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CN1507458A - 水溶性任意取代的部分n-,部分o-乙酰化壳聚糖,含有壳聚糖的防腐组合物及其制备方法 - Google Patents

水溶性任意取代的部分n-,部分o-乙酰化壳聚糖,含有壳聚糖的防腐组合物及其制备方法 Download PDF

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CN1507458A
CN1507458A CNA018232736A CN01823273A CN1507458A CN 1507458 A CN1507458 A CN 1507458A CN A018232736 A CNA018232736 A CN A018232736A CN 01823273 A CN01823273 A CN 01823273A CN 1507458 A CN1507458 A CN 1507458A
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Abstract

本发明涉及一种水溶性任意取代的部分N－，部分O－乙酰化壳聚糖或壳聚糖衍生物，以及水溶性任意取代的部分N－，部分O－乙酰化壳聚糖或壳聚糖衍生物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：将壳聚糖或壳聚糖衍生物溶解于酸性水溶液中，在相转移试剂的存在下使壳聚糖或壳聚糖衍生物与乙酰化试剂发生反应。该组合物包括：(a)至少一种壳聚糖或壳聚糖衍生物，以及(b)至少一种缓冲溶液，本发明还涉及采用该类组合物对隐形眼镜溶液进行防腐和对隐形眼镜进行消毒的方法。

Description

水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化壳聚糖，含有壳聚糖的防 腐组合物及其制备方法
相关申请的交叉引用
本申请为申请序列号为09/838,528，申请日为2001年4月19日的美国申请的部分继续申请，其中该申请序列号为09/838,528的美国申请又是申请序列号09/611,160，申请日为2000年7月6日的美国申请的部分继续申请，其优先权为申请序列号为60/199,406，申请日为2000年4月21日，以及申请序列号为60/202,548，申请日为2000年5月10日的美国临时申请，将它们完整地列于此以作参考。
技术领域
本发明涉及一种新型水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖或其衍生物，以及包括水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖、壳聚糖或其衍生物的防腐组合物，还涉及水溶性任意取代的部分N-、部分O-乙酰化的壳聚糖、壳聚糖或其衍生物的新型制备方法。
背景技术
打开后重复使用的眼科产品，即“多剂量”产品，必须经过防腐处理以使在使用中的微生物污染最小化。用于眼科溶液的防腐剂通常会刺激眼睛，且最糟糕的是，可能会在重复使用后破坏眼组织。这种曾置于眼镜护理液的防腐剂中的隐形眼镜会成为眼睛中集中防腐剂的地方，那么隐形眼镜溶液中的防腐问题可能变得更加严重。
在美国，人们所接受的保存的药用产品，包括用于眼科、鼻科和耳科的制剂，在使用United States Pharmacopoeia Presevative EfficacyTest(PET)方法进行测试时，必须达到最低的性能标准。根据PET方案，在接种后的14天和28天之内，保存的制剂必须将第0天的接种物和第14天的再接种物，即细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和大肠杆菌的量减少至少99.99％(3对数)。在PET的真菌接种部分，保存的制剂不允许黑曲霉(Aspergillus niger)和白色念珠菌(Candida albicans)在0天接种之后的14天和28天内生长。为证明隐形眼镜护理产品的防腐效力，FDA要求采用一种改进的PET方法，其中在14天生物浓度确定之后，对所测试的溶液在第14天进行再接种。
壳聚糖，即壳多糖(chitin)的脱乙酰产物，是一种无毒性的生物高聚物，具有较弱的抗微生物活性。迄今为止，用壳聚糖来保存药物组合物受其在pH大于6条件下的不溶解性所阻碍，同时壳聚糖在酸性溶液中的抗微生物活性本身太低而不能满足PET的要求。壳聚糖在中性pH附近的水溶性可通过采用亲水性官能团进行衍生化而得以改进，如使用羧甲基或二醇取代基，或通过对商业化的壳聚糖进行选择性N-乙酰化而得以改进。
人们为提高壳聚糖在中性pH值附近的水溶性付出了大量的努力。Sannan，et al.，Makromol Chem.177，3589(1976)中报道了在均匀的条件下用碱处理壳多糖，约50％脱乙酰化的壳多糖变得具有水溶性。然而在某些阶段，需要很长的反应时间和大量的溶剂，包括中和反应混合物以及除去产生的盐。这种费力的方法特别在大型生产中带来了麻烦。
Kurita et al.，Carbohydrate Polymers 16，83(1991)也公开了通过采用包括乙酸水溶液/甲醇/吡啶的复合溶剂系统，对90％脱乙酰化的壳聚糖进行进行乙酰化，制备约50％N-乙酰化的水溶性壳聚糖的方法。Kuiritaet al.描述了如果乙酰化程度控制在50％且乙酰基基团随机分布，则所得到的部分N-乙酰化的壳聚糖是水溶性的。然而，Kuirta方法中过量使用吡啶溶剂使得该方法不具有可实践性。进一步地，由于采用不均匀的反应条件限制了均匀和任意的乙酰化反应，因此反应产物在中性pH值处具有有限的水溶性。特别是，Kurita’s壳聚糖反应物在反应混合物中不溶，却以膨胀的凝胶形式分散，这防碍了反应位点的完全利用。在此情况下，乙酰化反应优选在绝大部分曝露于反应混合物中且自由的链片断上进行，而其它部分的凝胶由于来自于相邻聚合物链片断的位阻影响而导致被乙酰化的程度相对较小。作为一个整体，聚合物链并非均一随机的，而是包括了高度乙酰化和低度乙酰化的区段。
Kubota et al.，Polymer Journal.29，123(1997)报道了水溶性N-乙酰化壳聚糖的较容易的制备方法。在该参考文献中，壳聚糖通过NaBO3处理而降解，且降解的产品随后被乙酸水溶液中的乙酸酐所N-乙酰化。由于壳聚糖的物理-化学以及生物性质都取决于聚合物的化学性质，如确定量的乙酰基团的随机分布和聚合物的分子量，因此涉及解聚的方法可能会导致壳聚糖生物性质的改变。
发明概述
本发明涉及一种药用防腐组合物，包括：(a)至少一种壳聚糖或壳聚糖衍生物，以及(b)至少一种缓冲溶液。
本发明进一步涉及一种对隐形眼镜溶液进行防腐处理的方法，包括混合隐形眼镜溶液和一种组合物，该组合物包括(a)至少一种壳聚糖或壳聚糖衍生物和(b)至少一种缓冲溶液。
此外，本发明还涉及一种对隐形眼镜进行消毒的方法，包括将隐形眼镜在组合物中浸泡一段时间，该组合物包括(a)至少一种壳聚糖或壳聚糖衍生物和(b)至少一种缓冲溶液。
本发明也涉及一种组合物，包括(a)至少一种壳聚糖或壳聚糖衍生物，以及(b)至少一种缓冲溶液，其中至少一种壳聚糖或壳聚糖衍生物由以下方法制备：将至少一种壳聚糖或壳聚糖衍生物溶解于酸性水溶液中，并在一种相转移剂的存在条件下，使乙酰化试剂和壳聚糖进行反应。
本发明进一步涉及一种制备水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖或壳聚糖衍生物的方法，包括将至少一种壳聚糖或壳聚糖衍生物溶解于酸性水溶液中，并在一种相转移剂的存在条件下，使乙酰化试剂和壳聚糖进行反应。进一步地，本发明涉及由该方法制备而得的产品。
本发明进一步涉及一种通式(I)所示的水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖或其衍生物，
其中R1，R2和R3独立为H或C(O)CH3，壳聚糖或其衍生物被部分乙酰化，使得R1的C(O)CH3取代程度为24到55％，R2的C(O)CH3取代程度为1到60％，m大于25，其中部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖或其衍生物被任意取代且具有水溶性。
在另一方面，本发明提供了一种药用防腐组合物，包括：
(a)至少一种通式(I)所示的水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖或其衍生物，
(b)以及至少一种缓冲溶液。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种药用防腐组合物，包括由混合上述的成分(a)和(b)而得到的产物。
本发明的另一方面提供了一种药用防腐组合物，包括：
(a)至少一种水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖或衍生物，
(b)以及至少一种缓冲溶液，
其中，至少一种水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖或壳聚糖衍生物由以下方法制备：在溶剂中使碱和至少一种任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖进行反应。
在另一方面，本发明提供了一种包含上述药用防腐组合物的隐形眼镜溶液。
在另一方面，本发明提供了一种隐形眼镜溶液，包括上述组分(a)和(b)混合而形成的产物。
在另一方面，本发明提供了一种制备水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖或壳聚糖衍生物的方法，包括在溶剂中使碱和一种任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖进行反应。
在另一方面，本发明提供了一种在溶剂中使碱和一种任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖进行反应制备而得的产品。
在另一方面，本发明提供了一种由本发明的方法制备而得的产品。
本发明的其它优点中的一部分将在以下的描述的加以阐述，而另一部分是从说明书出发显而易见，或是可通过实施本发明而获悉。通过后附的权利要求书中明确指出的要素以及组合，本发明的优点就能实现和达到。应该理解以上的发明概述和以下的发明详述仅为示例性和阐释性的，而并非对本发明的限定。
发明详述
通过参照以下本发明优选实施方式的详细描述以及所包括的实施例，可更容易理解本发明。
在公开和描述本发明的化合物，组合物，产品，装置，和/或方法之前，应该理解本发明并非限定于特定的合成方法，而是可以多种多样的。也应该理解此处所用的术语仅用于描述特定的实施方式而并非是限定性的。
如说明书和权利要求书所采用的，单一形式的“一”以及“这”包括复数指代，除非上下文有清楚的相反说明。例如，“一酰基”包括酰基基团的混合物，而“一卤素”包括两个或多个卤素原子的混合物，等等。
范围在此处可表达为从“约”某一特定值，和/或到“约”另一特定值。当表达此类范围时，另一种实施方式包括从某一特定值和/或到另一特定值。类似地，当采用前述的“约”来表达近似值时，应该理解特定值形成了其它的实施方式。应该进一步理解的是，每个范围的端点无论是与另一端点相联系，还是独立于另一端点，都是很重要的。
在说明书及其以下的权利要求书中，请参照具有下述意义的多个术语：
说明书和权利要求书中所指组合物或产品中的某一特定要素或组分的重量份，是指要素或组分和组合物或产品中任一其它要素或组分之间的关系，以重量份表达。因此，在包括2重量份的组分X，5重量份的组分Y的化合物中，X和Y的重量比为2∶5，无论化合物中所包含的其它组分如何，X和Y总是保持该比率。
组分的重量百分比，除非有特别的相反说明，都基于包含该组分的组合物配方的总重量。
“酸性水溶液”是指pH值低于7.0的水溶液。
术语化合物或物质(property)的“有效量”是指能实现化合物或物质的功能的量，用有效量来表达。所需的确切量会随着方法的不同而有所不同，取决于认可的变量如所利用的化合物和所遵从的工艺条件。因此，“有效量”不可能特别确定。然而，合适的有效量可由本领域的普通技术人员用本领域常规的试验进行确定。
“药学上可接受的”指在生物学上或其它方面符合需要，即，对个体给药的材料不会导致不需要的生物学效应或以有害的方式与药物组合物中含有的其它任何组分发生作用。
术语“水溶性的”用于描述本发明水溶性的壳聚糖，指包括的壳聚糖或其衍生物具有至少0.2％的水溶性，其中溶解性以说明书实施例8-28所描述的测试方法测定。采用该种方法，任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的本发明壳聚糖的水溶性一方面至少为0.2％，另一方面最多达2％，再一方面(如果测试中所采用的壳聚糖多于0.200g)高于2％。当采用其它测试方法进行测定时，本发明壳聚糖的水溶性可甚至高于2％或低于0.2％。在此类情况下，水溶性取决于聚合物的分子量，所得壳聚糖水溶液的粘度以及所选择的溶解性测试条件。
术语“任意取代”是指在壳聚糖主链上对酰基基团的任意取代，其有利于所得壳聚糖聚合物的水溶性或亲水性。
术语水溶性“部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖”或其衍生物是指聚(N-，O-乙酰化-D-葡糖胺)。
术语“脱乙酰化程度”是指水溶性壳聚糖或壳聚糖衍生物上自由氨基的百分比。N-乙酰化的百分比可通过脱乙酰化值计算出来。术语N-乙酰化或O-乙酰化也指在N或O上被C(O)CH3取代的程度。
应该理解当N-乙酰化大于50％时，有时在本领域内被称为壳多糖。然而，本发明通篇所采用术语的“壳聚糖”，包括壳聚糖，而当N-乙酰化大于50％时，也包括壳多糖。
术语“不均匀条件”是指所有或部分反应是在固态或高度膨胀的状态，即凝胶中进行的。
术语“均匀条件”是指反应完全在溶液中进行。
本发明为用于药物产品的防腐组合物。该防腐组合物可用于不同的眼科产品例如隐形眼镜清洗液，润滑液，清洁和储存液，人造泪液以及眼科药物。本发明的组合物还可用于对耳科或鼻科溶液进行防腐处理。
由于隐形眼镜佩戴者持续多年每日都与防腐剂接触，隐形眼镜溶液尤其面临着特殊的防腐挑战。眼镜佩戴者经历不舒适或对防腐剂产生敏感的可能性甚至高于短期接触者。本领域中所采用的典型的隐形眼镜溶液防腐剂有山梨酸，硫柳汞，或DYMEDTM(聚氨丙基双胍)。
本发明的组合物包括至少一种壳聚糖或壳聚糖衍生物，以及至少一种缓冲溶液。本发明的组合物还可包括至少一种生物杀灭佐剂。本发明的组合物包括有效量的这些组分作为药用防腐组合物，来对药物产品包括眼科、鼻科和耳科制剂进行防腐处理。
一种优选实施方式用作隐形眼镜溶液防腐剂。另一种优选实施方式用作隐形眼镜消毒法。当包括至少一种壳聚糖或壳聚糖衍生物以及至少一种缓冲溶液的组合物用于对隐形眼镜溶液进行防腐处理时，将隐形眼镜溶液和组合物相混合。当包括至少一种壳聚糖或壳聚糖衍生物以及至少一种缓冲溶液的组合物用于隐形眼镜消毒法时，用组合物冲洗并擦拭隐形眼镜，并将隐形眼镜浸泡在组合物中达一段合适的时间，如不小于15分钟，更优选为不超过1小时，甚至更优选不超过4小时。优选地，浸泡在室温下进行，可采用任何合适的温度。
在一种优选实施方式中，本发明的壳聚糖和壳聚糖衍生物能实现几种功能，而这几种功能的实现在通常情况下还需要其它的组分。例如，在一种优选实施方式中，除了防腐作用之外，壳聚糖或壳聚糖衍生物可作为天然的表面活性剂，并通过将隐形眼镜蛋白质和油脂从眼镜表面乳化除去，使其进入溶液中而有助于清洁隐形眼镜。进一步地，壳聚糖作为一种聚糖，可在一实施方式中用作溶液增厚剂和眼镜润滑剂，通过降低眼镜干燥速度而增加眼镜舒适度。同样地，在本发明一个实施方式中的壳聚糖或壳聚糖衍生物具有缓和作用，以提高眼镜佩戴的舒适性。
壳聚糖和壳聚糖衍生物的例子包括壳聚糖盐、水溶性壳聚糖、水溶性任意取代的部分N-、部分O-乙酰化壳聚糖、壳聚糖寡糖，羧甲基壳聚糖、以及羟烷基壳聚糖。羟烷基壳聚糖的取代基羟烷基，以及羧甲基壳聚糖的取代基羧甲基可连接到壳多糖或壳聚糖环亚单元上的任何氮或氧基团上。特别优选的羟烷基壳聚糖包括但不限于羟乙基壳聚糖(也称为乙二醇壳聚糖)，羟丙基壳聚糖，二羟丙基壳聚糖，羟丁基壳聚糖以及二羟丁基壳聚糖。
水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化壳聚糖衍生物包括相应壳聚糖的盐、寡糖、羧甲基壳聚糖、以及羟烷基壳聚糖。此类羟烷基壳聚糖的取代基羟烷基和此类羧甲基壳聚糖的取代基羧甲基可连接到壳多糖或壳聚糖环亚单元上的任何氮或氧基团上。特别优选的部分N-，部分O-乙酰化壳聚糖的羟烷基壳聚糖包括但不限于羟乙基壳聚糖(也称为乙二醇壳聚糖)，羟丙基壳聚糖，二羟丙基壳聚糖，羟丁基壳聚糖以及二羟丁基壳聚糖。
在一个实施方式中，水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化壳聚糖或其衍生物可由下面的通式(I)表示
其中R1，R2和R3独立选自H或C(O)CH3，其中壳聚糖或其衍生物被部分乙酰化，使得R1被C(O)CH3取代的程度为约24到55％，R2被C(O)CH3取代的程度为约1到60％，
m大于25，
其中部分N-，部分O-乙酰化壳聚糖或其衍生物被任意取代且为水溶性的。
术语“m”是水溶性壳聚糖或聚合物链的重复单元数。在一个方式中m为约100,000，而在另一方式中m可更大。水溶性壳聚糖或聚合物链的分子量范围是指重均分子量。典型地，水溶性壳聚糖或聚合物的重均分子量为至少约5,000。在另一种方式中重均分子量可高达约3,000,000，而在另一些方式中可能更高。
与柠檬酸盐，三羟甲基氨基甲烷(tris)缓冲剂和水中的相似制剂相比，分别惊奇地发现了本发明的一种实施方式中，壳聚糖或壳聚糖衍生物与确定的缓冲溶液如硼酸盐或磷酸盐缓冲剂组合时，具有更高的抗微生物活性。因此，在一种实施方式中，缓冲溶液可包括硼酸盐缓冲剂。合适的硼酸盐缓冲剂包括但不限于硼酸，硼酸钠，四硼酸钾，偏硼酸钾及其混合物。在另一种实施方式中，缓冲溶液可包括磷酸缓冲剂。合适的磷酸缓冲剂包括但不限于磷酸二氢钠和磷酸氢二钠及其混合物。
本发明包括一种生物杀灭佐剂。生物杀灭佐剂可用来杀灭细菌、真菌以及病毒等。本发明的一个优点在于组合物具有惊人的协同防腐作用。合适的生物杀灭佐剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)，次氮基三乙酸，以及乙二醇-二(β-氨基-乙醚)-N，N-四乙酸。
本组合物可包括几种实现组合物预定功能的组分。可使用一种添加组分以使组合物获得正常泪液附近的渗透压。此功能可通过渗透试剂如氯化钠，氯化钾或甘油实现。
本发明隐形眼镜溶液优选实施方式的一个特征在于，与商业化的多用途隐形眼镜溶液相比，本发明溶液中的蛋白质是稳定的，不会发生变性。在一种实施方式中，这一效果可通过在组合物中添加至少一种表面活性剂而得以实现。表面活性剂也有助于清洁隐形眼镜。典型的表面活性剂包括但不限于Pluronics或泊洛沙姆(poloxamer)，它是氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物，或为Tetronics或poloxamer，它是将氧化乙烯和氧化丙烯加成到乙二胺而得到的嵌段聚合物。其它可用于本发明的表面活性剂包括但不限于四丁酚醛、辛基酚聚醚、壬基酚聚醚、以及Tweens或聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。
本发明的隐形眼镜溶液，在另一种方式中，可包括使眼镜润滑的粘性试剂。典型的粘性试剂包括聚糖如葡聚糖，纤维素衍生物如羧甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇以及甘油。
组合物具有至少最小限度的防腐活性。在一种实施方式中，组合物的生物杀灭活性足以达到USP(United States Pharmacopoeia)发布、FDA修订的Preservative Efficacy Test(“PET”)中的性能标准。同样，分别在接种和再接种日之后的14天内，本发明的组合物将第0天的接种物和第14天的再接种物，即细菌金黄色葡萄球菌(ATCC No.6538)、绿脓杆菌(ATCC No.9027)和大肠杆菌(ATCC No.8739)的量减少至少99.99％(3对数)。在PET的真菌接种部分，本发明的组合物不允许黑曲霉(ATTCC No.16404)和白色链球菌(ATCC No.10231)在第0天接种和第14天再接种后的14天内生长。同样，本发明可用于对隐形眼镜进行防腐处理的方法中，其中将隐形眼镜溶液和组合物相混合。
在一种实施方式中，本发明的组合物具有接近中性的pH值。这一pH条件优选与有机体如人的眼睛相适应。同样，本发明一种优选的pH值为6到8，优选为6.6到7.8，更优选为6.8到7.2。在单独考虑组合物的抗生物活性时，优选特定范围内的最低pH值。在此类优选pH值的范围中，在一种优选实施方式中，本发明壳聚糖或壳聚糖衍生物在药学上可接受的pH水平具有溶解性。另一种实施方式包括壳聚糖或壳聚糖衍生物在中性附近可溶，即在pH6到8的范围内可溶于水。
本发明所述的壳聚糖和壳聚糖衍生物可由本发明已知的方法制备。此外，在一种实施方式中，即在本发明方法的一种实施方式中，水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖或壳聚糖衍生物可通过将壳聚糖或壳聚糖衍生物溶解于酸性水溶液中，使壳聚糖和乙酰化试剂在至少一种相转移试剂的存在下进行反应制备得到。水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖或壳聚糖衍生物的制备是在均相溶液中进行的，该溶液提供了任意的乙酰化取代基。采用有效量的乙酰化试剂和相转移试剂，使其适于制备水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化壳聚糖和壳聚糖或壳聚糖衍生物。在一个优选的实施方式中，水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化壳聚糖和壳聚糖优选在中性pH附近的溶液中溶解，例如在pH6.0到8.0的范围内。酸性水溶液是指pH小于7，且为本领域在不均匀条件下进行乙酰化的典型的酸性pH值。
乙酰化试剂对壳聚糖进行乙酰化。可采用任何公知的乙酰化试剂。乙酰化试剂的例子包括但不限于乙酰卤和乙酸酐。优选的乙酰化试剂为乙酸酐。
相转移试剂可包括本领域公知的任何相转移试剂。一般来说，相转移试剂在水相和有机相工作。合适的相转移试剂包括但不限于“Phase-Transfer Catalysis，”Starks，C.，et.al.Chapman & Hall，1994中描述的相转移试剂，为完整性的缘故列于此以作参考。相转移试剂的例子包括但不限于季铵盐(Eq.I)，季膦盐(Eq.II)，冠醚(Eq.IIIa-IIIc)，以及吡啶盐(Eq.IV)。
[A]w[B]x[C]zN+Q           (I)
或
[A]w[B]x[C]y[D]zP+Q-   (II)
其中
w，x，y，z分别为0到4的整数且w+x+y+z＝4
Q为负离子，选自F-，Cl-，Br-，I-，CH3COO-，OH-，HSO4 -，NO3 -，PF6 -，BF4 -，HCOO-以及H2PO4 -，且
A，B，C，D分别选自C1-C18烷基；苯基，其中苯环未被取代或被C1-C8烷基，C1-C8烷氧基，卤素，羟基，苯氧基，硝基，羧基，乙酰胺基或芳基所取代；苄基；具有5-6个环原子的环烷基或杂环系统。
在一种实施方式中，季铵盐(Eq.I)和季膦盐(II)包括但不限于氯化四C1-C4烷基铵盐如溴化四丁基铵(“TBABr”)、氯化四甲基铵(“TMACl”)、磷酸二氢化四丁基铵(“TBADHP”)、以及碘化四丁基铵(“TBAI”)；卤化苄基三C1-C4烷基铵盐如氯化苄基三乙基铵(“BTEACl”)；以及卤化四C1-C18烷基膦盐如溴化四丁基膦(“TBPBr”)和溴化十六烷基三丁基膦(“HDTRPBr”)。
一种优选的实施方式包括本发明实施中的多种冠醚(Eq.IIIa到IIIc)。
Figure A0182327300181
其中X＝O或S，对于每个独立的X/＝1到3
在一种优选实施方式中，根据Eq.IIIa的合适冠醚包括但不限于12-冠-4，15-冠-5，18-冠-6和1，4，7，10，13，16-六硫代环十八烷(hexathiacyclooctadecane)。
其中m＝1到3
在一种优选实施方式中，根据Eq.IIIb的合适冠醚包括但不限于苯并-12-冠-4，苯并-15-冠-5和苯并-18-冠-6。
Figure A0182327300183
其中n＝1到3
p＝1到3
Figure A0182327300191
＝脂环或芳香族环
＝脂环或芳香族环
R3＝H，C1-C4烷基或卤素
在一种实施方式中，适于用作Eq.IIIc的冠醚包括但不限于双环己基-18-冠-6，双环己基-24-冠-8，双苯并-18-冠-6，双苯并-21-冠-7，双苯并-24-冠-8，双苯并-30-冠-10，双-叔丁基-双-苯并-18-冠-6和4’-溴苯并-18-冠-6。
吡啶盐(Eq.IV)也可用于本发明中。
Eq.IV
其中R1＝C1-C18烷基，苄基或羧甲基
R2＝C1-C4烷基，氯，氟，溴，羟基，C1-C4烷氧基或烷氧基羰基
X＝F，Cl，Br，I或对甲苯磺酸盐的负离子。
Eq.IV的吡啶盐例子包括但不限于卤化C1-C18烷基吡啶盐如氯化1-十二烷基吡啶和溴化1-十六烷基吡啶、卤化1-苄基吡啶盐、以及氯化1-苄基-3-羟基吡啶。
在另一种实施方式中，作为本发明方法的一种实施方式，水溶性壳聚糖或壳聚糖衍生物可通过在溶剂中使至少一种水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化壳聚糖或壳聚糖衍生物和碱反应而制备得到。
碱可包含任何本领域公知的碱类。碱的例子包括但不限于碱金属氢氧化物如氢氧化钾或氢氧化钠，以及碱金属碳酸盐如碳酸钠，或磷酸三钠。
溶剂可包括任何本领域公知的溶剂。溶剂的例子包括但不限于醇类如甲醇，乙醇或异丙醇；醚类如二乙醚或四氢呋喃；极性溶剂如二甲基甲酰胺，二甲基亚砜或N-甲基吡咯烷酮；以及酮类如丙酮或2-丁酮。
本发明可通过以下不同方式的实施例进一步阐释，除非另有说明，应该理解这些实施例仅用于阐释而并非用于限定本发明的范围。除非另有说明，起始原料均由商业化途径获得。除非另有说明，所有的百分比均为重量百分比。
实施例
以下提出的实施例向本领域的普通技术人员完全公开并描述了如何制备和测定化合物，组合物，产品，装置和/或方法，且实施例仅用于纯粹的示例作用而并非用于限定本发明的范围。发明人已尽力确保数值(如量，温度等)的精确性，但应该考虑到一些错误和偏差。除非另有说明，份是指重量份，百分比是指重量百分比，温度以℃表示且为环境温度，压力在大气压或其附近。
实施例1：含有乙二醇壳聚糖的隐形眼镜等渗水溶液
乙二醇壳聚糖 0.25％
Pluronic F68TM(BASF公司) 0.05％
乙二胺四乙酸二钠的二水合物(EDTA) 0.05％
硼酸盐缓冲剂： q.s.100.00mL
硼酸钠十水合物 0.08％
硼酸 0.72％
超纯水 q.s.100.00mL
氢氧化钠溶液(0.5M) q.s.*pH＝6.9
氯化钠 q.s.渗透压＝300mOsm
q.s.指足量，如使溶液到达体积的足够量
在约90％要求体积的硼酸盐缓冲剂中溶解乙二醇壳聚糖、PluronicF68TM和EDTA而制备得到溶液。当所有的第一组分都溶解之后，加入硼酸盐缓冲剂达到预定体积。加入足够体积的0.5M的氢氧化钠溶液调节pH至6.9。然后加入氯化钠调节渗透压。通过0.45微米的滤筛过滤对溶液进行灭菌处理。根据修订的USP防腐性效力测试方法(PET)测定溶液对细菌金黄色葡萄球菌(ATCC No.6538)，绿脓杆菌(ATCC No.9027)，大肠杆菌(ATCC No.8739)和白色念珠菌(ATCC No.10231)的防腐效力，其中PET在1997年5月出版的Premarket Notification(510(k))Guidance Document for Contact Lens Care Products(U.S.Department ofHealth and Human Services，Food and Drug Adiministration，Center forDevices and Radiologic Health发行)中有所描述。
根据该方法，溶液在开始时用每一种测试的微生物以至少为105微生物/mL(cfu/mL)的浓度进行接种，一式两份，然而在第14天时对测试溶液进行再接种，其中每种生物体的浓度调节到至少104cfu/ml。在进行再接种调节前的第14天，测定微生物的存活量，并在第28天测定其存活量。如果存活细菌在第14天和28天至少减少了3对数，且如果存活真菌的浓度在第14天和28天小于或等于接种浓度，(即对数减少为0或更多)，则认为所测试的溶液是有效防腐的。下列PET的结果说明了溶液1是能有效防腐的。
          表1-a实施例1的防腐效力测试结果
                 平均生物体对      数减少
微生物           14天              28天           有效性1
大肠杆菌(Ec)     3.6               3.7            通过
绿脓杆菌(Pa)     5.7               3.6            通过
金黄色葡萄球     5.1               3.3            通过
菌(Sa)
白色念珠菌       1.1               2              通过
(Ca)
黑曲霉(An)       1.5               1              通过
注：1Ec，Pa和Sa在第14天和28天要求至少减少3对数Ca和An在第14天和28天要求至少减少0对数
眼泪蛋白质在柔软的隐形眼镜上发生变性是一个普遍的现象。一旦在隐形眼镜上蛋白质发生变性就很难被除去，会降低眼镜的清洁度，也可能会导致佩戴者的敏感性反应，且可能会成为传染性微生物的结合部位。由于溶菌酶是带正电荷的蛋白质，其容易吸引在负电性的隐形眼镜表面，因此溶菌酶被认为是特别在高水含量(～55％水)的隐形眼镜中具有潜在麻烦的眼泪蛋白质。进行体外试验以确定测试溶液延迟溶菌酶变性的能力。在该试验中，新制备1％溶于等渗硼酸缓冲盐中的溶菌酶的备用溶液(pH＝7.0)，将该备用溶液的等分试样与被测试溶液的相同等分试样相混合。用热水浴加热所得的混合物至75℃并维持15分钟。将混合物从热水浴中移出，冷却到室温，观察到了蛋白质变性现象，证据是形成了白色沉淀物。
为与几种商业隐形眼镜多功能溶液进行比较，采用所述的溶菌酶试验对实施例#1进行测试，列于表1-b中的试验结果说明了只有实施例#1阻止了蛋白质变性。
表1-b实施例1和商业隐形眼镜多功能溶液的比较
测试溶液 组分 溶菌酶试验后的表观(75℃，15分钟)
COMPLETEComfortPlusTM(Allergan) 磷酸盐缓冲剂，氯化钾&氯化钠，乙二胺四乙酸二钠，Poloxamer237，羟丙基甲基纤维素，PHMB(1ppm) 沉淀
ReNuMultiPlus(Bausch &Lomb) 硼酸盐缓冲剂，氯化钠，Poloxamine，羟烷基磷酸盐，DYMEDTM(1ppm) 沉淀
Opti-FreeExpress(Alcon Laboratories，Inc.) 柠檬酸盐缓冲剂，氯化钠，乙二胺四乙酸二钠(0.05％)，POLYQUAD(10ppm) 沉淀
双氯苯双胍己烷溶液 硼酸盐缓冲剂，氯化钠，双氯苯双胍己烷(50ppm) 沉淀
双氯苯双胍己烷二乙酸酯二水合物 硼酸盐缓冲剂，氯化钠，双氯苯双胍己烷二乙酸酯二水合物(50ppm) 沉淀
硼酸缓冲盐(对照) 硼酸盐缓冲剂，氯化钠 浑浊溶液，少许沉淀
实施例1 硼酸盐缓冲剂，氯化钠，乙二醇壳聚糖，Poloxamer188，EDTA 清澈溶液，无沉淀
对实施例1的制剂进行视觉刺激和体外生物兼容性测定。根据Draize JH，Woodard G，and Calvery HO：Methods for the substancesApplied Topically to the Skin and Mucous Membrans.J.Pharmacol.Ext.Ther.(1944)82：377-390中提出的方法，在6只兔中测定视觉刺激和上皮细胞层染色。在初步测试并对双眼进行Draize评分后，仅对每只兔的右眼表面每8小时灌输10毫升的实施例1制剂，左眼作为对照物不进行处理。在最后一次施用测试溶液后的1小时内，以及24，48和72小时后，根据Draize评分法对所有的眼睛进行测定。在溶液灌输日的末期用McDonald-Shadduck评分方法(McDonald，T.O.and Shadduck J.A.1977.Eye Irritation.Pages 162-166 in F.N.Marzulli and H.I.Maibach.Eds.Advances in Modem Toxicology，Vol.4，Dermatotoxicology andPharmacology.Halsted Press，John Wiley & Sons，Inc.，New Work.)进行Slit-lamp生物显微测试。所有兔的被测试的和对照的眼睛的Draize和McDonald-Shadduck评分都为0，意味着实施例1对兔眼的视觉表面无刺激。
实施例1的体外生物兼容性研究基于琼脂扩散试验，该试验在USP/NF 22(87)Biological Reactivity Tests In-Vitro中有描述。在该测试中，在直接覆盖了L-929小鼠纤维原细胞的融合单层的复制琼脂糖表面上，放置具有0.1ml实施例1等分样的滤板和合适的负对照和正对照滤板。在37℃，5％CO2中培养24-26小时后，对培养物进行测试，结果说明了实施例1并不导致细胞溶解或毒性，因此满足USP的生物兼容性要求(参见表1-c)。
表1-c  实施例1的体外生物兼容性测试结果
测试/对照项1 样号      溶 解 区 级2      反应性1
                        (mm)
实施例1       1         0.0      0         无
              2         0.0      0         无
滤板对照      1         0.0      0         无
              2         0.0      0         无
正对照        1         5.0      3         适度
              2         5.0      3         适度
负对照        1         0.0      0         无
              2         0.0      0         无
1：滤板对照：0.1ml 0.9％氯化钠冲洗剂，USP施涂到纸滤板上；正
对照：锡稳定的聚氯乙稀；
负对照：低密度聚乙烯
2：0级，无反应性：在试样周围或下面未观察到溶解区；
1级，轻微反应性：在试样下有一些畸变或退化的细胞；
2级，适度反应性：溶解区集中在试样下面且最多达4mm；
3级，中等反应区：溶解区在试样外延伸出5-10mm；
4级，严重反应区：溶解区在试样外延伸超出10mm。
实施例2：
该实施例揭示了不同羟烷基壳聚糖溶液在28天US防腐效力试验(PET)中抗大肠杆菌的活性。采用下列的配方根据实施例1描述的方法制备溶液2a-e。
实施例配方#2a-e：
0.05％EDTA
1.00％硼酸
超纯水(q.s.调节到100.00ml)
0.5M氢氧化钠(q.s.调节pH＝6.9)
氯化钠(q.s.调节mOsm＝300)
a：对照；b＝0.25％乙二醇壳聚糖(SIGMA Chemical Co.)；c＝0.25％羟丙基壳聚糖(Austin Chemical Co.)；d＝0.25％羟丁基壳聚糖(AustinChemical Co.)；e＝0.25％二-羟丙基壳聚糖(Technology ResourceInternational Corporation)。
除了在第14天不引入再接种之外，PET的条件与实施例1相同。在测试中仅选用大肠杆菌作为筛选微生物，这是因为早期测试表明相对于其它PET微生物，大肠杆菌对壳聚糖抗微生物制剂具有更强的抗性。
参照表2，可以看到所有的测试溶液均满足USP PET对大肠杆菌的要求，也就是说，在起始的细菌接种后的第14天，存活细菌的数目减少了3对数，而在28天测试期间的剩余期内，所测试的细菌浓度比第14天的浓度有所降低。
表2：溶液2a-2e对大肠杆菌的防腐效力
                    平均大肠杆菌对数减少
制剂                14天      28天         有效性1
2a(对照)            0.9       2.5          失败
2b(乙二醇壳聚糖)    4.2       4.7          通过
2c(羟丙基壳聚糖)    3.9       4.3          通过
2d(羟丁基壳聚糖)    4.3       4.8          通过
2e(二羟丙基壳聚糖)  4.2       5.3          通过
注：
1要求第14天至少达3对数减少，且3对数减少必须保持到28天后。
实施例3
这一实施例说明了pH对乙二醇抗生物活性的影响。实施例3中所采用的测试微生物为绿脓杆菌(ATCC No.9027)，它在普通隐形眼镜相关的眼睛感染和传染性角膜炎中是需要引起注意的微生物。
实施例3配方
乙二醇壳聚糖(Sigma Chemical)     0.5％
PluronicTMF68(BASF Corporation) 0.05％
EDTA                             0.05％
硼酸钠十水合物                   0.08％
硼酸                             0.72％
超纯水                           q.s调节到100.00ml
氢氧化钠溶液(0.5M)               q.s调节到pH＝6.6，7.2或7.8
氯化钠                           q.s调节到mOsm＝300±10
表3：实施例3对绿脓杆菌的抗微生物活性比较
            24小时后的绿脓杆菌Cfu1，2
PH＝6.6            PH＝7.2            PH＝7.8
2                  184                ＞1000
注：1接种物浓度为106cfu/ml
    2数据取自于105cfu回收板
上表揭示了在用106cfu/ml的绿脓杆菌接种所测试的制剂24小时后制备的105cfu回收板上的存活群落的平均数目。从这些数据可以看到，对于在24小时内杀灭绿脓杆菌，pH6.6和7.2时的乙二醇壳聚糖制剂比pH7.8时的乙二醇壳聚糖制剂更为有效。
实施例4：
本实施例说明了水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖制剂的抗微生物活性，其中水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖制剂根据实施例10中公开的方法制备。
实施例4的形成如下：将500ppm水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖溶解于硼酸盐缓冲剂(来自实施例1)中，并加入250ppm EDTA。用0.5M氢氧化钠溶液调节溶液的pH至7.0，用氯化钠调节溶液的渗透压为300mOsm，然后使溶液滤过0.45微米的膜。
实施例4的抗微生物活性在第14天和28天根据实施例1所述的FDA修订的USP防腐效力试验进行测定。结果总结于表4中，表明了实施例4通过了防腐效力试验的要求。
    表4  实施例4的防腐效力试验结果
14天和28天后平均微生物的对数减少
微生物有效性1                            14天                            28天                 通过
大肠杆菌(Ec)  4.8  3.8 通过
绿脓杆菌(Pa)  4.4  4.2 通过
金黄色葡萄球菌(Sa)  3.7  3.0 通过
白色念珠菌(Ca)  1.2  0.8 通过
黑曲霉(An)  0.9  0.9 通过
1 Ec，Pa和Sa要求在第14天和第28天至少减少3对数；
  Ca和An要求在第14天和第28天至少减少0对数
实施例5
实施例5说明了不同缓冲剂对水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖制剂的抗微生物活性的影响，其中水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖制剂根据实施例10中公开的方法制备。
实施例5：硼酸盐、磷酸盐、tris和柠檬酸盐缓冲剂中含有水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化壳聚糖的隐形眼镜等渗水溶液
                                            浓度
根据实施例10的水溶性任意取代的部
分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖                  0.10％
乙二胺四乙酸二钠的二水合物(EDTA)            0.05％
缓冲剂(硼酸盐、磷酸盐、tris或柠檬
酸盐)*                                     q.s.**100.00ml
氢氧化钠溶液(0.5M)                          q.s.**pH＝6.9
氯化钠                                      q.s.**等渗压＝300mOsm
注：
*硼酸盐缓冲剂与实施例1中相同
磷酸盐缓冲剂包括0.08％磷酸二氢钠和0.48％磷酸氢二钠水溶液
Tris缓冲剂包括1％氯化三(羟甲基)氨基甲烷的水溶液
柠檬酸盐缓冲剂包括1.5％柠檬酸钠水溶液
**q.s.是指足量(足量的体积)，如足以使溶液达到体积
以上列出的四种溶液根据实施例4的描述制备得到。采用实施例1描述的防腐效力测试方法，在第14天和第28天测定对大肠杆菌的抗微生物活性。表5中所列的抗微生物活性结果表明：硼酸盐缓冲剂中的抗生物活性在第14天和第28天比其它溶液中的活性高出2对数，且磷酸盐缓冲的任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖的抗微生物活性高于TRIS和柠檬酸盐缓冲的任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖。
表5硼酸盐、磷酸盐和柠檬酸盐缓冲剂中水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化壳聚糖对大肠杆菌的抗微生物活性比较
                   大肠杆菌的平均对数减少
实施例5，缓冲剂类型       第14天           第28天
硼酸盐                     5.2              5.7
磷酸盐                     2.4              2.9
TRIS                       1.5              2.0
柠檬酸盐                   2.0              0.9
实施例6
实施例6说明了EDTA和任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖相结合对实现对大肠杆菌的防腐效力的重要性。
溶液6a-h的组合物如下所示：
实施例序号 任意取代的部分N-，部分O-乙酰化 Poloxamer(ppm) EDTA(ppm)
 的壳聚糖(ppm)
 6-a  1000  0  500
 6-b  0  0  500
 6-c  1000  0  0
 6-d  0  0  0
 6-e  1000  500  500
 6-f  0  500  500
 6-g  1000  500  0
 6-h  0  500  0
上述测试溶液中所采用的水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖根据实施例10中的方法制备得到。上述所列出的组分如实施例1一样溶解在硼酸缓冲剂中。除采用0.5M的氢氧化钠溶液调节每一溶液的pH至7.0之外，还采用氯化钠调节每一溶液的渗透压至300mOsmoles。
根据实施例1所述的PET方法，对溶液6a-h在第14天和第18天对大肠杆菌的抗微生物活性的测定结果列于表6中。
表6  实施例6a-h对大肠杆菌的抗微生物活性
               大肠杆菌的平均对数减少
实施例序号      14天      28天          防腐有效性1
6-a             4.0       4.9           通过
6-b             1.9       1.7           失败
6-c             2.1       0.9           失败
6-d             0.6       0.6           失败
6-e             5.2       5.1           通过
6-f             1.9       1.9           失败
6-g             1.9       1.5           失败
6-h             0.6       0.5           失败
1通过PET要求在第14天和第28天至少减少3对数
从表6中可以看出，只有溶液6-a和6-e在第14天和第18天导致了最少减少3对数，这是为说明对大肠杆菌的防腐有效性所要求的。通过比较相应的对照溶液6-b(与6-a对照)和6-f(与6-e对照)，其中除去了任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖；以及对照溶液6-c(与6-a对照)和6-g(与6-e对照)，其中除去了EDTA；它们的抗微生物活性小于任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖/EDTA溶液抗微生物活性的一半。因此，从该数据可以看出，EDTA和任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖协同作用，与未相互配合的任何一种组分相比，任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖和EDTA意想不到地产生了更高的对大肠杆菌的抗微生物活性
        表7  壳聚糖寡糖溶液的防腐效力测试结果
                                   14天和28天后的平均微生物对数减少
测试溶液   大肠杆菌14天   28天   绿脓杆菌14天   28天  金黄色葡萄球菌14天   28天   白色念珠菌14天   28天    黑曲霉14天   28天 PET通过与否？
寡糖壳聚糖的水溶液1 0.1    +0.4  +0.3   +1.2  4.9    4.9  0.3    0.2  0.2    0.3     否
寡糖壳聚糖的水溶液+EDTA1，2 1.9    0.9  +0.2   0.0  3.1    2.6  0.4    0.3  0.1    +0.1     否
寡糖壳聚糖的水溶液+EDTA1，2，3 5.8    4.8  5.9    4.0  4.4    4.2  4.3    3.7  1.3    0.2     是
1含有1000ppm寡糖壳聚糖(lot#COS-KL225，Kitto Life Co.，LTD，Seoul Korea)，用0.5M的氢氧化钠调节pH至7.0，用氯化钠调节渗透压为300mOsmoles
2含有250ppm乙二胺四乙酸的二钠盐二水合物(EDTA)
3根据实施例1所述的硼酸缓冲剂
实施例7
本实施例中测定壳聚糖寡糖溶液的防腐效力，其中采用的比较溶液包括(1)水，(2)水和EDTA，(3)硼酸缓冲剂和EDTA。根据实施例1所述，分别调节测试溶剂的pH和渗透压至7.0和300mOsmoles，并采用实施例1所述的测试条件。从表7中的数据可以看出，壳聚糖寡糖水溶液在第14天或是在第28天均未达到减少3对数(对绿脓杆菌和大肠杆菌)，这是在第14天进行再接种的修订USP防腐效力测试所要求的。与此相反，硼酸盐中的寡糖制剂实现了有效的防腐，原因在于被测试的所有细菌均减少了至少3对数，并且阻止了真菌、白色念珠菌和黑曲霉的生长。
溶解性测试
以下的实施例8-28和比较试样A-C中，在室温下搅拌10mlDI水中的0.200g壳聚糖试样混合物约18小时。将溶液滤过#1定性滤纸，用少量去离子水冲洗容器。将合并的滤液置于称重过的铝质称重盘中，并在真空下约60℃的温度下干燥。在水中的溶解度(％)结果列于表8-11中，在此测试条件下(基于10ml水中的0.200g壳聚糖)，测得的最大溶解度为2％。本发明一些水溶性壳聚糖的实际溶解度大于2％。为测定此类大于2％的实际溶解度，必须使用多于0.200g的壳聚糖(10ml水中)。当根据其它溶解度测试方法进行测定时，一些水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖可能高于2％。
根据Kurita’s方法制备出两个试样，然而，两个试样在中性pH的水中的溶解度相当低。
比较实施例A
按照Kurita et al.，Carbohydrate Polymers 16，83(1991)，方法D，用80ml甲醇对84％脱乙酰的3.0g壳聚糖在80ml 10％醋酸的水溶液进行稀释后，倾入1000ml吡啶中，得到了高度膨胀的沉淀物。搅拌5小时后于室温下加入7.7g乙酸酐，将混合物倾入3L丙酮中。通过过滤收集沉淀物，用丙酮洗涤并干燥，得到3.31g固体。参照实施例8中的1HNMR方法测定脱乙酰化程度值和O-乙酰化值。(尽管Kurita并未公开NMR数据，我们获得的Kurita产品的NMR数据表明了同时存在N-乙酰化和O-乙酰化。)
比较实施例B
比较实施例B根据与比较实施例A相似的方法进行制备，但是使用11.1g乙酸酐。得到了3.45g固体。参照实施例8中的1HNMR方法测定脱乙酰化程度值和O-乙酰化值。
比较实施例C
比较实施例C根据与实施例4所描述的方法进行制备，但并不加入溴化四丁基铵。得到了4.17g固体。参照实施例8中的1HNMR方法测定脱乙酰化程度值和O-乙酰化值。
实施例8
在600ml 10％的乙酸溶液中溶解13.5g脱乙酰化程度为84％的壳聚糖，制备得到粘性溶液。加入1.35g氯化苄基三乙基铵，然后加入38.5g乙酸酐。在室温下搅拌得到的混合物约18小时。加入400ml甲醇，继续搅拌混合物达30分钟。然后将反应混合物转移到另外的漏斗(additional funnel)中，然后在搅拌良好的条件下缓慢加入2400ml丙酮。收集沉淀物，然后用丙酮洗涤，直到检测不到乙酸。所得固体称重为12.24g。用1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值(A.和Hirai，H.Odani and A.Nakajima：Polymer Bulletin 26，87(1991))。DD是指N-脱乙酰百分数。N-乙酰化(C(O)CH3取代的程度)的百分数为100-DD。
实施例9
按照类似于实施例8所述的方法，使10.25g壳聚糖，450ml 10％的乙酸，2.56g溴化四丁基铵和26.05g乙酸酐在室温下反应约18小时，得到11.19g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
实施例10
按照类似于实施例8所述的方法，使13.5g壳聚糖，600ml 10％的乙酸，3.375g溴化四丁基铵和17.2g乙酸酐相互反应得到14.72g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
实施例11
按照实施例8所述的方法，使3.347g壳聚糖，150ml 10％的乙酸，0.335g溴化四丁基铵和5.725g乙酸酐在室温下反应得到3.14g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
实施例12
实施例12按照类似于实施例11的方法进行制备，但采用氯化苄基三乙基铵代替溴化四丁基铵。得到3.69g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
实施例13
实施例13按照类似于实施例11所述的方法进行制备，但使用9.54g乙酸酐，得到4.04g固体。参照实施例8所述的1H NMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
实施例14
实施例14按照类似于实施例11所述的方法进行制备，但采用氯化四甲基铵代替溴化四丁基铵。得到3.54g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
实施例15
实施例15按照类似于实施例11所述的方法进行制备，但采用碘化四丁基铵代替溴化四丁基铵。得到4.33g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
实施例16
实施例16按照类似于实施例11所述的方法进行制备，但采用磷酸二氢化四丁基铵代替溴化四丁基铵。得到4.13g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
表8  季铵盐对水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化壳聚糖的影响
试样  催化剂 DD值(％)(NMR测定)  O-乙酰化(％)(NMR测定)  水溶性(％)
Vanson壳聚糖 84  0  0.025
比较实施例A  无 63.5  16.9  0*
比较实施例B  无 66.7  12.3  0.10#
比较实施例C  无 55.6  21.3  0.015#
实施例8  BTEACl(1∶4)** 54.4  19.4  1.87
实施例9  TBABr(1∶4) 57.9  18.0  2.00
实施例10  TBABr(1∶4) 74.1  17.3  1.83
实施例11  TBABr(1∶10) 64.3  16.8  1.93
实施例12  TBACl(1∶10) 67.2  23.7  2.00
实施例13  TBABr(1∶10) 58  32.5  1.95
实施例14  TMACl(1∶10) 58.4  19.9  2.00
实施例15  TBAI(1∶10) 57.7  46.0  2.00
实施例16  TBADHP(1∶10) 59.8  48.8  1.89
*高粘性凝胶不能滤过#1滤纸
#只有少量的高粘性凝胶滤过#1滤纸
**催化剂重量∶壳聚糖重量
实施例17
实施例17按照实施例8中所述的方法进行制备，使13.5g壳聚糖，600ml 10％的乙酸，1.35g溴化十六烷基三丁基膦，以及38.5g乙酸酐在室温下反应约18小时，得到13.61g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
实施例18
实施例18按照实施例8中所述的方法进行制备，使13.5g壳聚糖，600ml 10％的乙酸，1.35g溴化十六烷基三丁基膦，以及38.5g乙酸酐在室温下反应约18小时，得到13.32g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
表9季膦盐对水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化壳聚糖的影响
试样  催化剂  DD值(％)(NMR测定)  O-乙酰化(％)(NMR测定)  水溶性(％)
Vanson壳聚糖  84  0  0.025
比较实施例A  无  63.5  16.9  0*
比较实施例B  无  66.7  12.3  0.10#
比较实施例C  无  55.6  21.3  0.015#
实施例17  HDTBPBr(1∶10)**  54.1  22.4  1.86
实施例18  TBPBr(1∶10)  54.4  32.8  1.76
*高粘性凝胶不能滤过#1滤纸
#只有少量的高粘性凝胶滤过#1滤纸
**催化剂重量∶壳聚糖重量
实施例19
将10.0g脱乙酰化程度为90％的壳聚糖溶解在225ml的20％乙酸溶液中，得到粘性溶液。加入1.0g 18-冠-6，然后加入28.6g乙酸酐。将得到的混合物在室温下搅拌约18小时。将反应混合物转移到另外的漏斗中，然后在搅拌良好的条件下逐滴加入1600ml丙酮。收集沉淀物，用丙酮洗涤，直到检测不到乙酸。得到的固体称重为11.84g。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
实施例20
按照类似于实施例19所述的方法，使10.0g壳聚糖，225ml 20％的乙酸，1.0g顺-二环己醇-18-冠-6，以及28.6g乙酸酐化合得到12.92g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
实施例21
按照类似于实施例19所述的方法，使10.0g壳聚糖，225ml 20％的乙酸，1.0g 15-冠-5，以及28.6g乙酸酐化合得到12.52g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
实施例22
按照类似于实施例19所述的方法，使10.0g壳聚糖，225ml 20％的乙酸，1.0g二苄基-18-冠-6，以及18.6g乙酸酐在室温下反应约18小时，混合物在1500ml异丙醇中缓慢萃取。收集沉淀物，用异丙醇洗涤，直到检测不到乙酸。得到12.52g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
表10  冠醚对对水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化壳聚糖的影响
试样 催化剂 DD值(％)(NMR测定)  O-乙酰化(％)(NMR测定)  水溶性(％)
Vanson壳聚糖 84  0  0.025
比较实施例A 无 63.5  16.9  0*
比较实施例B 无 66.7  12.3  0.10#
比较实施例C 无 55.6  21.3  0.015#
实施例19 18-冠-6(1∶10)** 47.4  55.1  1.87
实施例20 DC-18-冠-6(1∶10) 48.6  41.3  2.0
实施例21 15-冠-5(1∶10) 51.3  47.5  1.70
实施例22 DB-18-冠-6(1∶10) 53.6  30.6  1.79
*高粘性凝胶不能滤过#1滤纸
#只有少量的高粘性凝胶滤过#1滤纸
**催化剂重量∶壳聚糖重量
DC-18-冠-6＝顺-二环己醇-18-冠-6
DB-18-冠-6＝二苯并-18-冠-6
实施例23
按照类似于实施例22所述的方法，使10.0g壳聚糖，225ml 20％的乙酸，1.0g溴化十六烷基吡啶盐一水合物，以及28.6g乙酸酐化合得到11.56g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
实施例24
按照类似于实施例19所述的方法，使10.0g壳聚糖，225ml 20％的乙酸，1.0g氯化1-十二烷基吡啶盐一水合物，以及28.6g乙酸酐化合得到12.992g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
实施例25
按照类似于实施例19所述的方法，使10.0g壳聚糖，225ml 20％的乙酸，1.0g氯化1-苄基-3-羟基吡啶盐，以及28.6g乙酸酐化合得到11.43g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值和O-乙酰化值。
表11  吡啶盐对水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化壳聚糖的影响
试样  催化剂 DD值(％)(NMR测定)  O-乙酰化(％)(NMR测定)  水溶性(％)
Vanson壳聚糖 84  0  0.025
比较实施例A  无 63.5  16.9  0*
比较实施例B  无 66.7  12.3  0.10#
比较实施例C  无 55.6  21.3  0.015#
实施例23  CPB(1∶10)** 50.9  22.6  2.0
实施例24  DPCl(1∶10) 48.1  57.5  2.0
实施例25  BHPCl(1∶10) 50.4  30.8  2.0
*高粘性凝胶不能滤过#1滤纸
#只有少量的高粘性凝胶滤过#1滤纸
**催化剂重量∶壳聚糖重量
CPB＝溴化1-十六烷基吡啶盐，一水化合物
DPCl＝氯化十二烷基吡啶盐，一水化合物
BHPCl＝氯化1-苄基-3-羟基吡啶盐
实施例26
按照类似于实施例8所述的方法，使4.5g壳聚糖，400ml 10％的乙酸，1.0g溴化四丁基铵，以及9.0ml乙酸酐在室温下反应约18小时，得到5.6g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值为75.9％，O-乙酰化值为12.3％。水溶性为1.86％。
实施例27
1.5g实施例26所述的O-乙酰化壳聚糖，1.0g氢氧化钾和200ml甲醇的混合物在室温下搅拌18小时。过滤得到的产物并用2×100ml异丙醇洗涤。干燥的固体称重为1.12g。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值为76.2％，O-乙酰化值为1.2％。水溶性为2.0％。
实施例28
按照类似于实施例8所述的方法，使5.0g脱乙酰化程度为86％的壳聚糖，405ml 5％的乙酸，0.34g溴化四丁基铵，以及8.4ml乙酸酐反应得到5.63g固体。参照实施例8所述的1HNMR方法测定脱乙酰化程度(DD)值为64.7％，O-乙酰化值为2.5％。水溶性为2.0％。
在本申请的全文中，引用了多个出版文献。这些出版文献的公开整体合并于本申请中作为参考，以更全面描述本发明所属的技术领域。
对于本领域的技术人员来说，在不背离本发明的范围和精神的情况下，可对本发明作多种修改和变化。依据本发明此处公开的说明书和实践，本发明的其它实施方式对于本发明的技术人员是显而易见的。说明书和实施例仅用作示例，而以下的权利要求书中揭示了本发明真正的范围和精神。

Claims (55)

1.一种水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖或其衍生物，如通式I所示：
其中R1，R2和R3独立选自H或C(O)CH3，壳聚糖或其衍生物被部分乙酰化，以使R1的C(O)CH3取代程度为24到55％，R2的C(O)CH3取代程度为1到60％，且
m大于25，
其中部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖或其衍生物被任意取代且具有水溶性。
2.一种药用防腐组合物，包括：
(a)至少一种权利要求1所述的水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖或其衍生物，
(b)以及至少一种缓冲溶液。
3.权利要求2的组合物，其中至少一种缓冲溶液包括一种硼酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。
4.权利要求2的组合物，进一步包括至少一种生物杀灭佐剂。
5.权利要求4的组合物，其中至少一种生物杀佐佐剂包括EDTA。
6.权利要求2的组合物，其中组合物的pH范围是6到8。
7.权利要求2的组合物，进一步包括至少一种表面活性剂。
8.一种药用防腐组合物，包括混合权利要求2的组分a和b而得的产物。
9.一种隐形眼镜溶液，包括权利要求2的药用防腐组合物。
10.一种隐形眼镜溶液，包括混合权利要求2的组分a和b而得的产物。
11.一种对隐形眼镜溶液进行防腐处理的方法，包括使隐形眼镜溶液和权利要求2的组合物相混合。
12.权利要求11的方法，其中组分a和b的存在量使细菌金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌中的每一种在接种和再接种后的14天内减少至少99.99％(3对数)。
13.权利要求11的方法，其中组分a和b的存在量使黑曲霉和白色念珠菌中的每一种在接种和再接种后的14天内不生长。
14.一种对隐形眼镜进行消毒的方法，包括用权利要求2的组合物浸泡隐形眼镜达一段合适的时间。
15.权利要求13的方法，进一步包括用权利要求2的组合物擦拭和冲洗隐形眼镜。
16.一种制造水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖或其衍生物的方法，包括使任意取代的部分N，部分O-乙酰化的壳聚糖和碱在溶剂中进行反应。
17.由权利要求16的方法制备而得的产物。
18.一种药用防腐组合物，包括：
(a)至少一种权利要求17的产物，
(b)以及至少一种缓冲溶液。
19.一种药用防腐组合物，包括：
(a)至少一种壳聚糖或壳聚糖衍生物，
(b)至少一种缓冲溶液。
20.权利要求19的组合物，其中至少一种壳聚糖或壳聚糖衍生物包括：壳聚糖盐，水溶性壳聚糖，任意取代的水溶性部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖，壳聚糖寡糖，羧甲基壳聚糖，或羟烷基壳聚糖。
21.权利要求19的组合物，其中至少一种壳聚糖或壳聚糖衍生物包括乙二醇壳聚糖，羟丙基壳聚糖，二羟丙基壳聚糖，羟丁基壳聚糖或二羟丁基壳聚糖。
22.权利要求19的组合物，其中至少一种缓冲溶液包括硼酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。
23.权利要求19的组合物，进一步包括至少一种生物杀灭佐剂。
24.权利要求23的组合物，其中至少一种生物杀灭佐剂包括EDTA。
25.权利要求19的组合物，其中组合物的pH范围为6到8。
26.权利要求19的组合物，进一步包括至少一种表面活性剂。
27.一种隐形眼镜溶液，包括权利要求19的药用防腐组合物。
28.一种隐形眼镜溶液，包括混合权利要求19的组分a和b而得的产物。
29.一种药用防腐组合物，包括混合权利要求19的组分a和b而得的产物。
30.一种对隐形眼镜溶液进行防腐处理的方法，包括使隐形眼镜溶液和权利要求19的组合物相混合。
31.权利要求30的方法，其中组分a和b的存在量使细菌金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌中的每一种在接种和再接种后的14天内减少至少99.99％(3对数)。
32.权利要求30的方法，其中组分a和b的存在量使黑曲霉和白色念珠菌中的每一种在接种和再接种后的14天内不生长。
33.一种对隐形眼镜进行消毒的方法，包括用权利要求19的组合物浸泡隐形眼镜达一段合适的时间。
34.权利要求33的方法，进一步包括用权利要求19的组合物擦拭和冲洗隐形眼镜。
35.一种制备水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化的壳聚糖或壳聚糖衍生物，包括在酸性水溶液中溶解壳聚糖或壳聚糖衍生物，使壳聚糖或壳聚糖衍生物与乙酰化试剂在相转移试剂的存在下进行反应。
36.权利要求35的方法，其中水溶性任意取代的部分N-，部分O-乙酰化壳聚糖或壳聚糖衍生物在接近中性的pH值溶液中溶解。
37.权利要求36的方法，其中接近中性的pH值范围为6到8。
38.权利要求35的方法，其中相转移试剂包括至少一种方程式I的季铵盐：
[A]w[B]x[C]y[D]zN+Q                   方程式I
其中
w，x，y，z独立选自整数0到4，条件是w，x，y，z的总和为4；
Q为负离子，选自F-，Cl-，Br-，I-，CH3COO-，OH-，HSO4 -，NO3 -，PF6 -，BF4 -，HCOO-以及H2PO4 -，且
A，B，C，D分别选自C1-C18烷基；苯基，其中苯环未被取代或被C1-C8烷基，C1-C8烷氧基，卤素，羟基，苯氧基，硝基，羧基，乙酰胺基或芳基所取代；苄基；具有5-6个环原子的环烷基或杂环系统。
39.权利要求38的方法，其中季铵盐为氯化苄基三乙基铵，溴化四丁基铵，氯化四甲基铵，碘化四丁基铵，磷酸二氢化四丁基铵，或其混合物。
40.权利要求35的方法，其中相转移试剂包括至少一种方程式II的季膦盐：
[A]w[B]x[C]y[D]zP+Q-                方程式II
其中
w，x，y，z独立选自整数0到4，条件是w，x，y，z的总和为4；
Q为负离子，选自F-，Cl-，Br-，I-，CH3COO-，OH-，HSO4 -，NO3 -，PF6 -，BF4 -，HCOO-以及H2PO4 -，且
A，B，C，D分别选自C1-C18烷基；苯基，其中苯环未被取代或被C1-C8烷基，C1-C8烷氧基，卤素，羟基，苯氧基，硝基，羧基，乙酰胺基或芳基所取代；苄基；具有5-6个环原子的环烷基或杂环系统。
41.权利要求40的方法，其中季膦盐选自溴化十六烷基三丁基膦，溴化四丁基膦，或其混合物。
42.权利要求35的方法，其中相转移试剂包括至少一种冠醚。
43.权利要求42的方法，其中冠醚为15-冠-5，18-冠-6，顺-二环己醇-18-冠-6，二苯并-18-冠-6，或其混合物。
44.权利要求35的方法，其中相转移试剂包括至少一种吡啶盐。
45.权利要求44的方法，其中吡啶盐为溴化1-十六烷基吡啶盐一水合物，氯化1-十二烷基吡啶盐一水合物，氯化1-苄基-2-羟基吡啶盐，或其混合物。
46.权利要求35的方法，其中乙酰化试剂为乙酸酐。
47.权利要求35的方法，进一步包括从相转移试剂中分离出水溶性壳聚糖或其衍生物。
48.权利要求35的方法所制备而得的产物。
49.权利要求38的方法所制备而得的产物。
50.权利要求39的方法所制备而得的产物。
51.权利要求40的方法所制备而得的产物。
52.权利要求41的方法所制备而得的产物。
53.权利要求42的方法所制备而得的产物。
54.权利要求43的方法所制备而得的产物。
55.一种药用防腐组合物，包括：
(a)至少一种权利要求48的产物，
(b)以及至少一种缓冲溶液。
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