais nos resíduos de

aminoácido. Uma modalidade onde a porção é uma porção de polietilenoglicol (PEG) é altamente preferida.

Em uma modalidade preferida adicional da invenção, o inibidor de IL-18 compreende uma fusão de imunoglobulina, isto é, o inibidor de IL18 é uma proteína fundida compreendendo toda ou parte de uma proteína 10 de ligação de IL-18, que é fundida a toda ou uma porção de uma imunoglobulina. Métodos de fabricação de proteínas de fusão de imunoglobulina são bem-conhecidos na técnica, tal como, aqueles descritos no WO 01/03737, por exemplo. A pessoa versada na técnica vai compreender que a proteína de fusão resultante da invenção retém a atividade biológica da IL-18BP, em particular a ligação à IL-18. A fusão pode ser direta, ou através de um peptideo ligante curto que pode ser tão curto quanto 1 a 3 resíduos de aminoácido de comprimento ou mais longo, por exemplo, 13 resíduos de aminoácido de comprimento. O dito ligante pode ser um tripeptídeo da seqüência E-F-M (Glu-Phe-Met), por exemplo, ou uma seqüência de ligante de 13 aminoáci20 dos compreendendo Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-GIn-Phe-Met

introduzida entre a seqüência de IL-18BP e a seqüência de imunoglobulina. A proteína de fusão resultante tem propriedades aperfeiçoadas, tal como um tempo de residência prolongado nos fluidos do corpo (meia-vida), atividade específica maior, nível de expressão maior ou a purificação da proteína de 25 fusão é facilitada.

Em uma modalidade particular, IL-18BP é fundida à região constante de uma molécula de Ig. De preferência, ela é fundida a regiões de cadeia pesada, tal como domínios CH2 e CH3 de lgG1 humano, por exemplo. A geração de proteínas de fusão específicas compreendendo IL-18BP e 30 uma porção de uma imunoglobulina é descrita no exemplo 11 do WO 99/09063, por exemplo. Outras isoformas de moléculas de Ig são também adequadas para a geração de proteínas de fusão de acordo com a presente

invenção, tal como isoforma lgG2 ou lgG4, ou outras classes de Ig, tal como IgM ou IgA, por exemplo, proteínas de fusão podem ser monoméricas ou multiméricas, hetero- ou homomultiméricas.

Interferons são predominantemente conhecidos pelos efeitos inibidores sobre a replicação viral e proliferação celular. Interferon-γ, por exemplo, desempenha um papel importante na promoção de respostas imune e inflamatória. Interferon β (IFN-β, um interferon do tipo I) é dito desempenhar um papel antiinflamatório.

A invenção desse modo refere-se também ao uso de uma com-

binação de um inibidor de IL-18 e um interferon na fabricação de um medicamento para o tratamento de distúrbios de hipersensibilidade.

Interferons podem ser também conjugados a polímeros a fim de melhorar a estabilidade das proteínas. Um conjugado entre interferon β e o polietilenoglicol de poliol (PEG) foi descrito no WO 99/55377, por exemplo.

Em uma outra modalidade preferida da invenção, o interferon é um interferon-β (IFN-β), e com mais preferência IFN-β 1a.

O inibidor de produção e/ou ação de IL-18 é de preferência usado simultaneamente, seqüencialmente ou separadamente com o interferon.

Em uma modalidade ainda adicional da invenção, um inibidor de

IL-18 é usado em combinação com um antagonista de TNF. Antagonistas de

TNF exercem sua atividade de várias maneiras. Primeiro, os antagonistas podem ser ligar ou seqüestrar a própria molécula de TNF com afinidade e especificidade suficientes para parcialmente ou substancialmente neutralizar o epítopo ou epítopos de TNF responsáveis pela ligação do receptor de TNF (daqui em diante referido como antagonistas de seqüestro). Um antagonista de seqüestro pode ser, por exemplo, um anticorpo direcionado contra

TNF.

Alternativamente, antagonistas de TNF podem inibir o curso de sinalização de TNF ativado pelo receptor de superfície celular após ligação 30 de TNF (daqui em diante chamados antagonistas de sinalização). Ambos grupos de antagonistas são úteis, ou sozinhos ou juntos, em combinação com um inibidor de IL-18, na terapia de distúrbios de hipersensibilidade.

Antagonistas de TNF são facilmente identificados e avaliados através de avaliação de rotina de candidatos quanto ao seu efeito sobre a

atividade de TNF nativo sobre tipos de célula suscetíveis in vitro, por exemplo, células humanas B, onde TNF causa proliferação e secreção de imuno5 globulina. O ensaio contém formulação de TNF em diluições variáveis de antagonista candidato, por exemplo, de a partir de 0,1 á 100 vezes a quantidade molar de TNF usado no ensaio, e controles sem nenhum TNF ou apenas antagonista (Tucci e outros, 1992).

Antagonistas de seqüestro são os antagonistas de TNF preferi10 dos para serem usados de acordo com a presente invenção. Dentre os antagonistas de seqüestro, aqueles polipeptídeos que se ligam a TNF com alta afinidade e possuem baixa imunogenicidade são preferidos. Moléculas de receptor de TNF solúveis e anticorpos de neutralização para TNF são particularmente preferidos. Por exemplo, TNF-RI e TNF-RII solúveis são úteis na 15 presente invenção. Formas truncadas desses receptores, compreendendo os domínios extracelulares dos receptores ou suas porções funcionais, são antagonistas mais particularmente preferidos de acordo com a presente invenção. Receptores do tipo I e tipo II de TNF solúveis truncados são descritos na EP914431, por exemplo.

Formas truncadas dos receptores de TNF são solúveis e foram detectadas na urina e soro como proteínas de ligação inibidoras de TNF de 30 kDa e 40 kDa, que são chamadas TBPI e TBPII, respectivamente (Engelmann e outros, 1990). O uso simultâneo, seqüencial ou separado do inibidor de IL-18 com o antagonista de TNF e/ou Interferon é preferido, de 25 acordo com a invenção.

De acordo com a invenção, TBP I e TBP II são antagonistas de TNF preferidos para serem usados em combinação com um inibidor de IL18. Derivados, fragmentos, regiões e porções biologicamente ativas das moléculas de receptor funcionalmente lembram as moléculas de receptor 30 que podem ser também usadas na presente invenção. Tais equivalentes ou derivados biologicamente ativos da molécula de receptor referem-se à porção do polipeptídeo, ou da sequência codificando a molécula de receptor,

que é de tamanho suficiente e capaz de se ligar a TNF com tal afinidade que a interação com o receptor de TNF ligado à membrana é inibida ou bloqueada.

Em uma modalidade adicionalmente preferida, TNF-RI solúvel humano (TBPI) é o antagonista de TNF a ser usado de acordo com a invenção. As moléculas de receptor de TNF solúvel natural e recombinante e métodos para sua produção foram descritos nas Patentes Européias EP 308 378, E 398 327 e EP 433 900.

O inibidor de IL-18 pode ser usado simultaneamente, seqüenci-

almente ou separadamente com o inibidor de TNF.

Em uma modalidade adicionalmente preferida da invenção, o medicamento compreende ainda um agente antiinflamatório, tal como um NSAID (drogas antiinflamatórias não-esteroidais). Em uma modalidade pre ferida, um inibidor de COX, e com mais preferência um inibidor de COX-2, é usado em combinação com um inibidor de IL-18. Inibidores de COX são conhecidos na técnica. Inibidores de COX-2 específicos são descritos no WO

01/00229, por exemplo. Os componentes ativos podem ser usados simultaneamente, seqüencialmente ou separadamente.

Reações de hipersensibilidade estão freqüentemente sendo tra20 tadas com drogas antialérgicas tal como anti-histaminas, cromolina, glico-

corticóides ou simpatomiméticos. Desse modo, a presente invenção referese ainda à terapia de combinação compreendendo um inibidor de IL-18 e uma droga antialérgica. O uso de uma anti-histamina e/ou cromolina e/ou um glicocorticóide e/ou simpatomimético para uso separado, seqüencial ou si25 multâneo com um inibidor de IL-18 é preferido de acordo com a presente invenção.

Em uma modalidade adicionalmente preferida da presente invenção, o inibidor de IL-18 é usado em uma quantidade de cerca de 0,001 a 1000 mg/kg de peso corporal, ou cerca de 0,0001 a 100 mg/kg de peso cor30 poral a cerca de 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal ou cerca de 0,1 a 5 mg/kg ou cerca de 1 a 3 mg/kg de peso corporal.

O inibidor de IL-18 de acordo com a invenção é de preferência

administrado topicamente, isto é, localmente. Para dermatite de contato, por exemplo, o inibidor de IL-18 pode ser administrado diretamente sobre a área afetada da pele.

Em uma outra modalidade da invenção, o inibidor de IL-18 é 5 administrado sistemicamente, e de preferência subcutaneamente ou intramuscularmente.

A invenção refere-se ainda ao uso de um vetor de expressão compreendendo a seqüência de codificação de um inibidor de IL-18 na preparação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de distúrbios 10 de hipersensibilidade. Desse modo, uma abordagem de terapia de gene é considerada a fim de aplicar o inibidor de IL-18 ao sítio onde ele é necessário. A fim de tratar e/ou prevenir um distúrbio de hipersensibilidade, um vetor de terapia de gene compreendendo a seqüência de um inibidor de produção e/ou ação de IL-18 pode ser injetado diretamente do tecido doente, por 15 exemplo, desse modo evitando problemas envolvidos em administração sistêmica de vetores de terapia de gene, tal como diluição dos vetores, alcance e chegada nas células ou tecidos alvo, e de efeitos colaterais.

O uso de um vetor para indução e/ou aumento da produção endógena de um inibidor de IL-18 em uma célula normalmente silenciosa 20 quanto à expressão de um inibidor de IL-18, ou que expressa quantidades

do inibidor que não são suficientes, é também contemplado de acordo com a invenção. O vetor pode compreender seqüências de regulagem funcionais nas células desejadas para expressar o inibidor ou IL-18. Tais seqüências de regulagem podem ser promotoras ou realçadoras, por exemplo. A seqüência 25 de regulagem pode então ser introduzida no local à direita do genoma através de recombinação homóloga, desse modo operavelmente ligando a seqüência de regulagem com o gene, cuja expressão é requerida ser induzida ou realçada. A tecnologia é geralmente referida como Ativação de Gene Endógeno (EGA), e é descrita, por exemplo, no WO 91/09955.

Será compreendido pela pessoa versada na técnica que é também possível parar a expressão de IL-18 diretamente, sem usar um inibidor de IL-18, com a mesma técnica. Para se fazer isso, um elemento de regula37

gem negativo, tal como, por exemplo, um elemento de silenciamento, pode ser introduzido no local do gene de IL-18, desse modo levando à supraregulagem ou prevenção da expressão de IL-18. A pessoa versada na técnica vai compreender que tal supra-regulagem ou silenciamento da expressão 5 de IL-18 tem o mesmo efeito que o uso de um inibidor de IL-18 a fim de prevenir e/ou tratar doença.

A invenção refere-se ainda ao uso de uma célula que foi geneticamente modificada para produzir um inibidor de IL-18 na fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de distúrbios de hipersensi-

bilidade.

A invenção refere-se ainda a composições farmacêuticas, particularmente úteis para prevenção e/ou tratamento de distúrbios de hipersensibilidade, que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de IL-18 e/ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um interferon e/ou uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um inibidor de

TNF e/ou uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um agente antiinflamatório e/ou uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um agente anti-

alérgico, em particular uma anti-histamina.

Como inibidor de IL-18, a composição pode compreender inibi20 dores de caspase-1, anticorpos contra IL-18, anticorpos contra qualquer uma das subunidades do receptor de IL-18, inibidores do curso de sinalização de IL-18, antagonistas de IL-18 que competem com IL-18 e bloqueiam o receptor de IL-18, e proteínas de ligação de IL-18, isoformas, muteínas, proteínas fundidas, derivados funcionais, frações ativas ou seus derivados circular25 mente permutados tendo a mesma atividade.

IL-18BP e suas isoformas, muteínas, proteínas fundidas, derivados funcionais, frações ativas ou derivados circularmente permutados conforme acima descrito são os ingredientes ativos preferidos das composições farmacêuticas.

O interferon compreendido na composição farmacêutica é de preferência IFN-β.

Em ainda uma outra modalidade preferida, a composição farma38

cêutica compreende quantidades terapeuticamente eficazes de um inibidor de TNF alfa. A composição farmacêutica de acordo com a invenção compreende ainda um ou mais inibidores de COX.

A definição de farmaceuticamente aceitável quer dizer com5 preender qualquer veículo que não interfira com a eficácia da atividade biológica do ingrediente ativo e que não seja tóxico para o hospedeiro ao qual ele é administrado. Por exemplo, para administração parenteral, a(s) proteínas(s) ativa(s) pode(m) ser formulada(s) em uma forma de dosagem unitária

para injeção em veículos tal como solução salina, solução de dextrose, al10 bumina de soro e solução de Ringer.

Os ingredientes ativos da composição farmacêutica de acordo com a invenção podem ser administrados a um indivíduo em uma variedade de maneiras. As vias de administração incluem vias intradérmica, transdérmica (por exemplo, em formulações de liberação lenta), intramuscular, intra15 peritoneal, intravenosa, subcutânea, oral, intracranial, epidural, tópica, retal e intranasal. Qualquer outra via terapeuticamente eficaz de administração pode ser usada, por exemplo, absorção através de tecidos epiteliais e endoteliais ou através de terapia de gene onde uma molécula de DNA codificando o agente ativo é administrada ao paciente (por exemplo, através de um vetor) que faz com que o agente ativo seja expresso e secretado in vivo.

Em adição, a(s) proteína(s) de acordo com a invenção pode(m) ser administrada(s) junto com outros componentes de agentes biologicamente ativos tal como tensoativos, excipientes, veículos, diluentes e veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Para administração parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular) a(s) proteínas(s) ativa(s) pode(m) ser formulada(s) como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável (por exemplo, água, solução salina, solução de dextrose) e aditivos que mantêm a isotonicidade (por exemplo, manitol) ou estabilidade química (por exemplo, conservantes e tampões). A formulação é esterilizada através de técnicas comumente usadas.

A biodisponibilidade da(s) proteína(s) ativa(s) de acordo com a invenção pode também ser melhorada usando procedimentos de conjugação que aumentam a meia-vida da molécula no corpo humano, por exemplo, ligando a molécula a polietilenoglicol, conforme descrito no Pedido de Patente 5 PCT WO 92/13095.

As quantidades terapeuticamente eficazes da(s) proteína(s) ativais) serão uma função de muitas variáveis, incluindo o tipo de antagonista, a afinidade do antagonista para IL-18, qualquer atividade citotóxica residual

exibida pelos antagonistas, a via de administração, a condição clínica do paciente (incluindo a vontade de manter um nível não-tóxico de atividade de IL-18).

Uma quantidade terapeuticamente eficaz é tal que quando administrado, o inibidor de IL-18 resulta em inibição da atividade biológica da IL-18. A dose administrada, com doses únicas ou múltiplas, a um indivíduo 15 vai variar dependendo de uma variedade de fatores, incluindo propriedades farmacocinéticas do inibidor de IL-18, a via de administração, condições e características do paciente (sexo, idade, peso do corpo, saúde, tamanho), extensão dos sintomas, tratamentos concomitantes, freqüência de tratamento e efeito desejado. Ajuste e manipulação de faixas de dosagem fixa20 das estão dentro da habilidade daqueles versados na técnica, bem como

métodos in vitro e in vivo de determinação da inibição de IL-18 em um indivíduo.

De acordo com a invenção, o inibidor de IL-18 é usado em uma quantidade de cerca de 0,001 a 100 mg/kg ou cerca de 0,01 a 10 mg/kg ou 25 peso do corpo, ou cerca de 0,1 a 5 mg/kg de peso do corpo ou cerca de 1 a 3 mg/kg de peso do corpo ou cerca de 2 mg/kg de peso do corpo.

A via de administração que é preferida de acordo com a invenção é administração através de via subcutânea. Administração intramuscular é ainda preferida de acordo com a invenção. A fim de administrar o inibidor 30 de IL-18 diretamente ao local de sua ação, é também preferível administrá-lo topicamente.

Em modalidades ainda preferidas, o inibidor de IL-18 é adminis40

trado diariamente ou dia sim, dia não.

As doses diárias são geralmente dadas em doses divididas ou na forma de liberação prolongada eficaz para se obter os resultados desejados. Segunda ou administrações subsequentes podem ser realizadas em 5 uma dose que é a mesma, menor do que ou maior do que a dose inicial ou

anterior administrada ao indivíduo. Uma segunda ou subseqüente administração pode ser administrada durante ou antes do início da doença.

De acordo com a invenção, o inibidor de IL-18 pode ser administrado profilaticamente ou terapeuticamente a um indivíduo antes de, si10 multaneamente ou seqüencialmente a outros regimes ou agentes terapêuticos (por exemplo, regimes de droga múltiplos), em uma quantidade terapeuticamente eficaz, em particular com um interferon e/ou um inibidor de TNF e/ou um outro agente antiinflamatório, tal como inibidor de COX e/ou agente antialérgico. Agentes ativos que são administrados simultaneamente com 15 outros agentes terapêuticos podem ser administrados na mesma ou em composições diferentes.

A invenção refere-se ainda a um método para a preparação de uma composição farmacêutica compreendendo misturar uma quantidade eficaz de um inibidor de IL-18 e/ou um interferon e/ou um antagonista de

TNF e/ou inibidor de COX com um veículo farmaceuticamente aceitável.

A invenção refere-se ainda a um método de tratamento de distúrbios de hipersensibilidade, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de IL-18 a um paciente com necessidade dele.

Tendo agora descrito a invenção em sua totalidade, será compreendido por aqueles versados na técnica que a mesma pode ser realizada dentro de uma ampla faixa de parâmetros, concentrações e condições equivalentes sem se afastar do espírito e escopo da invenção e sem experimentação indevida.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com ligação às suas modalidades específicas, será compreendido que ela é capaz de modificações adicionais. Este pedido pretende cobrir quaisquer variantes, usos ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais desvios do presente relatório dentro da prática conhecida e comum na técnica à qual a invenção pertence e como tal pode ser aplicado às características essenciais mostradas aqui anteriormente como segue no 5 escopo das reivindicações apensas.

Todas as referências citadas aqui, incluindo artigos de jornal e resumo, publicadas ou não-publicadas nos Estados Unidos ou pedido de patente estrangeiro, expedido nos EUA ou patentes estrangeiras ou quaisquer outras referências, são totalmente aqui incorporadas a título de referên-

cia, incluindo todos os dados, tabelas, figuras e texto presentes nas referências citadas. Adicionalmente, os conteúdos integrais das referências citadas nas referências citadas aqui são também aqui totalmente incorporados a título de referência.

Referência a etapas de método conhecidas, etapas de métodos convencionais, métodos conhecidos ou métodos convencionais não é de modo algum uma admissão de que qualquer aspecto, descrição ou modalidade da presente invenção seja descrita, ensinada ou sugerida na técnica relevante.

A descrição acima das modalidades específicas vai então reve20 lar completamente a natureza geral da invenção que os outros podem, através da aplicação de conhecimento dentro da habilidade da técnica, (incluindo os conteúdos das referências citadas aqui) imediatamente modificar e/ou adaptar para várias aplicações tal como modalidades específicas, sem experimentação indevida, sem se afastar do conceito geral da presente invenção.

Desse modo, tais adaptações e modificações pretendem estar dentro do significado e faixa de equivalentes das modalidades descritas, com base no ensinamento e guia apresentados aqui. Deve ser entendido que a fraseologia e terminologia aqui é para propósito de descrição e não de limitação, de modo que a terminologia ou fraseologia do presente relatório deve ser inter30 pretada pelo versado na técnica à luz dos ensinamentos e guia apresentados aqui, em combinação com o conhecimento de uma pessoa versada na técnica.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Tratamento com IL-18BP diminui a hipersensibilidade de contato

Métodos

Modelos de murino de hipersensibilidade de contato experimentalmente induzida (CHS) foram usados em todos os exemplos abaixo. A extensão da CHS é medida através de inchaço da orelha em resposta a um sensibilizador localmente aplicado.

O teste de inchaço da orelha do camundongo que foi usado para

gerar os dados apresentados nas Figuras 1 a 3 (vide abaixo) foi descrito em detalhe (Garrigue e outros, 1994). Em resumo, os camundongos foram sensibilizados topicamente aplicando 25 pl de solução de 2,4dinitrofluorbenzeno 0,5% (DNFB; Sigma Chemical Co.) em acetona/óleo de oliva (4:1) ao abdômen depilado (dia 0). Cinco dias mais tarde, 20 pl de

DNFB 0,2% no mesmo veículo foram aplicados às orelhas direitas e veículo sozinho às orelhas esquerdas.

Ambos camundongos receberam diariamente, do dia 5 ao dia 8, ou 250 pg/camundongo/dia de rhlL-18BP (IL-18BP humana recombinante) ou solução salina no grupo de controle intraperitonealmente (i.p.) (Figura 20 1 A), ou eles receberam IL-18BP nos dias 0 a 2 (Figura 1B).

A espessura da orelha foi medida com um medidor de espessura com mostrador (Mitutoyo Corp., Kawasaki, Japão), e o inchaço da orelha foi estimado subtraindo a pré-provocação do valor de pós-provocação, e ainda subtraindo qualquer inchaço detectado na orelha contralateral provocada 25 com veículo.

O inchaço da orelha foi medido nos dias 0, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 14,

16.

Um outro modelo foi usado para gerar os dados apresentados nas Figuras 4 a 6, vide exemplos abaixo. A proteína de ligação de IL-18 (IL30 18BP) foi usada para neutralizar a IL-18 durante hipersensibilidade de contato experimentalmente induzida (CHS) para 2,4-Dinitrofluorbenzeno (DNFB). A estrutura experimental era como segue:

1. Dia 0: sensibilização μΙ de DNFB (0,5% em acetona/óleo de oliva (4/1) no torso depilado

2. Dia 5: provocação pl de DNFB (0,2%) cada no lado dorsal e ventral da orelha di5 reita μΙ de veículo cada no lado dorsal e ventral da orelha esquerda

3. Dia 6 e posteriores: leitura

Monitorar a espessura da orelha como uma medida de inflamação

Expressar o resultado como aumento no inchaço [pm] de orelha provocada versus controle

4. Dia 6 ou 7: orelhas de processo para análise

Neste modelo, os picos de inchaço entre o dia 6 e o dia 7. IL-18 foi neutralizada através de injeções diárias de 250 pg de IL-18BP (em solu15 ção salina) por animal, ou durante sensibilização no dia 0, dia 1 e dia 2, ou durante provocação no dia 4, dia 5 e dia 6.

Resultados

Respostas de hipersensibilidade de contato (CHS) são inflamações da pele específicas de hapteno mediadas por células T. A maior parte

dos haptenos dão origem a uma resposta de célula T oligoclonal consistindo principalmente em células T efetoras CD8⁺, enquanto que as células T CD4⁺têm um papel de sub-regulagem na resposta CHS (Bour, H. e outros, 1995; Grabbe e outros, 1998). Para testar o papel da IL-18 em CHS, os camundongos foram epicutaneamente sensibilizados com DNFB, e então provoca25 dos 5 dias mais tarde através de aplicação de hapteno à pele da orelha.

Concomitantemente à provocação do hapteno, os camundongos foram injetados i.p. ou com 250 pg/camundongo/dia de rhlL-18BP ou com solução salina. IL-18BP, ou solução salina como controle, foi administrada diariamente por 3 dias, nos dias 5 a 8 após a primeira sensibilização com DNFB (dia 0).

Provocação com DNFB no dia 5 induziu significantemente o inchaço na orelha em ambos grupos (Figura 1A). A extensão do inchaço nos camundongos tratados com solução salina (triângulos) era muito mais acentuada do que

em camundongos tratados com IL-18BP (quadrados), e quase voltaram para o estado normal já no dia 9.

A mudança no inchaço da orelha observado com tratamento com IL-18BP nos dias 0 a 2 não era estatisticamente significante (Figura 5 1B). O momento da administração de IL-18BP parece ser um fator importante a fim de se obter um efeito benéfico de tratamento com IL-18BP.

Conclusão:

Neste modelo de murino estabelecido de hipersensibilidade de contato/dermatite de contato, um tratamento de três dias com um inibidor de

IL-18BP tinha um efeito benéfico significante sobre a extensão do inchaço/inflamação elicitada pelo tratamento com um hapteno.

Exemplo 2: Tratamento com IL-18BP diminui a hipersensibilidade de contato após uma segunda provocação Métodos

Camundongos C57BL/6 foram sensibilizados através de aplicação epicutânea de 25 pl de solução de DNFB 0,5% no abdômen depilado (dia 0). Os camundongos receberam uma primeira provocação com 20 μΙ de DNFB 0,2% nas orelhas no dia 5. No dia 19, os camundongos receberam

uma segunda provocação com DNFB. O inchaço na orelha foi medido nos 20 dias 0 (sensibilização com hapteno), 5 (1^a provocação com hapteno), 6, 7, 8,

9, 12, 14, 16, 19 (2^a provocação com hapteno), 20, 21, 22, 23, 26, 28, 30. Os valores médios com SD para cada grupo são apresentados na Figura 2. Os camundongos foram tratados diariamente ou com 250 pg/camundongo/dia de IL-18BP i.p. (n = 5; Figura 2 quadrados abertos) ou com solução salina (n = 5, Figura 2, quadrados fechados) do dia 19 ao dia 23.

Resultado

Conforme mostrado na Figura 2, tratamento com IL-18BP significantemente reduziu o inchaço na orelha em particular após a segunda provocação com hapteno.

Desse modo, a terapia com IL-18BP é particularmente adequada para a terapia de distúrbios de hipersensibilidade, onde os pacientes são geralmente repetidamente provocados com o mesmo alérgeno e precisam

ser tratados a fim de superar as reações inflamatórias elicitadas pelas provocações.

Exemplo 3: IL-18BP protege de CHS através de neutralização de IL-18

A fim de verificar que a proteção do inchaço observado com o tratamento com IL-18BP era devido à neutralização de IL-18, camundongos deficientes em IL-18 (KO) e C57BL/6 do tipo selvagem foram comparados quanto à sua habilidade em estabelecer uma resposta de CHS. Camundongos deficientes em IL-18 realmente desenvolveram CHS para DNFB, embora menos pronunciada do que nos camundongos do tipo selvagem. No en-

tanto, nenhum efeito do tratamento com IL-18BP foi observado em camundongos deficientes em IL-18, conforme mostrado na Figura 3, indicando que o efeito antiinflamatório de IL-18BP em CHS era devido à neutralização de

IL-18 (n = 5 camundongos por grupo).

Exemplo 4: IL-18BP não reduz o derrame vascular

Métodos

CHS foi induzida em camundongos C57BL/6 conforme acima descrito. Para monitorar o edema causado pela reação de CHS, Evans Blue foi injetado i.v. 2 horas antes da provocação com DNFB. Os camundongos foram sacrificados 24 horas mais tarde e as orelhas processadas para extrair 20 o corante que tinha vazado da vasculatura e acumulado no tecido circun-

dante. Derrame vascular foi avaliado como quantidade de corante por mg de tecido de orelha seco corrigida para a concentração de Evans Blue no soro e expressa como a razão de orelha provocada versus de controle. Enquanto tratamento com IL-18BP no dia 4 e dia 5 reduziu o inchamento para 56% do 25 controle tratado com veículo (Figura 4, painel da esquerda, p < 0,01), não houve diferença no derrame vascular entre esses dois grupos (Figura 4, painel da direita). Ambos grupos mostraram edema significantemente maior conforme comparado com grupo de controle não-sensibilizado (p<0,05 e p<0,01). Como um controle adicional, os camundongos foram tratados com 30 250 pg da proteína BSA irrelevante por animal e dia. Esses camundongos desenvolveram CHS tal como os animais de controle tratados com veículo (n = 10 camundongos por grupo).

Ensaio in vivo quanto à derrame vascular (Evans Blue)

Princípio: Injeção (i.v.) de Evans Blue e extração do tecido alvo (orelha)

Dados brutos para avaliar:

· Curva padrão de Evans Blue (OD₆2o/ng) • Concentração de Evans Blue no sangue (OD₆2o/ml ou pg/ml, respectivamente) • Peso do tecido seco das orelhas (Ipsi e contralateral, mg) • Teor de Evans Blue nas orelhas (Ipsi e contralateral, OD₆₂o/pg

ou ng/mg, respectivamente)

Protocolo em combinação com DHFB induzida por CHS:

• no dia 5 de CHS experimentalmente induzida injetar 100 pl de

Evans Blue i.v. retroorbitalmente 2 horas antes da provocação de camundongos com DNFB · injetar IL-18BP i.p. 1 hora antes da provocação • no dia 6 (24 horas após provocação da orelha com DNFB) medir o inchaço e sacrificar o animal • tomar amostras sangüíneas e processar como segue:

o adicionar 30 μΙ de soro a 970 μΙ de formamida (—> diluição de

1/33)

gue:

o determinar o OD a 620 nm (1 OD₆2o θ igual a 33 OD₆2o/ml) • colher a orelha ipsilateral e contralateral e processar como seo secar 24 horas a 80° C o determinar o peso seco o moer e extrair corante com 1 ml de formamida, suavemente agitar 24 horas a 55°C o filtrar para remover dobras*³, encher os cadinhos, deixar assentar em temperatura ambiente por várias horas para permitir que os lipí30 deos flutuem para cima “ 7,5 mg/ml de Evans Blue (2 2129) em NaCI, 100 pl, i.v.) ^β Filtro de preparação de amostra Whatman de malha de 5 pm PTFE, N° 6984.0350

o determinar ο OD a 620 nm

Valores a serem calculados:

Derrame: —> Teor de Evans Blue por peso de tecido seco [ng/mgl

Concentração de Evans Blue no soro [pg/ml]

Derrame relativo: ~^> 100* derrame experimental derrame do veículo

Resultados:

Basicamente, dois processos contribuem para o inchaço observado durante a reação CHS: o derrame do líquido da vasculatura para o te-

cido circundante causando edema, e o extravasamento de células inflamatórias dos vasos sanguíneos para o sítio de dano de tecido.

Usando Evans Blue como o agente de traço, ele demonstrou que apesar da redução geral do inchaço o tratamento com IL-18BP não reduziu o derrame vascular (Figura 4).

Exemplo 5: Tratamento com IL-18BP reduz a infiltração inflamatória e produção de IFNy da orelha provocada com DNFB

Métodos

CHS foi induzida em camundongos C57BL/6 conforme descrito.

Os animais foram tratados com IL-18BP ou veiculo nos dias 4 a 6. O trata

mento com IL-18BP reduziu o inchaço para 58% do controle veículo no dia

7. Os camundongos foram sacrificados no dia 7, as orelhas provocadas coletadas, agrupadas por grupo (n = 8) e digeridas com enzima para se obter suspensões de célula únicas. As células eram caracterizadas por análise FACS subsequente aceitando as células vivas CD45 positivas. O número de 25 células αβΤ, células NK neutrófilos e monócitos/macrófagos encontradas nas preparações da orelha é expresso como porcentagem de células totais analisadas. A redução desses tipos de célula após tratamento com IL-18BP relativo ao controle de veículo foi também calculada.

Para medição da produção de IFNy, as células obtidas das ore30 lhas provocadas com DNFB foram novamente estimuladas a 2 x 10⁵ por cavidade com anticorpo anti-CD3 ligado à placa. Nenhuma IL-18BP a mais foi adicionada durante o período de cultura de 24 horas subseqüente. A produ-

ção de IFNy foi medida em triplicata através de ELISA.

Preparações de célula de orelhas provocadas com DNFB foram estimuladas com 50 ng/ml de PMA* e 500 ng/ml de lonomicina por 4 horas. Secreção de citocina foi bloqueada através da adição de 2 pg/ml de brefeldin 5 A durante as 2 últimas horas de incubação. As células foram então submetidas a tingimento imunofluorescente multicolorido para IFNy intracelular e antígenos de superfície. O IFNy foi produzido por células CD8 T e a um grau menor pelas células CD4 T. Nenhum IFNy foi detectado em células NK e células γδΤ. (n.d., não-detectado; 13-Acetato de 12-Miristato de Forbol*)

Preparação de suspensão de célula única

Digestão enzimática de orelhas de camundongo para se obter suspensão de célula única foi baseada em protocolos de Schuler, G. e

Steinman, R.M. (1985) e Stingl e outros (1983).

1. cortar as orelhas, agrupar 5 orelhas por preparação

2. enxaguar com etanol 70%

3. despedaçar com a ajuda de fórceps

4. pôr o lado da derme para baixo em 7,5 ml de HBSS¹ a 37° C

5. adicionar 5 ml de Tripsina² 2,5% (10x) para se obter uma concentração final de 1%

6. incubar 35 minutos a 37° C

7. transferir as metades da orelha com o lado da derme para baixo para uma peneira de náilon (coador de célula) posta em 10 ml de HBSS/ FCS 80% em gelo e suavemente apanhar com a rede para expulsar as células da matriz extracelular

8. remover as peneiras com dobras grandes

9. lavar 2x com HBSS frio/FCS 10%

10. contar as células

Análise FACS

1. ressuspender as células em tampão de tingimento FACS³, todas as etapas subseqüentes em gelo ¹ Solução salina Balanceadas de Hanks sem Ca²+ e Mg²+ (GIBCO N° 14170.070) ² Tripsina 2,5%/EDTA (10x) (GIBCO No. 35400-027) ³ Albumina de Soro Bovino 1% em Solução Salina Tamponada de Fosfato

2. usar 10⁶ células por tingimento

3. adicionar 1 pg de Bloqueador-FC, 10 min

4. adicionar anticorpo anti-CD45 em combinação com anticorpos direcionados contra marcadores de interesse, 1 pg cada, 30 min

5. lavar 2x

6. adquirir 0,5 χ 10⁶ casos totais através de FACS

7. analisar marcadores específicos após reter as células vivas CD45+

Resultados

Para examinar o infiltrado inflamatório no lado que foi provocado, suspensões de célula únicas preparadas de orelhas puras e provocadas foram analisadas através de FACS, retendo as células vivas CD45+ (Figura 5). As células CD45+ presentes na orelha pura foram mostradas ser principalmente células γδΤ e células dendríticas da pele. O infiltrado inflamatório 24 15 horas após provocação era composto de células CD8 e CD4, neutrófilos, monócitos de células NK, aumentando o número total de células CD45+ na orelha em cerca de duas vezes. Correspondendo à redução no inchaço, tratamento com IL-18BP reduziu o número total de leucócitos que infiltraram no sítio de provocação. Isso afetou todos os tipos de célula diferentes do infiltrado inflamatório. A redução perfazia entre 20% e 40% dependendo do

tipo de célula.

Caracterização adicional da qualidade do infiltrado obtido das orelhas de camundongos tratados com IL-18BP revelou uma produção de IFNy prejudicada quando da reestimulação do anti-CD3 (Figura 6). Análise 25 FACS mostrou que o IFNy era principalmente produzido por células CD8 e em uma quantidade menor pelas células CD4 T. Interessantemente, células NK e células γδΤ não contribuíam para a produção de IFNy (Figura 7). Exemplo 6: IL-18BP não prejudica o recrutamento de células Lanqerhans

Método:

Os camundongos foram pintados com o FITC de hapteno (50 pl de uma solução de 4 mg/ml) ou a acetona/dibutilftalato veículo (1:1) no flanco direito e no esquerdo, respectivamente. Linfonodos inguinais foram cole

tados 24 horas após a pintura. Células Langerhans conjugadas com hapteno puderam ser detectadas através de FACS como células FITC+, CD11c+ no linfonodo drenando o flanco pintado com FITC, mas não no linfonodo contralateral drenando o flanco pintado com veículo apenas (n = 5 linfonodos de drenagem por grupo)

Resultados:

A migração de célula Langerhans (LC) carregando antígeno para o linfonodo de drenagem é dependente das citocinas pró-inflamatórias IL-1 β e TNF-α e reguladas por caspase-1 (Antonopoulos e outros, 2001; Kimber e

outros, 1992). Desse modo, IL-18 estava envolvida para contribuir com o tráfego de LC (Cumberbatch e outros, 2001). Desse modo, tratamento com

IL-18BP pode prejudicar o recrutamento de LC e desse modo reduz a resposta imune a DNFB durante a fase de provocação. Para testar esta hipótese, os camundongos foram pintados com o FITC de hapteno ou o veículo no 15 flanco direito e no esquerdo, respectivamente. Linfonodos inguinais de drenagem da pele foram coletados 24 horas após a pintura e o número de células FITC+ por linfonodo avaliado. O tratamento dos animais com IL-18BP horas e 1 hora antes da pintura não mudou o número de LC carregando hapteno no linfonodo de drenagem 24 horas após a pintura (Figura 8). Des20 se modo, não há nenhuma contribuição maior de IL-18 para tráfego de LC

neste modelo.

Exemplo 7: IL-18BP reduz a extensão de hipersensibilidade do tipo tardia em um outro modelo de DHT de murino

Métodos

Hipersensibilidade do tipo tardia

Os camundongos são sensibilizados através de injeção intravenosa de 10⁶ esplenócitos de BALB/c e provocados no dia 5 com 13 x 10⁶esplenócitos de BALB/c (50 pl de PBS) nas patas direitas. As patas esquerdas de controle receberam 50 μΙ de PBS. O inchaço na pata direita é calcu30 lado em dias diferentes subtraindo o valor de pré-provocação e qualquer inchaço medido nas patas esquerdas do valor de pós-provocação.

Para experimentos de transferência adotados, as suspensões de

célula de linfonodos de BALB/c sensibilizados com esplenócito ou animais de controle não-tratados são desprovidas de células B220+ e CD8+ através de incubação com B220-FIT e CD8-FITC de rato anticamundongo, seguido por separação em colunas MACS com microcontas anti-FITC paramagnéti5 cas (Miltenyi Biotech, Auburn, Califórnia, USA). Preparações enriquecidas com célula T CD4+ eluída são injetadas na veia do rabo dos camundongos recipientes (2 x 10⁷ células/camundongo). Após 16 horas, os camundongos são provocados injetando 13 x 10⁶ esplenócitos de BALB/c (sem células sangüíneas vermelhas) nas patas direitas, e inchaço é monitorado nos dias 10 que seguem.

Resultado

Hipersensibilidade do tipo tardia (DHT) é elicitada por células T CD4+ com efeitos de supra-regulagem aparentes de células T CD8+ (Grabbe e outros, 1998). O comportamento de células T CD4+ de camundongos 15 tratados com IL-18BP é estudado em um modelo de DTH. Animais C57BL/6 são sensibilizados através de injeção intravenosa de 10⁶ esplenócitos de BALB/c alogênicos. Cinco dias depois, 13 x 10⁶ esplenócitos de BALB/c são injetados nas patas direitas, junto com 10 mg/kg de IL-18BP humana recombinante i.p. ou veículo. Inflamação local é medida através da determinação 20 do inchaço da pata em 24 horas.

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Claims

1. Uso da proteína de ligação a IL-18 (IL-18BP), caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratamento e/ou prevenção de um distúrbio de hipersensibilidade do tipo IV.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o distúrbio de hipersensibilidade é hipersensibilidade do tipo tardia.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o distúrbio de hipersensibilidade é hipersensibilidade de contato.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende ainda um interferon, para uso simultâneo, sequencial ou separado.

5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o interferon é interferon-β.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende ainda um inibidor de Fator de Necrose de Tumor (TNF) para uso simultâneo, sequencial ou separado.

7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o inibidor de TNF é TBP I e/ou TBP II.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende ainda um agente anti-inflamatório, para uso simultâneo, sequencial ou separado.

9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o agente anti-inflamatório é um inibidor de COX.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o medicamento compreende ainda um agente antialérgico para uso simultâneo, sequencial ou separado.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o inibidor de IL-18 é usado em uma quantidade de cerca de 0,001 a 1000 mg/kg de peso do corpo, ou cerca de 0,01 a 100 mg/kg de peso do corpo ou cerca de 0,1 a 10 mg/kg de peso do corpo ou cerca de 5 mg/kg de peso do corpo.