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CN1476838A - 一种高活性银杏叶提取物制剂和用途 - Google Patents

一种高活性银杏叶提取物制剂和用途 Download PDF

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CN1476838A CNA021299056A CN02129905A CN1476838A CN 1476838 A CN1476838 A CN 1476838A CN A021299056 A CNA021299056 A CN A021299056A CN 02129905 A CN02129905 A CN 02129905A CN 1476838 A CN1476838 A CN 1476838A
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杨义芳
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Abstract

本发明公开了一种银杏叶提取物的冻干粉针制剂，它是由高活性的银杏叶提取物制备而成；同时也公开了高活性的银杏叶提取物制备方法和冻干粉针制剂的配方和制备方法，另外也公开了该冻干粉针制剂在预防和治疗心脑血管疾病中的应用。

Description

一种高活性银杏叶提取物制剂和用途
本发明涉及一种银杏叶的提取物制剂和用途，更确切地说是涉及一种银杏叶提取物粉针制剂和用途。
在现有技术中，银杏叶提取物作为心脑血管疾病的治疗药物最早见于德国Schwabe制药公司的TEBONIN，以后又开发了Ginaton，是一种水针粉剂，其主要指标为银杏叶提取物中含总黄酮苷24％以上，总内酯6％以上，银杏酸小于5ppm。但在该制剂中有效成分偏低，白果内酯几乎丢失，有文献报道，银杏叶提取物用于治疗心脑血管疾病其总黄酮和总内酯起协同作用，白果内酯对缺血脑组织损伤具有保护作用；能抑制大脑内低氧诱导的膜分解；提高氰化物处理后鸡胚神经元的存活性，诱导提高CA1锥体神经兴奋作用，抑制MPN降低海马和大脑皮质中α-氨基丁酸水平和谷氨酸脱羧酶活性，具有中枢神经的保护作用以及清除自由基等作用。为了获得更高效的银杏叶提取物制剂，就必需获得一种高含总黄酮苷和总内酯的银杏叶提取物，同时作为注射剂，也应该使提取物的杂质尽可能的少。这是人们一直在寻求的，但至今尚未达到的目标。
现在我们发现通过在银杏叶初提物精制过程中，将黄酮成分和内酯成分分离，分别精制，得到两种银杏叶提取物，它们分别高含有总黄酮苷和总内酯，并通过药理研究，获得了一种总黄酮苷和总内酯具有一定配比的高活性的银杏叶提取物，并用它来制备高活性的制剂。
本发明的目的就是提供一种高活性的银杏叶提取物制剂并用于治疗心脑血管疾病。
本发明的高活性银杏叶提取物制剂是一种冻干粉针剂，其特征在于该冻干粉针剂含高活性银杏叶提取物，该高活性银杏叶提取物是由银杏叶总黄酮苷提取物(简称为提取物A)和银杏叶总内酯提取物(简称为提取物B)混合而成，提取物A含总黄酮苷为65％以上，提取物B含总内酯75％以上，其中白果内酯在总内酯中的含量为百分之四十以上，比例为(4.20-5.0)∶(1.05-1.80)，经混合后的提取物含总黄酮苷和总内酯65％以上，银杏酸含量小于5ppm；。
本发明的高活性银杏叶提取物冻干粉针剂具有以下特征：
(1)高活性的银杏叶提取物冻干粉针剂中的提取物含有高的总黄酮苷和总内酯以及白果内酯含量为百分之四十以上，并可用以下方法测定。总黄酮苷含量测定照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)为流动相；检测波长为360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备分别精密称取经五氧化二磷干燥过的槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品，加少许甲醇溶解，加流动相制成每1ml分别含0.036mg、0.020mg、0.006mg的溶液。
供试品溶液的制备  取冻干粉针剂内容物，研细，混均，取0.2g，精密称定，加7.5％盐酸20ml，加70％乙醇20ml，95℃回流2小时，冷却，转移至50ml量瓶中，并加无水乙醇至刻度，摇匀，即得。
测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算三种黄酮苷元的含量，以下式换算成总黄酮苷的含量。
总黄酮苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李含量)×2.51内酯含量测定照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；水-甲醇-四氢呋喃(75∶20∶10)为流动相，流速1.0ml/min Alltech 500 ELSD为检测器，检测器漂移管温度为115℃，氮气流速为2.74SLPM，理论板数按白果内酯峰计算应不低于9000。
对照品溶液的制备 取经置有五氧化二磷干燥剂，60℃真空干燥6h的对照品适量，加水-甲醇-四氢呋喃(44∶50∶6)溶剂制成每1ml含银杏内酯J：0.135mg、银杏内酯C：0.355mg、白果内酯0.660mg、银杏内酯A：0.400mg、银杏内酯B：0.102mg，为对照品溶液I；取对照品溶液I 3ml与2ml，分别置5ml量瓶中，加上述溶剂稀释至刻度，为对照品溶液II、III。
供试品溶液的制备 取冻干粉针剂内容物，研细混匀，取0.52g，精密称定，置锥形瓶中，加20ml水溶液，用2％盐酸调节pH至3-4，加于已处理好的聚酰胺柱(内径1.5cm，长5cm的聚酰胺，预先用70％乙醇浸泡过夜，滤弃乙醇，装柱，用水洗至无醇味，备用)上，加水40ml洗脱，收集洗脱液，洗脱液加氯化钠1.8g，用醋酸乙酯提取3次，分别为40ml、35ml、30ml，合并醋酸乙酯液；减压蒸干，残渣加水-甲醇-四氢呋喃(44∶50∶6)溶剂使溶解，定量转容至5ml量瓶中，摇匀，过0.45μm的滤膜，取续滤液，即得。
测定法  分别精密吸取对照品溶液I、II、III及供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，测定。将浓度及峰面积均取自然对数后用外标三点法计算，求出供试品峰面积的自然对数，并转换成供试品的含量，即得。
白果内酯在银杏总内酯中的含量通过计算得出。
(2)高活性的银杏叶提取物冻干粉针剂中总黄酮苷和总内酯还具有以下的指纹图谱特征：a)黄酮类成分的指纹图谱特征(见附图1)：共有峰的峰号(相对保留时间)：1(0.424)，2(0.544)，3(0.651)，4(1.000)，5(1.151)，6(1.571)，7(1.845)。
共有峰的归属  峰4为槲皮素；峰6为山柰酚；峰7为异鼠李素；峰5为具有槲皮素同样母核的黄酮类成分。
峰面积比值4(S)∶6∶7＝(1.000)∶(0.561～0.841)∶(0.136～0.252)
上述技术特征是由以下方法测定的：
按照《中国药典》2000年版一部附录VID的高效液相色谱方法测定。
仪器：惠普公司HP1100 Series。
色谱条件和系统适应性试验：(Alltech)Platinum EPS C18 100A 3μ150mm×4.6mm；甲醇-0.4％磷酸水溶液(50∶50)为流动相，流速0.7ml/min；检测波长方370nm。Slope Senesitivity：1、peakwidth：0.5、Area Reject：0.5、heightReject 0.5、Shoulders off，0.000 Integration OFF，3.464 Integration ON、4.890Baseline Now ON。理论板数按槲皮素计算，应不低于3200。
供试品溶液的制备：取本发明冻干粉针剂内容物0.2g，精密称定，加7.5％盐酸20ml，溶解，加70％乙醇20ml，95℃回流2小时，冷却，转移至50ml量瓶中，并加无水乙醇至刻度，摇匀，过0.45μm的滤膜，取续滤液，即得。
参照物溶液制备：取槲皮素对照品适量，精密称定，加少许甲醇超声处理使溶解，加流动相制成每1ml含0.026mg的溶液，作为对照品溶液。
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录45分钟色谱图，即得。以槲皮素的色谱峰(S峰)的保留时间和峰面积为1计算相对保留时间和峰面积比值。b)内酯类成分指纹图谱特征(见附图2)：
共有峰的峰号(相对保留时间)：1(0.713)、2(0.884)、3(1.000)、4(1.296)、5(1.701)
共有峰归属  峰1为银杏内酯J；峰2为银杏内酯C；峰3为白果内酯；峰4为银杏内酯A；峰5为银杏内酯B。
峰面积比值2∶3(S)∶4＝(0.166～0.276)∶(1.000)∶(0.362～0.544)
上述技术特征是由以下方法测定的：
按照《中国药典》2000年版一部附录VI D的高效液相色谱方法测定。
仪器：岛津公司LC-10ATvp，记录仪C-R6A；检测器：美国科达技术公司A1ltech 500 ELSD。
色谱条件和系统适应性试验：PhenomenexHypersil 5μ C18(ODS)，250mm×4.6mm；水-甲醇-四氢呋喃(75∶20∶10)为流动相，流速：1.0ml/min；检测器漂移管温度：115℃，氮气流速：2.74SLPM；ATTEN：6，SLOPE：500，MIN.AREA：5000，纸速5mm/min。理论板数按银杏内酯峰计算应不低于3500。
供试品溶液的制备  取本发明冻干粉针剂0.52g，精密称定，置锥形瓶中，加20ml水溶解，用2％盐酸调节pH至3～4，加于已处理好的聚酰胺柱(内径1.5cm，长5cm的聚酰胺，预先用70％乙醇浸泡过夜，滤弃乙醇，装柱，用水洗至无醇味，备用)上，加水40ml洗脱，收集洗脱液，洗脱液加醋酸钠1.8g，用醋酸乙酯提取3次，分别为30ml、20ml、20ml，合并醋酸乙酯提取液，用水洗涤两次提取液，每次15ml，  减压蒸干，残渣加水-甲醇-四氢呋喃(44∶50∶6)溶剂使溶解，定量转溶至5ml量瓶中，过0.45μm的滤膜，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备取白果内酯对照品适量，精密称定，加水-甲醇-四氢呋喃(44∶50∶6)溶剂制成每1ml含0.40mg的溶液，即得。
测定方法：分别精密吸取对照品溶液与试验溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录30分钟色谱图，并以白果内酯的色谱峰3(S峰)的保留时间和峰面积为1计算相对保留时间和峰面积比值。
(3)高活性银杏叶提取物冻干粉针剂具有以下优秀的药效学特性a)高活性银杏叶提取物可缩小MCAO大鼠脑梗塞面积，降低神经症状评分，减少脑水含量及脑指数，降低大鼠毛细血管通透性，与对照品比较，其性能差异具显著的意义。b)高活性银杏叶提取物可增加麻醉猫脑血流量，降低血管阻力，与对照品比较其性能差异具显著性意义。c)高活性银杏叶提取物可降低大鼠血小板聚集率，延长大鼠颈动脉血栓时间，提高纤维蛋白酶溶解活性，降低MDA含量，与对照组比较其性能差异具显著性意义。d)高活性银杏叶提取物可延长小鼠凝血时间，对血小板计数无明显影响。e)高白果内酯(BB)含量，对缺血脑组织损伤具有保护作用；能抑制大脑内低氧诱导的膜分解；提高氰化物处理后鸡胚神经元的存活性，诱导提高CA1锥体神经兴奋作用，抑制MPN降低海马和大脑皮质中α-氨基丁酸水平和谷氨酸脱羧酶活性，具有中枢神经的保护作用以及清除自由基等作用。上述性质可用以下实验来证实：
                       实验材料和仪器
1、动物：SD大鼠，动物级别：清洁级，上海市西普尔——必凯实验动物有限公司提供，合格证号：医动字第02-49-2号。昆明小鼠，江西医学院动物中心提供，动物合格证号：医动第字第021-9609。
2、药物：
注射用高活性银杏叶提取物冻干粉针剂(简称注射用银杏叶(冻干))按本发明的制剂工艺制备得到的一种试验用药物，批号980827，实验时用蒸镏水配制成相应浓度备用；
氯化三苯基四氮唑  上海化学试剂总厂；
伊文思蓝  上海化学度剂采购供应站，批号820805；
丙二醛测试盒  南京建成生物工程研究所。
3、仪器：307-6型台式牙钻，上海齿科医械厂；1422型高频手术器，上海医用电子仪器厂；GMIAS图像分析仪，北京航空航天大学；MFA-1200电磁流量计，日本Nihokohden公司；TYXN-91A智能血液凝集仪，上海通用机电技术研究所制；721型分光光度计，上海第三仪器厂；TG328A型分析天平，上海天平仪器厂生产；WMT-01型数字温度计，上海医用仪表厂；BT87-3型实验性体内血栓形成仪，包头医学院附属医院心血管研究室监制。
               实验一  对大鼠局灶型脑缺血梗塞面积的影响
取SD大鼠70只，雌雄各半，体重280±30g，按雌雄体重随机分为假手术组，脑缺血模型组，注射用银杏叶(冻干)高剂量组(提取物15mg/kg)，注射用银杏叶(冻干)中剂量组(提取物10mg/kg)，注射用银叶(冻干)低剂量组(提取物5mg/kg)。以水合氯醛350mg/kg；ip麻醉，除假手术组不阻断大脑中动脉外，其余各组按Tamara方法[1]，于无菌条件下，于右眼外吡及右耳道连线中点作纵行切口，分离剪断咬肌和颞肌，除去颧弓，暴露鳞状骨，在颧弓根及鳞状骨前方以牙钻钻孔开颅，暴露大脑中动脉，用电凝凝闭位于嗅束处动脉节段，创面放置明胶海绵，逐层缝合肌肉皮肤。术后各给药组均按上述剂量静脉注射，假手术组，脑缺血模型组给予等容积生理盐水静注，每天一次，连续2天。于48小时后，用乙醚麻醉大鼠，断头取脑，于视交叉处向后约2mm处平行作冠状切片(厚度5mm)，置于2％TTC液中[37℃]避光孵育30分钟，正常组织染成红色，梗塞组织为白色，以10％福尔马林固定，在CMIAS图像分析仪上测定脑梗塞面积，计算出右侧大脑梗塞面积百分比[右侧脑梗塞面积/右侧大脑面积×100％]。结果见表1。
              实验二  对局灶性脑梗塞大鼠神经症状的影响
取SD大鼠70只，雌雄各半，体重260±40g，按性别体重随机分为假手术组，脑缺血模型组，注射用银杏叶(冻干)高剂量组，注射用银杏叶(冻干)中剂量组，注射用银杏叶(冻干)低剂量组。除假手术组外，其余各组均行右侧大脑中动脉阻断术。术前一天各组按相应剂iv.qd。术后2h各组按同样剂量iv.qd，
表1注射用银杏叶(冻干)对大鼠大脑中动脉阻断性脑梗塞面积的影响( X±SD
                               n＝10)
    组别   右侧大脑平均面积(mm2) 右侧大脑平均梗塞面积(mm2) 右侧脑梗塞面积百分比(％) 右侧梗塞面积减少率(％)
    假手术组   118.82±9.61
    脑缺血模型组   121.20±12.26   29.20±4.63   23.85±4.53
    注射用银杏叶(冻干)高剂量组   109.74±9.49   14.08±5.32***   12.96±4.56***     51.78
    注射用银杏叶(冻干)中剂量组   122.59±11.95   16.69±6.23***   13.60±4.87***     42.84
    注射用银杏叶(冻干)低剂量组   114.07±8.75   19.80±6.15**   16.27±4.24**     31.88
注：与脑缺血模型组比较**P＜0.01  ***P＜0.001
表2注射用银杏叶(冻干)对局灶性脑梗塞大鼠神经症状评分的影响
                         ( X±SD n＝10)
分组 剂量    24h     48h 72h
假手术组 N.S 4ml/kg    0     0 0
脑缺血模型组 N.S 4ml/kg    6.20±1.64     6.05±1.20 5.80±1.75
注射用银杏叶(冻干)高剂量组 提取物15mg/kg    4.25±1.48*     3.25±1.47** 2.25±2.01**
注射用银杏叶(冻干)中剂量组 提取物10mg/kg    4.15±1.73*     3.30±1.66** 2.60±2.15**
注射用银杏叶(冻干)低剂量组 提取物5mg/kg    4.95±1.67     4.05±1.94* 3.55±2.09*
注：与脑缺血模型组比较*P＜0.05  **P＜0.01观察末次给药后24h、48h、72h的临床症状，按文献确定神经症状评分标准：(1)提起鼠尾观察左前肢内收，左肩内旋，评为1-4分；(2)将大鼠置于平板上，推右肩向左移动，以左侧阻力降低程度，评为1-3分；(3)视左前肢肌力下降程度评为1-3分。总分为10分，采用上述评分标准，进行统计学处理，结果见表2。
        实验三  对大鼠局灶性脑缺血脑含水量、脑指数的影响
SD大鼠分组及给药方法同前，末次给药后观察神经症状72h后，用乙醚麻醉，开颅取脑，用精密天平称取全脑湿重，于100℃烤箱中烘烤24h，称取干重，按公式计算脑含水量(湿重-干重/湿重×100％)，并按公式计算脑指数(脑重×100/体重)。结果见表3。
            实验四  对大鼠脑毛细血管通透性的影响
取雄性SD大鼠60只，体重220～255g，随机分为假手术组，脑缺血模型组，注射用银杏叶(冻干)高剂量组，注射用银杏叶(冻干)中剂量组，注射用银杏叶(冻干)低剂量组，各组按其剂量阴茎静脉注射给药，qd×2d，末次给药30min，由静脉注射20％伊文思蓝0.3ml/100g，5min后，除假手术组外，各组结扎双侧颈总动脉，4h后断头取脑，称全脑湿重，用0.5％Na2SO43ml及丙酮7ml，制成10％脑匀浆，静置于冰箱中12h，离心3000r/min 20min，再置入冰箱中12h，离心3000r/min 20min，取上清液，用721分光光度计(波长620nm)比色，根据OD值及标准曲线计算组织伊文思蓝含量，结果见表4。
           实验五  对麻醉猫脑血流量及脑血管阻力的影响
健康猫36只，雌雄兼用，体重2.4～3.8kg，随机分为生理盐水对照组，注射用银杏叶(冻干)高剂量组(提取物7.5mg/kg)，注射用银杏叶(冻干)中剂量中组(提取物5mg/kg)，注射用银杏叶(冻干)低剂量组(提取物2.5mg/kg)。
      表3注射用银杏叶(冻干)对大鼠局灶性脑缺血脑含水量、脑指数的影响
                                ( X±SD n＝10)
分组 剂量   脑含水量(％)     脑指数
假手术组 N.S 4ml/kg   76.40±1.26ΔΔΔ     0.60±0.04ΔΔ
脑缺血模型组 N.S 4ml/kg   78.96±1.07     0.69±0.06
注射用银杏叶(冻干)粉针高剂量组 提取物15mg/kg   77.04±1.01**     0.62±0.05*
注射用银杏叶(冻干)粉针中剂量组 提取物10mg/kg   77.15±1.05**     0.63±0.05*
注射用银杏叶(冻干)粉针低剂量组 提取物5mg/kg   77.72±1.18*     0.64±0.07
注：给药组与模型组比较*P＜0.05  **P＜0.01
假手术组模型组比较ΔΔP＜0.01  ΔΔΔp＜0.001
             表4注射用银杏叶(冻干)对大鼠脑毛细管通透性的影响
                           ( X±SD n＝10)
    分组     剂量   伊文思蓝含量(ug/g)
    假手术组     N.S 4ml/kg     14.23±2.95***
    脑缺血模型组     N.S 4ml/kg     24.86±5.01
    注射用银杏叶(冻干)高剂量组     提取物15mg/kg     17.56±3.63**
    注射用银杏叶(冻干)中剂量组     提取物10mg/kg     17.98±3.04**
    注射用银杏叶(冻干)低剂量组     提取物5mg/kg     19.39±4.34*
注：与脑缺血模型组比较*P＜0.05  **P＜0.01用1.5％氯醛糖+25％乌拉坦(2∶1)溶液3.5～5ml/kg ip麻醉。分离右侧颈动脉，向上分离颈外动脉、颈内动脉，沿右侧颈动脉向下分离，在颈外静脉向内转弯处向下分离椎动脉。结扎右侧颈处动脉及椎动脉。用电磁流量计适合探头测定右侧颈内动脉每分钟平均血流量。另外进行股动脉插管，直接用水银检测计测定血压，同时进行股静脉插管，以生理盐水缓慢静脉滴注，待血压稳定20min后，分别记录给药前、给药后10min、30min、60min、90min的颈内动脉血流量、血压。实验结束后，摘取全脑称重，按公式[3]计算脑血流量及血管阻力，结果见表5-1，5-2。
                实验六  对大鼠血小板聚集的影响
*SD雄性大鼠60只，体重240±30g，随机分为生理盐水组、注射用银杏叶(冻干)高剂量组，注射用银杏叶(冻干)中剂量组、注射用银杏叶(冻干)低剂量组，各组按其剂量由阴茎静脉注射给药，每日一次，连续3天，末次给药30min后，以30％戊巴比妥纳30mg/kg ip麻醉，经腹主动脉取血，用3.28％枸橼酸钠(抗凝剂与全血之比为1∶9)，以500rpm×3min，制备富血小板血浆(PRP)，制备贫血小板血浆(PPP，3000rpm×10min)，采用PPP测试杯调节零点，以ADP为诱导剂(浓度4μm，用量11ul)，用TYXN-91A型智能血液凝集仪按比浊法计算血小板聚集率，并计算血小板聚集抑制率＝对照组聚集率-药物组聚集率/对照组聚集率×100％，结果见表6。
                实验七  对大鼠颈动脉血栓形成时间的影响
取SD大鼠50只，雌雄各半，体重260～330g，随机分为生理盐水组、注射用银杏叶(冻干)高剂量组、注射用银杏叶(冻干)中剂量组、注射用银杏叶(冻干)低剂量组。各组按其剂量静脉注射qd×2d，末次给药15分钟后，用戊巴比
表5-1注射用银杏叶(冻干)对麻醉猫脑血流量的影响( X±SD n＝6)
组别 给药前              脑血流量(ml/100g/min)     30min脑血流     30min平均血
                给药后(min)
10′             30′              60′             90′     增加率(％)     Kpa
生理盐水组注射用银杏叶(冻干)高剂量组注射用银杏叶(冻干)中剂量组注射用银杏叶(冻干)低剂量组金纳多组葛根素组  64.38±9.7166.17±9.3460.59±10.0464.12±5.7657.20±9.1970.35±9.45 69.75±10.93     65.81±9.66       63.53±8.45      63.92±11.2994.57±16.03**  109.15±21.51*** 101.71±16.01** 88.89±16.81**83.80±15.79**  92.35±21.60**   88.56±24.45**  78.23±12.90**84.90±19.67*   92.16±25.69**   84.79±19.50**  79.18±17.19*73.38±12.74*   85.68±13.49**   76.95±16.28**  69.93±15.19*91.04±23.87*   97.51±19.30**   91.18±20.40*   84.30±17.42     2.2264.9552.4243.7349.5338.60     17.18±2.0118.53±1.5717.30±1.5417.22±0.8418.63±2.1717.28±2.14
注：各组给药后各时段脑血流量与给药前脑血流量比较*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001；各时段脑血流量及30min平均血压注射用银杏叶(冻干)低
剂量组与金纳多比较P＞0.05表5-2银杏叶粉针对麻醉猫脑血阻力的影响  ( X±SD n＝6)
组别   给药前                     脑血流量(ml/100g/min)
                        给药后(min)     30min脑血管阻力
10′           30′             60′            90′     下降率(％)
生理盐水组注射用银杏叶(冻干)高剂量组注射用银杏叶(冻干)中剂量组注射用银杏叶(冻干)低剂量组金纳多组葛根素组   0.27±0.020.29±0.040.29±0.040.27±0.030.31±0.030.25±0.03 0.26±0.03     0.27±0.03       0.28±0.03      0.26±0.030.21±0.03**  0.17±0.02***   0.19±0.02**   0.22±0.02*0.22±0.03**  0.19±0.03**    0.21±0.05**   0.23±0.04*0.21±0.04*   0.20±0.05*     0.21±0.05*    0.23上0.04*0.25±0.04*   0.23±0.05*     0.25±0.04*    0.25±0.04*0.19±0.05*   0.19±0.04**    0.21±0.05*    0.22±0.04 41.3834.4825.9225.8124.00
注：各组给药后各时段脑血管阻力与给药前脑血管阻力比较*P＜0.05  ***P＜0.01
             表6注射用银杏叶(冻干)对ADP诱导大鼠血小板聚集率的影响
                                 ( X±SD n＝10)
分组 剂量   聚集率(％)     聚集抑制率(％)
生理盐水组 4ml/kg   47.54±6.00
注射用银杏叶(冻干)高剂量组 提取物15mg/kg   30.38±11.74**     36.10
注射用银杏叶(冻干)中剂量组 提取物10mg/kg   32.09±12.78**     32.50
注射用银杏叶(冻干)低剂量组 提取物5mg/kg   36.80±10.64*     22.59
注：与生理盐水组比较*P＜0.05  **P＜0.01
          表7注射用银杏叶(冻干)对大鼠颈动脉血栓形成时间的影响
                         ( X±SD n＝10)
分组 剂量     血栓形成时间(min)   延长率(％)
生理盐水组 4ml/kg     17.78±4.28
注射用银杏叶(冻干)高剂量组 提取物15mg/kg     29.29±7.69**     64.73
注射用银杏叶(冻干)中剂量组 提取物10mg/kg     27.32±8.02**     53.66
注射用银杏叶(冻干)低剂量组 提取物5mg/kg     23.47±6.06*     32.00
注：与生理盐水组比较*P＜0.05  **P＜0.01妥钠30ml/kg ip麻醉。分离右侧颈动脉，用WMY-01型数字温度计测量颈动脉血管表面温度后，再用BT87-3型体内血栓形成仪以1.5mv直流电刺激7min，每隔2min测一次颈动脉表面温度，观察从电刺激开始到温度突然下降的时间为大鼠颈动脉内血栓形成时间，结果见表7。
          实验八  对大鼠纤维蛋白溶解酶活性的影响
取雄性SD大鼠50只，体重220±20g，随机分为4组。实验前各组按相应剂量静脉注射qd×2d，经戊巴比妥钠30mg/kg ip麻醉。由腹主动脉取血2ml，加入3.8％枸橼酸钠0.2ml，以2500r/min离心10分钟，制成贫血小板血浆，取血浆0.5ml，加入酸化水9.5ml(1％冰醋酸11ml稀释至1000ml)。置入冰箱30分钟，再以2500r/min离心15分钟，去上清液，用PH9.0的硼酸溶液使沉淀溶解，加入0.5ml/40M氯化钙溶液，使管内液体凝固，记录凝块溶解时间，按公式计算纤维蛋白溶解酶活性[6]，结果见表8。
           实验九  对小鼠凝血时间及血小板计数的影响
取健康昆明小鼠75只，体重21±3g，雌雄各半，随机分为4组。各组按表中剂量进行尾静脉注射，qd×2d，末次给药15min后，迅速摘除小鼠眼球，滴一滴血于清洁玻片一端，每隔30s用针头自滴血边缘挑动，记录凝血出现时间，同时用吸管吸取10ul血液，置于血小板稀释液内静置15min，用高倍镜计血小板数，结果见表9。
            实验十  对大鼠脑缺血组织中MDA测定的影响
取SD大鼠50只，体重238±17.5g，雌雄兼用，随机分为4组。各组按表中剂量静脉注射，qd×2d，末次给药15min后，除假手术组外，其余组均行双侧颈动脉结扎(不结扎迷走神经)。各组于3小时后断头取脑称重，以生理盐水制成10％脑均浆，3000r/min 10min，弃上清液留沉淀组织，加双蒸水，在旋涡混
     表8注射用银杏叶(冻干)对大鼠纤维蛋白溶解酶活性的影响
                       ( X±SD n＝0)
分组 剂量   血浆凝块溶解时间(min) 纤维蛋白溶解酶活性(μ)
生理盐水组 4ml/kg     338.2±51.03     30.12±4.40
注射用银杏叶(冻干)高剂量组 提取物15mg/kg     253.9±47.03**     40.63±7.55**
注射用银杏叶(冻干)中剂量组 提取物10mg/kg     264.9±48.57**     38.79±6.80**
注射用银杏叶(冻干)低剂量组 提取物5mg/kg     287.8±39.07*     35.31±4.65*
注：与生理盐水组比较*P＜0.05  **P＜0.01
          表9注射用银杏叶(冻干)对小鼠凝血时间及血小板计数的影响
                            ( X±SD n＝10)
分组 剂量   凝血时间(s)   血小板数(109/L)
生理盐水组 20ml/kg   73.66±28.52     201.04±30.35
注射用银杏叶(冻干)高剂量组 提取物30mg/kg   123.80±35.69**     210.09±28.21
注射用银杏叶(冻干)中剂量组 提取物20mg/kg   117.83±29.25**     193.37±30.30
注射用银杏叶(冻干)低剂量组 提取物10mg/kg   109.06±28.96*     211.10±36.69
注：与生理盐水组比较*P＜0.05  **P＜0.01
           表10注射用银杏叶(冻干)对脑缺血大鼠脑组织MDA含量的影响
                             ( X±SD n＝10)
分组 剂量     MDA(nmol/mg-1)
假手术组 N.S 4ml/kg     0.97±0.24***
脑缺血模型组 N.S 4ml/kg     2.15±0.57
注射用银杏叶(冻干)高剂量组 提取物15mg/kg     1.39±0.37***
注射用银杏叶(冻干)中剂量组 提取物10mg/kg     1.45±0.31**
注射用银杏叶(冻干)低剂量组 提取物5mg/kg     1.62±0.39*
注：与脑缺血模型组比较*P＜0.05  **P＜0.01 ***P＜0.001表十一银杏叶制剂总内酯及BB/总内酯的(％)的比较
品名     生产厂家     总内酯(％)   BB/总内酯(％)
金纳多注射液   德国威玛舒培大药厂     4.27     5.35
注射用银杏叶(冻干)   江西省药物研究和浙江海正药业股份有限公司研制     14.35     40.35
匀器上混匀，使脑细胞溶解。用95％乙醇抽提MDA，以三氯甲烷沉淀蛋白。按丙二醛试剂盒检测方法，分别制作标准管、测定管、空白管，通过MDA与硫代巴比妥酸络合形成红色生成物的原理，采用721分光光度计532nm处进行比色，通过上述三管吸光度计算MDA含量，结果见表10。
表十一是与金纳多注射液中白果内酯(BB)含量比较，本发明的高活性提取物配制的注射剂中保留了较高的含量。
本发明制剂在应用上与普通制剂一样用于预防和治疗心脑血管的疾病。
本发明提供高活性银杏叶提取物的制备方法。
高活性银杏叶提取物制备方法采用将黄酮类化合物和萜内酯类化合物分别提取精制，再按一定比例混合的方法。从现有技术证明，黄酮类化合物和萜内酯类化合物两类具有不同的性质化合物，两类物质同时提取很难同时得到高含有该两类物质的提取物，现有技术也证明，分别提取精制能得到较高含量的两种提取物，但是它们均不同于本发明的目的，并且总黄酮苷的含量最高只能达到48％，本发明对现有技术进一步的改进，使在提取物A中总黄酮苷的含量达到65％以上，在提取物B中总内酯含量达到75％以上，然后将提取物A和提取物B用常规方法，按一定比例混合得到高活性的银杏叶提取物，使混合后的总黄酮苷和总内酯的含量达到65％以上。
我们采用以下的技术方案来实现上述目标：提取物A的制备：将银杏叶初提取物(简称EGb)加水超声提取，取上清液，上聚酰胺柱，用水洗洗脱，弃去保留体积的水，收集所有的内酯流份，供提取银杏叶总内酯用，再用60％乙醇洗脱，以HCl-Mg粉反应为指标，收集洗脱液并在60℃以下减压浓缩，喷雾干燥，得黄棕色粉末，该粉末加丙酮超声提取2次，提取液过滤，浓缩至干，干固物加醋酸乙酯搅拌处理、过滤、取滤渣真空干燥、研细得淡黄色粉末即为目的物。在本发明中，采用减压浓缩，喷雾干燥，避免活性成分高温分解，聚酰胺柱后得到的黄棕色粉末用丙酮超声提取2次，提取液过滤去除不溶物，滤液浓缩至干，干固物加醋酸乙酯搅拌处理，是提高提取物A中的总黄酮苷含量的关键。提取物B的制备：取总黄酮提取物制备过程中的聚酰胺水洗流份，减压浓缩，以下有二种方法：a.由醋酸乙酯提取，提取液真空浓缩，干燥，研细即为目的物；b.浓缩液水洗，冷却，结晶，过滤，得白色内酯结晶物，内酯结晶物经真空干燥，研细备用，母液再用醋酸乙酯提取，取醋酸乙酯提取液，浓缩，真空干燥，研细得浅黄白色的粉末，加入上述内酯结晶物，混合均匀即为目的物。高活性的银杏叶提取物制备：将提取物A和提取物B按(4.20-5.0)∶(1.05-1.80)混合均匀，得到高活性的银杏叶提取物，总黄酮苷和总内酯含量大于65％，银杏酸含量为5ppm以下。
本发明也提供一种冻干粉针制剂制备方法：取高活性银杏叶提取物和乳糖，再加入适量的注射用水，用超声法使之溶解，滴加1mol/L的氢氧化钠溶液，边加边充分搅拌，调节至pH6.5-7.1，加注射用水至足量，充分混合，除菌过滤，分装，置冻干机中，冻干成疏松的块状物，并在冻干机中真空状态下压盖密封。以上工艺中最重要的是用超声法溶解高活性银杏叶提取物，和稀碱液调节pH控制在一定的范围内，它与通常的加温溶解的方法比较，白果内酯不被破坏。白果内酯是一种对缺血性脑组织损伤具有保护作用，能抑制大脑内低氧诱导的膜分解，提高氰化物处理后鸡胚神经元的存活性，诱导提高CA1锥体神经兴奋作用，抑制MPN降低海马和大脑皮质中α-氨基丁酸水平和谷氨酸脱羧酶活性，具有中枢神经的保护作用以及清除自由基等作用。在冻干粉针剂中充分保留作为有效成分的白果内酯也是本发明的特点。
为了更好地理解本发明，以下将举实例说明，但这并不意味是对本发明的限制。
首先对名词进行解释和对检验方法进行说明：
黄酮是指银杏中存在的各种黄酮苷和黄酮苷元类化合物的总称，在本发明的提取物中所含的黄酮主要是槲皮素、山奈素及异鼠李素以苷的形式存在的，所称黄酮苷含量是指提取物经盐酸水解后，其中的黄酮苷水解成苷元，再按HPLC法测定，计算得到的黄酮苷的含量，总内酯是指各种银杏二萜内酯和倍半萜内酯总和。
总黄酮苷含量按下式计算；
总黄酮苷含量＝(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)×2.51。
本发明中所说的总黄酮苷的含量和总内酯含量均按重量百分比表示。
超声提取是借助超声波使有效成分溶出。
                           实施例1
a提取物A的制备方法：
取银杏初提物(EGb总黄酮苷含量＞24％，总内酯含量＞6％)100克，加水超声45min，残渣加水超声处理30min，取上清液上聚酰胺柱(聚酰胺量为银杏叶提取物10倍。上柱前，新用聚酰胺需用水浸泡过夜后，5倍保留体积的水冲洗，备用)，用水洗脱，弃去相当于聚酰胺保留体积水洗液，继续用水洗脱，收集聚酰胺重量的约8倍体积的水，浓缩至1/8体积，供提取总内酯，备用。用水洗脱后的聚酰胺柱，用60％乙醇洗脱，以HCl-Mg粉反应为指标，收集醇洗脱液，真空浓缩，喷雾干燥(进风温度：160℃～180℃，出口风温度80℃～90℃)得黄棕色干燥粉末，加10倍干粉量的丙酮，超声提取2次，滤过，合并滤液，减压蒸干，干固物用10倍量的醋酸乙酯搅拌(100r/min)提取2次，抽滤，取滤渣，真空干燥，干燥物粉碎过100目筛，再于50℃真空干燥24小时，得蛋黄颜色的提取物7.5克，即为提取物A，总黄酮苷的含量为71.8％，提取物A对EGb收率为7.5％。
b提取物B的制备
在提取物A制备过程中，浓缩至1/8体积供提取总内酯用的浓缩液，用浓缩液2/3体积的醋酸乙酯提取，提取液水洗涤二次后，3号砂蕊漏斗滤过，滤液75℃旋转蒸发除去醋酸乙酯，得淡黄白色的发泡物，80℃真空干燥0.5小时，室温真空干燥3小时，粉碎过100目筛，50℃真空干燥24小时，得到疏松淡黄白色总内酯提取物4.7克，总内酯含量为80.6％，BB/总内酯比为46.44％，对EGb的收率为4.7％。
c高活性银杏叶提取物的制备
将提取物A 6.6克，提取物B 1.5克，比例为4.4∶1，混合均匀，得高活性银杏叶提取物8.1克，总黄酮苷和总内酯含量为73.4％，银杏酸含量为5ppm以下。
                            实施例2
取实施例1的高活性提取物8.1g，乳糖130g，加注射用水1.9L，超声30min使溶解，滴加1mol/L NaOH，边加边充分搅拌，调节pH7，加注射用水至2000ml，充分振摇，0.8mm膜粗滤，0.2mm滤膜精滤，灌装(2ml置8ml的西林瓶内)，置西班牙Telstar L-100冻干机冻干。冻干条件为：预冻至-40℃，保持3h；升华干燥：用45min升温至3.0℃，用6h升温至5.0℃，于5.0℃保持6h，用3h升温至35℃；再干燥：于35.0℃保持7h。抽出瓶内空气加塞扎铝盖即得。每瓶含总黄酮苷4.64mg，含总内酯1.14mg，BB/总内酯为40.35％；总黄酮苷和总内酯的含量为71.36％。

Claims (5)

1.一种高活性银杏叶提取物冻干粉针剂，其特征在于该冻干粉针剂含高活性银杏叶提取物，该高活性银杏叶提取物是由银杏叶总黄酮苷提取物(简称为提取物A)和银杏叶总内酯提取物(简称为提取物B)混合而成，提取物A含总黄酮苷为65％以上，提取物B含总内酯75％以上，其中白果内酯在总内酯中的含量为百分之四十以上，提取物A和提取物B混合比例为(4.20-5.0)∶(1.05-1.80)，经混合后的提取物含总黄酮苷和总内酯65％以上，银杏酸含量小于5ppm。
2.根据权利要求1的冻干粉针剂，其特征在于冻干粉针剂中的银杏叶提取物A和银杏叶提取物B是由下述方法制备的：提取物A的制备：取银杏叶初提取物(含银杏黄酮苷大于24％和银杏内酯大于6％，简称EGb)，加水超声提取，取上清液，上聚酰胺柱(EGb与聚酰胺的比例为1∶8-15)，用水洗脱，弃去保留体积的水，收集所有内酯流份，供提取银杏叶总内酯用，继用60％的乙醇洗脱，EGb与洗脱剂60％的乙醇的比例为1∶80-120，洗脱液减压浓缩、喷雾干燥、得黄棕色粉末，该粉末加丙酮超声提取2次，提取液过滤、减压浓缩至干，干固物加醋酸乙酯搅拌处理、过滤、滤渣真空干燥、研细得淡黄色粉末即为提取物A；提取物B的制备：取总黄酮苷提取物制备过程中的聚酰胺用水洗脱的内酯流份，减压浓缩，醋酸乙酯提取，醋酸乙酯提取液真空浓缩、干燥、研细得提取物B；或聚酰胺用水洗脱的内酯流份经浓缩、冷却、结晶、过滤，得白色内酯结晶物，内酯结晶物经真空干燥，研细备用，母液再用醋酸乙酯提取，取醋酸乙酯提取液，浓缩、真空干燥、研细得浅黄白色的粉末，加入上述内酯结晶物，混合均匀即为提取物B。
3.根据权利要求1的冻干粉针剂，其特征在于该冻干粉针剂每瓶含高活性银杏叶提取物7.5-10mg。
4.根据权利要求1的冻干粉针剂，其特征在于该冻干粉针剂用于预防和治疗缺血性脑血管疾病，如脑梗塞、脑中风、老年性认识功能衰退和老年痴呆症等疾病。
5.根据权利要求1的冻干粉针剂，其特征在于该冻干粉针剂用如下方法制备：(1)配方：高活性银杏叶提取物7.5-10克
     乳糖                 110-140克
     注射用水             2000ml(2)工艺过程：取配方量的高活性银杏叶提取物和乳糖加注射用水，用超声溶解，加氢氧化钠溶液调节pH至7左右，加注射用水至足量，无菌过滤，分装，冷冻干燥，得淡黄色的疏松块状物。
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