CN1516739A - 利用hmg片段作为抗炎症试剂 - Google Patents

Abstract

公开了抑制从脊椎动物细胞中释放炎症前细胞因子，抑制患者中炎症细胞因子的级联的释放的组合物和方法。组合物包括脊椎动物HMG A盒子，和特异地结合脊椎动物HMG B盒子的抗体的制剂。该方法包括用足够量的组合物处理细胞或治疗患者抑制炎症前细胞因子的释放，或抑制炎症细胞因子的级联。

Description

利用HMG片段作为抗炎症试剂

相关申请

本申请要求享受2001年5月15日递交的美国临时申请号60/291,034的优先权，该文献通过在此引述而全文合并于本文。

政府资助

本发明全部或部分受国家健康研究所的基金RO1GM57226-02的资助。政府在本发明中有一些权力。

发明背景

炎症经常受炎症前细胞因子诱导，如肿瘤坏死因子(TNF)，白介素(IL)-1α，IL-1β，IL-6，血小板激活因子(PAF)，巨嗜细胞迁移抑制因子(MIF)，和其他化合物。这些炎症前细胞因子是几个不同的细胞类型产生的，最重要的是免疫细胞(例如，单核细胞，巨噬细胞和嗜中性细胞)，和非免疫细胞，如成纤维细胞，成骨细胞，光滑肌细胞，上皮细胞和神经元。这些前炎症细胞因子对炎症细胞因子级联的早期过程中的各种紊乱有作用。

炎症细胞因子级联有助于不利的特征，包括对多种的紊乱的炎症和细胞程序死亡有作用。这些紊乱包括定位的和系统反应特征的紊乱，非限制性地包括参与肠胃道和相关组织的疾病(如阑尾炎，消化性，胃和十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，溃烂，伪膜状，急性和局部缺血性结肠炎，憩室炎，会咽炎，喷门痉挛，胆管炎，胆囊炎，腹腔疾病，肝炎，Crohn疾病，肠炎，和Whipple疾病)；系统的或局部的炎症疾病和病症(如，气喘，过敏，过敏性休克，免疫复合疾病，器官缺血，再灌注损伤，器官坏死，枯草热，脓毒病，败血病，内毒休克，癌血症，高热，嗜酸性肉芽瘤，肉芽肿病，和结节病)；包括泌尿系统和相关组织的疾病(如败血性流产，附睾炎，阴道炎，前列腺炎和尿道炎)；包括呼吸系统和相关组织的疾病(支气管炎，肺气肿，鼻炎，膀胱纤维变性，肺炎，成人呼吸胁迫综合症，超微硅火岩肺炎，alvealitis，细支气管炎，咽炎，胸膜炎，鼻窦炎)；各种病毒感染引起的疾病(如流感，呼吸多核性病毒，HIV，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒和疱疹)，细菌(如弥散性菌血症，登革热)，真菌(如，念珠菌病)和原虫和多细胞寄生虫(如疟疾，丝虫病，阿米巴病，和棘球囊膀胱)；皮肤疾病和皮肤症状(如，烧伤，皮炎，皮肌炎，太阳烧伤，寻麻症，疹块)；包括心肌系统和相关组织的疾病(如vasulitis，血管炎，心内膜炎，动脉炎，动脉粥样化病，血栓性静脉炎，心包炎，先天性心脏衰竭，心肌炎，心肌缺血，动脉外膜炎结节，和风湿热)；中枢和周边神经系统和相关组织的疾病(如Alzheimer疾病，脑膜炎，脑炎，多硬化，脑梗死，脑栓塞，Guillame-Barre综合症，神经炎，神经痛，脊索损伤，瘫痪和葡萄膜炎)；骨，关节，肌肉和结缔组织的疾病(如各种关节炎和关节痛，骨髓炎，筋膜炎，Paget病，痛风，牙周疾病，风湿性关节炎和滑膜炎)；其他自身免疫和炎症紊乱(如血管硬化性肌无力，thryoiditis，系统性狼疮红斑，Goodpasture综合症，Behcets综合症，同种移植反射，移植寄主疾病，I型糖尿病，强直性脊椎炎，Berger疾病，和Retier综合症)；以及各种癌症，肿瘤和增殖紊乱(如Hodgkins疾病)；并且在任何情况下对各种主要疾病的炎症或免疫寄主应答有作用。

早期的炎症前细胞因子(例如，TNF，IL-1等等)介导了炎症，并且诱导了高流动组-1(HMG1)(也称为HMG-1和HMGB1)，血清中积累的蛋白质的后期释放，和介导了早期炎症前细胞因子的延迟的致死和进一步的诱导。

HMG首先鉴定为DNA结构和稳定性关键的命名为高流动组(HMG)的DN结合蛋白质的家族的基础成员。它在近40年以前鉴定为普遍表达的核蛋白质，没有序列特异性地结合双链DNA。

HMG1的结合趋向于使DNA促进核蛋白质复合物的形成和稳定，简化糖皮质激素受体和RAG重组酶的基因转录。HMG1分子具有三个区域：两个DNA结合基序，命名为HMG A和HMGB盒子，和酸性羧基末端。两个HMG盒子是高度保守的80个氨基酸，L型区域。HMG盒子也表达成其他转录因子，包括RNA聚合酶I转录因子，人上游结合因子和淋巴样特异因子。

最近的证据已经表明，HMG可以作为内毒素血症中延迟致死的细胞因子介导物。这一工作证明，细菌内毒素(脂多糖(LPS))激活单核细胞/巨噬细胞释放HMG1作为对激活的应答，导致毒性的血清HMG1水平升高。甚至当在早期细胞因子应答后延迟给药抗体，抗HMG1的抗体还能防止内毒素的致死。和其他炎症前的细胞因子一样，HMG1是潜在的单核细胞激活物。气管内应用HMG1引起急性的肺损伤，抗HMG1抗体防止了内毒素诱导的肺水肿。在有脓毒或出血性休克的重要患者中血清HMG1水平升高，在未生存者中水平明显比生存者更高。

HMG也已表明可以作为RAGE的配体，一个免疫球蛋白超家族的多配体受体。RAGE是在内皮细胞，光滑肌细胞，单核细胞和神经上表达的，配体相互作用通过MAP激酶，P21ras，和NF-kB转导信号。在内毒素血症过程中出现的HMG1的延迟的动力学使它成为潜在的良好的治疗试剂，但关于HMG1发信号和毒性的分子原理知道很少。

所以，鉴定HMG1的炎症前活性是有用的，特别是鉴定应答这一活性的活性区，和其他区域的任何抑制效果。

本发明的概述

本发明是基于这样的发现：(1)HMG A盒子可以作为HMG炎症前作用的竞争性抑制剂，和(2)HMG B盒子具有HMG的主导的炎症前活性。

因此，本发明涉及含有脊椎动物HMG A盒子或其生物活性片段或非天然存在的HMG A盒子或其生物活性片段的多肽。这些例子中的HMG A盒子可以抑制从用HMG处理的脊椎动物细胞释放炎症前细胞因子。HMG A盒子优选地是哺乳动物HMG A盒子，更优选地是哺乳动物HMG1 A盒子，例如人HMG1 A盒子，最优选地，HMG1 A盒子包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：22的序列。在优选的实施方案中，脊椎动物细胞是哺乳动物的巨噬细胞。本发明也包括编码这些多肽的载体。

在其他的实施方案中，本发明涉及如上所述在药物可接受的赋形剂中含有HMG A盒子多肽或其生物活性片段的组合物。在这些实施方案中，该组合物可以抑制特征是炎症细胞因子级联的激活的症状。该组合物可以进一步包括早期的脓毒介导物的激动剂。早期脓毒介导物的激动剂优选地可以是选自包括TNF，IL-1α，IL-1β，MIF和IL-6的组的细胞因子的拮抗物，更优选地是TNF或MIF的抗体或IL-1受体拮抗物。

在这些实施方案中，症状优选地选自下组：包括阑尾炎，消化性，胃和十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，溃烂，伪膜状，急性和局部缺血性结肠炎，憩室炎，会咽炎，喷门痉挛，胆管炎，胆囊炎，腹腔疾病，肝炎，Crohn疾病，肠炎，和Whipple疾病，气喘，过敏，过敏性休克，免疫复合疾病，器官缺血，再灌注损伤，器官坏死，枯草热，脓毒病，败血病，内毒休克，癌血症，高热，嗜酸性肉芽瘤，肉芽肿病，和结节病，支气管炎，肺气肿，鼻炎，膀胱纤维变性，肺炎，成人呼吸胁迫综合症，超微硅火岩肺炎，alvealitis，细支气管炎，咽炎，胸膜炎，鼻窦炎，流感，呼吸多核性病毒感染，疱疹感染，HIV感染，乙型肝炎病毒感染，丙型肝炎病毒感染，弥散性菌血症，登革热，念珠菌病，疟疾，丝虫病，阿米巴病，和棘球囊膀胱，烧伤，皮炎，皮肌炎，太阳烧伤，寻麻症，疹块，vasulitis，血管炎，心内膜炎，动脉炎，动脉粥样化病，血栓性静脉炎，心包炎，先天性心脏衰竭，心肌炎，心肌缺血，动脉外膜炎结节，和风湿热，Alzheimer疾病，腹腔疾病，先天性心脏衰竭，成人呼吸胁迫综合症，脑膜炎，脑炎，多硬化，脑梗死，脑栓塞，Guillame-Barre综合症，神经炎，神经痛，脊索损伤，瘫痪和葡萄膜炎，关节炎和关节痛，骨髓炎，筋膜炎，Paget病，痛风，牙周疾病，风湿性关节炎和滑膜炎，血管硬化性肌无力，thryoiditis，系统性狼疮红斑，Goodpasture综合症，Behcets综合症，同种移植反射，移植寄主疾病，I型糖尿病，强直性脊椎炎，Berger疾病，和Retier综合症，Hodgkins疾病，更优选地，症状选自下组：包括包括阑尾炎，消化性，胃和十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，溃烂，伪膜状，急性和局部缺血性结肠炎，憩室炎，会咽炎，喷门痉挛，胆管炎，胆囊炎，腹腔疾病，肝炎，Crohn疾病，气喘，过敏，过敏性休克，免疫复合疾病，器官缺血，再灌注损伤，器官坏死，枯草热，脓毒病，败血病，内毒休克，癌血症，弥散性菌血症，烧伤，Alzheimer疾病，脑膜炎，腹腔疾病，先天性心脏衰竭，成人呼吸胁迫综合症，脑膜炎，脑炎，多硬化，脑梗死，脑栓塞，脊索损伤，瘫痪，移植后排斥和移植对寄主的疾病；最优选地，症状是内毒休克或移植后排斥。当症状是移植后排斥，组合物可以进一步包括免疫阻遏剂，用于移植后排斥，优选地是环孢菌素。

在其他实施方案中，本发明涉及特异地结合脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子，但不特异结合HMG的非B盒子表位的抗体的纯化制剂。在这些实施方案中，抗体可以抑制HMG B盒子多肽的生物活性，例如从用HMG处理的脊椎动物细胞中释放炎症前细胞因子。在优选的实施方案中，HMG B盒子是哺乳动物HMG B盒子，例如人HMG B盒子，更优选地是HMG1 B盒子，最优选地是HMG1 B盒子，具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗体结合HMG1 B盒子的特异多肽序列，包括SEQ ID NO：20(SEQ ID NO：16)的氨基酸1-20，或包括SEQ ID NO：5(SEQ ID NO：23)的氨基酸1-20，或包括SEQ ID NO：20(SEQ ID NO：16)的氨基酸1-20，或包括SEQ ID NO：5(SEQ ID NO：23)的氨基酸1-20。脊椎动物细胞也优选地是哺乳动物的巨噬细胞。在一些实施方案中，抗体优选地人化了。

在其他实施方案中，本发明涉及在药物可接受的赋形剂中包括如上所述的任何抗体制剂的组合物。在这些实施方案中，组合物可以抑制特征是激活炎症细胞因子级联的症状。这些组合物也可以包括早期脓毒介导物的拮抗剂，用于这些组合物治疗的优选的症状是那些炎症细胞因子级联激活介导或为特征的那些，例如那些如上所述与A盒子组合物相关的那些。

另外，本发明涉及包括脊椎动物HMG B盒子或其生物活性片段或非天然存在的HMG B盒子或其生物活性片段，但不包括全长HMG蛋白质的多肽。在这些实施方案中，多肽可以引起从脊椎动物细胞中释放炎症前细胞因子。这些实施方案的多肽优选地是HMG B盒子，更优选地是HMGl B盒子，最优选地是HMG1B盒子，具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20的氨基酸序列。在另一个实施方案中，HMG B盒子片段包括SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：23的序列，或包括SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：23的序列。在优选的实施方案中，脊椎动物细胞是哺乳动物巨噬细胞。本发明也包括编码这些多肽的载体。

本发明也涉及抑制从哺乳动物细胞中释放前炎症细胞因子的方法。该方法包括用A盒子或如上所述的A盒子生物活性片段多肽组合物或B盒子或B盒子生物活性片段抗体组合物处理细胞，处理的量足以抑制从细胞释放炎症前细胞因子。在这些实施方案中，细胞优选地是巨噬细胞。另外，炎症前细胞因子优选地选自包括TNF IL-1a，IL-1b，MIF和IL-6的组。更优选地，细胞是巨噬细胞，炎症前细胞因子优选地选自包括TNF，IL-1α，IL-1β，MIF和IL-6的组。该方法优选地在患有，或有下面症状危险的患者中处理细胞，症状的特征是激活炎症细胞因子的级联。优选的症状已经在前面叙述。

在相关的实施方案中，本发明涉及在激活炎症细胞因子级联为特征的患者中治疗症状的方法。该方法包括对患者给药任何的A盒子，或A盒子生物活性片段多肽组合物，或B盒子或如上所述的B盒子生物活性片段抗体组合物，给药的量是足以抑制炎症细胞因子级联。优选的症状已经叙述过。

其他实施方案中涉及刺激从细胞中释放炎症前细胞因子的方法。该方法包括用B盒子多肽或其生物活性片段或B盒子多肽或B盒子生物活性片段的载体处理细胞，处理的量足以刺激炎症前细胞因子的释放。在相关的实施方案中，本发明涉及在患者中有效地减体重或治疗肥胖的方法。该方法包括对患者给药有效量的HMG B盒子多肽或其生物活性片段。在一个实施方案中，HMG B盒子多肽或其生物活性片段是药物可接受的赋形剂。

本发明也涉及确定化合物是否抑制炎症的方法。该方法包括当与脊椎动物HMG B盒子或其生物活性片段接触时，结合化合物和(a)释放炎症前细胞因子的细胞，和将化合物与(b)HMG B盒子或其生物活性片段结合，然后确定是否化合物抑制炎症前细胞因子从细胞中释放。优选地，HMG B盒子是哺乳动物HMG B盒子，例如HMG1 B盒子。优选的炎症前细胞因子如上所述。

附图的简要说明

图1是HMG1突变体和它们在TNF释放(pg/ml)中的活性的图解。

图2是显示0μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，或10μg/ml的B盒子对RAW264.7细胞中的TNF释放(pg/ml)的效果的方块图。

图2B是显示0μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，或10μg/ml的B盒子对RAW264.7细胞中的IL-1β的释放(pg/ml)的效果方块图。

图2C是显示0μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，或10μg/ml的B盒子对RAW264.7细胞中的IL-6的释放(pg/ml)的效果方块图。

图2D是RNAse保护实验的扫描成象，显示了B盒子(在给药后0小时，4小时，8小时，或24小时)或载体单独(在给药后4小时)对RAW264.7细胞中TNF mRNA的表达的效果。

图2E是HMG1 B盒子在给药后0小时，4小时，8小时，24小时，32小时或48小时对TNF蛋白质从RAW264.7细胞释放(pg/ml)的效果的直方图。

图2F是载体在给药后0小时，4小时，8小时，24小时，32小时或48小时对TNF蛋白质从RAW264.7细胞释放(pg/ml)的效果的直方图。

图3是HMG1 B盒子突变体和它们在TNF释放(pg/ml)中的活性的图解。

图4A是0μg/ml，5μg/ml，10μg/ml或25μg/mlHMG1 A盒子蛋白质对从RAW264.7细胞中释放TNF(如TNF单独释放介导的HMG1的百分数)的抑制效果的图。

图4B是HMG1(0或1.5μg/ml)，HMG1 A盒子(0或10μg/ml)，或载体单独，或其结合对TNF(TNF单独释放介导的HMG1的百分数)从RAW264.7细胞中的释放的效果的直方图。

图5A是¹²⁵I-HMGB1结合RAW264.7细胞(CPM/孔)过长时间(分钟)的图。

图5B是¹²⁵I-HMGB1在没有未标记的HMGB1或HMG1 A盒子，在4℃(总共)结合2小时，或存在5,000摩尔过量的未标记的HMGB1(HMGB1)或A盒子(A盒子)如总CPM/孔的百分数测量的直方图。

图6是HMG-1(10μg/ml或1μg/ml)或HMG1 B盒子(0μg/ml或10μg/ml)单独或结合抗B盒子抗体(25μg/ml或100μg/ml)或IgG(25μg/ml或100μg/ml)对从RAW264.7细胞(表示为HMG单独介导TNF的释放的百分数)的效果图。

图7A是苏木素和曙红染色的未处理的小鼠的肾切片的扫描成象。图7B是苏木素和曙红染色的从给药HMG1 B盒子的小鼠得到的肾切片的扫描成象。

图7C是从未处理的小鼠得到的苏木精和曙红染色的心肌的扫描成象。

图7D是从给药HMG1 B盒子的小鼠得到的苏木精和曙红染色的心肌切片的扫描成象。

图7E是从微处理的小鼠得到的苏木精和曙红染色的肺切片的扫描成象。

图7F是从给药HMG1 B盒子的小鼠得到的苏木精和曙红染色的非肺切片的扫描成象。

图7G是从微处理的小鼠得到的苏木精和曙红染色的肝切片的扫描成象。

图7H是从给药HMG1 B盒子的小鼠得到的苏木精和曙红染色的肝切片的扫描成象。

图7I是从未处理的小鼠得到的苏木精和曙红染色的肝切片(高放大率)的扫描成象。

图7J是从给药HMG1 B盒子的小鼠得到的苏木精和曙红染色的肝切片(高放大率)的扫描成象。

图8是在一段时间内(小时)进行盲肠连接和针刺(CLP)的小鼠中的HMG B1(ng/ml)的水平图。

图9是盲肠连接和针刺(CLP)后A盒子(60μg/小鼠或600μg/小鼠)或没有处理对小鼠的生存一段时间(天)的效果的图。

图10A是在盲肠和针刺(CLP)后抗HMG1抗体(黑园)或没有处理(开放的园)对小鼠的生存一段时间(天)的效果图。

图10B是抗HMG1 B盒子抗血清(◆)或没有处理(*)对给药脂多糖(LPS)的小鼠的生存(天)的效果。

图11A是抗RAGE抗体或非免疫IgG对从HMG1(HMG-1)，脂多糖(LPS)，或HMG1 B盒子(B盒子)处理的RAW264.7细胞释放TNF的效果图。

图11B是在用小鼠MyD 88-优先阴性(+MyD 88 DN)突变体(对应于氨基酸146-296)，或空的载体(-MyD 88 DN)共转染的RAW264.7细胞中HMG1或HMG1 B盒子多肽刺激对NFkB依赖ELAM启动子(通过荧光酶活性测量)的激活的效果的直方图。数据表示为来自微刺激的和刺激的细胞的平均荧光酶值(减去背景)+SD的比例(成倍激活)。

图11C是用IL-1，HMG1或HMG1 B盒子构成性地表达人TLR2(开放的条)或TLR4(阴影条)的CHO报道细胞系对CD25表达的刺激效果的直方图。数据表示为根据平均FL1荧光排除了最低5％的细胞的未刺激和刺激的细胞群体中CD25+细胞的百分数的比例(成倍激活)。

图11D是给药抗RAGE抗体，抗TLR2抗体，抗RAGE抗体和抗TLR2抗体一起，或IgG对RAW264.7细胞中HMG1介导的TNF释放(测量为没有抗体时TNF释放的百分数)的效果。

图12A是人HMG1多肽(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列。

图12B是大鼠和小鼠HMG1的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图12C是人HMG2的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。

图12D是人，小鼠，和大鼠HMG1 A盒子多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

图12E是人，小鼠，和大鼠HMG1 B盒子多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。

图12F是人HMG1的正向引物的核酸序列(SEQ ID NO：6)。

图12G是人HMG1的反向引物的核酸序列(SEQ ID NO：7)。

图12H是人HMG1的羧基末端突变体的正向引物的核酸序列(SEQ ID NO：8)。

图12I是人HMG1的羧基末端突变体的反向引物的核酸序列(SEQ ID NO：9)。

图12J是人HMG1的氨基末端正B盒子突变体的正向引物的核酸序列(SEQ ID NO：10)。

图12K是人HMG1的氨基末端正B盒子突变体的反向引物的核酸序列(SEQ ID NO：11)。

图12L是人HMG1的B盒子突变体的正向引物的核酸序列(SEQ ID NO：12)。

图12M是人HMG1的B盒子突变体的反向引物的核酸序列(SEQ ID NO：13)。

图12N是人HMG1的氨基末端正A盒子突变体的正向引物的核酸序列(SEQ ID NO：14)。

图12O是人HMG1的氨基末端正A盒子突变体的反向引物的核酸序列(SEQ ID NO：15)。

图13是来自大鼠(SEQ ID NO：2)，小鼠(SEQ ID NO：2)，和人(SEQ ID NO：18)的HMG1多肽序列的序列排列。

本发明的详细说明

除非特别说明，本发明的实践将利用本领域技术人员已知的细胞培养常规技术，分子生物学，微生物学，细胞生物学，和免疫学。这样的技术在文献中有全部说明，参见例如，Sambrook et al.，1989，“分子克隆：实验室手册”，冷泉港实验室出版；Ausubel etal.(1995)，“分子生物学的短期方案”，John Wiley and Sons；酶学方法(几卷)；细胞生物学方法(几卷)，和分子生物学中的方法(几卷)。

本发明是根据进一步阐明HMG1的能力的各种特征的一系列发现来诱导炎症前细胞因子和炎症细胞因子级联而产生的。具体地说，已经发现，HMG1的炎症前活性区是B盒子(特别是，B盒子开始的20个氨基酸)，特异于B盒子的抗体将抑制炎症前的细胞因子的释放和炎症细胞因子的级联，结果是可以缓解炎症细胞因子级联引起的不利症状。也已经发现，A盒子是炎症细胞因子释放的弱激动剂，和竞争性抑制B盒子和HMG1的炎症前活性。

如本文所用，“HMG多肽”或“HMG蛋白质”是基本纯净的，或基本纯净和分离的多肽，已经从天然伴随它的成分中分离，或具有相同的氨基酸序列的重组产生的多肽，和/或加强了炎症，和/或提高了从细胞中释放炎症前细胞因子，在一个实施方案中，HMG多肽具有上面的生物活性的一个。在另一个实施方案中，HMG多肽具有上面的生物活性的两个。在第三个实施方案中，HMG多肽具有所有三个上面的生物活性。

优选地，HMG多肽是哺乳动物HMG多肽，例如人HMG1多肽。优选地，HMG多肽与选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：18，如利用BLAST程序和本文所述的参数确定的有至少70％，75％，80％，85％或90％和最优选地有至少95％的序列同一性。HMG多肽的例子包括具有SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，或SEQ ID NO：18的序列的多肽。优选地，HMG多肽含有B盒子DNA结合区和/或A盒子DNA结合区，和/或酸性羧基末端。其他的HMG多肽如基因库登记号AAA64970，AAB08987，P07155，AAA20508，S29857，P09429，NP_002119，CAA31110中所述，这些专利全部引入作为参考。HMG多肽的其他例子包括，但不限于哺乳动物HMG1，HMG2，HMG-2A，HMG14，HMG17，HMGI和HMGY；非哺乳动物HMG T1和HMG T2(虹鳟)，HMG-X(爪澹)，HMG D/Z(果蝇)，酵母多肽NHP10蛋白质(HMG蛋白质同源物NHP1)和非组蛋白染色体蛋白质；HMG1/2类似蛋白质(小麦，玉米，大豆)；上游结合因子(UBF-1)，单链识别蛋白质(SSRP)或结构特异识别蛋白质；HMG同源TDP-1；哺乳动物性别确定区Y蛋白质(SRY，睾丸确定因子)；真菌蛋白质；mat-1，stell和Mc 1；SOX 14(以及SOXl-3，6，8，10，12和21)；淋巴样特异因子(LEF-1)；T性别特异转录因子(TCF-1)；和SP100-HMG核自身抗原。

如本文所用，“HMG A盒子”也在本文中也称为“A盒子”，是基本纯净多肽或基本纯净分离多肽，已经从天然伴随它的成分中分离，构成比全长HMG多肽少的氨基酸序列，具有一个或多个下面的生物活性：抑制炎症，和/或抑制从细胞释放炎症前细胞因子，和/或降低炎症细胞因子级联的活性。在一个实施方案中，HMG A盒子多肽具有上面的生物活性中的一个。在另一个实施方案中，HMG A盒子多肽具有上面的生物活性中的两个。在第三个实施方案中，HMG A盒子多肽具有所有三个上面的生物活性。优选地，HMG A盒子具有不超过10％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％的全长HMG的生物活性。在一个实施方案中，HMG A盒子氨基酸包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：22的序列或对应于哺乳动物的HMG蛋白质的区域中的氨基酸序列。HMG A盒子也是与如上所述的A盒子序列相同的氨基酸序列的重组产生的多肽。优选地，HMG A盒子是哺乳动物HMG A盒子，例如人HMG 1A盒子。本发明的HMG A盒子多肽优选地包括SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：22的序列或对应于哺乳动物的HMG蛋白质的区域中的氨基酸序列。HMG A盒子经常具有不到约85个氨基酸和不少于约4个氨基酸。在它们中具有A盒子序列的多肽的例子包括，但不限于HMG1，HMG2，HMG4；结构特异识别蛋白质(SSRP)；PMS1蛋白质同源物1；SOX-1，SOX-2，和SOX-14蛋白质；和MTT1。在这样的多肽中的A盒子序列可以利用如本文所述的方法来确定和分离，例如通过与如本文所述的A盒子进行序列比较和测试生物活性。

本发明的特征也有非天然存在的HMG A盒子。优选地，非天然存在的HMG A盒子与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：22，利用BLAST程序和如本文所述的参数与SEQ ID NO：4或SEQID NO：22的序列至少具有60％，更优选地至少70％，75％，80％，85％或90％，最优选地至少95％的同一性，和具有一个或几个HMG A盒子的生物活性。

本发明还有特征是A盒子生物活性片段。“具有A盒子生物活性的A盒子片段”或“A盒子生物活性片段”指具有如本文所述的HMG A盒子的活性的HMG A盒子的片段。例如，A盒子片段可以降低脊椎动物细胞释放炎症前细胞因子，降低炎症，和/或降低炎症细胞因子级联的活性。A盒子片段可以利用标准的分子生物学技术和通过确定当对细胞给药时是否片段抑制从细胞释放炎症前细胞因子，例如利用本文所述的方法测试片段的功能来产生。A盒子生物活性片段可以用于本文所述的方法中，其中利用了全长的A盒子多肽，抑制从细胞释放炎症前细胞因子，或治疗具有激活炎症细胞因子级联的症状的患者。

如本文所用，“HMG B盒子”也在本文中指“B盒子”是基本纯净，或基本纯净分离的多肽，已经从天然伴随它的成分分离，包括少于全长HMG多肽和具有一个或多个下面的生物活性的氨基酸序列：提高炎症，提高从细胞释放炎症前细胞因子，和/或提高炎症细胞因子级联的活性。在一个实施方案中，HMG B盒子多肽具有上面的生物活性中的一个。在另一个实施方案中，HMGB盒子多肽具有上面的生物活性中的两个。在第三个实施方案中，HMG B盒子多肽具有上面的生物活性的所有三个。优选地，HMGB盒子至少具有全长HMG的生物活性的25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％。在另一个实施方案中，HMG B盒子不包括HMG A盒子。在另一个实施方案中，HMG B盒子是全长HMG1多肽的长度的约90％，80％，70％，60％，50％，40％，35％，30％，25％或20％的多肽。在另一个实施方案中，HMG盒子包括SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20的序列，或对应于哺乳动物中HMG蛋白质的区域中的氨基酸序列，但仍然小于全长的HMG多肽。HMG B盒子多肽也是具有如上所述的HMG B盒子多肽相同的氨基酸序列的重组产生的多肽。优选地，HMG B盒子是哺乳动物HMG B盒子，例如人HMG1 B盒子。HMG B盒子经常不超过约85个氨基酸，和不小于约4个氨基酸。在它们中具有B盒子序列的多肽的例子包括但不限于本文所述的HMG多肽，单链识别蛋白质(SSRP)或结构特异识别蛋白质；酵母NHP10蛋白质(HMG蛋白质同源物NHP 1)；HMG同源物TDP-1；性别确定区域Y蛋白质(睾丸测定因子)；SOX14(以及SOX1-3，6，8，10，12和21)；淋巴样特异因子(LEF-1)；和T性别特异转录因子(TCF-1)。在这样的多肽中的B盒子序列可以利用本文所述的方法测定和分离，例如通过与本文所述的B盒子序列比较和测定生物活性的方法。

本发明也包括非天然存在的HMG B盒子多肽。优选地，非天然存在的HMG B盒子多肽至少具有60％，更优选地至少70％，75％，80％或90％，最优选地至少95％与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20，如利用BLAST程序和本文所述的参数确定的序列同一性。优选地，HMG B盒子包括SEQ ID NO：5或SEQID NO：20的序列或对应于哺乳动物中的HMG蛋白质的区域的氨基酸序列。

在其他实施方案中，本发明涉及包括脊椎动物HMG B盒子或具有B盒子生物活性的片段，或非天然存在的HMG B盒子但不包括全长HMG的多肽。“具有B盒子生物活性的B盒子片段”或“B盒子生物活性片段”是指具有HMG B盒子的活性的HMGB盒子的片段。例如，B盒子片段可以从脊椎动物性别释放炎症前性别因子或增强炎症，或诱导炎症细胞因子级联。这样的B盒子片段的例子是如本文所述包括HMG1 B盒子的开始20个氨基酸(SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：23)的片段。B盒子片段可以利用标准的分子生物技术和通过确定当对细胞给药时片段是否提高炎症前细胞因子成分细胞中释放的功能，来产生，并且与适当的对照例如利用本文所述的方法比较。

如本文所用，“细胞因子”是哺乳动物细胞天然产生，和在体内作为微或皮摩尔浓度的体液调节剂的可溶蛋白质或肽。在正常或病理条件下，细胞因子可以调节个别细胞和组织的功能活性。炎症前细胞因子是能够引起与与炎症相关的任何下面的生理反应的细胞因子：血管舒张，充血，与水肿相关的血管渗透性的提高，积累粒细胞和单核巨噬细胞或纤维素的沉积。在一些情况中，炎症前细胞因子也可以引起细胞程序死亡，如慢性心脏梗死，其中TNF已经显示能刺激心肌细胞程序死亡(Pulkki，Ann.Med.29：339-343，1997；和Tsutsui et al.，Immunol.Rev.174：192-209，2000)。

炎症前细胞因子的非限制例子是肿瘤坏死因子(TNF)，白介素(IL)-1α，IL-1β，IL-6，IL-8，IL-18，干扰素γ，HMG-1，白小板-激活因子(PAF)，巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)。

炎症前细胞因子是与不是炎症调节物的抗炎症细胞因子如IL-4，IL-10和IL-13有区别的。

在许多情况中，炎症前细胞因子是哺乳动物中至少一个炎症前细胞因子的体内释放确定的炎症细胞因子级联中产生的，其中细胞因子的释放影响了哺乳动物的生理条件。所以，炎症细胞因子级联是在本发明的实施方案中受抑制的，其中炎症前细胞因子释放引起了不利的生理条件。

天然存在或非天然存在的HMG A盒子和HMG B盒子包括与如上所述的HMG A盒子和HMG B盒子具有序列同一性的多肽。如本文所用，当氨基酸序列至少约60％，70％，80％，85％，90％或95％或更大的同源性或同一性时，两个序列(或多肽的区域)基本同源或同一。两个氨基酸序列(或两个核酸序列)的同一性百分数可以通过排列序列来确定，用于适当的比较目的(例如，在第一个序列的序列中可以导入裂隙)。然后比较对应位置的氨基酸或核苷酸，两个序列的同一性百分数是序列共享的相同位置的数目的功能(即，同一性％＝#同一位置/总#位置×100)。在一些实施方案中，HMG多肽的长度，HMG A盒子多肽，或比较目的排列的HMG B盒子多肽是至少约305，优选地至少约40％，更优选地至少约60％，甚至更优选地至少约70％，80％，90％或100％长度的参考序列，例如图12A-12E，SEQ ID NOS：18，20和22中提供的那些序列。通过已知的方法，例如利用算式可以进行两个序列的真正比较。这些算式的优选的非限制例子在Karlin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877(1993)中有叙述。这样的一个算式掺入了BLASTN和BLASTX程序(2.2版)，如Schaffer et al。Nucleic Acids Res.，29：2994-3005(2001)中所述。当利用BLAST和有缺口的BLAST程序时，可以利用各个程序(例如BLASTIN)的缺席参数。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.，其在2002年4月10日是可访问的。在一个实施方案中，研究的数据库是非丰富(NR)数据库，序列比较的参数可以设定在：非过滤；期望值10；字大小3；基质是BLOSUM62；和缺口值具有存在值11和延伸值1。

用于序列比较的算式的另外的优选的非限制例子是Myers和Miller，CABIOS(1989)的序列的比较。这样的算式掺入了ALIGN程序(2.2版)，是GCG(Accelrys)序列排列软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以利用PAM120重残基表，缺口长度惩罚数12，和缺口惩罚数4。序列分析的其他的算式是本领域已知的，包括如Torellis和Robotti，Comout.Appl.Biosci，10：3-5(1994)；和Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444-8(1988)中所述的ADVANCE和ADAM。

在另一个实施方案中，利用GCG软件包中的GAP程序可以进行两个氨基酸序列之间的同一性百分数的测定(在http：//www.accelrys.com 2001年8月31日可访问得到)，其中还利用了Blossom63基质或PAM250基质，和缺口重12，10，8，6或4和长度重2，3，4)。在另一个实施方案中，利用GCG软件宝中的GAP程序(可在http：//www.cgc.com得到)，和利用缺口重50和长度重3可以进行两个核酸序列之间的同一性百分数的测定。

A盒子多肽和其生物活性片段

如上所述，本发明涉及含有脊椎动物HMG A盒子或其生物活性片段的多肽组合物，可以抑制从用HMG处理的脊椎动物细胞中释放炎症前细胞因子，或可以用于处理激活炎症细胞因子级联为特征的症状。

当用于指本发明的任何组合物或方法对炎症前细胞因子的释放的效果时，利用术语“抑制”或“降低”至少包括炎症前细胞因子的释放的小的但可测量的降低。在优选的实施方案中，炎症前细胞因子的释放至少抑制了比非处理对照有20％；在更优选的实施方案中，抑制至少是约50％；在更优选的实施方案中，抑制至少约70％，在最优选的实施方案中，抑制至少约80％。在炎症前细胞因子释放中这样的释放能够降低体内实施方案中炎症细胞因子级联的不利的效果。

因为所有脊椎动物HMG A盒子显示了高度的序列保守(参见例如，图13，用于大鼠，小鼠和人的HMG多肽的氨基酸序列的比较)。确信任何脊椎动物HMG A盒子可以抑制从用HMG处理的脊椎动物细胞释放炎症前细胞因子。所以，任何脊椎动物HMGA盒子是在本发明的范围内的。优选地，HMG A盒子是哺乳动物HMG A盒子，例如哺乳动物HMG 1A盒子，如本文SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：22中提供的人HMG1 A盒子。同样包括在本发明中的是具有HMG A盒子生物活性的HMG A盒子的片段。

本领域技术人员同样认识到的是，在不进行实验时可以产生非天然存在的HMG A盒子(或其生物活性片段)，能抑制从脊椎动物HMG处理的脊椎动物细胞中释放炎症前细胞因子。通过排列不同来源的HMG A盒子的氨基酸序列可以产生这些非天然存在的功能A盒子，使在A盒子不同的氨基酸位置中的一个序列中有一个或多个取代。取代优选地是用比较的A盒子中存在的相同的氨基酸残基来进行的。或者，保守的取代在不同的残基中进行的。

保守的氨基酸取代指具有相似的侧链的残基的相互交换能力。保守取代的氨基酸可以根据它们的侧链的化学特性来分组。例如，一组氨基酸可以包括那些具有中性和疏水的侧链的氨基酸(a，v，l.i.p.w.f，和m)；另一组是那些具有中性和极性的侧链的氨基酸(g，s，t，y，c，n，和q)；另一组是那些具有碱性侧链的氨基酸(k，r，和h)；另一个组是那些具有酸性侧链的氨基酸(d和e)；另一组是那些具有脂肪族侧链的氨基酸(g，a，v，l，和I)；另一组是那些具有脂肪族羟基侧链的氨基酸(s和t)；另一组是那些具有含有胺的侧链的氨基酸(n，q，k，r and h)；另一组是那些具有芳香族侧链的氨基酸(f，y andw)；另一组是那些具有含有硫的侧链c和m的氨基酸)。优选的保守氨基酸取代是r-k；e-d，y-f，l-m；v-I，and q-h。

当保守氨基酸取代可以期望保存HMG A盒子多肽的生物活性时，下面是怎样通过比较人HMG A盒子(SEQ ID NO：4)与人HMG2 A盒子的残基32到85(SEQ ID NO：17)来制造非天然存在的A盒子多肽的一个例子。

HMG1 pdasvnfsef skkcserwkt msakekgkfe dmakadkaryeremktyipp kget

HMG2 pdssvnfaef skkcserwkt msakekskfe dmaksdkarydremknyvpp kgdk

非天然存在的HMG A盒子可以例如通过用HMG2盒子的第三个位置上存在的丝氨酸(s)残基取代HMG1 A盒子中的第三个位置的丙氨酸(a)残基来产生。技术人员已知，取代将提供功能性非天然存在的A盒子，因为在HMG2 A盒子中的那个位置中s发挥了功能。或者，HMG1 A盒子的第三个位置可以用对丙氨酸或丝氨酸保守的任何氨基酸来取代，如甘氨酸(g)，苏氨酸(t)，缬氨酸(v)或亮氨酸(i)。技术人员将认识到，这些保守的取代可以期望产生功能性A盒子，因为A盒子在第三个位置是非不变的，所以保守取代将提供在那个位置天然存在的氨基酸的适当的结构取代。

在上面的方法后，在不进行非必要性实验的情况下可以产生许多非天然存在的HMG A盒子，可以期望是功能性的，并且可以在适当的准确度下期望有任何特别的非天然存在的HMG A盒子的功能性。在任何事件中，在没有进行实验时通过在细胞中简单加入它和HMG可以测定任何非天然存在的HMG A盒子的功能性，利用如本文所述的方法确定是否A盒子抑制细胞中炎症前细胞因子的释放。

A盒子或A盒子生物活性片段将抑制HMG诱导的炎症前细胞因子的释放的细胞可以是诱导产生炎症前细胞因子的任何细胞。在优选的实施方案中，在最优选的实施方案中，细胞是巨噬细胞。

现在已知或后来发现的可以抑制任何单个炎症前细胞因子的产生的包括A盒子或A盒子的生物活性片段的多肽是在本发明的范围内的。优选地，该抗体可以抑制TNF，IL-1β，或IL-6的产生。最优选地，该抗体可以抑制脊椎动物细胞产生的炎症前细胞因子的产生。

本发明也涉及在药物可接受的赋形剂中包括任何上面所述的多肽的组合物。在这些实施方案中，组合物可以抑制特征是激活炎症细胞因子的级联的症状。该症状可以是炎症细胞因子级联引起系统反应的一个，如内毒休克。或者，该症状可以通过定位的炎症细胞因子级联来介导的，如风湿性关节炎。这些症状的非限制例子可以利用本发明来有用地治疗，包括在本申请书的背景下叙述的那些症状。优选地，该症状是包括阑尾炎，消化性，胃和十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，溃烂，伪膜状，急性和局部缺血性结肠炎，憩室炎，会咽炎，喷门痉挛，胆管炎，胆囊炎，腹腔疾病，肝炎，Crohn疾病，肠炎，和Whipple疾病，气喘，过敏，过敏性休克，免疫复合疾病，器官缺血，再灌注损伤，器官坏死，枯草热，脓毒病，败血病，内毒休克，癌血症，高热，嗜酸性肉芽瘤，肉芽肿病，和结节病，支气管炎，肺气肿，鼻炎，膀胱纤维变性，肺炎，成人呼吸胁迫综合症，超微硅火岩肺炎，alvealitis，细支气管炎，咽炎，胸膜炎，鼻窦炎，流感，呼吸多核性病毒感染，疱疹感染，HIV感染，乙型肝炎病毒感染，丙型肝炎病毒感染，弥散性菌血症，登革热，念珠菌病，疟疾，丝虫病，阿米巴病，和棘球囊膀胱，烧伤，皮炎，皮肌炎，太阳烧伤，寻麻症，疹块，vasulitis，血管炎，心内膜炎，动脉炎，动脉粥样化病，血栓性静脉炎，心包炎，先天性心脏衰竭，心肌炎，心肌缺血，动脉外膜炎结节，和风湿热，Alzheimer疾病，腹腔疾病，先天性心脏衰竭，成人呼吸胁迫综合症，脑膜炎，脑炎，多硬化，脑梗死，脑栓塞，Guillame-Barre综合症，神经炎，神经痛，脊索损伤，瘫痪和葡萄膜炎，关节炎和关节痛，骨髓炎，筋膜炎，Paget病，痛风，牙周疾病，风湿性关节炎和滑膜炎，血管硬化性肌无力，thryoiditis，系统性狼疮红斑，Goodpasture综合症，Behcets综合症，同种移植反射，移植寄主疾病，I型糖尿病，强直性脊椎炎，Berger疾病，和Retier综合症，Hodgkins疾病，在更优选的实施方案中，症状是，阑尾炎，消化性，胃和十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，溃烂，伪膜状，急性和局部缺血性结肠炎，憩室炎，会咽炎，喷门痉挛，胆管炎，胆囊炎，腹腔疾病，肝炎，Crohn疾病，气喘，过敏，过敏性休克，免疫复合疾病，器官缺血，再灌注损伤，器官坏死，枯草热，脓毒病，败血病，内毒休克，癌血症，弥散性菌血症，烧伤，Alzheimer疾病，脑膜炎，腹腔疾病，先天性心脏衰竭，成人呼吸胁迫综合症，脑膜炎，脑炎，多硬化，脑梗死，脑栓塞，脊索损伤，瘫痪，移植后排斥和移植对寄主的疾病。在最优选的实施方案中，症状是内毒休克或移植后排斥。当症状是移植后排斥是，组合物可以有利地包括用于抑制移植后排斥的免疫阻遏剂，如环孢菌素。

在这些组合物中的多肽包括的赋形剂是根据在治疗应用中的组合物的给药的期望途径来选择的。组合物的给药途径是依据待治疗的症状的。例如静脉内注射可以优选地用于治疗系统性的紊乱，如内毒休克，口服给药可以优选地治疗肠胃道紊乱如肠胃溃疡。给药的途径和给药的组合物的剂量可以通过技术人员来确定，不需要进行实验和标准的剂量应答研究。在进行那些测定时待考虑的相关情况包括待治疗的症状，带给药的组合物的选择，年龄，体重，和个别患者的应答，患者症状的严重程度。所以，根据症状，抗体组合物可以口服，经肠胃，鼻内，经阴道，直肠，舌，舌下，口，口内和经皮地给患者给药。

因此，设计口服，舌，口和口内给药的组合物可以在不进行实验的情况下通过本领域已知的方法与惰性或可食的载体一起进行。组合物可以包括在明胶胶囊中或压缩成片剂。为了口服治疗给药的目的，本发明的药物组合物可以掺入赋形剂，可以片剂，锭剂，胶囊，驰剂，悬浮液，糖浆，华夫，口香糖等等。

片剂，丸剂，胶囊，锭剂等等也含有赋形剂，受体，分散剂，润滑剂，甜味剂，和调味剂。结合剂的一些例子包括微结晶纤维素，黄氏胶或明胶。赋形剂的例子包括淀粉或乳糖。分散剂的一些例子包括海藻酸，玉米淀粉等等。润滑剂的例子包括硬脂酸镁或硬脂酸钾。润滑剂的例子是二氧硅胶。甜味剂的例子包括蔗糖，多糖等等。调味剂的例子包括胡椒薄荷，甲基水杨酸，橘子调味剂等。在制备这些各种各样的组合物时利用的物质应该是药物纯净级的并且在利用的量上是非毒性的。

本发明的组合物可以容易地肠胃外给药，例如静脉内，肌肉内，鞘内或皮下注射给药。肠胃外给药可以通过将本发明的抗体组合物掺入溶液或悬浮液来完成。这样的溶液或悬浮液也可以包括无菌稀释液，如用于注射的水，盐水溶液，固定的油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其他合成溶剂。肠胃外配方也可以包括抗细菌剂，如苯基醇或甲基对甲基苯甲酸，抗氧化剂，如抗坏血酸或二硫酸钠和螯合剂如EDTA。缓冲液如乙酸，柠檬酸或磷酸，和调节张力的试剂如氯化钠或葡聚糖也可以利用。肠胃外制剂可以包括在安瓿中，可处置的针筒中，或玻璃或塑料制成的多个剂量的小瓶中。

直肠给药包括将药物组合物给药入直肠或大肠。这可以利用栓剂或灌肠的方法来进行。栓剂配方可以容易地用本领域已知的方法来制造。例如，栓剂配方可以通过加热甘油到约120℃，在甘油中溶解抗体组合物，混合加热的甘油，然后可以加入纯化的水。将热的混合物倾入栓剂模中来制备。

经皮给药包括将组合物通过皮肤吸收。经皮配方包括膏药，油膏，奶液，凝胶，salves等等。

本发明包括对哺乳动物经鼻给药治疗有效量的组合物。如本文所用，鼻给药包括将组合物给药到患者的鼻通道或鼻腔的粘膜。如本文所用，鼻给药组合物的药物组合物包括治疗有效量的已知方法制备的激动剂，如鼻喷洒剂，鼻滴剂，悬浮液，凝胶，油膏，奶液或粉末。给药组合物也可以用鼻棉塞或鼻海绵进行。

本文所述的多肽组合物也包括早期的脓毒介导物的拮抗剂。如本文所用，早期的脓毒介导物是炎症前细胞因子，是从细胞中在导入炎症细胞因子级联(例如与LPS接触)后不久释放的。这些细胞因子的非限制例子是TNF，IL-1α，IL-1β，IL-6，PAF和MIF。同样包括为早期脓毒介导物的是这些细胞因子的受体(例如，肿瘤坏死因子受体I型)和生产这些细胞因子需要的酶，例如白介素1β转化酶)。任何早期的脓毒介导物的拮抗物，不论是现在已知或后来发现的，都可以通过进一步抑制炎症细胞因子级联用于这些实施方案中。

早期脓毒介导物的非限制性例子是结合早期脓毒介导物的mRNA的抗血清化合物，可以防止表达(参见例如，Ojwang et al.，Biochemistry 36：6033-6045，1997；Pampfer et al.，Biol.Reprod.52：1316-1326，1995；U.S.专利号6,228,642；Yahata et al.，反义核酸药物发展6：55-61，1996；和Taylor et al.，AntisenseNucleic Acid Drug Dev.8：199-205，1998)，特异地裂解早期脓毒介导物的mRNA的核酶(参见例如，Leavitt et al.，Antisense NucleicAcid Drug Dev.10：409-414,2000；Ki憩ch et al.，1999；and Hendrixet al.，Biochem.J.314(Pt2)：655-661，1996)，和结合早期脓毒介导物和抑制它们的作用的抗体(参见例如，Kam and Targan，ExpertOpin.Pharmacother.1：615-622，2000；Nagahira et al.，J.Immunol.Methods 222,83-92，1999；Lavine et al.，J.Cereb.Blood FlowMetab.18：52-58，1998；and Holmes et al.，Hybridoma19：363-367,2000)。任何早期的脓毒介导物的拮抗物，现在已知的或后来发现的都包括在本发明的范围内。技术人员可以不进行应答途径剂量研究的实验确定这些组合物中利用的早期脓毒介导物的量抑制任何特殊的炎症细胞因子级联。

B盒子多肽，其生物活性片段和其抗体

如上所述，本发明涉及包括脊椎动物HMG B盒子或其生物活性片段的多肽组合物，可以提高从HMG处理的细胞中释放炎症前细胞因子。

当指本发明的任何组合物或方法对炎症前细胞因子的释放的效果时，术语“提高”的用法至少包括小的但可测量的炎症前细胞因子的释放的提高。在优选的实施方案中，炎症前细胞因子的释放提高了至少1.5倍，至少2倍，至少5倍或至少10倍于非处理的对照。炎症前的细胞因子的释放的这样的升高能够提高体内的实施方案中炎症细胞因子的级联的效果。这样的多肽也可以用于诱导体重的减轻和/或治疗肥胖。

因为所有的HMG B盒子显示了高度的序列保守性(参见例如，图13的大鼠，小鼠，和人HMG多肽的氨基酸比较)，可以确信，不进行实验，提高进行一个或多个保守氨基酸的取代，或通过比较天然存在的不同来源的脊椎动物B盒子，和取代类似氨基酸可以产生功能性非天然存在的HMG B盒子，如上面关于生产功能性非天然存在的A盒子说讨论的。在特定的优选的实施方案中，B盒子包括SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20)，是人HMG1 B盒子的序列(两个不同的长度)，或是具有B盒子生物活性的HMGB盒子的片段。例如，在SEQ ID NO：20内含有的20个氨基酸序列对B盒子的功能有作用。这20个氨基酸B盒子片段具有下面的氨基酸序列：fkdpnapkrl psafflfcse(SEQ ID NO：16)。HMG B盒子生物活性片段的另一个例子包括SEQ ID NO：5的氨基酸1-20(napkrppsaf flfcseyrpk；SEQ ID NO：23)。

本发明也涉及特异地结婚脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子但不特异结合HMG1的非B盒子的抗体的纯化制剂。在这些实施方案中，抗体可以抑制B盒子多肽的生物活性，例如从HMG诱导的脊椎动物细胞中释放炎症前细胞因子。

为了制造特异于HMG B盒子或其片段的抗体，表达B盒子或含有表位的片段的细胞可以用作生产免疫特异于免疫原的抗体的免疫原。如本文所用“抗体”包括单克隆抗体，多克隆抗体，嵌合，单链，猿化抗体和人化抗体，以及Fab片段，包括Fab免疫球蛋白表达文库的产物。

因为所有脊椎动物HMG B盒子显示具有高度的序列保守性，可以确信任何脊椎动物HMG B盒子可以诱导脊椎动物细胞释放炎症前细胞因子。所以，抗任何脊椎动物HMG B盒子的抗体是在本发明的范围内的。优选地，HMG B盒子是哺乳动物HMGB盒子，更优选地是哺乳动物HMG1 B盒子，最优选地是人HMG1B盒子，本文中是SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20。抗体也涉及具有B盒子生物活性的HMG B盒子片段。例如，在SEQ IDNO：20内含有的20个氨基酸序列对B盒子的功能有作用。这20个氨基酸B盒子片段具有下面的氨基酸序列：fkdpnapkripsafflfcse(SEQ ID NO：16)。另一个例子和HMG B盒子生物活性片段包括SEQ ID NO：5的氨基酸1-20(napkrppsaf flfcseyrpk；SEQ ID NO：23)。

本发明也涉及特异地结合高流动组蛋白质(HMG)B盒子但不特异结合HMG1非B盒子表位的抗体的纯化制剂。在这些实施方案中，抗体可以抑制B盒子多肽的生物活性，例如从HMG诱导的脊椎动物细胞释放炎症前细胞因子。

为了制造特异于HMG B盒子或其片段的抗体，表达B盒子或含有表位的片段的细胞可以用作产生免疫特异于免疫原的抗体的免疫原。如本文所用“抗体”可以包括单克隆和多克隆抗体，嵌合，单链，猿化抗体和人化抗体，以及Fab片段，包括Fab免疫球蛋白表达文库的产物。

因为所有脊椎动物HMG B盒子显示了高度的序列保守性，可以确信任何脊椎动物HMG B盒子可以诱导脊椎动物细胞释放炎症前细胞因子。所以，抗任何脊椎动物HMG B盒子的抗体是在本发明的范围内的。优选地，HMG B盒子是哺乳动物HMG B盒子，更优选地是哺乳动物HMG1 B盒子，最优选地是人HMG1B盒子，在本文中是SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：20。抗体也可以指具有B盒子生物活性的HMG B盒子片段。

利用常规方案，给药B盒子，B盒子片段，或含有B盒子或B盒子片段给动物，优选地非人，可以得到抗B盒子免疫原产生的抗体。多肽，如抗原性或免疫相当衍生物或其融合蛋白质可以用作免疫小鼠或其他动物如大鼠或鸡的抗原。B盒子或片段免疫原可以提供作为给予稳定性的融合蛋白质，提高B盒子或片段的免疫原性。免疫原可以例如通过结合来与免疫原性载体蛋白质，例如小牛血清白蛋白(BSA)或钥孔戚血蓝蛋白(KLH)相关联。或者，含有多拷贝的B盒子或片段的多个抗原肽可以是有足够的抗原性来提高免疫原性使避免利用载体的。涉及抗不同B盒子表位的两个抗原结合区的双特异抗体也可以是通过常规方法来产生的。

对于单克隆抗体的制备，可以利用提供连续的细胞系培养产生的抗体的本领域的任何技术。参见例如，Kohler and Milstein，Nature 256：495-497，1975；Kozbor et al.，Immunology Today 4：72，1983；and Cole et al.，pg.77-96 in MONOCLONAL ANTIBODIESAND CANCER THERAPY，Alan R.LISS，Inc.，1985。

生产单链抗体(美国专利号4,946,778)的技术也适用于生产B盒子或片段的单链抗体。同样，转基因小鼠，或其他有机体如其他哺乳动物可以用于表达人化的抗体。

如果抗体是治疗性地用于体内的应用的，抗体优选地修饰使它在个体中免疫原性更小。例如，如果个体是人，抗体优选地是“人化”，其中抗体的互补确定区是移植入人抗体(例如，如Joneset al.所述，Nature 321：522-525，1986；and Tempest et al.，Biotechnology 9：266-273，1991)。

噬菌体展示技术也可以用于选择对来自筛选具有抗B盒子抗体的人或来自天然文库的淋巴细胞的PCR扩增的v-基因的文库的多肽有结合活性的抗体基因(McCafferty et al.，Nature348：552-554，1990；and Marks，et al.，Biotechnology 10：779-783，1992)。这些抗体的亲和力也可以通过链穿梭来提高(Clackson etal.，Nature 352：624-628，1991)。

当得到特异地结合HMG B盒子表位的抗体后，它们可以不进行实验筛选抑制炎症前细胞因子的释放的能力。

可以抑制任何单个炎症前细胞因子的生产的抗HMG B盒子抗体是在本发明的范围内的。优选地，抗体可以抑制TNF，IL-1β，或IL-6的生产。最优选地，抗体可以抑制脊椎动物细胞产生的炎症前细胞因子的生产。

利用HMG B盒子或其生物活性片段的抗体抑制从细胞释放炎症前细胞因子或治疗特征是激活炎症细胞因子级联的症状的方法中，细胞可以是诱导产生炎症前细胞因子的任何细胞。在优选的实施方案中，细胞是免疫细胞，例如巨噬细胞，单核细胞，或嗜中性细胞。在最优选的实施方案中，细胞是巨噬细胞。

在其他实施方案中，本发明涉及在药物可接受赋形剂中包括如上所述的抗体制剂的组合物。在这些实施方案中，组合物可以抑制特征是激活炎症细胞因子的症状。可以用这些组合物治疗的症状前面已经叙述。

如上所述的抗体组合物也可以包括早期脓毒介导物的拮抗剂，如上所述。

这些实施方案中的B盒子多肽和生物活性片段可以用于在适当分离的细胞中，体外或来自体内或如体内处理诱导炎症细胞因子。在任何这些处理中，可以通过提供编码B盒子或B盒子片段的DNA或RNA载体，和适当的与编码的B盒子或B盒子片段可操作地连接的对照序列来给药多肽或片段，使B盒子或B盒子片段可以在处理的细胞或患者中合成。在体内应用中包括了利用B盒子多肽或B盒子片段多肽或载体作为体重减轻治疗。参见WO 00/47104(其全部内容引入作为参考)，证明用HMG1治疗诱导体重减轻。因为HMG B盒子具有HMG蛋白质的活性，B盒子也可期望诱导体重减轻。具有B盒子功能的HMG B盒子片段也可以期望诱导体重减轻。

在其他实施方案中，本发明也涉及抑制从哺乳动物细胞释放炎症前细胞因子的方法。该方法包括用任何HMG A盒子组合物或任何HMG B盒子或HMG B盒子生物活性片段抗体组合物来处理细胞，如上所述。

可以确信，这一方法将可以用于抑制从产生炎症前的细胞因子的任何哺乳动物细胞释放细胞因子。但是，在优选的实施方案中，细胞是巨噬细胞，因为炎症前细胞因子生产巨噬细胞是与几个重要的疾病相关的。

可以确信，这一方法可用于抑制哺乳动物细胞产生的任何炎症前细胞因子。在优选的实施方案中，炎症前细胞因子是TNF，IL-1α，IL-1β，MIF或IL-6，因为那些炎症前细胞因子是特别重要的疾病介导物。

这些实施方案的方法可用于体外，如确定细胞中炎症前细胞因子的生产的生物特征的研究。但是，优选的实施方案是体内治疗应用，其中细胞是患有或有特征是激活炎症细胞因子级联的症状的患者中的。

这些体内实施方案可以确信是可以用于炎症细胞因子级联介导的任何症状的，包括前面已经叙述过的那些中的任何一个。优选地，症状包括阑尾炎，消化性，胃和十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，溃烂，伪膜状，急性和局部缺血性结肠炎，憩室炎，会咽炎，喷门痉挛，胆管炎，胆囊炎，腹腔疾病，肝炎，Crohn疾病，气喘，过敏，过敏性休克，器官缺血，再灌注损伤，器官坏死，枯草热，脓毒病，败血病，内毒休克，癌血症，弥散性菌血症，烧伤，Alzheimer疾病，脑膜炎，腹腔疾病，脑梗死，脑栓塞，脊索损伤，瘫痪，移植后排斥或移植对寄主疾病。在最优选的实施方案中，症状是内毒休克或移植后排斥。当症状是移植后排斥时，组合物有利地包括用于移植移植后排斥的免疫阻遏剂，如环孢菌素。

这些方法也可以有用地包括给药早期的脓毒介导物。这些拮抗物得到特性已经在前面讨论过。

仍然在其他的实施方案中，本发明涉及在患者中治疗特征是激活炎症细胞因子级联的症状。该方法包括对患者给药任何HMG A盒子组合物(包括非天然存在的A盒子多肽和A盒子生物活性片段)或任何HMG B盒子或B盒子生物活性片段抗体组合物(包括非天然存在的B盒子多肽或其生物活性片段)，如上所述。该方法将可以期望用于炎症细胞因子级联介导的任何症状，包括前面已经叙述的那些中的任何一个。如前面体内的方法所述，优选的症状包括阑尾炎，消化性，胃和十二指肠溃疡，腹膜炎，胰腺炎，溃烂，伪膜状，急性和局部缺血性结肠炎，憩室炎，会咽炎，喷门痉挛，胆管炎，胆囊炎，腹腔疾病，肝炎，Crohn疾病，气喘，过敏，过敏性休克，器官缺血，再灌注损伤，器官坏死，枯草热，脓毒病，败血病，内毒休克，癌血症，弥散性菌血症，烧伤，Alzheimer疾病，脑膜炎，腹腔疾病，脑梗死，脑栓塞，脊索损伤，瘫痪，移植后排斥或移植对寄主疾病。在最优选的实施方案中，症状是内毒休克或移植后排斥。当症状是移植后排斥时，组合物有利地可以包括用于抑制移植后排斥的免疫阻遏剂，如环孢菌素。

这些方法也可以有用地包括给药早期脓毒介导物。这些拮抗物的特征已经在前面讨论过。

在其他实施方案中，本发明涉及刺激从细胞中释放炎症前细胞因子的方法。该方法包括用任何B盒子多肽或生物活性B盒子片段多肽，例如如上所述的SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：23(包括非天然存在的B盒子多肽和片段)来处理细胞。这一方法用于体内应用，例如研究炎症前细胞因子的产生对生产细胞的生物学的效果。该方法也可以用于体内应用，例如在患者中减轻体重或治疗肥胖，如前面讨论。

所以，在其他的实施方案中，本发明涉及影响体重减轻或治疗患者的肥胖的方法。该方法包括对患者给药有效量的药物可接受赋形剂中的任何本文所述的B盒子多肽或B盒子片段多肽(包括非天然存在的B盒子多肽和片段)。

从细胞中筛选释放炎症前细胞因子的介导物

本发明也涉及确定是否化合物(实验化合物)抑制炎症和/或炎症应答的方法。该方法包括当与脊椎动物HMG B盒子或其生物活性片段接触时，将化合物与(a)释放炎症前细胞因子的细胞结合，和(b)将化合物与HMG B盒子或其生物活性片段结合，然后确定与适当的对照相比，是否化合物抑制从细胞释放炎症前细胞因子。在这一实验中抑制炎症前细胞因子的释放的化合物是可以用于治疗炎症和/或炎症应答的化合物。HMG B盒子或其生物活性HMG B盒子片段对细胞可以是内源的，或者可以利用标准的重组分子生物学技术导入细胞。

在对与脊椎动物HMG B盒子或其生物活性片段接触的应答中，在没有实验化合物时释放炎症前细胞因子的任何细胞都将可以期望能用于本发明。可以概括，选择的细胞将是在待利用实验的抑制化合物治疗的症状的病原学中的重要部分。对于许多症状，可以期望优选的细胞是人巨噬细胞。

任何确定是否化合物抑制细胞中释放炎症前细胞因子得到任何方法可以用于这些实施方案中。可以期望，优选的方法是利用任何数目的商业可得的ELISA实验直接测定炎症前细胞因子。但是，在一些实施方案中，释放的细胞因子的炎症效果的测定可以是优选的，特别是当有几个实验细胞产生的炎症前细胞因子时尤其优选。如本文讨论，对于许多重要的紊乱，优先的炎症前细胞因子是TNF，IL-1α，IL-1β，MIF或IL-6；特别是TNF。

本发明的特征也是确定是否化合物增强炎症应答和/或炎症的方法。该方法包括将化合物(实验化合物)当与脊椎动物HMG A盒子或其生物活性片段接触时与(a)释放炎症前细胞因子的细胞结合，和将化合物与(b)HMG A盒子或其生物活性片段结合，然后确定与适当的对照比较，是否化合物能增强细胞中释放炎症前细胞因子。在这一实验中降低炎症前细胞因子的释放的化合物是可以用于增强炎症应答和/或炎症的化合物。HMG A盒子或HMGA盒子生物活性片段可以是细胞内源的，或者可以利用标准的重组分子生物学技术导入细胞。

与用于鉴定炎症抑制物的细胞类型相似，如上所述，在没有任何实验化合物时应答与脊椎动物HMG A盒子或其生物活性片段时正常抑制炎症前细胞因子的释放的任何细胞可以期望能用于本发明。可以期望，选择的细胞将是在待实验的抑制化合物治疗的症状的病原学中的重要部分。对于许多症状，可以期望优选的细胞是人巨噬细胞。

确定是否化合物增强细胞中炎症前细胞因子的释放的方法将是在这些实施方案中有用的。可以期望，优选的方法是用任何数目的商业可得ELISA实验直接测定炎症前细胞因子。但是，在一些实施方案中，测定释放的细胞因子的炎症影响可能是优选的，特别是当有几个实验细胞产生的炎症前细胞因子时尤其优选。如前面讨论，对于许多重要的紊乱疾病，优先的炎症前细胞因子是TNF，IL-1α，IL-1β，MIF或IL-6；特别是TNF。

本发明的优选的实施方案在下面的实施例中有叙述。在本发明的范围内的其他实施方案对本领域的技术人员从考虑本文公开的发明的说明书或实验来看是明显的。说明书，实施例和权利要求一起应该仅仅作为举例性地来考虑。

实施例1：材料和方法

克隆HMG1和生产HMG1突变体

下面的方法用于制备人HMG1的克隆和突变体。通过从人脑快克隆cDNA制剂进行PCR扩增克隆重组全长人HMG1(651个碱基对；GenBank登记号U51677)，制剂中包括下面的引物；正向引物：5’GATGGGCAAAGGAGATCCTAAG3’(SEQ ID NO：6)和反向引物：5’GCGGCCGCTTATTCATCATCATCATCTTC3’(SEQID NO：7)。人HMG1突变体如下克隆和纯化。通过从人脑快克隆cDNA制剂(Clontech，Palo Alto，CA)进行PCR扩增可以克隆人HMG1的截断形式。利用的引物是(正向和反向)：

羧基末端突变体(557bp)：5’GATGGGCAAAGGAGATCCTAAG3’(SEQ ID NO：8)and 5’GCGGCCGCTCACTTGCTTTTTTCAGCCTTGAC 3’(SEQ ID NO：9).

氨基末端+B盒子突变体(486bp)：5’GAGCATAAGAAGAAGCACCCA 3’(SEQ ID NO：10)and 5’GCGGCCGCTCACTTGCTTTTTTCAGCCTTGAC3’(SEQ ID NO：11).

B盒子突变体(233bp)：5’AAGTTCAAGGATCCCAATGCAAAG 3’(SEQ ID NO：12)and 5’GCGGCCGCTCAATATGCAGCTATATCCTTTTC 3’(SEQ ID NO：13)

氨基末端+A盒子突变体(261bp)：5’GATGGGCAAAGGAGATCCTAAG 3’(SEQ ID NO：13)and 5’TCACTTTTTTGTCTCCCCTTTGGG 3’(SEQ ID NO：14)。

在各个突变体中加入终止密码子可以保证蛋白质大小的准确度。根据制造商的说明，利用TA克隆方法，在pCRII-TOPO载体EcoRI位点中亚克隆PCR产物(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在扩增后，用EcoRI消化PCR产物，并且用GSTtag pGEX(Pharmacia)亚克隆在表达载体上，并且通过在两个链上进行DNA测序证实准确的定向和阳性克隆。将重组质粒转化进蛋白酶缺陷大肠杆菌菌株BL21或BL21(DE3)plys(Novagen，Madison，WI)，并且通过异丙基-D-流半乳糖吡喃糖苷(IPTG)。利用亲和纯化和谷光甘肽琼脂糖树脂柱(Pharmacia)得到重组的蛋白质。

如上所述产生的HMG突变体具有下面的氨基酸序列：

野生型HMG1：

MGKGDPKKPTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEF

SKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKD

PNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQP

YEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEED

EEDEEEEEDEEDEEDEEEDDDDE(SEQ ID NO：18)

羧基末端突变体：

MGKGDPKKPTGKMS SYAFFVQTCREEHKKKHPDAS

VNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGET

KKKFKDPNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTA

ADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSK(SEQ

ID NO：19)

B盒子突变体

FKDPNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEM

WNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAY(SEQ ID NO：20)

氨基末端+A盒子突变体：

MKGGDPKKPTGKMS SYAFFVQTCREEHKKK

HPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIP

PKGET(SEQ ID NO：21)，A盒子序列：

PTGKMSSYAFF

VQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADK

ARYEREMKTYIPPKGET(SEQ ID NO：22)

从没有HMG1蛋白质的GST载体产生的多肽作为对照(只含有GST tag)。为了失活结合野生型HMG1的细菌DNA，和一些突变体(羧基末端和B盒子)，在约20单位/ml的细菌溶菌物中加入对于羧基末端的DNase I(生命技术公司)，对于野生型HMG1的苯基酶核酸酶(Novagen，Madison，WI)。在处理之前和之后，含有HMG1蛋白质琼脂糖凝胶的溴化乙锭染色证实了DNA的降解。将蛋白质洗脱物通过多黏菌素B柱(Pierce，Rockford，IL)除去任何污染的LPS，用磷酸缓冲盐广泛地洗脱，除去过量降低的谷光甘肽。然后冻干制剂，在使用之前再溶解中无菌水中。如Limylus amebocyte lysate实验(Bio Whittaker Inc.，Walkersville，MD)所测量的，对所有突变体LPS水平小于60pg/μg蛋白质，对野生型HMG-1水平是300pg/μg。通过SDS-PAGE证实了蛋白质的整体性。在一些实验中利用了重组大鼠HMG 1(Wang et al.，Science285：248-251，1999)，因为如在纯化的人HMG1中观察到的，它不具有降解的片段。

肽合成

合成肽，并且在Utah州大学，生物技术中心(Logan，Utah)纯化HPLC，纯度90％。如Limulus实验中测定，在合成的肽制剂中没有可检测的内毒素。

细胞培养

在用10％胎牛血清(Gemini，Gatabasas，CA)，青霉素和链霉素(生命技术)补充的RPMI1640培养基(生命技术公司，GrandIsland NY)中培养小鼠巨噬细胞类似RAW 264.7细胞(美国类型培养物收藏处，Rockville，MD)，并且在无血清的Opti-MEM培养基中90％融合时利用(生命技术公司，Grand Island，NY)。以100-1,000个单位/ml常规加入多黏菌素B(Sigma，St.Louis，MO)，中和如前所述的任何污染的LPS的活性；多黏菌素B单独不影响用台盼兰(Wang et al.，出处同上)评估的细胞存活率。多黏菌素B不在合成肽研究的实验中使用。

测定从细胞释放TNF

通过标准的小鼠成纤维细胞L929(ATCC，美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)细胞毒性生物实验(Bianchi et al.，出处同上)测定TNF释放，最小的可检测浓度是30pg/ml。从R&D系统公司(Minneapolis，MN)得到重组的小鼠TNF。在用10％胎牛血清(Gemini，Catabasas，CA)，青霉素(50单位/ml)，和链霉素(50ug/ml)(生命技术公司)补充的DMEM(生命技术公司，GrandIsland，NY)中，在5％CO₂的潮湿培养气中培养小鼠成纤维细胞L929细胞(ATCC)。

抗体生产

在兔子(Cocalico Biologicals，Inc.，Reamstown，PA)中产生抗HMG1 B盒子的多克隆抗体，通过免疫印迹测试效价。利用蛋白质A琼脂糖，根据制造商的指导(Pierce，Rockford，IL)从抗HMG1抗血清纯化IgG。利用袖氰激活的琼脂糖小珠(Cocalico Biological，Inc.)亲和纯化抗HMG1 B盒子抗体。从Sigma(St.Louis，MO)购买非免疫兔子IgG。在免疫实验中抗体检测了全长的HMG1和B盒子，但不与TNF，IL-1和IL-6交叉反应。

用Na-¹²⁵I标记HMG1和细胞表面结合

根据制造商的指导，利用Iodo-小珠(Pierce，Rockford，IL)用0.2mCi的无载体¹²⁵I(NEN生命科学产品公司，Boston，MA)放射性标记纯化的HMG1蛋白质(10ug)。通过前面已经300mM氯化钠，17.5mM柠檬酸钠，pH7.0和0.1％小牛血清白蛋白(BSA)平衡过凝胶层析柱(P6 Micro Bio-Spin层析柱，Bio-Rad实验室，Hercules，CA)，从未反应的¹²⁵I分离¹²⁵I-HMG1蛋白质。洗脱的HMG1的特异活性约是2.8×10⁶cpm/ug蛋白质。如上所述进行细胞表面结合研究(Yang et al.，Am.J.Physiol.275：C675-C683，1998)。在24孔盘上平铺RAW264.7细胞，生长到融合。用含有0.1％BSA的冰冷PBS洗涤细胞两次，在4℃，用含有120mM的氯化钠，1.2mM硫酸镁，15mM的乙酸钠，5mM的氯化钾，10mM Tris-HCl，pH7.4，0.2％BSA，5mM葡萄糖和25,000cpm ¹²⁵I-HMG1的0.5ml的结合缓冲液进行2小时的结合。在温育结束时，丢弃上清液，用含有0.1％BSA的冰冷PBS0.5ml洗涤细胞3次，用0.5N NaOH和0.1％SDS 0.5ml在室温溶解20分钟。然后利用gamma计数器测定溶解物的放射性活性。将总的结合减去存在过量的未标记的HMG1或A盒子蛋白质时得到的放射性活性确定特异的结合。

动物实验

从Amgen(Thousand Oaks，CA)得到TNF敲出小鼠，是在B6×129背景上的。将年龄相当的野生型B6×129小鼠用作研究的对照。在Florida大学特定的无病原体转基因小鼠工厂(Gainesville，FL)，室内培育小鼠，在6-8星期大的时候使用。

从Harlen Sprague-Dawley(Indianapolis，IN)购买雄性的6-8星期大的Balb/c和C3H/HeJ小鼠，允许在实验使用之前驯化7天。所有动物在North Shore大学医学动物工厂室内养育在标准的温度下，和光暗循环中。

盲肠连接和刺孔

如上所述进行盲肠连接和刺孔(CLP)(Fink and Heard，J.Surg.Res.49：186-196，1990；Wichmann et al.，Crit.Care Med.26：2078-2086，1998；and Remick et al.，Shock4：89-95，1995)。简要地说，用75mg/kg可它因(For Dodge，Fort Dodge，Iowa)和20mg/kg塞拉嗪(Bohringer IngeIheim，St.Joseph，MO)肌肉内麻醉Balb/c小鼠。进行中线切入，分离盲肠。在离开回盲阀的盲肠尖5.0mm水平进行6-0prolene缝合连接。

然后用22量规的针刺连接的盲肠一次，不需要直接伸展。然后，将盲肠放回它正常的腹内位置。然后，在两层腹膜和筋膜中用6-0prolene快速缝合关闭腹部，防止液体流走。在皮下给药20ml/kg体重的正常盐溶液使所有动物复苏。在外科手术后30分钟，每个小鼠接受皮下注射亚胺青霉素(0.5mg/小鼠)(Primaxin，Merck&Co.，Inc.，West Point，PA)。然后，允许动物复原。在这一过程后1星期记录致死率；生存的继续2星期，保证后来没有发生死亡。

D-半乳糖胺敏感小鼠

前面已经叙述了D半乳糖胺敏化模型(Galanos et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76：5939-5943，1979；and Lehmann et al.，J.Exp.Med.165：657-663，1997)。用20mg D半乳糖胺-HCl(Sigma)/小鼠(在200ul PBS中)和0.1或1mg的各个HMG1 B盒子或载体蛋白质(在200ul PBS中)腹膜内注射小鼠。在注射后72小时每天记录死亡率，观察B盒子毒性的后来的死亡。

脾细菌培养

在CLP后24和30小时，14个小鼠接受抗HMG 1抗体(n＝7)或对照(n＝7)，如本文所述，并且进行安乐死后尸体解剖。如上所述回收脾细菌(Villa et al.，J.Endotoxin Res.4：197-204，1997)。用无菌技术除去脾，在2mlPBS中匀浆。在用PBS系列稀释后，在胰胨大豆琼脂平板(Difco，Detroit，MI)上以0.15ml等分试样平铺匀浆物，在37℃过夜温育后计数CFU。

统计学分析

除非特别叙述，数据表示为±SEM。通过双尾学生t-实验，单方法ANOVA确定组之间的差异，接着是至少明显差异实验或2尾Fisher萃取实验。

实施例2：将HMG1区域定位促进细胞因子活性

HMG1具有2倍的DNA结合区(A和B盒子)，和一个阴性的带电酸性羧基末端。为了阐明HMG1细胞因子活性的结构原理，和为了将炎症蛋白质区域定位，我们通过诱变表达了全长和截断形式的HMG1，筛选纯化的蛋白质刺激单核细胞培养物的活性(图1)。产生了全长的HMG1，羧基末端缺失的突变体，只含有B盒子的突变体，和只含有A盒子的突变体。这些人HMG1的突变体是利用特异的引物如本文所述通过聚合酶链式反应(PCR)制造的，利用谷光甘肽-S-转移酶(GST)基因融合系统(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)根据制造商的说明表达了突变体蛋白质。简要地说，PCR方法制造的DNA片段是与GST融合载体融合的，在大肠杆菌中扩增的。然后利用GST亲和柱分离表达的HMG1蛋白质和HMG1突变体。

如下所述进行突变体对从小鼠巨噬细胞-类似RAW264.7细胞(ATCC)释放TNF的效果的测定。在用10％的胎牛血清(Gemini，Catabasas，CA)，青霉素和链霉素(生命技术公司)补充的RPMI1640培养基(生命技术公司，Grand Island NY)中培养RAW264.7细胞。以100单位/ml加入多黏菌素(Sigma，St.Louis，MO)，阻遏任何污染的LPS的活性。用1μg/ml的全长(野生型)HMG1和Opti-MEM培养基中的HMG1突变体蛋白质温育细胞8小时，回收调节的上清液(含有已经从细胞中释放的TNF)，通过标准的小鼠成纤维细胞L929(ATCC)细胞毒性生物实验(Bianchi et al.，出处同上)，在最小的可检测浓度30pg/ml测定从细胞释放的TNF。从R&D系统公司(Minneapolis，MN)得到重组小鼠TNF，并且在这些实验中用作对照。图1中显示了这一研究的结果。在图1中的数据除非特别说明都表示为平均±SEM。(N＝6-10)。

如图1所示，野生型HMG1和羧基截断的HMG1明显刺激了单核细胞培养物(小鼠巨噬细胞类似RAW264.7细胞)释放TNF。B盒子是单核细胞TNF释放的潜在激活物。B盒子的这一刺激效果是特异的，因为A盒子仅仅微弱地激活了TNF的释放。

实施例3：以剂量依赖的方式HMG1 B盒子

蛋白质刺激细胞因子活性

为了进一步检测HMG1 B盒子对细胞因子生产的效果，评估各个量的HMG1 B盒子在小鼠巨噬细胞类似RAW264.7细胞中对TNF，IL-1B和IL-6生产的效果。用B盒子蛋白质，在0-10ug/ml刺激RAW264.7细胞，如图2A-2C所示，刺激了8小时。收获常规的调节培养基，测定TNF，IL-1β和IL-6水平。如本文所述测定TNF水平，利用小鼠IL-1β和IL-6酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒(R&D系统公司，Minneapolis，MN)和N＞5，在所有实验中测定IL-1β和IL-6水平。研究的结果表示在图2A-2C。

如图2A所示，从RAW264.7细胞释放的TNF随着给予细胞的B盒子的量提高而提高。如图2B所示，加入1μg/ml或10μg/ml的B盒子导致从RAW264.7细胞中IL-1β的释放增加。另外，如图2C所示，从RAW264.7细胞释放IL-6随着给予细胞的B盒子的量的提高而提高。

同时检测了B盒子诱导的TNF释放的动力学。仅仅用B盒子多肽或GST tag多肽用作对照(载体)(10μg/ml)诱导了0到48小时的RAW 264.7细胞中测定了TNF释放和TNF mRNA的表达。通过L929细胞毒性实验(N＝3-5)如上所述分析了上清液的TNF蛋白质水平。对于mRNA测定，在100mm平板中铺细胞，在含有B盒子多肽的Opti-MEMI培养基或载体单独处理细胞0，4，8或24小时，如图2D所示。在4小时的时间点测试载体唯一样品。从平板上刮下细胞，根据制造商的说明通过RNAzol B方法分离总的RNA(Tel-Test”B”，Inc.，Friendswood，TX)。通过Rnase保护实验(Ambion，Austin，TX)测定TNF(287bp)。通过琼脂糖甲醛的凝胶上的RNA样品的溴化乙锭染色证实RNA的等量的负载和整体性。Rnase保护实验的结果表示在图2D中。如图2D所示，B盒子激活单核细胞发生在基因转录水平，因为TNFmRNA在与B盒子蛋白质接触的单核细胞中明显增加(图2B)。TNFmRNA表达在4小时时最大，在8和24小时时降低。载体唯一对照(GST tag)显示对TNF mRNA表达没有效果。在给予B盒子或只给予载体(GST tag)后0，4，8，24，32或48小时，利用如本文所述的L929细胞毒性实验，测量从RAW264.7细胞释放TNF进行了相似的研究。比较对照(只是培养基)，B盒子处理刺激了TNF蛋白质的表达(图2F)，但载体单独(图2E)没有刺激。数据代表了三个分开的实验。和这些数据一起表明了，HMG1 B盒子区域具有细胞因子活性，并且负责刺激全长HMG1的活性的细胞因子。

概括地说，和全长HMG1的炎症活性一样，HMG1 B盒子依赖剂量地刺激TNF，IL-1β，和IL-6从单核细胞培养物中的释放(图2A-2C)(Andersson et al.，J.Exp.Med.192：565-570,2000)。另外，这些研究表明，最大的TNF蛋白质的释放发生在8小时内(图2F)。这一延迟的TNF释放的方式是与HMG1本身诱导的TNF释放相似的，并且明显比LPS诱导的TNF动力学延后(Andersson et al.，出处同上)。

实施例4：HMG1 B盒子的开始20个氨基酸刺激TNF活性

HMG1 B盒子的TNF刺激活性另外定位了。这一研究如下进行了。利用如本文所述的合成肽保护技术产生了B盒子片段。如图3所示产生了含有HMG1 B盒子的氨基酸1-20，16-25，30-49，45-64，或60-74的HMG1 B盒子片段(来自SEQ ID NO：20)。如图3所示，用B盒子(1μg/ml)或B盒子的合成肽片段(10μg/ml)处理细胞10小时，如本文所述测定了上清液中的TNF释放。数据表示为平均±SEM，(n＝3实验，各做成双份，用3个分开批次的合成肽证实)。如图3所示，通过对应于SEQ ID NO：20(fkdpnapkrlpsafflfcse；SEQ ID NO：16)的HMG1 B盒子的氨基酸1-20的合成肽保留TNF刺激活性。1-20体的TNF刺激活性比全长合成B盒子(1-74体)或全长HMG1潜力更小，但刺激效果是特异的，因为含有16-25，30-49，45-64，或60-74的氨基酸片段的HMG1 B盒子的合成性20体不诱导TNF的释放。这些结果是B盒子的巨噬细胞刺激活性特异地定位于SEQ ID NO：20的HMG B盒子区域的开始20个氨基酸的直接证据。这一B盒子片段可以用于相同的方法中，作为编码全长B盒子多肽的多肽，例如刺激炎症前细胞因子的释放，或治疗特征是激活炎症细胞因子级联的患者的症状。

实施例5：HMG1 A盒子蛋白质以剂量依赖方式

拮抗HMG1诱导的细胞因子活性

弱激动剂是定义为拮抗剂。因为HMG1 A盒子仅仅微弱地诱导了TNF的产生，如图1所示，评估了HMG1 A盒子作为HMG1活性的拮抗剂的能力。如下进行了这一研究。在存在多黏菌素B(100单位/ml)时的Opti-MEM I培养基中用HMG1(1μg/ml)和0、5、10或25μg/ml的A盒子处理24孔盘中的亚融合RAW 264.7细胞16小时。在不接受A盒子的样品中的TNF刺激活性(利用本文所述的L929细胞毒性实验)表达为100％，A盒子的抑制表达为HMG1单独的百分数。A盒子对从RAW264.7细胞释放TNF的效果的结果表示在图4A。如图4A所示，A盒子依赖剂量地抑制HMG诱导TNF释放，表观EC₅₀约为7.5μg/ml。图4A中的数据表示为平均±SD(n＝2-3个独立实验)。

实施例6：HMG1 A盒子蛋白质抑制全长的HMG1 和HMG1 B盒子细胞因子活性

通过共加入A盒子与全长HMG1刺激TNF从RAW264.7巨噬细胞培养物释放同样确定HMG1 A盒子或GST tag(载体对照)对全长HMG活性的拮抗。在24孔组织培养平板上播种RAW264.7巨噬细胞(ATCC)，在90％的融合度下利用。在存在多黏菌素B(100单位/ml，Sigma，St.Louis，MO)时的Opitimum I培养基(生命技术公司，Grand Island，NY)时用HMG1和/或A盒子处理细胞16小时，从收集上清液用于TNF测定(来自R&D系统公司，Minneapolis，MN)的小鼠ELISA试剂盒)。将TNF诱导活性表达为用HMG-1单独得到的活性的百分数。这些研究的结果表示在图4B中。图4B是HMG1，单独，A盒子单独，载体(对照)单独，HMG1结合A盒子，和HMG1结合载体的效果直方图。如图4B所示，HMG1 A盒子明显减弱了全长HMG1的TNF刺激活性。

实施例7：通过结合HMG1 A盒子蛋白质 抑制HMG1细胞因子活性

为了确定是否HMG1 A盒子可以通过替代HMG1结合来作为拮抗物，在巨噬细胞培养物中加入¹²⁵I标记的HMG1，在4℃测量结合2小时。如本文所述进行RAW264.7细胞中结合实验。在24孔的盘中平铺RAW264.7细胞中测定¹²⁵I-HMG1结合，时间如图5A所示。特异的结合显示了在存在5000倍的摩尔过量的未标记的HMG1时，与¹²⁵I-HMG1(CPM/孔)相关的总的细胞减去与CPM/孔相关的细胞。图5A是¹²⁵I-HMG1一段时间的结合的图。如图5所示，HMG1具有饱和的第一顺序结合动力学。结合的特异性如实施例1中所评估的。

另外，在24孔盘上铺的RAW264.7细胞中测定¹²⁵I-HMG1结合，和用¹²⁵I HMG1单独或存在未标记的HMG1或A盒子时温育。这一结合实验的结果表示在图5B中。数据表示为3个分开的实验中的平均±SEM。图5B是没有未标记的HMGB1或HMGB1(HMG1)A盒子，或存在5,000摩尔过量的未标记的HMGB1或HMGB1 A盒子时¹²⁵I HMGB1的细胞表面结合的直方图，测定为总的CPM/孔的百分数。在图5B中，“总共”等于在存在未标记的HMGB1或A盒子时，在4℃，结合¹²⁵I-HMGB1的细胞2小时的每分钟(CPM)/孔的计数。“HMGB1”或“A盒子”等于在存在5,000摩尔过量的未标记的HMGB1或A盒子时结合¹²⁵I-HMGB1的细胞的CPM/孔。数据表示为存在未标记的HMGB1蛋白质时得到的总计数(2,382,179CPM/孔)。这些结果表明，HMG1 A盒子是体外抑制HMG1的TNF刺激活性的HMG1活性竞争性拮抗剂。

实施例8：通过抗B盒子多克隆抗体抑制全长HMG1和 HMG1B盒子细胞因子活性

同时评估了直接抗HMG1 B盒子的抗体调节全长的或HMG1 B盒子的效果的能力。直接抗HMG1 B盒子(B盒子抗体)的亲和纯化抗体如本文所述利用标准技术产生了。为了评估抗体对HMG1-或HMG1 B盒子诱导的TNF从RAW264.7细胞中的释放的效果，用HMG-1(1μg/ml)或HMG1 B盒子(10μg/ml)处理24孔盘中的亚融合RAW264.7细胞10小时，可以有或可以没有抗B盒子抗体(25μg/ml或100μg/ml抗原亲和纯化，CocalicoBiological，Inc.，Reamstown，PA)或非免疫IgG(25μg/ml或100μg/ml；Sigma)的加入。利用L929细胞毒性实验，如本文所述测定从RAW264.7细胞释放TNF。这一研究的结果表示在图6中，是不给药，给药1μg/mlHMG1，1μg/ml HMG1+25μg/ml抗B盒子抗体，1μg/ml HMG1+25μg/ml IgG(对照)，10μg/ml B盒子，10μg/ml B盒子+100μg/ml抗B盒子抗体或10μg/ml B盒子+100μg/mlIgG(对照)时从RAW 264.7细胞释放TNF的直方图。从HMG1单独诱导(没有加入B盒子抗体)的细胞中释放的TNF的量设定为100％，数据表示在图6中，是3个独立的实验的结果。如图6所示，直接抗HMG1 B盒子的亲和纯化抗体明显抑制了全长HMG1或HMG1 B盒子诱导的TNF释放。这些结果表明，这样的抗体可以用于调节HMG1功能。

实施例9：HMG1 B盒子蛋白质是D半乳糖胺 -敏化Balb/c小鼠毒性物质

为了研究是否HMG1 B盒子在体内具有细胞因子活性，我们对未麻醉的用D半乳糖胺(D-gal)敏化的Balb/c小鼠，广泛用于研究细胞因子毒性的一个模型(Galanos et al.，出处同上)给药HMG1 B盒子蛋白质。简要地说，用D-gal(20mg)(Sigma)和B盒子(0.1mg/ml小鼠或1mg/ml小鼠)或GST tag(载体，0.1mg/ml小鼠或1mg/ml/小鼠)腹膜内注射小鼠(20-25g，雄性，Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IN)，如表1所示。在7天中检测小鼠的生存，保证没有后来的死亡。这一研究的结果表示在表1中。

表1：HMG1 B盒子对D半乳糖胺敏化的Balb/c小鼠的毒性

	处理	活着的/总
			对照	-	10/10
载体	0.1mg/小鼠	2/2
				1mg/小鼠	3/3
B盒子	0.1mg/小鼠	6/6
				1mg/小鼠	2/8*

P＜0.01是单独对载体的，如Fisher’s萃取实验所测试的。

这一研究的结果显示，HMG1 B盒子是在依赖剂量的方式下对D-半乳糖胺敏化的小鼠致死的。在所有发生死亡的情况中，死亡是在12小时内发生的。在用没有B盒子的纯化GST载体蛋白质的可比较制剂处理的小鼠中没有观察到死亡。

实施例10：给药HMG1 B盒子蛋白质的D-半乳糖胺 敏化的Balb/c小鼠或C3H/HeJ小鼠的组织学

为了进一步评估体内HMG1 B盒子蛋白质的死亡率，再次对B半乳糖胺敏化Balb/c小鼠给药HMG1 B盒子。小鼠(每组3个)腹膜内接受D-gal(20mg/小鼠)+B盒子或载体(1mg/小鼠)7小时，然后断头杀死。收集血液，收集器官(肝，心脏，肾脏和肺)，在10％的甲醛中固定。用苏木精和曙红染色制备组织切片，用于组织学评估(Criterion Inc.，Vancouver，Canada)。这些研究的结果表示在图7A-7J，是苏木精和曙红染色的从未处理的小鼠得到的肾脏切片(图7A)，心肌切片(图7C)，肺切片(图7E)和肝切片(图7G和7I)和用HMG1 B盒子处理的肾脏切片(图7B)，心肌切片(图7D)，肺切片(图7F)，和肝切片(图7H和7J)的扫描成象。与对照小鼠比较，B盒子处理没有引起肾脏(图7A和7B)和肺(图7E和7F)的不正常。小鼠在心脏的心肌纤维中具有一些缺血变化和交叉条纹的丢失(图7C和7D，如图7D的箭头所示)。如活性肝炎所示，肝显示了B盒子有最大的损伤(图7G-7J)。在图7J中，可以看到肝细胞滴周围有积累的多形核白细胞。图7J中的箭头点到了多形核积累(点)或细胞程序死亡的肝细胞(块)的位置。在体内给药HMG1 B盒子也明显刺激了IL-6(315+93对20+7pg/ml，B盒子对应对照，p＜0.05)和IL-1β(15+3对应于4+1pg/ml，B盒子对应于对照，p＜0.05)的血清水平有明显的提高。

对C3H/HeJ小鼠(不应答内毒素)给药B盒子蛋白质也是致死的，表明在没有LPS信号转导时HMG1 B盒子是致死的。在给药B盒子后8小时收集苏木精和曙红染色的肺和肾脏切片表明没有不正常的形态学变化。但是，检测来自心脏的切片发现了局部缺血的证据，其中有心肌纤维中无定形粉红色细胞质结合的交叉条纹的丢失。来自肝的切片显示了温和急性的炎症应答，其中有一些肝细胞滴出和细胞程序死亡，和偶尔的多形核白细胞。这些特异的病理变化在给药全长HMG1后是可以和观察到的那些比较的，证实B盒子单独可以重新表现对HMG1的体内致死病理应答的。

为了证实HMG1的TNF刺激活性是否对B盒子介导的致死有作用，我们测量了TNF敲出的小鼠(TNF-KO，Nowak et al.，Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.278：R1202-R1209，2000)和用D半乳糖胺(20mg/小鼠)敏化和接触B盒子(1mg/小鼠，腹膜注射)的野生型对照(B6×129菌株)。B盒子对野生型小鼠是高度致死的(9个接触的小鼠中死了6个)，但在用B盒子处理的人TNF-KO小鼠中没有观察到死亡(9个接触的小鼠中0个死亡，p＜0.05v.野生型)。和本文所述的来自RAW 264.7巨噬细胞培养物的数据一并，这些数据现在表明，HMG1的B盒子给予了特异的TNF刺激细胞因子活性。

实施例11：HMG1蛋白质水平在脓毒小鼠中升高

为了检测脓毒小鼠中HMG1的作用，我们鉴定了小鼠中的脓毒，并且利用前面所述的定量免疫测试测定了血清HMG1(Wanget al.，出处同上)。将小鼠进行盲肠连接和穿刺(CLP)，这是一个已经鉴定的穿刺外科产生的盲肠憩室的脓毒模型，导致了多微生物腹膜炎和脓毒(Fink and Heard，出处同上；Wickmann et al.，出处同上；和Remick et al.，出处同上)。然后，测量HMG1的血清水平(Wang et al.，出处同上)。图8显示了在说明了在进行CLP后0小时，8小时，18小时，24小时，48小时，和72小时时小鼠中的HMG1水平的图中的这一研究的结果。如图8所示，在盲肠穿刺后开始的8小时血清HMG1水平没有明显提高，然后在18小时后明显提高(图8)。提高的血清HMG1仍然在CLP后72小时保留了提高的平台水平，是与前面所述的十分相似的动力学方案，内毒缺血中的延迟的HMG1动力学(Wang et al.，出处同上)。这一暂时的HMG1释放方案紧密应对了小鼠中脓毒的信号的发展。在盲肠穿刺的开始8小时中，观察到动物是轻微病态了，有一些活力减退和搜索行为减弱。在18小时后，动物变得重度病态，挤作一团，毛竖着，不找水或食物，用手检查变得对外部刺激或用手检查的反应很小。

实施例12：用HMG1 A盒子蛋白质处理

      脓毒小鼠提高了小鼠的生存

为了确定是否HMG1 A盒子可以抑制脓毒过程中HMG1的致死率，将小鼠进行盲肠穿刺，在启动脓毒后24小时开始给药A盒子处理。如上所述对雄性Balb/c小鼠进行CLP。任意组合动物，每组15到25个小鼠。在CLP后24小时开始，腹膜内单独给药HMG1 A盒子(每次60或600μg/小鼠)或载体(GST tag，600μg/小鼠)，每天2次，共3天。这一研究的结果说明在图9，是载体(GST；对照)60ug/小鼠或600μg/小鼠对生存在一段时间内的效果(^*P＜0.03，如Fisher’s萃取实验是相对于对照的)。如图9所示，给药HMG1 A盒子明显能从脓毒的致死效果中拯救小鼠，并且提高用没有A盒子的载体蛋白质(GST)纯化的蛋白质处理的动物的生存率从28％到接受A盒子的动物中的68％(Fischer’s萃取实验的P＜0.03)。在这一脓毒模型中拯救HMG1 A盒子的效果是依赖A盒子剂量的；用600μg/小鼠处理的动物观察到比用载体起源的制剂处理的对照，或与仅60μg A盒子处理的动物是明显更警觉，更有活力并且恢复了食物行为。后面的得动物仍然严重病态，活力抑制，喂食几天大部分死亡。

实施例13：用抗HMG1抗体处理脓毒小鼠

           提高了小鼠的生存

同时评估了用抗HMG1抗体被动免疫的重病脓毒小鼠。在这一研究中，如本文所述，将雄性Balb/c小鼠(20-25gm)进行CLP。在外科手术后24小时开始以600μg/小鼠给药亲和纯化的抗-HMG1 B盒子多克隆抗体或兔子IgG(作为对照)，每天2次3天。检测生存2星期。这一研究的结果表示在图10A中，是用对照抗体或抗HMG1抗体处理的脓毒小鼠的生存的图。结果显示，在开始盲肠穿刺后24小时对小鼠给药抗HMG1抗体明显地能从死亡拯救动物，这可以与给药非免疫抗体比较(Fisher萃取实验的p＜0.02)。在给药抗HMG1抗体后12小时，与接受非免疫抗体体的对照相比，处理动物显示活力和应答提高。而用非免疫抗体处理的动物仍然挤作一团，病态，没有活力，处理的动物明显有改善，并且在48小时内恢复了正常饮食。抗HMG1抗体在这一模型中不抑制细菌繁殖，因为我们观察到，与接受相关抗体的动物(对照细菌数＝3.5±0.9×10⁴CFU/g；n＝7)比较，处理动物中CLP后31小时，脾中有可比较的细菌数(CFU，需氧菌落形成单位)。然后检测动物2星期，没有观察到以后还有死亡，表明用抗HMG1处理能完全拯救致死脓毒，不仅仅是延迟死亡。

就我们的知识，当在脓毒开始后很迟给药时，没有其他涉及特异细胞因子的治疗是有效的。通过比较，在这一模型中给药抗TNF确实提高了致死率，如果在盲肠穿孔后8小时多才给药抗MIF抗体是无效的(Remick et al.，出处同上；Calandra et al.，Nature Med.6：164-170，2000)。这些数据证明，HMG可以在盲肠穿孔后24小时时达到挽救已确定的脓毒的致死情况。

在利用抗B盒子抗体的内毒症小鼠的挽救另一个例子中，评估抗HMG1 B盒子抗体恢复LPS诱导的脓毒小鼠的能力。腹膜内注射，用LPS的LD75剂量(15mg/kg)处理雄性Balb/c小鼠(20-25gm，26每组)。在LPS给药后时间0，+12小时，+24小时给予看HMG1 B盒子或非免疫兔血清(每次0.3ml每个小鼠，IP)。在一段时间评估小鼠的生存。这一研究的结果表示在图10B，是给药看HMG1 B盒子抗体或非免疫血清的脓毒小鼠的生存图。如图10B所示，抗HMG1 B盒子抗体提高了脓毒小鼠的生存。

实施例14：利用抗RAGB抗体的抑制HMG1信号途径

前面的数据表明，RAGE作为HMG1的受体可以脑发育和伤口愈合中光滑肌细胞的迁移过程中的轴突的外生长(Hori et al.，J.Biol.Chem.270：25752-25761，1995；Merenmies et al.J.Bio.Chem.266：16722-16729，1991；and Degryse et al.，J.Cell Biol.152：1197-1206，2001)。在存在抗RAGE抗体(25μg/ml)或非免疫IgG(25μg/ml)时，我们测量用HMG1(1μg/ml)，LPS(0.1μg/ml)，或HMG1 B盒子(1μg/ml)刺激RAW264.7培养物中的TNF的释放。简要地说，在24孔的组织培养平板上播种细胞，并且在90％的融合度时利用。在使用之前，超声波处理LPS(大肠杆菌0111：B4，Sigma，St Louis，MO)20分钟。在存在如图11A所示的抗RAGE抗体(25μg/ml)或非免疫IgG(25μg/ml)时，在无血清的Opti-MEM I培养基(生命技术公司)时，用HMG(1μg/ml)，LPS(0.1μg/ml)，或HMG1 B盒子(1μg/ml)处理细胞16小时，回收上清液用于利用如本文所述的L929细胞毒性实验进行的TNF测定。在使用之前对PBS广泛地透析IgG纯化的多克隆抗RAGE抗体(Catalog号sc-8230，N-16，Santa Cruz Biotech，Inc.，SantaCruz，CA)。这一研究的结果表示在图11A，这是在存在抗RAGE抗体或非免疫IgG(对照)时，HMG1，LPS，或HMG1 B盒子对从RAW264.7细胞中释放TNF的效果的直方图。如图11A所示，与非免疫IgG比较，抗RAGE抗体明显抑制HMG1 B盒子诱导的TNF释放。这一抑制效果是特异的，因为抗RAGE没有明显抑制LPS刺激的TNF的释放。很显然，抗RAGE的最大抑制效果降低HMG-1发信号仅40％，表明其他信号转导途径可能参与了HMG1发信号。

为了检测HMG1或HMG B盒子对NF-kB依赖的ELAM启动子的效果，进行了下面的实验。如Means et al.所述(J.Immunol.166：4074-4082，2001)，在NF-kB依赖ELAM启动子的控制下，用编码小鼠MyD 88优势阴性(DN)突变体(对应于氨基酸146-296)，或空载体，和荧光酶报道质粒短暂共转染RAW264.7巨噬细胞。用全长的HMG1(100ng/ml)或纯化的HMG1B盒子(10μg/ml)刺激细胞部分5小时。然后收获细胞，利用标准方法测定荧光酶的活性。所有转染过程进行一式三份，至少重复三次，单个的代表性实验表示在图11B中。如图11B所示，HMG1刺激没有用MyD88优势阴性共转染的样品中的荧光酶活性，在用MyD88优势阴性共转染的样品中刺激水平降低。这一效果也在给药HMGB盒子的样品中观察到了。

同时检测了HMG1或HMG1 B盒子对NF-kB激活的效果。前面已经叙述了构成性地表达人Toll类似受体2(TLR2)或Toll类似受体4(TLR4)的CHO受体细胞系(Mean et al.，J.Immunology，163：3920-3927，1999)。这些受体系同样含有温度转染的ELAM-CD25受体基因，并且作为NF-kB激活的结果在它们的表面上表达人CD25。用IL-1(10ng/ml)，纯化的全长HMG-1(100ng/ml)，或纯化的B盒子(10μg/ml)刺激CHO/TLR2和CHO/TLR4细胞18小时。在刺激后，用PE标记的抗CD25单克隆抗体染色细胞，和通过流动细胞计测定CD25的表面表达。这一研究的结果表示在图11C。数据表示为根据平均的FL1荧光，排除了最低的5％的细胞后未刺激和刺激的细胞群体中CD25+细胞的百分数的比例(激活倍数)。与CHO/TLR2样品比较，在CHO/TLR4细胞中，用HMG1和HMG1 B盒子刺激导致CD25表达的降低。

同时测定了抗RAGE抗体，抗TLR2抗体，抗RAGE抗体和抗TLR2抗体或IgG对HMG1介导的RAW264.7细胞中TNF的释放的效果。在24孔组织培养平板上播种了RAW264.7细胞，并且在90％融合度时利用。用有或没有抗RAGE抗体(Cat#sc-8230，Santa Cruz Biotech Inc.，Santa Cruz，CA)，抗TLR2抗体(亲和纯化的多克隆抗体，Cat#sc-12540，D17，Santa Cruz)或IgG(非免疫IgG，Sigma，St.Louis，MO)在Optimum I培养基(生命技术公司，Grand Island，NY)在存在多黏菌素B(100单位/ml，Sigma，St.Louis，MO)时温育细胞16小时。在使用之前对PBS透析抗体，除去迭氮化钠。回收调节培养基，利用标准的ELISA方法进行TNF ELISA。数据(n＝3)表示为用HMG-1单独得到的活性的百分数。这一研究的结果表示在图11D。抗RAGE和抗TLR2抗体明显(^*p＜0.05)抑制HMG1介导的TNF释放。两个抗体的结合在抑制TNF释放时具有附加的效果，而IgG是不相干的。

参考优选的实施方案本发明已经特定地显示和叙述了，本领域技术人员将能理解，不脱离本发明的附加的权利要求的范围可以进行各种形式和细节的变化。

序列表

<110>北岸长岛犹太人研究学院

     通用医院有限公司

     匹兹堡大学

     凯文·J·翠西

     杨欢

     小郝兰德·绍·沃伦

     米切尔·P·芬克

<120>利用HMG片段作为抗炎症试剂

<130>3268.1001004

<140>PCT/US02/15329

<141>2002-05-15

    <150>60/291,034

<151>2001-05-15

<160>23

<170>FastSEQ的Windows4.0版

<210>1

<211>215

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Met G1y Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr

1                   5                   10                       15

Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro

               20                   25                      30

Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg

         35                     40                      45

Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala

    50                      55                      60

Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro

65                      70                      75                80

Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys

                     85                     90                  95

Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys

               100                     105                  110

Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys

          115                     120                    125

Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr

       130                    135                  140

Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala

145                    150                     155                 160

Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val

                  165                      170                 175

Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu

             180                       185                   190

Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu

        195                       200                 205

Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu

    210                     215

<210>2

<211>215

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>2

Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr

1                   5                   10                      15

Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro

              20                     25                      30

Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg

        35                      40                      45

Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala

    50                      55                      60

Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro

65                      70                      75                  80

Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys

                    85                      90                  95

Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys

               100                     105                  110

Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys

          115                     120                 125

Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr

      130                     135                 140

Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala

145                      150                   155                 160

Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val

                    165                 170                     175

Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu

                  180                 185                 190

Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu

              195                 200                 205

Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu

    210                   215

<210>3

<211>209

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>3

Met Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr

1                   5                      10                    15

Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro

               20                    25                     30

Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg

           35                     40                    45

Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Ser Lys Phe Glu Asp Met Ala

    50                       55                     60

Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro

65                      70                      75                  80

Pro Lys Gly Asp Lys Lys Gly Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys

                   85                      90                   95

Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu His Arg Pro Lys

              100                     105                   110

Ile Lys Ser Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys Lys

         115                      120                     125

Leu Gly Glu Met Trp Ser Glu Gln Ser Ala Lys Asp Lys Gln Pro Tyr

    130                     135                     140

Glu Gln Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala

145                      150                    155                160

Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Ser Glu Ala Gly Lys Lys Gly Pro Gly

                    165                     170                 175

Arg Pro Thr Gly Ser Lys Lys Lys Asn Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu

              180                     185                   190

Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu

        195                     200                    205

Glu

<210>4

<211>54

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>4

Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu

1                   5                      10                  15

Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met

              20                      25                    30

Ala Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile

        35                       40                     45

Pro Pro Lys Gly Glu Thr

    50

<210>5

<211>69

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>5

Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu

1                   5                      10                  15

Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp

               20                     25                    30

Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp

          35                      40                    45

Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu

    50                      55                      60

Lys Asp Ile Ala Ala

65

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>6

gatgggcaaa ggagatccta ag                                                 22

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>7

gcggccgctt attcatcatc atcatcttc                                          29

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>8

gatgggcaaa ggagatccta ag                                              22

<210>9

<211>32

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>9

gcggccgctc acttgctttt ttcagccttg ac                                   32

<210>10

<2ll>21

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>10

gagcataaga agaagcaccc a                                               21

<210>11

<211>32

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>ll

gcggccgctc acttgctttt ttcagccttg ac                                   32

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>12

aagttcaagg atcccaatgc aaag                                            24

<210>13

<211>32

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>13

gcggccgctc aatatgcagc tatatccttt tc                                             32

<210>14

<211>22

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>14

gatgggcaaa ggagatccta ag                                                        22

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>15

tcactttttt gtctcccctt tggg                                                      24

<210>16

<211>20

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>16

Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Leu Pro Ser Ala Phe Phe Leu

1                   5                      10                  15

Phe Cys Ser Glu

            20

<210>17

<211>54

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>17

Pro Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu

1                   5                     10                    15

Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Ser Lys Phe Glu Asp Met

              20                      25                    30

Ala Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val

        35                      40                      45

Pro Pro Lys Gly Asp Lys

    50

<210>18

<211>216

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>18

Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Thr Gly Lys Met Ser Ser Tyr

1                   5                      10                  15

Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro

              20                      25                    30

Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg

        35                      40                      45

Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala

    50                      55                      60

Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro

65                      70                      75                  80

Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys

                     85                   90                     95

Arg Leu Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys

              100                     105                    110

Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys

         115                      120                     125

Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr

     130                    135                    140

Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala

145                     150                     155                160

Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val

                    165                     170                 175

Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu

              180                      185                  190

Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp

        195                     200                   205

Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu

    210                   215

<210>19

<211>182

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>19

Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Thr Gly Lys Met Ser Ser Tyr

1                   5                      10                  15

Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro

              20                      25                    30

Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg

        35                      40                      45

Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala

    50                      55                      60

Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro

65                      70                    75                  80

Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys

                    85                    90                   95

Arg Leu Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys

              100                    105                    110

Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys

          115                     120                    125

Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr

    130                     135                    140

Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala

145                     150                     155                 160

Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val

                    165                     170                 175

Lys Ala Glu Lys Ser Lys

              180

<210>20

<211>74

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>20

Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Leu Pro Ser Ala Phe Phe Leu

1                   5                     10                   15

Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu

               20                     25                    30

Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr

           35                     40                    45

Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys

    50                      55                      60

Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr

65                      70

<210>21

<211>85

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>21

Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Thr Gly Lys Met Ser Ser Tyr

1                   5                     10                   15

Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro

            20                      25                      30

Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg

        35                     40                       45

Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala

    50                      55                     60

Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro

65                      70                      75                  80

Pro Lys Gly Glu Thr

                85

<210>22

<211>77

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>22

Pro Thr Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg

1                   5                     10                    15

Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu

              20                       25                   30

Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu

          35                      40                    45

Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu

    50                      55                      60

Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro Pro Lys Gly Glu Thr

65                      70                      75

<210>23

<211>20

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>23

Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu

1                   5                     10                   15

Tyr Arg Pro Lys

            20

Claims (24)

1.一种多肽，其包括脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)A盒子或非天然存在的HMG A盒子，可以抑制炎症前细胞因子从高流动组(HMG)蛋白质处理的脊椎动物细胞中的释放。

2.一种多肽，其中多肽是脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)A盒子生物活性片段或非天然存在的HMG A盒子生物活性片段，可以抑制炎症前细胞因子从用高流动组(HMG)蛋白质处理的脊椎动物细胞中的释放。

3.一种含有多肽的组合物，包括脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)A盒子或非天然存在的HMG A盒子，可以抑制炎症前细胞因子从用药物可接受赋形剂中的高流动组(HMG)蛋白质处理的脊椎动物细胞中的释放。

4.一种含有多肽的组合物，其中多肽是脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)A盒子生物活性片段或非天然存在的HMG A盒子生物活性片段，可以抑制炎症前细胞因子从用药物可接受赋形剂中的高流动组(HMG)蛋白质处理的脊椎动物细胞中的释放。

5.一种抗体的纯化制剂，所述的抗体特异地结合脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子但不特异结合HMG的非B盒子表位，其中抗体可以抑制炎症前细胞因子从用HMG处理的脊椎动物细胞中的释放。

6.一种组合物，其含有特异地结合脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子但不特异结合药物赋形剂中的HMG的非B盒子表位额抗体的纯化制剂，其中抗体可以抑制炎症前细胞因子从用HMG处理的脊椎动物细胞中的释放。

7.一种多肽，其含有脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子或非天然存在的HMG B盒子，但不含有全长HMG，其中多肽可以引起炎症前细胞因子从脊椎动物细胞中释放。

8.一种多肽，其中多肽是脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子生物活性片段或非天然存在的HMG B盒子生物活性片段。

9.一种编码多肽的载体，含有脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子或非天然存在的HMG B盒子，但不包括全长的HMG，其中多肽可以引起炎症前细胞因子从脊椎动物细胞中释放。

10.一种编码多肽的载体，其中多肽是脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子生物活性片段，或非天然存在的HMG B盒子生物活性片段，其中多肽可以引起炎症前细胞因子从脊椎动物细胞中释放。

11.一种抑制炎症前细胞因子从哺乳动物细胞中释放的方法，该方法包括用特异地结合脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子，但不特异结合HMG的非B盒子表位量的抗体的纯化制剂处理细胞。

12.一种抑制炎症前细胞因子从哺乳动物细胞中的释放的方法，该方法包括用含有脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)A盒子或非天然存在的HMGA盒子的多肽处理细胞的方法，可以抑制炎症前细胞因子从用足以抑制炎症前细胞因子从细胞中释放的量的高流动组(HMG)蛋白质处理的脊椎动物细胞中的释放。

13.一种抑制炎症前细胞因子从哺乳动物细胞中释放的方法，该方法包括用多肽处理细胞，其中多肽是脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)A盒子生物活性片段或非天然存在的HMG A盒子生物活性片段，可以抑制炎症前细胞因子从用足以抑制炎症前细胞因子从细胞释放的量的高流动组(HMG)蛋白质处理的脊椎动物细胞中的释放。

14.一种治疗特征是炎症细胞因子级联激活的患者的症状的方法，包括对患者给药足以抑制炎症细胞因子级联的量的特异结婚脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子但不特异结合HMG的非B盒子表位的抗体的纯化制剂。

15.一种治疗特征是炎症细胞因子级联激活的患者中的症状的方法，包括对患者给药多肽，多肽含义脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)A盒子或非天然存在HMG A盒子的多肽，可以抑制炎症前细胞因子从用足以抑制炎症前细胞因子从细胞中释放的量的高流动组(HMG)蛋白质处理的脊椎动物细胞中释放。

16.一种治疗特征是炎症细胞因子级联激活的患者中的症状的方法，包括对患者给药多肽，其中多肽是脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)A盒子生物活性片段或非天然存在的HMG A盒子生物活性片段，可以抑制用足以抑制炎症前细胞因子从细胞中释放的量的高流动组(HMG)蛋白质处理脊椎动物细胞中的释放。

17.一种刺激炎症前细胞因子从细胞中释放的方法，包括用足以刺激炎症前细胞因子从细胞中释放的量的含有脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子或非天然存在的HMG B盒子，但不合有全长的HMG的多肽处理细胞。

18.一种刺激炎症前细胞因子从细胞中释放的方法，包括用多肽处理细胞，其中多肽是脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子生物活性片段或非天然存在的HMG B盒子生物活性片段，处理的量是足以刺激炎症前细胞因子从细胞中释放的量。

19.一种刺激炎症前细胞因子从细胞中释放的方法，包括用编码多肽的载体处理细胞，多肽包括脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子或非天然存在的HMG B盒子，但不含有全长HMG，处理的量是足以刺激炎症前细胞因子从细胞中释放的量。

20.一种刺激炎症前细胞因子从细胞中释放的方法，该方法包括用编码多肽的载体处理细胞，其中多肽是脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子生物活性片段或非天然存在的HMG B盒子生物活性片段，处理的量是足以刺激炎症前细胞因子从细胞中释放的量。

21.一种有效减轻体重或治疗患者的肥胖的方法，包括对患者给药有效量的多肽，多肽含有脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子或非天然存在的HMG B盒子，但不含有全长HMG多肽，处理的量是足以刺激炎症前细胞因子从细胞中释放的量。

22.一种有效减轻体重或治疗患者肥胖的方法，包括对患者给药有效量的多肽，其中多肽是脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子生物活性片段，或非天然存在的HMG B盒子生物活性片段，给药的量是足以刺激炎症前细胞因子从细胞中释放的量。

23.一种确定是否化合物抑制炎症的方法，包括将化合物与(a)当与脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子接触时释放炎症前细胞因子的细胞和(b)HMG B盒子结合，然后确定是否化合物抑制炎症前细胞因子从细胞中释放。

24.一种确定化合物是否抑制炎症，包括将化合物与(a)当与脊椎动物高流动组蛋白质(HMG)B盒子或其生物活性片段接触时释放炎症前细胞因子的细胞；和(b)HMG B盒子或其生物活性片段结合，然后确定是否化合物抑制炎症前细胞因子从细胞中释放。

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