CN1546682A - 酶解与膜滤集成连续制取酪蛋白生物活性多肽的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酶解与膜滤集成连续制取酪蛋白生物活性多肽的工艺。该工艺以酪蛋白为原料，在由酶解罐与不同截留分子量的超滤、纳滤膜组合而成的多级酶膜反应器中，经至少一种蛋白酶作用，制得具有多种功能的生物活性多肽。本发明集酶促水解反应、催化剂回收再用、产物分离纯化与浓缩脱盐、苦味肽脱除五步工序于一体，相比现有工艺技术，使酶解反应转化率由50％增至80％、活性多肽单位时间产量由30g/h增至50g/h、蛋白质收率由50％提高至70％、蛋白酶利用率提高1.5倍，工艺成本降低1倍。所制得的活性多肽产品组成趋向均一，且安全无毒，在食品、化妆品、保健品、医药等领域应用前景极其广阔。
Description
技术领域
本发明涉及一种将酶解反应与膜分离技术集成连续制取酪蛋白源多肽的新工艺，属于以酪蛋白为底物酶促水解制取活性多肽的技术。
背景技术
酪蛋白是乳中含量最高的蛋白质，为几种含磷蛋白的复合体，主要成分为αs1、αs2、β、κ四种多肽链。酪蛋白经单酶或复合酶系水解作用，再经分离纯化可制得近10类百余种生物活性多肽。复杂的酶解产物、多样性的序列结构使该类物质具有免疫调节、自由基清除、矿物质载体、抗癌抑菌、溶栓降压、安神麻醉等多种生理功能(表1)，是极具开发价值的一类生物活性物质。
表1酪蛋白源生物活性多肽示例
| 氨基酸序列 | 名称 | 生理功能 |
| ThrThr-Met-Pro-Leu-Trp | αs1-Casokinin-6αs1-酪激肽-6 | 免疫调节 |
| Tyr-Gln-Gln-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Arg | β-Casokinin-6β-酪激肽-10 | 免疫调节 |
| Phe-Phe-Val-Ala-Pro | αs1-ACEI-5血管紧张素转换酶抑制剂 | 降血压 |
| Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-Gln-Arg | β-ACEI-7血管紧张素转换酶抑制剂 | 降血压 |
| Met-Ala-Ile-Pro-Pro-Lys-Lys-Asn-Gln-Asp-Lys | κ-Casoplatelin-11酪蛋白血小板因子 | 溶栓、抗凝血 |
| Asp-Ile-Gly-SerP-Glu-SerP-Thr-Glu-Asp-Gln-Ala-Met-Glu-Asp-Ile-Lys-Gln-Met-Glu-Ala-Glu-SerP-Ile-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ile-Val-Pro-Asn-SerP-Val-Glu-Gln-Lys | αsl-CPP-37αs1-酪蛋白磷酸肽-37 | 矿物质载体 |
| Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg | β-CPP-25β-酪蛋白磷酸肽-25 | 矿物质载体 |
| Arg-Pro-Lys-His-Pro-Ile-Lys-His-Gln-Gly-Leu-Pro-Gln-Glu-Val-Leu-Asn-Glu-Asn-Leu-Leu-Arg-Phe | αs1-Isracidin-23酪蛋白拟杀细胞粒体 | 抗菌 |
| Lys-Lys-Ile-Ser-Gln-Arg-Tyr-Gln-Lys-Phe-Ala-Leu-Pro-Gln-Tyr-Leu-Lys-Thr-Val-Tyr-Gln-His-Gln-Lys-Ala-Met-Lys-Pro-Trp-Ile-Gln-Pro-Lys-Thr-Lys-Val-Ile-Pro-Tyr | αs2-Casocidin-39酪蛋白杀细胞粒体 | 抗菌 |
| Tyr-Pro-Ple-Pro-Gly-Pro-Ile | β-Casomorphin-7β-酪啡肽-7 | 阿片活性安神麻醉 |
| Ser-Thr-Tyr-Pro-Ser-Tyr | κ-Casoxin-5κ-酪新素 | 阿片活性安神麻醉 |
目前，酪蛋白生物活性多肽的生产工艺广泛采用间歇酶解，即在普通水解罐中进行分批操作，当酶解反应结束后，通过调节溶液pH值使蛋白酶变性失活，并使未水解的酪蛋白沉淀后离心分离，再经溶剂选择性沉淀或离子交换树脂处理等多步分离纯化步骤，方能制得目标多肽产品，工艺过程中存在如下问题：(1)由于酶解产物无法从反应体系中及时分离，容易造成产物抑制现象，酶解反应转化率及目标多肽产率均较低；(2)不同反应批次之间水解条件有一定差异，产品质量不稳定；(3)从反应体系中分离产物以及从反应混合物中将酶回收再用均非常困难，故酶耗量大，工艺成本高，不能完全满足商品化的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种将酶解反应与膜滤技术集成连续制取酪蛋白活性多肽的新工艺。采用该工艺制得的生物活性多肽产率高，成本低，并具有多种生理功效，且安全无毒，可作为保健品食用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案加以实现：在由酶解罐与不同截留分子量的超滤、纳滤膜组合而成的多级酶膜反应器中，实施酶解与膜滤集成连续制取酪蛋白生物活性多肽的工艺。所述酶解反应是以全酪蛋白、αs1、αs2、β、κ-酪蛋白单体、酪蛋白酸盐中的至少一种为底物，在蛋白酶适宜反应温度25～50℃与pH值4～10的条件下，经胰酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶中的一种或复配催化作用而实现酶促水解反应，上述工艺中：初始底物质量浓度为2～4％，初始酶与底物质量浓度之比为1∶20～1∶40；通过滴加NaOH溶液维持体系pH恒定；通过水浴加热维持体系温度恒定。其特征在于：在酶解罐中进行水解反应的同时，连续由罐底将酶解液引入平均截留分子量为6000～10000的超滤器中，超滤膜截留液回流至酶解罐继续循环降解，超滤膜渗透液被连续引入平均截留分子量为1000～2000的纳滤器中，纳滤膜渗透液排弃，收集纳滤膜截留浓缩液，在进口温度150～200℃，出口温度70～85℃、进料速度1.0～1.5L/h、操作压力0.1～1MPa的条件下，经喷雾干燥制得分子量为1000～10000的多功能酪蛋白源生物活性多肽，包括：酪蛋白磷酸肽、降血压肽、免疫活性肽、血管紧张素转化酶抑制剂、阿片活性肽、溶栓肽、抑菌肽、自由基清除肽。
上述膜分离单元包括至少一级用于截留酪蛋白底物和蛋白酶的超滤膜和一级用于多肽溶液浓缩、脱盐和除苦味肽的纳滤膜：超滤膜操作压力0.02～0.05MPa、循环流量20～40L/h，反应物平均停留时间3～4h；纳滤膜操作压力0.1～0.5MPa。
上述工艺中需不断向酶解罐中补加底物溶液和蛋白酶以维持体系恒定：向酶解罐连续流加质量浓度为1～2％的底物溶液，流加速度与超滤膜渗透通量一致；每6～8小时向酶解罐分批补加蛋白酶，使罐体内蛋白酶有效质量浓度保持0.1～0.15％。
本发明集酶促水解反应、催化剂回收再用、产物分离纯化与浓缩脱盐、苦味肽脱除五步工序于一体，相比现有技术具有如下优点：(1)采用膜技术及时将水解产物从反应单元分离，移动化学平衡，消除产物抑制，使活性多肽单位时间产量由30g/h增至50g/h；(2)以不同截留分子量的超滤和纳滤膜组合处理酶解液，可实现对酶解产物分子量分布的有效调控，使目标多肽分子量分布集中、成分趋向均一、品质稳定；(3)以超滤膜截留反应物系中的高分子物质，可使酪蛋白底物有效浓度升高，酶解反应转化率由50％增至80％，并可实现蛋白酶的重复循环使用，酶利用率提高1.5倍，原料成本降低1倍；(4)以纳滤膜处理超滤膜渗透液，可一步实现高效脱盐(脱盐率达65～95％)、透水浓缩(脱水率达50～70％)和去除引起苦味的小分子杂肽，使产品风味更好、功效更高；(5)在反应物流中富集浓缩产物，使蛋白质总收率由50％提高至70％，同时简化了下游分离纯化步骤，工艺成本明显降低；(6)强化反应过程，大幅度延长有效反应时间，使酶解工艺适于大规模连续化生产的要求；(7)常压常温操作，温和易控，节约能耗，且无有毒有害试剂污染环境，属绿色工艺。
本发明所制得的具有多种生物功能的酪蛋白活性多肽，安全无毒，无副作用，易于被人体吸收，理化与卫生学检测达到国家保健(功能)食品通用标准，可广泛用于食品、保健品、化妆品等多个领域，经进一步纯化还可开发为活性多肽类药物。
附图说明
附图1为本发明提出的酶解与膜滤集成连续制取酪蛋白活性多肽的工艺流程框图。
具体实施方式
下面举例对本发明做进一步详细描述。
实施例1
称取酪蛋白800g，加入20L水置于储液罐中，微热并充分搅拌，缓慢加入1g/mL的NaOH溶液16mL，配成pH＝8.5、浓度为4％的酪蛋白底物溶液，泵入水解罐中，调节搅拌转速为80rmp，启动恒温水浴，待温度恒定于45℃后，开启超滤循环装置，超滤膜平均截留分子量为10000，使底物溶液以30L/h的循环流量，常压稳定循环15min，向水解罐中加入20克碱性蛋白酶，开始连续酶解反应并记时，10min后调节超滤膜操作压力达0.05MPa，酪蛋白、蛋白酶及高分子多肽等大分子物质被超滤膜截留而返回反应单元继续循环降解，而小于超滤膜平均截留分子量的多肽通过膜件形成渗透液，反应过程中通过滴加4mol/L的NaOH溶液维持体系pH＝8.5恒定，通过水浴加热维持体系温度45℃恒定，根据所测超滤膜渗透通量以相同数值连续流加1.5％的酪蛋白底物溶液维持反应体积与有效底物浓度恒定，每隔6小时补加5g碱性蛋白酶维持体系酶活力恒定，当超滤膜渗透侧缓冲罐收集到5L渗出液时，开启纳滤循环装置以同时完成多肽溶液脱水、脱盐和除苦味肽，纳滤膜平均截留分子量为1000，操作压力0.2MPa，当浓缩脱水达50％时结束纳滤，此时脱盐率达70％，收集纳滤膜截留液，在进口温度180℃，出口温度75℃、进料速度1.5L/h、操作压力0.5MPa的条件下，经喷雾干燥制得分子量为1000～10000的多功能酪蛋白活性多肽产品，经计算：蛋白质收率＞70％，活性多肽单位时间生成速率为50g/h。
实施例2
采用平均截留分子量为6000的超滤膜和平均截留分子量为2000的纳滤膜与20L酶解罐组成连续反应分离系统，向20L质量浓度为2％的酪蛋白底物溶液中加入20g胰酶，反应过程中维持体系温度40℃、pH＝8.0恒定，连续流加1％的酪蛋白底物溶液维持反应体积与有效底物浓度恒定，每隔4小时补加4g胰酶维持体系酶活力恒定，其他酶解反应和膜分离操作步骤与工艺参数同实施例1，制得以酪蛋白磷酸肽为主的活性多肽产品，产品经HPSEC检测分析，分子量主要集中于3000～5000对应的谱峰中，氮磷比值＜10。
Claims (3)
1.一种酶解与膜滤集成连续制取酪蛋白生物活性多肽的工艺，该工艺在由酶解罐与不同截留分子量的超滤、纳滤膜组合而成的多级酶膜反应器中具体实施；所述酶解反应是以全酪蛋白、αs1、αs2、β、κ-酪蛋白单体、酪蛋白酸盐中的至少一种为底物，在蛋白酶适宜反应温度25～50℃与pH值4～10的条件下，经胰酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、羧肽酶中的一种或复配催化作用而实现酶促水解反应，上述工艺中：初始底物质量浓度为2～4％，初始酶与底物质量浓度之比为1∶20～1∶40，通过滴加NaOH溶液维持体系pH恒定，通过水浴加热维持体系温度恒定，其特征在于：在酶解罐中进行水解反应的同时，连续由罐底将酶解液引入平均截留分子量为6000～10000的超滤器中，超滤膜截留液回流至酶解罐继续循环降解，超滤膜渗透液被连续引入平均截留分子量为1000～2000的纳滤器中，纳滤膜渗透液排弃，收集纳滤膜截留浓缩液，在进口温度150～200℃，出口温度70～85℃、进料速度1.0～1.5L/h、操作压力0.1～1MPa的条件下，经喷雾干燥制得分子量为1000～10000的多功能酪蛋白源生物活性多肽，包括：酪蛋白磷酸肽、降血压肽、免疫活性肽、血管紧张素转化酶抑制剂、阿片活性肽、溶栓肽、抑菌肽、自由基清除肽。
2.如权利要求1所述的酶解与膜滤集成连续制取酪蛋白生物活性多肽的工艺，其特征在于：膜分离单元包括至少一级用于截留酪蛋白底物和蛋白酶的超滤膜和一级用于多肽溶液浓缩、脱盐和除苦味肽的纳滤膜，超滤膜操作压力0.02～0.05M Pa、循环流量20～40L/h，反应物平均停留时间3～4h；纳滤膜操作压力0.1～0.5M Pa。
3.如权利要求1所述的酶解与膜滤集成连续制取酪蛋白生物活性多肽的工艺，其特征在于：反应过程中需不断向酶解罐中补加底物溶液和蛋白酶以维持体系恒定，向酶解罐连续流加质量浓度为1～2％的底物溶液，流加速度与超滤膜渗透通量一致；每6～8小时向酶解罐分批补加蛋白酶，使罐体内蛋白酶有效质量浓度保持0.1～0.15％。
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