CN1415383A

CN1415383A - 外科植入用组织材料改性方法及改性材料

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Publication number: CN1415383A
Application number: CN 01137562
Authority: CN
Inventors: 金磊
Original assignee: Individual
Current assignee: Beijing Bai Ren Medical Polytron Technologies Inc
Priority date: 2001-10-29
Filing date: 2001-10-29
Publication date: 2003-05-07
Anticipated expiration: 2021-10-29
Also published as: CN1175910C

Abstract

本发明涉及用于外科植入的异种或同种组织材料化学改性的方法和用该方法制备的组织材料，尤其是人工生物心脏瓣膜材料的改性处理方法和改性处理的瓣膜材料，其抗钙化和耐疲劳性能明显增强，从而具有更长的使用寿命。

Description

外科植入用组织材料改性方法及改性材料

技术领域

背景技术

心脏瓣膜病是最常见的心脏病，其发病占整个心脏病的一半[1]。这类疾病的晚期、瓣膜病变严重的患者，最终有效治疗唯有换瓣。据最近的资料，全世界每年接受换瓣手术的病人已从十年前的10万增加到目前的30万[2]。在我国，按“八五”期间的调查，全国现有风湿性心脏病患者已超过250万[3]。随着心脏外科的发展，换瓣已成为常规手术，故这些换瓣术后病人的远期疗效主要取决于人工瓣膜的质量。

人工心脏瓣膜分为机械瓣和生物瓣两大类，它们的研究已走过了近40年的历程。随着对机械瓣和生物瓣各自优缺点认识的不同，人工瓣膜的研制与临床应用也随之出现过几起几伏。60年代，机械瓣与生物瓣相继问世，并均在临床中使用。70年代初，人们发现机械瓣会出现血栓、栓塞等严重并发症，与此同时，发明了Carpentier戊二醛改性技术，从而使生物瓣的应用超过了机械瓣。进入80年代后，随着术后有效的抗凝手段的发展和机械瓣设计上的重大改进，即双叶瓣的问世，以致80年代末，机械瓣的应用大幅增加，但在总体上两类人工瓣仍同样受到重视，并处于平行发展状态。进入90年代后，虽然机械瓣在设计和制作工艺上几乎达到了无可挑剔的地步(以St.Jude为代表的双叶瓣，叶片薄，开放角度大，流体力学性能几乎与生物瓣相近)，各种类型的机械瓣有近20种之多，但最终仍没能解决术后长期抗凝的难题。

生物瓣一般以牛心包或猪主动脉瓣为组织材料制作，最近，美国FDA确认了牛心包作为人工生物心脏瓣膜的理想材料。与机械瓣相比，生物瓣具有良好的血液动力学性能和生物相容性，因此，换瓣术后病人无需长期抗凝治疗，具有较高的生活质量，这一优势一直是机械瓣所无法比拟的，因此，人们对生物瓣寄以更多期望。但是，目前的生物瓣由于过早的钙化和退变使其耐久性不确定又令人担忧，影响了其更大范围的应用。因此，人们一直渴求一种能够延缓生物瓣组织材料的钙化和退变的有效方法，这是目前生物瓣膜研究和改进的焦点。针对现有技术的上述问题，本发明提供了一种对人工生物瓣膜材料进行改性处理以延缓其钙化和退变的新的方法，以及采用该方法改性处理的生物瓣膜。与现有技术的人工生物瓣相比，本发明改性的生物瓣能够大大减少组织材料的钙化和退变，从而使用寿命大大延长。

发明内容

生物瓣组织(牛心包或猪主动脉瓣)结构的基本特征是由胶原纤维交织成网状的骨架，其间被多种粘多糖基质所填充。生物瓣材料最基本的结构单位是前胶原纤维分子，它们交联的程度和交联的质量决定了组织的稳定性和耐疲劳性。本领域一般以组织热皱缩温度来衡量组织的交联程度，所谓组织热皱缩温度是指组织材料在40度以下的水介质中，当以2度/分均匀升高水温致材料组织皱缩时水介质的温度。未加处理的天然生物瓣组织(牛心包瓣或猪主动脉瓣)其热皱缩温度为65-68度，最初以甲醛处理的第一代生物瓣(1965年-1969年)，其热皱缩温度为74-76度，四年完好率仅为30％；第二代以戊二醛(Carpentier’法)改性的生物瓣组织，其热皱缩温度提高到84-86度，耐久性提高一倍以上。。目前国外市场上所用的人工生物心脏瓣膜仍为戊二醛改性的异种组织瓣(牛心包瓣或猪主动脉瓣)。其十年完好率为70％，十五年完好率为30-40％[4]。几十年来，就如何减少生物瓣植入后的钙化，以进一步延长其使用寿命进行了大量的研究，但至今仍未能找到比戊二醛改性更好的化学改性方法。

本发明从生物瓣组织分子结构的特点入手，改变以往化学改性仅以交联氨基为主的模式，成功地建立了使用配位化合物与瓣膜组织胶原蛋白分子上的游离羧基交联的化学改性新方法。经这种方法改性后的生物瓣组织热皱缩温度可达到100度以上，其组织稳定性显著提高。同时具有非常好的抗钙化作用。

1.作为交联剂的配位化合物

生物瓣组织的交联可以有效地加强组织稳定性，从而改善其耐久性，这已成为众多学者的共识。1968年法国著名学者Carpentier用戊二醛(GA)交联生物瓣组织，使其耐久性成倍增加，并一直沿用至今。戊二醛改性技术的原理是借助戊二醛分子两端的醛基，使瓣膜组织中胶原蛋白分子上的游离氨基相互交联，这样增加了生物瓣组织中基本结构单位之间的交联程度，从而增加了组织的稳定性。然而，大量的研究结果已经表明，GA改性的瓣叶组织一个致命的弱点是容易钙化，并且其交联作用使生物瓣膜所能达到的耐久程度已到极限[5]。为此，若要进一步改善其耐久性，需要有一种新的交联剂和新的交联方式。

作为交联剂的配位化合物是指某些金属过渡元素如铝(Al)、铬(Cr)、铁(Fe)等在水溶液中由于水解作用多以配合物形式存在，空间构型为正八面体，它们可以用来交联生物瓣膜组织。以羟基铬为例，其配位数是6，空间结构是正八面体，在纯水中可以表示为〔Cr(H₂O)₆〕。在溶液中，由于水解作用多以羟基铬形式存在，除水分子外，许多阴离子在不同的条件下可作为铬络离子的配位体，并且有着不同的络合能力。按照内配位体取代规则，配合能力较大的配位体可以进入配合物内界取代配合能力较小的配位体。胶原蛋白分子上的游离羧基其配合能力远远大于水分子，因此，羟基铬可同胶原蛋白结合而形成交联。同时，其中的羟基氧因具有不止一对未共用电子对，所以它可以与另一中心铬离子结合形成配位键，形成含有两个以上铬原子的多核羟基铬。由此，通过改变羟基铬的水解度可增加或减少OH的数目，从而可改变其分子的自身聚合。

配位化合物一般以上述金属元素的盐溶液形式提供。如使用铝的配位化合物时，可以取铝的各种无机盐如盐酸盐、硫酸盐和硝酸盐等配制成水溶液，必要时，向水溶液中加入碱，以利于配位化合物的形成。所述的碱可以是碱金属或碱土金属的碱，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁或氢氧化钙，优选使用氢氧化钠。配位化合物水溶液中金属离子的浓度可以从0.001mol/L到1mol/L，具体浓度本领域技术人员在考虑到待处理的组织材料大小、厚度等因素后无需过多实验即可确定。制备的配位化合物溶液具有一定的吸收图谱，羟基铁和羟基铬溶液的吸收图谱见图7和图8。

同时，由于配位化合物是以小分子状态存在，因而较戊二醛更易于较快地在组织内均匀分布。这也有利于用配位化合物对组织进行交联处理。

发明人发现，配位化合物对组织材料的交联处理与戊二醛法相比，具有以下特点：①交联的靶基团是羧基，而不是氨基。由于其数目是氨基的三倍，并且完全处于游离状态，在顺序分布上也具有明显的稳定性优势，因此，对组织的交联程度更高。同时，由于组织羧基(组织胶原蛋白和基质中的蛋白聚糖均含有大量羧基)是瓣膜钙化的聚附点，交联的结果是大量的聚附点被封闭，因此具有非常确切的抗钙化作用。而戊二醛无抗钙化作用。③HC交联的同时通过水解度的改变可使其自身聚合，故通过改变其分子的大小和空间构型，在三维空间上形成多点交联。而戊二醛自身几乎是不变5碳链，只是线性的“手拉手”的两点联结。④HC不仅交联胶原，也交联基质(PG)。而戊二醛只交联胶原，对基质则无交联作用。⑤由于HC的分子可调的，其小分子状态在组织中分布快而均匀(只需1.5小时)，故使用浓度较低。而戊二醛分布较慢(需48小时)，使用浓度高。此外，HC的抗钙化作用也不同于一般抗钙化意义上所指的单纯封闭羧基，已知目前所有的抗钙化方法均无明显的交联作用。

2.外科植入用组织材料：

主要指牛心包、猪主动脉瓣、猪背侧腹膜、人阔筋膜和硬脑膜等新鲜组织材料。一般，在使用时，待获得离体材料后，修剪去除多余的脂肪和不用的部分，在冷生理盐水中反复漂洗，至肉眼见无血色为止。然后可以在生理相容的溶液如Hank’s液中浸泡过夜，以进一步漂洗组织材料，溶液与组织材料的比例可以是50∶1到2∶1，优选20∶1到3∶1，更优选10∶1到5∶1。漂洗过程中可以更换漂洗液，一般每2小时更换一次，每1小时更换一次效果更佳。

组织材料经过以上所述处理程序后，基本除去了其中的不希望有的血液和组织液，可以用于进一步的交联处理。

3.配位化合物的交联

配位化合物对组织材料的交联一般包括以下步骤：

a)预处理。一般是用甲酸溶液浸泡组织材料，甲酸溶液中可以含有氯化钠，浸泡过程中可以不时搅动，或置于振荡条件下。预处理可以在室温下进行，在30℃温度下效果更好。

b)配位化合物交联。将预处理后的组织材料置于预先配制好的配位化合物溶液中浸泡，进行交联处理，或者也可以使处理过程在振荡条件下进行。处理可以在室温下进行，或提高处理温度至30℃到40℃效果更佳。在处理过程中可以用碱调节溶液的pH值，使溶液的pH值逐步提高，这样交联效果更好。

c)后处理。将经过上述交联处理的组织材料继续浸泡于处理液中一段时间，如1小时到10小时，最佳为2小时，然后转移到含有4％甲醛的等渗硫酸钠溶液中保存。等渗Na₂SO₄溶液有利于作为交联剂的配位化合物在溶液中保持交联状态的稳定。

4.组织材料的复合交联处理。

所谓复合交联是指将组织材料先用戊二醛预固定，然后再用配位化合物交联处理，这样获得的改性组织材料，其中氨基被戊二醛交联在一起，而羧基被配位化合物交联在一起，因此其交联程度更高，抗钙化和耐疲劳性更好。

戊二醛的处理基本同现有技术的方法，具体可参见[6-8]。

5.本发明的改性组织材料

可以用本发明的配位化合物交联处理方法处理的组织材料包括牛心包、猪主动脉及瓣膜、猪背侧腹膜、人阔筋膜和硬脑膜等新鲜组织材料。而且，胶原涂层的人工材料如胶原涂层的涤纶人工血管等也可以使用本发明的方法进行处理，并提高其耐疲劳性和抗钙化性能。

发明人发现，经过本发明的配位化合物交联处理的组织材料与现有技术的戊二醛改性处理的组织材料相比，具有以下特点：①被交联的基团为组织中的羧基，由于组织中羧基含量高，同时是瓣膜钙化的聚附点，因此，本发明的交联组织材料交联程度更高，并同时具有明确的抗钙化作用。发明人采用本领域测定组织羧基含量的Bowes法对经处理后的组织羧基含量进行了测定，结果表明，本发明的交联组织材料中羧基含量最低。②配位化合物可以与组织基质交联，这样进一步增加了组织材料中的交联程度，因此，增强了组织材料的强度和稳定性。③本发明的交联组织材料其热皱缩温度较戊二醛改性处理的相同材料要高，一般不低于90℃，而一般戊二醛改性处理的材料其热皱缩温度为85℃左右。经过本发明的复合交联处理的组织材料其热皱缩温度一般不低于95℃。

附图说明

图1为戊二醛改性牛心包组织胶原纤维纵切面，可见较多的电子密度较高颗粒。

图2为戊二醛改性牛心包组织胶原纤维横断面，可见较多的电子密度较高颗粒。

图3为羟基铁改性牛心包组织透射电镜照片，组织切片为胶原纤维的纵切面，整个视野未见电子密度较高的蛋白聚糖颗粒。

图4为羟基铁改性牛心包组织透射电镜照片，组织切片为胶原纤维的横切面，整个视野未见电子密度较高的蛋白聚糖颗粒。

图5为羟基铬改性牛心包组织透射电镜照片，组织切片为胶原纤维的纵切面，整个视野未见电子密度较高的蛋白聚糖颗粒。

图6为羟基铬改性牛心包组织透射电镜照片，组织切片为胶原纤维的横切面，整个视野未见电子密度较高的蛋白聚糖颗粒。

图7为羟基铁溶液的吸收图谱。

图8为羟基铬溶液的吸收图谱。

具体实施方式

1.配位化合物对组织材料的交联处理

1).配位化合物溶液的制备：取分析纯的AlCl₃ 6H₂O和NaOH固体，加水配制成一系列Al³⁺离子浓度分别为0.0300、0.0500和0.100mol/dm3，OH/Al比分别为0、1.0、1.5、2.0、和2.5的羟基铝溶液备用。

2)组织材料的准备：取新鲜牛心包，离体后修剪去除多余的脂肪和不用的部分，在冷生理盐水中漂洗至肉眼见无血色为止。在洁净环境于Hank’s液中浸泡过夜(组织与液体比为1∶5-10)，每一小时换液体一次。

3)配位化合物交联处理：

a)预处理：将准备好的牛心包用刀片切成6～8×10～12cm²大小，置于含有0.9％NaCl的甲酸溶液(pH2.5)中，30℃水浴振荡30分钟。

b)配位化合物交联：将预处理后的组织材料置于0.0625mol/dm3，OH/Al为0.5的羟基铝溶液中，32℃水浴振荡3.5小时；检测材料处理液的pH并用10％NaHCO₃提高0.4pH单位，然后再在36℃水浴振荡45分钟；再测定材料处理液的pH，并用10％NaHCO₃提高0.4pH单位，36℃水浴振荡45分钟；继续用10％NaHCO₃调节溶液pH值至4.0，40℃水浴振荡1.5小时。

c)后处理：将交联后的组织材料继续浸泡于处理液中2小时，然后置于含有4％甲醛的等渗Na₂SO₄溶液中保存备用。

2.戊二醛和配位化合物对组织材料的复合交联处理

即在以配位化合物对组织材料进行交联处理之前，先以低浓度的戊二醛(浓度为0.25-0.3％)进行处理，这样获得的交联组织材料其强度和抗钙化性能都优于仅用配位化合物交联处理的相同材料。

仍以牛心包为例。选取准备好的牛心包组织材料，裁成大小为6～8×10～12cm²的片状材料，用含0.25％戊二醛的0.05mol/L HEPES缓冲液(pH7.4)浸泡48小时，再置于含0.3％戊二醛的0.05mol/LHEPES缓冲液(pH7.4)中保存备用。

3.本发明的交联组织材料

将经过上述方法交联处理的牛心包材料与现有技术的牛心包材料和未经处理的牛心包材料进行了对比，结果如下：

(1).交联的基团

本发明中，交联处理的牛心包材料中组织羧基被交联，这通过对处理后的组织材料中的羧基含量进行测定可以看出。

以新鲜牛心包组织为对照，用Bowes法[9，10]对GA处理和配合物处理(羟基铝和羟基铬)后的牛心包材料组织作过组织羧基含量测定[6]。结果对照组组织羧基含量为0.7±0.016mmol/g；GA组为0.88±0.012mmol/g；配合物组分别为：羟基铝为0.36±0.012mmol/g，羟基铬为0.34±0.014mmol/g，明显低于GA组(P＜0.001)。

(2).组织基质被交联

蛋白聚糖(Proteoglycan，PG)是生物组织基质的主要成分，钌红为多聚阳离子结构，极易与多聚阴离子结构的蛋白聚糖结合。在透射电镜下可使这些蛋白聚糖颗粒呈现电子密度较高的颗粒。因此，采用钌红组化电镜可特异性显示PG颗粒[7]。我们用钌红组化染色通过扫描电镜和透射电镜观察GA处理和配合物处理(羟基铝和羟基铬)后的牛心包材料组织，结果见图1-6。结果表明，经配合物处理(羟基铝和羟基铬)后的牛心包组织PG颗粒明显减少。

(3).抗钙化性能

分别将羟基铬(HC)处理的牛心包瓣片和GA改性牛心包瓣片植入大鼠皮下21，60，90和120天后，用原子吸收法[11，12]作组织钙含量测定。结果如下表1所示。表1.HC和GA改性牛心包瓣片植入Wistar大鼠皮下21，60，90，120天钙含量(μg/mg)

瓣膜	钙含量
	钙含量				21天	60天	90天	120天
	HC(0.1％)改性	1.5±0.21	1.68±0.24	4.67±2.65	21天	60天	90天	120天	5.93±2.47
GA(0.3％)改性	HC(0.1％)改性	1.5±0.21	1.68±0.24	4.67±2.65	125.0±13.14	200.8±21.09	230.5±0.21	245.56±10.07	5.93±2.47
GA(0.3％)改性	n	14	14	12	125.0±13.14	200.8±21.09	230.5±0.21	245.56±10.07	13

将配合物处理的牛心包瓣片植入犬循环系同样获得了较好的抗钙化作用。

参考文献：

1.朱晓东、薛淦兴，《心脏外科指南》，世界图书出版公司，1990年10月，第一版，第389页

2.Edwards Lifesciences.News.http：//www.edwards.com.Aug.，312000

3.饶栩栩、黄震东、岑润超等，我国风湿性心脏病的流行现状，中华心血管病杂志，1998年4月第26卷第2期第98-100页

4.Ham-mermeiater KE.A comparison of outcomes in men 11 yearsafter heart valve replacement with a mechanicalvalve or bioprostjesis.NEng J Med，1993，328：1289-1296

5.Magilligan DJ.The future of bioprosthetic valves Trans Am SocArtif Intern Organs 1988，34：1032

6.Carpentier A.et al.Six-year follow-up of glutaraldehyde preservedheterografts：With particular reference to the treatment of congenital valvemolformation.J thorac Cardiovasc Surg 1974，68：771

7.Carpentier A.el al.Continuing improvements in valvularbioprostheses.J Thorac Cardiovasc Surg 1982，83：27

8.Carpentier A.et al.Techniques for prevention of calcification ofvalvular bioprostheses.Circ 1984，70(Suppl I)：165

9.Bowes JH，et al.The amino-acid composition and titration curve ofcollagen.Biochem.J，1948，43：358

10.易定华、刘维永、王伯云等，减轻异种(猪)主动脉瓣钙化的实验研究，中华胸心血管外科杂志，1988年第4卷第48页

11.Levy，R.J.et al.，Vitamin K-dependent calcium binding proteins inaortic valve calcification.J.Clin.Invest.，1980，65：563

12.地质化学标准参考样研究组，地质化学标准参考的研制与分析方法GSD1-8，地质出版社，北京，1986年，第182页

Claims

1.一种提高组织材料耐疲劳和抗钙化性能的方法，其特征在于，使用配位化合物的溶液对生物组织材料进行处理。

2.权利要求1的方法，其中使用配位化合物对组织材料进行处理时包括以下步骤：

a)预处理：用含有氯化钠的甲酸溶液处理组织材料；

b)交联处理：将预处理后的组织材料置于配位化合物溶液中浸泡处理；

c)后处理：将经交联处理的组织材料继续置于处理液中一段时间，然后转移到含有4％甲醛的等渗硫酸钠溶液中保存。

3.权利要求2的方法，其中步骤a)中是使用含0.9％氯化钠，pH为2.5的甲酸溶液在30℃下振荡处理组织材料。

4.权利要求3的方法，其中步骤b)中是使用配位化合物溶液在30℃-40℃的温度下振荡处理组织材料，并且处理过程中溶液的pH通过加入碳酸氢钠逐步升高，最终达到pH为4。

5.权利要求4的方法，其中所述组织材料为牛心包、猪主动脉及瓣膜、猪背侧腹膜、人阔筋膜和硬脑膜等新鲜组织材料和胶原涂层的人工材料。

6.权利要求5的方法，其中所述组织材料为牛心包。

7.权利要求4的方法，其中配位化合物的溶液由过渡金属元素的盐溶液制成。

8.权利要求7的方法，其中过渡金属元素为铬、铝和铁，且向过渡金属元素的盐溶液中加入了氢氧化钠，形成羟基铬、羟基铝和羟基铁。

9.权利要求8的方法，其中过渡金属元素为铁。

10.权利要求8的方法，其中过渡金属元素为铬。

11.权利要求1-8任一项的方法，其中，在使用配位化合物对组织材料进行处理之前，使用戊二醛对组织材料进行处理。

12.权利要求11的方法，其中，使用的戊二醛浓度为0.25-0.3％，

13.使用权利要求11的方法制备的组织材料，其中组织材料中的羧基和组织基质均被交联，且其具有良好的抗钙化性能。