CN1436074A - 治疗剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于治疗或预防必须增强生长因子产生的疾病的治疗剂和预防剂，以及生长因子产生增强用食品、饮料和饲料，其中以多元酚类、其衍生物和/或其盐；或者多元酚类、其衍生物和/或其盐通过(i)与金属、金属盐和/或金属离子进行混合处理或(ii)进行氧化处理得到的组合物作为有效成分。

Description

治疗剂

技术领域

本发明涉及以多元酚类、其衍生物和/或它们的盐作为有效成分的药物、食品、饮料或饲料。

背景技术

多元酚类是分子内具有数个以上酚性羟基的物质的总称，已知大多来源于植物。广义上包括类黄酮、绿原酸、咖啡酸、二咖啡酰奎尼酸、没食子酸、原花色素苷(proanthocyanin)、棓单宁(gallotannin)等。另外，类黄酮根据基本骨架进一步分类，可以分为黄酮、黄酮醇类、黄烷酮、花青素、查尔酮、异黄酮、黄烷醇、黄烷酮醇等几类，作为黄酮醇类，可以例举杨梅黄酮(myricetin)、五羟黄酮(quercetin)等。作为黄烷醇，可以例举儿茶素类，例如表棓儿茶素棓酸酯(epigallocatechin gallate)等。作为黄烷酮，可以例举异黄腐酚等。作为查尔酮，可以例举黄腐酚B、黄腐酚D等。

作为多元酚类的生理活性，已知主要是抗氧化活性，对于生长因子产生增强活性尚不知道。

神经细胞对于维持人的智能、记忆、感情、行动等精神活动承担着主要的作用。认为在作为这些精神活动基础的神经细胞的分化、生存、功能表达中，对各种神经细胞特异的神经营养因子是必需的。神经营养因子中最初明确了其存在和功能的是神经生长因子(NerveGrowth Factor，以下简称为NGF)，现在发现了来源于脑的神经营养因子(Brain-derived-neurotrophic Factor)、神经营养蛋白(Neurotrophin)-3、神经营养蛋白-4/5等。

由于NGF是前脑基底部的巨细胞型胆碱能神经细胞的神经营养因子，因而与阿耳茨海默型痴呆症之间的关连受到瞩目〔Pharmacia，Vol.22，No.2，147～151(1986)、老年精神医学，Vol.3，No.6，751～758(1986)〕。阿耳茨海默型痴呆症是指伴有发育障碍、病灶症状、下肢强直痉挛、癫痫样发作等临床症状，可见老年斑、阿耳茨海默原纤维变化等病理学表象的疾病，是老年性痴呆的一种疾病类型。在近年来的高龄化社会中可见增加的趋势，得到了社会的极大关心，但是尚未找到这种症状的改善方法、治疗方法。

确认在阿耳茨海默型痴呆症患者的脑中，以迈内特基底核为中心的前脑基底部显著变性，胆碱乙酰基转移酶(CAT)活性显著降低〔Annu.Rev.Neurosci.，Vol.3，77(1980)〕。1985年使用大鼠脑的研究表明NGF是脑的这一部位的神经营养因子〔EMBO J.，Vol.4，1389(1985)〕，NGF与该疾病的关连受到注目。另外，亨廷顿氏舞蹈病患者的脑的纹状体中，GABA能神经细胞的脱落以及胆碱能神经细胞的脱落显著，表明NGF也作用于纹状体的内在性胆碱能神经细胞〔Science，Vol.234，1341(1986)〕，指出该疾病可能与NGF有关。有报道指出用能够成为各种神经疾病模型的大鼠等动物研究了NGF的效果，如果大鼠神经细胞显著变性以前在脑内给予NGF，则可以抑制变性，防止CAT活性降低〔J.N eurosci.，Vol.6，2155(1986)、Brain Res.，Vol.293，305(1985)、Science，Vol.235，214(1986)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.83，9231(1986)〕。已经证明在末梢的交感神经支配组织和脑中生物合成NGF，该NGF的生物合成中末梢组织或脑组织的间质细胞即成纤维细胞或星形神经胶质细胞分别发挥重要作用〔J.Biol.Chem.，Vol.259，1259(1984)、Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.136，57(1986)〕。另外，已经明确该成纤维细胞或星形神经胶质细胞产生的NGF的抗原性、分子量、等电点、生物活性与以前进行了充分研究的颚下腺NGF相同，而且通过在成纤维细胞(L-M细胞)以及星形神经胶质细胞的培养液中加入各种神经传导物质的实验，发现儿茶酚胺类(去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺)显示出NGF产生增强作用〔J.Biol.Chem.，Vol.201，6039(1986)〕。

期待NGF在NGF作为神经营养因子发挥作用的部位发生变性的神经疾病中能够用作抑制变性的治疗药。另外，如脑血管障碍、脑肿瘤、脑栓塞(脑尖)、头部外伤变性疾病、麻醉药物中毒等脑神经细胞一旦发生变性，则一生也不能恢复，结果不仅智力低下、记忆缺陷，还会引起感情障碍、行动异常等各种障碍，但是神经纤维具有可塑性，如果受到损伤，则由其附近的健康正常纤维发芽，形成新的突触代替受伤的突触，因此这时期待能够使用NGF作为促进神经机能修复再生的治疗剂。

但是，将NGF应用于各种神经疾病的治疗时，NGF必须到达需要NGF的神经细胞非常近的地方，中枢神经疾病的场合也必须将NGF送到脑细胞的患处，但是通过血管系统不能将NGF送入脑内。这是由于脑内的血管内皮细胞相互紧密结合(称为血脑屏障)，水、气体、脂溶性物质以外的物质由血液向脑组织的移动受到限制，作为高分子物质的蛋白质(也包括NGF)完全不能通过血脑屏障。即使拥有现在的技术，采用外科方法将该NGF直接给予脑内，危险也过大。

另一方面，也不断开发了增强NGF产生的物质，而不直接给予NGF，但是其中多数是具有很强毒性或出现毒性的浓度与有效浓度非常接近的物质，或者是产生神经兴奋作用等对神经系统有非常严重的副作用的物质等，存在多种问题，至今尚未达到实用化。

接受了部分肝切除的肝脏迅速再生，恢复到原来的大小。该肝再生因子的本体常年以来一直不明确，但是在严重肝炎患者的血浆中发现了肝细胞增殖因子(Hepatocyte growth factor：HGF)，并由其患者血浆分离、纯化了该肝细胞增殖因子(Gohda，E.et al.：J.Clin.Invest.，88414-419，1988)。而且，也克隆了人HGF的cDNA，明确了HGF的1维结构(Miyakawa，K.et al.：Biochem.Biophys.Res.Commun.，163967-973，1989)。另外，已经明确使细胞的运动性亢进的scatter factor(SF)以及肿瘤细胞障碍因子即tumor cytotoxicfactor(TCF)与HGF是同一物质(Weidner，K.M.et al.：Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887001-7005，1991，Shima，N.et al.：Biochem.Biophys.Res.Commun.，180 1151-1158，1991)。

HGF不仅促进肝细胞的增殖，而且促进胆管上皮细胞、肾小管上皮细胞、胃粘膜细胞等多种上皮细胞的增殖。并且诱导在上皮细胞的运动性亢进或者血管新生、上皮细胞的管腔形成中可见的形态形成，HGF是显示非常多样的生理活性的多功能活性物质。即，HGF在各种脏器中，修复其脏器的障碍时促进上皮细胞的增殖，诱导运动性的亢进或血管新生等形态形成等。

HGF显示肝细胞增殖作用、蛋白质合成促进作用、胆汁淤滞改善作用以及预防药物引起肾障碍的作用等。HGF的mRNA也在脑、肾脏、肺等中合成。HGF是促进胆管上皮细胞、肾小管上皮细胞、胃粘膜细胞等多种上皮细胞增殖的中胚叶性细胞生长因子，是具有修复障碍时促进上皮细胞增殖，或诱导运动性亢进、血管新生等形态形成等非常多样的生理活性的多功能活性物质。而且，HGF也具有保护神经细胞、促进增殖、修复障碍的作用等。因此，期待通过增加HGF的产生，能够治疗或预防肝炎、重症肝炎、剧症肝炎、肝硬化、肝内胆汁淤滞等肝障碍、药物等引起的肾障碍、胃肠障碍、血管障碍、慢性肾炎、肺炎、创伤、糖尿病、癌症等。

由于HGF显示上述各种作用，因此期待HGF自身作为肝炎、重症肝炎、剧症肝炎、肝硬化、肝内胆汁淤滞等肝障碍、药物等引起的肾障碍、胃肠障碍、血管障碍、慢性肾炎、肺炎、创伤、糖尿病、癌症等的治疗药，但是HGF本身作为治疗药并没有得以实际应用。而且，在基因治疗中也尝试了导入HGF基因的方法，但是由于在不必要的时间、场所发挥作用而产生的副作用，因而距离实际应用尚很遥远。这样，认为如果能够任意地增强HGF，而不是从外部给予，则对于治疗和预防肝炎、重症肝炎、剧症肝炎、肝硬化、肝内胆汁淤滞等肝障碍、药物等引起的肾障碍、胃肠障碍、血管障碍、慢性肾炎、肺炎、创伤、糖尿病、癌症等必须增强HGF产生的疾病有效，但是至今尚未实际应用。

因而，虽然认为通过增强生长因子能够治疗或预防与该生长因子有关的各种疾病，但是目前尚不知道不显示毒性或副作用，能够根据需要适当增强生长因子产生的物质、方法等。

发明公开

本发明人进行了悉心研究，结果发现多元酚类、其衍生物或它们的盐具有生长因子产生增强作用，从而完成了本发明。

也就是说，本发明涉及：

〔1〕一种必须增强生长因子产生的疾病的治疗剂或预防剂，其特征在于，含有下述物质作为有效成分：

(i)选自多元酚类、其衍生物和它们的盐中的至少1种，或者

(ii)选自多元酚类、其衍生物和它们的盐中的至少1种通过下述处理得到的组合物，

(A)与选自金属、金属盐和金属离子中的至少1种的混合处

   理，或者

(B)氧化处理，

〔2〕如上述〔1〕所述的治疗剂或预防剂，多元酚类是选自类黄酮、没食子酸、绿原酸、隐绿原酸(cryptochlorogenic acid)、新绿原酸、咖啡酸和二咖啡酰奎尼酸中的至少1种，

〔3〕如上述〔2〕所述的治疗剂或预防剂，类黄酮是选自黄酮醇类、黄烷酮、查尔酮和黄烷醇中的至少1种，

〔4〕如上述〔3〕所述的治疗剂或预防剂，黄酮醇类是杨梅黄酮和/或五羟黄酮，黄烷酮是异黄腐酚，查尔酮是黄腐酚B和/或黄腐酚D，黄烷醇是表棓儿茶素棓酸酯，

〔5〕如上述〔1〕～〔4〕中任意一项所述的治疗剂或预防剂，多元酚类的衍生物是多元酚类的羧酸酯和/或糖苷，

〔6〕如上述〔5〕所述的治疗剂或预防剂，多元酚类的羧酸酯是咖啡酸甲酯和/或咖啡酸乙酯，多元酚类的糖苷是异东方蓼黄素，

〔7〕如上述〔1〕～〔6〕中任意一项所述的治疗剂或预防剂，金属是选自铁、锰、镁、铜、锌、银、金、铝、钙、镍、钴中的至少1种，金属盐是含有上述金属的盐，金属离子是上述金属的离子，

〔8〕如上述〔1〕～〔7〕中任意一项所述的治疗剂或预防剂，生长因子是肝细胞增殖因子或神经生长因子，

〔9〕一种生长因子产生增强用的食品、饮料或饲料，其特征在于，含有下述物质作为有效成分：

(i)选自多元酚类、其衍生物和它们的盐中的至少1种，或者

(ii)选自多元酚类、其衍生物和它们的盐中的至少1种通过下述处理得到的组合物，

(A)与选自金属、金属盐和金属离子中的至少1种的混合处

   理，或者

(B)氧化处理，

〔10〕如上述〔9〕所述的食品、饮料或饲料，多元酚类是选自类黄酮、没食子酸、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、咖啡酸和二咖啡酰奎尼酸中的至少1种，

〔11〕如上述〔10〕所述的食品、饮料或饲料，类黄酮是选自黄酮醇类、黄烷酮、查尔酮和黄烷醇中的至少1种，

〔12〕如上述〔11〕所述的食品、饮料或饲料，黄酮醇类是杨梅黄酮和/或五羟黄酮，黄烷酮是异黄腐酚，查尔酮是黄腐酚B和/或黄腐酚D，黄烷醇是表棓儿茶素棓酸酯，

〔13〕如上述〔9〕～〔12〕中任意一项所述的食品、饮料或饲料，多元酚类的衍生物是多元酚类的羧酸酯和/或糖苷，

〔14〕如上述〔13〕所述的食品、饮料或饲料，多元酚类的羧酸酯是咖啡酸甲酯和/或咖啡酸乙酯，多元酚类的糖苷是异东方蓼黄素，

〔15〕如上述〔9〕～〔14〕中任意一项所述的食品、饮料或饲料，金属是选自铁、锰、镁、铜、锌、银、金、铝、钙、镍、钴中的至少1种，金属盐是含有上述金属的盐，金属离子是上述金属的离子，

〔16〕如上述〔9〕～〔15〕中任意一项所述的食品、饮料或饲料，生长因子是肝细胞增殖因子或神经生长因子，

〔17〕一种组合物，由选自多元酚类、其衍生物和它们的盐中的至少1种通过下述处理得到，

(A)与选自金属、金属盐和金属离子中的至少1种的混合处

   理，或者

(B)氧化处理，

〔18〕如上述〔17〕所述的组合物，多元酚类是绿原酸和/或咖啡酸，衍生物是上述多元酚类的羧酸酯和/或糖苷，

〔19〕如上述〔17〕或〔18〕所述的组合物，金属是选自铁、锰、镁、铜、锌、银、金、铝、钙、镍、钴中的至少1种，金属盐是含有上述金属的盐，金属离子是上述金属的离子，

〔20〕如上述〔17〕～〔19〕中任意一项所述的组合物，具有生长因子产生增强作用，

〔21〕如上述〔20〕所述的组合物，生长因子是肝细胞增殖因子或神经生长因子。

附图说明

图1是来源于当归根部的级分18-3的MS图谱。

图2是来源于当归根部的级分18-3的¹H-NMR波谱。

图3是来源于当归根部的级分28的MS图谱。

图4是来源于当归根部的级分28的¹H-NMR波谱。

图5是来源于黄腐酚级分的级分A-5的MS图谱。

图6是来源于黄腐酚级分的级分A-5的¹H-NMR波谱。

发明的实施方式

本发明中的有效成分是(i)选自多元酚类、其衍生物和它们的盐中的至少1种(以下，有时称为多元酚类等)或者(ii)选自多元酚类、其衍生物和它们的盐中的至少1种通过下述处理得到的组合物，所述处理为(A)与选自金属、金属盐和金属离子中的至少1种的混合处理，或者(B)氧化处理。该有效成分的生长因子产生增强作用是通过多元酚类、其衍生物或它们的盐发挥的，这些物质可以简便地制备，根据其各种生理功能在药物、食品等广泛领域非常有用。另外，该多元酚类等通过进行上述(A)或(B)的处理，可以增强其生长因子产生增强作用。因此，上述组合物更优选作为本发明的有效成分。上述多元酚类等的生长因子产生增强作用以及该多元酚类等通过上述处理增强上述作用是本发明首次发现的。

另外，在本说明书中，“生长因子产生增强作用”以及“生长因子产生增强活性”分别是指导致生长因子产生增强以及增强生长因子产生的功能，在其含义上并没有特别严格的区别。“增强”包括与本发明的有效成分作用前相比，在作用后目的物质的量增加的方式，以及通过使本发明的有效成分发挥作用产生目的物质的方式(诱导)。另外，本说明书中作为有效成分列举的任意一种物质可以单独或者2种以上混合用于本发明。

本发明中使用的多元酚类只要具有生长因子产生增强作用，并没有特别的限定。例如属于黄酮醇类、查尔酮、异黄酮、花色素苷、黄烷醇、黄烷酮、黄酮、2-次苯甲基苯并呋喃酮、黄烷酮醇等类黄酮的物质，属于没食子酸、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、咖啡酸、鞣花酸、二咖啡酰奎尼酸等非类黄酮的物质均可以使用。另外，原花色素苷等缩合型、棓单宁、鞣花单宁等水解型的聚合物多元酚也包括在本发明的多元酚中。从表现出本发明所需的效果的观点出发，作为多元酚类，优选选自类黄酮、没食子酸、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、咖啡酸和二咖啡酰奎尼酸中的至少1种。作为二咖啡酰奎尼酸，特别优选3，5-二咖啡酰奎尼酸。另外，作为上述类黄酮，优选选自黄酮醇类、黄烷酮、查尔酮和黄烷醇中的至少1种。作为上述黄酮醇类有莰非醇(kaemferol)、杨梅黄酮、五羟黄酮等，优选杨梅黄酮和/或五羟黄酮。作为上述黄烷酮，优选异黄腐酚。作为上述查尔酮，优选黄腐酚B和/或黄腐酚D。作为上述黄烷醇，有儿茶素类等，优选表棓儿茶素棓酸酯。另外，只要具有生长因子产生增强作用，光学异构体、酮-烯醇互变异构体、几何异构体等各种异构体也可以在本发明中使用，可以是各种异构体的纯化物，也可以是其混合物。本发明中使用的多元酚类可以采用公知的方法制备，例如可以由植物(如艾蒿、当归、竹、洋李、稻、大豆、菊、茼蒿、蛇麻花、mulukhiya(モロヘイヤ)、紫郁金、郁金等)的果实、种子、种皮、花、叶、茎、根或根茎分离、纯化。另外，也可以使用市售的多元酚类。另外，也可以直接使用合有多元酚类的植物的提取物。

作为本发明中的多元酚类的衍生物没有特别的限定，例如多元酚类的羧酸酯、糖苷、硫酸化物等，只要具有生长因子产生增强作用，均可以用于本发明。作为该衍生物，优选多元酚类的羧酸酯和/或糖苷。作为上述多元酚类的羧酸酯，例如与具有脂肪族基团、芳香族基团或芳香脂肪族基团的羧酸形成的酯。该羧酸可以是具有不饱和烃的羧酸，也可以是氢原子被卤素或官能团，例如羟基、氨基、酮基等取代的羧酸。可以是多元酚类中存在的酚性羟基全部与羧酸成酯得到的衍生物，可以是这些羟基部分残留的衍生物。作为多元酚类的羧酸酯，优选作为多元酚类上述例举的适于作为有效成分的化合物的羧酸酯，更优选咖啡酸的羧酸酯--咖啡酸甲酯和/或咖啡酸乙酯。另外，作为类黄酮的莰非醇(kaemferol，ケンフエロ-ル)、杨梅黄酮、五羟黄酮、异黄腐酚、黄腐酚B、黄腐酚D或表棓儿茶素棓酸酯的羧酸酯均优选。

另外，作为多元酚类的糖苷，例如葡萄糖、苏阿糖、核糖、芹菜糖、阿洛糖、鼠李糖、吡喃阿拉伯糖、核酮糖、木糖、半乳糖、甘露糖、塔罗糖、岩藻糖、果糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等单糖，新橙皮糖(neohesperidose)、芸香糖、琼脂二糖、异麦芽糖、蔗糖、木二糖(xylobiose)、黑曲霉二糖、麦芽糖、乳糖等二糖，以及琼脂糖、岩藻依聚糖等多糖等的糖苷。另外，作为糖苷，除了该多元酚类和糖通过O-、N-、S-或C-糖苷键结合的化合物以外，还包括与糖的还原末端以外的碳通过C-C键结合的化合物。作为多元酚类的糖苷，优选黄酮的1种即藤黄菌素的糖苷--异东方蓼黄素。另外，作为多元酚类的糖苷，优选作为多元酚类上述例举的适于作为有效成分的化合物的糖苷。另外，作为类黄酮的莰非醇、杨梅黄酮、五羟黄酮、异黄腐酚、黄腐酚B、黄腐酚D或表棓儿茶素棓酸酯的糖苷均优选。

而且，多元酚类的衍生物也包括例如通过生物体内的水解反应能够发挥生长因子产生增强作用的作为所谓前药发挥功能的化合物。

上述多元酚类的衍生物可以按照公知的方法适当制备。

作为本发明的多元酚类或衍生物的盐，例如碱金属盐、碱土金属盐、与有机碱形成的盐等。可以例举与钠、钾、钙、镁、铵或二乙醇胺、乙二胺形成的盐等。这些盐可以通过例如按照公知的方法使多元酚类的酚性羟基等转变成盐获得。作为所述的盐，优选药理学上允许的盐。

另外，作为本发明的有效成分，优选使用上述组合物，即选自多元酚类、其衍生物和它们的盐中的至少1种通过下述处理得到的组合物，所述处理为(A)与选自金属、金属盐和金属离子中的至少1种的混合处理，或者(B)氧化处理。通过上述(A)或(B)的处理，能够增强上述多元酚类等的生长因子产生增强作用。因此，该组合物与上述多元酚类等相比更适于作为有效成分。另外，作为多元酚类等，可以例举作为多元酚类在上述例举的适于作为有效成分的化合物、该化合物的衍生物以及它们的盐，其中优选绿原酸和/或咖啡酸、它们的衍生物以及它们的盐。另外，作为衍生物优选绿原酸和/或咖啡酸的羧酸酯和/或糖苷。所述组合物自身也包括在本发明中。

作为本发明中使用的金属，没有特别的限定，优选例如选自铁、锰、镁、铜、锌、银、金、铝、钙、镍和钴中的至少1种金属元素单质。作为金属盐，优选含有上述金属的盐，例如与该金属形成的硫酸盐、醋酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐、氯化物等。另外，也可以使用含有络离子的络盐。所谓金属离子是指将这些金属和/或金属盐溶解于例如水性液中生成的金属离子，优选使用选自Fe²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Mn³⁺、Mg²⁺、Cu⁺、Cu²⁺、Cu³⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Ag²⁺、Au⁺、Au³⁺、Al³⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Co²⁺和Co³⁺中的至少1种。

上述多元酚类等的(A)与选自金属、金属盐和金属离子中的至少1种(以下，有时称为金属等)的混合处理，通过使上述多元酚类等与金属等接触进行。例如通过下述步骤进行，即在适当的溶剂中，将多元酚类和金属盐混合，使摩尔比(多元酚类/金属盐)优选达到0.01～10000，更优选达到1～100，优选在0～100℃下，更优选在室温(25℃)下，放置优选5分钟～10天，更优选30分钟～1天。作为该溶剂，例如可以单独或者作为混合液使用水、氯仿、乙醇、甲醇、异丙醇等醇类，丙酮、甲乙酮等酮类，乙酸甲酯、乙酸乙酯等亲水性或亲油性溶剂，优选使用水。在混合处理中，优选作为处理对象的多元酚类等和金属等一同溶解于溶剂中。另外，也可以在由植物提取多元酚类的步骤中，通过进行上述混合处理，得到上述组合物。例如，通过预先在提取溶剂中添加上述金属等，提取后，例如放置数分钟～数小时，也可以得到上述组合物。

通过混合处理得到的组合物的结构尚不明确，推测是例如多元酚类等与金属等通过某种结合生成了例如络合物，或者没有结合以简单混合的状态存在等。

上述多元酚类等的(B)氧化处理，通过例如将多元酚类供于与氧接触进行氧化、利用氧化剂的氧化、利用氧化酶的氧化、电氧化等工序进行。均可以按照公知的方法进行。例如，通过与氧接触进行氧化时，可以通过对溶解于水溶液中的多元酚类经由泵送入空气进行。利用氧化剂的氧化，优选使用过氧化氢、臭氧、银、铜、铁、镍、锰、钴、铬等作为氧化剂进行。利用氧化酶的氧化，优选使用酪氨酸酶、过氧化物酶等作为氧化酶进行。另外，利用氧化酶的氧化中，也包括利用含有上述例举的氧化酶的微生物进行的氧化。另外，进行电氧化时，可以通过使用例如铂、氧化铅、碳、石墨、氧化铂等作为电极的阳极氧化反应进行氧化。

通过氧化处理得到的组合物的结构尚不明确，推测是多元酚类等简单氧化，或者发生聚合作为聚合物存在等。

另外，作为有效成分使用的组合物只要是经过上述(A)或(B)处理得到的物质，并没有特别的限定，因此也可以使用通过包括上述(A)或(B)处理步骤的处理方法(即，包括上述(A)或(B)的处理步骤以外的步骤的处理方法)得到的物质。另外，上述处理后的上述多元酚类等可以在处理后直接作为组合物使用，另一方面，只要能够获得所需的效果，也可以根据需要按照公知的精制步骤进行精制后使用。

本发明的有效成分也可以与公知的具有生长因子产生增强作用的物质组合使用，而且也可以将多元酚类等通过与金属等进行混合处理得到的组合物与多元酚类等通过氧化处理得到的组合物组合使用。

本发明的有效成分如上所述，均具有生长因子产生增强作用。这种作用的表达可以通过例如下述实施例1和17所示的方法进行评价。

本发明的有效成分如下所述确认没有特别的毒性。另外，也不必担心产生副作用。因而，可以安全且适当地增强生长因子的产生。因此，含有该有效成分的本发明的治疗剂、预防剂、食品、饮料或饲料对于治疗或预防必须增强生长因子产生的疾病有效。

本发明中，所谓生长因子只要具有促进细胞生长的活性即可，并没有特别的限定，例如肝细胞增殖因子(HGF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子、上皮生长因子、来源于乳的生长因子、成纤维细胞生长因子、来源于脑的成纤维细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、来源于血小板的生长因子、血小板碱性蛋白质、结缔组织活化肽、胰岛素样增殖因子、集落形成刺激因子、红细胞生成素、血小板生成素、T细胞生长因子、白介素类(例如白介素2、3、4、5、7、9、11、15)、B细胞生长因子、来源于软骨的因子、来源于软骨的生长因子、来源于骨的生长因子、骨骼生长因子、内皮细胞生长因子、来源于内皮细胞的生长因子、来源于眼的生长因子、来源于睾丸的生长因子、来源于塞尔托利氏细胞的生长因子、乳腺刺激因子、来源于脊髓的生长因子、来源于巨噬细胞的生长因子、再循环间叶生长因子、性状转化增殖因子-α性状转化增殖因子-β、肝素结合性EGF样增殖因子、双调蛋白、SDGF、β-动物纤维素(betacellulin)、表皮整联配体蛋白(epireguiun)、神经调节蛋白1，2，3、血管内皮增殖因子、神经营养蛋白、BDNF、NT-3、NT-4、NT-5、NT-6、NT-7、来源于神经胶质细胞株的神经营养因子、干细胞因子、midkine、pleiotrophin、Ephrin、血管形成素(Angiopoietin)、活化素、肿瘤坏死因子、干扰素类等。按照本发明，可以特别好地增强神经生长因子(NGF)或肝细胞增殖因子(HGF)的产生。

HGF是肝细胞的再生因子，而且也是使细胞运动亢进的因子以及肿瘤细胞障碍因子。HGF不仅促进肝细胞的增殖，而且促进胆管上皮细胞、肾小管上皮细胞、胃粘膜细胞等多种上皮细胞的增殖。另外，HGF显示诱导在上皮细胞的运动性亢进或者血管新生、上皮细胞的管腔形成中可见的形态形成等非常多样的生理活性。因此，通过增强HGF的产生，能够治疗或预防例如肝炎、重症肝炎、剧症肝炎、肝硬化、肝内胆汁淤滞等肝障碍、药物等引起的肾障碍、胃肠障碍、血管障碍、慢性肾炎、肺炎、创伤、糖尿病、癌症等。

另一方面，NGF是维持神经细胞的生存和功能，或随着NGF的浓度梯度使神经细胞伸长的内因性生长因子，通过增强NGF的产生，可以治疗或预防阿耳茨海默病等老年痴呆症、末梢神经障碍、脑血管障碍、脑肿瘤、脑栓塞(脑尖)、头部外伤变性疾病、麻醉药物中毒等引起的需要修复或再生神经功能的疾病。另外，对于治疗或预防肌肉萎缩性侧索硬化症、药物障碍性末梢神经障碍、糖尿病性末梢神经障碍、帕金森氏病、感觉神经障碍、色素性视网膜症、黄斑变性症等也有用。

作为本发明中必须增强生长因子产生的疾病，只要是通过采用含有上述有效成分的治疗剂、预防剂等增强生长因子的产生能够治疗或预防的疾病即可，并没有特别的限定，对于如上所述例举的通过增强HGF或NGF产生能够治疗或预防的各种疾病特别有效。

作为本发明的必须增强生长因子产生的疾病的治疗剂或预防剂，可以例举将本发明的上述有效成分与公知的药用载体组合进行制剂得到的物质。在本发明的实施方式中，作为有效成分的盐使用药学上允许的盐。

本发明的治疗剂或预防剂的制备通常可以通过将上述有效成分与药学上允许的液状或固体状载体配合进行，根据需要加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等，制成片剂、颗粒剂、散剂、粉末剂、胶囊剂等固体制剂、常规溶液剂、悬浊剂、乳剂等液体制剂。另外，也可以制成使用前添加适当载体能够形成液状的干燥品以及其它外用制剂。

药用载体可以根据治疗剂或预防剂的给药方式和剂型进行选择。制成由固体组合物构成的口服制剂的场合，可以制成片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、细粒剂、颗粒剂等，可以利用例如淀粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。另外，配制口服制剂时，也可以进一步配合粘结剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、助流剂、矫味剂、着色剂、香料等。例如，制成片剂或丸剂时，可以根据需要用蔗糖、明胶、羟丙基纤维素等糖衣或者胃溶性或肠溶性物质的膜包覆。制成由液体组合物构成的口服制剂的场合，可以制成药理学上允许的乳浊剂、溶液剂、悬浊剂、糖浆剂等，可以利用例如蒸馏水、乙醇等作为载体。另外，也可以根据需要进一步添加润湿剂、悬浮剂等助剂、甜味剂、风味剂、防腐剂等。

另一方面，非口服制剂的场合，可以按照常规方法使本发明的上述有效成分溶解或悬浊于作为稀释剂的注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，根据需要加入杀菌剂、稳定剂、等渗剂、止痛剂等进行配制。另外，也可以制备固体组合物，在使用前溶解于无菌水或无菌的注射用溶剂中后进行使用。

作为外用制剂，包括经皮给药用或经粘膜(口腔内、鼻腔内)给药用的固体、半固体状或液体状的制剂。另外，也包括栓剂等。例如，可以制成乳剂、洗剂等乳浊剂、外用酊剂、经粘膜给药用液体制剂等液体状制剂、油性软膏、亲水性软膏等软膏剂、膜剂、硬膏剂(带剂)、巴布剂等经皮给药用或经粘膜给药用的贴剂等。

以上各种制剂，可以分别利用公知的药用载体等，适当采用常规方法进行制备。另外，所述制剂中有效成分的含量考虑其给药形态、给药方法等，只要是能够以下述给药量范围给予该有效成分的量即可，并没有特别的限定。

本发明的治疗剂和预防剂可以根据制剂形态采用适当的给药途径给药。给药方法也没有特别的限定，可以内用、外用和注射。注射剂可以在如静脉内、肌肉内、皮下、皮内等给药，关于外用制剂，例如可以采用其适当的给药方法给予栓剂。

本发明的治疗剂或预防剂的给药量并不是一定的，可以根据其制剂形态、给药方法、使用目的以及该治疗剂或预防剂的给药对象即患者的年龄、体重、症状适当设定。一般，制剂中含有的上述有效成分的给药量，优选成人每天为0.1μg～200mg/kg体重。当然给药量根据种种条件变化，因此有时采用低于上述给药量的量就足够，或者有时必须超过上述范围。在所需的给药量范围内，可以1日内单次给药，或者分成数次给药。另外，本发明的治疗剂或预防剂除了直接口服给药之外，也可以添加到任意的饮食品中使之日常摄取。

另外，作为本发明的另一种方式，还提供含有本发明的上述有效成分的生长因子产生增强剂。作为该增强剂，可以是上述有效成分本身，另外也可以是含有上述有效成分的组合物。在本发明的方式中，作为有效成分的盐优选药理学上允许的盐。生长因子产生增强剂例如可以将上述有效成分以及能够用于与该有效成分相同用途的其它成分等配合，按照上述治疗剂或预防剂的制备方法制成通常使用的试剂形态。所述增强剂中上述有效成分的含量考虑该增强剂的给药方法、使用目的等，只要是能够得到本发明所需效果的量即可，没有特别的限定。另外，该增强剂的用量也是只要能够得到本发明所需的效果即可，没有特别的限定。特别是给予生物体使用时，优选以能够在上述治疗剂或预防剂中有效成分的给药量范围内给予有效成分的量进行使用。生长因子产生增强剂对于必须增强生长因子产生，特别是增强HGF或NGF产生的疾病中该生长因子的增强有用。另外，该增强剂对于有关生长因子的疾病用药物的筛选也有用。另外，该增强剂可以用于上皮细胞活化方法，该方法对于有关上皮细胞机理的生物化学研究以及肝脏障碍、肾脏障碍、胃肠障碍、血管障碍的药物筛选有用。另外，该增强剂对于生长因子的功能研究也有用。

而且，作为本发明的另一种方式，还提供将本发明的上述有效成分给予动物的生长因子产生增强方法。在本发明的方式中，作为有效成分的盐优选药理学上允许的盐。所述方法可以通过对预测必须增强生长因子产生或者必须增强生长因子产生的动物，给予上述有效成分进行，优选作为上述生长因子产生增强剂给予，通过这种给药可以增强生长因子的产生。有效成分的给药方法、给药量等可以与上述生长因子产生增强剂的场合同样。另外，在生长因子产生增强方法中，也可以使用本发明的治疗剂或预防剂、下述的食品、饮料或饲料。另外，作为“动物”，可以例举哺乳动物的人、狗、猫、牛、猪、马等，其中优选用于人。所述生长因子产生增强方法对于例如治疗或预防必须增强生长因子产生的疾病时增强该生长因子产生是有用的。另外，该增强方法对于有关生长因子的疾病用药物的筛选有用。另外，该增强方法对于生长因子的功能研究也有用。

另外，本发明还提供含有上述有效成分的生长因子产生增强用食品、饮料或饲料。本发明的方式中，作为有效成分的盐优选药学上允许的盐、或具有与其同等安全性的盐。本发明的食品、饮料或饲料由于其生长因子产生增强作用，对于必须增强生长因子产生的疾病的症状改善、预防非常有用。

另外，本发明的方式中，“含有”这一用语包括含有、添加、稀释的含义，“含有”是指食品、饮料或饲料中含有本发明使用的有效成分这种方式，“添加”是指在食品、饮料或饲料的原料中添加本发明使用的有效成分这种方式，“稀释”是指在本发明使用的有效成分中添加食品、饮料或饲料的原料这种方式。

本发明的食品、饮料或饲料的制备方法没有特别的限定。例如可以按照配合、烹调、加工等一般食品、饮料或饲料的制备方法进行，只要可以按照这些制备方法进行制备，且制得的食品、饮料或饲料中含有具有生长因子产生增强作用的本发明上述有效成分即可。

作为本发明的食品或饮料，没有特别的限定，例如含有本发明的上述有效成分的谷类加工品(小麦粉加工品、淀粉加工品、预混合加工品、面类、通心粉类、面包类、馅类、荞麦面类、麸子、米粉、粉条、包装饼等)，油脂加工品(增塑性油脂、油炸用油、色拉油、蛋黄酱类、调味汁等)，大豆加工品(豆腐类、豆酱、纳豆等)，肉类加工品(火腿、熏猪肉、压缩火腿、香肠等)，水产品(冷冻碎鱼肉、鱼糕、鱼卷、鱼肉山芋蒸饼、油炸鱼丸子、汆鱼丸子、饭卷、鱼肉火腿、香肠、干狐鲣、鱼子加工品、水产品罐头、煮的鱼贝等)，乳制品(原料乳、乳酪、酸乳、奶油、干酪、炼乳、乳粉、冰淇淋等)，蔬菜·果实加工品(馅类、果酱类、腌菜类、果类饮料、蔬菜饮料、混合饮料等)，糖果类(巧克力、饼干类、甜点类、蛋糕、年糕、米糕类等)，酒精饮料(日本酒、中国酒、葡萄酒、威士忌酒、日本蒸馏酒、伏特加酒、白兰地、杜松子酒、朗姆酒、啤酒、清凉醇饮料、果酒、利口酒等)，嗜好饮料(绿茶、红茶、乌龙茶、咖啡、清凉饮料、乳酸饮料等)，调料(酱油、辣酱油、醋、料酒等)，罐装、瓶装、袋装食品(牛肉盖饭、小锅什锦饭、红小豆饭、咖哩饭、其它各种烹调好的食品)，半干燥或浓缩食品(肝酱、其它涂抹果酱的食品、荞麦·面条的汁、浓缩的汤类)，干燥食品(速食面类、速食咖哩饭、速溶咖啡、果汁粉、汤粉、速食酱类、烹调好的食品、烹调好的饮料、烹调好的汤等)，冷冻食品(素烧、蒸鸡蛋羹、烤鳗鱼串、汉堡包、烧麦、饺子、各种面条、鸡尾酒等)，固态食品、液态食品(汤等)，香辣料类等农产·林产加工品、畜牧加工品、水产加工品等。

在本发明的食品或饮料中，上述有效成分可以含有、添加和/或稀释1种或数种，只要含有表达其生长因子增强作用所必需的量，对其形状没有特别的限定，包括片状、颗粒状、胶囊状等形状的可以口服摄取的形状物。

本发明的食品或饮料中的上述有效成分的含量没有特别的限定，可以从其功能和作用表达的观点出发适当选择，例如每100重量份食品优选为0.0001重量份以上，更优选0.001～10重量份，例如每100重量份饮料优选为0.0001重量份以上，更优选0.001～10重量份。另外，本发明的食品或饮料优选其中含有的有效成分例如成人每天最好摄取达到0.01～100mg/kg体重。

另外，本发明还提供一种含有、添加和/或稀释上述有效成分而成的具有生长因子产生增强作用的生物用饲料，而且作为另一种方式，还提供一种生物的饲养方法，其特征在于，将上述有效成分给予生物。另外，作为本发明的另一种方式，还提供一种生物饲养用剂，其特征在于，含有上述有效成分。

在这些发明中，生物是指例如养殖动物、宠物等，作为养殖动物，例如家畜、试验动物、家禽、鱼类、甲壳类或贝类。作为饲料，例如身体状况的维持和/或改善用饲料。作为生物饲养用剂，例如浸渍用剂、饲料添加剂、饮料用添加剂。

按照这些发明，对于适用其的以上例举的生物，基于本发明使用的上述有效成分的生长因子产生增强作用，可以期待出现与本发明的上述治疗剂或预防剂同样的效果。也就是说，按照这些发明，可以期待出现该生物的需要生长因子产生增强作用的疾病的治疗或预防效果。

本发明中使用的上述有效成分通常是每1kg对象生物的体重，每天优选给予0.01～2000mg。给药可以通过例如将该有效成分添加、混合到供给对象生物的人工配合饲料的原料中，或与人工配合饲料的粉末原料混合后，再添加、混合到其它原料中进行。另外，上述有效成分在饲料中的含量没有特别的限定，可以根据目的适当设定，优选0.001～15重量％的比例。

作为人工配合饲料，例如以鱼粉、酪蛋白、乌贼粉等动物性原料，大豆粕、小麦粉、淀粉等植物性原料，饲料用酵母等微生物原料，鳕鱼肝油、乌贼肝油等动物性油脂，大豆油、菜籽油等植物性油脂，维生素类、矿物类、氨基酸、抗氧化剂等为原料的人工配合饲料。另外，还例如鱼肉绞碎物等鱼类用饲料。

本发明饲料的制备方法没有特别的限定，另外配合只要按照一般饲料进行即可，只要制得的饲料中含有具有生长因子产生增强作用的本发明的上述有效成分即可。

另外，也可以通过将具有生长因子产生增强作用的本发明的上述有效成分直接添加到池塘、水槽、贮水池或饲养区域的水、海水等中，浸渍对象生物给药。这种浸渍方法在对象生物的饲料摄取量低下时特别有效。水或海水中具有生长因子产生增强作用的本发明有效成分的浓度没有特别的限定，可以根据目的使用，优选0.00001～1重量％的比例。

另外，也可以将含有具有生长因子产生增强作用的本发明的上述有效成分的饮料作为饲养用饮料使对象生物摄取。该饮料中具有生长因子产生增强作用的本发明使用的有效成分的浓度没有特别的限定，可以根据目的使用，优选0.0001～1重量％的比例。含有具有生长因子产生增强作用的本发明上述有效成分的生物饲养用剂，例如浸渍用剂、饲料添加剂、饮料用添加剂可以按照其本身公知的配合和制备方法制备。该生物饲养用剂中有效成分的含量只要能够得到本发明所需的效果即可，并没有特别的限定。

本发明可以适用的生物没有限定，作为养殖动物，例如马、牛、猪、羊、山羊、骆驼、驼羊等家畜，小鼠、大鼠、土拨鼠、兔等实验动物，鸡、鸭、火鸡、鸵鸟等家禽，真鲷、石鲷、比目鱼、鲽鱼、鱼师鱼、黄尾笛鲷、黄条鱼师、金枪鱼、大甲参、香鱼、鲑类、河豚、鳗鲡、泥鳅、鲇鱼等鱼类，对虾、黑虎虾、对虾(タイシヨウエビ)、青蟹等甲壳类等，鲍、蝾螺、扇贝、牡蛎等贝类，作为宠物，例如狗、猫等，可以广泛适用于陆上、水中动物。

通过使之摄取含有具有生长因子产生增强作用的本发明使用的上述有效成分的饲料，或者将对象生物浸渍在含有具有生长因子产生增强作用的本发明使用的上述有效成分的液体中，能够良好地维持或改善家畜、实验动物、家禽、鱼类、甲壳类、贝类、宠物等的身体状况。

而且，作为本发明的另一种方式，提供本发明的上述有效成分在制备必须增强生长因子产生的疾病的治疗剂或预防剂、生长因子产生增强剂或者生长因子产生增强用食品、饮料或饲料中的用途。作为所述用途的方式，可以例举上述有效成分在制备本发明的上述治疗剂或预防剂、生长因子产生增强剂或者生长因子产生增强用食品、饮料或饲料中的用途的方式。例如，作为上述有效成分在制备必须增强生长因子产生的疾病的治疗剂或预防剂或者生长因子产生增强剂中的用途，可以例举在制备上述片剂、颗粒剂、散剂、粉末剂、胶囊剂等固体制剂、常规溶液剂、悬浊剂、乳剂等液体制剂，或使用前添加适当载体能够形成液状的干燥品中的用途。

本发明中使用的上述有效成分即使供于表达其作用的有效量，也确认没有毒性。例如口服给药的场合，即使将莰非醇、杨梅黄酮、五羟黄酮、异黄腐酚、黄腐酚B、黄腐酚D、表棓儿茶素棓酸酯、没食子酸、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、咖啡酸、二咖啡酰奎尼酸、异东方蓼黄素、咖啡酸甲酯、咖啡酸乙酯或其光学活性体或它们的盐中任意一种对小鼠以1g/kg单次给药，也确认没有死亡例。

以下结合实施例更具体地说明本发明，但是本发明并不受这些实施例的任何限定。另外，只要没有特别的说明，实施例中的％表示重量％。另外，有时将级分称为部分。实施例1杨梅黄酮和五羟黄酮的HGF产生增强活性

将悬浊于含有10％胎牛血清的DME培养基中达到5×10⁴cells/cm²的MRC-5细胞(CCL 171：大日本制药社制，code.02-021)加入48孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂存在下培养24小时后，更换培养基。之后添加试样，再培养24小时后，回收培养基，使用Quantikine Human Hepatocyte Growth Factor(HGF)ELISA Kit(Funakoshi公司制，Code.RS-0641-00)，测定培养基中的HGF的量。作为试样，添加杨梅黄酮(试样①)使最终浓度达到0、1、10、100μM，添加五羟黄酮(试样②)使最终浓度达到0、10、100μM。另外，试样的添加通过预先配制各种浓度的试样水溶液，以一定量添加到培养基中，达到上述最终浓度进行。仅添加一定量蒸馏水的孔(试样的最终浓度为0μM)作为对照，以该细胞培养液中的HGF浓度作为100％，采用相对值(％)表示HGF产生量。其结果如表1所示。实验全部进行2次，取其平均值。如表1所示，试样①、②增强了HGF的产生。而且，黄酮醇的B环的羟基数多的杨梅黄酮增强HGF产生的活性强。

由此表明黄酮醇类及其衍生物具有增强HGF产生的活性。表1

       试样    浓度(μM)       HGF产生量(％)

      试样①         0               100

                     1               187

                    10               543

                   100               454

      试样②         0               100

                    10               139

                   100               304(其中，对照的HGF产生量为4.80ng/ml。)实施例2  表棓儿茶素棓酸酯的HGF产生增强活性

采用与实施例1同样的方法，测定表棓儿茶素棓酸酯的HGF产生增强活性。其中，添加表棓儿茶素棓酸酯使最终浓度达到0、1、10μM。其结果如表2所示。如表2所示，表棓儿茶素棓酸酯增强了HGF的产生。表2

       浓度(μM)          HGF产生量(％)

             0                 100

             1                 175

            10                 160(其中，对照的HGF产生量为6.78ng/ml。)实施例3  没食子酸的HGF产生增强活性

采用与实施例1同样的方法，测定没食子酸的HGF产生增强活性。其中，添加没食子酸使最终浓度达到0、1、10、100μM。其结果如表3所示。如表3所示，没食子酸增强了HGF的产生。表3

   浓度(μM)                HGF产生量(％)

         0                       100

         1                       112

        10                       217

       100                       576(其中，对照的HGF产生量为6.78ng/ml。)实施例4  绿原酸的HGF产生增强活性

采用与实施例1同样的方法，测定绿原酸的HGF产生增强活性。添加绿原酸(东京化成社制)使最终浓度达到0、1、10、100、500、1000μM。其结果如表4所示。如表4所示，绿原酸增强了HGF的产生。表4

   浓度(μM)           HGF产生量(％)

         0                  100

         1                  105

        10                  122

       100                  302

       500                  479

      1000                  624(其中，对照的HGF产生量为5.16ng/ml。)实施例5   啡酸的HGF产生增强活性

采用与实施例1同样的方法，测定咖啡酸的HGF产生增强活性。其中，添加咖啡酸(Sigma公司制)使最终浓度达到0、10、100μM。其结果如表5所示。如表5所示，咖啡酸增强了HGF的产生。表5

   浓度(μM)            HGF产生量(％)

         0                   100

        10                   117

       100                   196(其中，对照的HGF产生量为6.27ng/ml。)实施例6  二咖啡酰奎尼酸的制备和HGF产生增强活性

(1)将艾蒿干燥品(阪本汉方堂社制)40g用50％丙酮500ml提取3次后，减压浓缩至约15ml。向浓缩液中添加10％构橼酸水溶液35ml，用乙酸乙酯100mL提取3次后，用硫酸镁干燥有机层，减压浓缩。将浓缩物供于硅胶柱色谱，以氯仿∶甲醇∶乙酸＝2∶1∶1(体积比)作为展开溶剂，每8mL分别收集。集中得到的级分7～13，减压浓缩后，在硅胶板上展开，以氯仿∶甲醇∶乙酸＝1∶1∶0.05作为展开溶剂，回收Rf值0.5附近的在UV 254nm显示吸收的物质225mg。通过¹H-NMR解析该物质的结构，得知为二咖啡酰奎尼酸(3，5-二咖啡酰奎尼酸，3，5-dicaffeoylquinic acid)。

(2)采用与实施例1同样的方法，测定实施例6-(1)制备的二咖啡酰奎尼酸的HGF产生增强活性。其中，添加二咖啡酰奎尼酸使最终浓度达到0、1、10、100μM。其结果如表6所示。如表6所示，二咖啡酰奎尼酸增强了HGF的产生。表6

   浓度(μM)        HGF产生量(％)

         0               100

         1               142

        10               206

       100               290(其中，对照的HGF产生量为6.27ng/ml。)实施例7  二咖啡酰奎尼酸的制备和HGF产生增强活性

将春菊约900g的植物试样冷冻干燥，与80％乙醇2L一起加入到混合器中进行磨碎，使用纱布进行过滤，将得到的提取液浓缩至200mL，制得春菊粗提取液。将得到的粗提取液中100mL供于XAD-2树脂(Organo公司制)200mL，依次用0％、30％、40％、60％和100％的甲醇各500mL洗脱。将各级分浓缩至50mL，与实施例1同样确认各级分的HGF产生增强活性，如表7所示，60％甲醇洗脱级分可见HGF产生增强活性。通过¹H-NMR解析60％甲醇洗脱级分，得知该级分中含有高浓度的3，5-二咖啡酰奎尼酸。另外，添加该级分至最终浓度达到0、0.1、1％。表7

  春菊粗提取液60％甲醇级分       HGF产生量

           (％)                    (％)

            0                       100

           0.1                      220

            1                       349(其中，对照的HGF产生量为8.22ng/ml。)实施例8  异东方蓼黄素的HGF产生增强活性

将粉碎的竹叶约5g与50％丙酮70mL一起搅拌15分钟以上，对得到的提取液进行抽滤，再用等量的溶剂提取残渣。将得到的滤液100mL中1mL减压干燥固化后，溶解于DMSO 1mL中，按照与实施例1同样的方法考察HGF产生增强活性，如表8所示确认有HGF产生增强活性。添加粗提取液使最终浓度达到0、0.1、1％。减压浓缩粗提取液，将浓缩液用水稀释至20倍，将其中一部分供于10mL的XAD-2(Organo公司制)上，依次用30％、40％、50％、60％和100％的甲醇各30mL洗脱。按照与实施例1同样的方法，测定各级分的HGF产生增强活性后，确认40％甲醇、30％甲醇级分具有活性。将30％、40％甲醇级分浓缩、干燥固化，供于硅胶柱色谱，以氯仿∶甲醇∶乙酸＝3∶1∶0.025作为展开剂，分别收集每10mL。采用¹H-NMR、FAB-MS进行分析，结果由级分第19～35支得到了高浓度含有黄酮的1种即藤黄菌素的糖苷——异东方蓼黄素(isoorientin)的级分，确认该级分具有如表9所示的HGF产生增强活性。另外，添加该级分至最终浓度达到0、0.1、1mg/ml。¹H-NMR

isoorientin：σ7.57(1H，dd，J＝8.0，2.0Hz)，7.55(1H，d，J＝2.0Hz)，7.02(1H，d，J＝8.0Hz)，6.81(1H，s)，6.63(1H，d，J＝8.0Hz)，4.74(1H，d，J＝10.0Hz)，4.19(1H，t，J＝4.5Hz)FAB-MASS

449(M+H)⁺表8

   竹叶粗提取液(％)        HGF产生量(％)

            0                   100

            0.1                 195

            1                   463(其中，对照的HGF产生量为9.09ng/ml。)表9

    异东方蓼黄素高浓度级分       HGF产生量

            (mg/ml)                (％)

               0                   100

               0.1                 131

               1                   318(其中，对照的HGF产生量为9.62ng/ml。)实施例9  绿原酸的异构体的HGF产生增强活性

用混合机将干燥洋李约300g与100％甲醇500mL一起磨碎，通过抽滤得到滤液。将该滤液1mL浓缩干燥固化，溶解于1mL的DMSO中。按照与实施例1同样的方法考察该洋李粗提取液的HGF产生增强活性，确认如表10所示具有活性。添加粗提取液至最终浓度达到0、0.01、0.1、1％。

将得到的粗提取液浓缩，除去提取溶剂，用水稀释至1L，供于200mL的XAD-2，用500mL的水洗涤后，用100％甲醇洗脱吸附级分。将得到的洗脱级分浓缩后，溶解于少量的水中，然后供于Cosmosil 140C₁₈-OPN(Nakalaitesque公司制)，按照0％～25％的乙腈/水、合计800mL的梯度进行洗脱，每1级分收集约10mL。通过¹H-NMR分析得到的级分，结果由第26支～第32支的级分和第41支～第48支的级分分别得到高浓度地含有绿原酸的异构体——新绿原酸(5-咖啡酰奎尼酸，5-caffeoyl-quinic acid)、隐绿原酸(4-咖啡酰奎尼酸，4-caffeoyl-quinicacid)的级分，确认分别如表11、表12所示具有HGF产生增强活性。另外，添加这些级分至最终浓度达到0、0.01、0.1mg/ml。¹H-NMR

5-caffeoyl-quinicacid：σ7.63(1H，d，J＝15.5Hz)，7.19(1H，s)，7.12(1H，d，J＝8.0Hz)，6.93(1H，d，J＝8.0Hz)，5.40(1H，m)，4.18(1H，m)，3.77(1H，dd，J＝9.5，4.5Hz)，2.2～1.6(5H，m)

4-caffeoyl-quinic acid：σ7.49(1H，d，J＝15.5Hz)，7.04(1H，d，J＝4.0Hz)，6.99(1H，dd，J＝8.0，4.0Hz)，6.73(1H，d，J＝8.0Hz)，6.27(1H，d，16Hz)，4.65(1H，dd J＝8.0，3.0Hz)，4.08(1H，m)，2.2～1.6(5H，m)表10

      洋李粗提取液(％)        HGF产生量(％)

             0                     100

             0.01                  111

             0.1                   214

             1                     306(其中，对照的HGF产生量为8.02ng/ml。)表11

     新绿原酸高浓度级分        HGF产生量

         (mg/ml)                 (％)

            0                     100

            0.01                  111

            0.1                   321(其中，对照的HGF产生量为9.98ng/ml。)表12

    隐绿原酸高浓度级分       HGF产生量

        (mg/ml)                (％)

           0                    100

           0.01                 103

           0.1                  142(其中，对照的HGF产生量为9.98ng/ml。)实施例10  注射剂的制备注射剂

(1)以1％浓度向生理盐水中加入杨梅黄酮、五羟黄酮、莰非醇、表棓儿茶素棓酸酯、没食子酸、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异黄腐酚、黄腐酚B、黄腐酚D、咖啡酸或二咖啡酰奎尼酸，分别制备注射剂。

(2)分别以0.5％和0.1％浓度向生理盐水中加入杨梅黄酮、五羟黄酮、莰非醇、表棓儿茶素棓酸酯、没食子酸、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异黄腐酚、黄腐酚B、黄腐酚D、咖啡酸或二咖啡酰奎尼酸以及甘草酸，制备注射剂。

实施例11片剂的制备片剂

(1)制备含有杨梅黄酮、五羟黄酮、莰非醇、表棓儿茶素棓酸酯、没食子酸、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异黄腐酚、黄腐酚B、黄腐酚D、咖啡酸或二咖啡酰奎尼酸100mg和微晶纤维素适量的片剂，包覆糖衣，制备各种片剂。

(2)制备分别含有杨梅黄酮、五羟黄酮、莰非醇、表棓儿茶素棓酸酯、没食子酸、绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异黄腐酚、黄腐酚B、黄腐酚D、咖啡酸或二咖啡酰奎尼酸0.1mg、甘草酸二钾10mg以及微晶纤维素适量的片剂，包覆糖衣，制备片剂。实施例12  铁对绿原酸的HGF产生增强活性的增强

配制绿原酸水溶液达到100mM的浓度。接着，配制10mM氯化铁(半井化学药品社制)水溶液，与等体积的绿原酸水溶液混合，在室温下静置60分钟。按照与实施例1同样的方法测定该铁处理后的绿原酸的HGF产生增强活性。铁处理后的绿原酸换算成绿原酸进行添加，至0、10、100、500μM。另外，试样的添加，通过预先配制各种浓度的铁处理后的绿原酸水溶液，以一定量添加到培养基中，达到上述最终浓度进行。铁处理后的绿原酸的最终浓度为0μM的试验是添加一定量在不存在绿原酸的条件下进行铁处理得到的水溶液的试验。另外，作为比较，对于未进行铁处理的绿原酸也同样测定活性。与上述同样，仅添加一定量蒸馏水的试验(绿原酸的最终浓度为0μM)作为对照，以该细胞培养液中的HGF浓度作为100％，采用相对值(％)表示HGF产生量。其结果如表13所示。通过铁处理增强了绿原酸的HGF产生增强活性。表13

      浓度(μM)             0      10     100     500未进行铁处理   HGF产生量(％)   100     122    302     479进行铁处       HGF产生量(％)    77     399    508     635(其中，对照的HGF产生量为5.16ng/ml。)实施例13  锰对绿原酸的HGF产生增强活性的增强

配制绿原酸水溶液达到100mM的浓度。接着，配制10mM氯化锰(II)(Nakalaitesque公司制)水溶液，与等体积的绿原酸水溶液混合，在室温下静置60分钟。按照与实施例1同样的方法测定该锰处理后的绿原酸的HGF产生增强活性。添加锰处理后的绿原酸达到培养基的1000分之1的量(绿原酸的最终浓度：50μM)。另外，作为比较，对于未进行锰处理的绿原酸也同样测定活性。其结果如表14所示。通过锰处理增强了绿原酸的HGF产生增强活性。表14

        试样                   HGF产生量(％)绿原酸0μM                               100绿原酸50μM                              148锰处理后的绿原酸50μM                    364(其中，对照的HGF产生量为7.02ng/ml。)实施例14  铜对绿原酸的HGF产生增强活性的增强

配制绿原酸水溶液达到100mM的浓度。接着，配制10mM硫酸铜(II)(半井化学药品社制)水溶液，与等体积的绿原酸水溶液混合，在室温下静置60分钟。按照与实施例1同样的方法测定该铜处理后的绿原酸的HGF产生增强活性。添加铜处理后的绿原酸达到培养基的1000分之1的量(绿原酸的最终浓度：50μM)。另外，作为比较，对于未进行铜处理的绿原酸也同样测定活性。其结果如表15所示。通过铜处理增强了绿原酸的HGF产生增强活性。表15

        试样                 HGF产生量(％)绿原酸0μM                             100绿原酸50μM                            148铜处理后的绿原酸50μM                  293(其中，对照的HGF产生量为7.02ng/ml。)实施例15  绿原酸氧化处理物的HGF产生增强活性的增强

将绿原酸溶解于100mM碳酸钠缓冲液(pH9)中，达到100mM的浓度。通过蠕动泵向该溶液中通入空气12小时，配制绿原酸的氧化处理物。按照与实施例1同样的方法测定该氧化处理后的绿原酸的HGF产生增强活性。氧化处理后的绿原酸换算成绿原酸进行添加，至0、1、10、100、1000μM。另外，氧化处理后的绿原酸的最终浓度为0μM的试验是添加一定量在不存在绿原酸的条件下进行氧化处理得到的水溶液的试验。另外，作为比较，对于未进行氧化处理的绿原酸也同样测定活性。其结果如表16所示。通过氧化处理增强了绿原酸的HGF产生增强活性。表16

      浓度(μM)              0    1     10   100  1000未进行氧化处理 HGF产生量(％)   100   105   122   302   624进行氧化处理   HGF产生量(％)   100   198   541   704   687(其中，对照的HGF产生量为5.16ng/ml。)实施例16  咖啡酸氧化处理物的HGF产生增强活性的增强

将咖啡酸溶解于100mM碳酸钠缓冲液(pH9)中，达到100mM的浓度。通过蠕动泵向该溶液中通入空气12小时，配制咖啡酸的氧化处理物。按照与实施例1同样的方法测定该氧化处理后的咖啡酸的HGF产生增强活性。氧化处理后的咖啡酸换算成咖啡酸进行添加，至0、1、10、100、1000μM。另外，作为比较，对于未进行氧化处理的咖啡酸也同样测定活性。其结果如表17所示。通过氧化处理增强了咖啡酸的HGF产生增强活性。表17

      浓度(μM)             0    1    10   100  1000未进行氧化处理HGF产生量(％)    100   85   117  196  92进行氧化处理HGF产生量(％)      100   307  353  411  555(其中，对照的HGF产生量为6.27ng/ml。)实施例17  铁对绿原酸的NGF产生增强活性的增强(1)

配制绿原酸(东京化成社制)水溶液达到100mM的浓度。接着，配制10mM氯化铁(半井化学药品社制)水溶液，与等体积的绿原酸水溶液混合，在室温下静置60分钟，制得铁处理绿原酸。采用以下方法测定该铁处理绿原酸对NGF产生带来的影响。

将小鼠成纤维细胞L-M细胞(ATCC CCL-1.2)在含有0.5％细胞培养用蛋白胨(Gibco公司制)的M199培养基(ICN公司制)中悬浊至1.5×10⁵细胞/ml，在96孔板中分别接种0.1ml，进行无菌培养。培养3天后，除去培养基，更换至含有0.5％牛血清白蛋白(Sigma公司制)的M199培养基中。向其中添加上述铁处理后的绿原酸达到培养基的100分之1的量(绿原酸的最终浓度：500μM)，培养20小时。培养结束后，通过酶免疫测定法(NGF Emax Immuno Assay System：Promega公司制)测定培养液中的NGF的浓度。另外，铁处理后的绿原酸的最终浓度为0μM的试验是添加一定量在不存在绿原酸的条件下进行铁处理得到的水溶液的试验。另外，作为比较，对于未进行铁处理的绿原酸也同样测定活性。与上述同样，仅添加一定量蒸馏水的试验(未进行铁处理的绿原酸的最终浓度为0μM)作为对照，以该细胞培养液中的NGF浓度作为100％，采用相对值(％)表示NGF产生量。其结果如表18所示。实验进行2次，取其平均值。通过铁处理增强了绿原酸的NGF产生增强活性。表18

      浓度(μM)                   0        500未进行铁处理  NGF产生量(％)          100     351.1进行铁处理    NGF产生量(％)          98.8    476.7(其中，对照的NGF产生量为0.174ng/ml。)实施例18  铁对绿原酸的NGF产生增强活性的增强(2)

配制绿原酸水溶液达到100mM的浓度。接着，分别配制5、10、20mM氯化铁水溶液，与等体积的绿原酸水溶液混合，在室温下静置60分钟。按照与实施例17同样的方法测定该铁处理后的绿原酸的NGF产生增强活性。添加铁处理后的绿原酸达到培养基的100分之1的量(绿原酸的最终浓度：500μM)。另外，作为比较，对于未进行铁处理的绿原酸也同样测定活性。其结果如表19所示。铁浓度依赖性地增强了绿原酸的NGF产生增强活性。表19

 浓度(μM)         0    500    500    500    500铁浓度(μM)            0     0      25     50    100NGF产生量(％)        100   351.1  355.0  441.6  472.6(其中，对照的NGF产生量为0.176ng/ml。)实施例19  锰对绿原酸的NGF产生增强活性的增强(1)

配制绿原酸水溶液达到25、50、100mM的浓度。接着，配制10mM氯化锰(II)(Nakalaitesque公司制)水溶液，与等体积的绿原酸水溶液混合，在室温下静置60分钟。按照与实施例17同样的方法测定该锰处理后的绿原酸的NGF产生增强活性。添加锰处理后的绿原酸达到培养基的100分之1的量(绿原酸的最终浓度：125、250、500μM)。另外，作为比较，对于未进行锰处理的绿原酸也同样测定活性。其结果如表20所示。通过锰处理增强了绿原酸的NGF产生增强活性。表20

       浓度(μM)             0     125    250    500未进行锰处理  NGF产生量(％)     100   124.6  308.5  382.2进行锰处理    NGF产生量(％)     94.0  495.3  691.0  877.4(其中，对照的NGF产生量为0.145ng/ml。)实施例20  锰对绿原酸的NGF产生增强活性的增强(2)

配制绿原酸水溶液达到100mM的浓度。接着，配制2.5、5、10mM氯化锰(II)水溶液，与等量的绿原酸水溶液混合，在室温下静置60分钟。按照与实施例17同样的方法测定该锰处理后的绿原酸的NGF产生增强活性。添加锰处理后的绿原酸达到培养基的100分之1的量(绿原酸的最终浓度：500μM)。另外，作为比较，对于未进行锰处理的绿原酸也同样测定活性。其结果如表21所示。锰浓度依赖性地增强了绿原酸的NGF产生增强活性。表21

 浓度(μM)        0     500    500     500    500锰浓度(μM)           0      0     12.5     25     50NGF产生量(％)        100   328.5  567.5   647.6  661.6(其中，对照的NGF产生量为0.186ng/ml。)实施例21  锰对咖啡酸的NGF产生增强活性的增强

配制咖啡酸(Sigma公司制)水溶液达到12.5、25、50mM的浓度。接着，配制10mM氯化锰(II)水溶液，与等体积的咖啡酸水溶液混合，在室温下静置60分钟。按照与实施例17同样的方法测定该锰处理后的咖啡酸的NGF产生增强活性。添加锰处理后的咖啡酸达到培养基的100分之1的量(咖啡酸的最终浓度：62.5、125、250μM)。另外，作为比较，对于未进行锰处理的咖啡酸也同样测定活性。其结果如表22所示。通过锰处理增强了咖啡酸的NGF产生增强活性。表22

      浓度(μM)               0     62.5    125     250未进行锰处理  NGF产生量(％)      100    97.8   199.5   221.2进行锰处理    NGF产生量(％)      96.4   188.2  235.2   267.4(其中，对照的NGF产生量为0.253ng/ml。)实施例22  绿原酸氧化处理物的NGF产生增强活性的增强

将绿原酸溶解于100mM碳酸钠缓冲液(pH9)中，达到100mM的浓度。通过蠕动泵向该溶液中通入空气12小时，配制绿原酸的氧化处理物。按照与实施例17同样的方法测定该氧化处理后的绿原酸的NGF产生增强活性。氧化处理后的绿原酸换算成绿原酸进行添加，至0、250、500、1000μM。另外，氧化处理后的绿原酸的最终浓度为0μM的试验是添加一定量在不存在绿原酸的条件下进行氧化处理得到的水溶液的试验。另外，作为比较，对于未进行氧化处理的绿原酸也同样测定活性。其结果如表23所示。通过氧化处理增强了绿原酸的NGF产生增强活性。表23

      浓度(μM)              0    250    500   1000未进行氧化处理 NGF产生量(％)    100  192.8  231.9  256.2进行氧化处理   NGF产生量(％)    100  211.0  368.7  642.7(其中，对照的NGF产生量为0.166ng/ml。)实施例23  啡酸氧化处理物的NGF产生增强活性的增强

将咖啡酸溶解于100mM碳酸钠缓冲液(pH9)中，达到100mM的浓度。通过蠕动泵向该溶液中通入空气12小时，配制咖啡酸的氧化处理物。按照与实施例22同样的方法测定该氧化处理后的咖啡酸的NGF产生增强活性。氧化处理后的咖啡酸换算成咖啡酸进行添加，至0、250、500、1000μM。另外，作为比较，对于未进行氧化处理的咖啡酸也同样测定活性。其结果如表24所示。通过氧化处理增强了咖啡酸的NGF产生增强活性。表24

      浓度(μM)               0    250    500   1000未进行氧化处理NGF产生量(％)      100  227.8  287.9  269.3进行氧化处理  NGF产生量(％)      100  275.3  449.5  655.2(其中，对照的NGF产生量为0.218ng/ml。)实施例24  咖啡酸酯的合成和NGF产生增强活性(1)咖啡酸甲酯的合成

将0.1g咖啡酸溶解于含有10％硫酸的甲醇中，在无水硫酸钠存在下，100℃加热1小时。由反应液过滤除去无水硫酸钠，用旋转式汽化器浓缩干燥固化。接着，采用反相色谱法精制反应物。其条件如下所述。柱使用TSK gel ODS-80Ts(直径21.5mm×长度30cm：Tosoh公司制)。溶剂A(将蒸馏水和乙腈按体积比2比3混合得到的溶剂，含有0.1％三氟醋酸)和溶液B(将蒸馏水和乙腈按体积比1比4混合得到的溶剂，含有0.1％三氟醋酸)的洗脱比为0分钟至30分钟将溶剂B比直线地由25％上升至45％，接着使溶剂B比在45％保持15分钟。洗脱速度为5ml/分钟，检测在215nm进行。收集含有保留时间19.8分钟的峰的级分，浓缩干燥固化，得到3.7mg的化合物。通过NMR解析得到的化合物，确认化合物为咖啡酸甲酯。NMR波谱、质谱的测定结果如下所示。

¹H-NMR：δ3.67(3H，s，OCH₃)，6.26(1H，d，J＝16.0Hz，2’-H)，6.74(1H，d，J＝8.0Hz，5-H)，6.99(1H，dd，J＝2.0，8.0Hz，6-H)，7.04(1H，d，J＝2.0Hz，2-H)，7.47(1H，d，J＝16.0Hz，3’-H)，9.16(1H，s，3-0H)，9.63(1H，s，4-OH)

其中，试样溶解于重二甲基亚砜中，将残留二甲基亚砜的化学位移值表示为2.49ppm。

FAB-MS：m/z 195(M+H)⁺(其中，基质使用甘油。)(2)咖啡酸乙酯的合成

将0.1g咖啡酸溶解于含有10％硫酸的乙醇中，与实施例24-(1)同样进行加热反应、精制操作，收集反相色谱上含有保留时间23.8分钟的峰的级分，浓缩干燥固化，得到2.7mg的化合物。通过NMR解析得到的化合物，确认化合物为咖啡酸乙酯。NMR波谱、质谱的测定结果如下所示。

¹H-NMR：δ1.22(3H，t，J＝7.0Hz，2”-H)，4.14(2H，q，J＝7.0 Hz，1”-H)，6.24(1H，d，J＝16.0Hz，2’-H)，6.74(1H，d，J＝8.0Hz，5-H)，6.99(1H，dd，J＝2.0，8.0Hz，6-H)，7.03(1H，d，J＝2.0Hz，2-H)，7.45(1H，d，J＝16.0Hz，3’-H)，9.15(1H，s，3-OH)，9.62(1H，s，4-OH)

其中，试样溶解于重二甲基亚砜中，将残留二甲基亚砜的化学位移值表示为2.49ppm。

FAB-MS：m/z 209(M+H)⁺(其中，基质使用甘油。)(3)咖啡酸甲酯和咖啡酸乙酯的NGF产生增强活性

按照与实施例17同样的方法测定实施例24-(1)和(2)合成的咖啡酸甲酯和咖啡酸乙酯的NGF产生增强活性。

添加咖啡酸甲酯使最终浓度达到0、0.0625、0.125mg/ml，另一方面添加咖啡酸乙酯使最终浓度达到0、0.0625mg/ml。结果如表25所示。咖啡酸甲酯和咖啡酸乙酯增强了L-M细胞的NGF产生。表25

试样           浓度         NGF产生量

              (mg/ml)          (％)

                0              100咖啡酸甲酯        0.0625         824.4

              0.125          889.6咖啡酸乙酯          0              100

              0.0625         1279.1(其中，对照的NGF产生量为0.109ng/ml。)实施例25  咖啡酸甲酯的NGF产生增强活性(1)由当归根部制备水提取低分子级分XAD-2处理物

向干燥当归(Angelica keiskei koidz.)根部粉末5.8kg中加入24L的乙酸乙酯，室温下提取3小时。向抽滤后的残渣中加入18L的乙醇，室温下提取一夜。接着，向抽滤后的残渣中加入52L的蒸馏水，在60℃下提取3小时。将除去固态残渣的液体部分用旋转式汽化器浓缩，向得到的物质中加入2.5倍量的乙醇，4℃下静置一夜。然后，通过抽滤分级成沉淀物和液体部分。将液体部分用旋转式汽化器浓缩干燥固化，得到当归根部水提取低分子级分。接着，将当归根部水提取低分子级分供于Amberlite XAD-2(Organo公司制：树脂量2L)，用蒸馏水30L充分冲洗非吸附物，接着用16L的甲醇洗脱吸附物。将甲醇洗脱液用旋转式汽化器浓缩干燥固化，得到当归根部水提取低分子XAD-2级分处理物。(2)当归根部水提取低分子级分XAD-2处理物引起的NGF产生增强

按照与实施例17相同的方法测定实施例25-(1)制备的当归根部水提取低分子级分XAD-2处理物的NGF产生增强活性。添加当归根部水提取低分子级分XAD-2处理物，使之达到0、0.85、1.7、3.4mg/ml。如表26所示，当归根部水提取低分子级分XAD-2处理物浓度依赖性地增强了L-M细胞的NGF产生。表26

  当归根部水提取低分子级分XAD-2处理物     NGF产生量

                  (mg/ml)                   (％)

                     0                       100

                     0.85                    655.3

                     1.7                     858.8

                     3.4                     1127.6(其中，对照的NGF产生量为0.074ng/ml。)(3)当归根部水提取低分子级分XAD-2处理物通过Cosmosil 140色谱进行的分级

使用反相色谱将实施例25-(1)制备的当归根部水提取低分子级分XAD-2处理物的活性成分分级。其条件如下所述。树脂使用Cosmosil 140 C18-OPN(Nakalaitesque公司制：树脂量400ml)。供给当归根部水提取低分子级分XAD-2处理物，依次用1L的蒸馏水、20％乙腈水溶液、25％乙腈水溶液、40％乙腈水溶液、甲醇作为展开剂进行洗脱，减压浓缩各洗脱级分。(4)当归根部水提取低分子级分XAD-2处理物的Cosmosil 140色谱分级物引起的NGF产生增强

按照与实施例17相同的方法测定实施例25-(3)制备的Cosmosil140色谱分级物的NGF产生增强活性。结果表明20％乙腈水溶液洗脱级分、25％乙腈水溶液洗脱级分、40％乙腈水溶液洗脱级分具有NGF产生增强活性。其结果如表27所示。表27

          级分             浓度       NGF产生量

                         (mg/ml)        (％)20％乙腈水溶液洗脱级分        4.05          301.0

                          8.1           436.7

                         16.2          1263.325％乙腈水溶液洗脱级分        0.7           161.7

                          1.5          1028.8

                          2.8          2110.440％乙腈水溶液洗脱级分       0.575         465.3

                         1.15          653.1

                          2.3          1226.2(其中，对照的NGF产生量，20％乙腈洗脱级分为0.074ng/ml，25％和40％乙腈洗脱级分为0.087ng/ml。)(5)Cosmosil 140的25％乙腈水溶液洗脱级分通过ODS-80Ts色谱进行的分级

使用反相色谱将实施例25-(3)制备的Cosmosil 140的25％乙腈水溶液洗脱级分的活性成分分级。其条件如下所述。柱使用TSK gelODS-80Ts(直径21.5mm×长度30cm：Tosoh公司制)。溶剂A(蒸馏水)和溶剂B(将蒸馏水和乙腈按体积比1比1混合得到的溶剂)的洗脱比为0分钟到120分钟将溶剂B比直线地从25％上升至100％，接着将溶剂B比在100％保持20分钟，最后使溶剂B比为25％，保持20分钟。洗脱速度为5ml/分钟，检测在235nm进行。以紫外线吸收为指标收集级分。(6)Cosmosil 140的25％乙腈水溶液洗脱级分的ODS-80Ts色谱分级物引起的NGF产生增强

按照与实施例17相同的方法测定实施例25-(5)得到的Cosmosil25％乙腈水溶液洗脱级分的ODS-80Ts色谱分级物的活性。结果表明多数级分具有NGF产生增强活性。其结果如表28所示。表28分离级分                     浓度            NGF产生量(检测峰：分钟)               (mg/ml)             (％)1(46.0、47.2、49.0)           2.00              250.82(53.2)                           2.00          275.23(54.0)                           2.00          318.74(54.9、55.5、56.4)               2.00          293.05(57.6)                           2.00          320.56(58.6)                           2.00          297.87(59.3)                           2.00          324.88(60.5)                           2.00          324.89(61.3)                           2.00          402.810(62.2)                          2.00          565.511(63.0)                          2.00          616.912(64.1)                          2.00          575.413(66.9)                          2.00          805.314(68.4)                          2.00          819.615(69.2)                          2.00          510.216(70.3)                          1.00          389.217(71.3、71.9)                    1.00          609.118(73.0、73.8、74.9)              0.50          100 2.519(75.4)                          0.50          851.320(76.5)                          1.00          838.521(77.7)                          1.00          249.422(79.6、80.5)                    0.50          234.323(82.4)                          0.25          359.124(84.1)                          0.25          285.825(85.5)                          0.0625        359.126(86.9、87.5)                    0.10          411.627(89.1)                          0.50          443.328(91.4)                          0.05          1058.129(92.8)                          0.20          672.030(93.8、95.8、97.5、100.0、100.6)0.50          593.6(其中，对照的NGF产生量，级分1～9为0.355ng/ml，级分10～18为0.382ng/ml，级分19～27为0.415ng/ml，级分28～30为0.450ng/ml。)(7)级分18通过反相色谱进行的分级

使用反相色谱将实施例25-(6)中确认了强活性的级分18(含有保留时间73.0、73.8、74.9分钟的检测峰的级分)进一步分级。其条件如下所述。柱使用TSK gel ODS-80TsQA(直径4.6mm×长度25cm：Tosoh公司制)。溶剂A(含有0.1％三氟醋酸的蒸馏水)和溶剂B(将蒸馏水和乙腈按体积比1比1混合得到的溶剂，含有0.1％的三氟醋酸)的洗脱比为将溶剂B比在50％保持20分钟。洗脱速度为1ml/分钟，检测在235nm进行，以紫外线吸收为指标收集级分。(8)级分18的ODS-80TsQA色谱分级物引起的NGF产生增强

按照与实施例17相同的方法测定实施例25-(7)中用TSK gel ODS-80TsQA色谱分级得到的级分的活性。结果表明含有9.3、10.1、10.6、10.9、11.2、12.0、12.8、13.3、14.0、15.2、16.1、18.6分钟的检测峰的级分具有NGF产生增强活性。其结果如表29所示。表29

 分离级分            浓度        NGF产生量(检测峰：分钟)         (mg/ml)         (％)18-1(9.3)                0.20         1489.618-2(10.1)               0.50         2222.918-3(10.6)               0.25         3039.618-4(10.9)               0.0375       2510.418-5(11.2)               0.125        610.418-6(12.0)               0.50         560.418-7(12.8)               0.50         681.318-8(13.3)               0.40         339.618-9(14.0)               1.00         410.418-10(15.2)              1.00         2510.718-11(16.1)              1.00         3360.718-12(18.6)              1.00         1189.3(其中，对照的NGF产生量，18-1～9为0.027ng/ml，18-10～12为0.015ng/ml。)

通过质量分析仪(DX302：日本电子社制)，采用FAB-MS方法，测定在实施例25-(7)中制备并在实施例25-(8)中确认了活性的来源于当归根部的级分18-3的质谱(MS)。使用甘油作为基质。结果检测出m/z 195(M+H)⁺的峰。图1表示来源于当归根部的级分18-3的MS波谱。在图1中，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度。(9)级分18-3的¹H-NMR解析

使用核磁共振(NMR)波谱装置(JNM-A500：日本电子社制)，测定各种NMR波谱，对于在实施例25-(7)中制备并在实施例25-(8)中确认了活性的来源于当归根部的级分18-3进行结构解析。NMR的归属信号如下所示。

¹H-NMR：δ3.68(3H，s，OCH₃)，6.25(1H，d，J＝16.0Hz.2’-H)，6.75(1H，d，J＝8.0 Hz，5-H)，6.98(1H，dd，J＝2.0，8.0Hz，6-H)，7.03(1H，d，J＝2.0，2-H)，7.46(1H，d，J＝16.0 Hz，3’-H)，9.10(1H，s，3-OH)，9.56(1H，s，4-OH)

其中，试样溶解于重二甲基亚砜中，将残留二甲基亚砜的化学位移值表示为2.49ppm。图2表示来源于当归根部的级分18-3的¹H-NMR波谱。图2中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。(10)确定级分18-3的结构

对于在实施例25-(7)中制备并在实施例25-(8)中确认了活性的来源于当归根部的级分18-3进行质谱解析、NMR波谱解析，结果确认活性成分为咖啡酸甲酯(分子量194)。实施例26  咖啡酸乙酯的NGF产生增强活性(1)级分28的MS解析

通过质量分析仪(DX 302：日本电子社制)，采用FAB-MS方法，测定在实施例25-(5)中制备并在实施例25-(6)中确认了活性的来源于当归根部的级分28(含有保留时间91.4分钟的检测峰的级分)的质谱(MS)。使用甘油作为基质。结果检测出m/z 209(M+H)⁺的峰。图3表示来源于当归根部的级分28的MS波谱。在图3中，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度。(2)级分28的¹H-NMR解析

使用核磁共振(NMR)波谱装置(JNM-A500：日本电子社制)，测定各种NMR波谱，对于在实施例25-(5)中制备并在实施例25-(6)中确认了活性的来源于当归根部的级分28进行结构解析。NMR的归属信号如下所示。

¹H-NMR：δ1.23(3H，t，J＝7.0Hz，2”-H)，4.14(2H，q，J＝7.0 Hz，1”-H)，6.24(1H，d，J＝16.0Hz，2’-H)，6.74(1H，d，J＝8.0Hz，5-H)，6.98(1H，dd，J＝2.0，8.0Hz，6-H)，7.03(1H，d，J＝2.0Hz，2-H)，7.45(1H，d，J＝16.0Hz，3’-H)，9.11(1H，s，3-0H)，9.57(1H，s，4-OH)

其中，试样溶解于重二甲基亚砜中，将残留二甲基亚砜的化学位移值表示为2.49ppm。图4表示来源于当归根部的级分28的¹H-NMR波谱。图4中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。(3)确定级分28的结构

对于在实施例25-(5)中制备并在实施例25-(6)中确认了活性的来源于当归根部的级分28进行质谱解析、NMR波谱解析，结果确认活性成分为咖啡酸乙酯(分子量208)。实施例27  异黄腐酚的NGF产生增强活性

(1)将来源于蛇麻花的黄腐酚级分(ホツプシユタイナ-公司制)0.4g用氯仿3ml溶解，供于硅胶色谱。依次用氯仿(1000ml)、氯仿∶甲醇＝50∶1(1000ml)、氯仿∶甲醇＝20∶1(1000ml)进行梯度洗脱，每1级分收集8ml。将得到的级分67～100减压浓缩，得到来源于蛇麻花的黄腐酚级分——级分A。再使用反相色谱，纯化来源于蛇麻花的黄腐酚级分——级分A。其条件如下所述。柱使用TSK gel ODS-80Ts(直径21.5mm×长度30cm：Tosoh公司制)。溶剂A(将蒸馏水和乙腈按体积比3比2混合得到的溶剂，含有0.1％三氟醋酸)和溶剂B(将蒸馏水和乙腈按体积比1比4混合得到的溶剂，含有0.1％三氟醋酸)的洗脱比为0分钟到60分钟将溶剂B比直线地由50％上升至100％，接着将溶剂B比在100％保持20分钟，最后使溶剂B比为50％，保持20分钟。洗脱速度为5ml/分钟，检测在370nm进行，每1分钟收集1级分。将含有保留时间42.5分钟的检测峰的级分浓缩干燥固化，制得高纯度的黄腐酚(Xanthohumol)(19.4mg)。

(2)将实施例27-(1)制得的黄腐酚3.5mg溶解于二甲基亚砜溶液0.75ml中，将得到的物质添加至200ml的10mM醋酸钠缓冲液(pH5.5，含有10％的蔗糖)中，在100℃下加热2小时。冷却后，使用反相色谱对反应液进行分级。其条件如下所述。树脂使用Cosmosil 140C18-OPN(Nakalaitesque公司制：树脂量20ml)。将反应液供于柱，依次用50ml的蒸馏水、20％、30％、40％、50％、60％、70％的乙腈水溶液、甲醇作为展开剂进行洗脱。结果，将40％乙腈水溶液洗脱级分浓缩干燥固化，得到高纯度的异黄腐酚(Isoxanthohumol)(2.1mg)。使用核磁共振(NMR)波谱装置(JNM-A500：日本电子社制)，通过测定各种NMR波谱，对得到的化合物进行解析，确认结构。NMR波谱、质谱的测定结果如下所示。

¹H-NMR：δ1.52(3H，s，3”-CH₃)，1.57(3H，s，3”-CH₃)，2.54(1H，dd，J＝3.0，16.5Hz，3-H)，2.92(1H，dd，J＝12.5 16.5Hz，3-H)，3.09(2H，d，J＝7.0Hz，1”-H)，3.68(3H，s，5-0CH₃)，5.07(1H，t，J＝7.0Hz，2”-H)，5.30(1H，dd，J＝3.0，12.3Hz，2-H)，6.12(1H，s，6-H)，6.76(2H，d，J＝8.5Hz，3’-H和5’-H)，7.27(2H，d，J＝8.5Hz，2’-H和6’-H)，9.53(1H，s，4’-OH)，10.43(1H，brs，7-OH)

其中，试样溶解于重二甲基亚砜中，将残留二甲基亚砜的化学位移值表示为2.49ppm。

FAB-MS：m/z 355(M+H)⁺(其中，基质使用甘油。)

(3)按照与实施例17相同的方法测定实施例27-(2)制得的异黄腐酚的NGF产生增强活性。其结果如表30所示。添加异黄腐酚至0、50、100、200μM。异黄腐酚浓度依赖性地增强了L-M细胞的NGF产生。表30

           浓度       NGF产生量

          (μM)         (％)

            0            100

           50           110.7

           100          121.4

           200          198.0(其中，对照的NGF产生量为0.181ng/ml。)

实施例28

(1)将黄腐酚级分(ホツプシユタイナ-社制)0.4g溶解于氯仿3ml，供于硅胶色谱。依次用氯仿(1000ml)、氯仿∶甲醇＝50∶1(1000ml)、氯仿∶甲醇＝20∶1(1000ml)进行梯度洗脱，每1级分收集8ml。将得到的级分67～100减压浓缩，得到来源于蛇麻花的黄腐酚级分——级分A。

(2)再使用反相色谱纯化、分离上述黄腐酚级分——级分A。其条件如下所述。柱使用TSK gel ODS-80Ts(直径21.5mm×长度30cm：Tosoh公司制)。溶剂A(将蒸馏水和乙腈按体积比3比2混合得到的溶剂，含有0.1％三氟醋酸)和溶剂B(将蒸馏水和乙腈按体积比1比4混合得到的溶剂，含有0.1％三氟醋酸)的洗脱比为0分钟到60分钟将溶剂B比直线地由50％上升至100％，接着将溶剂B比在100％保持20分钟，最后使溶剂B比为50％，保持20分钟。洗脱速度为5ml/分钟，检测在370nm进行，每1分钟收集1级分。

(3)按照与实施例17相同的方法测定上述黄腐酚级分——级分A的反相色谱级分的NGF产生增强活性。结果表明含有21.1、22.2、24.2、25.7、28.6分钟的检测峰的级分具有NGF产生增强活性。其结果如表31所示。表31级分(保留时间：分钟)     浓度(mg/ml)    NGF产生量(％)A-1(21.1)                  0.025            92.4

                       0.05             151.4A-2(22.2)                  0.05             109.5

                       0.1              136.2

                       0.2              208.6A-3(24.2)                  0.0125           134.3

                       0.025            151.4

                       0.05             202.9

                       0.1              298.1A-4(25.7)                  0.025            197.1

                       0.05             345.7

                       0.1              416.2A-5(28.6)                  0.0125           145.7

                       0.025            189.5

                       0.05             229.5

                       0.1              517.1(其中，对照的NGF产生量为0.093ng/ml。)

(4)通过质量分析仪(DX302：日本电子社制)，采用FAB-MS方法，测定上述级分A-5(含有保留时间28.6分钟的检测峰的级分)的质谱(MS)。使用甘油作为基质。结果检测出m/z 371(M+H)⁺的峰。图5表示来源于黄腐酚级分的级分A-5的MS波谱。在图5中，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度。

再使用核磁共振(NMR)波谱装置(JNM-A500：日本电子社制)，测定各种NMR波谱，进行结构解析，结果确认活性成分为黄腐酚B(分子量370)和黄腐酚D(分子量370)的混合物(混合比1∶1.65)。NMR的归属信号如下所示。黄腐酚B

¹H-NMR：δ1.21(3H，s，6-H)，1.27(3H，s，6-H)，2.70(2H，m，4-H)，3.65((1H，m，5-H)，3.87(3H，s，6-OCH₃)，6.00(1H，s，5-H)，6.80(2H，m，3-H和5-H)，7.55(2H，m，2-H和6-H)，7.70(1H，m，β-H)，7.75(1H，m，α-H)，10.12(1H，s，4-OH)，14.18(1H，s，2-OH)黄腐酚D

¹H-NMR：δ1.71(3H，s，5-H)，2.60(2H，m，1-H)，3.85(3H，s，6-OCH₃)，4.20(1H，m，2-H)，4.58(1H，s，4-H)，4.61(1H，s，4-H)，6.04(1H，s，5-H)，6.80(2H，m，3-H和5-H)，7.55(2H，m，2-H和6-H)，7.70(1H，m，β-H)，7.75(1H，m，α-H)，10.09(1H，s，4-OH)，10.58(1H，s，4-OH)，14.69(1H，s，2-OH)

其中，试样溶解于重二甲基亚砜中，将残留二甲基亚砜的化学位移值表示为2.49ppm。图6表示来源于黄腐酚级分的级分A-5的¹H-NMR波谱。图6中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。

工业实用性

本发明提供一种用于治疗或预防必须增强生长因子产生的疾病的治疗剂或预防剂、食品、饮料和饲料，其中以多元酚类、其衍生物和/或其盐；或者多元酚类、其衍生物和/或其盐通过(i)与金属、金属盐和/或金属离子进行混合处理或(ii)进行氧化处理得到的组合物作为有效成分。上述有效成分特别是对肝细胞增殖因子和神经生长因子的产生增强作用优良，因此按照本发明的优选方式，提供一种用于治疗或预防必须增强肝细胞增殖因子和神经生长因子产生的疾病的治疗剂或预防剂、食品、饮料和饲料。

Claims (21)

1、一种必须增强生长因子产生的疾病的治疗剂或预防剂，其特征在于，含有下述物质作为有效成分：

(i)选自多元酚类、其衍生物和它们的盐中的至少1种，或者

(ii)选自多元酚类、其衍生物和它们的盐中的至少1种通过下述处理得到的组合物，

(A)与选自金属、金属盐和金属离子中的至少1种的混合处

理，或者

(B)氧化处理。

2、如权利要求1所述的治疗剂或预防剂，多元酚类是选自类黄酮、没食子酸、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、咖啡酸和二咖啡酰奎尼酸中的至少1种。

3、如权利要求2所述的治疗剂或预防剂，类黄酮是选自黄酮醇类、黄烷酮、查尔酮和黄烷醇中的至少1种。

4、如权利要求3所述的治疗剂或预防剂，黄酮醇类是杨梅黄酮和/或五羟黄酮，黄烷酮是异黄腐酚，查尔酮是黄腐酚B和/或黄腐酚D，黄烷醇是表棓儿茶素棓酸酯。

5、如权利要求1～4中任意一项所述的治疗剂或预防剂，多元酚类的衍生物是多元酚类的羧酸酯和/或糖苷。

6、如权利要求5所述的治疗剂或预防剂，多元酚类的羧酸酯是咖啡酸甲酯和/或咖啡酸乙酯，多元酚类的糖苷是异东方蓼黄素。

7、如权利要求1～6中任意一项所述的治疗剂或预防剂，金属是选自铁、锰、镁、铜、锌、银、金、铝、钙、镍、钴中的至少1种，金属盐是含有上述金属的盐，金属离子是上述金属的离子。

8、如权利要求1～7中任意一项所述的治疗剂或预防剂，生长因子是肝细胞增殖因子或神经生长因子。

9、一种生长因子产生增强用的食品、饮料或饲料，其特征在于，含有下述物质作为有效成分：

(i)选自多元酚类、其衍生物和它们的盐中的至少1种，或者

(ii)选自多元酚类、其衍生物和它们的盐中的至少1种通过下述处理得到的组合物，

(A)与选自金属、金属盐和金属离子中的至少1种的混合处

   理，或者

(B)氧化处理。

10、如权利要求9所述的食品、饮料或饲料，多元酚类是选自类黄酮、没食子酸、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、咖啡酸和二咖啡酰奎尼酸中的至少1种。

11、如权利要求10所述的食品、饮料或饲料，类黄酮是选自黄酮醇类、黄烷酮、查尔酮和黄烷醇中的至少1种。

12、如权利要求11所述的食品、饮料或饲料，黄酮醇类是杨梅黄酮和/或五羟黄酮，黄烷酮是异黄腐酚，查尔酮是黄腐酚B和/或黄腐酚D，黄烷醇是表棓儿茶素棓酸酯。

13、如权利要求9～12中任意一项所述的食品、饮料或饲料，多元酚类的衍生物是多元酚类的羧酸酯和/或糖苷。

14、如权利要求13所述的食品、饮料或饲料，多元酚类的羧酸酯是咖啡酸甲酯和/或咖啡酸乙酯，多元酚类的糖苷是异东方蓼黄素。

15、如权利要求9～14中任意一项所述的食品、饮料或饲料，金属是选自铁、锰、镁、铜、锌、银、金、铝、钙、镍、钴中的至少1种，金属盐是含有上述金属的盐，金属离子是上述金属的离子。

16、如权利要求9～15中任意一项所述的食品、饮料或饲料，生长因子是肝细胞增殖因子或神经生长因子。

17、一种组合物，由选自多元酚类、其衍生物和它们的盐中的至少1种通过下述处理得到，

(A)与选自金属、金属盐和金属离子中的至少1种的混合处理，或者(B)氧化处理。

18、如权利要求17所述的组合物，多元酚类是绿原酸和/或咖啡酸，衍生物是上述多元酚类的羧酸酯和/或糖苷。

19、如权利要求17或18所述的组合物，金属是选自铁、锰、镁、铜、锌、银、金、铝、钙、镍、钴中的至少1种，金属盐是含有上述金属的盐，金属离子是上述金属的离子。

20、如权利要求17～19中任意一项所述的组合物，具有生长因子产生增强作用。

21、如权利要求20所述的组合物，生长因子是肝细胞增殖因子或神经生长因子。

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