CN1491282A

CN1491282A - 异戊二烯醇的制备方法

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Publication number: CN1491282A
Application number: CNA018227147A
Authority: CN
Inventors: 大音德; 生; 小畑充生; 善; 村松正善; 彦; 仁志圣彦; 户塚一彦
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 2000-12-28
Filing date: 2001-12-20
Publication date: 2004-04-21
Also published as: JPWO2002053746A1; EP1354955A1; CA2433529A1; US7501268B2; EP1354955A4; US20070087425A1; JP3894119B2; WO2002053746A1

Abstract

一种制备异戊二烯醇的方法，其特征在于该方法包括：通过将一个表达重组DNA或一个用于基因组整合的DNA导入宿主内而构建一个重组体，这两种DNA均含有异戊二烯基二磷酸合酶基因或其变体基因；培养得到的重组体；然后从获得的培养基中收集异戊二烯醇。

Description

异戊二烯醇的制备方法

技术领域

本发明涉及异戊二烯醇的制备方法。

背景技术

萜类化合物(类异戊二烯)的生物合成，开始于香叶基二磷酸(GPP；C₁₀)，法呢基二磷酸(FPP；C₁₅)和香叶基香叶基二磷酸(GGPP；C₂₀)的合成，这三种物质都属于直链异戊二烯基二磷酸，顺次经由异戊烯基二磷酸(IPP；C₅)与一个烯丙基二磷酸底物的缩合反应进行(图1)。图1中，方框中的缩写和名称表示酶。特定的，hmgR表示羟甲基戊二酰基辅酶A(HMG辅酶A)还原酶；GGPS表示GGPP合酶；FPS表示FPP合酶。

在各种异戊二烯基二磷酸中，FPP是生物合成中最重要的中间体，也是许多种类萜类化合物合成的前体，例如，包括麦角固醇(维生素原D2)的类固醇，醌类物质的侧链(维生素K；VK)，倍半萜烯，(角)鲨烯(SQ)，法呢基化蛋白质的锚着分子，天然橡胶，等等。

GGPP也是萜类化合物生物合成的一个重要中间体，并对一些化合物的生物合成而言是必不可少的，诸如：视黄醇(维生素A；VA)，β-胡罗卜素(维生素原A)，叶绿醌(维生素K1；VK1)，香叶基香叶基蛋白质的锚着分子，叶绿素的侧链，赤霉素，以及古细菌的醚脂。

法呢醇(FOH；C₁₅)和香叶基香叶醇(GGOH；C₂₀)，分别是FPP和GGPP的醇衍生物，它们的异构体如橙花叔醇(NOH；C₁₅)是用于制造香水的香精油中的芳香物质。它们也在各种不同的化合物，包括上述作为药理剂的维生素的合成中作为重要的起始物质(图1)。

因此，希望能够建立一个体系，可大量制备所谓活性型异戊二烯醇的纯产物，而不是顺和反((Z)-和(E)-)两种异构体的混合物。

尽管业界普遍认为所有IPP的生物合成均通过甲羟戊酸途径完成(该途径中，IPP由乙酰辅酶A经由甲羟戊酸而合成)，但是M.Rohmer等人于80年代末阐明了利用细菌合成IPP的新途径。该途径被称为非甲羟戊酸途径或DXP(1-脱氧木酮糖5-磷酸)途径，该途径中，IPP由甘油醛-3-磷酸盐合成，丙酮酸经由1-脱氧木酮糖5-磷酸合成。

目前，GGOH是采用化学合成的方法制备的(例如，见日本未审查专利公开No.8-133999)。可是，化学法合成GGOH所需的步骤多于化学合成短碳链的FOH或NOH所需的步骤，因此也需要更高的成本。此外，尽管化学方法合成的GGOH和天然存在的GGOH相比，具有相同的碳骨架结构，但是获得的却是(E)-型(反式)和(Z)-型(顺式)、两种双键模式的混合物。(E，E，E)-GGOH(以下缩写为(全-E)-GGOH)是生物体代谢途径中合成的构型，具有工业价值。为获得单一构型的(全-E)-GGOH，需采用柱层析精炼，高精度蒸馏等方法。不过，由于GGOH是一种热不稳定的烯丙醇，因此很难采用高精度蒸馏的方法。同样，采用柱层析法精炼的方法也不适用于工业生产实践，因为该方法需要大量的溶剂和柱填料，还需要分析、回收连续洗脱馏分，及去除溶剂的复杂操作；因此，该方法不仅操作复杂而且需要很高的成本。目前情况下，希望能够建立一种通过控制顺反两种几何异构体的产生，或利用某些特性，如反应产物的重复结构来进行(全-E)-GGOH生物合成的方法。不过，这样的方法还没有建立起来。GGOH合成的底物由细胞，如芽殖的啤酒糖酵母细胞中的甲羟戊酸途径提供。然而，即使采用被认为是GGOH合成中的关键酶HMG辅酶A还原酶，其作用也仅增加了通过合成FPP来合成鲨烯的能力。(日本未审查专利公开No.5-192184；Donald et al.，(1997)Appl.Environ Microbiol.63，3341-3344)。此外，即使培养一种获得了固醇吸收能力的鲨烯合酶基因缺乏的特殊芽殖酵母菌株，也仅在培养液中显示出每升1.3mg的FOH积累量。(Chambon et al.，(1990)Curr.Genet.18，41-46)：而NOH的生物合成方法还不知道。关于GGOH的生物合成，在日本未审查专利公开No.9-238692中，通过培养植物细胞可得到每升培养液0.66-3.25mg的产率。不过，这一方法需要昂贵的、不适用于工业应用的植物细胞培养基，以及需要对培养细胞进行光照。因此，这一方法即使同传统的从天然产物，如香精油中制备GGOH的方法相比，都是不实用的。已经知道的方法中还没有适用于工业化的生物合成GGOH的方法，例如，通过培养微生物来生物合成GGOH。

发明内容

本发明的一个目标是提供一种通过培养重组DNA转化的重组体来制备异戊二烯醇的方法，该重组DNA含有一个异戊二烯基二磷酸合酶基因。

针对上述难题的解决方法进行了大量广泛而且集中的研究后，本发明人努力开发了异戊二烯醇的制备体系，即将与合成异戊二烯基二磷酸相关的酶基因导入宿主。作为宿主，采用的是那些很早就已经被广泛应用于发酵工业，可通过甲羟戊酸途径或DXP途径合成异戊二烯基二磷酸，且使用易于进行多种遗传工程技术改造的微生物，例如：单细胞真核生物(特别是酵母)或原核生物(如细菌，特别是大肠杆菌)。为了在酵母内构建与异戊二烯基二磷酸合成相关的酶基因(例如，以HMG辅酶A还原酶基因，IPPΔ-异构酶基因，多种异戊二烯基二磷酸合成酶基因，或其突变体或融合基因为代表的甲羟戊酸途径相关的酶基因)在宿主细胞内人工表达的体系，构建了含有组成型(永久表达型)或诱导型表达启动子、及各种营养缺陷标记的表达穿梭载体。然后，将一个关注的基因或其突变体整合到载体中，再将该载体导入宿主细胞。发明人成功地在得到的重组体的培养物中获得异戊二烯醇(特别是香叶基香叶醇)，达成上述目标。本发明也因而得以完成。当细菌，特别是大肠杆菌，被用作宿主时，采用了一种常规载体，将与异戊二烯基二磷酸合成相关的一种酶基因(例如：FPP合酶基因的突变体，或IPPΔ异构酶基因)导入宿主细胞。培养该重组体，脱磷酸化后，从得到的培养物中获得了香叶基香叶醇。这就达成了上述目标，本发明也得以完成。

本发明总结如下：

(1)一种制备异戊二烯醇(例如：香叶基香叶醇)的方法，包括：通过将均含有异戊二烯基二磷酸合酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA导入宿主而构建一个重组体；培养得到的重组体；及从得到的培养物中回收异戊二烯醇。

(2)一种制备异戊二烯醇的方法，包括：通过将均含有异戊二烯基二磷酸合酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA以及均含有羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA导入宿主而构建一个重组体；培养得到的重组体；及从得到的培养物中回收异戊二烯醇。

(3)一种制备香叶基香叶醇的方法，包括：通过将均含有异戊二烯基二磷酸合酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA以及均含有异戊烯基二磷酸Δ异构酶基因的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA导入宿主而构建一个重组体；培养得到的重组体；及从得到的培养物中回收香叶基香叶醇。

(4)异戊二烯基二磷酸合酶基因可选自下列基因(a)和(b)以及融合基因(c)和(d)：

(a)法呢基二磷酸合酶基因或其突变体

(b)香叶基香叶基二磷酸合酶基因或其突变体

(c)由法呢基二磷酸合酶基因或其突变体和香叶基香叶基二磷酸合酶基因或其突变体组成的融合基因

(d)添加一个编码His Asp Glu Leu氨基酸序列的核苷酸序列的上述基因(a)或(b)或融合基因(c)。

法呢基二磷酸合酶基因的特定实例包括：一个编码如SEQ ID NO：2或4中所示氨基酸序列的基因；香叶基香叶基二磷酸合酶基因的特定实例包括：一个编码如SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的基因。

(5)一种制备香叶基香叶醇的方法，包括：通过将均含有羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA导入宿主而构建一个重组体；培养得到的重组体；及从得到的培养物中回收香叶基香叶醇。

(6)一种制备香叶基香叶醇的方法，包括：通过将均含有羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA以及含有选自下列(e)到(j)的基因的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA导入宿主而构建一个重组体：

(e)异戊烯基二磷酸Δ-异构酶基因

(f)甲羟戊酸激酶基因

(g)乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因

(h)羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因

(i)磷酸甲羟戊酸激酶基因

(j)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因

培养得到的重组体；及从得到的培养物中回收香叶基香叶醇。

(7)根据上述的方法，可制备出浓度至少为0.05mg/L的香叶基香叶醇。在这些方法中可采用宿主的特定实例包括酵母(例如：啤酒糖酵母)和大肠杆菌。在这些方法中可采用的优选啤酒糖酵母株包括：A451株，YPH499株，YPH500株，W303-1A株和W303-1B株，或这些菌株的任意一种衍生的菌株。

(8)一个用于表达的重组DNA，含有选自上述基因(a)、基因(b)、融合基因(c)和融合基因(d)中的任一基因，以及转录启动子和转录终止子。

(9)转录启动子可选自ADH1启动子、TDH3(GAP)启动子、TEF2启动子、GAL1启动子和tac启动子的任意一个；转录终止子可以是CYC1终止子。

(10)一种重组体，该重组体是通过将上述重组DNA导入宿主而获得的。宿主的特定实例如上所述。

(11)一种制备异戊二烯醇的方法，包括：采用含下列组分(i)-(vi)之一的培养基，培养具有产生异戊二烯醇能力的微生物：

(i)糖

(ii)醇

(11i)氨气，氨水和/或铵盐

(iv)氢氧化钠和硫酸的混合物

(v)KH₂PO₄、硫酸镁、硫酸铵、玉米浸渍液、氯化钙和表面活性剂的混合物

(vi)上述组分(i)-(v)中的两种或以上的混合物；

并且从得到的培养物中回收异戊二烯醇。

在上文(11)中所描述的方法中，可以使用补料液培养微生物，该补料液含有下列组分(i)、(ii)或(iii)或这些组分中的两种或两种以上的混合物：

(i)糖

(ii)醇

(iii)氨气、氨水和/或铵盐。

补料液可含有下述的组分，也可按下述方式添加到培养基中，例如：

简言之，补料液的碳源组分从培养开始到培养开始后12-24小时之间仅由葡萄糖组成，在此之后碳源组分更换为含乙醇的组分。这一更换可按照如下方式进行，即在培养开始12-24小时后，乙醇与补料液中总碳源组分的比率为50％或以上。作为选择，在培养开始12-24小时后，补料液的碳源组分可仅由乙醇组成。

术语“补料”指：在培养过程中，将一种特定的溶液或组分以任意方式补充或添加进培养液中。将特定组分补充或添加进发酵罐的培养方法被称为“补料分批培养”。

异戊二烯醇在培养物中积累的浓度至少为0.1g/L或更高，优选地为1g/L或更高。香叶基香叶醇可作为异戊二烯醇的一个特定实例；微生物的特定实例包括酵母，如啤酒糖酵母。本发明可采用啤酒糖酵母A451株、YPH499株、W303-1A株或W303-1B株，或任一上述菌株的衍生菌株。

此外，在上文(11)描述的方法中，优选的微生物是重组体。这样的重组体的特定实例，可以是下面的(a)或(b)：

a)通过将均含有甲羟戊酸途径相关基因或其突变体，或异戊二烯基二磷酸合酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA导入宿主而构建的重组体。

b)通过将均含有异戊二烯基二磷酸合酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA以及均含有甲羟戊酸途径相关基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA导入宿主而构建的重组体。

宿主的特定实例包括啤酒糖酵母。更为明确地可采用啤酒糖酵母A451株、YPH499株、YPH500株、W303-1A株或W303-1B株，或任一上述菌株的衍生菌株。

甲羟戊酸途径相关基因的特定实例包括羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(即HMG1基因)。

异戊二烯基二磷酸合酶基因的特定实例，包括选自下列基因(a)、基因(b)、融合基因(c)和融合基因(d)的任意基团：

(a)法呢基二磷酸合酶基因或其突变体

(b)香叶基香叶基二磷酸合酶基因或其突变体

此外，本发明采用的微生物可以是一种原养型微生物、一种双倍体细胞，或者既是原养型微生物，也是双倍体细胞。

此外，本发明以培养基pH控制为特征。pH控制是通过采用如氨气、铵盐溶液、氢氧化钠溶液或硫酸来实现的。

下文中，将对本发明进行更为具体的描述。本说明含公开于日本专利申请No.2000-403067的说明书和/或附图中的内容，基于此专利申请，本申请要求优先权。

利用代谢工程技术，本发明人试图建立一个制备活性异戊二烯醇，尤其是(全-E)-香叶基香叶醇(以下称为“GGOH”)的体系。

业界相信GGOH是以香叶基香叶基二磷酸为前体(GGPP)合成而来。通常，简单地提高GGPP合酶活性将仅引起从异戊烯基二磷酸(IPP)和3，3-二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)合成GGPP的加速，而且不可预知这种提高是否会导致GGOH的产生(图1)。另外，已知在体内，GGPP仅作为类胡罗卜素和异戊二烯化的蛋白质等多种终产物合成的前体(图1)。这样，即使在GGPP合成加速、这些终产物水平也可望提高的情况下，仍不可预知是否能够建立一种具有工业应用价值的GGPP合成体系。即使通过提高HMG辅酶A还原酶的酶活性或上文列于(e)-(j)中的酶的活性，从而提高了HMG辅酶A还原酶(一种甲羟戊酸途径中的关键酶)的表达水平，仍不可预知哪种合成(即FPP合成或GGPP合成)会加强；因此，不能期望上述表达水平的提高对GGPP的合成是有效果的。此外，根据迄今为止积累的资料，也不能预期FPP合酶基因的表达(FPP合酶催化法呢基二磷酸(FPP)的合成，是FOH的前体)会对GGOH的制备有效(图1)。

本发明中，通过构建用于将异戊二烯基二磷酸合酶基因、HMG辅酶A还原酶基因和/或IPPΔ-异构酶基因导入宿主细胞的各种重组DNA，及用这些重组DNA构建重组体，发明人从而发展了大量制备异戊二烯醇、特别是GGOH的体系。

1.用于表达的重组DNA或用于基因组整合的DNA片段的制备

本发明中，通过将一个转录启动子DNA和一个转录终止子DNA连接或插入到一个异戊二烯基二磷酸合酶基因内，可获得用于转化宿主细胞的一个用于表达的重组DNA的实例。预先制备一个含有异戊二烯基二磷酸合酶基因的基因表达盒也是可能的，该异戊二烯基二磷酸合酶基因已连接了一个转录启动子和一个转录终止子，然后将该基因表达盒整合到一个载体内。启动子和终止子的连接或插入可按任意顺序进行，但优选的是将启动子和终止子分别连接到异戊二烯基二磷酸合酶基因的上游和下游。作为选择，本发明中，一个异戊二烯基二磷酸合酶基因，一个转录启动子和一个转录终止子可被顺序掺入一个适当的DNA，如一个载体中。如果正确地考虑转录方向，就可按任意顺序完成掺入。

异戊二烯基二磷酸合酶基因的特定实例包括：法呢基二磷酸合酶基因(称为“FPP合酶基因”)和香叶基香叶基二磷酸合酶基因(称为“GGPP合酶基因”)。FPP合酶基因的特定实例包括：啤酒糖酵母ERG20(SEQ ID NO：1)、大肠杆菌ispA(SEQ ID NO：3)和嗜热脂肪芽孢杆菌来源的FPP合酶基因(日本未审查专利公开No.5-219961；美国专利No.5,786,192)。GGPP合酶基因的特定实例包括啤酒糖酵母BTS1(SEQ ID NO：5)，嗜酸热硫化叶菌(日本未审查专利公开No.7-308913；美国专利No.5,773,273)和栖热嗜热菌Tth(日本未审查专利公开No.9-107974；美国专利No.6,107,072)。这些基因可通过常规基因分离方法或使用商业试剂盒而获得。本发明中，也可能采用一个FPP合酶基因的突变体或一个GGPP合酶基因的突变体。

此外，本发明中，可构建一个载体，该载体含有一个由GGPP合酶基因或其突变体和FPP合酶基因或其突变体组成的融合基因，使得经GGPP合酶基因和FPP合酶基因表达产生的多肽具有融合蛋白的形式。本发明中，这样一种用两种或两种以上基因构建、使融合蛋白作为一种表达产物而产生出来的基因，被称为“融合基因”。为制备融合基因，可采用下述方法，即用一种适当的限制性内切酶消化一个DNA，然后将用同一种酶作用下预消化的另一个DNA以特定的方式连接到前一个DNA，该方式中后者DNA编码的蛋白质的氨基酸序列的读码框架不发生移码。

此外，本发明中，为添加内质网(ER)过渡信号(氨基酸序列表现为His Asp Glu Leu(SEQ ID NO：24)；下文参见“HDEL序列”)到异戊二烯基二磷酸合酶基因或其突变体或上述融合基因表达产生的蛋白质的C-端上，编码该氨基酸序列的核苷酸序列可被添加到异戊二烯基二磷酸合酶基因或融合基因上，从而构建出一种修饰的基因。

此外，本发明中，通过将单独的羟甲基戊二酰辅酶A(HMG辅酶A)还原酶基因(SEQ ID NO：7)或其突变体，或含上述异戊二烯基二磷酸合酶基因(包括其突变体)的融合基因导入宿主中，并表达基因，也可能制备异戊二烯醇(特别是GGOH)。作为选择，也可将异戊二烯基二磷酸合酶基因或其突变体和HMG辅酶A还原酶基因或其突变体一起导入宿主中，从而共表达两种基因。HMG辅酶A还原酶基因的特定实例包括啤酒糖酵母HMG1和HMG2。

上述异戊二烯基二磷酸合酶基因和HMG辅酶A还原酶基因的突变体可以是缺失突变体基因，即有一部分区域的缺失(例如：HMG辅酶A还原酶基因最多可缺失2217个核苷酸)，或者是在野生型基因或上述缺失突变基因的核苷酸序列中具有缺失、替代或添加1个或几个至10个核苷酸的突变基因。因此，由这样的突变基因编码的氨基酸序列可能有一个(或多个)突变。特定的，野生型异戊二烯基二磷酸合酶的氨基酸序列(FPP合酶：SEQ ID NO：2或4；GGPP合酶：SEQ ID NO：6)或野生型MMG辅酶A还原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)可能有一个(或多个)突变，如缺失、替代或添加一个或几个氨基酸(例如：1-10个，优选的是1-3个)。野生型HMG辅酶A还原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)最多有739个氨基酸的缺失，且这种缺失突变型酶还可能进一步发生一个(或几个)突变，例如缺失、添加、替代或插入了一个或几个氨基酸(例如：1-10个，优选的是1-3个)。特定的，本发明可采用图2B中阐明的野生型HMG辅酶A还原酶基因或其缺失突变体，且由于核苷酸替代的原因，由它们编码的氨基酸序列可能会有1-10个位点特异性替代，可参见图2A。此外，当一个野生型异戊二烯基二磷酸合酶(例如：SEQ ID NO：1，3或5)或野生型HMG辅酶A还原酶基因(SEQ ID NO：7)经PCR(聚合酶链反应)扩增后，由于DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶的低准确性，使得核苷酸的替代突变发生在得到的DNA片段上，被称为“PCR错误”。例如在本发明中可用到的一种HMG辅酶A还原酶基因所编码的多肽具有替代突变，该突变是由于以野生型HMG辅酶A还原酶基因(SEQ ID NO：7)为模板，由于PCR错误造成的核苷酸替代引起的；该HMG辅酶A还原酶基因被命名为“HMG1”。在以野生型HMG辅酶A还原酶基因(SEQ ID NO：7)为模板，由于PCR错误造成的核苷酸替代的实施方案见图2A。HMG1’具有如SEQ ID NO：9中所示的核苷酸序列，由其编码的氨基酸序列如SED ID NO：10中所示。图2A中，核苷酸突变按如下顺序表示：替代前的相关核苷酸(以一个字母代码表示)，按照在野生型HMG辅酶A还原酶基因的起始密码子中第一个核苷酸的位置为1进行记数的该核苷酸的位置，替代后的核苷酸(以一个字母代码表示)。包含在PCR错误型HMG辅酶A还原酶的氨基酸序列中的氨基酸突变，按如下顺序表达：替代前的相关氨基酸(以一个字母代码表示)，该氨基酸在HMG辅酶A还原酶中的位置，替代后的氨基酸(以一个字母代码表示)。此外，上述的PCR错误型核苷酸序列可通过诸如定点诱变的技术进行部分修饰。这种修饰过的HMG辅酶A还原酶基因也可用于本发明。PCR错误引起的核苷酸替代的实施方案如图2A所示。此外，上述的PCR错误类型核苷酸序列可通过诸如定点诱变形成技术进行部分修饰。编码该修饰型HMG辅酶A还原酶(SEQ ID NO：12)的基因(SEQ ID NO：11)也可用于本发明。

此外，PCR错误型HMG辅酶A还原酶基因HMG1’的缺失突变体HMG1Δ基因(Fig 2B)可作为HMG辅酶A还原酶基因(包括PCR错误型)的一个实例，该基因编码了预测跨膜域缺失的缺失突变体。该图中最高一行表示没有缺失的HMG1’。由细实线(一)指出的部分表示缺失区域。下表1显示在每个缺失突变体基因中，HMG1’基因(SEQ ID NO：9)缺失了哪一个区域。根据缺失模式，HMG1’缺失突变体表示为“HMG1Δxxy”，“xx”表示缺失模式，“y”是一个工作数字(任意数字)。图2B中，“Δ026”即HMG1Δ02y的一个实例。(其它缺失模式实例也以相同方式表达)

表1

缺失的实施方式

预测跨膜

缺失突变体域的缺失

的命名引物1 引物2 质粒 (s) 缺失区域缺失后序列

HMG1Δ02y HMG1(558-532) HMG1(799-825) pYHMG02X #2-#3 Nucleotide Positions 559-798 SEQ ID NO：13

HMG1Δ04y HMG1(1191-1165) HMG1(1267-1293) pYHMG04X #6 Nucleotide Positions 1192-1266 SEQ ID NO：14

HMG1Δ05y HMG1(1380-1354) HMG1(1573-1599) pYHMG05X #7 Nucleotide Positions 1381-1572 SEQ ID NO：15

HMG1Δ06y HMG1(558-532) HMG1(1267-1293) pYHMG06X #2-#6 Nucleotide Positions 559-1266 SEQ ID NO：16

HMG1Δ07y HMG1(558-532) HMG1(1573-1599) pYHMG07X #2-#7 Nucleotide Positions 559-1572 SEQ ID NO：17

HMG1Δ08y HMG1(27-1) HMG1(1573-1599) pYHMG08X #1-#7 Nucleotide Positions 27-1572 SEQ ID NO：18

HMG1Δ10y HMG1(27-1) HMG1(1816-1842) pYHMG10X #1-#7(-605aa) Nucleotide Positions 27-1815 SEQ ID NO：19

HMG1Δ11y HMG1(27-1) HMG1(1891-1917) pYHMG11X #1-#7(-631aa) Nucleotide Positions 27-1890 SEQ ID NO：20

HMG1Δ12y HMG1(27-1) HMG1(1990-2016) pYHMG12X #1-#7(-663aa) Nucleotide Positions 27-1989 SEQ ID NO：21

HMG1Δ13y HMG1(27-1) HMG1(2218-2244) pYHMG13X #1-#7(-739aa) Nucleotide Positions 27-2217 SEQ ID NO：22

引物序列

HMG1(27-1) 5′TTT CAG TCC CTT GAA TAG CGG CGG CAT 3′ SEQ ID NO：77

HMG1(558-532) 5′GTC TGC TTG GGT TAC ATT TTC TGA AAA 3′ SEQ ID NO：61

HMG1(799-825) 5′CAC AAA ATC AAG ATT GCC CAG TAT GCC 3′ SEQ ID NO：78

HMG1(1191-1165) 5′AGA AGA TAC GGA TTT CTT TTC TGC TTT 3′ SEQ ID NO：79

HMG1(1267-1293) 5′AAC TTT GGT GCA AAT TGG GTC AAT GAT 3′ SEQ ID NO：80

HMG1(1380-1354) 5′TTG CTC TTT AAA GTT TTC AGA GGC ATT 3′ SEQ ID NO：81

HMG1(1573-1599) 5′CAT ACC AGT TAT ACT GCA GAC CAA TTG 3′ SEQ ID NO：62

HMG1(1816-1842) 5′GCA TTA TTA AGT AGT GGA AAT ACA AAA 3′ SEQ ID NO：82

HMG1(1891-1917) 5′CCT TTG TAC GCT TTG GAG AAA AAA TTA 3′ SEQ ID NO：83

HMG1(1990-2016) 5′TCT GAT CGT TTA CCA TAT AAA AAT TAT 3′ SEQ ID NO：84

HMG1(2218-2244) 5′AAG GAT GGT ATG ACA AGA GGC CCA GTA 3′ SEQ ID NO：85

此外，本发明中，通过将一个异戊烯基二磷酸Δ-异构酶(IPPΔ-异构酶)基因和上述异戊二烯基二磷酸合酶基因或其突变体一起导入宿主中而制备异戊二烯醇，尤其是GGOH，也是可能的。IPPΔ-异构酶基因的特定实例包括大肠杆菌来源的idi(SEQ ID NO：32)。异戊二烯基二磷酸合酶基因的特定实例包括大肠杆菌来源的ispAm突变基因(Y79M：SEQ ID NO：37；Y79E；SEQ ID NO：35；Y79D：SEQ ID NO：33)和嗜热脂肪芽孢杆菌来源的fpsm(Y81M：SEQ ID NO：39)。从ispA来源的突变基因编码突变酶，其中位于野生型FPP合酶(SEQ IDNO：4)79位上的氨基酸残基Tyr经替代突变被改变为Asp(SEQ IDNO：34)、Glu(SEQ ID NO：36)或Met(SEQ ID NO：38)。

本发明用到的DNA只要可在宿主细胞中遗传保留，就不用特定限制。可采用DNA的特定实例包括：质粒DNA、噬菌体、逆转录转座子DNA、酵母人工染色体DNA(YAC：酵母人工染色体)等。至于用于基因组整合的DNA片段，这些片段不需要复制能力。这样就可采用PCR或化学合成的方法制备DNA片段。

可用质粒DNA的特定实例包括YCp型大肠杆菌-酵母穿梭载体，如：pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112或pAUR123；YEp型大肠杆菌-酵母穿梭载体，如：pYBS2或YEp13；YIp型大肠杆菌-酵母穿梭载体，如：pRS403，pRS404，pRS405，pRS406，pAUR101或pAUR135；大肠杆菌衍生质粒(例如：ColE质粒，如：pBR322，pBR325，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pTV118N，pTV119N，pBluescript，pHSG298，pHSG396或pTrc99A；p15A质粒，如：pACYC177或pACYC184；和pSC101质粒，如：pMW118，pMW119，pMW218或pMW219)和枯草芽孢杆菌衍生质粒(例如：pUB110，pTP5)。可用的噬菌体DNA的特定实例包括λ噬菌体(Charon4A，Charon21A，EMBL3，EMBL4，λgt10，λgt11，λZAP)，φX174，M13mp18和M13mp19。可用的逆转录转座子的特定实例包括Ty因子。YAC载体的特定实例包括pYACC2。

当将各种重组DNA导入宿主时，很多情况下会采用选择性标记基因。不过，如果有一种合适的分析方法，采用标记基因并不是必要的。

组成型(永久表达型)启动子或诱导型启动子都可作为转录启动子。术语“组成型启动子”意指一个涉及主要代谢途径的基因的转录启动子。这样的启动子在很多生长条件下都具有转录能力。“诱导型启动子”意指仅在特定生长条件下才具有转录活性的启动子，且其转录活性在其他生长条件下受到抑制。

只要在诸如酵母的宿主内具有转录活性，任何转录启动子都可被采用。例如：GAL1启动子、GAL10启动子、TDH3(GAP)启动子、ADH1启动子、TEF2启动子或相似的启动子都可用于酵母内的表达。用于大肠杆菌表达的启动子，可采用trp启动子、lac启动子、trc启动子、tac启动子等。

此外，如需要，重组DNA可包含顺式元件，如增强子，剪切信号，聚腺苷酸附加信号，选择性标记等。可用的选择性标记的特定实例包括标记基因，如：指示物是非营养缺陷型表型的URA3，LEU2，TRP1和HIS3，和抗生素抗性基因，如：Amp^r，Tet^r，Cm^r，Km^r和AUR1-C。

只要在诸如酵母的宿主内具有活性，就可采用来源于任何基因的转录终止子。对于酵母中表达，可采用ADH1终止子，CYC1终止子等终止子。对于大肠杆菌中表达，可采用rrnB终止子。为在细菌细胞中表达出感兴趣的基因，也可将一个SD序列(代表性的是：5’-AGGAGG-3’)作为核糖体结合位点整合到基因起始密码子的上游，用于有效翻译。

可通过在所用质粒名称之后指出相关基因名称来命名和识别本发明制备的表达载体，这些表达载体是作为用于基因转移的重组DNA。表2显示的是采用pRS435GAP质粒时，表达载体的名称和组成之间的关系。采用pRS434、pRS444、pRS445质粒和上述启动子组合时，也可以相同于pRS435GAP的方式描述所述关系。

表2

表达载体命名	组成
表达载体命名	组成	PRS435GG	连接了GGPP合酶基因BTS1的pRS435GAP质粒
pRS435F	连接了FPP合酶基因ERG20的pRS435GAP质粒	PRS435GG	连接了GGPP合酶基因BTS1的pRS435GAP质粒
pRS435F	连接了FPP合酶基因ERG20的pRS435GAP质粒	pRS435GGF	连接了一个融合基因的pRS435GAP质粒，该融合基因按顺序连接GGPP合酶基因BTS1和FPP合酶基因ERG20
pRS435FGG	连接了一个融合基因的pRS435GAP质粒，该融合基因按顺序连接FPP合酶基因ERG20和GGPP合酶基因BTS1	pRS435GGF	连接了一个融合基因的pRS435GAP质粒，该融合基因按顺序连接GGPP合酶基因BTS1和FPP合酶基因ERG20
pRS435FGG	连接了一个融合基因的pRS435GAP质粒，该融合基因按顺序连接FPP合酶基因ERG20和GGPP合酶基因BTS1	pRS435GGHDEL	连接了一个编码HDEL序列的核苷酸序列的pRS435GG质粒
pRS435FHDEL	连接了一个编码HDEL序列的核苷酸序列的pRS435F质粒	pRS435GGHDEL	连接了一个编码HDEL序列的核苷酸序列的pRS435GG质粒
pRS435FHDEL	连接了一个编码HDEL序列的核苷酸序列的pRS435F质粒	pRS435FGGHDEL	连接了一个编码HDEL序列的核苷酸序列的pRS435FGG质粒
pRS435GGFHDEL	连接了一个编码HDEL序列的核苷酸序列的pRS435GGF质粒	pRS435FGGHDEL	连接了一个编码HDEL序列的核苷酸序列的pRS435FGG质粒

当HMG1基因被连接到pRS434GAP质粒时，得到的载体表达为“pRS434GAP-HMG1”。表3显示的是采用pRS434GAP质粒时，表达载体的名称和其组成之间的关系。当采用pRS435GAP、pRS445GAP或类似的质粒时，名称与组成之间的关系也可以相同方式描述。

表3

表达载体名称	组成
表达载体名称	组成	pRS434GAP-HMG1 连接了HMG辅酶A还原酶基因HMG1的pRS434GAP质粒
pRS434GAP-HMG1Δ 连接了HMG辅酶A还原酶基因HMG1的缺失突变基因HMG1Δ的pRS434GAP质粒		pRS434GAP-HMG1 连接了HMG辅酶A还原酶基因HMG1的pRS434GAP质粒

2.重组体的制备

通过将本发明的各种重组DNA以特定方式导入宿主，可以获得本发明的重组体，该方式即：能够表达不同异戊二烯基二磷酸合酶基因或其融合基因、和/或HMG辅酶A还原酶基因(包括这些基因的突变体；无另外说明，也适用于本发明的其余部分)、或IPPΔ异构酶基因。本发明采用的宿主类型无需特别限定。只要是可产生异戊二烯醇的宿主，就可采用。优选的宿主是酵母或大肠杆菌。

本发明中，将包含一个转录启动子、一个转录终止子、一个异戊二烯基二磷酸合酶基因、HMG辅酶A还原酶基因、IPPΔ异构酶基因或上文中(e)-(j)所列基因之一的重组DNA导入包括单细胞真核生物如酵母在内的真菌、原核生物、动物细胞、植物细胞等；从而获得重组体。

本发明可采用的真菌包括：粘菌、藻状菌、子囊菌、担子菌和半知菌。在真菌当中，一些单细胞真核生物如酵母在工业应用上扮演重要角色。可以列举出属于子囊菌、担子菌、或半知菌的酵母。本发明可采用酵母的特定实例包括属于子囊菌的酵母，尤其是芽殖酵母，如啤酒糖酵母(称作Baker’s酵母)、产朊假丝酵母或毕赤巴斯德酵母；裂殖酵母，如粟酒裂殖酵母。本发明可采用的酵母菌株只要可产生异戊二烯醇就无需特别限定。在采用啤酒糖酵母的情况下，可采用菌株的特定实例包括如下所示的A451、EUG5、EUG8、EUG12、EUG27、YPH499、YPH500、W303-1A、W303-1B、ATCC28382、AURGG101、AURGG102、AH1和YH1。就将重组DNA导入酵母中的方法而言，可应用电穿孔方法、原生质球法、或乙酸锂方法。

A451(ATCC200589，MATa can1 leu2 trp1 ura3 aro7)

YPH499(ATCC76625，MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ63 his3-Δ200leu2-Δ1，Stratagene，La Jolla，CA)

YPH500(ATCC76626，MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ63 his3-Δ200leu2-Δ1，Stratagene)

W303-1A(MATa leu2-3 leu2-112 his3-11 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100)

W303-1B(MATa leu2-3 leu2-112 his3-11 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100)

AURGG101(A451，aur1::AUR1-C)：本发明构建的A451衍生菌株；整合有AUR1-C基因。

AURGG102(A451，aur1::GAL1p-BTS1&AUR1-C)：本发明构建的A451衍生菌株；含有GAL1启动子，BTS1和CYC1终止子及AUR1位点上的AUR1-C基因。

EUG5，EUG8(A451，ERG9p::URA3-GAL1p)：本发明构建的A451衍生菌株；含有鲨烯合酶基因ERG9，转化株选择标记基因URA3和转录启动子GAL1p。

EUG12(YPH499，ERG9p::URA3-GAL1p)：本发明构建的YPH499衍生菌株；含有ERG9，URA3和GAL1p。

EUG27(YPH500，ERG9p::URA3-GAL1p)：本发明构建的YPH500衍生菌株；含有ERG9，URA3和GAL1p。

AH1菌株(pRS434GAP-HMG1/A451)：本发明构建的A451衍生菌株；A451菌株中导入有pRS434GAP-HMG1。

YH1菌株(pRS434GAP-HMG1/YPH499)：本发明构建的YPH499衍生菌株；YPH499菌株中导入有pRS434GAP-HMG1。

本发明可采用的原核生物包括古生菌和细菌。就古生菌而言，可列举出：产甲烷微生物，如甲烷杆菌；嗜盐微生物，如嗜盐杆菌；和嗜温嗜酸微生物，如硫化叶菌。就细菌而言，可列举出多种在工业或科学研究领域具有非常高应用价值的革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，如：埃希氏菌，如大肠杆菌；杆菌，如枯草芽孢杆菌或短芽孢杆菌；假单胞菌，如恶臭假单胞菌；土壤杆菌，如根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌；棒状杆菌，如谷氨酸棒杆菌；乳酸菌，如胚芽乳杆菌和放射菌，如放线菌或链霉菌。

当一种细菌，如大肠杆菌被用做宿主时，本发明优选的重组DNA可在宿主内自主复制，且由一个转录启动子，一个如核糖体RNA结合位点的SD序列，和本发明的基因组成。该重组DNA中也可正确插入一个转录终止子，该DNA还可包含控制启动子的基因。本发明采用的大肠杆菌菌株的特定实例包括：BL21，DH5α，HB101，JM101，JM109，MV1184，TH2，XL1-Blue和Y-1088，但不仅限于这些菌株。就转录启动子而言，只要可在宿主，如大肠杆菌中，指导本发明基因的表达，就可以采用。例如，可采用一种大肠杆菌或噬菌体来源的启动子，如trp启动子，lac启动子，P_L启动子或P_R启动子。也可采用人工改变过结构的启动子。就导入重组载体到细菌的方法而言，可采用将DNA转移入细菌的方法。如，可采用利用钙离子、电穿孔等方法。

可运用PCR(聚合酶链反应)法或DNA印迹杂交法验证本发明的基因是否被导入宿主细胞内。例如，从得到的重组体制备DNA，采用一对特异于转移动DNA的引物，进行PCR。然后，将扩增产物经由琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳纯化，继而由溴化乙啶、SYBR Green溶液等进行染色，或用紫外检测仪进行DNA的检测。通过检测扩增产物是一条谱带或谱峰，就可验证转移的DNA。作为选择，可通过带荧光染料或类似物的标记引物进行PCR操作，由此检测扩增产物。

3.异戊二烯醇的制备

本发明通过培养上述重组体，该重组体含有一个异戊二烯基二磷酸合酶基因或其突变体(包括融合基因)、和/或一个HMG辅酶A还原酶基因或其突变体、或一个选自上文(e)-(j)的甲羟戊酸途径相关酶基因；及从得到的培养物中进行回收，从而可获得异戊二烯醇。此处所用术语“培养物”指下列任一物质：培养上清液、培养细胞或微生物本身、或来自培养细胞或微生物中的破裂产物。本发明重组体的培养采用培养其宿主的传统方法。GGOH可作为异戊二烯醇的一个特定实例。异戊二烯醇可单独或以混合物形式在培养物中积累。

就培养得自微生物宿主的重组体的培养基而言，无论天然或合成的培养基，只要含有可被微生物同化的碳源、氮源和无机盐，并可有效培养重组体，都可被采用。就碳源而言，可列举出：碳水化合物，如葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、棉子糖、淀粉；有机酸，如乙酸、丙酸；醇类，如乙醇和丙醇。就氮源而言，可列举：氨水；无机或有机酸的铵盐，如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵；其它含氮化合物；蛋白胨；肉提取物；玉米浸渍液，多种氨基酸，等。就无机物而言，可列举出：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙，等等。通常，重组体在通氧、26-42℃的条件下进行培养。但宿主为啤酒糖酵母时，优选的是在30℃培养重组体2-7天；当宿主为大肠杆菌时，在37℃培养重组体12-18小时。pH的调节是利用无机或有机酸、碱溶液等物质来进行的。

在培养一个整合了含有可诱导的转录启动子的表达载体的重组体时，可在需要时向培养基中添加一种诱导剂。例如，在载体中用到GAL1启动子时，可采用半乳糖作为碳源。在培养用含有一个可用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子的表达载体转化的微生物时，可在培养基中添加IPTG。

在上述条件下进行培养，宿主可高产量地产出异戊二烯醇。为大量制备异戊二烯醇，可应用一种发酵罐培养设备。尤其是当宿主为YPH499啤酒糖酵母，且导入的质粒DNA为pRS435GGF或pRS434GAP-HMG1时，重组体可产出每升培养基1.5mg甚至更多的异戊二烯醇；根据培养条件，重组体可产出128mg甚至更多的异戊二烯醇。

本发明中，通过添加诸如萜类化合物、油类、或表面活性剂之类的物质，有可能提高异戊二烯醇的产出率。这些添加物的特定实例包括如下物质：

萜类化合物：鲨烯、生育酚、IPP、DMAPP

油类：大豆油、鱼油、杏仁油、橄榄油

表面活性剂：Tergitol，Triton X-305，Span85，ADEKANOL LG109(Asahi Denka)，ADEKANOL LG294(Asahi Denka)，ADEKANOL LG295S(Asahi Denka)，ADEKANOL LG297(Asahi Denka)，ADEKANOL B-3009A(Asahi Denka)，ADEKA PLURONIC L-61(Asahi Denka)

油类浓度为0.01％或大于0.01％，优选为1-3％。表面活性剂的浓度为0.005-1％，优选为0.05-0.5％。萜类化合物浓度为0.01％或大于0.01％，优选为1-3％。

此外，本发明中，采用含有下列化合物(i)-(vi)中任意一种的培养基，并从得到的培养物中回收异戊二烯醇，也可培养具有产出异戊二烯醇能力的微生物。进一步采用含下述化合物(i)-(v)中任意一种的补料液可以进行补料-批式培养。

(i)糖

(ii)醇

(iii)氨气、氨水和/或铵盐

(iv)氢氧化钠和硫酸的混合物

(v)磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铵、玉米漫渍液、氯化钙和一种表面活性剂的混合物

(vi)两种或两种以上上述化合物(i)-(v)的混合物

上述的糖的特定实例包括：葡萄糖、蔗糖、半乳糖和乳糖。上述醇组合的特定实例包括：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。

就补料液中的碳源组分而言，优选的是葡萄糖和乙醇的组合，更为优选的是在培养基中添加用于控制pH的氨气或一种铵盐(例如：乙酸铵)。就补料方法而言，优选的是在培养开始到开始后12-24小时采用碳源仅为葡萄糖的补料液，然后就更换为乙醇作为另一种碳源组分的补料液。作为选择，葡萄糖可以是贯穿整个培养过程的单一碳源物质。乙醇在补料液中与总碳源中可以是任何比例。可以是50％或更多，甚至100％。

无需在培养基中补充特定营养物质就能增殖的菌株被称为原养型。通常，原养型是在营养需求上同相应的野生型菌株具有相同表型的菌株。另一方面，为构建重组体，营养缺陷型(营养缺陷型的突变菌株)经常被用做宿主菌株。可通过补充营养缺陷突变，将该营养缺陷型的表型改造成与相应原养型相同的表型。简言之，就是将对应于导致营养缺陷型突变的突变基因的一种野生型基因转移至营养缺陷体。当与导致营养缺陷型突变的突变基因相比，野生型基因更占优势时，也可采用具有野生型基因的菌株，通过交配或接合营养缺陷型来补充突变。本发明中，例如，通过将一些在产GGOH克隆(YH1菌株含一个由GGPP合酶基因与FPP合酶基因组成的融合基因)的基因组引起营养需求的突变基因替换为相应的野生型基因，然后用一种与保留的突变基因相比，具有优势的野生型基因的YPH500衍生克隆与上述得到的克隆杂交，可获得一种原养型。本发明中，优选的是采用是二倍体细胞，同时也是原养型的微生物。

培养后，如果微生物或细胞内产生醇，可采用诸如匀浆器处理破坏微生物或细胞，从而回收异戊二烯醇。作为选择，采用有机溶剂可无需破坏细胞直接提取出醇类物质。如果本发明的异戊二烯醇在微生物或细胞外产生，培养液将直接利用，或通过离心等方法除去微生物或细胞。因此，可通过例如有机溶剂抽提法，从培养物中提取出目的异戊二烯醇。如有必要，可通过多种类型的色谱法或类似方法提纯和分离异戊二烯醇。

本发明中，宿主菌株和载体的优选组合，及这些组合与异戊二烯醇产量之间的关系在下表4中阐明。

表4

启动子		基因	宿主	添加试剂	GGOH产量(mg/l)1	GGOH产量(mg/l)2	GGOH产量(mg/l)3
启动子		基因	宿主	添加试剂	GGOH产量(mg/l)1	GGOH产量(mg/l)2	GGOH产量(mg/l)3	宿主	----	----	Sc A451AURGG101Sc YPH499Ec JM109	----	(0.00-0.02)(0.00-0.02)(0.00)(0.00)
								宿主
	HMG1	GAPADH1GAL1GAL1GAPGAPGAP	HMG1HMG1HMG1HMG1HMG1HMG1HMG1	Sc A451Sc A451Sc A451Sc AURGG101Sc EUG8Sc EUG12Sc EUG27	-------	0.070.050.050.050.050.050.05	0.07-0.350.05-0.140.05-0.10.05-2.20.05-0.160.05-1.030.05-0.63	-------
	HMG1

HMG1Δ	GAL1 HMG1Δ044 Sc A451 - 0.05 - -
HMG1Δ	GAL1 HMG1Δ044 Sc A451 - 0.05 - -	GAL1 HMG1Δ056 Sc A451 - 0.05 0.05-0.07 -GAL1 HMG1Δ062 Sc A451 - 0.05 0.05-0.07 -GAL1 HMG1Δ078 Sc A451 - 0.05 - -GAL1 HMG1Δ081 Sc A451 - 0.05 - -GAL1 HMG1Δ112 Sc A451 - 0.05 0.05-0.06 -GAL1 HMG1Δ122 Sc A451 - 0.05 0.05-0.06 -GAL1 HMG1Δ044 Sc AURGG101 - 0.05 0.05-2.2 2.2-7.9GAL1 HMG1Δ062 Sc AURGG101 - 0.05 0.05-0.06 -GAL1 HMG1Δ075 Sc AURGG101 - 0.05 0.05-0.06 -GAL1 HMG1Δ081 Sc AURGG101 - 0.05 - -GAP HMGΔ044 Sc EUG5 - 0.05 0.05-0.09 -GAP HMGΔ056 Sc EUG5 - 0.05 0.05-0.11 -GAP HMGΔ062 Sc EUG5 - 0.05 0.05-0.13 -GAP HMGΔ076 Sc EUG5 - 0.05 0.05-0.15 -GAP HMGΔ081 Sc EUG5 - 0.05 0.05-0.14 -GAP HMGΔ100 Sc EUG5 - 0.05 0.05-0.18 -GAP HMGΔ112 Sc EUG5 - 0.05 0.05-0.34 -GAP HMGΔ122 Sc EUG5 - 0.05 0.05-0.13 -GAP HMGΔ133 Sc EUG5 - 0.05 0.05-0.71 -GAP HM6Δ026 Sc EUG12 - 0.05 0.05-0.63 -GAP HMGΔ044 Sc EUG12 - 0.05 0.05-0.44 -GAP HMGΔ056 Sc EUG12 - 0.05 0.05-0.40 -GAP HMGΔ062 Sc EUG12 - 0.05 0.05-0.45 -GAP HMGΔ076 Sc EUG12 - 0.05 0.05-0.55 -GAP HMGΔ081 Sc EUG12 - 0.05 0.05-0.49 -GAP HMGΔ100 Sc EUG12 - 0.05 0.05-0.44 -GAP HMGΔ112 Sc EUG12 - 0.05 0.05-0.53 -GAP HMGΔ122 Sc EUG12 - 0.05 0.05-0.50 -GAP HMGΔ133 Sc EUG12 - 0.05 0.05-0.44 -

HMG1+HMG1Δ	GAL1，GAP HMG1Δ044，HMG1 Sc AURGG101 - 0.27 0.27-0.93 -
HMG1+HMG1Δ	GAL1，GAP HMG1Δ044，HMG1 Sc AURGG101 - 0.27 0.27-0.93 -	FPS基因	GAP ERG20 Sc A451 - 0.05 0.05-0.07 -lac fpsm Ec JM109 IPP&DMAPP 6.9 6.9-16 -tac ispAm(Y79D) Ec JM109 IPP&DMAPP 0.06 0.06-0.12 -tac ispAm(Y79E) Ec JM109 IPP&DMAPP 0.14 0.14-0.26 -tac ispAm Ec JM109 IPP&DMAPP 6.0 6.0-22 -
		FPS基因
	BTS1(YIp)	GAL1 整合了BTS1 Sc A451(AURGG102) - 0.05 0.05-0.07 -GAL1 整合了BTS1 Sc YPH499(AURGG703) - 0.05 0.05-0.07 -
	BTS1(YIp)
	BTS1(YEp)		GAP BTS1 Sc A451 - 0.10 0.10-0.58 -GAP BTS1 Sc YPH499 - 0.05 0.05-0.15 -GAP BTS1 Sc EUG8 - 0.05 0.05-1.4 -GAP BTS1 Sc EUG12 - 0.05 0.05-1.6 -GAP BTS1 Sc EUG27 - 0.05 0.05-1.5 -
	BTS1(YEp)
	HMG1Δ+FPS基因	GAL1，GAP HMG1Δ044，ERG20 Sc AURGG101 - 0.38 0.38-11.3 -GAL1，GAP HMG1Δ044，ispA Sc AURGG101 - 0.11 0.11-1.64 -
	HMG1Δ+FPS基因
	HMG1+BTS1(YEp)		GAP，GAP HMG1，BTS1 Sc YPH499 - 0.14 0.14-0.58 -TEF，GAP HMG1，BTS1 Sc YPH499 - 0.13 0.13-0.63 -
	HMG1+BTS1(YEp)
	HMG1+BTS1(YIp)	GAP，GAL1 HMG1，BTS1 Sc AURGG102 - 0.05 0.05-1.3 -GAP，GAL1 HMG1，BTS1 Sc AURGG703 - 0.05 0.05-0.46 -
	HMG1+BTS1(YIp)
	HMG1Δ+BTS1(YEp)		GAL1，GAP HMG1Δ044，BTS1 Sc AURGG101 - 0.46 0.46-9.8 -
	HMG1Δ+BTS1(YEp)	GAP，GAL1 HMG1Δ027，整合了BTS1 Sc AURGG102 - 0.05 0.05-0.08 -GAP，GAL1 HMG1Δ044，整合了BTS1 Sc AURGG102 - 0.05 0.05-0.42 -GAP，GAL1 HMG1Δ045，整合了BTS1 Sc AURGG102 - 0.05 0.05-0.61 -GAP，GAL1 HMG1Δ059，整合了BTS1 Sc AURGG102 - 0.05 0.05-0.10 -GAP，GAL1 HMG1Δ062，整合了BTS1 Sc AURGG102 - 0.05 0.05-0.42 -GAP，GAL1 HMG1Δ063，整合了BTS1 Sc AURGG102 - 0.05 0.05-0.11 -GAP，GAL1 HMG1Δ075，整合了BTS1 Sc AURGG102 - 0.05 0.05-0.40 -GAP，GAL1 HMG1Δ083，整合了BTS1 Sc AURGG102 - 0.05 0.05-0.21 -GAP，GAL1 HMG1Δ094，整合了BTS1 Sc AURGG102 - 0.05 0.05-0.14 -GAP，GAL1 HMG1Δ106，整合了BTS1 Sc AURGG102 - 0.05 0.05-0.12 -GAP，GAL1 HMG1Δ122，整合了BTS1 Sc AURGG102 - 0.05 0.05-0.16 -GAP，GAL1 HMG1Δ123，整合了BTS1 Sc AURGG102 - 0.05 0.05-0.09 -GAP，GAL1 HMG1Δ134，整合了BTS1 Sc AURGG102 - 0.05 0.05-0.11 -GAP，GAL1 HMG1Δ044，整合了BTS1 Sc AURGG703 - 0.12 0.12-0.20 -GAP，GAL1 HMG1Δ062，整合了BTS1 Sc AURGG703 - 0.16 0.16-0.24 -	GAL1，GAP HMG1Δ044，BTS1 Sc AURGG101 - 0.46 0.46-9.8 -

HMG1Δ+MVN基因	GAL1，GAP HMG1Δ044，HMGS Sc AURGG101 - 0.20 0.20-1.3 -GAL1，GAP HMG1Δ044，ERG12 Sc AURGG101 - 0.21 0.21-1.0 -GAL1，GAP HMG1Δ044，ERG8 Sc AURGG101 - 0.12 0.12-2.7 -GAL1，GAP HMG1Δ044，ERG10 Sc AURGG101 - 0.17 0.17-1.22 -GAL1，GAP HMG1Δ044，ERG19 Sc AURGG101 - 0.05 0.05-1.89 -GAL1，GAP HMG1Δ044，ID11 Sc AURGG101 - 0.05 0.05-0.79 -GAL1，GAP HMG1Δ044，idi Sc AURGG101 - 0.43 0.43-1.2 -
HMG1Δ+MVN基因
FPS基因+idi			tac，idi ispAm，idi Ec JM109 - 0.07 - -
FPS基因+idi	FGG融合体	GAP ERG20-BTS1 Sc YPH499 - 0.06 0.06-0.27 -GAP ERG20-BTS1-HDEL Sc YPH499 - 0.05 0.05-0.12 -	tac，idi ispAm，idi Ec JM109 - 0.07 - -
	FGG融合体
	GGF融合体		GAP BTS1-ERG20 Sc A451 - 0.05 0.05-0.35 0.46-0.98GAP BTS1-ERG20 Sc YPH499 - 0.17 0.17-0.46 1.3-2.5GAP BTS1-ERG20 Sc EUG5 - 0.05 0.05-2.9 5.1-6.6GAP BTS1-ERG20 Sc EUG12 - 0.07 0.07-5.4 2.0-3.8GAP BTS1-ERG20-HDEL Sc A451 - 0.05 0.05-0.07 0.07-0.56GAP BTS1-ERG20-HDEL Sc YPH499 - 0.44 0.44-0.80 1.6-1.9GAP BTS1-ERG20-HDEL Sc EUG5 - 0.21 0.21-0.35 5.5-6.5GAP BTS1-ERG20-HDEL Sc EUG12 - 1.3 1.3-5.6 -
	GGF融合体
	HMG1+BTSHDEL	GAP，GAP HMG1，BTS1-HDEL Sc YPH499 - 0.14 0.14-0.23 -
HMG1+FGG融合体	HMG1+BTSHDEL	GAP，GAP HMG1，BTS1-HDEL Sc YPH499 - 0.14 0.14-0.23 -	GAP，GAP HMG1，ERG20-BTS Sc YPH499 - 0.20 0.20-0.46 -GAP，GAP HMG1，ERG20-BTS1-HDEL Sc YPH499 - 0.11 0.11-0.29 -
HMG1+FGG融合体	HMG1+GGF融合体	GAP，GAP HMG1，BTS1-ERG20 Sc A451 - 0.05 0.05-4.1 -GAP，GAP HMG1，BTS1-ERG20 Sc YPH499 - 0.46 0.46-2.1 2.1-128GAP，GAP HMG1，BTS1-ERG20-HDEL Sc A451 - 0.05 0.05-5.1 -GAP，GAP HMG1，BTS1-ERG20-HDEL Sc YPH499 - 1.0 1.0-1.9 2.2-5.6

在“GGOH产量”一栏中，标“1”的一栏显示的是下限，标“2”的一栏显示的是优选范围，标“3”的一栏显示的是更为优选的范围

“宿主”一栏中，“Sc”表示啤酒糖酵母，“Ec”表示大肠杆菌

“fps”表示嗜热脂肪芽胞杆菌FPS基因

“fpsm”表示嗜热脂肪芽胞杆菌FPSm(Y81M)基因

“idi”表示大肠杆菌IPP异构酸基因。/质粒为p3-47-13

“ispAm”表示大肠杆菌ispAm(Y79M)基因。/质粒为pALispA16m

(i)当质粒pRS445GG被导入宿主A451或YPH499菌株时，GGOH产量增加(大约平均为0.4mg/L)，该质粒是通过将GGPP合酶基因BTS1整合到pRS445GAP而得到的。

(ii)当通过将一个由GGPP合酶基因BTS1和FPP合酶基因ERG20组成的融合基因整合到质粒pRS435GAP或pRS445GAP而制备质粒pRS435FGG、pRS445FGG、pRS435GGF、pRS445GGF并将其导入宿主A451或YPH499菌株时；或当制备含有编码连接到上述融合基因一个末端的HDEL序列的核苷酸序列的质粒(即含有一个修饰基因的质粒，它使得HDEL序列被添加到通过融合基因表达产生的多肽的C-端)pRS435FGGHDEL、pRS445FGGHDEL或pRS435GGHDEL并将其导入A451或YPH499菌株时，具有ERG20-BTS1融合基因的菌株，能平均产出0.2mg/L的GGOH；具有BTS1-ERG20融合基因的菌株，能平均产出0.39mg/L的GGOH；具有BTS1-ERG20-HDEL融合基因的菌株，能平均产出0.62mg/L的GGOH。

(iii)当将质粒pRS434GAP-HMG1(整合了HMG辅酶A还原酶基因HMG1的pRS434GAP)和含有上述融合基因的质粒pRS435GGF导入宿主YPH499，且共表达时，该重组体平均产出1.55mg/L GGOH。当在YMO培养基(补充有大豆油等物质的YM培养基)中30℃培养该重组体7天，可产出5.61mg/L的GGOH。

(iv)当pRS435GGFHDEL和pRS434GAP-HMG1都被导入宿主YPH499中，并共表达，该重组体平均产出1.50mg/L的GGOH。当在YMO培养基中30℃培养该重组体7天，可产出5.64mg/L的GGOH。

(v)当pRS435GGF和pRS434GAP-HMG1都被导入宿主YPH499中，并在发酵罐中培养得到的重组体109小时，可产出128mg/L的GGOH。

(vi)当HMG辅酶A还原酶基因和GGF融合基因被共表达时，大多数重组克隆产出100mg/L或更多的GGOH，最多可产出189mg/L的GGOH。

(vii)当补料-分批培养pRS435GGF/YH3克隆时，该克隆是通过将一种共表达HMG辅酶A还原酶基因和GGF融合基因的克隆转化到一种原养型微生物中，并随后二倍化而获得的，培养开始20小时后采用500g/L的葡萄糖溶液作为补料液，该克隆产生0.47g/L的GGOH；采用400g/L乙醇溶液作为补料液时，该克隆产生1.16g/L的GGOH。

(viii)当补料-分批培养pRS435GGF/YH3克隆时，下列条件下，该克隆能够产生2.5g/L的GGOH：培养开始21小时后乙醇占补料液中总碳源比例为71％，且补料液中添加有乙酸铵。

附图简述

图1为一幅显示甲羟戊酸途径相关酶代谢途径的图表。

图2A为一个显示一种替代突变模式的表框。

图2B为一幅缺失型HMG1基因的构建示意图。

图3为一幅显示质粒pRS414的示意图。

图4为一幅显示质粒pYES2的示意图。

图5显示ADH1启动子和终止子的序列。

图6A为一幅显示质粒pRS414PTadh的示意图。

图6B为一幅显示质粒pRS414TPadh的示意图。

图7A为一幅显示质粒pRS434GAP的示意图。

图7B为一幅显示质粒pRS434TEF的示意图。

图7C为一幅显示质粒pRS435GAP的示意图。

图7D为一幅显示质粒pRS444GAP的示意图。

图7E为一幅显示质粒pRS444TEF的示意图。

图7F为一幅显示质粒pRS445GAP的示意图。

图8为一幅显示每种插入pT7载体的甲羟戊酸途径相关酶的方向示意图。

图9为一幅质粒Palhmg106的物理图谱。

图10为一幅显示在ORF182片段上的限制性酶识别位点的示意图。

图11为一幅显示用于嗜热脂肪芽孢杆菌FPP合酶突变基因(Y81M)的表达载体的示意图。

图12呈出显示DNA印迹杂交结果的照片。

图13呈出显示PCR图谱结果的照片。

图14呈出显示RNA印迹结果的照片。

图15A呈出显示异戊二烯基二磷酸合酶在粗酶溶液中的比活性曲线图。

图15B呈出显示异戊二烯基二磷酸合酶在粗酶溶液中的比活性曲线图。

图16为一幅显示通过将连接有一个组成型启动子的HMG1基因导入A451，从而获得的重组体的GGOH产量的曲线图。

图17为一幅显示以A451或AURGG101(均保留有含GAL1p-HMG1的YEp表达载体)为宿主获得的每种重组体的GGOH产量的曲线图。

图18为一幅显示通过将质粒pYES2-HMG导入AURGG102或AURGG703，从而获得的每种重组体的GGOH产量的曲线图。

图19为一幅显示当将一个缺失型HMG1’基因插入含GAL1p的pYES2载体时，每种重组体的GGOH产量的曲线图。

图20为一幅显示当将一个缺失型HMG1’基因插入含GAL1p的pYES2载体时，每种重组体的GGOH产量的曲线图。

图21为一幅显示当将一个缺失型HMG1’基因插入含GAL1p的pYES2载体时，每种重组体的GGOH产量的曲线图。

图22为一幅显示当将一个缺失型HMG1’基因插入含GAL1p的pYES2载体时，每种重组体的GGOH产量的曲线图。

图23为一幅显示在含有IPP和DMAPP的培养基中培养保留有p4M、p16M等的重组大肠杆菌时的GGOH产量的曲线图。

图24为一幅显示用于构建BTS1-ERG20融合基因的引物，及这些引物的位点和方向的示意图。

图25为一幅显示将ERG20-BTS1融合基因导入A451衍生的克隆时GGOH产量的检测结果曲线图。

图26为一幅显示将ERG20-BTS1融合基因导入YPH499衍生的克隆时GGOH产量的检测结果曲线图。

图27为一幅显示经TEF2p-HMG1转化的YPH499衍生的克隆中GGOH产量的检测结果曲线图。

图28为一幅显示经TDH3p-HMG1转化的YPH499衍生的克隆中GGOH产量的检测结果曲线图。

图29A为一幅显示在A451衍生的克隆中GGOH产量的检测结果曲线图。

图29B为一幅显示在A451衍生的克隆中GGOH产量的检测结果曲线图。

图30A为一幅显示在YPH499衍生的克隆中GGOH产量的检测结果曲线图。

图30B为一幅显示在YPH499衍生的克隆中GGOH产量的检测结果曲线图。

图31A为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的A451菌株在有指出的糖组合物的条件下培养2天的GGOH产量的曲线图。

图31B为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的A451菌株在有指出的糖组合物的条件下培养4天的GGOH产量的曲线图。

图31C为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的A451菌株在有指出的糖组合物的条件下培养7天的GGOH产量的曲线图。

图32A为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的AH1菌株在有指出的糖组合物的条件下培养2天的GGOH产率曲线图。

图32B为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的AH1菌株在有指出的糖组合物的条件下培养4天的GGOH产量的曲线图。

图32C为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的AH1菌株在有指出的糖组合物的条件下培养7天的GGOH产量的曲线图。

图33A为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的EUG5菌株在有指出的糖组合物的条件下培养2天的GGOH产量的曲线图。

图33B为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的EUG5菌株在有指出的糖组合物的条件下培养4天的GGOH产量的曲线图。

图33C为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的EUG5菌株在有指出的糖组合物的条件下培养7天的GGOH产量的曲线图。

图34A为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的YPH499菌株在有指出的糖组合物的条件下培养2天的GGOH产量的曲线图。

图34B为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的YPH499菌株在有指出的糖组合物的条件下培养4天的GGOH产量的曲线图。

图34C为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的YPH499菌株在有指出的糖组合物的条件下培养7天的GGOH产量的曲线图。

图35A为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的YH1菌株在有指出的糖组合物的条件下培养2天的GGOH产量的曲线图。

图35B为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的YH1菌株在有指出的糖组合物的条件下培养4天的GGOH产量的曲线图。

图35C为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的YH1菌株在有指出的糖组合物的条件下培养7天的GGOH产量的曲线图。

图36A为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的EUG12菌株在有指出的糖组合物的条件下培养2天的GGOH产量的曲线图。

图36B为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的EUG12菌株在有指出的糖组合物的条件下培养4天的GGOH产量的曲线图。

图36C为一幅显示经pRS435GGF或pRS435GGFHDEL转化的EUG12菌株在有指出的糖组合物的条件下培养7天的GGOH产量的曲线图。

图37为一幅显示在含有大豆油培养基的发酵罐内培养pRS435GGF/YH1(pRS435GAP-HMG1/YPH499)克隆时的异戊二烯醇产量的检测结果曲线图。

图38为一幅显示在含大豆油培养基的发酵罐内培养15-2克隆时的异戊二烯醇产量的检测结果曲线图。

图39呈出显示用于验证融合基因表达的RNA印迹杂交法检测结果的照片。

图40呈出显示蛋白质印迹法检测结果的照片。

图41A呈出显示共表达HMG辅酶A还原酶基因和一个由GGPP合酶基因和FPP合酶基因组成的融合基因的克隆的GGOH产量的检测结果曲线图。

图41B呈出显示在共表达HMG辅酶A还原酶基因和一个由GGPP合酶基因和FPP合酶基因组成的融合基因的克隆的GGOH产量的检测结果曲线图。

图41C呈出显示在双表达HMG辅酶A还原酶基因和一个由GGPP合酶基因和FPP合酶基因组成的融合基因的克隆的GGOH产量的检测结果曲线图。

图42为一幅显示一种补料液的流速条件的曲线图。

发明的优选实施方案

下文中，本发明将引用下列实施例对本发明进行更为明确的描述。不过，本发明的技术范围不仅限于这些实例。

实施例包含下列内容：

(1)表达载体，如pRS435GAP，是采用pRS载体(Stratagene)，pYES载体(Invitrogen)，啤酒糖酵母YPH499来源的基因组DNA等制备的。

(2)甲羟戊酸途径相关酶基因的克隆

克隆乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因、HMG辅酶A还原酶基因或其突变体、甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因、异戊烯基二磷酸Δ异构酶基因、法呢基二磷酸合酶基因或其替代突变体、及香叶基香叶基二磷酸合酶基因后，制备它们的表达载体。

(3)将含甲羟戊酸途径相关酶基因的质粒导入A451、YPH499等宿主。同样，通过将A451或YPH499基因组DNA中的ERG9转录启动子替换为pYES2衍生的GAL1转录启动子，构建突变菌株(EUG菌株)，并将之作为宿主，用于导入异戊二烯基二磷酸合酶基因。

(4)AURGG101是一种整合有AUR1-C基因的A451衍生菌株；AURGG102是一种含GAL1启动子、BTS1和CYC1终止子，且其AUR1基因座有AUR1-C基因的A451衍生的菌株，构建这两种菌株，作为宿主，用于导入基因。

(5)将异戊二烯基二磷酸合酶基因表达载体导入宿主，然后在YM7培养基(pH用NaOH调至7的YM培养基)、YMO培养基、IPP和含DMAPP培养基等培养基中分别培养该宿主。将每种培养液进行分离和提取，并定量测定其中的异戊二烯醇(特别是GGOH)。为大量获得异戊二烯醇，在发酵罐中对已显示良好结果的重组体进行长期培养。此外，分析了当重组体被更换为原养型微生物，并二倍体化后对GGOH产量的影响。同样，分析了添加进培养基中的化合物(如乙醇或氨气)对GGOH产量的影响。

[实施例1]表达载体的结构

(1)大肠杆菌-啤酒糖酵母穿梭载体

质粒pRS404、pRS404和pRS414(图3)购自Stratagene。质粒pAUR123购自Takara，质粒pYES2(图4)购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。

(2)基因组DNA

采用购自Takara的Dr.GenTLETM试剂盒(一种用于酵母的基因组DNA制备试剂盒)，并根据试剂盒所附说明从啤酒糖酵母YPH499制备啤酒糖酵母基因组DNA。

按如下步骤从大肠杆菌JM109(Takara)制备大肠杆菌基因组DNA。简言之，在1.5ml 2xYT培养基中培养JM109细胞，并通过离心收获。将567μl TE(pH8.0)，3μl 20mg/ml蛋白酶K(BoehringerMannheim，Mannheim，Germany)和30μl 10％SDS加入这些细胞中。将得到的混合物37℃保温1小时后，加入100μl 5M NaCl，使之混合。再加入80μl CTAB/NaCl溶液(10％CTAB，0.7MNaCl)，65℃加热得到的混合物10分钟。用700μl氯仿/异戊醇(24∶1)抽提该混合物，进一步用600μl苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提水相。抽提后，将0.6体积的异丙醇添加到水相，而后离心水相。用70％乙醇洗涤沉淀，干燥，继而将之溶解于100μl TE(pH8.0)中，获得大肠杆菌基因组DNA溶液。测定DNA的OD₂₆₀值，并定量测定DNA。然后，将TE加入溶液中，获得一种1μg/μL浓度的DNA。

采用Wizard PureFection质粒DNA纯化系统(Promega，Madison，WI)制备大肠杆菌质粒DNA。

(3)ADH1p-ADH1t片段插入到pRS414

用Nael和PvuII消化pRS414质粒(图3)，从而获得一个长度为4.1kbp的无flori和LacZ部分的片段。经琼脂糖凝胶电泳纯化该片段。分别用BamHI消化、Klenow酶钝端化质粒pAUR123。然后，经琼脂糖凝胶电泳纯化一个长度为1.0kbp、含ADH1转录启动子(ADH1p)和ADH1转录终止子(ADH1t)(图5；SEQ ID NO：23)的片段。来源于pRS414的长度为4.1kbp的片段仍保留了大肠杆菌和酵母的复制起点，用于大肠杆菌的转化标记Amp^γ，和用于酵母营养缺陷型标记TRP1。另一方面，来源于pAUR123的长度为1.0kbp的片段含ADH1p、ADH1t和一个位于它们中间的克隆位点。通过DNA连接试剂盒(Takara)将这两个片段彼此连接，并转化进大肠杆菌SURE2超感受态细胞(Stratagene，La Jolla，CA)。

从得到的重组体中制备质粒DNA。用SalI和ScaI得到的DNA图谱显示出：ADH1p-ADHt片段以两个方向被插入pRS414中，从而产生出两种质粒pRS414PTadh(图6A)和pRS414TPadh(图6B)。

(4)CYC1t片段插入到pRS载体

由PCR制备CYC1t(CYC1转录终止子)片段。以下列各种寡聚DNA、Xhol-Tcyc1FW和ApaI-Tcyc1RV为PCR引物。模板采用pYES2。

XhoI-Tcyc1FW：5′-TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT AAT TAG-3′(SEQID NO：40)

ApaI-Tcyc1RV：5′-CAT TAG GGC CCG GCC GCA AAT TAA AGC CTT CG-3′(SEQ ID NO：41)

简言之，制备50μl的反应溶液，该溶液含0.1μg pYES2、50pmol每种引物DNA、含MgSO₄的1x Pfu缓冲液(Promega，Madison，WI)、10nmol dNTPs、1.5单位的PfuDNA聚合酶(Promega)和1μl完全匹配聚合酶增强子(Stratagene)。反应条件如下：95℃第一次变性2分钟；95℃变性45秒，共30次循环，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟；和72℃最终延伸5分钟。反应完成后，于4℃储存该溶液。用XhoI和ApaI消化扩增DNA，经琼脂糖凝胶电泳纯化得到的260bpDNA片段，从而获得CYC1t-XA。

将CyC1t-XA插入到pRS404和pRS406的XhoI-ApaI位点，从而分别获得pRS404Tcyc和pRS406Tcyc。

(5)转录启动子的制备

以pAUR123或酵母基因组DNA为模板，通过PCR制备含转录启动子的DNA片段。可采用的引物DNA如下：

SacI-Ptdh3FW：5′-CAC GGA GCT CCA GTT CGA GTT TAT CAT TAT CAA-3′

(SEQ ID NO：42)

SacII-Ptdh3RV：5′-CTC TCC GCG GTT TGT TTG TTT ATG TGT GTT TAT TC-3′

(SEQ ID NO：43)

SacI-Ptef2FW：5′-CCG CGA GCT CTT ACC CAT AAG GTT GTT TGT GAC G-3′

(SEQ ID NO：44)

SacII-Ptef2RV：5′-CTT TCC GCG GGT TTA GTT AAT TAT AGT TCG TTG

ACC-3′(SEQ ID NO：45)

就扩增ADH1转录启动子(ADH1p)而言，以SacI-Padh1FW和SacII-Padh1RV为PCR引物，以pAUR123为模板。就扩增TDH3(GAP)转录启动子(TDH3p(GAPp))而言，以SacI-Ptdh3FW和SacII-Ptdh3RV为PCR引物；就扩增TEF2转录启动子(TEF2p)而言，以SacI-Ptef2FW和SacII-Ptef2RV为PCR引物。对这些启动子而言，以酵母基因组DNA为模板。制备100μl反应溶液，含0.1μg pAUR123或0.46μg酵母基因组DNA、100pmol每种引物DNA、1x ExTaq缓冲液(Takara)、20nmoldNTPs、0.5U的ExTaqDNA聚合酶(Takara)和1μl完全匹配聚合酶增强子(Stratagene)。反应条件如下：95℃第一次变性2分钟；95℃变性45秒，共30次循环，60℃1分钟，72℃延伸2分钟，72℃延伸4分钟。反应完成后，于4℃储存该溶液。用SacI和SacII消化扩增的4种类型DNA，且经琼脂糖凝胶电泳纯化分离出得到的620bp、680bp、710bp和400bpDNA片段，从而分别获得TDH3p和TEF2p。

(6)2μDNA复制起点区域的制备

用SspI和NheI消化一种YEp载体，pYES2。经琼脂糖凝胶电泳纯化得到的长度为1.5kbp、含2μDNA复制起点(2μori)的片段，然后将其钝端化。该DNA片段被命名为2μOriSN。

(7)YEp型表达载体的制备

将2μOriSN插入pRS404Tcyc和pRS406Tcyc的NaeI位点，该位点事先经过BAP(细菌碱性磷酸酯酶：Takara)的预处理。将得到的质粒转化到大肠杆菌SURE2后，制备质粒DNA。用DraIII、和EcoRI、HapI或PstI、和PvuII消化质粒DNA；继而经琼脂糖凝胶电泳检测2μori的插入情况及方向。将2μori分别插入pRS404Tcyc和pRS405Tcyc，插入的方向与2μori插入pYES2的方向相同，获得的质粒被分别命名为pRS434Tcyc2μOri和pRS435Tcyc2μOri。将2μori插入pRS404Tcyc和pRS405Tcyc，插入的方向与2μori插入pYES2的方向相反，获得的相应质粒被分别命名为pRS444Tcyc2μOri和pRS445Tcyc2μOri。

将含ADH1p、TDH3p(GAPp)、PGK1p或TEF2p片段的转录启动子插入到上述四种质粒，即pRS434Tcyc2μOri、pRS435Tcyc2μOri、pRS444Tcyc2μOri、pRS445Tcyc2μOri的SacI-SacII位点，克隆DNA。获得下列四种质粒：(i)从pRS445Tcyc2μOri获得pRS434GAP和pRS434TEF；(ii)从pRS435Tcyc2μOri获得pRS435GAP；(iii)从pRS444Tcyc2μOri获得pRS444GAP和pRS444TEF；(iv)从pRS445Tcyc2μOri获得pRS445GAP(图7A-7F)。

本发明制备的表达载体总结于下表5中。

表5

载体	类型	标记和方向^*	启动子、终止子和方向^*	ori和方向^*
载体	类型	标记和方向^*	启动子、终止子和方向^*	ori和方向^*	pRS414PTadhpRS414TPadhPRS434GAPpRS434TEFpRS435GAPpRS444GAPpRS444TEFpRS445GAP	YCpYCpYEpYEpYEpYEpYEpYEp	TRP1 +TRP1 +TRP1 +TRP1 +LEU2 +TRP1 +TRP1 +LEU2 +	ADH1 ADH1 +ADH1 ADH1 -TDH3 CYC1 -TEF2 CYC1 -TDH3 CYC1 -TDH3 CYC1 -TEF2 CYC1 -TDH3 CYC1 -	ARS4&CEN6 +ARS4&CEN6 +2μ +2μ +2μ +2μ -2μ -2μ -

^*出现在标记和基因表达转录单位后的“+”和“-”标记分别表示下游方向和上游方向。出现在ori之后的“+”标记表示ori被插入的方向与其插入pRS(用于YCp载体)或pYES(用于YEp载体)的方向相同；出现在ori之后的“-”标记表示ori被插入的方向与其插入pRS(用于YCp载体)或pYES(用于YEp载体)的方向相反。

(8)YEp型表达载体在酵母中的导入

为了检查已制备的YEp型表达载体的DNA复制区域是否发挥作用，采用Frozen-EZ酵母转化II(Zymo Research，Orange，CA)将大约40ng的每种YEp型表达载体导入YPH499菌株。(步骤遵照试剂盒所附说明)。然后，检测30℃下、在SD-W(DOB+CMS(-Trp)；BI0101，Vista，CA)琼脂平板上生长的菌落。其结果如下表6所示：

表6

	GAP	TEF
	GAP	TEF	pRS 434	＞1000	＞1000
435	＞1000	-	pRS 434	＞1000	＞1000
435	＞1000	-	444	＞1000	＞1000
445	＞1000	-	444	＞1000	＞1000

表6中的结果显示：本发明制备的各种YEp型载体通常作为载体被保留。

【实施例2】甲羟戊酸途径相关酶基因的克隆

采用一种购自Clontech(Palo Alto，CA)的啤酒糖酵母DBY746来源的cDNA库“Quick-Clone cDNA″对源自酵母cDNA的基因进行克隆。

(1)法呢基二磷酸合酶基因的克隆

(1-1)啤酒糖酵母来源的FPP合酶基因ERG20：

以上述cDNA为模板，PCR(聚合酶链反应)扩增一个编码啤酒糖酵母FPP合酶基因ERG20(SEQ ID NO：1)、长度大约为0.9kbp的DNA片段。采用的PCR引物如下：

引物1(SCFPS1)：5’-ATG GCT TCA GAA AAA GAA ATT AG-3’

(SEQ ID NO：46)

引物2(SCFPS2)：5’-CTA TTT GCT TCT CTT GTA AAC TT-3’

(SEQ ID NO：47)

10x Ex Taq缓冲液(Takara) 5μl

2.5mM dNTP混合物 4μl

5U/μl Ex Taq(Takara) 1μl

10pmol 引物1

10pmol 引物2

0.5ng cDNA

共计50μl

在上述反应溶液中进行PCR反应，即30个循环过程，每个循环包括：94℃45秒，55℃1分钟和72℃2分钟。

如无其它说明，以下实施例的PCR反应条件均与上述条件相同。

经琼脂糖凝胶电泳纯化扩增后的片段，然后通过T/A连接将其克隆到pT7Blue-T(Novagen，Madison，WI)。发现ERG20被插入pT7Blue-T的方向与lacZ在该质粒上的方向相同(图8)。检测克隆后片段的核苷酸序列，并将其同记录于SGD(酵母基因组数据库，http：//genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)中相应的核苷酸序列比较。结果没有在1-300和610-1059的核苷酸位置上发现PCR错误。

制备的质粒DNA被命名为pT7ERG20。

(1-2)大肠杆菌来源的FPP合酶基因ispA：

以大肠杆菌基因组DNA为模板、以下列合成寡聚DNA为引物，PCR克隆大肠杆菌来源的FPP合酶基因ispA(SEQ ID NO：3)。

ISPA1：5′-TGA GGC ATG CAA TTT CCG CAG CAA CTC G-3′

(SEQ ID NO：48)

ISPA2：5′-TC AGA ATT CAT CAG GGG CCT ATT AAT AC-3′

(SEQ ID NO：49)

在100μl反应溶液中进行PCR反应，该反应溶液含有1x EXTaq缓冲液、0.5mM dNTPs、100pmol ISPA1、100pmol ISPA2、0.2μg大肠杆菌基因组DNA和5单位ExTaq，反应经过30个循环过程，每个循环包括94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1.5分钟。PCR产物由EcoRI和SphI消化后，经琼脂糖凝胶电泳纯化，得到一个长度为1.0kbp的DNA片段。将该片段插入pALTER-Ex2(Promega)的EcoRI-SphI位点后，再将其导入大肠杆菌JM109，用于克隆基因。结果获得质粒pALispA4、pALispA8、pALispA15、pALispA16、pALispA18；采用限制性内切酶EcoRI、SphI、NdeI、SmaI和BamHI得到的图谱证实ispA基因被正确地导入这些质粒中。

(1-3)嗜热脂肪芽孢杆菌来源的FPP合酶基因

用NotI和SmaI消化公开于日本未审查专利公开No.5-219961中的pFE15，经纯化，得到含一个长度为2.9kbp转录单位的FPP合酶基因片段。将该基因片段插入到pACYC177(Nippon Gene)的ScaI位点，从而制备出一个含有嗜热脂肪芽孢杆菌来源的FPP合酶基因fps(SEQ ID NO：25)的表达载体。

(2)香叶基香叶基二磷酸合酶基因的克隆

啤酒糖酵母来源的GGPP合酶基因BTS1(SEQ ID NO：5)克隆方法如下文。

简言之，即基于记录在GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html/)(A.N.U31632)(Y.Jiang，et al.，J.Biol.Chem.270(37)，21793-21799(1995))中关于啤酒糖酵母来源的GGPP合酶基因的资料，构建一对引物，该引物与基因编码的蛋白质的N-末端和C-末端匹配。以这些引物和一个酵母cDNA库(Clontech；No.CL7220-1)为模板，进行PCR。

N-末端引物：5’-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG CT-3’

(SEQ ID NO：50)

C-末端引物：5，-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC TA-3’

(SEQ ID NO：51)

采用完全匹配聚合酶增强子(Stratagene)进行PCR，需进行30个循环过程，每个循环包括：94℃变性45秒、55℃退火1分钟、和72℃延伸2分钟。

感兴趣的片段(长度大约为1.0kbp)已经得到证实。将该BTS1片段克隆到可TA克隆的pT7Blue T载体中，然后对BTS1的全部区域进行测序。结果显示该基因的核苷酸序列与记录于GenBank(SEQ IDNO：5)中相应的核苷酸序列完全相同。这就证实：该基因是啤酒糖酵母来源的GGPP合酶基因。

(3)乙酰辅酶A乙酰转移酶基因的克隆

采用ExTaq DNA聚合酶，PCR扩增一个长度大约为1.2kbp的基因组DNA片段，该片段编码啤酒糖酵母乙酰辅酶A乙酰转移酶基因ERG10(SEQ ID NO：26)。将得到的片段克隆到pRS435GAP和pRS445GAP的SacII-XbaI位点。采用的PCR引物如下：

引物1(SacII-ERG10)：5’-TCC CCG CGG ATG TCT CAG AAC GTTTAC ATT GT-3’(SEQ ID NO：52)

引物2(XbaI-ERG10)：5’-TGC TCT AGA TCA TAT CTT TTC AAT GACAAT GGA-3’(SEQ ID NO：53)

(下划线部分表示限制性内切酶识别位点。)

在完全匹配聚合酶增强子的共存在下进行PCR操作，需经过30个循环过程，每个循环包括95℃45秒、60℃1分钟、和72℃2分钟。由SmaI、ScaI、NcoI和BamHI识别位点图谱检验得到的质粒是否与设计的一致。成功制备的质粒被分别命名为pRS435GAP-ERG10和pRS445GAP-ERG10。

(4)HMG辅酶A合酶基因的克隆

以cDNA为模板，采用PCR扩增一个长度大约为1.5kbp的片段，该片段编码啤酒糖酵母HMG辅酶A合酶基因HMGS(SEQ ID NO：27)。退火温度采用50℃。采用的PCR引物如下：

引物1(HMGS-1-2)：5’-ATG AAA CTC TCA ACT AAA CTT TGT T-3’

(SEQ ID NO：54)

引物2(scHMGS-15)：5’-GTT CAG CAA GAT GCA ATC GAT GGG G-3’

(SEQ ID NO：55)

用琼脂糖凝胶电泳纯化PCR片段，再经T/A连接将其克隆到pT7Blue-T。结果发现HMGS被插入pT7Blue的方向与lacZ在该质粒上的方向相反(图8)。检测该克隆片段的核苷酸序列。与SGD中相应的核苷酸序列比较的结果显示：由于PCR错误，39位上的核苷酸A(以起始密码子ATG的第一个核苷酸A为第1位)被改变为G(A39G；下文中的PCR错误以相同方式表达)。

此外，也发现了另外5个错误：T144C、T223C、T1038C、C1122T和A1370G。在这些PCR错误中，T223C和A1370G引起编码氨基酸的改变。T223C将75位的Ser改变为Pro(S75P；下文中，氨基酸序列错误以相同方式表示)，A1370G引起另一个氨基酸序列错误K457R。

得到的质粒被命名为pT7HMGS。

(5)HMG辅酶A还原酶基因的克隆

克隆啤酒糖酵母来源的HMG辅酶A还原酶基因HMG1的方法描述如下。

简言之，即基于记录在GenBank关于啤酒糖酵母来源的HMG辅酶A还原酶基因HMG1(A.N.M22002)(M.E.Basson，et al.，Mol.Cell.Biol.8，3797-3808(1988)：SEQ ID NO：7)的资料，设计一对引物，该引物匹配了由该基因编码蛋白质的N-末端和C-末端。以这两种引物和酵母cDNA库(Clontech)为模板，进行PCR。

N-末端引物：5’-ATG CCG CCG CTA TTC AAG GGA CT-3’

(SEQ ID NO：56)

C-末端引物：5’-TTA GGA TTT AAT GCA GGT GAC GG-3’

(SEQ ID NO：57)

采用完全匹配聚合酶增强子进行PCR，需进行30个循环过程，每个循环包括94℃变性45秒、55℃退火1分钟、和72℃延伸2分钟。

感兴趣的片段(长度大约为3.2kbp)已经得到证实。将该片段(HMG1)克隆到可TA克隆的pT7BlueT载体中，从而获得pT7-HMG1。检测该克隆HMG1的核苷酸序列。结果显示获得了如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。由于PCR错误，检测得到的核苷酸序列与记录于GenBank中相应的核苷酸序列有部分不同(图2A)。这个包含PCR错误的突变型HMG辅酶A还原酶基因被命名为HMG1’。

(6)HMG辅酶A还原酶基因PCR错误的纠正

通过来自pT7HMG1的HMG1片段的亚克隆纠正PCR错误，而在HMG1区域纠正这些错误会引起氨基酸替代突变。

简言之，即从含有HMG1’，HMG辅酶A还原酶基因HMG1的PCR错误型DNA的质粒pT7HMG1亚克隆一个HMG1’基因片段。然后，通过定点诱变纠正在HMG1区域的PCR错误所引起的氨基酸替代突变，从而得到pALHMG106。该制备的具体方法描述如下。

pT7HMG1质粒被用做克隆的HMG1。就用于导入定点突变的载体而言，可采用购买的pALTER-1(Promega)。

根据Promega出版的“Protocols and Application Guide，3^rdedition，1996 Promega，ISBN1-882274-57-1”中描述的步骤进行定点诱变。就用于导入突变的寡聚核苷酸而言，可采用下列三种化学合成的寡聚核苷酸。

HMG1(190-216)：5′-CCAAATAAAGACTCCAACACTCTATTT-3′

(SEQ ID NO：58)

HMG1(1807-1833)：5′-GAATTAGAAGCATTATTAAGTAGTGGA-3′

(SEQ ID NO：59)

HMG1(2713-2739)：5′-GGATTTAACGCACATGCAGCTAATTTA-3′

(SEQ ID NO：60)

首先，用SmaI、ApaLI、SalI消化pT7HMG1，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化，得到一个长度为3.2kbp的HMG1片段。将该片段插入到pALTER-1的SmaI-SalI位点，从而制备了pALHMG1。经碱变性处理该质粒后，将上述用于导入突变的寡聚核苷酸、Amp修复寡聚核苷酸(Promega)作为修复寡聚核苷酸、和Tet剔除寡聚核苷酸(Promega)作为剔除寡聚核苷酸进行退火。将得到的质粒导入大肠杆菌ES1301(Promega)。然后，将保留有已导入定点突变的质粒转化体采用125μg/ml的氨苄青霉素进行富集培养，继而制备质粒DNA。由具有如下序列的引物检测得到的质粒DNA的核苷酸序列。结果显示所有对应于HMG1(190-216)、HMG1(1807-1833)和HMG1(2713-2739)的序列已被纠正为指定序列(SEQ ID NO：11)。由已纠正核苷酸序列(SEQID NO：12)编码的氨基酸序列与由HMG1’(SEQ ID NO：10)(沉默突变体)编码的氨基酸序列相一致。

HMG1(558-532)5′-GTCTGCTTGGGTTACATTTTCTGAAAA-3′

(SEQ ID NO：61)

HMG1(1573-1599)5′-CATACCAGTTATACTGCAGACCAATTG-3′

(SEQ ID NO：62)

HMG1(2458-2484)5′-GAATACTCATTAAAGCAAATGGTAGAA-3′

(SEQ ID NO：63)

已纠正HMG1区域内序列的质粒被命名为pALHMG106(图9)。

(7)甲羟戊酸激酶基因的克隆

以cDNA为模板，采用PCR扩增一个长度大约为1.3kbp的片段，该片段编码啤酒糖酵母甲羟戊酸激酶基因ERG12(SEQ ID NO：28)。采用的PCR引物如下所示。

引物1(ATM-1)：5’-AA C TGC AGA TGT CAT TAC CGT TCT TAA CTTC-3’

(SEQ ID NO：64)

引物2(ATM-2)：5’-CC G AGC TCT TAT GAA GTC CAT GGT AAA TTCG-3’

(SEQ ID NO：65)

(下划线部分表示限制性内切酶识别位点。)

用PstI和SacI消化得到的片段，经琼脂糖凝胶电泳纯化后，将其克隆到pT7Blue的PstI-SacI位点。通过这些步骤，ERG12插入pT7Blue的方向与lacZ在该质粒的方向相反(图8)。将克隆片段的核苷酸序列进行测定，并与记录在SGD中的相应的序列相对照。结果没有发现PCR错误。

得到的质粒DNA被命名为pT7ERG12。

(8)磷酸甲羟戊酸激酶基因的克隆

以cDNA为模板，采用PCR扩增一个长度大约为1.3kbp的片段，该片段编码啤酒糖酵母ERG8(SEQ ID NO：29)。采用的PCR引物如下所示。

引物1(YSCE-1)：5’-AAC TGC AGA TGT CAT TAC CGT TCT TAACTT C-3’

(SEQ ID NO：66)

引物2(YSCE-2)：5’-CCG AGC TCT TAT GAA GTC CAT GGT AAATTC G-3’

(SEQ ID NO：67)

琼脂糖凝胶电泳纯化PCR扩增片段后，通过T/A连接将其克隆到pT7Blue-T中。经过这些步骤，ERG8插入pT7Blue-T中的方向与lacZ在该质粒中的方向相反(图8)。检测克隆片段的核苷酸序列，并与记录于SGD中的相应序列相对照。结果发现下面的PGR错误：A70C、A72G、G146A、C171G、G224C、A306G、T387C、G574T、C637G、G638C、G729A、G739A、T759A、A879G和A1222G。在这些错误中，A70C和A72G引起T24P的一个氨基酸错误；G146A引起G49E的一个氨基酸错误；G224C引起S75T的一个氨基酸错误；G574T引起A192S的一个氨基酸错误；C637G和G638C引起R213A的一个氨基酸错误；G739A引起D247N的一个氨基酸错误；A1222G引起T408A的一个氨基酸错误。

得到的质粒DNA被命名为pT7ERG8。

(9)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因的克隆

以cDNA为模板，采用PCR扩增一个长度大约为1.2kbp的片段，该片段编码啤酒糖酵母二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因ERG19(MVD1)(SEQID NO：30)。采用的PCR引物如下所示。

引物1(SCU-1)：5’-AA C TGC AGA TGA CCG TTT ACA GAG CAT CCGT-3’

(SEQ ID NO：68)

引物2(SCU-2)：5’-CG G AAT TCT TAT TCC TTT GGT AGA CCA GTCT-3’

(SEQ ID NO：69)

(下划线表示限制性内切酶识别位点)

用PstI和EcoRI消化扩增片段，经琼脂糖凝胶电泳纯化后，将其克隆到pT7Blue的PstI-EcoRI位点。通过这些步骤，ERG19(MVD1)插入pT7Blue的方向与lacZ在该质粒中的方向相反(图8)。将克隆片段的核苷酸序列进行测定，并与记录在SGD中的相应的序列对照。结果没有发现PCR错误。

得到的质粒DNA被命名为pT7ERG19。

(10)异戊烯基二磷酸Δ异构酶基因的克隆

(10-1)啤酒糖酵母来源的IPPΔ异构酶基因IDII

以cDNA为模板，采用PCR扩增一个长度大约为0.9kbp的片段，该片段编码啤酒糖酵母IDII基因(SEQ ID NO：31)。采用的PCR引物为引物1(SCIPP-1)和引物2(SCIPP-2)。

引物1(SCIPP-1)：5’-ATG ACT GCC GAC AAC AAT AGT AT-3’

(SEQ ID NO：70)

引物2(SCIPP-2)：5’-TTA TAG CAT TCT ATG AAT TTG CC-3’

(SEQ ID NO：71)

琼脂糖凝胶电泳纯化PCR扩增片段后，通过T/A连接将其克隆到pT7Blue-T。经过这些步骤，IDII插入pT7Blue-T的方向与lacZ在该质粒中的方向相反(图8)。将克隆片段的核苷酸序列进行测定，并与记录在SGD中的相应的序列相对照。结果没有发现PCR错误。

得到的质粒DNA被命名为pT7IDII。

(10-2)大肠杆菌来源的IPPΔ异构酶基因idi

以质粒p3-47-13(Hemmi et al.，(1998)J.Biochem.123，1088-1096)为模板，将含有大肠杆菌ORF182(预期可以编码一个同源于IPPΔ异构酶的多肽的开放读码框架；基因名称：idi)的基因组DNA克隆到该质粒中，PCR扩增一个长度大约为0.55kbp的ORF182片段。在完全匹配聚合酶增强子的共存在下进行30个循环过程以完成PCR反应，每个循环包括95℃45秒、60℃1分钟、和72℃2分钟。采用的PCR引物如下所示。

引物1(SacII-ORF182(1-23))：5’-TCC CCG CGG ATG CAA ACGGAA CAC GTC ATT TT-3’

(SEQ ID NO：72)

引物2(XbaI-ORF182(549-525))：5’-TGC TCT AGA TTA TTTAAG CTG GGT AAA TGC AGA-3’

(SEQ ID NO：73)

(下划线部分表示限制性内切酶识别位点)

用SpeI、DraIII和AluI消化PCR产物后，经琼脂糖凝胶电泳纯化。结果获得如图10所示的物理图谱，该物理图谱与EcoGene( http：//bmb.med.miami.edu/EcoGene/EcoWeb/)的ORF182片段(idi)的核苷酸序列数据(SEQ ID NO：32)一致。然后，用SacII和XbaI消化扩增后得到的长度为0.55kbp的片段，经琼脂糖凝胶电泳纯化后，将其克隆到pRS435GAP和pRS445GAP的SacII-XbaI位点。得到的质粒被分别命名为pRS435GAP-ORF182和pRS445GAP-ORF182。

大肠杆菌IPPΔ异构酶基因(SEQ ID NO：32)曾被称为OPF182(根据NCBI BLAST检索；GenBank Accession No.AE000372)，不过Hahn等人，(1999)J.Bacteriol.，181：4499-4504命名这个基因为idi。就被克隆进idi的质粒而言，本发明用到了在Hemmi等人，(1998)J.Biochem.123：1088-1096中描述的p3-47-11和p3-47-13。

【实施例3】突变基因的克隆

(1)大肠杆菌FPP合酶基因被转化为GGPP合酶基因

(FPP合酶基因突变体的克隆)

采用实施例2(1-2)节中获得的pALispA4、pALispA8、pALispA15、pALispA16和pALispA18，根据Promega出版的“Protocols and Applications Guide，3^rd edition，1996 Promega，ISBN 1-882274-57-1”中描述的方法，通过替代突变修饰编码多肽79位的氨基酸残基Tyr的密码子，该多肽由大肠杆菌ispA编码。下列用于导入突变的寡聚核苷酸(有时为“突变寡聚核苷酸”)是通过化学合成法制备的。

ISPA-D：5′-ATC ATG AAT TAA TGA GTC AGC GTG G AT GCA TTC AAC GGC

GGC AGC-3′(SEQ ID NO：74)

ISPA-E：5′-ATC ATG AAT TAA TGA TTC AGC GTG G AT GCA TTC AAC GGC

GGC AGC-3′(SEQ ID NO：75)

ISPA-M：5′-ATC ATG AAT TAA TGA CAT AGC GTG G AT GCA TTC AAC GGC

GGC AGC-3′(SEQ ID NO：76)

在上述突变寡聚核苷酸ISPA-M中，在16-18位的核苷酸(有下划线的3个核苷酸)相当于编码野生型FPP合酶79位的氨基酸残基Tyr的密码子；设计这三个核苷酸以使该密码子编码Met。同样，设计突变寡聚核苷酸ISPA-D和IDPA-E以使这个密码子分别编码Asp和Glu。设计在上述突变寡聚核苷酸中的26-31位上的核苷酸(下划线的6个核苷酸)以使一个EcoT22I(NsiI)位点由于替代突变的原因而重新形成。带有该位点的突变基因可轻易通过限制性内切酶图谱被辨别出。这些突变寡聚核苷酸经由T4多核苷酸激酶(Promega)在其5’末端的磷酸化后，在使用前需通过Nick Column(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)的凝胶过滤，使其纯化。在突变体的导入过程中，Cm修复寡聚核苷酸(Promega)被用作修复寡聚核苷酸，Tet剔除寡聚核苷酸(Promega)被用作剔除寡聚核苷酸。Cm修复寡聚核苷酸，Tet剔除寡聚核苷酸和突变寡聚核苷酸被退火到经碱变性处理的pALispA16后，将其转化到大肠杆菌ES1301 mutS(Promega)。从生长在有20μg/ml Cm(氨霉素)存在的环境中的大肠杆菌菌落制备质粒DNA并转化到大肠杆菌JM109。然后，从生长在含有20μg/ml氯霉素的琼脂平板上的菌落中制备出质粒DNA。这些含有替代突变型ispA(称为“ispAm”)的质粒分别被命名为p4D、p4E和p4M，ispAm是通过以pALispA4为模板，以ISPA-D、ISPA-E或ISPA-M为突变寡聚核苷酸构建的。同样，通过以pALisp8为模板制备的那些质粒分别被命名为p8D、p8E和p8M；通过以pALisp15为模板制备的那些质粒分别被命名为p15D、p15E和p15M；通过以pALisp16为模板制备的那些质粒分别被命名为p16D、p16E和p16M；通过以pALisp18为模板制备的那些质粒分别被命名为p18D、p18E和p18M。

编码Y79D突变型氨基酸序列(SEQ ID NO：34)的基因如SEQ IDNO：33所示；编码Y79E突变型氨基酸序列(SEQ ID NO：36)的基因如SEQ ID NO：35所示；编码T79M突变型氨基酸序列(SEQ ID NO：38)的基因如SEQ ID NO：37所示。这样，获得的质粒就可被恰当地选择和利用。

(2)嗜热脂肪芽孢杆菌FPP合酶基因突变体的克隆

从公开在Ohnuma et al.，(1996)J.Biol.Chem.，271，30748-30754中的pFPS(Y81M)制备出含嗜热脂肪芽孢杆菌FPP合酶基因(fps：SEQ ID NO：39)的一个替代突变体基因的表达载体。

pFPS是一种在pTV118N(Takara)的lac启动子下游整合了fps的质粒，并且在IPTG存在的环境中，该质粒可在大肠杆菌中表达嗜热脂肪芽孢杆菌FPP合酶基因。首先，通过定点诱变将Y81M突变(即替代突变，该突变将被FPP合酶基因编码的氨基酸序列的81位上的Tyr改变为Met)导入FPP合酶基因[从而获得pFPS(Y81M)]。Y81M突变体的导入使得被编码在pEPS(Y81M)上的酶的反应产物特异性被改变；在没有降低编码酶的比活性的情况下，FPP合酶基因被修饰成为一个GGPP合酶基因。随后，由PshBI消化Pfps(Y81M)，并由Klenow酶对其进行钝端化。接着，纯化含转录单位的一个长度为2.7Kbp的片段，并将其插入到pACYC177中Amp’基因的HincII位点。以与Amp’基因相反的方向插入突变fps基因片段得到的质粒被命名为pFPS21m；以与Amp’基因相反的方向插入突变fps基因片段的质粒被命名为pFPS31m(图11)。

(3)HMG辅酶A还原酶基因缺失突变体的克隆

均含有一个组成型启动子ADH1p的载体pRS414PTadh和Prs414TPadh经限制性内切酶消化后，插入HMG1，从而制备出质粒pRS414PTadh-HMG1和PRS414TPadh-HMG1。

用BamHI、SalI和ScaI消化实施例2(5)中制备的pT7-HMG1，获得有PCR错误的HMG1’基因。将该基因导入到pYES2(Invitrogen，Carlsbad，CA)的BamHI-XhoI位点，从而获得一个重组载体pYES-HMG1。该载体中的核苷酸序列经证实是SEQ ID NO：3的核苷酸序列。pYES是一个用于在酵母中表达的穿梭载体，该酵母有作为复制始点的酵母2μmDNA的ori和可被半乳糖诱导的GAL1启动子(图4)。

为制备用于HMG辅酶A还原酶基因缺失突变体的表达载体，该缺失突变体有与HMG辅酶A还原酶跨膜区域相应的区域缺失，以上文中制备的pYES-HMG1为模板进行PCR反应，从而产生缺失部分HMG1编码区域的DNA片段(包括载体部分)。用Klenow酶使获得片段钝端化，通过自连接环化后，导入大肠杆菌JM109。然后制备质粒DNA。用作引物的合成DNA序列及其组合如上表1中所示。

就获得的每种质粒DNA而言，373A DNA测序仪(Perkin Elmer，Foster City，CA)证实在HMG1的缺失区域上游与下游之间的氨基酸的读码框架上没有发生偏移，在结合位点周围也没有因PCR错误引起的氨基酸替代。这样就获得了在结合位点周围没有因PCR错误引起的氨基酸替代，且在读码框架没有任何偏移的情况下可以缺失一部分基因的下列质粒。根据缺失模式将HMG1基因的缺失突变体表示为，如“Δ02y”(y代表任意工作数字)，包含有Δ02y的pYES2载体可表示为，如pYHMG026。(这一表示方式也适用于其它缺失突变体。)

HMG1Δ026：SEQ ID NO：13

HMG1Δ044：SEQ ID NO：14

HMG1Δ056：SEQ ID NO：15

HMG1Δ062：SEQ ID NO：16

HMG1Δ076：SEQ ID NO：17

HMG1Δ081：SEQ ID NO：18

HMG1Δ100：SEQ ID NO：19

HMG1Δ112：SEQ ID NO：20

HMG1Δ122：SEQ ID NO：21

HMG1Δ133：SEQ ID NO：22

质粒：

pYHMG026，pYHMG027，pYHMG044，pYHMG045，pYHMG059，pYHMG062，

pYHMG063，pYHMG065，pYHMG076，pYHMG081，pYHMG083，pYHMG085，

pYHMG094，pYHMG100，pYHMG106，pYHMG107，pYHMG107，pYHMG109，

pYHMG112，pYHMG122，pYHMG123，pYHMG125，pYHMG133和pYHMG134，

【实施例4】基因亚克隆到载体中

对具有一个组成型转录启动子的大肠杆菌-啤酒糖酵母YEp穿梭载体而言，采用实施例1中制备的pRS载体。

(1)FPP合酶基因型的亚克隆

(1-1)啤酒糖酵母来源的FPP合酶基因ERG20：

用XbaI和BamHI消化实施例2(1-1)节描述的pT7ERG20，经琼脂糖凝胶电泳纯化获得长度为1.1kbp的ERG20基因片段。将该片段插入到pRS435GAP和pRS445GAP的XbaI-BamHI位点，从而分别获得pRS435GAP-ERG20和pRS445GAP-ERG20。

(1-2)大肠杆菌来源的FPP合酶基因ispA：

用SphI和EcoRI消化实施例2(1-2)节描述的pALispA4，经琼脂糖凝胶电泳纯化得到长度为1.0kbp的ispA基因片段。将SphI-SacII接头DNA(5’-pTTT CCG CGG AAA CAT G-3’；SEQ ID NO：86)和EcoRI-Eco52I接头DNA(5’-pAAT TGA CGG CCG TC-3’；SEQ IDNO：87)连接到该片段。然后，经SacII和Eco52I消化该片段。为了亚克隆，将得到的长度为1.0kbp的SacII-Eco52I片段插入pRS435GAP和pRS445GAP的SacII-EGo52I位点。就每种亚克隆质粒而言，得到了SacI、SacII、NdeI、NsiI(EcoT22I)、Aor51HI、XbaI、SmaI、BamHI、PstI、NdeI、PvuII和EcoT14I的识别位点图谱，然后挑选出按设计构建的质粒。挑选出的质粒分别被命名为pRS435GAP-ispA和pRS445GAP-ispA。

(1-3)嗜热脂肪芽孢杆菌来源的FPP合酶基因

将嗜热脂肪芽孢杆菌来源的FPP合酶基因从一个染色体PCR片段直接克隆到一个载体中。

(2)GGPP合酶基因或其突变体的亚克隆

(2-1)啤酒糖酵母来源的GGPP合酶基因BTS1：

用BamHI和SalI消化实施例2(2)中描述的pT7Blue-T载体，获得一个编码BTS1的片段，将其导入到pYES2(Invitrogen)的BamHI-XhoI位点。得到的重组载体被命名为pYESGGPS。

用BamHI和MluI消化pYESGGPS后，经琼脂糖凝胶电泳纯化，得到一个长度为1.3kbp的片段。将该片段插入到pRS435GAP和pRS445GAP的BamHI-MluI位点，从而分别获得pRS435GAP-BTS1和pRS445GAP-BTS1。

(2-2)大肠杆菌来源的GGPP合酶基因(替代突变型FPP合酶基因)ispAm：

用SphI和EcoRI消化实施例3(1)中描述的p16M后，经琼脂糖凝胶电泳纯化，得到一个长度为1.0kbp的片段，该片段编码ispAm基因。将本实施例(1-2)中描述的SphI-SacII接头DNA和EcoRI-Eco52I接头DNA连接到该片段，然后，经SacII和Eco52I消化。为了亚克隆，将得到的SacII-Eco52I片段(1.0kbp)插入到pRS435GAP和pRS445GAP的SacII-Eco52I位点。对每种亚克隆质粒而言，得到SacI、SacII、NdeI、NsiI(EcoT22I)、Aor51HI、XbaI、SmaI、BamHI、PstI、PvuII和EcoT14I的识别位点图谱，然后挑选出按设计构建的质粒。在这些识别位点中，NsiI(EcoT22I)识别位点是当导入一个替代突变体到ispA中时被新导入的位点。如质粒可被该限制性内切酶切割，就证实质粒中的基因是ispA突变基因ispAm。挑选出的质粒被分别命名为pRS435GAP-ispAm和pRS445GAP-ispAm。

(3)乙酰辅酶A乙酰转移酶基因的亚克隆

将乙酰辅酶A乙酰转移酶基因ERG10从一个基因组PCR片段直接克隆到pRS载体中。

(4)HMG辅酶A合酶基因的亚克隆

从实施例2(4)中描述的pT7HMGS制备一个长度为1.5kbp编码HMGS基因的BamHI-SalI片段，将其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的BamHI-SalI位点。通过KpnI限制位点图谱检测HMGS-亚克隆质粒后，选择按设计构建的质粒。挑选出的质粒分别被命名为pRS435GAP-HMGS和pRS445GAP-HMGS。

(5)HMG辅酶A还原酶基因或其突变体的亚克隆

用BamHI、SalI和ScaI消化实施例2(5)中描述的pT7Blue-T载体，从而切除编码一个PGR错误型突变HMG辅酶A还原酶的HMG1’基因。将该基因插入到pYES2(Invitrogen)的BamHI-XhoI位点。得到的质粒被命名为pYES-HMG1。

用SmaI和SalI消化载体pRS414PTadh和pRS414TPadh，这两种载体都含有一个组成型ADH1p。将HMG1基因插入消化后的两种载体，从而制备出pRS414PTadh-HMG1和pRS414TPadh-HMG1。

进一步用SmaI和SalI消化在实施例2(6)中描述的pALHMG106(图9)，经琼脂糖凝胶电泳纯化得到一个长度为3.2kbp的片段，该片段编码已纠正PCR错误的HMG1基因。将该片段插入到pRS434GAP、pRS444GAP、pRS434TEF、pRS444TEF、pRS434PGK、pRS444PGK的SmaI-SalI位点。通过使用XhoI、SpeI、NaeI和SphI得到的限制性内切酶图谱，及确认插入的长度为3.2kbp的HMG1基因的边缘区域的核苷酸序列，来检验HMG1-亚克隆质粒的物理图谱。然后，挑选出精确按设计构建的质粒，并分别命名为pRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1、pRS434TEF-HMG1、pRS444TEF-HMG1、pRS434PGK-HMG1、pRS444PGK-HMG1。

从pYES2衍生的质粒中获得HMG辅酶A还原酶基因的缺失突变体，该衍生质粒掺入了实施例3描述的HMG1的相应缺失突变体，以前面章节中描述的方式将HMG辅酶A还原酶基因的缺失突变体克隆到pRS434GAP中。

(6)甲羟戊酸激酶基因的亚克隆

从实施例2(7)中描述的pT7ERG12制备一个长度为1.3kbp的SmaI-SalI片段，该片段编码ERG12基因，将其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的SmaI-SalI位点。经KpnI识别位点图谱检测ERG12-亚克隆质粒，继而挑选出精确按设计构建的质粒，并分别命名为pRS435GAP-ERG12和pRS445GAP-ERG12。

(7)磷酸甲羟戊酸激酶基因的亚克隆

从实施例2(8)描述的pT7ERG8制备一个长度为1.3kbp BamI-SalI片段，该片段编码ERG8基因，并将其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的SmaI-SalI位点。经XbaI识别位点图谱检验ERG8-亚克隆的质粒，继而挑选出精确按设计构建的质粒，并分别命名为pRS435GAP-ERG8和pRS445GAP-ERG8。

(8)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因的亚克隆

用BamHI和SalI消化实施例1(9)中描述的pT7ERG19，经琼脂糖凝胶电泳纯化，得到一个长度为1.5kbp的BamHI-SalI片段，该片段编码ERG19基因。将该片段插入到pRS435GAP和pRS445GAP的BamHI-SalI位点。挑选出精确按设计构建的质粒，并分别命名为pRS435GAP-ERG19和pRS445GAP-ERG19。

(9)异戊烯基二磷酸Δ异构酶基因的亚克隆

(9-1)啤酒糖酵母来源的IPPΔ异构酶基因IDI1：

从实施例2(10-1)中描述的pT7IDI1制备一个长度为0.9kbp的BamHI-SalI片段，并将其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的BamHI-SalI位点。用NcoI和BamHI识别位点图谱检测亚克隆质粒，挑选出精确按设计构建的质粒，并分别命名为pRS435GAP-IDI1和pRS445GAP-IDI1。

(9-2)大肠杆菌来源的IPPΔ异构酶基因ORF182(idi)：

按实施例2(10-2)的描述将ORF182(idi)从一个基因组PGR片段直接克隆到pRS载体。

【实施例5】AURGG101、AURGG102和AURGG703的制备

以实施例4(2-1)中描述的pYESGGPS为模板，并采用下列引物PYES2(1-27)和PYES2(861-835)，经PCR制备一个长度为1.9kbp的SalI片段，该片段具有GAL1启动子＝BTS1＝CYC1终止子(GAL1p-BTS1-CYC1t)一级结构。

PYES2(1-27)：5′-GGC CGC AAA TTA AAG CCT TCG AGC GTC-3′

(SEQ ID NO：88)

PYES2(861-835)：5′-ACG GAT TAG AAG CCG CCG AGC GGG TGA-3′

(SEQ ID NO：89)

将该片段插入到pAUR101(Takara)的SalI位点，从而获得pAURGG115。经DNA测序证实：在pAURGG115中的BTS1基因没有PCR错误。

用Eco065I线性化pAURGG115质粒，通过乙酸锂法将该质粒导入A451菌株和YPH499菌株。然后，挑选出能够在30℃、含有1μg/ml金担子素的YPD琼脂平板(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)上生长的菌落，将其作为转化体。

在金担子素选择性平板上重新培养该转化体，以挑选出单菌落。

结果获得A451衍生的重组体的两种菌株：AURGG101和AURGG102。同样获得作为YPH499衍生的重组体的菌株AURGG703。下述DNA印迹杂交(图12)和PCR图谱(图13)结果显示：BTS1基因没有被整合到AURGG101中，并且在该菌株中，AURI被一个标记基因AUR1-C所替代。另一方面，发现GAL1启动子＝BTS1＝CYC1终止子被整合在AURGG102的AUR1基因座。

【实施例6】EUG菌株的构建

从SGD获得鲨烯合酶基因ERG9附近的一个基因图谱。根据该图谱，设计用于扩增DNA片段的各种PCR引物DNA，扩增片段被用于替代ERG9转录启动子(ERG9p)。另一方面，以pYES2Δ为模板，该模板是通过用NaeI和NheI消化pYES2，再由Klenow酶将该质粒钝端化，通过自连接删除2μori而获得的，采用PCR扩增法制备一个长度为1.8kbp的DNA片段，该片段含一个转化体选择标记基因URA3和一个转录启动于GALIp。

采用的PCR扩增引物如下所示：

E-MCSf：5′-GCC GTT GAC AGA GG G TCC GAG CIC GGT ACC AAG-3′

(SEQ ID NO：90)

E-URA3r：5′-CAT ACT GAC CCA TT G TCA ATG GGT AAT AAC TGA T-3′

(SEQ ID NO：91)

在上述每种引物中，都加入一个Eaml105I识别位点(下划线部分)，使得可以通过T/A连接，将一个长度为0.7kbp、含有YHR189W的一个下游部分的DNA片段和一个长度为0.9kbp、含有ERG9的一个上游部分的DNA片段连接到一个长度为1.8kbp片段上。YHR189W片段是以YHR189Wf和YHR189Wr为引物，以YPH499基因组DNA为模板，经PCR扩增制备的。ERG9片段是以ERG9f和ERG9r为引物，以YPH499基因组DNA为模板，经PCR扩增制备的。YPH499染色体DNA是用一个酵母基因组DNA制备试剂盒“Dr.GenTLE^TM”(Takara)制备的。

YHR189Wf：5′-TGT CCG GTA AAT GGA GAC-3′(SEQ ID NO：92)

YHR189Wr：5′-TGT TCT CGC TGC TCG TTT-3′(SEQ ID NO：93)

ERG9f：5′-ATG GGA AAG CTA TTA CAA T-3′(SEQ ID NO：94)

ERG9r：5′-CAA GGT TGC AAT GGC CAT-3′(SEQ ID NO：95)

简言之，用Eaml105I消化长度为1.8kbp的DNA片段后，将其连接到长度为0.7kbp的DNA片段上。以得到的片段为模板，采用上述引物YHR189Wf和E-MCSf进行第二次PCR扩增。再用Eaml105I消化经上述步骤得到的长度为2.5kbp的DNA片段，将其连接到长度为0.9kbp的DNA片段上。以得到的片段为模板，采用下述引物YHR189W-3f和ERG9-2r进行第三次PCR扩增。结果得到长度为3.4kbp的DNA片段。该DNA片段将用于转化。

YHR189W-3f：5’-CAA TGT AGG GCT ATA TAT G-3’(SEQ ID NO：96)

ERG9-2r：5’-AAC TTG GGG AAT GGC ACA-3’(SEQ ID NO：97)

采用购自Zymo Research(Orange，CA)的Frozen EZ酵母转化II试剂盒将载体导入酵母菌株。将获得的重组体培养在特定琼脂培养基(称为SGR(-URA)培养基)上，培养温度为30℃，该培养基是通过将CSM(-URA)(购自EIO 101，Vista，CA)和硫酸腺嘌呤(终浓度为40mg/L)加入到SGR培养基中而获得的。将生长于该培养基上的菌落再次涂布于相同培养基上，可得到分离的单菌落。

获得的重组体被命名为EUG(ERG9p::URA3-GAL1p)克隆。在这些克隆中，A451衍生的克隆被命名为EUG1-EUG10；YPH499衍生的克隆被命名为EUG11-EUG20；YPH500衍生的克隆被命名为EUG21-EUG30；W303-1A衍生的克隆被命名为EUG31-EUG50；W303-1B衍生的克隆被命名为EUG51-EUG70。

可挑选出那些显示出生长速率下降的克隆，生长速率下降是由于SD培养基中的葡萄糖抑制了ERG9表达而造成的。结果从A451中获得EUG5和EUG8；从YPH499中获得EUG12；从YPH500中获得EUG27。

采用Dr.GenTLE^TM，从EUG5、EUG8、EUG12和EUG27制备基因组DNA，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增。结果证实：长度为1.8kbp、含有URA3和GAL1p的PCR片段被整合到每个基因组的ERG9编码区域的上游。

【实施例7】基因和酶活性分析

本实施例中，采用各种不同的技术，包括异戊二烯基二磷酸合酶的酶活测定、RNA印迹杂交、DNA印迹杂交、PCR作图和异戊二烯醇产量测定，来分析所制备的不同重组酵母克隆中(就其制备而言，见描述异戊二烯醇制备的实施例8-13)的基因表达情况。

(1)DNA印迹法

采用酵母DNA纯化试剂盒Dr.GenTLE^TM，根据试剂盒所附说明制备酵母DNA。

制备的酵母DNA经NdeI和StuI消化后，采用0.8％琼脂糖凝胶电泳，每泳道DNA上样量为3μg。分子量标记采用0.5μg的1kb的序列梯和0.5μg的λ/HindIII(均购自Promega，Madison，WI)。电泳完成后，根据传统方法，将DNA碱变性、中和、并通过20x SSC的毛细管印迹转移到Hybond N尼龙膜(Amersham，Buckinghamshire，England)。在最适交联条件下，用UV交联仪(Stratagene)对尼龙膜进行照射，以固定DNA到膜上。

(2)RNA印迹法

根据Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，pp.13.12.2-13.12.3中描述的方法，并稍加修改而制备RNA。该修改即：将已制备的RNA样品进一步用Dnase I处理。

经甲醛变性的琼脂糖凝胶电泳分离RNA后，根据传统方法，将RNA通过20x SSC的毛细管印迹转移到Hybond N尼龙膜。每泳道电泳上样量为5μg总RNA。分子量标记采用20ng的DIG-RNA标记I。在最适交联条件下用UV交联仪(Stratagene)对得到的膜进行紫外照射，以固定RNA到膜上。

(3)PCR作图

为检测一个源自pAURGG115(实施例5中制备的一个YIp载体)的片段是如何被整合进染色体的，以上述已制备的0.3-0.6μg的酵母DNA为模板，采用合成寡聚核苷酸引物AUR-FWc和AUR-RVc，或AUR-SAL1和AUR-SAL2的组合为引物进行PCR扩增。PCR条件如下：30个循环过程，每个循环包括94℃变性30秒，55℃退火1分钟，72℃延伸3分钟。

AUR-FWc：5′-TCT CGA AAA AGG GTT TGC CAT-3′(SEQ ID NO：98)

AUR-RVc：5′-TCA CTA GGT GTA AAG AGG GCT-3′(SEQ ID NO：99)

AUR-SAL1：5′-TGT TGA AGC TTG CAT GCC TGC-3′(SEQ ID NO：100)

AUR-SAL2：5′-TTG TAA AAC GAC GGC CAG TGA-3′(SEQ ID NO：101)

(4)DIG标记的探针DNA的制备

制备探针I、II、III和V(表7)，作为杂交探针。

表7.杂交探针

探针编号	基因	模板	引物1	引物2
探针编号	基因	模板	引物1	引物2	IIIIIIV	ERG20BTS1HMG1AUR1	pT7ERG20pYES2-GGPS6pYHMG1pAUR123	SCFPS1BTS1(1-21)HMG1(1267-1293)AUR-RV	SCFPS2BTS1(1008-982)HMG1(2766-2740)AUR-FW

探针I：

以实施例2(1-1)中制备的pT7ERG20为模板，以SCEPS1和SCEPS2为引物，用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics，MannheimGermany)合成一种DIG标记的探针DNA。实验条件与试剂盒所附制造商的说明一致。PCR需进行30个循环过程，每个循环包括94℃30秒、58℃1分钟、72℃3分钟。继而经琼脂糖凝胶电泳检测得到的DIG标记的探针DNA的合成状态。

探针II：

一种DIG标记的探针DNA，其合成方式与合成探针I描述的方式相同，引物是合成寡聚核苷酸BSTS1(1-21)和BTS1(1008-988)，模板为(见实施例4(2-1))pYESGGPS。

BTS1(1-21)：5′-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG-3′(SEQ ID NO：102)

BTS1(1008-988)：5′-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC-3′(SEQ ID NO：103)

探针III：

一种DIG标记的探针DNA，其合成方式与合成探针I描述的方式相同，采用的引物是合成寡聚核苷酸HMG1(1267-1293)和HMG1(2766-2740)，模板为(见实施例3(3))pYES-HMG1。

HMG1(1267-1293)：5′-AAC TTT GGT GCA AAT TGG GTC AAT GAT-3′

(SEQ ID NO：80)

HMG1(2766-2740)：5′-TCC TAA TGC CAA GAA AAC AGC TGT CAC-3′

(SEQ ID NO：104)

探针V：

一种DIG标记的探针DNA，其合成方式与合成探针I描述的方式相同，采用的引物是合成寡聚核苷酸AUR-FW和AUR-RV，模板为pAUR123(Takara)。

AUR-FW：5′-ATG GCA AAC CCT TTT TCG AGA-3′(SEQ ID NO：105)

AUR-RV：5′-AGC CCT CTT TAC ACC TAG TGA-3′(SEQ ID NO：106)

(5)探针的杂交和检测

在探针浓度为20ng/ml、42℃条件下、采用DIG Easy Hyb(Roche)进行持续时间24小时的DNA印迹杂交。在探针浓度为100ng/ml、50℃下、采用DIG Easy Hyb进行持续时间24小时的RNA印迹杂交。每次杂交前，在DIG Easy Hyb溶液中先进行持续时间24小时的预杂交，预杂交温度与各次杂交的温度相同。杂交完成后，于65℃、用2x SSC、0.1％SDS洗涤膜3次，每次持续时间为10分钟；然后于65℃、用2xSSC、0.1％SDS洗涤膜2次，每次持续时间为15-20分钟。接着，采用DIG发光检测试剂盒(Roche)使膜上的DIG标记探针可以化学发光，再将印迹曝光到X射线胶片上，使其显影。

(6)酶活性的测定

在制备的重组体中，下列宿主菌株和重组体被应用在本实验。根据Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，Inc.，pp.13.7.1-13.7.2中描述的乙酸锂法，或者采用Frozen EZ酵母转化II试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)(操作步骤与试剂盒所附说明一致)，将各个载体导入宿主。在下列清单中，通过将pYES-HMG1导入到A451中获得克隆1-2；通过将pYHMG044导入到A451中获得克隆3-2；通过将pYES-HMG1导入到AURGG101中获得克隆13-2；通过将pYHMG044导入到AURGG101中获得克隆15-2。

No.1宿主菌株：A451

No.2 GAL1p-BTS1(YIp)：AURGG101(A451，aur1::AUR1-C)

No.3 GAL1p-BTS1(YIp)：AURGG102(A451，aur1::BTS1-AUR1-C)

No.4 GAL1p-HMG1(YEp)：1-2(pYES-HMG1/A451)

No.5 GAL1p-HMG1Δ(YEp)：3-2(pYHMG044/A451)

No.6 GAL1p-HMG1(YEp)&GAL1p-BTS1(YIp)：13-2(pYES-HMG1/AURGG101)

No.7 GAL1p-HMG1Δ(YEp)&GAL1p-BTS1(YIp)：15-2(pYHMG044/AURGG101)

No.8 GAL1p-HMG1(YEp)&GAL1p-BTS1(YIp)：24-1(pYES-HMG1/AURGG102)

No.9 GAL1p-HMG1Δ(YEp)&GAL1p-BTS1(YIp)：27-2(pYHMG045/AURGG102)

No.10 GAL1p-HMG1Δ(YEp)&GAL1p-BTS1(YIp)：31-2(pYHMG076/AURGG102)

在26℃分别预培养No.1-10的菌株/克隆。用生理盐水洗涤1毫升的预培养物，将其加入到300ml Erlenmeyer烧瓶中的100ml培养液中，于26℃、120次/分钟的振荡条件下培养。该培养采用SD或SG培养基(将SD培养基中的葡萄糖组分替换为半乳糖)。保留URA3标记的重组体被培养在SD-U[加CSM(-URA)的SD培养基]或SG-U[加CSM(-URA)的SG培养基]。AURGG菌株则培养在含1μg/ml金担子素的培养基中。

测定细胞的OD₆₀₀值，以监测细胞生长。当OD₆₀₀值达到3-4(培养开始后23-52小时)时停止培养。将培养物在冰中冷却后，制备DNA、RNA和粗酶溶液，方法描述如下。

通过离心从每种培养液中收获细胞后，采用与制备RNA相同的方式，在4℃用玻璃珠破碎细胞。然后，将细胞悬浮在无菌水中，制成菌悬液。再用冷冻微离心机以12,000rpm转速、离心10分钟该菌悬液，回收得到的上清作为粗酶提取物。以BSA为标准蛋白质，由Bio-Rad蛋白测定(Bio-Rad，Hercules，CA)检测该粗酶提取物中的蛋白质浓度。简言之，即37℃下，在200μl、含下列物质的反应混合物中反应10μg的粗酶提取物40分钟。

0.125mM[¹⁴C]IPP(185 GBq/mol)

0.125mM香叶基二磷酸(Sigma Chemical，St.Louis，MO)

100mM Tris·HCl(pH7.0)

10mM NaF，5mM MgCl₂

5mM 2-巯基乙醇

0.05％Triton X-100

0.005％BSA

反应完毕，用水饱和的丁醇提取延伸的异戊二烯基二磷酸。经由液体闪烁计数检测一份异戊二烯基二磷酸的放射活性。用马铃薯酸磷酸酶将剩余样品脱去磷酸，再用薄层层析法[板：LKC18(Whatman，Clifton，NJ)；显影剂∶H₂O/丙酮＝1∶19]显影，接着根据Koyama等人的方法(Koyama T.，Fujii，H.and Ogura，K.，1985，Meth.Enzymol.110：153-155)用Bio图像分析仪BAS2000(Fuji Flim)进行放射自显影成像，以检测相对放射活性。

(7)观察结果

(7-1)DNA印迹杂交和PCR图谱

DNA印迹杂交结果如图12所示。AUR1附近的PCR图谱结果如图13所示。在图12和图13中，1-10泳道对应的是上文(6)中采用的菌株/克隆(No.1-No.7)的编号。

出现在每泳道编号下的“N”表示DNA被NdeI消化；“S”表示DNA被StuI消化。自下列菌株/克隆制备出每泳道上样的各种DNA。

泳道1：A451；泳道2：AURGG101；泳道3：AURGG102；泳道4：pYES-HMG1/A451；泳道5：pYHMG044/A451；泳道6：pYES-HMG1/AURGG101；泳道7：pYHMG044/AURGG101；泳道8：pYES-HMG1/AURGG102；泳道9：pYHMG045/AURGG102；和泳道10：pYHMG076/AURGG102

发现检测的所有菌株/克隆中ERG20(FPP合酶基因)都是相同的，并且在每个菌株/克隆基因组中的ERG20附近区域没有变化(图12)。

当以BTS1(GGPP合酶基因)和AUR1为探针时，发现BTS1被整合进AURGG102的AUR1区域，而AURGG101中出现的条带与在宿主菌株A451中出现的条带相同。在AURGG101中，只有AUR1基因被pAUR101来源的AUR1-C基因所替代；发现GAL1-BTS1片段没有被整合进该菌株的基因组中。当由PCR检测因染色体整合引起的AUR1位点复制时，仅在AURGG102中检测到预期的条带，在AURGG101中没有检测到预期条带(图13)。

图12中，当以HMG1为探针时，在NdeI消化的各种DNA(泳道4-7)中出现一个质粒来源的条带。在StuI消化的各种DNA中，原先预期能够如在克隆1-2(No.4)的情况一样，出现一个长度为8.2kbp、来源自质粒的条带(重叠了一个长度为8.3kbp、来源自基因组的条带)。然而，由于基因组中的HMG1临近区域与导入质粒发生重组，使得在克隆13-2(No.6)和克隆15-2(No.7)中观察到一个条带偏移。

从DNA印迹杂交和PCR图谱的结果中，可以总结本实施例采用的菌株/克隆基因型如下表8中所示。该表中，“AUR”指一种加入了金担子素的培养基。“培养基1”指用于预培养的培养基，“培养基2”指用于主培养的培养基。

表8

菌株/克隆No.	命名	整合基因	质粒中基因	培养基1	培养基2
菌株/克隆No.	命名	整合基因	质粒中基因	培养基1	培养基2	12345678910	A451AURGG101AURGG1021-23-213-215-224-127-231-2	--BTS1----BTS1BTS1BTS1	---HMG1HMG1Δ044HMG1HMG1Δ044HMG1HMG1Δ045HMG1Δ076	SDSD-AURSD-AURSD-USD-USD-U-AURSD-U-AURSD-U-AURSD-U-AURSD-U-AUR	SGSG-AURSG-AURSG-USG-USG-U-AURSG-U-AURSG-U-AURSG-U-AURSG-U-AUR

(7-2)RNA印迹杂交

RNA印迹杂交结果如图14所示。杂交时用到了表7中所列的探针I、II、III和V。

图14中，泳道1-10所用的菌株/克隆同图12中所用的菌株/克隆相同。标记“-”表示在SD培养基中的转录物，标记“+”表示在SG培养基中的转录物。

当SG培养基诱导GAL1p转录时，在克隆13-2(No.6)和克隆15-2(No.7)中，ERG20转录物显示出减少的趋势。

当在GAL1转录启动子控制下，SG培养基诱导基因的转录时，BTS1转录物仅在特定的菌株中增加，即AURGG102(No.3)，该菌株中，染色体整合了GAL1p-BTS1片段。

然而，当同HMG1转录物比较时，发现BTS1的转录诱导程度比较低。当由SG培养基诱导转录时，在克隆No.4-No.7中HMG1转录物有非常显著的增加，这些克隆都通过质粒导入了GAL1p-HMG1片段。

(7-3)异戊二烯基二磷酸合酶活性

以香叶基二磷酸(GPP)和¹⁴C标记的IPP为烯丙基二磷酸底物，测定在粗酶组分中异戊二烯基二磷酸合酶活性。

简言之，将以(GPP)和[¹⁴C]IPP为底物合成的各个异戊二烯基二磷酸脱磷酸，经TLC显影，继而检测每个斑点的放射活性。结果是，FPP合酶活性最高，其次是HexPP(六异戊二烯基二磷酸)合酶活性，并发现该酶活性远高于GGPP合酶活性。然后，从放射自显影图中推算出反应产物的相对含量，继而推算总蛋白质的比活性。结果如图15所示。图15A中，上图显示FPP合酶(FPS)活性，下图显示GGPP合酶(GGPS)活性。图15B中，上图显示HexPP合酶(HexPS)活性，下图显示PT酶(总异戊二烯基二磷酸合酶)活性。阴影柱显示在SD培养基中的结果，空白柱显示在SG培养基中的结果。总异戊二烯基二磷酸合酶活性的大部分是FPP合酶活性。因SG培养基造成的该活性的增加是可以观察到的。尤其是FPP合酶活性在克隆13-2(No.6)和15-2(No.7)中有显著的增加。总体上，当GPP被作为烯丙基底物时，GGPP合酶活性大约为FPP合酶活性的1/20000，大约是HexPP合酶活性的1/300。在SG培养基中，HexPP合酶活性是降低的。

[实施例8]DNA导入宿主及宿主的培养

(通过啤酒糖酵母表达)

该实施例中，为构建一个甲羟戊酸途径相关酶基因在啤酒糖酵母中永久表达的体系，通过将啤酒糖酵母来源的基因导入含有一个组成型启动子和多种不同营养缺陷型标记的表达穿梭载体，从而制备用于甲羟戊酸途径相关酶基因的表达载体。然后评估这些基因高表达对异戊二烯醇制备的效果。

(1)酵母的转化

将得到的用于每个甲羟戊酸途径相关酶基因的表达载体导入宿主。在新导入的载体里，每个甲羟戊酸途径相关酶基因被插入到TDH3转录启动子TDH3p(＝GAPp)的下游。就宿主而言，可采用下列菌株/克隆。

A451

AURGG101

YPH499

AURGG703

YPH500

W303-1A

W303-1B

EUG5(来源自A451)

EUG8(来源自A451)

EUG12(来源自YPH499)

EUG24(来源自YPH500)

EUG27(来源自YPH500)

15-2(pYHMG044/AURGG101)(来源自AURGG101)

(2)酵母的培养

根据采用的标记基因，在SD选择性培养基中，预培养每个导入甲羟戊酸途径相关酶基因的酵母克隆。然后，将25μl的预培养液加入到2.5ml的YM或SG(SD的葡萄糖组分被半乳糖替代)培养基中，以130rpm、26℃条件下反复振荡培养4天。在将预培养液加入SG培养基前，预先用生理盐水洗涤细胞，以免葡萄糖组分被带入培养基。当采用YPH499来源的克隆时，在培养基中加入硫酸腺嘌呤，浓度为40μg/ml。

(3)戊烷抽提

在甲羟戊酸途径相关酶基因转化的酵母克隆的培养完成后，检测培养物的30倍稀释液的OD600值。然后，加入2.5ml甲醇到该稀释液中，并使其混合。再加入5ml戊烷，并剧烈振荡。继而将得到的混合物静置后，转移戊烷层到一个干净的玻璃试管中。将该试管置于通风橱内，使戊烷蒸发以浓缩溶质。随后，以10μl 1.0ml/L十一醇作为内部标准物加入其中，从而制备出用于GC/MS的样品。

(4)GC/MS分析

用HP6890/5973 GC/MS系统(Hewlett-Packard，Wilmington，DE)将戊烷抽提组分进行分离、鉴定和定量检测。采用的色谱柱是HP-5MS(0.25mm×30m；膜厚0.25μm)。分析条件如下所示。相同的条件也适用于本说明书中所有的GC/MS分析。

入口温度：250℃

检测器温度：260℃

[MS区域温度]

MS四极杆温度：150℃

MS离子源温度：230℃

质量扫描范围：35-200

[进样参数]

自动进样模式

样品容量：2μl

甲醇洗涤3遍，正己烷洗涤2遍

分流比：1/20

载气：氦气1.0ml/分钟

溶剂延迟：2分钟

[炉加热条件]

115℃90秒

以70℃/分钟的速度加热至250℃，并维持2分钟

以70℃/分钟的速度加热至300℃，并维持7分钟

0小时后

内部标准：0.01μl 1-十一醇于乙醇中

可信标准：(全E)-橙花叔醇(Eisai)

(全E)-法呢醇(Sigma)

(全E)-香叶基香叶醇(Eisai)

鲨烯(Tokyo Kasei Kogyo)

(5)结果

基因、表达载体、宿主、培养条件(培养基、温度及培养时间)与最大GGOH产量之间的关系总结于下表9中。

表9.最大GGOH产量

基因导入的DNA	宿主	培养基	温度(℃)	培养时间(hr)	GGOH产量(mg/l)
基因导入的DNA	宿主	培养基	温度(℃)	培养时间(hr)	GGOH产量(mg/l)	HMG1pRS434GAP-HMG1pRS444GAP-HMG1pRS444TEF-HMG1pYES-HMG1pYES-HMG1pRS414TPadh-HMG1	Sc A451Sc A451Sc A451Sc A451Sc AURGG101Sc YPH499	YMYMYMSGSGYM*	262630262628	969696484896	0.3480.1280.0690.1002.200.136
HMG1ΔpYHMG044pYHMG056pYHMG062pYHMG076pYHMG081pYHMG112pYHMG122pYHMG044pYHMG044pYHMG044pYHMG062pYHMG076pYHMG081	Sc A451Sc A451Sc A451Sc A451Sc A451Sc A451Sc A451Sc AURGG101Sc AURGG101Sc AURGG101Sc AURGG101Sc AURGG101Sc AURGG101	SGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSG	26262626262626262630262626	48484848484848489696484848	0.0530.0700.0650.0500.0510.0640.0622.200.7297.950.0610.0620.052		Sc A451Sc A451Sc A451Sc A451Sc AURGG101Sc YPH499	YMYMYMSGSGYM*	262630262628	969696484896	0.3480.1280.0690.1002.200.136
		SGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSG	26262626262626262630262626	48484848484848489696484848		HMG1+HMG1ΔpYHMG044+pRS434GAP-HMG1pYHMG044+pRS444GAP-HMG1	Sc AURGG101Sc AURGG101	SGSG	2626	9696	0.9270.739
ERG20(YEp)pRS435GAP-ERG20pRS445GAP-ERG20	Sc A451Sc A451	YMYM	2626	9696	0.0670.073	HMG1+HMG1ΔpYHMG044+pRS434GAP-HMG1pYHMG044+pRS444GAP-HMG1	Sc AURGG101Sc AURGG101	SGSG	2626	9696	0.9270.739
ERG20(YEp)pRS435GAP-ERG20pRS445GAP-ERG20	Sc A451Sc A451	YMYM	2626	9696	0.0670.073	BTS1(基因组)pAURGG115(Eoo0651消化的)pAURGG115(Eoo0651消化的)	Sc A451(AURGG102)Sc YPH499(AURGG703)	SGSG	3028	9898	0.0750.093
BTS1(Yep vector)pRS445GAp-BTS1pRS435GAP-BTS1pRS435GAP-BTS1(＝pRS435GG)pRS445GAP-BTS1(＝pRS445GG)pRS435GAP-BTS1(＝pRS435GG)pRS445GAP-BTS1(＝pRS445GG)	Sc A451Sc YPH499Sc W303-1ASc W303-1ASc W303-1BSc W303-1B	YMYMYMYMYMYM	262830303030	969696969696	0.5850.2040.7260.1890.8530.254	BTS1(基因组)pAURGG115(Eoo0651消化的)pAURGG115(Eoo0651消化的)	Sc A451(AURGG102)Sc YPH499(AURGG703)	SGSG	3028	9898	0.0750.093
	Sc A451Sc YPH499Sc W303-1ASc W303-1ASc W303-1BSc W303-1B	YMYMYMYMYMYM	262830303030	969696969696	0.5850.2040.7260.1890.8530.254	HMG1Δ(YEp)+ERG20(YEp)pYHMG044+pRS435GAP-ERG20pYHMG044+pRS445GAP-ERG20	Sc AURGG101Sc AURGG101	SGSG	2626	9696	11.31.24
HMG1Δ(YEp)+ispA(YEp)pYHMG044+pRS435GAP-ispApYHMG044+pRS445GAP-ispA	Sc AURGG101Sc AURGG101	SGSG	2626	9696	1.640.900		Sc AURGG101Sc AURGG101	SGSG	2626	9696	11.31.24
	Sc AURGG101Sc AURGG101	SGSG	2626	9696	1.640.900	HMG1(YEp)+BTS1(YEp)pRS434GAP-HMG1(＝pRS435GG)pRS434GAP-HMG1(＝pRS445GG)pRS434TEF-HMG1(＝pRS435GG)pRS434TEF-HMG1(＝pRS445GG)	Sc YPH499Sc YPH499Sc YPH499Sc YPH499	YMYMYMYM	26262626	96969696	0.5810.3500.5090.630
HMG1(YEp)+BTS1(基因组)pYES-HMG1pYES-HMG1pYES-HMG1	Sc AURGG102Sc AURGG102Sc AURGG703	SGSGSG	262626	489696	0.0901.2800.462		Sc YPH499Sc YPH499Sc YPH499Sc YPH499	YMYMYMYM	26262626	96969696	0.5810.3500.5090.630
HMG1(YEp)+BTS1(基因组)pYES-HMG1pYES-HMG1pYES-HMG1	Sc AURGG102Sc AURGG102Sc AURGG703	SGSGSG	262626	489696	0.0901.2800.462	HMG1Δ(YEp)+BTS1(YEp)pYHMG044(＝pRS435GG)pYHMG044(＝pRS445GG)	Sc AURGG101Sc AURGG101	SGSG	2626	9696	9.768.82

HMG1Δ(YEp)→BTS1(基因组)

pYHMG027 Sc AURGG102 SG 26 48 0.078

pYHMG044 Sc AURGG102 SG 26 48 0.120

PYHMG044 Sc AURGG102 SG 26 96 0.415

pYHMG045 Sc AURGG102 SG 26 48 0.610

pYHMG059 Sc AURGG102 SG 26 48 0.099

pYHMG062 Sc AURGG102 SG 26 48 0.120

pYHMG062 Sc AURGG102 SG 26 48 0.418

pYHMG063 Sc AURGG102 SG 26 48 0.110

pYHMG076 Sc AURGG102 SG 26 48 0.400

pYHMG083 Sc AURGG102 SG 26 48 0.210

pYHMG094 Sc AURGG102 SG 26 48 0.170

pYHMG108 Sc AURGG102 SG 26 48 0.120

pYHMG122 Sc AURGG102 SG 26 48 0.160

pYHMG123 Sc AURGG102 SG 26 48 0.097

pYHMG134 Sc AURGG102 SG 26 48 0.110

pYHMG044 Sc AURGG703 SG 26 96 0.201

pYHMG062 Sc AURGG703 SG 26 96 0.243HMG1Δ(YEp)+ispAm(YEp)

pYHMG044+pRS435GAP-lspAm Sc AURGG101 SG 26 96 1.36

HMG1Δ(YEp)+ORF182(YEp)

pYHMG044+pRS435GAP-ORF182 Sc AURGG101 SG 26 96 0.626

pYHMG044+pRS445GAP-ORF182 Sc AURGG101 SG 26 96 1.16

HMG1Δ(YEp)+HMGS(YEp)

pYHMG044+pRS435GAP-HMGS Sc AURGG101 SG 26 96 1.30

pYHMG044+pRS445GAP-HMGS Sc AURGG101 SG 26 96 0.883

HMG1Δ(YEp)+ERG12(YEp)

pYHMG044+pRS435GAP-ERG12 Sc AURGG101 SG 26 96 0.702

pYHMG044+pRS445GAP-ERG12 Sc AURGG101 SG 26 96 1.01

HMG1Δ(YEp)+ERG8(YEp)

pYHMG044+pRS435GAP-ERG8 Sc AURGG101 SG 26 96 0.700

pYHMG044+pRS445GAP-FRG8 Sc AURGG101 SG 26 96 2.72

HMG1Δ(YEp)+ERG10(YEp)

pYHMG044+pRS435GAP-ERG10 Sc AURGG101 SG 26 96 1.16

pYHMG044+pRS445GAP-ERG10 Sc AURGG101 SG 26 96 1.22

HMG1Δ(YEp)+ERG19(YEp)

pYHMG044+pRS435GAP-ERG19 Sc AURGG101 SG 26 96 1.89

pYHMG044+pRS446GAP-FRG19 Sc AURGG101 SG 26 96 1.02

fpsm(Y81M)

pFPSm21 Ec JM109 2xYT*** 37 16 16.1

ispAm(Y79M) p16M Ec JM109 2xYT*** 37 16 21.9

ispAm(Y79D)

p15D Ec JM109 2xYT*** 37 16 0.12

ispAm(Y79E)

p4E Ec JM109 2xYT*** 37 16 0.26

ispAm(Y79M)+idi

pALispA16m+p3-47-13 Ec JM109 2xYT 37 16 0.07

- Sc A451** 0.02

- Sc AURGG101 0.02

- Sc YPH499 0.00

- Sc YPH500 0.00

- Sc W303-1A 0.00

- Sc W303-1B 0.00

Ec JM109 0.00

HMG1

pRS434GAP-HMG1 Sc EUG8 YM 30 96 0.16

pRS444GAP-HMG1 Sc EUG8 YM 30 96 0.12

pRS434GAP-HMG1 Sc EUG12 YM 30 96 1.03

pRS444GAP-HMG1 Sc EUG12 YM 30 96 1.02

pRS434GAP-HMG1 Sc EUG12 YM 30 96 0.55

pRS434GAP-HMG1 Sc EUG27 YM 30 96 0.55

pRS434GAP-HMG1 Sc EUG27 YM 30 96 0.63

HMG1Δ

pYHMG044 Sc AURGG101 YMO 26 157 3.58

pRS434GAP-HMG026 Sc EUG5 YM 30 96 0.09

pRS434GAP-HMG044 Sc EUG5 YM 30 96 0.09

pRS434GAP-HMG056 Sc EUG5 YM 30 96 0.11

pRS434GAP-HMG062 Sc EUG5 YM 30 96 0.13

pRS434GAP-HMG076 Sc EUG5 YM 30 96 0.15

pRS434GAP-HMG081 Sc EUG5 YM 30 96 0.14

pRS434GAP-HMG100 Sc EUG5 YM 30 96 0.18

pRS434GAP-HMG112 Sc EUG5 YM 30 96 0.34

pRS434GAP-HMG122 Sc EUG5 YM 30 96 0.13

pRS434GAP-HMG133 Sc EUG5 YM 30 96 0.71

pRS434GAP-HMG026 Sc EUG12 YM 30 96 0.63

pRS434GAP-HMG044 Sc EUG12 YM 30 98 0.44

pRS434GAP-HMG056 Sc EUG12 YM 30 96 0.4

pRS434GAP-HMG062 Sc EUG12 YM 30 96 0.45

pRS434GAP-HMG076 Sc EUG12 YM 30 96 0.55

PRS434GAP-HMG081 Sc EUG12 YM 30 96 0.49

pRS434GAP-HMG100 Sc EUG12 YM 30 96 0.44

pRS434GAP-HMG112 Sc EUG12 YM 30 96 0.53

pRS434GAP-HMG122 Sc EUG12 YM 30 96 0.5

pRS434GAP-HMG133 Sc EUG12 YM 30 96 0.44BTS1(载体)

pRS435GG Sc EUG8 YM 30 96 1.4

pRS435GG Sc EUG12 YM 30 96 1.58

pRS435GG Sc EUG27 YM 30 96 1.53FPS基因

pFPSm21 Ec JM109 2xYT*** 37 16 16.1

pFPSm31 Ec JM109 2xYT*** 37 16 6.9

p4D Ec JM109 2xYT*** 37 16 0.09

p4E Ec JM109 2xYT*** 37 16 0.26

p4M Ec JM109 2xYT*** 37 16 15.5

p8M Ec JM109 2xYT*** 37 16 0.31

p15D Ec JM109 2xYT*** 37 16 0.12

p15E Ec JM109 2xYT*** 37 16 0.21

p16D Ec JM109 2xYT*** 37 18 0.06

p16E Ec JM109 2xYT*** 37 16 0.88

p16M Ec JM109 2xYT*** 37 16 21.9

p18E Ec JM109 2xYT*** 37 16 0.14

p16M Ec JM109 2xYT*** 37 16 6FPS基因+idi

p16M+p3-47-13 Ec JM109 2xYT 37 16 0.07GGHDEL

pRS445GGHDEL Sc YPH499 YM 30 96 0.23FGG融合体

pRS435FGG Sc YPH499 YM 30 96 0.46

pRS435FGGHDEL Sc YPH499 YM 30 96 0.29

GGF融合体

pRS435GGF Sc A451 YM 30 96 0.28

pRS435GGF Sc A451 YMO 30 96 0.48

pRS435GGF Sc A451 YM 30 168 0.28

pRS435GGF Sc A451 YMO 30 168 1.01

pRS435GGF Sc YPH499 YM 30 98 2.1

pRS435GGF Sc YPH499 YMO 30 96 1.49

pRS435GGF Sc YPH499 YM 30 168 0.37

pRS435GGF Sc YPH499 YMO 30 168 2.92

pRS435GGF Sc EUG5 YM 30 96 5.2

pRS435GGF Sc EUG5 YMO 30 96 4.2

pRS435GGF Sc EUG5 YM(100) 30 96 3.5

pRS435GGF Sc EUG5 YM 30 168 7.32

pRS435GGF Sc EUG5 YMO 30 168 10.1

pRS435GGF Sc EUG12 YM 30 96 0.47

pRS435GGF Sc EUG12 YMO 30 96 2.38

pRS435GGF Sc EUG12 YM(20) 30 96 7.04

pRS435GGF Sc EUG12 YM 30 168 1.43

pRS435GGF Sc EUG12 YMO 30 168 5.78

pRS435GGFHDEL Sc A451 YMO 30 96 0.13

pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YM 30 96 1.9

pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YMO 30 96 1.69

pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YM 30 168 0.54

pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YMO 30 168 2.5

pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YM 30 96 5.78

pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YMO 30 96 3.97

pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YM(75) 30 96 3.94

pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YM 30 168 6.99

pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YMO 30 168 10.8

pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YM 30 96 0.6

pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YMO 30 96 2.33

pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YM(20) 30 98 8.01

pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YM 30 188 1.18

pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YMO 30 168 5.78HMG1+GGF融合体

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGF Sc A451 YM 30 98 0.55

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGF Sc A451 YMO 30 96 0.36

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGF Sc A451 YM 30 168 0.93

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGF Sc A451 YMO 30 168 1.01

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGF Sc A451 YM(50) 30 16B 4.54

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGF Sc YPH499 YM 30 96 0.78

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGF Sc YPH499 YMO 30 96 2.46

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGF Sc YPH499 YM(50) 30 98 2.25

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGF Sc YPH499 YMO 33 109 128

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGF Sc YPH499 YM 30 168 1.28

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGF Sc YPH499 YMO 30 168 5.66

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGF Sc YPH499 YM(100) 30 168 2.5

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDEL Sc A451 YM 30 96 0.54

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDEL Sc A451 YMO 30 96 0.41

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDEL Sc A451 YM 30 168 0.76

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDEL Sc A451 YMO 30 188 3.49

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDEL Sc A451 YM(75) 30 168 5.74

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YM 30 96 1

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YMO 30 96 2.6

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YM(100) 30 168 2.85

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YM 30 168 2.45

pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YMO 30 68 6.16

*：加入了0.1％ADEKANOL+5％Glc。

**：当培养宿主本身时，在任何培养条件下都不产生GGOH。

***：加入了IPP和DMAPP

在“基因”一栏中，“YEp″意指采用YEp载体转移的基因，“基因组”意指通过基因组整合转移的基因。

在上表中，在宿主一栏中的“Ec”意指大肠杆菌，“Sc”意指啤酒糖酵母。在“培养基”一栏中，“YM(20)”意指该YM培养基含20％Glc-80％Gal的初始糖成分，并且在2天的培养中，Glc被进一步加进该培养基中，达到5％的终浓度。培养基的其它组分及数值有相同的意义。

(5-1)通过ERG20表达制备GGOH

当pRS435GAP-ERG或pRS445GAP-ERG被导入A451时，重组体高效产出GGOH。当采用pRS445GAP-ERG时，可产出0.73mg/L的GGOH(表9)。

(5-2)通过BTS1表达制备GGOH

当pRS435GAP-BTS1或pRS445GAP-BTS1被导入A451或YPH499时，GGOH产量大幅度增加(表9)。当宿主为A451时，重组体平均产出0.10-0.11mg/L的GGOH，最多为0.585mg/L(表9)。此外，当pRS435GAP-BTS1或pRS445GAP-BTS1被导入W303-1A或W303-1B时，最多产出0.19-0.85mg/L的GGOH(表9)。

(5-3)通过HMG辅酶A还原酶基因或其突变体表达制备GGOH

(i)当组成型启动子连接的HMG1基因被导入A451时GGOH的制备

(表达为“组成型启动子；HMG1；A451”；该表示方式也应用于下文描述的其它重组体)

GGOH产量的测定结果如图16所示。在图16中，434和444分别表示采用pRS434GAP和pRS444GAP载体时的结果。该图表中的右柱显示的是培养基因导入前的宿主(A451)所得到的结果。

这些结果显示：在pRS343GAP-HMG/A451中，GGOH产率有改善，平均产出0.105mg/L的GGOH，并且根据菌落的不同，仅活化了HMG1基因的转录，最多就可产出0.348mg/L的GGOH(表9)。这样，该重组体被认为对GGOH的制备是有效的。

(ii)诱导型启动子；HMG1；A451 & AURGG101

将质粒pYES2-HMG导入到A451和AURGG101(A451，aur1::AUR1-C)中，该质粒是通过将一个HMG1基因(HMG1’，一个PCR错误型HMG1)插入到含诱导型启动子GAL1p的载体pYES2而获得。

结果获得GGOH高产克隆。AURGG101衍生的克隆的GGOH产量平均达到1.1mg/L，最多达到2.2mg/L(图17)。

(iii)诱导型启动子；HMG1 &BTS1；AURGG102 &AURGG703

将质粒pYES-HMG导入到A451衍生的AURGG102和YPH499衍生的AURGG703(该宿主染色体中整合有BTS1)中，该质粒是通过将一个HMG1’插入到含诱导型启动子GAL1p的载体pYES2而获得。

结果，当以AURGG102或AURGG703为宿主时，只要采用GAP1p就可获得GGOH高产克隆(图18)。AURGG102衍生的克隆最多可产出1.28mg/L的GGOH。

(iv)诱导型启动子；HMG1Δ；A451

将下列质粒分别导入A451中，这些质粒均通过将HMG1’基因的缺失突变体插入到含诱导型启动子GAL1p的载体pYES2而获得。

pYHMG026

pYHMG044

pYHMG056

pYHMG062

pYHMG076

pYHMG081

pYHMG100

pYHMG112

pYHMG122

在SG培养基中培养得到的重组体，继而测定GGOH产量(图19)。图19中，“HMG1Δ026”表示当把pYHMG026导入A451时的结果。其它基因的导入也以相同方式表示。

当用诱导型启动子表达HMG1基因的缺失突变体时，获得GGOH高产克隆。HMG1Δ056和HMG1Δ062对GGOH制备是有效的。(HMG062/A451克隆平均产出0.063mg/L的GGOH。)

(v)诱导型启动子；HMG1Δ；AURGG101

将下列质粒分别导入AURGG101中，这些质粒均通过将HMG1’基因的缺失突变体插入到含诱导型启动子GAL1p的载体pYES2中而获得。

pYHMG026

pYHMG044

pYHMG056

pYHMG062

pYHMG076

pYHMG081

pYHMG100

pYHMG112

pYHMG122

pYHMG133

在SG培养基中培养得到的重组体，继而测定GGOH产量(图20)。结果在HMG1Δ044中测到大约3.1mg的GGOH产量。在图20中，最右边的柱表示基因导入前的宿主AURGG101的GGOH产量。

(vi)诱导型启动子；HMG1Δ&BTS1；AURGG102

将下列质粒分别导入AURGG102中，这些质粒均通过将HMG1’基因的缺失突变体插入到含诱导型启动子GAL1p的载体pYES2而获得。

pYHMG027

pYHMG044

pYHMG045

pYHMG059

pYHMG062

pYHMG063

pYHMG076

pYHMG083

pYHMG094

pYHMG106

pYHMG112

pYHMG123

pYHMG134

在SG培养基中培养得到的重组体，继而测定GGOH产量。

结果当导入pYHMG045时，获得平均产出0.36mg/L GGOH的克隆(图21)。

(vii)诱导型启动子；HMG1Δ&BTS1；AURGG703

将质粒pYHMG044和pYHMG062分别导入AURGG703中，这两种质粒均通过将HMG1’基因的缺失突变体插入到含诱导型启动子GAL1p的载体pYES2而获得。在SG培养基中培养得到的重组体，继而测定GGOH产量。

结果是导入pYHMG062的克隆平均产出0.21mg/L GGOH的克隆(图22)。

(5-4)通过BTS1和HMG辅酶A还原酶基因共表达制备GGOH

将pRS435GAP-HMG1或pRS445GAP-HMG1同BTS1一起导入YPH499中，测定得到的重组体的GGOH产量。结果当导入pRS435GAP-HMG1时，获得一个最多产出0.58mg/L GGOH的克隆(表9)。

(5-5)通过ispAm、0RF182(idi)、HMGS、ERG8、ERG10或ERG19与HMG辅酶A还原酶基因的一个缺失突变体(HMG1Δ)共表达制备GGOH

将ispAm、ORF182(idi)、HMGS、ERG8、ERG10或ERG19与HMG1Δ一起导入AURGG101中，继而测定得到的重组体的GGOH产量。结果获得最多可产出0.6-2.7mg/L GGOH的克隆。

[实施例9]DNA导入宿主及宿主的培养

(在大肠杆菌中的表达)

将下列载体导入大肠杆菌JM109中，用大肠杆菌FPP合酶基因ispA的表达载体：pALisp4、pALisp15、pALisp16和pALisp18；用作通过转化自ispA的GGPP合酶基因ispA(Y79D)、ispA(Y79E)和ispA(Y79M)的替代突变的表达载体：p4D、p4E、p4M、p8M、p15D、p15E、p16D、p16E、p16M、p18E和p18M；以及用作嗜热脂肪芽孢杆菌FPP合酶基因fps的Y81M突变体的表达载体：pFPSm21和pFPSm31。预培养得到的重组体。将0.5ml的预培养液加入到装有50ml含2xYT和1mM IPTG的培养基的300m1烧瓶中。如有需要，还可加入抗生素(氨苄青霉素和氯霉素)、5mM(大约0.12％(w/v))IPP和5mM DMAPP，37℃下振荡培养细胞16小时。

培养完成后，将马铃薯酸磷酸酶加入到培养液上清中，经超声波破碎产生的沉淀，继而用有机溶剂戊烷将异戊二烯醇抽提出来。然后，由GC/MS对异戊二烯醇进行鉴别和定量测定。进一步地，为确定在没有IPP和DMAPP加入的情况下，是否能够产出异戊二烯醇，将实施例3(1)中获得的质粒p16M(命名为pALispA16m)和实施例2(10-2)中获得的保留有IPPΔ异构酶基因idi的p3-47-13导入大肠杆菌JM109中，然后预培养。将0.5ml的预培养液加入到装有50ml含2xYT和1mM IPTG的培养基的300ml烧瓶中。如有需要，还可加入抗生素(氨苄青霉素和氯霉素)。然后，37℃下振荡培养细胞16小时。

当加入IPP和DMAPP到培养基中时，GGOH产量结果如下。当导入突变体fps(图23的pFPSm21和pFPSm31)时，GGOH产量为16.1mg/L和6.9mg/L。当导入突变体ispA时，保留p4M、p16M和p18M的JM109细胞分别产出15.5mg/L、21.9mg/L和6.0mg/L的GGOH(图23)。在导入Y79M突变的p4M和p16M中，验证出其沉淀组分中有高GGOH活性。从这些结果，可以认为pALispA4和pALispA16在大肠杆菌细胞中能表达具有活性的FPP合酶基因，且其替代突变型质粒p4M和p16M也有足够的表达活性。

当没有加入IPP和DMAPP到培养基中时，在保留pALispA16m的JM109中，GGOH产量为0.07mg/L。当pALispA16m和p3-47-13(保留IPPΔ异构酶基因)被共表达时，以GGOH计算，异戊二烯醇的产率为0.12mg/L。

[实施例10]通过融合基因表达制备异戊二烯醇

假定被啤酒糖酵母BTS1编码的GGPP合酶倾向以FPP而非DMAPP(二甲基烯丙基二磷酸)为起始底物。可以认为，在加强FPP合成能力的同时，需要加强从IPP合成GGPP(GGOH的前体)的能力。

考虑到这一点，该实施例中试图构建由BTS1和ERG20组成的融合基因，以在啤酒糖酵母细胞中将其表达，并确定GGOH的产率是否改善。进一步也试图掺入在BTS1、ERG20或其融合基因的下游编码一个ER过渡信号的核苷酸序列，并检测其对异戊二烯醇制备的影响。

(1)质粒DNA的制备

以pYESGGPS和pT7ER20为模板进行PCR反应，这两种质粒，前者是掺入GGPP合酶基因BTS1的pYES2质粒，后者是掺入FPP合酶基因ERG20的pT7质粒。PCR引物如下所示。

SacII-BTS1：5′-TCC CCG CGG ATG GAG GCC AAG ATA GAY-3′

(SEQ ID NO：107)

BTS1-XhoI：5′-CAA CTC GAG TCA CAA TTC GGA TAA GTG-3′

(SEQ ID NO：108)

ERG20HDEL-XbaI：5′-GC T CTA GAG TTC GTC GTG TTT GCT TCT CTT GTA

AAC TT-3′(SEQ ID NO：109)

BTS1HDEL-XhoI：5′-TAT CTC GAG TCA CAA TTC GTC ATG TAA ATT GG-3′

(SEQ ID NO：110)

BTSI-109I：5′-GCA GGG ACC CCA ATT CGG ATA AGT GGT C-3′

(SEQ ID NO：111)

109I-BTS1：5′-GTA GGG TCC CTG GAG GCC AAG ATA GAT G-3′

(SEQ ID NO：112)

ERG20-109I：5′-GCA GGG ACC CTT TGC TTC TCT TGT AAA CT-3′

(SEQ ID NO：113)

109I-ERG20：5′-GTA GGG TCC TCA GAA AAA GAA ATT AGG AG-3′

(SEQ ID NO：114)

-21：5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′(SEQ ID NO：115)

T7：5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3′(SEQ ID NO：116)

ERG20HDEL-XbaI：5′-GC T CTA GAG TTC GTC GTG TTT GCT TCT CTT GTA

AAC TT-3′(SEQ ID NO：117)

BTSlHDEL-XhoI：5′-TAT CTC GAG TCA CAA TTC GTC ATG TAA ATT GG-3′

(SEQ ID NO：118)

ERG20HDEL-XbaI的3-8位的核苷酸与BTS1HDEL-XhoI4-9位的核苷酸(下划线部分)表示用于载体连接的SacII、XhoI或XbaI识别位点。BTS1-109I、109I-BTS1、ERG20-109I和109I-ERG20的4-10位的核苷酸(下划线部分)分别表示用于融合基因制备的Eco0109I识别位点。

在下述反应溶液中进行PCR。

1xKOD-Plus缓冲液(Toyobo)

0.2mM dNTPs

0.25mM MgSO₄

15pmol引物1

15pmol引物2

0.01-0.1μg模板DNA

1单位KOD-Plus DNA聚合酶(Toyobo)

共计：50μl

KOD-Plus含1.6μg/μl的KOD抗体。接着在94℃下初始变性2分钟，再进行30个循环过程完成PCR，每个循环包括94℃15秒、55℃30秒和68℃1分钟。然后，将溶液置于68℃2分钟。

如表10和图24所示的方法采用模板和引物(引物1+引物2)的组合进行第一次PCR。PCR产物的命名如表10和图24所示。在图24中，最终质粒的命名如最左边的列所示。以灰色字母书写的序列表示氨基酸序列。其中，GS被导入融合基因的结合序列，HDEL被作为ER过渡信号插入。箭头指示用于PCR的各个引物的位置及方向。

表10

模板	引物1	引物2	PCR产物
模板	引物1	引物2	PCR产物	pT7ERG20	SacII-BTS1	BTS1HDEL-XhoI	#6
pYESGGPS	SacII-ERG20	ERG20HDEL-XbaI	#7	pT7ERG20	SacII-BTS1	BTS1HDEL-XhoI	#6
pYESGGPS	SacII-ERG20	ERG20HDEL-XbaI	#7	pYESGGPS	SacII-BTS1	BTS1-109I	#9
pT7ERG20	T7	ERG20-109I	#10	pYESGGPS	SacII-BTS1	BTS1-109I	#9
pT7ERG20	T7	ERG20-109I	#10	pT7ERG20	109I-ERG20	-21	#11
pYESGGPS	109-BTS1	BTS1-XhoI	#12	pT7ERG20	109I-ERG20	-21	#11
pYESGGPS	109-BTS1	BTS1-XhoI	#12	pT7ERG20	109I-ERG20	ERG20HDEL-XbaI	#13
pYESGGPS	109I-BTS1	BTS1HDEL-XhoI	#14	pT7ERG20	109I-ERG20	ERG20HDEL-XbaI	#13

用限制性酶Eco0109I消化PCR产物#9、#10、#11、#12、#13和#14。然后，将#9和#11、#10和#12、#9和#13、及#10和#14彼此单独连接。以得到的连接溶液为模板，以SacII-BTS1和-21的组合、T7和BTS1-XhoI的组合、SacII-BTS1和ERG20HDEL-XbaI的组合、及T7和BTS1HDEL-XhoI的组合为引物1和引物2，进行第二次PCR，反应条件与进行第一次PCR的条件相同。结果获得第二次PCR的产物#9-#11、#10-#12、#9-#13和#10-#14。

用SacII和BamHI消化产物#9-#11，并将其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的SacII-BamHI位点，从而分别获得pRS435GGF和pRS445GGF。

用XbaI和XhoI消化产物#10-#12，并将其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的XbaI-XhoI位点，从而分别获得pRS435FGG和pRS445FGG。

用SacII和XbaI消化产物#9-#13，并将其插入到pRS435GAP的SacII-XbaI位点，从而获得pRS435GGFHDEL。

用XbaI和XhoI消化产物#10-#14，并将其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的XbaI-XhoI位点，从而分别获得pRS435FGGHDEL和pRS445FGGHDEL。

用SacII和XbaI消化产物#7，并将其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的SacII-XbaI位点，从而分别获得pRS435FHDEL和pRS445FHDEL。

用BamHI和XhoI消化产物#6，并将其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的BamHI-XhoI位点，从而分别获得pRS435GGHDEL和pRS445GGHDEL。

通过DNA测序证实每一种得到的质粒DNA都具有与设计精确一致的核苷酸序列。

就用于分别表达非融合BTS1和ERG20基因的质粒而言，采用了pRS435GAP-BTS1(称为pRS435GG)、pRS445GAP-BTS1(称为pRS445GG)、pRS435GAP-ERG20(称为pRS435F)和pRS445GAP-ERG20(称为pRS445F)。就用于表达HMG1的质粒而言，采用的是pRS434TEF-HMG1和pRS434GAP-HMG1。

(2)重组体的制备

用Frozen EZ酵母转化试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)将上述步骤制备的质粒导入宿主，从而制备出重组体。就宿主而言，可以采用A451、YPH499、AH1(pRS434GAP-HMG1/A451)、YH1(pRS434GAP-HMG1/YPH499)、EUG5和EUG12。

(3)异戊二烯醇产量的测定

将除EUG菌株以外的重组体接种到SD(合成右旋糖)选择性液体培养基中。EUG菌株被接种到SGR培养基(即将SD培养基中的葡萄糖组分用半乳糖和棉籽糖替代后得到的培养基)中。然后全部在30℃下培养，以制备预培养液。将10或25μl的预培养液加入到1.0或2.5ml的YM7+ade培养基(YM，pH7，40μg/ml硫酸腺嘌呤)或YMO培养基[YM7+ade，1％大豆油，0.1％ADEKANOL LG-109(Asahi Denka Kogyo，Tokyo，Japan)]中，然后以130rpm，30℃下反复振荡培养4天或7天。

培养完成后，将等体积的甲醇加入到培养液中，将之混合。再将大约2体积的戊烷加入到该混合液中，剧烈振荡后静置。将得到的相应戊烷层转移到一个干净的玻璃试管中，然后置于通风橱内。戊烷在通风橱内挥发后即可浓缩溶质组分。随后，通过GC/MS鉴定异戊二烯醇，并以十一醇为内部标准定量检测。与此同时，可以将20μl培养液用水稀释30倍后，在600nm测其吸光度，以考查细胞生长的程度。

就GC/MS分析法而言，采用PH6890/5973 GC/MS系统(Hewlett-Packard，Wilmington，DE)。

(4)观察结果

通过表达融合基因获得的最大GGOH产量如表11所列。

表11通过融合基因表达的最大GGOH产量

基因	表达载体	宿主	培养基	温度(℃)	培养时间	GGOH产量(mg/l)
基因	表达载体	宿主	培养基	温度(℃)	培养时间	GGOH产量(mg/l)	435FHDEL	pRS435FHDELpRS445FHDELpRS435FHDELpRS445FHDEL	Sc EUG5Sc EUG5Sc EUG12Sc EUG12	YMYMYMYM	30303030	96969696	0.1710.1060.0900.056
435GGHDEL	pRS445GGHDEL+pRS434GAP-HMG1pRS435GGHDELpRS445GGHDELpRS435GGHDELpRS445GGHDEL	Sc YPH499Sc EUG5Sc EUG5Sc EUG12Sc EUG12	YMYMYMYMYM	3030303030	9696969696	0.2270.1680.3970.7330.825	435FHDEL	pRS435FHDELpRS445FHDELpRS435FHDELpRS445FHDEL	Sc EUG5Sc EUG5Sc EUG12Sc EUG12	YMYMYMYM	30303030	96969696	0.1710.1060.0900.056
435GGHDEL		Sc YPH499Sc EUG5Sc EUG5Sc EUG12Sc EUG12	YMYMYMYMYM	3030303030	9696969696	0.2270.1680.3970.7330.825	435FGG	pRS435FGGpRS445FGGpRS435FGG+pRS434GAP-HMG1pRS445FGG+pRS434GAP-HMG1pRS435FGGpRS445FGGpRS435FGGpRS445FGG	Sc YPH499Sc YPH499Sc YPH499Sc YPH499Sc EUG5Sc EUG5Sc EUG12Sc EUG12	YMYMYMYMYMYMYMYM	3030303030303030	9696969696969696	0.2710.1580.4620.6482.462.174.833.65
435GGF	pR5435GGFpRS435GGFpRS435GGFpRS435GGFpRS435GGF+pRS434GAP-HMG1pRS435GGF+pRS434GAP-HMG1pRS435GGF+pRS434GAP-HMG1pRS435GGF+pRS434GAP-HMG1pRS435GGFpRS435GGFpRS435GGFpRS435GGFpRS445GGFpRS435GGF+pRS434GAP-HMG1pRS435GGF+pRS434GAP-HMG1pRS435GGF+pRS434GAP-HMG1pRS435GGF+pRS434GAP-HMG1pRS445GGF+pRS434GAP-HMG1pRS435GGFpRS435GGFpRS435GGFpRS435GGFpRS445GGFpRS435GGFpRS435GGFpRS435GGFpRS435GGFpRS445GGF	Sc A451Sc A451Sc A451Sc A451Sc A451Sc A451Sc A451Sc A451Sc YPH499Sc YPH499Sc YPH499Sc YPH499Sc YPH499Sc YPH499Sc YPH499Sc YPH499Sc YPH499Sc YPH499Sc EUG5Sc EUG5Sc EUG5Sc EUG5Sc EUG5Sc EUG12Sc EUG12Sc EUG12Sc EUG12Sc EUG12	YMYMYMOYMOYMYMYMOYMOYMYMYMOYMOYMYMYMYMOYMOYMYMYMYMOYMOYMYMYMYMOYMOYM	30303030303030303030303030303030303030303030303030303030	96168981689616896168961689616896961689616896961689616898961689616896	0.3540.2830.4751.000.5460.9280.3621.010.4580.3711.492.920.3172.101.282.465.861.015.207.321.2010.10.8614.671.182.385.023.25	435FGG			YMYMYMYMYMYMYMYM	3030303030303030	9696969696969696	0.2710.1580.4620.6482.462.174.833.65
435GGF				30303030303030303030303030303030303030303030303030303030			435FGGHDEL	pRS435FGGHDELpRS445FGGHDELpRS435FGGHDEL+pRS434GAP-HMG1pRS445FGGHDEL+pRS434GAP-HMG1pRS435FGGHDELpRS445FGGHDELpRS435FGGHDELpRS435FGGHDELpRS445FGGHDEL	Sc YPH499Sc YPH488Sc YPH498Sc YPH499Sc EUG5Sc EUG5Sc EUG12Sc EUG12Sc EUG12	YMYMYMYMYMYMYMYMYM	303030303030303030	9696969696989816896	0.1210.0860.2940.3850.7860.5042.0411.430.521

435GGFHDEL pRS435GGFHDEL Sc A451 YM 30 96 0.072

pRS435GGFHDEL Sc A451 YMO 30 96 0.126

pRS435GGFHDEL+pRS434GAP-HMG1 Sc A451 YM 30 96 0.540

pRS435GGFHDEL+pRS434GAP-HMG1 Sc A451 YM 30 168 0.760

pRS435GGFHDEL+PRS434GAP-HMG1 Sc A451 YMO 30 96 0.414

pRS435GGFHDEL+pRS434GAP-HMG1 Sc A451 YMO 30 168 3.49

pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YM 30 96 0.805

pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YM 30 168 0.541

pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YMO 30 96 1.69

pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YMO 30 168 2.50

pRS435GGFHDEL+pRS434GAP-HMG1 Sc YPH499 YM 30 96 1.90

pRS435GGFHDEL+pRS434GAP-HMG1 Sc YPH499 YM 30 168 2.45

pRS435GGFHDEL+pRS434GAP-HMG1 Sc YPH499 YMO 30 96 2.60

pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YM 30 95 5.78

pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YM 30 168 6.99

pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YMO 30 96 3.97

pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YMO 30 168 10.6

pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YM 30 96 3.00

pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YM 30 168 1.43

pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YMO 30 96 2.33

pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YMO 30 168 5.78

EUG(ERG9p::URA3-GAL1p)

- Sc EUG5 YM 30 96 0.179

- Sc EUG5 YM 30 168 0.230

- Sc EUG5 YMO 30 96 0.232

HMG1Δ pRS434GAP-HMG026 Sc EUG5 YM 30 96 0.093

pRS434GAP-HMG044 Sc EUG5 YM 30 96 0.087

pRS434GAP-HMG056 Sc EUG5 YM 30 96 0.108

pRS434GAP-HMG062 Sc ELG5 YM 30 96 0.132

pRS434GAP-HMG076 Sc EUG5 YM 30 96 0.148

pRS434GAP-HMG081 Sc EUG5 YM 30 96 0.140

pRS434GAP-HMG100 Sc ELG5 YM 30 96 0.184

pRS434GAP-1MG112 Sc EUG5 YM 30 96 0.340

pRS434GAP-HMG122 Sc EUG5 YM 30 96 0.127

pRS434GAP-HMG133 Sc EUG5 YM 30 96 0.714

HMG1 pRS434GAP-HMG1 Sc EUG8 YM 30 96 0.074

BTS1 pRS435GAP-BTS1 Sc EUG8 YM 30 96 1.42

pRS445GAP-BTS1 Sc EUG8 YM 30 96 0.067

- Sc EUG12 YM 30 72 0.081

- Sc EUG12 YM 30 96 0.194

- Sc EUG12 YM 30 168 0.335

HMG1 pRS434GAP-HMG1 Sc EUG12 YM 30 96 0.705

pRS444GAP-HMG1 Sc EUG12 YM 30 96 2.05

ERG20 pRS435GAP-ERG20 Sc EUG12 YM 30 72 6.63

pRS435GAP-ERG20 Sc EUG12 YM 30 96 0.260

pRS445GAP-ERG20 Sc EUG12 YM 30 96 0.381

BTS1 pRS435GAP-BTS1 Sc EUG12 YM 30 96 1.75

pRS445GAP-BTS1 Sc EUG12 YM 30 96 3.70

HMG1Δ pRS434GAP-HMG026 Sc EUG12 YM 30 96 0.629

pRS434GAP-HMG044 Sc EUG12 YM 30 96 0.428

pRS434GAP-HMG056 Sc EUG12 YM 30 96 0.402

pRS434GAP-HMG062 Sc EUG12 YM 30 96 0.445

pRS434GAP-HMG076 Sc EUG12 YM 30 96 0.479

pRS434GAP-HMG081 Sc EUG12 YM 30 96 0.488

pRS434GAP-HMG100 Sc EUG12 YM 30 96 0.440

pRS434GAP-HMG112 Sc EUG12 YM 30 96 0.534

pRS434GAP-HMG122 Sc EUG12 YM 30 96 0.499

pRS434GAP-HMG133 Sc EUG12 YM 30 96 0.440

- Sc EUG27 YM 30 96 0.063

HMG1 pRS434GAP-HMG1 Sc EUG27 YM 30 96 0.723

pRS444GAP-HMG1 Sc EUG27 YM 30 96 0.205

ERG20 pRS435GAP-ERG20 Sc EUG27 YM 30 96 0.661

pRS445GAP-ERG20 Sc EUG27 YM 30 96 0.297

BTS1 pRS435GAP-BTS1 Sc EUG27 YM 30 96 0.761

pRS445GAP-BTS1 Sc EUG27 YM 30 96 0.595

(4-2)在A451中ERG20和BTS1

在A451中表达融合基因而引起的异戊二烯醇产量的变化如图25所示。在图25中，“435GGF”代表pRS435GGF，“435GGFHDEL”代表pRS435GGFHDEL(在以下的图中，这些术语具有相同的意义)。OD₆₀₀表示在600nm处的吸光度。图25也显示了当整合了非融合BTS1的表达载体被导入A451(435GG)中时的结果。

甚至导入pRS445GAP-BTS1(在该图中表示为“445GG/A451”)时，都能检测到平均0.44mg/L的GGOH产量。

(4-3)在YPH499中ERG20和BTS1的表达

在YPH499中表达融合基因所引起的异戊二烯醇产量的变化如图26所示。在图26中，“499”代表YPH499；“435GGF”代表pRS435GGF；“445GGFHDEL”代表pRS445GGFHDEL(在以下的图中，这些术语具有相同的意义)。图26也显示了当整合了非融合BTS1的表达载体被导入YPH499中时的结果。

当导入的是pRS435GAP-BTS1(该图中表示为“435GG/499”)时，能检测到平均0.11mg/L的GGOH产量。当导入的是整合有ERG20-BTS1融合基因的pRS435FGG(该图中表示为“435FGG/499”)时，能检测到平均0.20mg/L的GGOH产量。当导入的是pRS435GGF(该图中表示为“435GGF/499”)时，能检测到平均0.39mg/L的GGOH产量。当导入的是pRS35GGFHDEL(该图中表示为“435GGFHDEL/499”)时，能检测到平均0.62mg/L的GGOH产量。这就验证：融合基因和HDEL序列对改进GGOH产率是有效的。

(4-4)在YPH499中HMG1、ERG20和BTS1的表达

本发明者认为，通过在克隆pRS434GAP-HMG1/YPH499(YH1)和pRS434TEF-HMG1/YPH499中共表达HMG1和其它基因，是有可能从而获得具有更高GGOH产率的克隆的。克隆pRS434GAP-HMG1/YPH499(YH1)和pRS434TEF-HMG1/YPH499是通过导入一个HMG1表达载体到YPH499中而获得的。

图27显示的是：当把一个非融合EPG20或BTS1整合的表达载体进一步导入宿主克隆时，异戊二烯醇的产量，该宿主克隆是通过将pRS434TEF-HMG1导入到YPH499中而获得的。图27中，“434TEFp-HMG1”表示导入pRS434TEF-HMG1的克隆。TEFp是TEF2基因的转录启动子。“499”表示YPH499。“435F”表示pRS435F，“445F”表示pRS445F。(这些术语在下面的其它图中也具有相同的意义)当单独把BTS1导入YPH499中时，GGOH产量仅为0.11mg/L。另一方面，当把BTS1表达载体导入TEF2p-HMG1-转化的克隆中时，GGOH产量平均为0.40mg/L(见图27中的“435GG&434TEFp-HMG1/499”)；当把BTS1表达载体导入GAPp-HMG1-转化的克隆中时，产出GGOH为0.49mg/L(见图27中的“435GG&434GAPp-HMG1/499”)。这就显示出通过HMG辅酶A还原酶基因和一个异戊二烯基二磷酸合酶基因的共表达，构建一个大量制备异戊二烯醇体系的可能性。

随后，以GAPp-HMG1转化的YH1(pRS434GAP-HMG1/YPH499)为宿主，本发明制备的ERG20-BTS1融合基因或含HDEL信号的基因与TDH3转录启动子GAPp(TDH3p)一起在该宿主中得以表达。测定所得克隆的异戊二烯醇的产量。

结果如图28所示。图28中，“434GAPp-HMG1”表示导入pRS434GAP-HMG1的克隆。GAPp是TDH3基因的转录启动子。当一个连接有HDEL信号的异戊二烯基二磷酸合酶基因和HMG1共表达时，GGOH产率可以提高。通过导入ERG20-BTS1融合基因可以进一步提高产率。尤其是pRS435GGF转化克隆与pRS435GGFHDEL转化克隆表现出显著的提高。它们分别平均产出1.55mg/L和1.50mg/L的GGOH。(见图28中“435GGF & 434GAPp-HMG1/499”和“435GGFHEDL &434GAPp-HMG1/499”)

(4-5)在含大豆油的培养基中的异戊二烯醇产量

ERG20-BTS1融合基因转化的克隆，即本发明构建的产GGOH重组体，在YM7(YM，pH7)培养基和YMO(YM7，0.1％ADEKANOL LG109，1％大豆油)培养基中各培养4-7天，继而测定异戊二烯醇产量。以A451衍生的克隆为宿主得到的结果如图29A和29B所示。以YPH499衍生的克隆为宿主得到的结果如图30A和30B所示。在图29A和29B中，“AH1”代表pRS434GAPp-HMG1/451，“GGFHDEL”代表pRS435GGFHDEL。“-1”代表培养4天后的产量，“-2”代表培养7天后的产量。由于细胞悬浮在YMO培养基中的大豆油里，细胞量以细胞的个数表示。“10³细胞/μl”意指每微升的细胞个数除以1000。

在YM7培养基中培养7天的pRS435GGF/A451平均产出0.26mg/L的GGOH(图29A；上图；GGF/A451-2)，在YMO培养基中产量增加到平均0.98mg/L的GGOH(图29B；上图；GGF/A451-2)。同样，当以AH1(pRS434GAP-HMG1转化的A451)为宿主时，pRS435GGFHDEL转化的重组体平均产出2.5mg/L的GGOH(图29B；中图；GGFHDEL/AH1-2)，在YMO培养基中最多产出3.5mg/L的GGOH(表11；见基因名称“435GGFHDEL”下面一行)。甚至当以EUG5为宿主时，该宿主的获得是通过将A451的ERG9转录启动子替换为GAL1启动子(见实施例6)，pRS435GGF转化的重组体在YMO培养基中也能产出更多的GGOH。当在YM7培养基中培养7天该重组体，可以平均产出6.6mg/L的GGOH(图29A；下图；GGF-EUG5-2)，而在YMO培养基中培养7天该重组体，GGOH产量可增加到平均9.6mg/L(图29B；下图；GGF/EUG5-2)。

当以YPH499衍生的克隆为宿主时，也可观测到YMO培养基的使用对GGOH产率的促进作用(图30A和30B)。在YM7培养基培养7天的pRS435GGF转化的YPH499可以产出平均0.19mg/L的GGOH(图30A；上图；GGF/YPH499-2)，而在YMO培养基中培养7天可以产出平均2.5mg/L的GGOH(图30B；上图；GGF/YPH499-2)。进一步地，将pRS435GGF或pRS435GGFHDEL导入共表达HMG1的YH1中，并在YMO培养基中培养7天后，两种重组体均产出平均5.6mg/L的GGOH(图30B；中图；GGF/YH1-2和GGFHDEL/YH1-2)。当以EUG12为宿主时，该宿主构建自YPH499，且构建方式与构建EUG5的方式相同(见实施例6)，pRS435GGF转化的重组体或pRS435GGFHDEL转化的重组体产出大约3.7-4.0mg/L的GGOH。因此建议：可用HMG1和一个异戊二烯基二磷酸合酶基因的组合提高YPH499衍生的克隆的GGOH产率。

[实施例11]培养基中不同葡萄糖-半乳糖组分对异戊二烯醇制备的作用

(1)载体导入宿主及宿主的培养

该实施例中，检测了在芽殖酵母中异戊二烯醇的产出如何随着不同葡萄糖-半乳糖(Glc-Gal)组成比例变化。另外，也检测了BTS1-ERG20融合基因的表达对异戊二烯醇制备的作用。

采用购自Zymo Research(Orange，CA)的Frozen EZ酵母转化II型试剂盒将载体导入酵母宿主。就用于BTS1-ERG20融合基因的表达载体而言，采用pRS435GGF和pRS435GGFHDEL。就宿主而言，可用A451、YPH499、AH1、EUG5和EUG12。将每一种得到的转化体分别培养在以适当的营养缺陷体为指示因子的基于SGR的选择性培养基的琼脂平板上。为克隆，进行2次在选择性培养基琼脂平板上的培养。

将制备的转化体预培养在SGR选择性培养基上。然后，把0.01-0.05ml的预培养液加入到1-5ml的YM7培养基中，在18mm直径的试管中，30℃、130rpm反复振荡培养。预先制备五种有下列糖组分(Glc-Gal组成比例)的YM7培养基：0％Glc-100％Gal；20％Glc-80％Gal；50％Glc-50％Gal；75％Glc-25％Gal；和100％Glc-0％Gal。首先，在这些培养基中30℃、130rpm反复振荡培养细胞。培养两天后，向每种培养基中进一步加入Glc，以达到5％的终浓度(w/v)。继续培养细胞到第七天。

(2)结果

(2-1)通过A451制备GGOH

当pRS435GGF和pRS435GGFHDEL被分别导入A451时的GGOH产量如图31A-31C所示。在两种情况中，检测出很少的GGOH。典型地，当初始葡萄糖比例为20％时，培养4天的pRS435GGFHDEL/A451显示出最高的GGOH产量(平均为0.56mg/L)。

(2-2)通过AH1制备GGOH

当pRS435GGF和pRS435GGFHDEL被分别导入AH1时的GGOH产量如图33A-32C所示。当初始葡萄糖比例为20％时，培养2-4天的BTS1-ERG20融合基因转化的AH1克隆也显示出最高的GGOH产量(3.32mg/L)。当初始葡萄糖比例为50-80％时，培养7天的这些克隆显示出最高的GGOH产量(平均4.13mg/L)。

(2-3)通过EUG5制备GGOH

当pRS435GGF和pRS435GGFHDEL被分别导入EUG5时的GGOH产量如图33A-33C所示。当初始葡萄糖比例为20-80％时，培养2-4天的pRS435GGF转化克隆和pRS435GGFHDEL转化克隆中获得了好的结果。

(2-4)通过YPH499制备GGOH

当pRS435GGF和pRS435GGFHDEL被分别导入YPH499时的GGOH产量如图34A-34C所示。同通过A451制备GGOH的情况一样，检测出很少的GGOH。

(2-5)通过YH1制备GGOH

当pRS435GGF和pRS435GGFHDEL被分别导入YH1时的GGOH产量如图35A-35C所示。当初始葡萄糖比例为100％时，培养7天的重组体克隆获得了高的GGOH产量。

(2-6)通过EUG12制备

当pRS435GGF和pRS435GGFHDEL被分别导入EUG12时的GGOH产量如图36A-36C所示。当初始葡萄糖比例为20％时，两种重组体克隆都显示出高的异戊二烯醇产率。当pRS435GGF/EUG12在初始葡萄糖比例为20％时培养4天，尽管细胞量相当于OD₆₀₀＝1.1，该克隆仍产出7.6mg/L的FOH及5.4mg/L的GGOH。考虑到细胞平均产量，这些制备结果被认为是非常有效。

[实施例12]pRS435GGF/YH1和15-2的发酵罐培养

(1)pRS435GGF/YH1

为大量制备GGOH，将可以优先产出5.6mg/LGGOH(见实施例10)的pRS435GGF/YH1克隆按下文描述的条件在发酵罐中培养。

<发酵罐培养基>

5％葡萄糖(YM本身含1％葡萄糖。因此，葡萄糖的终浓度为6％)

YM肉汤(Difco)

3％大豆油(Nacalai Tesque)

0.1％ADEKANOL LG109(Asahi Denka)

<操作条件>

培养设备：MSJ-U 10L培养设备(B.E.Marubishi)

培养基体积：5L

培养温度：33℃

通气速率：1vvm

搅拌速率：300rpm

pH：用4N的氢氧化钠溶液和2N的盐酸溶液按下列参数适当地控制：

比例区 1.00

不敏感区 0.15

控制周期 16秒

全冲程 1秒

最小冲程 0秒

结果是，培养RS435GGF/YH1克隆115小时产出128mg/L的GGOH。与此同时，鲨烯(SQ)、FOH和橙花叔醇(NOH)的产量分别为15mg/L、5mg/L和几乎为0。因此，发明者成功构建了一个通过发酵大量单独制备GGOH的体系(图37)。

(2)15-2克隆

将实施例7中描述的15-2克隆(保留pYHMG044的AURGG101)从斜面接种到GSM-URA(BIO101)+DOB(BI0101)培养基(200ml，置于一个配有一个阀门的500ml三颈瓶)，并于30℃、130rpm培养2天。随后，重复3次离心(1500rpm，5分钟，4℃)和用灭菌的生理盐水洗涤的操作，以完全将培养液中所含的葡萄糖除去。接着，与上文(1)中培养pRS435GGF/YH1所用的条件相同，在发酵罐中培养50ml的该预培养液。然而，采用的培养基如下所示，培养温度为26℃。

<发酵罐培养基>

5％半乳糖(YM含1％葡萄糖。因此，糖的终浓度为6％)

无氨基酸YMB(Difco)

1％大豆油(Nacalai Tesque)

0.1％ADEKANOL LG109(Asahi Denka)

结果是，培养150小时的15-2克隆可以产出3mg/L的GGOH。(图38)

[实施例13]融合基因的表达

为了验证pRS435GGF转化的细胞和pRS435GGFHDEL转化的细胞是否表达各自的融合基因产物，需要通过RNA印迹杂交和蛋白质印迹杂交分析转录产物和翻译产物。

(1)RNA印迹杂交

图39显示的是：对YPH499衍生重组体和YH1衍生重组体的转录产物进行RNA印迹杂交分析的结果，YPH499衍生重组体中独立导入了pRS435GGF和pRS435GGFHDEL，YH1衍生重组体中独立导入了pRS435GGF和pRS435GGFHDEL。就探针而言，采用的是位于编码α微管蛋白的TUB1基因编码区的一个DNA片段和ERG20探针，BTS1探针和HMG1探针，后三种探针列于实施例7的表7中。TUB1探针的制备方式与实施例7描述的方式相同，即采用下文介绍的寡聚核苷酸TUB1f-2和TUB1r-2。RNA的制备及RNA印迹杂交以实施例7描述的方式进行。

TUB1f-2：5’-ACG GTA AGA AAT CCA AGC-3’(SEQ ID NO：119)

TUB1r-2：5’-TAT GAG TCG GCA CCC ACT-3’(SEQ ID NO：120)

图39中，“-”指来自那些没有导入含异戊二烯基二磷酸合酶基因质粒的细胞的RNA样品；“GGF”指来自pRS435GGF转化重组体的RNA样品；“HDEL”指来自pRS435GGFHDEL转化重组体的RNA样品；“HMG1”指来自YH1衍生的重组体的RNA样品。从采用探针TUB1(微管蛋白α基因)获得的结果看，可以认定从每一份制备样本中得到了几乎等量的信使RNA。当采用探针ERG20和探针BTS1时，检测出一个过表达、共有的长度为3.1kbp的条带，这说明融合基因被有效转录了。采用探针ERG20检测出长度为1.8kb的条带被认为是基因组中的野生型ERG20基因的转录产物。采用探针HMG1获得的结果显示：在所有预先导入pRS434GAP-HMG1的克隆(即YH1衍生的克隆；图39中标有“HMG1”的泳道中都大量检测出长度为4.1kbp的RNA(质粒来源HMG1的转录产物)。这说明即使异戊二烯基二磷酸合酶表达质粒被作为第二质粒进一步导入，HMG1的转录仍有效地进行。

(2)蛋白质印迹杂交

根据被ERG20和BTS1编码多肽的C端序列，化学合成具有下述氨基酸序列的多肽。以这些多肽为抗原，通过传统方法(描述在常见的实验手册如：F.M.Ausubel et al.Eds，Short Protocols inMolocular Biology，4th Edition，(1999)John Wiley & Sons，Inc.，New York)制备鼠抗体。将下列肽各2mg交联到KLH(KeyholeLimpet Hemocyanin)，并用作抗原。

BTS1-C：NH2 Cys Tyr Ile Ile Asp His Leu Ser Glu Leu COOH(SEQ ID NO：121)

ERG20-C：NH2 Cys Leu Asn Lys Val Tyr Lys Arg Ser Lys COOH(SEQ ID NO：

122)

从6种菌株/克隆：YPH499、pRS435F/YPH499、pRS435GGF/YPH499、pRS435FGG/YPH499、pRS435GGFHDEL/YPH499和pRS435GGF/YH1中制备蛋白质的方法如下，由蛋白质印迹分析制备的蛋白质。简言之，将每种菌株/克隆的预培养液(检测600nm处的吸光度，并且每种培养掖需经生理盐水稀释以获得等量的细胞)接种至一种选择性培养基[对YPH499而言，采用SD培养基DOB(dropout base：碳源为葡萄糖的基本培养基)，其中加入了可作为氨基酸或核酸组分的CSM(完全的补充混合物)；对pRS435F/YPH499而言，采用SD-L培养基(缺少亮氨酸的SD培养基)；对pRS435GGF/YPH499而言，采用SD-L培养基；对pRS435GG/YPH499而言，采用SD-L培养基；对pRS435GGFHDEL/YPH499而言，采用SD-L培养基；对pRS435GGF/YH1而言，采用SD-LW培养基(缺少亮氨酸和色氨酸的SD培养基)]，并在30℃、130rpm振荡培养4天。离心收获细胞后，每1g细胞加入2ml的Y-PER(PIERCE，Rockford，IL)，并于室温下剧烈摇动1小时以制备总蛋白溶液。20μg得到的总蛋白通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE；操作步骤见Short Protocols in Molecular Biology，4th Edition，(1999)John Wiley & Sons，Inc.，New York)以分子量为基础分离开，再通过蛋白质印迹(见Short Protocols inMolecular Biology，4th Edition，(1999)John Wiley & Sons，Inc.，New York)检测导入得到的重组体的基因的表达情况。本节用到的蛋白质印迹技术在下列几点有部分改动。

1)用第一抗体处理PVDF膜的条件

常规步骤中，在TBST中的第一抗体的10-1000倍稀释液中振荡PVDF膜30-60分钟。

改动步骤中，在TBST中的上文提到的抗肽的2000倍稀释液中振荡PVDF膜60分钟。

2)PVDF膜的洗涤条件

常规步骤中，用200mlTBST溶液洗涤膜4次，每次15分钟。

改动步骤中，用80ml的TBST溶液洗涤膜5次，每次5分钟。

3)用第二抗体对PVDF膜的处理

常规步骤中，用封闭液将抗IgG(H+L)碱性磷酸酶结合物稀释200-2000倍，然后将PVDF膜浸泡其中并振荡30-60分钟。

改动步骤中，将PVDF膜浸泡在TBST中的抗IgG(H+L)碱性磷酸酶结合物4000倍稀释液中，并振荡30分钟。

4)检测抗原蛋白质条带的方法

常规步骤中，用TBST和TBS洗涤的PVDF膜浸泡在BCIP(4-溴-4-氯-3-吲哚氧基-磷酸盐)/NBT(氮蓝四唑)混合物中30分钟，以上色。

改动步骤中，用TBST和TBS洗涤的PVDF膜浸泡在含有稳定的底物小鼠溶液(Promega，Madison，WI)的ProtoBlot II AP System中20-40秒以上色。

蛋白质印迹分析结果如图40所示。在图40中，“M”代表分子标记泳道。“F”、“GGF”、“GGFHDEL”和“GGF/YH1”代表分别来自pRS435F/YPH499、pRS435GGF/YPH499、pRS435FGG/YPH499、pRS435GGFHDEL/YPH499和pRS435GGF/YH1的蛋白质电泳后的泳道。

当采用可检测被BTS1编码多肽的抗BTS1-C小鼠抗体时，可检测出相当于大约79kDa融合蛋白(分别为GGF、FGG和GGFHDEL)的多肽(见图40，空心三角标记表示迁移率的条带)。从这些结果中，发现来源自ERG20-BTS1融合基因的FPP合酶-GGPP合酶融合蛋白实际上在pRS435GGF转化重组体和pRS435GGFHDEL转化重组体中被表达。同样，预期由于在来自YPH499的蛋白质中没有检测出条带，在非重组细胞中被BTS1基因编码的GGPP合酶几乎没有表达。

当采用可检测被ERG20编码多肽的抗ERG20-C小鼠抗体时，结果显示分子量(大约40kDa)相当于被ERG20编码的FPP合酶的蛋白质的表达水平在pRS435F转化克隆中有提高(泳道“F”)(实心三角标记表示迁移率的条带)。在pRS435GGF转化克隆(泳道“GGF”)和pRS435GGFHDEL转化克隆(泳道“GGFHDEL”)中，检测出了相当于融合蛋白(GGF和GGFHDEL)的多肽(显示了对应于79kDa迁移率的条带，以空心三角标记)。用抗ERG20-C抗体没有检测出应该在pRS435FGG转化克隆中表达的融合基因。相信这种情况的发生是因为在融合酶中GGPP合酶被融合到的FPP合酶C端，使得可以识别FPP合酶的C端部分的抗ERG20-C抗体不能很好地识别融合酶。在采用抗ERG20-C抗体检测出的其它条带中，一个大约45kDa的条带被认为是一个非特异性检测的蛋白质。小于40kDa的条带被认为是非特异性检测的蛋白质或是含有被ERG20基因编码氨基酸序列的蛋白质的降解产物。

[实施例14]当HMG辅酶A还原酶基因和GGF融合基因共表达时制备GGOH

为了确定增强HMG辅酶A还原酶基因和编码GGPP合酶-FPP合酶融合蛋白的BTS1-ERG20融合基因的表达是否也有可能从除YPH499以外的菌株(ATCC76625、MATa ura 3-52 lys2-801 ade2-101 trp1Δ63his3Δ200 leu2Δ1)中获得有利于工业生产GGOH的克隆，采用pRS434GAP-HMG1、pRS435GGF和pRS435GGFHDEL转化下列菌株。

INVSc1(MATa/MATa ura3-52/ura3-52 trp1-289/trp1-289 his3Δ1/his3Δ1 leu2/leu2)

YPH500(ATCC76626，MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1)

YPH501(ATCC76627，MATa/MATa ura3-52/ura3-52 lys2-801/lys2-801 ade2-101/

ade2-101 trp1Δ63/trp1-Δ63 his3Δ200/his3Δ200 leu2Δ1/leu2Δ1)

W303-1A(ATCC208352，MATa leu2-3 leu2-112 his3-11 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100)

W303-1B(ATCC208353，MATa leu2-3 leu2-112 his3-11 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100)

简言之，将pRS434GAP-HMG1导入INVSc1、YPH500、YPH501、W303-1A和W303-1B，从而分别获得IH1、YH2、YH3、WH1和WH2。以这些重组体为宿主，再导入pRS435GGF，获得GGF/IH1、GGF/YH2、GGF/YH3、GGF/WH1和GGF/WH2。同样，导入pRS435GGFHDEL到这些宿主内，可获得HDEL/IH1、HDEL/YH2、HDEL/YH3、HDEL/WH1和HDEL/WH2。在YPHO7富集培养基里培养这些重组体，继而测定异戊二烯醇的产率。结果如图41所示。每种重组体都优先产出GGOH，并且它们中的大部分都可产出100mg/L或更多的GGOH。尤其是HDEL/YH2克隆可最多产出189mg/L的GGOH。

[实施例15]当共表达HMG-Co还原酶基因和GGF融合基因的克隆被转化成原养型并二倍体化后GGOH的制备

通过用相应的野生型基因替换导致营养缺陷体的突变基因，使产GGOH克隆GGF/YH1被转化为原养型微生物(一种无需在培养基中补充特定营养物质也可以生长的菌株)，再通过与一个YPH500衍生的克隆杂交进行二倍体化，从而获得GGF/YH3-AHKU克隆。制备步骤描述如下。

(1)导入HIS3和ADE2到GGF/YH1及导入LYS2和URA3到YPH500

以用PvuII和XhoI消化的pRS403GAP为模板，以寡聚核苷酸HIS3-L(5’TTT TAA GAG CTT GGT GAG CGC 3’(SEQ ID NO：123))和HIS3-R(5’TCG AGT TCA AGA GAA AAA AAA 3’(SEQ ID NO：124))为引物DNA，按如下条件PCR制备一个HIS3片段。

0.1μg/L模板DNA 1μL

100pmol引物DNA1 1μL

100pmol引物DNA2 1μL

10×Pyrobest缓冲液 10μL

2mM dNTPmix 8μL

5u/μLPyrobest DNA聚合酶 0.5μL

H₂O 78.5μL

采用相同的方式，即以经PvuII和XhoI消化的pRS406GAP为模板，以寡聚核苷酸URA3-L(5’TTC AAT TCA TCA TTT TTT TTT 3’(SEQID NO：125))和URA3-R(5’GGG TAA TAA CTG ATA TAA TTA 3’(SEQID NO：126))为模板DNA，制备URA3片段。

A451染色体DNA为模板，以ADE-1(5’ATG GAT TCT AGA ACAGTT GGT 3’(SEQ ID NO：127))和ADE-2(5’TTA CTT GTT TTC TAGATA AGC 3’(SEQ ID NO：128))或LYS-1(5’ATG ACT AAC GAA AAGGTC TGG 3’(SEQ ID NO：129))和LYS-2(5’TTA AGC TGC TGC GGAGCT TCC 3’(SEQ ID NO：130))为引物DNA，在相同的反应条件下制备ADE2片段和LYS2片段。将得到的HIS3片段和ADE2片段相继导入pRS435GGF/YH1，从而获得pRS435GGF/YH1-AH，它表现出无组氨酸需求和无腺嘌呤需求的表型。另一方面，将LYS2片段和URA3片段相继导入YPH500，从而获得YPHS00-KU，该重组体表现出无赖氨酸需求和无尿嘧啶需求的表型。

(2)杂交

在YM培养基中30℃培养pRS435GGF/YH1-AH和YPH500-KU，并在DOB(dropout base)琼脂平板培养基上划线，使得两种克隆彼此交错。然后，在30℃下培养细胞3天。挑出出现在平板上的菌落，并将之培养在前孢子形成平板培养基上(含1.6g酵母提取物、0.6g聚蛋白胨、100ml 20％葡萄糖和4g/L琼脂)，继而在孢子形成平板培养基上(含2g乙酸钾、0.2g酵母提取物、500μl 20％葡萄糖和4g/L琼脂)培养。通过显微镜观察证实有孢子形成。因为可以在DOB平板(一种基本培养基)上生长，可以证实该克隆已转化为原养型，并且因为可以在孢子形成培养基上形成孢子，也证实该克隆已二倍体化。该克隆被命名为GGF/YH3-AHKU。

[实施例16]通过补料-分批培养制备GGOH(1)

在下述条件下对GGF/YH3-AHKU进行补料-分批培养，并测定GGOH产量。

(1)种子前培养

培养基组分如下：酵母提取物5g/L、麦芽提取物5g/L、Bacto蛋白胨10g/L、葡萄糖5g/L。

该培养基的pH未调节。将50ml该培养基置于一个500mlSakaguchi烧瓶中，并于120℃下灭菌20分钟。从斜面刮下一满接种环的GGF/YH3-AHKU，于120rpm、30℃下反复振荡培养24小时。OD(于562nm处测26倍的稀释液)达到0.4。

(2)种子培养

培养基组分如下：葡萄糖20g/L、MAMENO(Ajinomoto Co.，Inc.)310mg/L(以总氮量计算)、KH₂PO₄3g/L、MgSO₄0.5g/L、硫酸铵5g/L、CaCl₂0.5g/L、和消泡剂0.1ml/L。如果MAMENO的总氮浓度为63g/L，则加入到培养基中的MAMENO的量为4.9ml/L。

完全各种溶解培养基组分后，用KOH溶液将每一组分的pH值调节到5.0。调整液体体积后，将每一组分在120℃下灭菌20分钟。

种子培养采用1升的小型发酵罐。将300ml的培养基置于发酵罐内，再接种0.06-1ml的种子前培养物。接种前，将培养基的pH调节到5.5。通气率为1/2vvm，温度设置为30℃。用氨水控制pH为5.5。搅拌，开始时为500rpm，然后设置为级联控制，使得溶解氧(DO)＞20％。在pH值上升的时间点终止种子培养。OD(562nm处测51倍稀释液)达到0.18-0.2。上述的溶解氧量是以饱和量为100％进行计算。

(3)主培养

培养基组成如下表12所示。区块A、区块B、区块C和区块D的液体体积与主培养物总体积的比分别为20％、20％、30％和20％。用硫酸处理玉米漫渍液(CSL)，使其pH值调整为2.0，然后在80℃预灭菌1小时。列于表12中的CSL浓度是根据总氮量表示的。加入了31.4g/L的CSL本身才达到该浓度。将每一区块在120℃下灭菌20分钟后，混合在一起。调整液体体积后，将混合液置于容器中。

表12

组分浓度区块
组分浓度区块	葡萄糖 2g/l 区块A
MgSO₄ 1.7g/l 区块B硫酸铵 3g/lKH₂PO₄ 10g/l	葡萄糖 2g/l 区块A
MgSO₄ 1.7g/l 区块B硫酸铵 3g/lKH₂PO₄ 10g/l	CSL 2.3g/l 区块C消泡剂 0.26g/lH₂SO₄ pH＝2.0预灭菌 80℃×60分钟
CaCl₂ 0.7g/l 区块D	CSL 2.3g/l 区块C消泡剂 0.26g/lH₂SO₄ pH＝2.0预灭菌 80℃×60分钟

主培养采用1升的小型发酵罐。将10％种子培养液加入到上面的混合液后，罐内主培养总体积为300ml。由于灭菌后培养基的pH值在2.6左右，在接种前需要提高。通气速率为1/2vvm，温度设置为30℃。用氨水控制pH为5.5。搅拌，开始时为500rpm，然后设置为级联控制，使得溶解氧(DO)＞20％。葡萄糖的补料开始于培养2小时后，以流速逐渐增加的方式进行，如图42所示。最大流速为3.5ml/小时，这相当于大约5.8g葡萄糖/L/小时。当通过搅拌难以保证足够的溶解氧(DO＞20％)时，就增加通气体积。大约培养20小时后，补充预先确定量的补料液。与此同时，OD(562nm处测101倍的稀释液)达到0.9-1.0。

其后，根据培养条件改变补料和其它参数。

(1)培养条件的检验

在相同条件下培养细胞20小时后，检测葡萄糖和乙醇对GGOH生产的影响。

简言之，将400g/L的乙醇溶液(区块1)和500g/L的葡萄糖溶液(区块2)补料到培养液中。进一步将区块1中的乙醇溶液和区块2中的葡萄糖溶液1∶1混合以制备区块3。补料液的流速最大设置为3.5ml/小时，并且需控制得使培养液中的底物浓度为1.0g/L或更低。累积GGOH量如表13所示。发现通过补料可作为碳源的乙醇，增加了GGOH的累积量。

表13

	GGOH累积量(g/l)
	GGOH累积量(g/l)	区块1	1.16
区块2	0.47	区块1	1.16
区块2	0.47	区块3	0.58

[实施例17]通过补料-分批培养制备GGOH(2)

将GGF/YH3-AHKU克隆接种至200ml的DOB(dropout base)葡萄糖基本培养基(Q BIOgene，Carlsbad，CA)，在30℃下旋转培养3天。随后，将得到的培养液全部接种至3.35L的含0.09％葡萄糖、0.075％KH₂PO₄、0.14％硫酸镁、0.45％硫酸铵、5.4％玉米浸渍液、0.031％氯化钙和0.15％ADEKANOL LG109(Asahi Denka)的培养基(用氨水预调为pH5.5)，并在下述条件下培养。采用罐1、罐2和罐3进行分批培养。

培养设备：MSJ-U2W(10L发酵罐)(B.E.Marubishi，Chiyoda-ku，Tokyo)

培养温度：33℃

通气速率：0.74vvm

搅拌速率：900rpm

pH5.5(用4N的氢氧化钠溶液和2N的盐酸溶液调节)

培养4小时后，开始补充40％的葡萄糖溶液。培养21小时后，将罐2的补料液改变为40％葡萄糖+3.3％乙酸铵溶液；罐3的补料液改变为1.65％乙酸铵+50％乙醇+20％葡萄糖溶液。然后，进一步培养细胞。以实施例8中所述方式将无菌操作取出的培养液样品进行异戊二烯醇的分析和定量检测。为保持培养基中糖浓度为0.1％或低于0.1％，需调整补料速率(最大为18.7g/h)。

结果显示该方法使FOH的产生最小化，并可通过微生物有效制备GGOH(表14)。通过补充除葡萄糖以及乙醇和乙酸铵，使培养基中的GGOH浓度达到2.5g/L。

表14

罐1(补料溶液：40％葡萄糖)

培养时间(小时)	0	21	45	69	93	117	165
培养时间(小时)	0	21	45	69	93	117	165	FOH(mg/L)	0.0	2.0	1.0	8.0	19	24	23
GGOH(mg/L)	0.0	27	35	190	660	840	890	FOH(mg/L)	0.0	2.0	1.0	8.0	19	24	23
GGOH(mg/L)	0.0	27	35	190	660	840	890	OD600	0.0	52	86	93	120	120	110

罐2 (补料溶液：40％葡萄糖、3.3％乙酸铵)

培养时间(小时)	0	21	45	69	93	117	165
培养时间(小时)	0	21	45	69	93	117	165	FOH(mg/L)	0.0	1.0	1.0	1.0	0.3	0.8	5.0
GGOH(mg/L)	0.0	26	56	120	37	100	710	FOH(mg/L)	0.0	1.0	1.0	1.0	0.3	0.8	5.0
GGOH(mg/L)	0.0	26	56	120	37	100	710	OD600	0.0	49	91	120	120	120	170

罐3(补料溶液：20％葡萄糖、1.65％乙酸铵、50％乙醇)

培养时间(小时)	0	21	45	69	93	117	165
培养时间(小时)	0	21	45	69	93	117	165	FOH(mg/L)	0.0	2.0	4.0	17	33	38	77
GGOH(mg/L)	0.0	30	210	550	830	1000	2500	FOH(mg/L)	0.0	2.0	4.0	17	33	38	77
GGOH(mg/L)	0.0	30	210	550	830	1000	2500	OD600	0.0	63	160	160	120	140	120

此处引述的所有出版物、专利和专利申请在此引用作为参考。

工业实用性

本发明提供了制备异戊二醇烯醇的方法。既然有可能根据本发明提供的方法大量获得异戊二烯醇(尤其是香叶基香叶醇)的，因此可以用于生产生物体内重要的物质，及用作试剂，以发现活性异戊二烯醇新的生理学活性。这样，本发明的方法就具有应用价值。

序列表文本

SEQ ID NO：24：合成肽

SEQ ID NOS：25-120：合成DNA

SEQ ID NO：121：合成肽

SEQ ID NO：122：合成肽

SEQ ID NOS：123-130：合成DNA

序列表<110>丰田自动车株式会社<120>异戊二烯醇的制备方法<130>PH-1413-PCT<150>JP2000-403067<151>2000-12-28<160>130<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1059<212>DNA<213>啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220><221>CDS<222>(1)..(1056)<400>1atg gct tca gaa aaa gaa att agg aga gag aga ttc ttg aac gtt ttc 48Met Ala Ser Glu Lys Glu Ile Arg Arg Glu Arg Phe Leu Asn Val Phe1 5 10 15cct aaa tta gta gag gaa ttg aac gca tcg ctt ttg gct tac ggt atg 96Pro Lys Leu Val Glu Glu Leu Asn Ala Ser Leu Leu Ala Tyr Gly Met

20 25 30cct aag gaa gca tgt gac tgg tat gcc cac tca ttg aac tac aac act 144Pro Lys Glu Ala Cys Asp Trp Tyr Ala His Ser Leu Asn Tyr Asn Thr

35 40 45cca ggc ggt aag cta aat aga ggt ttg tcc gtt gtg gac acg tat gct 192Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Thr Tyr Ala

50 55 60att ctc tcc aac aag acc gtt gaa caa ttg ggg caa gaa gaa tac gaa 240Ile Leu Ser Asn Lys Thr Val Glu Gln Leu Gly Gln Glu Glu Tyr Glu65 70 75 80aag gtt gcc att cta ggt tgg tgc att gag ttg ttg cag gct tac ttc 288Lys Val Ala Ile Leu Gly Trp Cys Ile Glu Leu Leu Gln Ala Tyr Phe

85 90 95ttg gtc gcc gat gat atg atg gac aag tcc att acc aga aga ggc caa 336Leu Val Ala Asp Asp Met Met Asp Lys Ser Ile Thr Arg Arg Gly Gln

100 105 110cca tgt tgg tac aag gtt cct gaa gtt ggg gaa att gcc atc aat gac 384Pro Cys Trp Tyr Lys Val Pro Glu Val Gly Glu Ile Ala Ile Asn Asp

115 120 125gca ttc atg tta gag gct gct atc tac aag ctt ttg aaa tct cac ttc 432Ala Phe Met Leu Glu Ala Ala Ile Tyr Lys Leu Leu Lys Ser His Phe

130 135 140aga aac gaa aaa tac tac ata gat atc acc gaa ttg ttc cat gag gtc 480Arg Asn Glu Lys Tyr Tyr Ile Asp Ile Thr Glu Leu Phe His Glu Val145 150 155 160acc ttc caa acc gaa ttg ggc caa ttg atg gac tta atc act gca cct 528Thr Phe Gln Thr Glu Leu Gly Gln Leu Met Asp Leu Ile Thr Ala Pro

165 170 175gaa gac aaa gtc gac ttg agt aag ttc tcc cta aag aag cac tcc ttc 576Glu Asp Lys Val Asp Leu Ser Lys Phe Ser Leu Lys Lys His Ser Phe

180 185 190ara gtt act ttc aag act gct tac tat tct ttc tac ttg cct gtc gca 624Ile Val Thr Phe Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala

195 200 205ttg gcc atg tac gtt gcc ggt atc acg gat gaa aag gat ttg aaa caa 672Leu Ala Met Tyr Val Ala Gly Ile Thr Asp Glu Lys Asp Leu Lys Gln

210 215 220gcc aga gat gtc ttg att cca ttg ggt gaa tac ttc caa att caa gat 720Ala Arg Asp Val Leu Ile Pro Leu Gly Glu Tyr Phe Gln Ile Gln Asp225 230 235 240gac tac tta gac tgc ttc ggt acc cca gaa cag atc ggt aag atc ggt 768Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Thr Pro Glu Gln Ile Gly Lys Ile Gly

245 250 255aca gat atc caa gat aac aaa tgt tct tgg gta atc aac aag gca ttg 816Thr Asp Ile Gln Asp Asn Lys Cys Ser Trp Val Ile Asn Lys Ala Leu

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340 345 350tag 1059<210>2<211>352<212>PRT<213>啤酒糖酵母(saccharomyces cerevisiae)<400>2Met Ala Ser Glu Lys Glu Ile Arg Arg Glu Arg Phe Leu Asn Val Phe1 5 10 15Pro Lys Leu Val Glu Glu Leu Asn Ala Ser Leu Leu Ala Tyr Gly Met

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35 40 45Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Thr Tyr Ala

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290 295<210>4<211>299<212>PRT<213>大肠杆菌(Escherichia coli)<400>4Met Asp Phe Pro Gln Gln Leu Glu Ala Cys Val Lys Gln Ala Asn Gln1 5 10 15Ala Leu Ser Arg Phe Ile Ala Pro Leu Pro Phe Gln Asn Thr Pro Val

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245 250 255att cta aga att ctc ctg ttg agg aca agt gat aaa gat ata aaa cta 816Ile Leu Arg Ile Leu Leu Leu Arg Thr Ser Asp Lys Asp Ile Lys Leu

260 265 270aag ctg att caa ata ctg gaa ttc gac acc aat tca ttg gcc tac acc 864Lys Leu Ile Gln Ile Leu Glu Phe Asp Thr Asn Ser Leu Ala Tyr Thr

275 280 285aaa aat ttt att aat caa tta gtg aat atg ata aaa aat gat aat gaa 912Lys Asn Phe Ile Asn Gln Leu Val Asn Met Ile Lys Asn Asp Asn Glu

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325 330 335<210>6<211>335<212>PRT<213>啤酒糖酵母(saccharomyces cerevisiae)<400>6Met Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Ile Asn Asn Asp Pro Val Trp Ser1 5 10 15Ser Gln Asn Glu Ser Leu IIe Ser Lys Pro Tyr Asn His Ile Leu Leu

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245 250 255Ile Leu Arg IIe Leu Leu Leu Arg Thr Ser Asp Lys Asp Ile Lys Leu

260 265 270Lys Leu Ile Gln Ile Leu Glu Phe Asp Thr Asn Ser Leu Ala Tyr Thr

275 280 285Lys Asn Phe Ile Asn Gln Leu Val Asn Met Ile Lys Asn Asp Asn Glu

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21<210>102<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>102atggaggcca agatagatga g 21<210>103<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>103tcacaattcg gataagtggt c 21<210>104<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>104tcctaatgcc aagaaaacag ctgtcac 27<210>105<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>105atggcaaacc ctttttcgag a 21<210>106<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>106agccctcttt acacctagtg a 21<210>107<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>107tccccgcgga tggaggccaa gatagat 27<210>108<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>108caactcgagt cacaattcgg ataagtg 27<210>109<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>109gctctagagt tcgtcgtgtt tgcttctctt gtaaactt 38<210>110<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>110tatctcgagt cacaattcgt catgtaaatt gg 32<210>111<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>111gcagggaccc caattcggat aagtggt c 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10<210>122<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成肽<400>122Cys Leu Asn Lys Val Tyr Lys Arg Ser Lys1 5 10<210>123<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>123ttttaagagc ttggtgagcg c 21<210>124<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>124tcgagttcaa gagaaaaaaa a 21<210>125<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>125ttcaattcat catttttttt t 21<210>126<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>126gggtaataac tgatataatt a 21<210>127<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>127atggattcta gaacagttgg t 21<210>128<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成NDA<400>128ttacttgttt tctagataag c 21<210>129<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>129atgactaacg aaaaggtctg g 21<210>130<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成DNA<400>130ttaagctgct gcggagcttc c 21

Claims

1.一种制备异戊二烯醇的方法，包括：通过将均含有异戊二烯基二磷酸合酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA导入宿主而构建一个重组体；培养得到的重组体；及从得到的培养物中回收异戊二烯醇。

2.一种制备异戊二烯醇的方法，包括：通过将均含有异戊二烯基二磷酸合酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA以及均含有羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA导入宿主而构建一个重组体；培养得到的重组体；及从得到的培养物中回收异戊二烯醇。

3.根据权利要求1或2的方法，其中的异戊二烯醇为香叶基香叶醇。

4.一种制备香叶基香叶醇的方法，包括：通过将均含有异戊二烯基二磷酸合酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA以及均含有异戊烯基二磷酸Δ异构酶基因的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA导入宿主而构建一个重组体；培养得到的重组体；及从得到的培养物中回收香叶基香叶醇。

5.根据权利要求1-4中任意一项的方法，其中的异戊二烯基二磷酸合酶基因选自下列基因(a)和(b)以及融合基因(c)和(d)：

(a)法呢基二磷酸合酶基因或其突变体

(b)香叶基香叶基二磷酸合酶基因或其突变体

6.根据权利要求5的方法，其中法呢基二磷酸合酶基因编码如SEQID NO：2或4所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求5的方法，其中香叶基香叶基二磷酸合酶基因编码如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

8.一种制备香叶基香叶醇的方法，包括：通过将均含有羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA导入宿主而构建一个重组体；培养得到的重组体；及从得到的培养物中回收香叶基香叶醇。

9.一种制备香叶基香叶醇的方法，包括：通过将均含有羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA以及均含有选自下列(e)到(j)的基因的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA导入宿主而构建一个重组体：

(e)异戊烯基二磷酸Δ-异构酶基因

(f)甲羟戊酸激酶基因

(g)乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因

(h)羟甲基戊二酰辅酶A合酶基因

(i)磷酸甲羟戊酸激酶基因

(j)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因；

10.根据权利要求3-9中任意一项的方法，其中在得到得培养物中香叶基香叶醇的浓度至少为0.05mg/L。

11.根据权利要求1-10中任意一项的方法，其中的宿主为酵母或大肠杆菌。

12.根据权利要求11的方法，其中的酵母为啤酒糖酵母。

13.根据权利要求13的方法，其中的啤酒糖酵母为啤酒糖酵母A451菌株、YPH499菌株、YPH500菌株、W303-1A菌株或W303-1B菌株，或一种衍生自上述任一菌株的菌株。

14.一种用于表达的重组DNA，含有选自以下基因(a)和基因(b)以及融合基因(c)和(d)的一种基因，以及转录启动子和转录终止子：

(a)法呢基二磷酸合酶基因或其突变体

(b)香叶基香叶基二磷酸合酶基因或其突变体

15.根据权利要求14的重组DNA，其中的转录启动子是选自ADH1启动子、TDH3(GAP)启动子、TEF2启动子、GAL1启动子和tac启动子的任意一种启动子。

16.根据权利要求14的重组DNA，其中的转录终止子为CYC1终止子。

17.通过将权利要求14-16中任意一项的重组DNA导入宿主而获得的重组体。

18.根据权利要求17的重组体，其中的宿主为酵母或大肠杆菌。

19.根据权利要求18的重组体，其中的酵母为啤酒糖酵母。

20.根据权利要求19的重组体，其中的啤酒糖酵母为啤酒糖酵母A451菌株、YPH499菌株、YPH500菌株、W303-1A菌株或W303-1B菌株，或一种衍生自上述任一菌株的菌株。

21.根据权利要求18-20中任意一项的重组体，其中的重组体是原养型。

22.根据权利要求18-20中任意一项的重组体，其中的重组体是二倍体细胞。

23.根据权利要求18-20中任意一项的重组体，其中的重组体是原养型，且是二倍体细胞。

24.一种制备异戊二烯醇的方法，包括：采用含下列组分(i)-(vi)的任意一种的培养基，培养具有产生异戊二烯醇能力的微生物：

(i)糖

(ii)醇

(iii)氨气，氨水和/或铵盐

(iv)氢氧化钠和硫酸的混合物

(vi)上述组分(i)-(v)中的两种或以上的混合物；

并且从得到的培养物中回收异戊二烯醇。

25.根据权利要求24的方法，其中采用补料液培养微生物，该补料液含有下列组分(i)、(ii)或(iii)或这些组分中的两种或两种以上的混合物：

(i)糖

(ii)醇

(iii)氨气、氨水和/或铵盐。

26.根据权利要求24的方法，其中补料液的碳源组分从培养开始到培养开始后12-24小时之间仅由葡萄糖组成，在此之后碳源组分更换为含乙醇的组分。

27.根据权利要求24的方法，其中在培养开始12-24小时后，补料液中的乙醇占总的碳源组分的比例为50％或更多。

28.根据权利要求24的方法，其中在培养开始12-24小时后，补料液中的碳源组分仅由乙醇组成。

29.根据权利要求24的方法，其中所述积累于培养物中的异戊二烯醇浓度至少为0.1g/L或更高。

30.根据权利要求24的方法，其中所述积累于培养物中的异戊二烯醇浓度至少为1g/L或更高。

31.根据权利要求24的方法，其中的异戊二烯醇为香叶基香叶醇。

32.根据权利要求24的方法，其中的微生物为酵母。

33.根据权利要求32的方法，其中的酵母为啤酒糖酵母。

34.根据权利要求33的方法，其中的啤酒糖酵母为啤酒糖酵母A451菌株、YPH499菌株、YPH500菌株、W303-1A菌株或W303-1B菌株，或一种衍生自上述任一菌株的菌株。

35.根据权利要求24的方法，其中的微生物为重组体。

36.根据权利要求35的方法，其中的重组体是通过将均含有甲羟戊酸途径相关基因或其突变体，或异戊二烯基二磷酸合酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA导入宿主而构建的。

37.根据权利要求35的方法，其中的重组体是通过将均含有异戊二烯基二磷酸合酶基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA以及均含有甲羟戊酸途径相关基因或其突变体的一个用于表达的重组DNA或一个用于基因组整合的DNA导入宿主而构建的。

38.根据权利要求36或37的方法，其中的宿主为啤酒糖酵母。

39.根据权利要求38的方法，其中的啤酒糖酵母为啤酒糖酵母A451菌株、YPH499菌株、YPH500菌株、W303-1A菌株或W303-1B菌株，或一种衍生自上述任一菌株的菌株。

40.根据权利要求36或37的方法，其中的甲羟二羧酸途径相关基因为羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因。

41.根据权利要求40的方法，其中的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因为HMG1基因。

42.根据权利要求36或37的方法，其中的异戊二烯基二磷酸合酶基因是选自下列基因(a)和(b)以及融合基因(c)和(d)的任意一种：

(a)法呢基二磷酸合酶基因或其突变体

(b)香叶基香叶基二磷酸合酶基因或其突变体

43.根据权利要求24的方法，其中的微生物是原养型。

44.根据权利要求24的方法，其中的微生物是二倍体细胞。

45.根据权利要求24的方法，其中的微生物是原养型，且是二倍体细胞。

46.根据权利要求24的方法，其中培养基的pH是被控制的。

47.根据权利要求46的方法，其中pH的控制是采用氨气、铵盐溶液、氢氧化钠溶液或硫酸进行的。