CN111297786A

CN111297786A - 从羊胚胎中规模化提取活性小分子的方法

Info

Publication number: CN111297786A
Application number: CN202010201668.8A
Authority: CN
Inventors: 周旻昊; 王挺; 李秀芝
Original assignee: YANGZHOU YANGDA LIANHUAN PHARMACEUTICAL GENE ENGINEERING CO LTD
Current assignee: YANGZHOU YANGDA LIANHUAN PHARMACEUTICAL GENE ENGINEERING CO LTD
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2020-03-20
Publication date: 2020-06-19

Abstract

本发明公开了一种从羊胚胎中规模化提取活性小分子的方法，包括下列步骤：1)原料预处理；2)细胞破碎；3)酶解离心分离；4)取沉淀物A；5)截留不同分子量的羊胚胎素原液；6)除菌。本发明的提取方法实现了工业化提取羊胚胎素，同时节省了人工成本，提高了工作效率，并且可以按照活性物质分子量段分级提取相应的羊胎素。

Description

从羊胚胎中规模化提取活性小分子的方法

技术领域

本发明涉及生物制品领域，特别涉及一种从羊胚胎中规模化提取活性小分子的方法。

背景技术

羊胚胎素是从3-6个月小羊胚胎中提取的活性成分，富含小分子活性肽、多种氨基酸、透明质酸刺激因子、超氧化物歧化酶等多种生物活性成份。这些以小分子为主的活性成分，应用在护肤领域，有易吸收、直达肌肤底层等特点，促进肌肤活力动能，提升肌肤自我修护能力，改善多种肌肤问题。人们对羊胚胎素的提取研究已有多年的历史，传统方法是采用实验室提取方法，原料经过粉碎、冻融、乳化、离心、超滤等得到羊胚胎素原液，无法进行工业化生产，实验仪器处理量小，一般一批处理大概12-30kg，不能工业化生产，提取时间也比较长，主要问题在平板超滤膜超滤效率比较低，且目前的实验仪器羊原胚胎原液分级无法实现，不能发挥各分子量段活性物质相应的作用。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了弥补现有研究技术的不足，提供了一种可工业化生产，同时节省了人工成本，提高了工作效率，并且能从羊胚胎中规模化提取活性小分子的方法。

技术方案：本发明公开了一种从羊胚胎中规模化提取活性小分子的方法，包括下列步骤：

1)原料预处理：取3-5个月龄小羊胚胎，去除肠胃，洗净，剪或切碎，通过绞肉机加工成细小肉末，加水搅拌制成匀浆；

本步骤中，绞肉机，入料口大，进料顺畅，生产效率高，出料口绞龙螺距设计杜绝出油现象，选择合适的铰刀，对胚胎推力的控制，既能保证对肉粒大小的控制，又能保证对胚胎组织结构破坏少，控制粒径大概20-50目；

2)细胞破碎：将步骤1)中得到的匀浆在-25±3℃条件下冷冻24小时，在20-25℃的循环水中融化，反复冻融3-6次，使细胞破碎，得到细胞冻融液；

3)酶解离心分离：将步骤2)中得到的细胞冻融液调节pH至3.5-4.5，水解搅拌2-4hr,调节pH至2.0；加入胃蛋白酶，升温至37±2℃保温3小时，调节pH至6.2-7.2，加热至90±2℃，保温10分钟,得到混合液；混合液在卧式离心机上离心，去除沉淀物A，取上层液体B；离心过程中，利用高速旋转的转鼓产生离心力把悬浮液中的固体颗粒截留在转鼓内并在力的作用下向机外自动卸出；同时在离心力的作用下，悬浮液中的液体通过过滤介质、转鼓小孔被甩出，从而达到液固分离过滤的目的，卧式离心机具有同类产品无可比拟的价格优势，而且该机设计技术先进、性能稳定、结构简单、维修方便、占地面积小、能自动连续工作、处理量大、原料利用率高的优点；

4)取沉淀物A：向沉淀物A中加入适量水，搅拌均匀，调节pH至8.0，50℃的水浴下加入胰蛋白酶，重量比为酶：底物＝1:150，保温搅拌5hr，调节pH至6.2-7.2，加热至90±2℃，保温10分钟，得到混合液；将混合液在卧式离心机上离心，去除沉淀物C，取上层液体D,本步骤中的胰蛋白酶，因不同酶剪切点不同，可以把大分子蛋白质再一次酶解，提高活性小分子的提取率；

5)截留不同分子量的羊胚胎素原液：合并步骤3)中得到的上层液体B和步骤4)中得到的上层液体D,进入过滤分离设备进行分级，所述的过滤分离设备采用不同孔径聚砜材质中空纤维膜串联，用于截留不同分子量的活性物质，可以同时收集不同分子量的羊胚胎素原液；

6)除菌：将不同分子量的羊胚胎原液过微孔滤膜除菌，滤膜孔径0.22-0.45μm，分级储存。

作为优选，所述的步骤3)中，胃蛋白酶和细胞冻融液的重量比为1：90-120。

作为优选，所述的胃蛋白酶活性为7000-10000U/g，终浓度为0.3-0.5％。

作为优选，所述的步骤5)中，过滤分离设备由若干过滤单元依次收尾串联组成；所述的过滤单元由端盖、壳体相连，所述的壳体中设有聚砜材质制成的中空纤维膜柱。

作为优选，所述的过滤分离设备还设有原液管道、过滤液出口管道和回液管，所述的原液管道连接于第一个过滤单元的入口；所述的过滤液出口管道连接于最后一个过滤单元的出口；所述的每个过滤单元均共同连接于回液管。

本发明还公开了上述规模化提取方法所制得的羊胚胎素。

有益效果：本发明的提取方法实现了工业化提取羊胚胎中的活性小分子，同时节省了人工成本，提高了工作效率，并且可以按照活性物质分子量段分级提取相应的羊胎素。

附图说明：

图1为过滤分离设备的结构示意图；

附图标记：1-端盖，2-壳体，3-中空纤维膜柱，4-原液管道，5-过滤液出口管道，6-回液管,f1-第一阀门，f2-第二阀门，f3-第三阀门，f4-第四阀门，f5-第五阀门。

具体实施方式：

本发明中的立式低速大容量离心机为市售，离心容量6×1kg，每次离心要30分钟，而卧式离心机能自动连续工作、处理量大、原料利用率高，可连续处理，可以达30kg-100kg/h，出料的澄清度比立式离心机高。

实施例1：

一种从羊胚胎中规模化提取活性小分子的方法，包括下列步骤：

2)细胞破碎：将步骤1)中得到的匀浆在-25℃条件下冷冻24小时，在20℃的循环水中融化，反复冻融3次，使细胞破碎，得到细胞冻融液；

3)酶解离心分离：将步骤2)中得到的细胞冻融液调节pH至3.5，水解搅拌2hr,调节pH至2.0；加入胃蛋白酶，胃蛋白酶活性为7000-10000U/g，终浓度为0.3-0.5％；胃蛋白酶和细胞冻融液的重量比为1：90-120,升温至32℃保温3小时，调节pH至6.2，加热至90℃，保温10分钟,得到混合液；混合液在卧式离心机上离心，去除沉淀物A，取上层液体B；

4)取沉淀物A：向沉淀物A中加入适量水，搅拌均匀，调节pH至8.0，50℃的水浴下加入胰蛋白酶，重量比为酶：底物＝1:150，保温搅拌5hr，调节pH至6.2，加热至90℃，保温10分钟，得到混合液；将混合液在卧式离心机上离心，去除沉淀物C，取上层液体D；

6)除菌：将不同分子量的羊胚胎原液过微孔滤膜除菌，滤膜孔径0.22μm，分级储存。

本发明中,步骤3)与步骤4)中的胃蛋白酶与胰蛋白酶的加入次序不能省略，也不能颠倒，在步骤3)中胃蛋白酶的剪切主要部位是芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所组成的肽键，且胃蛋白酶的最佳水解温度是在37±2℃，而胰蛋白酶为肽链内切酶，专一作用有碱性氨基酸精氨酸及赖氨酸羧基所组成的肽键，对精氨酸和赖氨酸肽链具有选择性水解作用。步骤3)与步骤4)不能颠倒，因为不同酶的剪切部位不一样，胃蛋白酶水解的产物活性更高，次序颠倒会影响活性物质活性，而胰蛋白酶水解是为了进一步提高提取率。

具体来说，如图1，本发明中的过滤分离设备由若干过滤单元依次收尾串联组成，在本发明中，具体为三个过滤单元；每个过滤单元由端盖1、壳体2相连，壳体2中设有聚砜材质制成的中空纤维膜柱3，其有效膜面积最那大，过滤分离效率高，容易清洗，结构简单，操作方便，在生产过程不产生二次污染，检漏修补方便，截留率稳定，使用寿命长。原液管道4连接于第一个过滤单元的入口；过滤液出口管道5连接于最后一个过滤单元的出口；每个过滤单元均共同连接于回液管6，在本发明中，每个纤维膜柱和回流管之间均设有三通阀，相邻的两个纤维膜柱之间也设有三通阀。

工作原理：合并步骤3)中得到的上层液体B和步骤4)中得到的上层液体D,进入过滤分离设备之后，先进入第一根中空纤维膜柱，10000以下道尔顿分子量的活性多肽从第四阀门f4流出，进入第二根中空纤维膜柱，6000-10000道尔顿分子量的活性多肽从回流口的第二阀门f2流出，6000以下道尔顿的活性多肽从第五阀门f5流出进入第三根中空纤维膜柱，3000-6000道尔顿的活性多肽从第三根纤维膜柱的回流口的第三阀门f3流出，3000以下道尔顿的活性多肽从过滤液出口管道5流出。

需要排料收集相应的分子量的活性多肽只需要将相应进料管的三通阀扭转即可。

因每根纤维膜柱和回流管之间均设有三通阀，因此，含有过滤不了的分子量的液体的还是可以通过回流管回流。

实施例2：

2)细胞破碎：将步骤1)中得到的匀浆在-22℃条件下冷冻24小时，在25℃的循环水中融化，反复冻融6次，使细胞破碎，得到细胞冻融液；

3)酶解离心分离：将步骤2)中得到的细胞冻融液调节pH至4.5，水解搅拌4hr,调节pH至2.0；加入胃蛋白酶，胃蛋白酶和细胞冻融液的重量比为1：120，升温至37±2℃保温3小时，调节pH至7.2，加热至92℃，保温10分钟,得到混合液；混合液在卧式离心机上离心，去除沉淀物A，取上层液体B；

4)取沉淀物A：向沉淀物A中加入适量水，搅拌均匀，调节pH至8.0，50℃的水浴下加入胰蛋白酶，重量比为酶：底物＝1:150，保温搅拌5hr，调节pH至7.2，加热至92℃，保温10分钟，得到混合液；将混合液在卧式离心机上离心，去除沉淀物C，取上层液体D；

实施例3：

2)细胞破碎：将步骤1)中得到的匀浆在-23℃条件下冷冻24小时，在24℃的循环水中融化，反复冻融4次，使细胞破碎，得到细胞冻融液；

3)酶解离心分离：将步骤2)中得到的细胞冻融液调节pH至4，水解搅拌3hr,调节pH至2.0；加入胃蛋白酶，胃蛋白酶活性为7000-10000U/g，终浓度为0.3-0.5％；

升温至36℃保温3小时，调节pH至7，加热至91℃，保温10分钟,得到混合液；混合液在卧式离心机上离心，去除沉淀物A，取上层液体B；

4)取沉淀物A：向沉淀物A中加入适量水，搅拌均匀，调节pH至8.0，50℃的水浴下加入胰蛋白酶，重量比为酶：底物＝1:150，保温搅拌5hr，调节pH至7，加热至91℃，保温10分钟，得到混合液；将混合液在卧式离心机上离心，去除沉淀物C，取上层液体D；

5)截留不同分子量的羊胚胎素原液：合并步骤3)中得到的上层液体B和步骤4)中得到的上层液体D,进入过滤分离设备进行分级，过滤分离设备采用不同孔径聚砜材质中空纤维膜串联，同实施例1中的设备；用于截留不同分子量的活性物质，可以同时收集不同分子量的羊胚胎素原液；

实施例1-3均采用三级中空纤维膜柱，把分子量3000道尔顿以下活性多肽应用在化妆水及肌底液中，能够快速渗透肌肤，直接被皮肤吸收，抑制和缓解细胞白介素的生成，抑制糖基化反应；而3000-6000道尔顿的活性多肽可以减少皮肤自由基，促进肌肤透明质酸的合成；6000-10000道尔顿的活性多肽主要是在增加皮肤弹性，促进胶原蛋白的增加，经过更详尽的分类研究，能够让活性多肽在护肤领域“对症下药”。

本发明中细胞冻融液调节pH至3.5-4.5，生物体内的蛋白质及酶几乎都是酸性蛋白质，pH在3.5-4.5范围内水解更充分。

按照实施例1为例，经过两次酶解提高羊胚胎活性物质的提取率，和实验室方法相比，对比数据如下：

通过数据对比，可以明显看出，原料利用率提高了近10％，而处理相同原料所需离心机超滤时间节省近12倍，大大提高了生产效率，节省了人工成本。

和以往的平板超滤膜相比，本发明采用多根超滤膜进行串联连接，提高工作效率，串联连接，可以连续处理，同时根据实际应用可以采用不同分子量的滤膜，得到分级的羊胚胎素原液，分子量在3000-6000道尔顿可应用在护肤品中，分子量6000道尔顿以上可应用到食品中。

Claims

1.一种从羊胚胎中规模化提取活性小分子的方法，其特征在于：包括下列步骤：

3)酶解离心分离：将步骤2)中得到的细胞冻融液调节pH至3.5-4.5，水解搅拌2-4hr,调节pH至2.0；加入胃蛋白酶，升温至37±2℃保温3小时，调节pH至6.2-7.2，加热至90±2℃，保温10分钟,得到混合液；混合液在卧式离心机上离心，去除沉淀物A，取上层液体B；

4)取沉淀物A：向沉淀物A中加入适量水，搅拌均匀，调节pH至8.0，50℃的水浴下加入胰蛋白酶，重量比为酶：底物＝1:150，保温搅拌5hr，调节pH至6.2-7.2，加热至90±2℃，保温10分钟，得到混合液；将混合液在卧式离心机上离心，去除沉淀物C，取上层液体D；

2.如权利要求1中所述的从羊胚胎中规模化提取活性小分子的方法，其特征在于：所述的步骤3)中，胃蛋白酶和细胞冻融液的重量比为1：90-120。

3.如权利要求2中所述的羊胚胎素规模化提取方法，其特征在于：所述的胃蛋白酶活性为7000-10000U/g，终浓度为0.3-0.5％。

4.如权利要求1所述的从羊胚胎中规模化提取活性小分子的方法，其特征在于：所述的步骤5)中，过滤分离设备由若干过滤单元依次收尾串联组成；所述的过滤单元由端盖(1)、壳体(2)相连，所述的壳体(2)中设有聚砜材质制成的中空纤维膜柱(3)。

5.如权利要求4所述的从羊胚胎中规模化提取活性小分子的方法，其特征在于：所述的过滤分离设备还设有原液管道(4)、过滤液出口管道(5)和回液管(6)，所述的原液管道(4)连接于第一个过滤单元的入口；所述的过滤液出口管道(5)连接于最后一个过滤单元的出口；所述的每个过滤单元均共同连接于回液管(6)。

6.一种权利要求1-5中任一项所述的规模化提取方法所制得的羊胚胎素。