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CN1413258A - 用于表达甲病毒复制子的侵袭性细菌载体 - Google Patents

用于表达甲病毒复制子的侵袭性细菌载体 Download PDF

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CN1413258A
CN1413258A CN00817758A CN00817758A CN1413258A CN 1413258 A CN1413258 A CN 1413258A CN 00817758 A CN00817758 A CN 00817758A CN 00817758 A CN00817758 A CN 00817758A CN 1413258 A CN1413258 A CN 1413258A
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CN
China
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antigen
nucleic acid
protein
acid sequence
heterologous nucleic
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CN00817758A
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J·古德斯密特
J·C·萨多夫
W·科夫
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International AIDS Vaccine Initiative Inc
Original Assignee
International AIDS Vaccine Initiative Inc
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Abstract

本发明涉及用于将甲病毒复制子DNA传递到动物或动物细胞中的细菌传递系统，所述甲病毒复制子DNA编码一个或更多个要在所述动物或动物细胞中表达的异源基因。所述细菌为经工程化以含有一种DNA载体的侵袭性细菌或侵袭性减毒细菌，所述DNA载体编码在真核表达盒中的所述甲病毒复制子。所述异源基因可编码抗原、治疗剂、免疫调节剂、反义RNA、催化性RNA、蛋白质、肽、抗体或抗体的抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，所述异源基因编码一种或更多种作为HIV疫苗的有用抗原。除了细菌传递系统之外，本发明提供在动物或动物细胞中引入并表达所述异源基因的方法以及刺激或激发免疫应答的方法。

Description

用于表达甲病毒复制子的侵袭性细菌载体
发明领域
本发明涉及用于将甲病毒复制子DNA传递到动物或动物细胞中的细菌传递系统，所述复制子编码待在所述动物或动物细胞中表达的一个或更多个异源基因。所述细菌为侵袭性细菌或侵袭性减毒细菌，所述细菌经工程改造以含有在真核表达盒中编码所述甲病毒复制子的DNA载体。在细菌感染后，该真核表达载体立即驱动所述DNA载体的初级转录，而产生一种甲病毒复制子RNA，该RNA则被运送到细胞质中。为了表达在甲病毒复制子中编码的异源基因，转录所述RNA，且如果该基因编码蛋白质，则翻译它。所述异源基因可编码抗原、治疗剂、免疫调节剂、反义RNA、催化性RNA、蛋白质、肽、抗体、抗体的抗原结合片段或希望传递到动物或动物细胞中的其它任何分子。在一个优选的实施方案中，该异源基因编码一种或更多种作为HIV疫苗的有用抗原。除了细菌传递系统之外，本发明还提供在动物或动物细胞中引入并表达异源基因的方法、刺激或激发免疫应答的方法以及用于此目的的疫苗。
发明背景
关于传递DNA到动物或动物细胞中，有许多的用途；包括用于获得性或者遗传性疾病或病症的基因治疗、用于基于DNA的疫苗接种、用于了解基因的结构以及用于研究构成基因表达之基础的分子机制。
借助阳离子脂质体[Watanabe等，Mol.Repord.Dev.38：268-274(1994)]、将裸露DNA直接注射到动物肌肉组织中[Robinson等，Vacc.11：957-960(1993)；Hoffman等，Vacc.12：1529-1533(1994)；Xiang等，Virol.199：132-140(1994)；Webster等，Vacc.12：1495-1498(1994)；Davis等，Vacc.12：1503-1509(1994)；以及Davis等，Hum.Molec.Gen.2：1847-1851(1993)]及直接注射到胚胎中[Naito等，Mol.Repord.Dev.39：153-161(1994)；和Burdon等，Mol.Repord.Dev.33：436-442(1992)]、或用“基因枪”技术进行DNA的真皮内注射[Johnston等，Meth.Cell Biol.43：353-365(1994)]，已实现了将DNA成功传递到动物组织中。这些技术的局限是它们仅有效地传递DNA到非肠道的部位。目前，有效传递真核表达盒至粘膜组织已获得了有限的成功。这大概是由于口服传递时很少进入到这些部位、传递载体的毒性或传递载体的不稳定性所致。
至于基于DNA的疫苗接种，通过注射裸露质粒DNA的传递已在小鼠模型中显示了既诱导体液免疫应答又诱导细胞免疫应答的潜力。然而，在较大的动物中，为了接种而采用DNA传递则因需要大量的DNA或诱发有可能产生对其耐受性的抗原的持续表达而受到阻碍。Berglund报道了一种通过用质粒DNA注射小鼠而诱发或增强免疫应答的策略；所述质粒DNA包含甲病毒DNA表达载体，该表达载体具有一个在真核表达盒中的重组塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)(SFV)复制子[Berglund等，Nature Biotechnol.16：562-565(1998)]。该真核表达盒控制SFV复制子的初级核转录的表达。编码异源抗原的这种SFV复制子的转录物被转运到细胞质中，并由自身编码的SFV复制酶复合物扩增SFV复制子的转录物。经扩增的RNA复制子导致产生高水平的编码所述异源抗原的mRNA。Polo和他的研究小组描述了类似的结果[Polo等，NatureBiotechnol.16：517-518(1998)；Hariharan等，J.Virol.72：950-958(1998)]。这两个研究小组都发现，用少量输入的质粒DNA能诱导强烈的免疫应答。虽然这种方法允许较多的来自输入DNA载体的表达，但该方法仍有与非肠道传递相关的缺点。
另一方面，传递DNA到动物的、克服传统传递方法缺点的方法是给予包含细菌DNA载体的侵染性减毒细菌；所述细菌DNA载体具有编码待表达的基因的真核表达盒。例如，PoweII等的美国专利第5,877,159号描述了能侵入动物细胞而不建立生产性感染或致病的活细菌，由此引入能被所述动物细胞表达的、编码抗原的真核表达盒。虽然这种方法允许传递该DNA疫苗到粘膜表面且容易给予(这是在发展中国家里对疫苗传递的所关注的一个问题)，但它不具有提供编码所关注基因的可扩增的mRNA的优点。
因此，本发明联合使用减毒的侵染性活细菌和编码甲病毒复制子的真核表达盒，以提供改良的细菌传递系统来传递一种或更多种异源基因到动物中。这样的系统既有细菌传递系统的优点、又有甲病毒复制子载体的优点，并且是有效的、成本有效和安全的。对于传递用于基因治疗和疫苗接种的DNA，本发明的细菌传递系统是特别有用的。
通过引用，将引用的所有文献和专利通过引用全部结合到本文中。
发明概述
按照本发明，一个实施方案涉及细菌传递系统，该细菌传递系统包括侵染性活细菌，所述细菌包含一种DNA，该DNA包含一个与能以RNA形式在动物细胞中扩增的甲病毒复制子DNA有效连接的真核表达盒；其中，所述甲病毒复制子DNA包含至少一种有效连接到异源核酸序列的核酸控制序列，以控制所述异源核酸序列的表达。在需要的时候，将本发明的侵染性活细菌减毒；只要传递到动物中的细菌或者不使所述动物患病，或者至多在动物中引起临床上无害的自限性感染。
所述异源核酸序列可编码抗原、蛋白质的抗原性片段、治疗剂、免疫调节剂、反义RNA、催化性RNA、蛋白质、肽、抗体、抗体的抗原结合片段、或可由DNA编码的且希望传递到动物或动物细胞中的其它任何分子。从选自流感病毒、呼吸道合胞病毒、HPV、HBV、HCV、HIV、HSV、FeLV、FIV、HTLV-I、HTLV-II和CMV的病毒中，可以得到所述的异源核酸序列。所述病毒序列能编码一种或更多种病毒基因或其抗原性片段。所述异源核苷酸序列可以编码细胞因子、白介素、红细胞生成素或其它免疫刺激蛋白或免疫调节蛋白。
本发明的另一个实施方案涉及一种通过用侵染性活细菌、尤其是减毒的侵染性细菌感染在动物体内引入和表达基因的方法。这些细菌含有一种包含真核表达盒的DNA，该真核表达盒具有一段能以RNA形式在所述动物细胞中扩增的甲病毒复制子DNA。而且，所述甲病毒复制子DNA指导一种或更多种编码待在所述动物中表达的基因产物之异源核酸序列的表达。该方法适用于传递编码抗原、抗原性蛋白片段、治疗剂、免疫调节因子、反义RNA、催化性RNA、蛋白质、肽、抗体、抗体的抗原结合片段、或可由DNA编码的且希望传递到动物或动物细胞中的其它任何分子的基因。
本发明的另一方面提供一种用侵染性活细菌感染动物而在所述动物体内诱导免疫应答的方法，所述细菌包含一种DNA，该DNA包含一个与能以RNA形式在动物细胞中扩增的甲病毒复制子DNA有效连接的真核表达盒；其中，所述甲病毒复制子DNA编码至少一种抗原或蛋白质的抗原性片段。以足够激发针对抗原或抗原性片段的免疫应答的水平，表达所述抗原或抗原性片段。在一个优选的实施方案中，所述抗原来源于病毒，且更优选来源于HIV病毒。这一方法提供一种使动物且最好是人免疫的手段，从而防备HIV的感染。在一个优选的实施方案中，该甲病毒复制子DNA编码至少一种来自HIV基因env、gag、pol、nef、tat和rev中的每一基因的抗原或抗原性片段。
本发明的再一方面涉及一种在动物细胞中引入和表达基因的方法，即通过(a)用侵染性活细菌感染该动物，所述活细菌包含一种或更多种DNA分子，其中所述DNA分子包含一个与能以RNA形式在所述动物细胞中扩增的甲病毒复制子DNA有效连接的真核表达盒；且所述甲病毒复制子按次序地包含至少一种有效连接到异源核酸序列上的核酸控制序列，以控制其表达；和(b)在足以表达由所述异源核酸序列编码的基因产物的条件下，培养这些细胞；由此在动物细胞中引入和表达基因。发明详述
当用于本文时，“侵染性细菌”为能够传递真核表达盒到动物细胞或动物组织中的细菌。“侵染性细菌”包括：天然能进入动物细胞的细胞质或细胞核的细菌，以及为了进入动物细胞或动物组织中之细胞的细胞质或细胞核而被遗传工程化的细菌。本发明的侵染性细菌感染宿主，而不在所感染的宿主中建立生产性感染和/或致病。在侵染性菌株可能引起动物疾病或对所述动物产生问题或健康危险的情况下，可以修饰该菌株，或将其减毒；使得它可用于本发明。因此，“减毒的侵染性细菌”是本发明的侵染性细菌，它们也能够感染动物宿主，而不在所感染的宿主中建立生产性感染和/或致病。减毒的细菌菌株至多可引起限于临床上无关紧要的自限性感染。减毒一般指的是相对于参照菌株而言感染能力减弱。
因此，用本技术领域已知的方法，可制备本发明的减毒细菌。例如，或者用化学方法，用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍，或者用重组DNA技术，可以运用非特异性诱变，将减毒突变引入到细菌病原体中；所述重组DNA技术为：经典的遗传学技术例如Tn10诱变、P22介导的转导、λ-噬菌体介导的交换以及接合转移，或用重组DNA技术的定点诱变。优选重组DNA技术。这样的减毒突变的实例包括但不限于：
(i)营养缺陷突变，例如aro突变[Hoiseth等，Nature，291：238-239(1981)]、gua突变[McFarland等，Microbiol.Path.3：129-141(1987)]、nad突变[Park等，J.Bact.170：3725-3730(1988)]、thy突变[Nnalue等，Infect.Immun.55：955-962(1987)]以及asd突变[Curtiss等，Dev.Biol.Stand.82：23-33(1994)]；
(ii)钝化综合调节功能的突变，例如cya突变[Curtiss等，Infect.Immun.55：3035-3043(1987)]、crp突变[Curtiss等，(1987)参见上文]、phoP/phoQ突变[Groisman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7077-7081(1989)；及Miller等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5054-5058(1989)]、phoPc突变[Miller等，J.Bact.172：2485-2490(1990)]或ompR突变[Dorman等，Infect.Immun.57：2136-2140(1989)]；
(iii)修饰应激应答的突变，例如recA突变[Buchmeier等，Mol.Micro，7：933-936(1993)]、htrA突变[Johnson等，Mol.Micro，5：401-407(1991)]、htpR突变[Neidhardt等，参见上文，1981]、hsp突变[Neidhardt等，参见上文，1984]和groEL突变[Buchmeier等，Science.248：730-732(1990)]；
(iv)专性毒力因子的突变，例如lsyA突变[Libby等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：489-493(1994)]、pag或prg突变[Miller等，(1990)，参见上文；及Miller等，(1989)，参见上文]、iscA或virG突变[d’Hauteville等，Mol.Micro，6：833-841(1992)]、plcA突变[Mengaud等，Mol.Microbiol.5：367-72(1991)；Camilli等，J.Exp.Med 173：751-754(1991)]和act突变[Brundage等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11890-11894(1993)]；
(v)影响DNA拓扑学的突变，例如topA突变[Galan等，Infect.Immun.58：1879-1885(1990)]；
(vi)阻断表面多糖生物发生的突变，例如rfb突变、galE突变[Hone等，J.Infect.Dis.156：164-167(1987)]或via突变[Popoff等，J.Gen.Microbiol 138：297-304(1992)]；
(vii)修饰自杀系统的突变，例如sacB突变[Recorbet等，App.Environ.Micro.59：1361-1366(1993)；Quandt等，Gene 127：15-21(1993)]、nuc突变[Ahrenholtz等，App.Environ.Micro.60：3746-3751(1994)]、hop突变、gef突变、kil突变或phlA突变[Molin等，Ann.Rev.Microbiol 47：139-166(1993)]；
(viii)引入自杀系统的突变，例如由P22编码的溶原体[Rennell等，Virol.143：280-289(1985)]、λ胞壁质糖基转移酶[Bienkowska-Szewczyk等，Mol.Gen.Genet 184：111-114(1981)]或S基因[Reader等，Virol.43：623-628(1971)]；以及
(ix)破坏或修饰正确的细胞周期的突变，例如minB突变[de Boer等，Cell 56：641-649(1989)]。
减毒突变或者可以是组成型表达的，或者可以是在诱导型启动子控制之下的；所述诱导型启动子例如：温度敏感型热激家族的启动子[Neidhardt等，1984，参见上文]、或厌氧诱导型nirB启动子[Harborne等，Mol.Micro，6：2805-2813(1992)]或阻抑型启动子例如uapA[Gorfinkiel等，J.Biol.Chem.268：23376-23381(1993)]或gcv[Stauffer等，J.Bact.176：6159-6164(1994)]。
用于本发明的具体的天然存在的侵染性细菌(或减毒的侵染性细菌)对于本发明并不是关键性的。根据动物或细胞、对不同种细菌感染的敏感性，本领域普通技术人员能容易地确定哪些细菌菌株适于供打算感染的动物或动物细胞使用。这样天然存在的侵染性细菌的实例包括但不限于：沙门氏菌(Salmonella spp.)、志贺氏菌(Shigella spp.)、李斯特氏菌(Listeria spp.)、立克次体(Rickettsia spp.)和肠侵染性大肠杆菌(E.coli)。如果需要，可以用已知的方法将这些菌株中的任何菌株减毒。
可以用于本发明中的志贺氏菌菌株的实例包括但不限于：弗氏志贺氏菌2a(Shigella flexneri 2a)(ATCC 29903号)、索氏志贺氏菌(Shigellasonnei)(ATCC 29930号)、及痢疾志贺氏菌(Shigella disenteriae)(ATCC13313号)。在本发明中最好使用减毒的志贺氏菌菌株，例如弗氏志贺氏菌2a 2457TΔaroA ΔvirG突变体CVD 1203[Noriega等，Infect.Immun.62：5168-5172(1994)]、弗氏志贺氏菌M90T ΔicsA突变体[Goldberg等，Infect.Immun.62：5664-5668(1994)]、弗氏志贺氏菌Y SFL114 aroD突变体[Kamell等，Vacc.10：167-174(1992)]及弗氏志贺氏菌Δaro A ΔaroD突变体[Verma等，Vacc.9：6-9(1991)]。另一方面，通过或者单独地、或者与一种或更多种另外的减毒突变一起引入一种减毒突变，可以构建新的减毒的志贺氏菌菌株。
可以用于本发明的李斯特氏菌菌株的实例包括：单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(ATCC 15313号)。在本发明中优选使用减毒的李斯特氏菌菌株，例如单核细胞增生李斯特氏菌ΔactA突变株(Brundage等，参见上文)或单核细胞增生李斯特氏菌ΔplcA[Camilli等，J.Exp.Med 173：751-754(1991)]。另一方面，如同上面对志贺氏菌而描述的，通过引入一种或更多种减毒突变，可以构建新的减毒的李斯特氏菌菌株。
可以用于本发明的立克次体株的实例包括：立氏立克次体(Rickettsiarickettsiae)(ATCC VR149号和VR891号)、普氏立克次体(Rickettsiaprowaseckii)(ATCC VR233号)、恙虫热立克次体(Rickettsia tsutsugamuchi)(ATCC VR312号、VR150号和VR609号)、莫塞尔氏立克次体(Rickettsiamooseri)(ATCC VR144号)、西伯利亚立克次体(Rickettsia sibirica)(ATCCVR151号)和五日热罗卡利马氏体(Rochalimaea quitana)(ATCC VR358号)。在本发明中优选使用减毒的立克次体株，且如同上面对志贺氏菌而描述的，通过引入一种或更多种减毒突变，可以构建减毒的立克次体株。
可以用于本发明的大肠杆菌菌株的实例包括：大肠杆菌菌株4608-58、1184-68、53638-C-17、13-80和6-81[Sansonetti等，Ann.Microbiol.(Inst.Pasteur)132A：351-355(1982)]。在本发明中优选使用减毒的肠侵染性大肠杆菌菌株，且如同上面对志贺氏菌而描述的，通过引入一种或更多种减毒突变，可以构建减毒的肠侵染性大肠杆菌菌株。
可以用于本发明的沙门氏菌菌株的实例包括伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)(ATCC 7251号)和鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)(ATCC13311号)。在本发明中优选使用减毒的沙门氏菌菌株，且减毒的沙门氏菌菌株包括伤寒沙门菌aro AaroD[Hone等，Vacc.9：810-816(1991)]和鼠伤寒沙门菌aroA突变株[Mastroeni等，Micro.Pathol.13：477-491(1992)]。另一方面，如同上面对志贺氏菌而描述的，通过引入一种或更多种减毒突变，可以构建新的减毒的沙门氏菌菌株。
可以遗传工程化成侵染性的另外的细菌的实例包括但不限于：耶尔森氏菌(Yersinia spp.)、埃希氏杆菌(Escherichia spp.)、克雷伯氏菌(Klebsiella spp.)、博德特氏菌(Bordetella spp.)、奈瑟氏菌(Neisseria spp.)、气单胞菌(Aeromonas spp.)、弗朗西丝氏菌(Franciesellas spp.)、棒杆菌(Corynebacterium spp.)、柠檬酸杆菌(Citrobacter spp.)、衣原体(Chlamydiaspp.)、嗜血菌(Hemophilus spp.)、布鲁氏菌(Brucella spp.)、分枝杆菌(Mycobacterium spp.)、军团菌(Legionella spp.)、红球菌(Rhodococcusspp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、螺杆菌(Helicobacter spp.)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、弧菌(Vibrio spp.)、芽胞杆菌(Bacillus spp.)和丹毒丝菌(Erysipelothrix spp.)。通过插入使这些生物体能够进入动物细胞细胞质的基因，可以将这些生物体工程化，以模仿志贺氏菌、李斯特氏菌、立克次体或肠侵染性大肠杆菌的侵袭特性。在第5,877,159号美国专利中，可找到来自这些细菌的有用菌株之具体实例。另外，牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)BCG是一种能够被工程化而用于本发明的有用的菌株(strait)。
使细菌能够进入细胞之细胞质的基因的实例包括志贺氏菌属(Shigella)的侵染性蛋白、埃希氏杆菌属(Escherichia)的溶血素或侵袭质粒、或李斯特氏菌属(Listeria)的李斯特菌溶胞素O。已知引入这样的基因则产生能够进入所感染动物细胞细胞质的菌株[Formal等，Infect.Immun.46：465(1984)；Bielecki等，Nature 345：175-176(1990)；Small等，载于：Microbiology-1986，第121-124页，Levine等编辑，American Society forMicrobiology，Washington D.C.(1986)；及Zychlinsky等，Molec.Micro.11：619-627(1994)]。来自一种或更多种来源的、介导进入到动物细胞细胞质中的任一种基因或基因组合都满足需要。因此，这样的基因不限于细菌基因；而可包括病毒基因，例如促进内渗溶胞(endosmolysis)的流感病毒血凝素HA-2[Plank等，J.Biol.Chem.269：12918-12924(1994)]。
运用染色体或质粒转移[Miller，A Short Course in Bacterial Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor N.Y.(1992)；Bothwell等，Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes，编辑，Jones and Bartlett Publishers Inc.，Boston，Mass.(1990)；以及Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，Jone Wiley and Sons，New York，N.Y.(1992)]、噬菌体介导的转导[de Boer等，Cell，56：641-649(1989)；Miller(1992)，参见上文；以及Ausubel等，参见上文]、或化学药品[Bothwell等，参见上文；Ausubel等，参见上文；Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7417(1987)；及Farhood，Annal.N.Y.Acad.Sci.716：23-34(1994)]、电穿孔[Bothwell等，参见上文；Ausubel等，参见上文；及Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor N.Y.]以及物理转化技术[Johnston等，参见上文；以及Bothwell等，参见上文]，可以将上述侵染性基因引入到靶菌株中。可以把所述基因掺入到噬菌体中[de Boer等，参见上文]、质粒载体中[Curtiss等，(1987)或Curtiss等，(1994)，参见上文]或将其剪接到靶菌株的染色体中[Hone等，参见上文(1987)]。
此外，可以改变供本发明之用的细菌，从而增强其感染动物粘膜表面和组织的能力。这样的改变允许所述细菌通过天然的宿主屏障。在美国专利5,877,159号中，描述了用于构建这样的细菌的方法。
按照本发明，所述侵染性细菌或减毒的侵染性细菌包含一种DNA，该DNA包括一个有效连接到甲病毒复制子DNA的真核表达盒。真核表达盒通常为质粒形式，所述质粒含有甲病毒复制子DNA转录以及从细胞核转运到细胞质所需要的元件。例如，RNA聚合酶II盒提供所需要的调控元件。因此，用于转录和转运的元件可包括但不限于：在真核细胞中有活性的启动子、增强子、包括聚腺苷酸化信号或多聚A序列段的转录终止信号、促进核质转送的元件、促进3’甲病毒复制子RNA被加工为真正病毒样RNA 3’末端的元件等等。
因此，用于本发明的具体真核盒对于本发明并不是关键性的；且可从例如商业上可得到的许多盒的任一种中，挑选所述真核表达盒；所述商业上可得到的盒例如：来自Invitrogen Corporation(San Diego，Calif.)的pCEP4或pRc/RSV，来自Stratagene(La Jolla，Calif.)的pXT1、pSG5、pPbac或pMbac，来自ClonTech(Palo Alto，Calif.)的pPUR或pMAM以及来自Promega Corporation(Madison，Wis.)的pSVβ-gal；或者，可以或从头合成所述的真核表达盒、或通过对公众可获得或商业上可得到的真核表达系统进行改变，而合成所述的真核表达盒。
在所述真核表达盒内的各个元件可以来源于多个来源，且可以挑选各种元件，从而在受体细胞中赋予所述盒的作用位点特异性或耐久性。可用任一标准的分子生物学方法，进行真核表达盒的这种操作。
可用于在动物细胞中驱动基因表达的各种各样的启动子是众所周知的，例如：病毒来源的SV40启动子、CMV的立即早期启动子和RSV启动子，或者真核来源的β-酪蛋白启动子、子宫珠蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子或酪氨酸酶启动子。对于本发明，具体启动子不是关键性的；除非目的是获得组织特异性的表达。在这种情况下，可以挑选仅在所需组织或所选定细胞类型中有活性的启动子。组织特异性启动子的实例包括但不限于：对乳腺组织特异性的αS1-和β-酪蛋白启动子[Platenburg等，Trans.Res.3：99-108(1994)；及Maga等，Trans.Res.3：36-42(1994)]，在肝、肾、脂肪、空肠和乳腺组织中有活性的烯醇丙酮酸磷酸羧激酶启动子[McGrane等，J.Reprod.Fert.41：17-23(1990)]，在肺和脾细胞中有活性而在睾丸、脑、心、肝或肾中无活性的酪氨酸酶启动子[Vile等，Canc.Res.54：6228-6234(1994)]，仅在鳞状上皮的分化中的角质化细胞中有活性的involucerin启动子[Carroll等，J.Cell Sci.，103：925-930(1992)]，以及在肺和子宫内膜中有活性的子宫珠蛋白启动子[Helftenbein等，Annal.N.Y.Acad.Sci.622：69-79(1991)]。
另一方面，可以用细胞特异性的增强子序列来控制表达。例如，人嗜神经乳多空病毒(papovirus)JCV增强子仅仅在神经胶质细胞中调节病毒的转录[Remenick等，J.Virol.65：5641-5646(1991)]。控制组织特异性表达的再一种方式是运用激素效应元件(HRE)来限定启动子将在哪些细胞谱系中有活性，例如，在活化启动子之前，MMTV启动子需要激素受体(例如黄体酮受体)结合到上游HRE上[Beato，FASEB J.5：2044-2051(1991)；和Truss等，J.Steroid Biochem.Mol.Biol.41：241-248(1992)]。
合适的转录终止元件包括SV40转录终止区和从其中得到的终止子。
在5,824,538号和5,877,159号美国专利中，描述了另外的适合于表达甲病毒复制子DNA的真核表达盒和/或调节元件的实例。
细菌传递系统的细菌可包含一种或更多种有效连接到甲病毒复制子的真核表达盒。可以在所述细菌中所包含的同一质粒或DNA分子上、或者在不同的质粒或DNA分子上提供这样的盒。在某些实例中，使所述真核表达盒整合到细菌染色体或其它附加型DNA中可能是所希望的；且将这样的实例包括在本发明的范围之内。
甲病毒属来自披膜病毒(Togavirus)科，且在本技术领域是众所周知的。运用血凝测定而分类，已知有26种病毒和病毒亚型。至于许多甲病毒的一览表，参见例如5,843,723号美国专利。通常研究的甲病毒包括辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、SFV、委内瑞拉马脑炎病素(Venezuelan equineencephalitis virus)(VEE)和罗斯河病毒(Ross River virus)。所述病毒的形态发生是相当一致的，且病毒粒子是60-65nm的、有包膜正链RNA小粒子。甲病毒基因组RNA(49S RNA)大约长11-12kb，且包含5’帽和3’多聚腺苷酸的尾。通过在细胞质中将病毒核衣壳蛋白装配到基因组RNA上、且经由包埋有病毒所编码糖蛋白的细胞膜出芽，而产生感染性有包膜病毒。在病毒复制期间，基因组49S RNA充当合成互补负链的模板。该负链本身又充当全长基因组RNA和内部起始的正链26S亚基因组RNA的模板。根据该基因组RNA翻译出非结构蛋白。根据亚基因组26SRNA翻译出甲病毒结构蛋白。所有病毒蛋白首先以多聚蛋白的形式合成，且通过翻译后蛋白水解切割将其加工成各个蛋白。
当用于本文时，可互换地使用本发明的“甲病毒复制子”来表示包含甲病毒基因组RNA中的那些必需部分的RNA或DNA；所述必需部分是对转录和从细胞核中输出初级RNA转录物到细胞质、对所转运RNA的细胞质扩增以及对异源核酸序列的亚基因组表达是必需的部分。因此，该复制子编码并表达甲病毒RNA的细胞质扩增以及亚基因组RNA之表达所需的那些非结构蛋白。而且最好是不能将该甲病毒复制子包衣壳来产生甲病毒颗粒或病毒粒子。可以用缺少一种或更多种甲病毒结构基因的复制子来实现这一点，且最好是用缺少全部结构基因的复制子来实现这一点。在一个优选的实施方案中，能够由真核表达盒转录出本发明的甲病毒复制子，且能够将甲病毒复制子加工成具有真正甲病毒样5’和3’末端的RNA分子。
甲病毒复制子和包含它们的表达载体是本技术领域众所周知的，且已描述了含有各式各样甲病毒复制子的许多载体。例如在5,739,026号、5,766,602号、5,789,245号、5,792,462号、5,814,482号和5,843,723号美国专利中以及在上述Polo和上述Berglund的文章中，可以找到这样的复制子的实例。虽然这些甲病毒复制子的许多特征可用于本发明，但并由于上面所提出的理由非其全部特征都是必需的。只要甲病毒复制子的部分不干扰初级RNA转录物的产生、其细胞质的扩增以及异源核酸序列的表达，则这样的部分仍然可以作为该复制子的部分。本领域技术熟练人员能容易地确定任何不必要的序列或干扰的序列的性质并将其除去。
上面提出的专利和参考文献也描述了用于构建和产生本发明的甲病毒复制子的代表性方法。可以由任何甲病毒或任何甲病毒核酸序列的混合物来制备甲病毒复制子。在这方面，优选的甲病毒复制子来源于辛德毕斯病毒、SFV、VEE或罗斯河病毒。
运用本领域常规的重组DNA技术，可以将甲病毒复制子以DNA形式掺入到真核表达盒中。
按照本发明，该甲病毒复制子包括有效连接到异源核酸序列上从而控制其表达的核酸控制序列。这些控制序列是控制所需要的转录和翻译的序列元件。所述控制元件可包括但不限于：启动子、增强子、转录终止信号、翻译起始位点等等。这些元件可以与本文描述的用于那些真核表达盒的那些元件相同或不同于。在某些情况下，可以在所述真核表达盒中使用与控制异源核酸表达的序列元件相同的序列元件。
当用于本文时，“异源的”表示甲病毒复制子来源和异源核酸序列来源之间的关系。因此，所述异源核酸序列不编码甲病毒基因，而是编码对已用本发明的细菌传递系统感染的动物细胞而言或者是外源的、或者是内源的基因。当用于本文时，“外源的基因或核酸序列”表示编码蛋白质或其片段或反义RNA或催化性RNA的基因或核酸序列；所述的基因或核酸序列对受体动物细胞或组织而言是外来的，所述的蛋白质或其片段或反义RNA或催化性RNA例如疫苗抗原、免疫调节剂或治疗剂。“内源的基因或核酸序列”表示天然存在于受体动物、动物细胞或组织中的编码蛋白质或其部分或反义RNA或催化性RNA的基因或核酸序列。
可以由天然存在的基因序列或合成构建的基因序列来构建所述异源核酸序列。
所述异源核酸序列或异源基因(两者可互换使用)可编码抗原、蛋白质的抗原性片段、治疗剂、免疫调节剂、反义RNA、催化性RNA、蛋白质、肽、抗体、抗体的抗原结合片段、或可由DNA编码的且希望传递到动物或动物细胞中的其它任何分子。从选自流感病毒、呼吸道合胞病毒、HPV、HBV、HCV、HIV、HSV、FeLV、FIV、HTLV-I、HTLV-II和CMV的病毒中，可以得到所述的异源核酸序列。将这些缩写用于以下所述的病毒：HPV，人乳头瘤病毒；HBV，乙型肝炎病毒；HCV，丙型肝炎病毒；HIV，人免疫缺陷病毒；HSV，单纯疱疹病毒；FeLV，猫白血病病毒；FIV，猫免疫缺陷病毒；HTLV-I，人嗜T淋巴细胞病毒I；HTLV-II，人嗜T淋巴细胞病毒II；及CMV，巨细胞病毒。
所述病毒序列可以编码一种或更多种病毒基因或其抗原性片段。所述异源核苷酸序列也可以编码细胞因子、白介素、红细胞生成素或其它免疫刺激蛋白或免疫调节蛋白。
所述抗原可以是来自病毒病原体、细菌病原体和寄生病原体的蛋白质或其抗原性片段。另一方面，所述抗原可以是用重组DNA方法构建的合成基因；所述合成基因编码来自病毒病原体、细菌病原体、寄生病原体的抗原或其部分。这些病原体在人、家畜或野生动物宿主中可以是感染性的。
所述抗原可以是由任何病毒病原体、细菌病原体、寄生病原体在进入其动物宿主体内、在其动物宿主中定居或复制之前或期间表达的任何分子。
可以传递表达病毒抗原、细菌抗原、寄生物抗原或合成基因的任何组合的单个或多个真核表达盒，其中所述合成基因编码病毒抗原、细菌抗原、寄生物抗原之整个抗原或部分或任何组合。所述病毒病原体(由它们得到所述病毒抗原)包括但不限于：正粘病毒，例如流感病毒；逆转录病毒，例如RSV和SIV；疱疹病毒，例如EBV、CMV或单纯疱疹病毒；慢病毒，例如人免疫缺陷病毒；弹状病毒，例如狂犬病病毒；细小核糖核酸病毒，例如脊髓灰质炎病毒；痘病毒，例如痘苗病毒；轮状病毒以及细小病毒。病毒病原体的保护性抗原的实例包括：HIV抗原nef、p24、gp120、gp41、gp160、env、gag、tat、rev和pol[Ratner等，Nature 313：277-280(1985)]以及gp120的T细胞和B细胞表位[Palker等，J.Immunol.142：3612-3619(1989)]；乙型肝炎病毒表面抗原[Wu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：4726-4730(1989)]；轮状病毒抗原例如VP4和VP7[Mackow等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：518-522(1990)；Green等，J.Virol.62：1819-1823(1988)]；流感病毒抗原，例如血凝素或核蛋白(Robinson等，参见上文；Webster等，参见上文)以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶(Whitley等，在New Generation Vaccines的第825-854页中)。在HIV的情况下，所述抗原可来自任何结构基因、辅助基因或调节基因；且在多个或单个甲病毒复制子中，包含这样基因的组合或嵌合体。在一个优选实施方案中，所述异源基因编码至少一种来自HIV基因env、gag、pol、nef、tat和rev中每种的抗原或抗原性片段。
细菌病原体(由它们得到所述的细菌抗原)包括但不限于：分枝杆菌、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌、立克次体、李斯特氏菌、肺炎军团菌(Legionellapneumoniae)、假单胞菌、弧菌和布氏疏螺旋体(Borellia burgdorferi)。
细菌病原体的保护性抗原的实例包括：索氏志贺氏菌1型抗原[Formal等，Infect.Immun.34：746-750(1981)]、霍乱弧菌(V.cholerae)Inaba菌株569B的O-抗原[Forrest等，J.Infect.Dis.159：145-146(1989)]、肠毒性大肠杆菌的保护性抗原例如CFA/I菌毛抗原[Yamamoto等，Infect.Immun.50：925-928(1985)]和不耐热毒素的无毒B-亚基[Clements等，Infect.Immun.46：564-569(1984)]、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的pertactin[Roberts等，Vacc.10：43-48(1992)]、百日咳博德特氏菌的腺苷酸环化酶-溶血素[Guiso等，Micro.Path.11：423-431(1991)]、以及破伤风梭菌(Clostridium tetani)之破伤风毒素的片段C[Fairweather等，Infect.Immun.58：1323-1326(1990)]。
所述的寄生病原体(由它们得到所述寄生物的抗原)包括但不限于：疟原虫(Plasmodium spp.)、锥虫(Trypanosome spp.)、贾第鞭毛虫(Giardiaspp.)、牛蜱(Boophilus spp.)、巴贝虫(Babesia spp.)、内阿米巴(Entamoebaspp.)、艾美球虫(Eimeria spp.)、利什曼原虫(Leishmania spp.)、血吸虫(Schistosome spp.)、布氏丝虫(Brugia spp.)、片吸虫(Fascida spp.)、恶丝虫(Dirofilaria spp.)、吴策线虫(Wuchereria spp.)和盘尾丝虫(Onchocereaspp.)。
寄生病原体保护性抗原的实例包括：疟原虫的环子孢子抗原[Sadoff等，Science 240：336-337(1988)]例如P.bergerii的环子孢子抗原或恶性疟原虫(P.falciparum)的环子孢子抗原；疟原虫的裂殖子表面抗原[Spetzler等，Int.J.Pept.Prot.Res.43：351-358(1994)]；溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)的半乳糖特异性凝集素[Mann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：3248-3252(1991)]、利什曼原虫的gp63[Russell等，J.Immunol.140：1274-1278(1988)]、马来丝虫(Brugia malayi)的副肌球蛋白[Li等，Mol.Biochem.Parasitol.49：315-323(1991)]，曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)的磷酸丙糖异构酶[Shoemaker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1842-1846(1992)]，蛇形毛圆线虫(Trichostrongylus colubriformis)的分泌型珠蛋白样蛋白[Frenkel等，Mol.Biochem.Parasitol.50：27-36(1992)]，肝片吸虫(Frasciola hepatica)的谷胱甘肽-S-转移酶[Hillyer等，Exp.Parasitol.75：176-186(1992)]、牛血吸虫(Schistosoma bovis)和日本血吸虫(S.japonicum)的谷胱甘肽-S-转移酶[Bashir等，Trop.Geog.Med.46：255-258(1994)]，以及牛血吸虫和日本血吸虫的KLH[Bashir等，参见上文]。
在本发明中，侵染性活细菌也可以传递具有编码治疗剂的甲病毒复制子的真核表达盒到动物细胞或动物组织里。
具有甲病毒复制子的真核表达盒也可编码肿瘤特异性抗原、移殖抗原或自身免疫抗原或它们的抗原部分。肿瘤特异性抗原的实例包括但不限于：前列腺特异性抗原[Gattuso等，Human.Pathol.26：123-126(1995)]、TAG-72和CEA[Guadagni等，Int.J.Biol.Markers 9：53-60(1994)]、MAGE-1以及酪氨酸酶[Coulie等，J.Immunothera.14：104-109(1993)]。近来在小鼠方面已表明：用表达肿瘤抗原的非恶性细胞免疫，则提供一种疫苗效应，并且还帮助该动物建立清除展示同一抗原的恶性肿瘤细胞的免疫应答[Koeppen等，Anal.N.Y.Acad.Sci.690：244-255(1993)]。因此，用于表达肿瘤抗原的细菌传递系统提供了一种可供选择的给癌症患者接种疫苗的方式。
移殖抗原的实例包括T细胞上的CD3受体[Alegre等，Digest.Dis.Sci.40：58-64(1995)]。已经表明，用针对CD3受体之抗体的治疗迅速地清除循环的T细胞，且逆转大多数排斥事件(Alegre等，参见上文)。自身免疫抗原的实例包括IASβ链[Topham等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8005-8009(1994)]。已经证实，用一种来自IASβ链的18个氨基酸的肽接种小鼠，则为患有实验性自身免疫性脑脊髓炎的小鼠提供保护和治疗(Topham等，参见上文)。
另一方面，在本发明中，侵染性活细菌能传递具有编码一种或更多种免疫调节分子的甲病毒复制子的真核表达盒。这些免疫调节分子包括但不限于：生长因子，例如M-CSF、GM-CSF；以及细胞因子，例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12或干扰素-γ。近来已表明，传递细胞因子表达盒到肿瘤组织中则激发有效的系统免疫，且增强肿瘤抗原的呈递而不产生系统的细胞因子毒性[Golumbek等，Canc.Res.53：5841-5844(1993)；Golumbek等，Immun.Res.12：183-192(1993)；Pardoll，Curr.Opin.Oncol.4：1124-1129(1992)；及Pardoll，Curr.Opin.Immunol.4：619-623(1992)]。
可以使传递到动物细胞中的反义RNA和催化性RNA种类靶向存在于受体细胞内或很可能存在于受体细胞内的任何分子。这些包括但不限于：编码细胞调节分子例如白细胞介素-6的RNA种类[Mahieu等，Blood84：3758-3765(1994)]；癌基因例如ras[Kashani-Sabet等，Antisen.Res.Devel.2：3-15(1992)]；癌症病原体例如人乳头瘤病毒[Steele等，Canc.Res.52：4706-4711(1992)]；编码酶、病毒RNA和病原体来源的RNA例如HIV-RNA的RNA种类[Meyer等，Gene 129：263-268(1993)；Chatterjee等，Science 258：1458-1488(1992)；及Yamada等，Virol.205：121-126(1994)]。也可以使所述的RNA靶向非转录DNA序列，例如启动子或增强子区域；或者靶向任何存在于受体细胞内的其它分子，例如但不限于，与DNA合成有关的酶或tRNA分子[Scanlon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10591-10595(1991)；及Baier等，Mol.Immunol.31：923-932(1994)]。
在本发明中，侵染性活细菌也能传递具有编码蛋白质的甲病毒复制子的真核表达盒到动物组织中，随后可从该动物组织收获或纯化这样的蛋白。一个实例是传递在例如得自鼠乳腺瘤病毒(ATCC VR731号)的乳腺特异性病毒启动子控制下、编码α1-抗胰蛋白酶的真核表达盒到山羊或绵羊的腺房组织中，从而允许由所述动物的乳中回收该蛋白。
另一方面，可以将携带本发明真核表达盒的侵染性细菌引入到组织位点上，以致它不会从这种位点传播。可以用几种方法中的任一种来完成这一步，所述的几种方法包括：传递很有限的剂量；传递剧烈减毒的营养缺陷型菌株，例如将被迅速灭活或将迅速死亡的asd突变体(Curtiss等，(1994)，参见上文)；或者传递含有减毒损害(attenuating lesion)例如在强启动子控制之下的自杀系统(Rennell等，参见上文；以及Reader等，参见上文)的细菌菌株，所述强启动子例如将在受体宿主组织内被启用的厌氧性nirB启动子(Harborne等，参见上文)。另一方面，通过使用不同的种和/或血清型，可以将多剂量的携带所关注真核表达盒的侵染性细菌给予动物，以便控制表达水平或产物类型。这种方法免除对含有组织特异性启动子且具有严格的表达控制的、特殊饲养的转基因动物的需要，目前就是这样[Janne等，Int.J.Biochem.26：859-870(1994)；Mullins等，Hyperten.22：630-633(1993)；及Persuy等，Eur.J.Biochem.205：887-893(1992)]。
按照另外可采用的一种方法，可以以任何与编码免疫调节分子或其它蛋白质的真核表达盒的单一或多重组合的方式，来传递单个或多个编码抗原或抗原性片段的真核表达盒。
可以用含有本发明真核表达盒的侵染性细菌来感染在体外培养的动物细胞。可在体外进一步培养所述的动物细胞，并可通过针对在感染时引入到该受体细胞中的任何可选择标记进行选择，来富集具有所需遗传特性的细胞；也称之为细菌转染(bactofection)。这样的标记可包括：抗生素(例如潮霉素或新霉素)抗性基因、细胞表面选择标记、或通过细菌转染而引入或改变的任何其它表型元件或基因型元件。然后，可将这些体外感染的细胞或体外富集的细胞经静脉内、肌内、皮内地或腹膜内引入到动物体内，或者通过允许所述细胞进入宿主组织并且表达所关注的异源核酸序列的任何接种途径，将所述细胞引入到动物体内。另一方面，可以用这些体外感染的细胞来生产及回收由该异源核酸序列编码的基因产物。
为了用含有本发明真核表达盒的侵染性活细菌感染动物，可通过静脉内、肌内、皮内、腹膜内、经口、鼻内、眼内、直肠内、阴道内、口服、浸渍以及尿道内的接种途径，引入所述的细菌。
所给予的本发明侵染性活细菌的量将根据受治疗者的种类、以及正在治疗的疾病或病状而变化。通常，所用的剂量将为大约103-1011个有活力有机体；优选约105-109个有活力有机体。另一方面，当细菌转染单个细胞时，待给予的有活力有机体的剂量感染复数计将在大约0.1至106、且优选大约102-104的范围内。
通常，与一种药学上可接受的载体或稀释剂一道给予本发明的侵染性细菌。
对于本发明，所用特定的药学上可接受的载体或稀释剂不是关键性的。稀释剂的实例包括：磷酸缓冲盐溶液；用于在胃中对胃酸进行缓冲的缓冲液，例如含有蔗糖的柠檬酸缓冲液(pH 7.0)、单独的碳酸氢盐缓冲液(pH 7.0)[Levine等，J.Clin.Invest.79：888-902(1987)；及Black等，J.Infect.Dis.155：1260-1265(1987)]、或含有抗坏血酸、乳糖以及可任意选择的天冬甜素的碳酸氢盐缓冲液(pH 7.0)[Levine等，Lancet II：467-470(1988)]。载体的实例包括：蛋白质，例如在脱脂乳中发现的蛋白质；糖，例如蔗糖；或聚乙烯吡咯烷酮。一般可以以大约0.1-90％(w/v)的浓度、但优选以1-10％(w/v)的浓度范围，来使用这些载体。
当感染动物细胞时，可以将本发明的方法用于哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞等等。哺乳动物细胞最好选自人细胞、牛细胞、绵羊细胞、猪细胞、猫细胞、水牛细胞、犬细胞、山羊细胞、马细胞、驴细胞、鹿细胞和灵长类细胞。
当感染动物时，最好将本发明的方法用于哺乳动物与鸟类。优选的哺乳动物是人。

Claims (45)

1.一种细菌传递系统，所述细菌传递系统包括侵染性活细菌，所述细菌包含一种DNA，所述DNA包含一个与能以RNA形式在动物细胞中扩增的甲病毒复制子DNA有效连接的真核表达盒；其中，所述甲病毒复制子DNA包含至少一种有效连接到异源核酸序列上的核酸控制序列，以控制所述异源基因的表达。
2.权利要求1的细菌传递系统，其中，所述细菌是减毒的。
3.权利要求1的细菌传递系统，其中所述异源核酸序列包含基因的一个或更多个编码区。
4.权利要求3的细菌传递系统，其中，可以分别表达或以操纵子形式表达所述异源核酸序列的每个编码区。
5.权利要求1的细菌传递系统，其中，所述异源核酸序列编码抗原、蛋白质的抗原性片段、治疗剂、免疫调节剂、反义RNA、催化性RNA、蛋白质、肽、抗体或抗体的抗原结合片段。
6.权利要求5的细菌传递系统，其中，所述抗原或蛋白质的所述抗原性片段来自病毒病原体、细菌病原体或寄生病原体。
7.权利要求1的细菌传递系统，其中所述异源核酸序列为来自病毒的病毒序列，而所述病毒选自流感病毒、呼吸道合胞病毒、HPV、HBV、HCV、HIV、HSV、FeLV、FIV、HTLV-I、HTLV-II和CMV。
8.权利要求7的细菌传递系统，其中所述病毒序列编码一种或更多种病毒基因或由所述基因编码的蛋白质的抗原性片段。
9.权利要求7的细菌传递系统，其中所述病毒为HIV。
10.权利要求9的细菌传递系统，其中所述异源核酸序列编码一种或更多种选自env、gag、pol、nef、tat或rev的HIV基因，或者编码由所述基因中的任何一种编码的蛋白质的抗原性片段。
11.权利要求10的细菌传递系统，其中所述异源核酸序列编码至少一种来自HIV基因env、gag、pol、nef、tat和rev中的一种的抗原或抗原性片段。
12.权利要求10或11的细菌传递系统，其中所述HIV基因来自一种HIV分离物或来自HIV分离物的共有序列。
13.权利要求5的细菌传递系统，其中所述抗原或蛋白质的所述抗原性片段为肿瘤抗原、移殖抗原或自身免疫抗原。
14.权利要求1的细菌传递系统，其中所述异源核酸序列编码细胞因子、自细胞介素、红细胞生成素或其它免疫刺激蛋白或免疫调节蛋白。
15.一种用于在动物中引入及表达基因的方法；所述方法包括用侵染性活细菌感染所述动物，所述侵染性活细菌包含一种DNA，所述DNA包含一个与能以RNA形式在动物细胞中扩增的甲病毒复制子DNA有效连接的真核表达盒；其中，所述甲病毒复制子DNA包含至少一种有效连接到异源核酸序列上的核酸控制序列，以控制所述异源核酸序列的表达；并因此在所述动物中获得由所述异源核酸序列编码的基因产物的表达。
16.权利要求15的方法，其中所述细菌是减毒的。
17.权利要求15的方法，其中所述异源核酸序列包含基因的一个或更多个编码区。
18.权利要求15的方法，其中，所述基因产物为抗原、抗原性蛋白质片段、治疗剂、免疫调节剂、反义RNA、催化性RNA、蛋白质、肽、抗体或抗体的抗原结合片段。
19.权利要求18的方法，其中所述抗原或蛋白质的所述抗原性片段来自病毒病原体、细菌病原体或寄生病原体。
20.权利要求18的方法，其中所述抗原或蛋白质的所述抗原性片段为肿瘤抗原、移殖抗原或自身免疫抗原。
21.权利要求15的方法，其中所述异源核酸序列为一种来自病毒的病毒序列，而所述病毒选自流感病毒、呼吸道合胞病毒、HPV、HBV、HCV、HIV、HSV、FeLV、FIV、HTLV-I、HTLV-II和CMV。
22.权利要求21的方法，其中所述病毒为HIV。
23.权利要求15的方法，其中所述异源核酸序列编码细胞因子、白细胞介素、红细胞生成素或其它免疫刺激蛋白或免疫调节蛋白。
24.权利要求15的方法，其中，通过鼻内传递途径发生感染。
25.一种用于在动物中诱发免疫应答的方法；所述方法包括用侵染性活细菌感染所述动物，所述侵染性活细菌包含一种DNA，所述DNA包含一个与能以RNA形式在动物细胞中扩增的甲病毒复制子DNA有效连接的真核表达盒；其中，所述甲病毒复制子DNA编码至少一种抗原或蛋白质的抗原性片段，且其中所述抗原或所述片段以足以激发针对所述抗原或所述片段的免疫应答的水平表达。
26.权利要求25的方法，其中所述细菌是减毒的。
27.权利要求25的方法，其中所述抗原或所述抗原性片段为肿瘤抗原、移殖抗原或自身免疫抗原。
28.权利要求25的方法，其中，所述抗原或蛋白质来自病毒病原体、细菌病原体或寄生病原体。
29.权利要求25的方法，其中所述抗原或抗原性片段来自一种病毒，而所述病毒选自流感病毒、呼吸道合胞病毒、HPV、HBV、HCV、HIV、HSV、FeLV、FIV、HTLV-I、HTLV-II和CMV。
30.权利要求29的方法，其中所述病毒为HIV。
31.权利要求30的方法，其中，所述抗原或抗原性片段由HIV基因编码，所述HIV基因选自env、gag、pol、nef、tat或rev。
32.权利要求31的方法，其中所述甲病毒复制子DNA编码至少一种来自HIV基因env、gag、pol、nef、tat和rev中一种的抗原或抗原性片段。
33.权利要求31或32的方法，其中所述HIV基因来自一种HIV分离物或来自HIV分离物的共有序列。
34.权利要求25的方法，其中，通过鼻内传递途径发生感染。
35.一种用于在动物细胞中引入及表达基因的方法；所述方法包括：
(a)用侵染性活细菌感染所述动物细胞，所述侵染性活细菌包含一种或更多种DNA分子，所述分子包含一个与能以RNA形式在所述细胞中扩增的甲病毒复制子DNA有效连接的真核表达盒；其中，所述甲病毒复制子DNA包含至少一种有效连接到异源核酸序列上的核酸控制序列，以控制由所述异源核酸序列编码的基因产物的表达；且
(b)在足以表达所述基因产物的条件下，培养这些细胞。
36.权利要求35的方法，其中所述细菌是减毒的。
37.权利要求35的方法，其中所述异源核酸序列包含基因的一个或更多个编码区。
38.权利要求37的方法，其中，可以分别表达或以操纵子的形式表达所述异源核酸序列的每个编码区。
39.权利要求35的方法，其中，所述异源核酸序列编码抗原、蛋白质的抗原性片段、治疗剂、免疫调节剂、反义RNA、催化性RNA、蛋白质、肽、抗体或抗体的抗原结合片段。
40.权利要求39的方法，其中所述抗原或蛋白质的所述抗原性片段为肿瘤抗原、移殖抗原或自身免疫抗原。
41.权利要求35的方法，其中所述异源核酸序列编码细胞因子、白细胞介素、红细胞生成素或其它免疫刺激蛋白或免疫调节蛋白。
42.权利要求39的方法，其中，所述抗原或蛋白质的所述抗原性片段来自病毒病原体、细菌病原体或寄生病原体。
43.权利要求35的方法，其中所述异源核酸序列是来自一种病毒的病毒序列，而所述病毒选自流感病毒、呼吸道合胞病毒、HPV、HBV、HCV、HIV、HSV、FeLV、FIV、HTLV-I、HTLV-II和CMV。
44.权利要求43的方法，其中，所述病毒序列编码一种或更多种病毒基因，或者编码由所述基因编码的蛋白质的抗原性片段。
45.权利要求43的方法，其中所述病毒为HIV。
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