CN1384751A - 蛋白粉生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种方便生产可高度保留较高有序结构的蛋白粉的方法,包括将含蛋白的溶液以约－300至－10℃/min的冷却速率冷冻,然后干燥。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白粉的生产方法以及含有此蛋白粉的缓释制剂。此外，本发明涉及含有特定基料等的缓释制剂。
背景技术
近来，由于基因工程和细胞技术的发展，人们已利用大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、酵母、动物细胞或诸如山羊、仓鼠等的活体大量生产蛋白质，并且应用于药物用途。然而，由于这些蛋白质对酸性条件和肽酶具有非常高的反应活性，它们不能通过口服给药吸收。因而它们通常通过皮下或肌内给药。然而，由于它们的生物半衰期通常较短，因而必须频繁给药。频繁注射会给患者带来明显的身体负担。
例如，生长激素(下面有时称作GH)，一种原产于和分泌于脑垂体前部中的代表性激素，它是一种具有广泛不同生理学活性的蛋白质，例如促进身体生长、葡萄糖和脂质代谢、蛋白质合成代谢以及细胞增生和分化。并且GH近来已在基因重组技术领域中通过利用大肠埃希氏杆菌大规模生产，并且临床和世界范围地应用于药物用途。然而，由于生物半衰期较短，为维持有效的血液含量就必须频繁施用GH。特别是，在垂体性侏儒的病例中，需要用几个月至10年的时间对婴儿或少年患者进行长期的每日皮下给药。
为解决蛋白质药剂的这种特殊问题，人们研究了各种药物传递系统。此系统的一个实例是可在一段长的时间内持续释放蛋白质的缓释制剂。JI-A8-217691(WO 96/07399)公开了一种缓释制剂的生产方法，其中所说的缓释制剂中含有通过使用水溶性肽型生理学活性物和氧化锌等与生物降解性聚合物的水溶液制备的水不溶性或水微溶性多价金属盐。此外，JP-A 8-503950(WO 94/12158)公开了一种多孔性颗粒状微胶囊的生产方法，作为缓释制剂的生产方法，其中所说的缓释制剂中含有人GH(下面有时称作hGH)和生物降解性聚合物，此方法是通过将hGH和聚合物的有机溶剂溶液喷雾到液体氮中，这种多孔性颗粒中保留有生物学活性。另外，JP-A 10-504017(WO 95/29664)公开了一种缓释微胶囊的生产方法，通过将固体碳酸锌等分散在聚合物溶液中，然后加入生理学活性物质(激素等)，以便使生理学活性物质和金属阳离子分开式地分散在生物降解性聚合物中。尽管JP-A(WO 98/27980)和JP-A 10-7538(WO 97/01331)公开了含生理学活性多肽的缓释制剂的生产方法，但没有公开将生理学活性多肽冻干的条件。
由此可见，为构建能够保留蛋白质生理学活性的药物传递系统，人们作了很多尝试。然而，针对蛋白质的具有较高有序结构的特殊问题，可能存在涉及蛋白质稳定性的问题，这些问题起因于在制剂生产步骤过程中的变性、制剂中蛋白质随时间而变化导致的变性和/或给药后的体内变性等。具体说，缓释制剂可能具有诸如蛋白质摄入到制剂中的效率较低、给药初期阶段药物的过量释放、难以控制药物长时间的释放、制剂给药后药物的血液含量低等的问题仍未解决。
然而，当以细分粉末的形式制备蛋白质时，预期由于分子迁移性下降可以进一步构建蛋白质的稳定性。
JP-A 4-500527(WO 90/13285)公开了一种细分蛋白粉的生产方法，通过将蛋白水溶液喷雾到液化气中，以便使溶液冷冻，然后干燥。
此外，《药学杂志》(Journal of pharmaceutical Science)Vol.87，p152(1998)中报道了一种通过喷雾干燥生产细分蛋白粉的方法。然而，此报道公开了变性程度会增加，其与喷雾形成的蛋白水溶液颗粒的粒度成相反的有关，并且应当添加大量表面活性剂来控制之。
另外，WO 99/48519(其在本申请优先权日之后公开)公开了一种生理学活性多肽粉的生产方法，通过将水溶混性有机溶剂和/或挥发性盐添加到生理学活性多肽水溶液中并且将溶液冻干。
此外，JP-A 9-248177公开一种干燥微生物细胞的生产方法，通过将微生物细胞培养物液滴滴落到冷却至冰点以下的金属板上，以便将细胞快速冷冻。
通常来说，冻干的冷却速率慢于-10℃/min。例如，Iyakuhin noToketsukanso(药物冻干)(Yoji OHOHASHI，制备和机器，第8页，1988年1月15日，Crest有限公司出版)描述如下。“在用普通小瓶冻干时，进行快速冷冻处理，或者使用含高浓度糖类的溶液，以致于它可以形成玻璃态，这种玻璃态不会经常遇到除非使用特定的装置。即，冷却速率为0.3至5.0℃/min。”另一方面，在将水溶液喷雾到液化气如液化氮等中的情形中，冷却速率极快，如在液化氮中时快于-300℃/min。
本文所用的冷却速率中的减号简单地用来表达冷却。因此，例如冷却速率为-300℃/min时，是指将待测物料以每1分钟300℃的速率冷却，并且当以每30秒150℃的速率冷却待测物料时，冷却速率表示为-300℃/min。更具体说，当将待测物料在30秒内从20℃冷却至-130℃时，冷却速率表示为-300℃/min。
与喷雾干燥类似，在包括将蛋白溶液喷雾到液化气中、将溶液冷冻然后干燥的蛋白粉生产方法中，很大可能会引起蛋白质的变性。此外，由于使用液化气作为液体制冷剂，需要大规模和昂贵的设备来应付隔热和设备材料因温度差异而热胀冷缩、保持无菌条件、排空液化气问题。
另外，尽管通过使用大量的表面活性剂可以获得平均颗粒粒度为几微米的细分蛋白粉，但产品的用途因使用了大量表面活性剂而受限。
因而，期望简单和方便地提供保留有其较高有序结构的稳定蛋白粉，无需与液化气接触。
发明公开
本发明者为解决上述问题而进行了研究，并且发现当生产蛋白粉时，通过控制冷冻含蛋白溶液的冷却速率，可以获得保持其较高有序结构的蛋白粉。此外，本发明者发现，通过将上述获得的蛋白粉粉化，可以获得细分粉末。另外，本发明者发现，当将上述获得的蛋白质用于生产缓释制剂时，可以改进制剂的蛋白捕获比、给药初期阶段药物的过量释放以及缓释特性。
而且，本发明者发现，当冷冻溶液时通过洒落(apply)或滴落含蛋白溶液来控制冷却速率，可以获得高度保持其较高有序结构的蛋白粉。
此外，本发明者发现，通过使用药剂冻干时常用的冷冻-干燥器的架子(shelf)来完成上述冷冻，可以较便宜和较简单以及方便地获得所需的产品。
基于这些发现，本发明者完成了本发明。
也就是说，本发明涉及
(1)一种蛋白粉的生产方法，包括将含蛋白的溶液与致冷剂载体接触，以约-300至-10℃/min的冷却速率将溶液冷冻，然后干燥；
(2)根据上述(1)的方法，其中将含蛋白的溶液洒落或滴落到制冷剂载体上；
(3)根据上述(2)的方法，其中洒落或滴落直径为约0.1至40mm的滴落流体；
(4)根据上述(1)的方法，其中冷冻是通过防止含蛋白溶液与液体制冷剂直接接触来完成；
(5)根据上述(1)的方法，其中向含蛋白的溶液添加挥发性盐或水溶混性有机溶剂；
(6)根据上述(5)的方法，其中挥发性盐是乙酸铵；
(7)可根据上述(1)的方法获得的蛋白粉；
(8)根据上述(7)的蛋白粉，其中蛋白质的分子量为约5,000至1,000,000道尔顿；
(9)根据上述(7)的蛋白粉，其中蛋白质选自激素、细胞因子、造血因子、生长因子和酶；
(10)根据上述(7)的蛋白粉，其中蛋白质是生长激素或胰岛素；
(11)根据上述(7)的蛋白粉，其中蛋白质以含蛋白溶液中总的α-螺旋含量计保留了45％或更多的α-螺旋；
(12)一种细分蛋白粉的生产方法，包括将上述(7)的蛋白粉粉化；
(13)根据上述(12)的方法，其中粉化进行到致使获得平均颗粒粒度为约0.5至20μm的细分蛋白粉；
(14)一种缓释制剂，含有可根据上述(12)的方法获得的细分蛋白粉；
(15)根据上述(14)的缓释制剂，其中缓释制剂的基料是得自活体的材料或合成聚合物；
(16)根据上述(15)的缓释制剂，其中得自活体的材料或合成聚合物是生物降解性聚合物；
(17)一种缓释制剂，含有乳酸/乙醇酸摩尔比为60/40至70/60乳酸/乙醇酸的乳酸/乙醇酸共聚物和生长激素；
(18)一种缓释制剂的生产方法，包括使用根据上述(12)的方法获得的细分蛋白粉；
(19)上述(7)的细分蛋白粉在制造缓释制剂中的用途；
(20)根据上述(1)的方法，其中不通过喷雾来冷冻含蛋白溶液；
(21)根据上述(1)的方法，其中将含蛋白的溶液以约10至250mL/5min每1300cm2的制冷剂载体的速率洒落或滴落，在洒落或滴落之前将所说的制冷剂冷却至约-25℃或更低；
(22)根据上述(1)的方法，其中干燥在减压条件下进行；和
(23)根据上述(1)的方法，其中通过使用冷冻-干燥器的架子来进行冷冻。
附图简介
图1显示了给免疫抑制型SD大鼠给药hGH粉制备的微胶囊后的hGH血清含量的变化，其中hGH粉分别通过洒落[洒落量：10mL/5min(-▲-)、60mL/5min(-●-)]和喷雾[喷雾量：50mL/5min(-△-)、80mL/5min(-○-)]的方式将含hGH溶液冷冻而获得。
发明的最好实施方式
本发明中所用的蛋白质可以是任何蛋白质，如天然产物、合成产物、半合成产物以及通过基因重组技术生产的产物等等。此外，可以包括它们的衍生物、类似物和突变蛋白。总的来说，为获得大量高纯度的蛋白质，经常使用的是基因重组技术。
本发明中使用的蛋白质的实例包括分子量优选为约5,000-1,000,000道尔顿、更优选约6,000至约200,000道尔顿的蛋白质。
本发明中使用的蛋白质的具体实例包括激素、细胞因子、造血因子、生长因子等等。
上述的激素可以是具有对抗和拮抗功能任一种的激素。激素的实例包括胰岛素、生长激素(GH)、促乳素、促甲状腺激素(TSH)、促黄体素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、胸腺素、甲状旁腺素(PTH)等。激素优选是胰岛素和生长激素，更优选是生长激素。
生长激素的实例可以是得自任何物种的生长激素，优选得自人类。尽管本发明中使用的生长激素可以得自天然来源，如从垂体前叶等中提取的生长激素，但它们优选是基因重组型GH(JP-B 6-12996，JP-B 6-48987)，更优选是具有与N-末端不含甲硫氨酸(methionine)的天然存在型的结构相同的重组型hGH。这种与N-末端不含甲硫氨酸的天然存在型的结构相同的重组型hGH可以按照JP-A 10-72489(EP-A 812856)或WO 00/20439中描述的方法获得。GH可以是金属盐(包括金属络合物；金属是锌等)，并且也可以使用基本上不含金属的GH。作为hGH，不仅可以使用分子量为约22k道尔顿的hGH，还可以使用分子量约20k道尔顿的hGH(JP-A 7-101877，JP-A10-265404)。另外，作为hGH，还可以使用hGH的衍生物或其相关的蛋白质(WO 99/03887)。
细胞因子，例如，包括淋巴因子和单核因子。淋巴因子的实例包括干扰素(α、β和γ)和白介素(IL-2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)等。单核因子的实例包括白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)等。优选的细胞因子是淋巴因子等，更优选是干扰素等，特别优选是干扰素-α。
造血因子的实例包括红细胞生成素(EPO)、集落刺激因子(G-CSF、GM-CSF、M-CSF等)、血小板生成素(TPO)、血小板衍生生长因子、巨核细胞增效剂等。
生长因子的实例包括碱性和酸性成纤维细胞生长因子(FGF)及其家族(例如，EGF、TGF-α、TGF-β、PDGF、酸性FGF、碱性FGF、FGF-9等)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、神经生长因子(NGF)及其家族(例如，BDNF、NT-3、NT-4、CNTF、GDNF等)、胰岛素样生长因子(例如，IGF-1、IGF-2等)和骨形态发生蛋白(BMP)及其家族等等。
酶的实例包括超氧化物歧化酶(SOD)、尿激酶、组织纤溶酶源激活物(TPA)、天冬酰胺酶、激肽释放酶等。
另外，本发明所用的蛋白质包括胸腺生成素、血液胸腺因子(FTS)及其衍生物(US专利4,229,438)、其它胸腺因子[Igku no Ayumi，Vol.125，No.20，pp.835-843(1983)]等等。
本发明使用的蛋白质优选是激素，更优选是生长激素和胰岛素，并且特别优选是人生长激素。
本发明中，蛋白质可以含有金属。当蛋白质含有金属时，金属的含量优选不大于0.1％(w/w)，更优选不大于0.01％(w/w)。由此，基本上不含金属的生理学活性多肽是最适合于本发明的。例如，晶体胰岛素通常含有少量诸如锌、镍、钴和镉等的重金属。含0.4％(w/w)锌的胰岛素以稳定的六聚体的形式存在，并且似乎在与可生物降解聚合物的金属盐的相互作用中呈相对惰性。
如果必要，可以预先除去蛋白质中存在的金属，作为去除蛋白质金属的方法，可以利用已知的方法。例如，将胰岛素的酸性盐酸水溶液对水或乙酸铵水溶液的透析并且将透析液冻干，可以提供含微量金属的无定形胰岛素。
当需要将所需的蛋白质从组织、体液、化学合成粗制品或重组细胞或重组真菌中纯化或提纯时，可以采用蛋白质的标准分离或提纯方法(“蛋白质”，Kazuo SATAKE著，Asakura Shoten出版；“生理学活性肽”，PharmaciaReview，第3号，日本Pharmaceutical Society出版)。具体说，通过结合一些液相色谱法(“蛋白质式肽的高速液相色谱法”，Nobuo UI等编)，可以高产量地获得高纯度的蛋白质，同时不损失生理学活性。如果必要，可以优选采用脱盐步骤作为提纯过程的最后一步。
本发明含蛋白溶液的溶剂没有特别的限制，只要它可以溶解蛋白质。优选，溶剂具有-130℃或更高的冰点。其具体的实例包括水、醇(例如，甲醇、乙醇、异丙醇等)、丙酮、水与上述醇的混合溶剂、水与诸如丙酮等的有机溶剂的混合溶剂等等。优选，使用水。有机溶剂，如醇、丙酮等，可以用作下述的“水溶混性有机溶剂”。
优选，向使用上述溶剂的含蛋白溶液中添加挥发性盐或水溶混性有机溶剂。通过将添加挥发性盐或水溶混性有机溶剂而获得的含蛋白溶液冻干，可以制备出容易处理(优良的被处理性)和非常细(具有较小的颗粒粒度)的蛋白粉。
可以添加到含蛋白溶液中的挥发性盐是，例如，铵盐(如乙酸铵、碳酸氢铵、碳酸铵、氯化铵等，优选乙酸铵)。可以使用挥发性盐的按适宜比例的掺混物。挥发性盐的添加量相对于含蛋白溶液以摩尔比计是，例如，约1至约80倍摩尔(特别是，约10倍至约80倍摩尔)，优选约15倍至约70倍摩尔，更优选约15倍至约50倍摩尔，首选约15倍至约40倍摩尔。
可以添加到含蛋白溶液中的水溶混性有机溶剂的实例包括上述醇、丙酮等。可以使用具有适宜混合比的上述有机溶剂的掺混物。优选的有机溶剂是醇，更优选单独使用乙醇。水溶混性有机溶剂的添加量(浓度)，以体积比计，是约0.03至0.5％(V/V)，优选约0.06至0.25％(V/V)，更优选约0.1至0.15％(V/V)。
向含蛋白溶液添加的水溶混性有机溶剂和/或挥发性盐可以单独使用，或者以掺混物的形式使用。当使用水溶混性有机溶剂和挥发性盐的掺混物时，可以将它们分别按照上述的量添加到含蛋白溶液中。
优选，向含蛋白溶液添加挥发性盐。更优选，添加铵盐，并且更优选添加乙酸铵。
作冷冻处理用的含蛋白溶液的浓度是，例如0.01％(W/V)至30％(W/V)，优选0.03％(W/V)至10％(W/V)，更优选0.05％(W/V)至3％(W/V)等，然而对其不作特别的限制。当蛋白质是hGH时，含蛋白溶液中的hGH浓度优选是约0.01％(W/V)至约5％(W/V)，优选约0.05％(W/V)至约2％(W/V)，更优选约0.05％(W/V)至约0.5％(W/V)。
作冷冻处理用的含蛋白溶液中的蛋白质优选是单一蛋白质。
本发明中的含蛋白溶液的冷冻和干燥方法没有具体的限制。然而，优选减压干燥(例如，真空干燥)。例如，可以通过使用冷冻-干燥器(冻干器)以连续步骤的方式完成冷冻-干燥，或者可以通过冷冻-干燥器来干燥没有使用冷冻-干燥器已独立冷冻过的含蛋白溶液。
冷冻用的设备没有具体的限制。然而，出于经济、简单和方便生产蛋白粉的观点，优选使用可注射药剂冻干时常用的冷冻-干燥器的架子(冷冻-干燥器架)。这种冷冻-干燥器的详细介绍可见Masakazu KOBAYASHI“药物生产和冷冻-干燥技术”(Seizai to Kikai，第17-23、25-35和38-46号)。根据这些文献，通过使用用普通盐水冷却的冷冻-干燥器架子，可以将温度降至-70℃。这些冷冻-干燥器的实例包括Kyowa Shinkuu Gijyutsu K.K.制造的机器(例如，RL系列、RLC系列、RLE系列、R2L系列、R2LW系列或Triomaster系列)；Nippon Shinkuu Gijyutsu K.K制造的机器(例如，DF系列、DFM系列)等等。此外，由于这些冷冻-千燥器的预冷冻机原本是按使物料可以在无菌和无尘条件下处理以便采用可注射制剂生产中的干燥器来设计的，因此这种冷冻-干燥器适合生长蛋白粉。其中使用液化气作为冷冻-干燥器的主要制冷剂，并且经过第二制冷剂引入，其还可以使冷冻-干燥器架的温度降低至低于普通盐水所达到的温度。例如，其中使用液化氮作为主要制冷剂并且经由氢氟醚(hydrofluoroether)(HFE：3M制造)冷却，使用HFE-7100(3M制造)时可以使温度降至-135℃并且使用HFE-72100(3M制造)时可以使温度降至-117℃。通过使用此方法，可以防止含蛋白溶液与液化气的直接接触，并且可以避免诸如必需要进行液化气无菌和无尘处理的难题。优选架子温度为约-130至-20℃，更优选约-100至-30℃，并且更优选约-80至-40℃。由此，通过用冷冻-干燥器架冷冻含蛋白溶液，可以使冷冻的物料很快依次转载至真空干燥步骤。
优选，在放在冷冻-干燥器架上的制冷剂载体上完成冷冻。制冷剂载体没有具体的限制。然而，优选制冷剂载体是，例如，板、盘等，当允许含蛋白溶液洒落或滴落时优选是盘等。上述的板、盘等不限于具有平的表面，而是可以具有不平坦或者弯曲的表面。上述的板、盘等可以由任何材料制成，只要它们可以经得起本发明的冷却速率。优选，使用由金属制成(例如，不锈钢等)的制冷剂载体。优选，洒落或滴落开始时的制冷剂载体(如盘)的温度为约-25℃或更低(如-25℃至-100℃。特别是-25℃至-50℃)。此外，含蛋白溶液可以洒落或滴落在已冷冻的溶液上。洒落或滴落开始时，冷冻的含蛋白溶液的表面温度优选为约-25℃或更低(如-25℃至-100℃。特别是-25℃至-50℃)。制冷剂载体及冷冻的含蛋白溶液的表面温度可以通过例如温度传感器[例如，热电偶(T型：Okazaki Seisakusyo制造)]测定。
当用冷冻-干燥器来干燥没有使用冷冻-干燥器已独立冷却的含蛋白溶液时，可以通过例如将冷冻的溶液在保持其冷冻状态的情况下转移至冷冻-干燥器架子上来完成干燥。
本发明中，可以根据含蛋白溶液的特定类型、其蛋白质浓度、添加剂浓度等，来适宜地控制含蛋白溶液的冷却速率。正常情况下，本发明的含蛋白溶液的冷却速率为约-300至-10℃/min，优选约-250至-40℃/min，更优选-210至-40℃/min，特别是-210至-70℃/min。本发明的冷却速率可以基于洒落或滴落之前含蛋白溶液的温度、洒落或滴落之后含蛋白溶液在冷冻时的温度以及到冷冻完成时所需要的时间来计算。洒落或滴落之后含蛋白溶液在冷冻时的温度用与上述相同的温度传感器来测定。
为获得上述的冷却速率，例如，可以以约10至250mL/5min、优选约15至200mL/5min、更优选约20至175mL/5min每1300cm2制冷剂载体的速率将含蛋白溶液洒落或滴落，其中在洒落或滴落之前将所说的制冷剂载体冷却至约-25℃或更低(优选约-100至-25℃，更优选约-100至-30℃，再优选约-80至-40℃)。含蛋白溶液的接触(洒落或滴落)速率可以适宜地选自上述冷却速率可以达到的范围。在接触过程中，可以适宜地改变含蛋白溶液的洒落或滴落速率。在洒落或滴落期间，制冷剂的温度可以是约-2℃等等。
本发明中，“洒落”(application)意指使含蛋白溶液从开口(如，含蛋白溶液的装料喷嘴)以连续流体的形式与制冷剂载体接触，但不形成液滴。
本发明中，“滴落”(dropping)意指使含蛋白溶液从开口(如，含蛋白溶液的装料喷嘴)以液滴形式的不连续流体方式与制冷剂载体接触。
当洒落或滴落时，可以一次性将全部量的亟待冷冻的含蛋白溶液洒落或滴落。然而，优选将溶液分成数份，并且将它们间断式地洒落或滴落，以便使已冷冻部分的温度降低，由此保持所需的冷却速率。当间断式洒落或滴落含蛋白溶液时，优选间隔一定的时间来进行各自的洒落或滴落操作，以便制冷剂载体或已冷冻部分的温度降低至-25℃或更低。
本发明中，“滴落流体”既指上述的不形成液滴接触的连续流体，又指滴落时的不连续流体。当洒落或滴落含蛋白溶液时，滴落流体的直径(水平横截面的最大长度)是，例如，约0.1至40mm，优选约0.2至40mm，更优选约0.3至10mm。尽管当洒落或滴落含蛋白溶液时，滴落流体优选呈柱状，但根据开口的形状可以呈各种形状，如具有多角形横截面(如三角形、正方形、五角形或六角形横截面等)的棱柱。当滴落含蛋白溶液时，液滴的直径优选为约0.1至10mm，更优选约0.7至7mm，再优选约1至5mm。当滴落含蛋白溶液时，开口(如装料喷嘴)的直径优选为约0.05至10mm，更优选约0.1至5mm。此外，当滴落含蛋白溶液时，液滴的重量优选为约0.0005至500mg，更优选约0.2至180mg，再优选约0.5至65mg。
本发明中，当洒落或滴落含蛋白溶液时可以在制冷剂载体上面形成冰衬。
此外，本发明中，含蛋白溶液可以按成层的状态冷冻。层厚优选约0.5至100mm，更优选约1至80mm厚，再优选约3至50mm厚。
优选，可以对通过本发明获得的蛋白粉进行粉化处理，以获得进一步细分的颗粒。作为粉化处理，可以使用药品生产中已知的各种粉化方法。粉化方法的实例包括干粉化，如射流磨法(jet mill method)。此外，作为湿粉化，例如，将蛋白粉分散在其可溶性溶剂中，并且用声处理(探针型或浴型)、搅拌型粉化器(Polytron(Kinemachica制造))、小型混合器、Fillmix(Tokushukika制造)、Cleamix(M Tech制造)等处理分散液，接着除去溶剂。也可以通过将蛋白粉在不溶性溶剂(如二氯甲烷等)中轻微搅拌或振动来粉化本发明方法获得的蛋白粉。
当将如此获得的蛋白粉用于缓释制剂时、优选将蛋白粉直接添加到基料中(例如，生物降解性聚合物溶液)，接着用声处理、搅拌型粉化器等对混合物进行粉化处理。
例如，当使用约9mm旋转直径的Polytron(Kinemachiaca制造)作为搅拌型粉化器时，优选粉化处理在约500至40,000rpm、更优选约1,000至35,000rpm、再优选约5,000至30,000rpm的转数下进行。此时，搅拌进行优选约5秒至30分钟，更优选约10秒至20分钟，再优选约15秒至10分钟。例如，当使用9mm旋转直径的Polytron(Kinemachiaca制造)作为搅拌型粉化器时，优选在约500至40,000rpm下粉化处理5秒至30分钟，更优选在约1,000至35,000rpm下处理约10秒至20分钟，再优选在约5,000至30,000rpm下处理约15秒至10分钟。
粉化处理后的细分蛋白粉的平均颗粒粒度可根据施用粉末用的具体药物传递系统而不同，总的来说平均颗粒粒度优选为约0.5至20μm，更优选约0.7至10μm，再优选约1-5μm。本发明细分蛋白粉的平均颗粒粒度可以通过激光衍射型颗粒粒度分布分析仪(SALD 2000A：Shimadzu制造)来测量。在上述测量中，将细分蛋白粉分散在粉末的不溶性溶剂中(如二氯甲烷等)，接着用相同溶剂适宜稀释至上述颗粒粒度分布分析仪可测范围，以便测量平均颗粒粒度。
本发明生产的蛋白粉和细分蛋白粉，与经本发明方法处理之前的含蛋白溶液(例如，含蛋白水溶液)中的蛋白质比较起来，高比率地保留了蛋白质的较高有序结构。
用FT-IR光谱分析可以证实蛋白粉和细分蛋白粉中的蛋白质的二级结构。此分析在Carpenter等的评论中有详细描述(欧洲药学和生物药学杂志(European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics)，Vol.45，pp231-238，1998)。此评论中报道了通过冻干获得的蛋白粉和细分蛋白粉中的α-螺旋含量下降至小于蛋白水溶液中的含量，因为变性程度越高，α-螺旋含量的下降率越高，其中所说的α-螺旋是二级结构中的一种。于是，可以通过本发明方法获得的蛋白粉或细分蛋白粉中的α-螺旋含量与经本发明方法处理之前含蛋白溶液(如含蛋白水溶液)中的α-螺旋含量之比，来定义较高有序结构的变性程度，其中所说的α-含量通过FT-IR光谱分析来测定。
当如上所述定义蛋白质的变性程度时，本发明获得的蛋白粉和细分蛋白粉中保留了优选约45％或更多、更优选约50％或更多的α-螺旋。
本发明获得的保留有较高有序结构(具体说，二级结构，更具体说是α-螺旋)的蛋白粉和细分蛋白粉可以用于各种药物传递系统。其给药途径的实例包括通过肺给药、通过粘膜给药(眼、口腔、鼻、子宫、阴道、直肠)、口服给药、皮内、肌内或皮下注射或埋入、器官等中注射或埋入等等。蛋白粉和细分蛋白粉可以就其本身的粉状形式给药。或者，可以通过将它们配制在各种药物制剂中来给药(例如，片剂、粒剂、缓释制剂等)，优选缓释制剂。缓释制剂可以通过压型法(compression)、喷雾骤冷法、喷雾干燥法、乳化法、相分离法(凝聚法(coacervation method))、水中干燥法(in-water dryingmethed)(S/O/W法)等使用蛋白粉或细分蛋白粉以及各种下述的基料来制备。
制备上述缓释制剂用的基料可以是得自活体的任何基料或者通过合成获得的基料(如，合成聚合物)。在很多情形中，使用合成聚合物。
得自活体的基料的实例包括明胶、胶原、脂肪和油类(脂质、甘油三酸酯等)、血清中衍生的蛋白质(白蛋白、球蛋白等)、角蛋白、壳多糖、脱乙酰壳多糖、出芽短梗霉聚糖、纤维素类(羟甲基纤维素、羧甲基纤维素等)等等。
作为聚合物，可以使用任何生物降解性聚合物和非生物降解性聚合物。然而，优选使用生物降解性聚合物。
生物降解性聚合物的实例包括由一种或多种α-羟基羧酸(如，乙醇酸、乳酸等)、羟基二羧酸(如，苹果酸等)、羟基三羧基(如，柠檬酸等)等通过无催化剂的脱水缩聚合成并且具有自由羧基的聚合物、其混合物、聚-α-氰基丙烯酸酯、聚氨基酸(如，聚-γ-苄基-L-谷氨酸)和马来酸酐共聚物(如，苯乙烯/马来酸共聚物等)。聚合物可以是均聚物或共聚物。聚合可以是无规、嵌段或接枝型的。当上述α-羟基羧酸、羟基二羧酸和羟基三羧酸在它们的分子结构中具有光学活性中心时，它们可以是D-、L-或DL构型。
这些聚合物中，优选具有自由末端羧基的生物降解性聚合物，例如由α-羟基羧酸(如，乙醇酸、乳酸等)合成的聚合物(如，乳酸/乙醇酸共聚物、聚乳酸等)和聚-α-氰基丙烯酸酯。更优选的生物降解性聚合物是由α-羟基羧酸合成的聚合物，特别优选乳酸/乙醇酸共聚物等。本说明书中，有时将乳酸/乙醇酸共聚物以及诸如聚乳酸和聚乙醇酸的均聚物称作乳酸/乙醇酸聚合物。
当所用的生物降解性聚合物是乳酸/乙醇酸聚合物(乳酸/乙醇酸共聚物或均聚物)时，其组成比(mol％)优选为约100/0至约40/60，更优选约85/15至50/50。
上述乳酸/乙醇酸聚合物的重均分子量优选为约3,000至约50,000，更优选约3,000至约25,000，再优选约5,000至约20,000。
乳酸/乙醇酸聚合物的分散度(重均分子量/数均分子量)优选为约1.2至约4.0，更优选约1.5至约3.5。
就重均分子量和分散度而言，本说明书认为前者是按照聚苯乙烯测定的，通过凝胶渗透色谱法(CPC)使用重均分子量分别为120,000、52,000、22,000、9,200、5,050、2,950、1,050、580和162的9个聚苯乙烯作为参比物，并且从中计算出后者。使用GPC柱KF804L×2(日本Showa Denko制造)和RI监测器L-3300(日本Hitachi，Ltd.制造)，用氯仿作为流动相，进行上述测定。
具有自由末端羧基的生物降解性聚合物是其中按GCP测定的数均分子量与按端基定量法测定的数均分子量差不多彼此一致的生物降解性聚合物。按端基定量法测定的数均分子量如下计算：
将约1至3g生物降解性聚合物溶解在丙酮(25ml)和甲醇(5ml)的混合溶剂中，并且将溶液快速用0.05N氢氧化钾醇(乙)溶液滴定，同时在室温(20℃)下搅拌，用酚酞作指示剂，测定羧基含量；按照如下等式计算端基定量法测定的数均分子量：
端基定量法测定的数均分子量＝2000×A/B
A：生物降解性聚合物的重量(g)
B：达到滴定终点时所加的0.05N氢氧化钾(乙)醇溶液的量
端基定量法测定的数均分子量是绝对值，而GPC测定的数均分子量是因各种分析条件(如，流动相类型、柱、参比物的种类、所选的切片宽度、所选的基线等)不同而变化的相对值；因此很难具有这两个数值的绝对数值表示。然而，所述的“按GPC测定的数均分子量与按端基定量法测定的数均分子量差不多彼此一致”意指，例如，对由一种或多种α-羟基羧酸合成的聚合物来说，按端基定量法测定的数均分子量在按GPC测定的数均分子量的约0.5至约2倍、优选约0.7至约1.5倍范围内。
例如，在具有自由末端羧基并且是由一种或多种α-羟基羧酸通过无催化剂的脱水缩聚聚合合成的聚合物中，按GPC测定的数均分子量和按端基定量法测定的数均分子量差不多彼此一致。另一方面，在基本上没有自由末端羧基并且是由环状二聚物通过使用催化剂的开环聚合合成的聚合物中，按端基定量法测定的数均分子量明显大于按GPC测定的数均分子量(2倍或更多)。这个区别可以清楚地区分具有自由末端羧基的聚合物与没有自由末端羧基的聚合物。
具有自由末端羧基的乳酸/乙醇酸聚合物可以通过本领域已知的工艺来生产，例如按照JP-A 61-28521中所述的工艺(例如，通过无催化剂的脱水缩聚反应或在无机固体酸催化剂的存在下的脱水缩聚反应)。
根据组成比或重均分子量，乳酸/乙醇酸聚合物的分解/消除率有很大的不同。通过降低乙醇酸的比率或增加分子量，可以延长生理学活性多肽释放持续时间(例如，至约6个月)，因为分解/消除率通常随乙醇酸比率降低而延迟。相反，通过增加乙醇酸的比率或降低分子量，可以缩短药物释放持续时间(例如，至约1周)。为获得可以在1周至2个月期间内有效释放生理学活性多肽的缓释制剂，优选使用其组成比和重均分子量属于上述范围的乳酸/乙醇酸聚合物。
因此，优选根据生理学活性多肽的所需类型和所需持续时间来选择本发明所用的生物降解性聚合物的组成。在一个具体的实例中，例如当使用GH作为生理学活性多肽时，生物降解性聚合物优选是乳酸/乙醇酸聚合物，更优选乳酸/乙醇酸共聚物。在乳酸/乙醇酸共聚物中，乳酸/乙醇酸组成比(mol％)优选为约85/15至约50/50，更优选约75/25至约50/50。乳酸/乙醇酸共聚物的重均分子量优选为约8,000至约20,000，更优选约10,000至约20,000。此外，乳酸/乙醇酸聚合物的分散度(重均分子量/数均分子量)为约1.2至约4.0，更优选约1.5至约3.5。
所用的乳酸/乙醇酸聚合物可以通过已知方法来生产，例如上述公开出版物等中描述的方法。聚合物优选通过无催化剂的脱水缩聚来生产。优选，使用其中按端基定量法测定的数均分子量量与按GPC测定的数均分子差不多彼此一致的乳酸/乙醇酸聚合物(PLGA)。
此外，可以按一定比率掺混使用组成比和/或重均分子量不同的两类乳酸/乙醇酸聚合物。典型的实例是其中乳酸/乙醇酸组成比(mol％)为约75/25且重均分子量为约10,000的乳酸/乙醇酸聚合物与其中乳酸/乙醇酸组成比(mol％)约50/50且重均分子量为约12,000的乳酸/乙醇酸共聚物的混合物。此混合物中这些共聚物的重量比优选分别为约25/75至75/25。
本发明中所用的生物降解性聚合物可以是上述提及的生物降解性聚合物的金属盐。例如，可以使用WO97/01331中所述的生物降解性聚合物等的各种多价金属盐。优选，可以使用乳酸/乙醇酸聚合物的多价金属盐等，(更优选，锌盐、钙盐、镁盐等，再优选锌盐等)。本发明中所用的多价金属盐中的金属没有特别的限制，只要它不会对活体产生不利的作用。多价金属盐的例子是二价盐(如，Fe、Zn、Cu、Ca、Mg、Al、Sn、Mn等)，三价盐(如，Fe、Al、Mn等)、四价盐(如，Sn等)等等。
本说明书中，有时将生物降解性聚合物的金属盐也称作生物降解性聚合物。例如，有时将乳酸/乙醇酸聚合物的多价金属盐也称作乳酸/乙醇酸聚合物。
上述生物降解性聚合物的多价金属盐可以通过WO 97/01331中所述的方法或根据其它方法来生产。
当生物降解性聚合物的多价金属盐是锌盐时，其还可以通过将生物降解性聚合物与氧化锌在有机溶剂的存在下反应来生产。例如，可以按照以下方法来生产生物降解性聚合物的锌盐。
首先，通过将生物降解性聚合物与氧化锌共存于有机溶剂中，制备生物降解性聚合物-氧化锌络合物的有机溶剂溶液。在此情形中，生物降解性聚合物在溶剂中的浓度取决于其分子量或有机溶剂的类型等，例如浓度为约0.1至约80％(W/W)，优选约1至约70％(W/W)，更优选约2至约60％(W/W)。氧化锌的添加量取决于有机溶剂的类型而不同，例如，以生物降解性聚合物的量计，添加量为约0.001至约2％(W/W)，优选约0.01至约1.5％(W/W)，更优选约0.1至约1％(W/W)，如JP-A 10-231252所述。根据向有机溶剂添加生物降解性聚合物和氧化锌的顺序，可以将粉末状态或在有机溶剂中悬浮状态的氧化锌添加到通过将生物降解性聚合物溶于有机溶剂中制备的溶液中，或者相反，将生物降解性聚合物的有机溶剂溶液添加到通过将氧化锌悬浮在有机溶剂中制备的悬浮液中。可以将都呈粉末状态的生物降解性聚合物和氧化锌混合，然后可以添加有机溶剂。
生产缓释制剂时溶解生物降解性聚合物用的有机溶剂优选具有不超过120℃的沸点。此有机溶剂的实例包括卤化烃类(如，二氯甲烷、氯仿。四氯化碳等)、醇类(如，乙醇、甲醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇等)、乙酸乙酯、乙腈等等。这些溶剂也可以是按一定比率的混合物使用。单独使用的优选的有机溶剂包括二氯甲烷和乙腈等。以混合物形式使用的优选的有机溶剂，例如，卤化烃类(如，二氯甲烷、氯仿等)与醇类(如，乙醇、甲醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇等)或乙腈的组合。特别是，广泛使用二氯甲烷和乙腈的组合。卤化烃类相对于醇类或乙腈的混合比(体积比)为约40∶1至约1∶1，优选约20∶1至约1∶1。具体说，优选单独使用卤化烃(如，二氯甲烷等)，或使用基本上由卤化烃与乙腈的9∶1至1∶1混合比的混合溶剂。生物降解性聚合物在溶液中的浓度取决于分子量、有机溶剂类型等而不同。例如，可以是约0.01至约80％(W/W)、优选约0.1至约70％(W/W)、更优选约1至约60％(W/W)。
缓释制剂的生产是通过从S/O分散液中除去有机溶剂，其中将蛋白粉(S相)分散到得自活体的物料或合成聚合物(如，生物降解性聚合物)在有机溶剂(O相)中的溶液中，所说的蛋白粉(S相)是通过将已添加有水溶混性有机溶剂和/或挥发性盐的含蛋白溶液(如，生理学活性多肽溶液)冻干获得的。该生产方法是，例如，(a)水中干燥法(S/O/W法)、(b)相分离法(凝聚法)和(c)喷雾干燥法，或根据这些方法的其它方法。下面将描述生产微胶囊的方法，将所说的微胶囊作为缓释制剂。
(a)水中干燥法(S/O/W法)
根据此法，首先将水溶混性有机溶剂和/或挥发性盐添加到蛋白质的水溶液中，然后通过冻干获得蛋白粉(S相)。将生物降解性聚合物溶解在有机溶剂中，然后将上述蛋白粉分散在所得的有机溶剂溶液中。蛋白质与生物降解性聚合物的比(重量比)为，例如，约1∶1000至约1∶1，优选约1∶200至约1∶5，更优选约1∶100至约1∶5。
优选，施加外部物理能量使蛋白粉分散和均匀粉化在有机溶剂溶液中。为此，可以使用例如超声波辐射、涡轮机搅拌、均质机等等。蛋白粉在有机溶剂溶液中的平均颗粒粒度优选为约0.5至20μm，更优选约0.7至10μm，再优选约1至5μm，并且此通过使用本发明方法获得的蛋白粉容易实现。
然后，将如此制备的有机溶剂分散液(S/O分散液)再添加到水性溶剂中(W相)中，然后施加上述相同的外部物理能量，如超声波辐射、涡轮机搅拌、均质机等等，形成S/O/W乳液。之后，蒸发O相的有机溶剂，得到微胶囊。水相的体积通常选择是O相体积的约1倍至约10,000倍，优选约2倍至约5,000倍，更优选约5倍至约2,000倍。
可以向上述的外加水相中添加乳化剂。可以使用任何能够形成通常情况下稳定的S/O/W乳液的乳化剂。上述乳化剂的实例包括阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、聚氧乙烯蓖麻油的衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、卵磷脂、明胶、透明质酸等。这些乳化剂可以掺混物的形式添加。乳化剂在外加水相中的浓度优选为约0.001至20％(W/W)、更优选约0.01至10％(W/W)、特别优选约0.05至5％(W/W)。
通过离心或过滤回收如此获得的微胶囊，用蒸馏水洗涤去除附着在微胶囊表面的乳化剂等，再分散于蒸馏水水中并且冻干。然后，如果必要，通过温热进一步除去微胶囊中的水分和有机溶剂。温热可以在减压条件下进行。对温热条件而言，可以在不低于生物降解性聚合物的玻璃化转变温度且不高到会引起各个微胶囊颗粒附聚的温度下进行加热和干燥。优选，在比生物降解性聚合物的玻璃化转变温度低10℃至比此玻璃化转变温度高约20℃的温度范围下进行加热和干燥。玻璃化转变温度定义为当温度以每分钟10至20℃的速率增加时使用差式扫描量热计获得的中间玻璃化转变点。
(b)相分离法(凝聚法)
当通过此法生产微胶囊时，将凝聚剂在搅拌条件下逐渐添加到上述(a)描述的S/O分散液中，以便沉淀和固化微胶囊。凝聚剂的用量为约0.01至约1,000倍体积、优选约0.05至约500倍体积、特别优选约0.1至约200倍体积。可以使用任何凝聚剂，只要它是可与溶解生物降解性聚合物用的有机溶剂相溶混的聚合的矿物油或植物油化合物，并且它不能溶解所用的生物降解性聚合物。具体说，凝聚剂的实例包括硅油、芝麻油、大豆油、玉米油、棉籽油、椰油、亚麻子油、矿物油、正己烷和正庚烷等。可以结合使用它们的两种或更多种。过滤回收如此获得的微胶囊，用庚烷等重复洗涤以去除凝聚剂。此外，按与上述(a)中所述的相同方式进行洗涤，然后冻干。
在通过水中干燥法或凝聚法生产微胶囊时，可以添加抗附聚剂来防止颗粒附聚，可以使用的抗附聚剂的实例是，例如，水溶性多糖，如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、淀粉(如玉米淀粉等)、透明质酸及其碱金属盐；蛋白质，如甘氨酸、血纤蛋白、胶原；以及无机盐，如氯化钠和磷酸氢钠等。
(c)喷雾干燥法
当通过本发明的方法生产微胶囊时，通过喷嘴将上述(a)所述的S/O分散液喷雾到喷雾干燥器的干燥室中，以便使有机溶剂以细滴的形式在短时间内挥发，以获得微胶囊。这种喷嘴包括，例如，双液喷嘴型、压力式喷嘴型和旋转盘型。如果必要，通过另一个喷嘴喷雾上述抗附聚剂的水溶液以便防止各微胶囊颗粒附聚也是有利的。如果必要，按与上述(a)中所述的相同方式洗涤如此获得的微胶囊，接着加热(如果必要，在减压条件下)以去除水分和有机溶剂。
本发明的缓释制剂优选是细分颗粒(微粒)的状态。因为，缓释制剂通过注射针给药(通常用于皮下注射或肌内注射)时，以免患者感到过分疼痛。缓释制剂的颗粒粒度为，例如，平均颗粒粒度为约0.1至300μm，优选约1至150μm，更优选约2至100μm。
缓释制剂中的蛋白质含量为，例如，约0.1至40％(W/W)、优选约0.2至20％(W/W)。蛋白质的平均颗粒粒度优选不超过约0.5至20μm，更优选约0.7至至10μm，再优选约1至5μm。
包含在缓释制剂中的得自活体的聚合物或合成聚合物的量为，例如，约30至99.9％(W/W)、优选约60至97％(W/W)。更优选约70至90％(W/W)。
蛋白质从缓释制剂中的初期释放率[给药后1天(24小时)的初期释放率]优选不超过约50％，更优选约1至40％，再优选约3至35％。初期释放率可以通过皮下给药后第一个24小时的初期释放量来计算。初期释放量可以从测定缓释制剂皮下给药后24小时血液浓度的AUC(浓度曲线下面积)中获得；并且将AUC值应用到剂量-AUC的标准校准曲线上，此曲线通过含蛋白溶液的皮下给药获得。
例如，缓释制剂可以以微胶囊的形式使用，或者可以使用微胶囊作为源材料来用于制备各种剂型，并且能够以肠胃外制剂(例如，肌肉、皮下组织、器官等的注射用制剂或埋入；鼻腔、直肠、子宫等上的粘膜给药用的制剂)、口服制剂(固体制剂，如胶囊剂(如，硬胶囊、软胶囊等)、粒剂、粉剂等、液体制剂，如悬浮剂等)等等的形式给药。
具体说，缓释制剂优选是注射用制剂。例如，在缓释制剂是微胶囊的情况中，可以通过水悬浮液的方式来获得注射用的实际缓释制剂，其中将微胶囊与分散剂(例如，表面活性剂如吐温80、HCO-60等；多糖，如羧甲基纤维素、藻酸钠、透明质酸等)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等)、张力剂(tonicity agent)(例如，氯化钠、甘露糖醇、山梨糖醇、葡萄糖等)等一起悬浮。也可以通过油状悬浮液的方式获得注射用的实际缓释制剂，其中将微胶囊与植物油如芝麻油、玉米油、其混合物、与磷脂如卵磷脂或中链脂肪酸甘油三酸酯(如Miglyol 812)一起悬浮。
当缓释制剂是，例如，微胶囊时，用于注射悬浮液的缓释制剂可以选择满足分散度要求和可穿过注射针的颗粒粒度。例如，颗粒粒度的范围是平均颗粒粒度为约0.1至约300μm，更优选约1至约150μm，更优选约2至约100μm。
制备上述微胶囊无菌制剂的方法包括(但不限于)其中整个生产过程为无菌的方法，其中使用γ射线作为灭菌剂的方法以及其中在制造过程中添加抗菌剂的方法。
该缓释制剂可以安全地在哺乳动物中使用(例如，人、牛、猪、狗、猫、小鼠、大鼠、兔等)，并且具有低毒性。
缓释制剂的适应征取决于所用的蛋白质而不同。当使用胰岛素作为蛋白质时，缓释制剂可用于预防或治疗糖尿痛；当使用干扰素-α时，可预防或治疗病毒性肝炎(如C型肝炎、抗原阳性活性肝炎等)和癌症(如肾癌、多发性骨髓瘤等)；当使用红细胞生成素时可预防或治疗贫血(如肾渗析过程中的贫血等)；当使用G-CSF时，可预防或治疗中性白细胞减少(如，在癌症治疗中等)；当使用IL-2时，可预防或治疗癌症(如，血管内皮瘤等)；当使用FGF时，可预防或治疗骨折、创伤(如，褥疮等)、牙周炎和胃肠溃疡；当使用FGF-9时，可预防或治疗血小板减少症；当使用NGF时，可预防或治疗老年性痴呆；当使用TPA时，可预防或治疗血栓形成；并且当使用肿瘤坏死因子可预防或治疗恶性肿瘤。此外，根据GH的生长激素作用，除治疗垂体性侏儒外，施用含GH的缓释制剂还可以治疗特纳氏综合征、慢性肾病、软骨发育不全、成人垂体机能减退甚至衰退，如成人生长激素缺乏(成人GHD)、AIDS等。另外，由于据报道GH适用于诸如唐氏先天愚症、银综合征(Silver syndrome)、成软骨细胞过少和幼年慢性关节炎，提供杰出的治疗效果，因此含GH的缓释制剂可以用于这些疾病。含GH的缓释制剂还可对预防或治疗充血性心力衰竭等是有效的。此外，含GH缓释制剂可以用于，例如，AIDS患者器官移植和化学治疗时的生血、营养改善、肾贫血(renal anenmia)、心绞痛、高脂血、肥胖、加速烧伤、损伤和溃疡的愈合、外科侵袭(手术、外伤)/早期术后恢复、脓毒病、预防因骨质疏松引起的骨折、因骨质疏松引起的骨折患者早期术后恢复、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、褥疮等等。此外，预期此制剂可有效用作用于改善体弱老人生活质量(QOL)的抗衰老剂，或者预期可通过hGH的神经防护活性抑制神经变性疾病的发展并改善之(阿耳茨海默氏病、帕金森氏病和脑血管疾病等)。与每天皮下注射GH相比，通过缓释制剂的形式配制GH，可以获得抗这些疾病的更好的药理学活性。
尽管缓释制剂的剂量取决于蛋白质的类型和含量、释放的持续时间、目标疾病、针对的动物种类和其它因素而不同，但剂量可以设定为任何量，只要可以在体内维持有效浓度的蛋白质。例如，当缓释制剂是为够两周释放而设计的时，蛋白质的剂量可以适宜地选择为优选约0.0001至约10mg/kg体重、更优选约0.05至约1mg/kg体重每个成人。当缓释制剂是为够1个月释放而设计的时，蛋白质的剂量可以适宜地选择为优选约0.0002至约20mg/kg体重，更优选约0.1至约2mg/kg体重。
缓释制剂的优选的给药次数可以适宜地选择为每周一次，每两周一次，每月一次，每两个月一次等等，根据蛋白质的类型和含量、剂型、释放的持续时间、目标疾病、针对的动物种类和其它因素。优选，将缓释制剂设计成1周释放至2月释放，更优选1周至1月释放。
例如，当缓释制剂在约2周的期间内可以有效释放蛋白质时，优选使用乳酸/乙醇酸摩尔比为55∶45至45∶55(例如约50∶50)的乳酸/乙醇酸聚合物作为缓释制剂的基料。此外，优选乳酸/乙醇酸聚合物的重均分子量为约10,000至15,000(如，13,000)。
当缓释制剂中作为活性成分的蛋白质是，例如，胰岛素时，每次给糖尿病患者的给药剂量适宜地选择为通常约0.001至约1mg/kg体重，优选约0.01至约0.2mg/kg体重，作为优选成分。并且优选的给药次数是一周一次。
当缓释制剂中作为活性成分的蛋白质是GH时，剂量可以设定成任何量，只要可以在体内维持有效浓度的GH，但取决于GH的类型和含量、释放的持续时间、目标疾病、针对的动物种类和其它因素而不同。就治疗上述疾病而言，当缓释制剂是为够两个月释放而设定的时，则GH的剂量，为安全给药起见，可以适宜地选择为约0.01至约5mg/kg体重(约0.03至约15IU/mg/kg体重)、更优选约0.05至约1mg/kg体重(约0.15至约3IU/mg/kg体重)每个儿童或成人。优选的给药次数可以适宜地选择为一周一次、每两周一次、一月一次等，取决于GH的含量、剂型、释放持续时间、目标疾病、针对的动物种类和其它因素。
优选，将缓释制剂储存在常温或冷地。更优选，将缓释制剂在冷地储存。“常温”和“冷地”按日本药典定义。即，“常温”指15至25℃，并且“冷地”指不超过15℃。在“冷地”，更优选约2至8℃。
另一方面，提供可以有效释放GH约3至5周的含GH缓释制剂是合意的。在完成本发明的过程中，本发明者发现，通过使用缓释制剂用的特定基料，可以获得为约3至5周释放而设计的含GH缓释制剂。
为约3至5周释放而设计的含GH缓释制剂可以按照，例如，上述的微胶囊生产方法来获得。可以通过任何工艺，包括本发明中的工艺，来生产制备微胶囊用的GH粉。GH粉的平均颗粒粒度优选为约0.5至20μm，更优选为约0.7至10μm，再优选约1至5μm。另外，就GH变性程度的定义来说，GH粉保留了约45％或更多、优选约50％或更多的α-螺旋。
作为缓释制剂的基料，优选使用乳酸/乙醇酸摩尔比为约60∶40至70∶30(如约65∶35)的乳酸/乙醇酸聚合物。此外，优选乳酸/乙醇酸聚合物的重均分子量为约10,000至18,000(如，14,500)。
当使用如此获得的为约3至5周释放而设计的含GH缓释制剂作为治疗上述疾病用的注射制剂时，作为活性成分的GH的剂量，为安全给药起见，可以适宜地选择为约0.02至约10mg/kg体重(约0.06至约30IU/mg/kg体重)、更优选约0.1至约2mg/kg体重(约0.15至约3IU/mg/kg体重)每个儿童或成人。
实施例
下面将通过以下实施例、对比实施例、参考实施例和实验实施例的方式对本发明作更详细描述，这些实施例不能理解为是对本发明范围的限制。
在以下实施例中，当难于证实冷冻时，为计算冷却速率，计算任意单位时间(长于10秒)内的温度下降，并且取计算出的最大值作为冷却速率。
实施例1
冷冻牛血清白蛋白(BSA)水溶液并随后真空干燥
将20倍摩尔当量的乙酸铵添加到BSA水溶液中(BSA的最终浓度＝2mg/ml)并且通过0.22μm滤器过滤此混合物，制备冷冻-千燥用的溶液制剂(制剂1)。在将溶液冷却至10℃以下之后，将其具有约0.3至0.5mm流体直径的规定量部分洒落到每5分钟-45至-40℃下冷却的冷冻-干燥器架的盘上(面积：约1,300cm2)，并且冷冻干燥(Triomaster A04：Kyowa Vacuum(冷凝容量10kg型))，以制备BSA粉。在洒落期间，盘的温度为-40至-30℃。在1.85g乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)(乳酸/乙醇酸(摩尔比)＝约50/50，换算成聚苯乙烯的重均分子量＝约13,000)和10mg氧化锌存在于2.7mL二氯甲烷的溶液(O)中，用Polytron(Kinemachica制造)处理140mg BSA(S)，以便使粉末分散和粉化在溶液中。在向100μl所得S/O分散液中添加2.5mL二氯甲烷之后，通过激光衍射颗粒粒度分析仪(Shimadzu制造的SALD2000A)测定细分BSA粉的平均颗粒粒度。
表1显示了根据上述工艺通过冷冻制剂1获得的细分BSA粉的平均颗粒粒度。通过将洒落到盘上的量调节至10mL/5min至80mL/5min，使制剂1的平均冷却速率变至-108.7℃/min(最大-156℃/min)至-35.1℃/min(最小-32.4℃/min)。由此，可以将细分BSA粉的平均颗粒粒度控制到1.2μm至6.1μm。
表1
| 洒落量(量(mL)每5min/盘) | ||||
| 10 | 25 | 40 | 50 | |
| 平均颗粒粒度(μm) | 1.2 | 2.8 | 3.1 | 2.5 |
| 平均冷却速率(℃/min) | -108.7 | -92.1 | -66.0 | -68.8 |
表1(续)
| 洒落量(量(mL)每5min/盘) | |||
| 60 | 70 | 80 | |
| 平均颗粒粒度(μm) | 3.5 | 4.2 | 6.1 |
| 平均冷却速率(℃/min) | -58.3 | -49.4 | -35.1 |
实施例2
冷冻BSA水溶液并随后真空干燥
按照实施例1所述的相同方式，制备制剂1的BSA水溶液。将溶液的温度调节至室温，并且将其具有约0.3至0.5mm流体直径的规定量部分洒落到每5分钟在-45至-40℃下冷却的冷冻-干燥器架的盘上(面积：约1,300cm2)，并且冷冻干燥(RL-603BS：Kyowa Vacuum(冷凝容量60kg型))，以无菌制备BSA粉。在洒落期间，盘的温度为-40至-30℃。通过使用所得的BSA粉，按照实施例1所述的相同方式，测定细分BSA粉的平均颗粒粒度。
表2显示了根据上述工艺通过冷冻制剂1获得的细分BSA粉的平均颗粒粒度。通过将洒落到盘上的量调节至30mL/5min至60mL/5min，使制剂1的平均冷却速率变至-98.9℃/min(最大-101.1℃/min)至-80.6℃/min(最小-70.3℃/min)。由此，可以将细分BSA粉的平均颗粒粒度控制到1.2μm至5.0μm。
表2
| 洒落量(量(mL)每5min/盘) | ||||
| 30 | 40 | 50 | 60 | |
| 平均颗粒粒度(μm) | 1.2 | 1.9 | 2.4 | 5.0 |
| 平均冷却速率(℃/min) | -98.9 | -97.7 | -95.4 | -80.6 |
实施例3
冷冻hGH水溶液并随后真空干燥
将20倍摩尔当量的乙酸铵添加到基因重组型hGH中(hGH的最终浓度＝2mg/mL)并且通过0.22μm滤器过滤此混合物，制备冷冻-干燥用的溶液制剂(制剂2)。在将溶液冷却至10℃以下之后，将其具有约0.3至0.5mm流体直径的规定量部分洒落到每5分钟在-45至-40℃下冷却的冷冻-干燥器架的盘上(面积：约1,300cm2)，并且冷冻干燥(Triomaster A04：Kyowa Vacuum(冷凝容量10kg型))，以制备冻干粉(以下简称hGH粉)。在洒落期间，盘的温度为-40至-30℃。通过使用所得的hGH粉，按照实施例1所述的相同方式测定细分hGH粉的平均颗粒粒度。
表3显示了根据上述工艺通过冷冻制剂2获得的细分hGH粉的平均颗粒粒度。通过将洒落到盘上的量调节至10mL/5min至86mL/5min，使制剂2的平均冷却速率变至-201.0℃/min(最大-203.7℃/min)至-72.5℃/min(最小-54.6℃/min)。由此，可以将细分hGH粉的平均颗粒粒度控制到1.4μm至4.7μm。
表3
| 洒落量(量(mL)每5min/盘) | ||||
| 10 | 60 | 70 | 86 | |
| 平均颗粒粒度(μm) | 1.4 | 2.3 | 3 | 4.7 |
| 平均冷却速率(℃/min) | -201.0 | -88.7 | -84.1 | -72.5 |
实施例4
冷冻hGH水溶液并随后真空干燥
制备制剂2。将温度调节至室温，并且将其具有约0.3至0.5mm流体直径的规定量部分洒落到每5分钟在-45至-40℃下冷却的冷冻-干燥器架的盘上(面积：约1,300cm2)，并且冷冻干燥(RL-603BS：Kyowa Vacuum(冷凝容量10kg型))，以无菌制备hGH粉。在洒落期间，盘的温度为-40至-30℃。通过使用所得的hGH粉，按照实施例1所述的相同方式，测定细分hGH粉的平均颗粒粒度。
表4显示了根据上述工艺通过冷冻制剂2获得的细分hGH粉的平均颗粒粒度。通过将洒落到盘上的量调节至50mL/5min至80mL/5min，使制剂2的平均冷却速率变至-84.6℃/min(最大-87.4℃/min)至-67.3℃/min(最小-54.9℃/min)。由此，可以将细分hGH粉的平均颗粒粒度控制到2.7μm至5.5μm。
表4
| 洒落量(量(mL)每5min/盘) | ||||
| 50 | 60 | 70 | 80 | |
| 平均颗粒粒度(μm) | 2.7 | 2.7 | 3.2 | 5.5 |
| 平均冷却速率(℃/min) | -84.6 | -80.6 | -76.6 | -67.3 |
实施例5A
冷冻BSA水溶液并随后真空干燥
制备制剂1的BSA水溶液。将溶液的温度调节至室温，并且将其规定量部分以约2至3mm流体直径的液滴形式滴加到每5分钟在-45至-40℃下冷却的冷冻-干燥器架的盘上(面积：约1,300cm2)，并且冷冻干燥(RL-603BS：Kyowa Vacuum(冷凝容量60kg型))，以制备BSA粉。在滴加期间，盘的温度为：每盘滴速为60mL/5min时，盘温度为-40至-32℃；每盘滴速为80mL/5min时，盘温度为-32至-22℃；每盘滴速为140mL/5min时，盘温度为-34至-9℃；每盘滴速为160mL/5℃时，盘温度为-26至-8℃；每盘滴速为150mL/5min时，盘温度为-22至-4℃。通过使用所得的BSA粉，按照实施例1所述的相同方式，测定细分BSA粉的平均颗粒粒度。当每盘滴速为150mL/5min，将装料喷嘴的2mm直径硅管换成4mm直径。
表5显示了根据上述工艺通过冷冻制剂1获得的细分BSA粉的平均颗粒粒度。通过将滴落到盘上的滴速调节至60mL/5min至160mL/5min，使制剂1的平均冷却速率变至-92.6℃/min(最大-101.1℃/min)至-33.4℃/min(最小-32.6℃/min)。由此，可以将细分BSA粉的平均颗粒粒度控制到1.3μm至20.0μm。
表5
| 滴速(量(mL)每5min/盘) | |||||
| 50 | 80 | 140 | 160 | 150* | |
| 平均颗粒粒度(μm) | 1.3 | 1.4 | 2.4 | 3.8 | 20.0 |
| 平均冷却速率(℃/min) | -92.6 | -85.3 | -71.7 | 49.7 | -33.4 |
*：换管
实施例5B
冷冻BSA水溶液并随后真空干燥
制备制剂1的BSA水溶液。将溶液的温度调节至室温，并且将其规定量部分以约2至3mm流体直径的液滴形式连续滴加到每5分钟在-50至-40℃下冷却的冷冻-干燥器架的盘上(面积：约1,300cm2)，并且冷冻干燥(RL-402BS：Kyowa Vacuum(冷凝容量40kg型))，以无菌制备BSA粉。在滴加500mL制剂1期间，盘的温度为：每盘滴速为60mL/5min时，盘温度为-40至-31℃；每盘滴速为80mL/5min时，盘温度为-38至-30℃；每盘滴速为120mL/5min时，盘温度为-28至-12℃。
在1.69g乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)(乳酸/乙醇酸(摩尔比)＝约65/35，换算成聚苯乙烯的重均分子量＝约14,500)和10mg氧化锌存在于2.7mL二氯甲烷的溶液(O)中，用Polytron(Kinemachica制造)处理300mg所得的BSA，以便使粉末分散和粉化在溶液中。在向100μl所得S/O分散液中添加2.5mL二氯甲烷之后，通过激光衍射颗粒粒度分析仪(Shimadzu制造的SALD2000A)测定细分BSA粉的平均颗粒粒度。
表6显示了根据上述工艺通过冷冻制剂1获得的细分BSA粉的平均颗粒粒度。通过将滴落到盘上的滴速调节至60mL/5min至120mL/5min，使制剂1的平均冷却速率变至-93.7℃/min(最大-104.2℃/min)至-59.8℃/min(最小-57.4℃/min)。由此，可以将细分BSA粉的平均颗粒粒度控制到1.2μm至2.4μm。
表6
| 滴速(量(mL)每5min/盘) | |||
| 60 | 80 | 120 | |
| 平均颗粒粒度(μm) | 1.3 | 1.4 | 2.4 |
| 平均冷却速率(℃/min) | -93.7 | -88.5 | -59.8 |
实施例6A
冷冻hGH水溶液并随后真空干燥
制备制剂2。将温度调节至室温，并且将其规定量部分以约2至3mm流体直径的液滴形式连续滴加到在-45至-40℃下冷却的冷冻-干燥器架的盘上(面积：约1,300cm2)，并且冷冻干燥(Triomaster A04：Kyowa Vacuum(冷凝容量10kg型))，以制备hGH粉。在滴加期间，盘的温度为：每盘滴速为140mL/5min时，盘温度为-38至-18℃；每盘滴速为160mL/5min时，盘温度为-28至-2℃。通过使用所得的hGH粉，按照实施例1所述的相同方式，测定细分hGH粉的平均颗粒粒度。
表7显示了根据上述工艺通过冷冻制剂2获得的细分hGH粉的平均颗粒粒度。通过将滴落到盘上的滴速调节至140mL/5min至160mL/5min，使制剂2的平均冷却速率变至-74.1℃/min(最大-79.2℃/min)至-42.6℃/min(最小-39.8℃/min)。由此，可以将细分hGH粉的平均颗粒粒度控制到1.9μm至5.9μm。
表7
| 滴速(量(mL)每5min/盘) | ||
| 140 | 160 | |
| 平均颗粒粒度(μm) | 1.9 | 5.9 |
| 平均冷却速率(℃/min) | -74.1 | -42.6 |
实施例6B
冷冻hGH水溶液并随后真空干燥
将20倍摩尔当量的乙酸铵添加到hGH水溶液中(hGH的最终浓度＝5mg/ml)并且通过0.22μm滤器过滤此混合物，制备冷冻-干燥用的溶液制剂(制剂3)，并且还制备制剂2的hGH水溶液。将每种制剂调节至室温，并且将其规定量部分以约2至3mm流体直径的液滴形式连续滴加到在-50至-40℃下冷却的冷冻-干燥器架的盘上(面积：约1,300cm2)，并且冷冻干燥(RL-402BS：Kyowa Vacuum(冷凝容量40kg型))，以无菌制备hGH粉。在滴加期间，盘的温度为：每盘滴速为60mL/5min时，盘温度为-35至-25℃(亟待备接触的溶液的量：1L)；每盘滴速为80mL/5min时，盘温度为-31至-24℃(亟待备接触的溶液的量：500mL)；每盘滴速为94mL/5min时，盘温度为约-30℃(亟待备接触的溶液的量：250mL)。通过使用所得的hGH粉，按照实施例5B所述的相同方式，测定细分hGH粉的平均颗粒粒度。
表8显示了根据上述工艺通过冷冻制剂2和3获得的细分hGH粉的平均颗粒粒度，当制剂2的平均冷却速率为-87.4℃/min(最大-95.3℃/min)至-83.5℃/min(最小-76.6℃/min)时，可以将细分hGH粉的平均颗粒粒度控制到1.3μm至1.8μm。对制剂3的细分hGH而言，当平均冷却速率为-93.4℃/min时，可以将细分hGH粉的平均颗粒粒度控制到1.8μm。
表8
| 滴速(量(mL)每5min/盘) | ||
| 94(接触量250mL)制剂2 | 60(接触量1L)制剂2 | |
| 平均颗粒粒度(μm) | 1.3 | 1.8 |
| 平均冷却速率(℃/min) | -87.4 | -86.4 |
表8(续)
| 滴速(量(mL)每5min/盘) | ||
| 80(接触量500mL)制剂2 | 80(接触量100mL)制剂3 | |
| 平均颗粒粒度(μm) | 1.8 | 1.8 |
| 平均冷却速率(℃/min) | -83.5 | -93.4 |
实施例6C
冷冻hGH水溶液并随后真空干燥
制备制剂2的hGH水溶液。将此溶液的温度调节至室温，并且将其规定量部分以约2至3mm流体直径的液滴形式连续滴加到在-50至-40℃下冷却的冷冻-干燥器架的盘上(面积：约1,300cm2)，以便接触1L溶液，并且冷冻干燥(RL-402BS：Kyowa Vacuum(冷凝容量40kg型))，以无菌制备hGH粉。
通过使用在每盘滴速为60mL/5min或80mL/5min下获得的hGH粉，按照实施例5B所述的相同方式，测定细分hGH粉的平均颗粒粒度。此外，通过使用在每盘滴速为120mL/5min或140mL/5min下获得的hGH粉，按照实施例1所述的相同方式，测定细分hGH粉的平均颗粒粒度。
表9显示了根据上述工艺通过冷冻制剂2和3获得的细分hGH粉的平均颗粒粒度。当接触1LhGH水溶液时，可以通过将滴速控制到60mL/5min至140mL/5min，将细分hGH粉的平均颗粒粒度控制到1.6μm至4.0μm。
表9
| 滴速(量(mL)每5min/盘) | ||
| 60(接触量2L) | 80(接触量1L) | |
| 平均颗粒粒度(μm) | 1.6 | 2.5 |
表9(续)
| 滴速(量(mL)每5min/盘) | ||
| 120(接触量1L) | 140(接触量1L) | |
| 平均颗粒粒度(μm) | 3.1 | 4.0 |
参考实施例1
冷冻真空干燥BSA水溶液
制备制剂1的BSA水溶液。将溶液添加到盘上，以便形成厚度为1mm、2mm或5mm的溶液层，并且冷却至约-5％至0℃。将冷却的BSA水溶液通过冷冻干燥器(Triomaster A04：Kyowa Vacuum(冷凝容量10kg型))在-50至-40℃下冷冻，以制备冷冻干燥粉(以下简称BSA粉)。通过使用所得的BSA粉，按照实施例1所述的相同方式，测定细分BSA粉的平均颗粒粒度。
表10显示了根据上述工艺通过冷冻制剂1获得的细分BSA粉的平均颗粒粒度。上述冷冻干燥的平均冷却速率变至大于-2.1℃/min至-1.6℃/min，并且所得细分BSA粉的平均颗粒粒度为28.9μm至35.0μm。
表10
| 层厚 | |||
| 1mm | 2mm | 5mm | |
| 平均颗粒粒度(μm) | 35.0 | 38.9 | 28.9 |
| 平均冷却速率(℃/min) | -2.1 | -1.6 | -2.1 |
参考实施例2
冷冻真空干燥BSA水溶液
制备制剂1的BSA水溶液。将溶液添加到盘上，以便形成厚度为1mm的溶液层，并且放入冷冻干燥器(Triomaster A04：Kyowa Vacuum(冷凝容量10kg型))中。将溶液的温度控制到0℃。然后，以-4℃/hr的冷却速率冷却冷冻-干燥器架，以便冷冻BSA溶液，接着冷冻-干燥以制备BSA粉。通过使用所得的BSA粉，按照实施例1所述的相同方式，测定细分BSA粉的平均颗粒粒度。
表11显示了根据上述工艺通过冷冻制剂1获得的细分BSA粉的平均颗粒粒度。上述冷冻干燥的平均冷却速率与冷冻干燥器架相同，即-4℃/hr。此时，所得细分BSA粉的平均颗粒粒度为32.5μm。
表11
| 层厚 | |
| 1mm | |
| 平均颗粒粒度(μm) | 32.5 |
| 平均冷却速率(℃/hr) | -4 |
比较实施例1-6C与对比实施例1和2的结果，证实了冷却速率越慢，细分蛋白粉的平均颗粒粒度变得越大。
实施例7
冷冻hGH水溶液并随后真空干燥
制备制剂2的hGH水溶液。将此溶液调节至室温并且将规定量部分间歇式喷雾到低于-25℃的冷冻干燥器架的盘上(面积：约1,300cm2)，并且冷冻干燥(Triomaster A04：Kyowa Vacuum(冷凝容量10kg型))，以制备hGH粉。通过使用此hGH粉，按照实施例1所述的相同方式，测定细分hGH粉的平均颗粒粒度。
表12显示了根据上述工艺通过冷冻制剂2获得的细分hGH粉的平均颗粒粒度。当将制剂2喷向盘的喷雾速率控制到50ml/5min至100mL/5分钟时，制剂2的平均冷却速率变至-65.3℃/min(最大-73.9℃/min)至-37.3℃/min(最小-34.3℃/min)，并且通过将滴速控制到60mL/5min至140mL/5min，可以将细分hGH粉的平均颗粒粒度控制到1.5μm至9.5μm。
表12
| 喷速(量(mL)每5min/盘) | |||
| 50 | 80 | 100 | |
| 平均颗粒粒度(μm) | 1.5 | 2.9 | 9.5 |
| 平均冷却速率(℃/min) | -65.3 | -43.3 | -37.3 |
实施例8
生产含hGH的微胶囊
向1.85g乳酸/乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸＝50/50，换算成聚苯乙烯的平均分子量值＝13,000，粘度＝0.145dL/g)和10mg氧化锌存在于2.7mL二氯甲烷的溶液中添加140mg实施例3获得的hGH粉，其中洒落量为10或60(每盘5min的量(mL))。然后，通过使用Polytron(可商购得自Kinemachica)将其粉化。将此S/O分散液添加到800mL聚乙烯醇的0.1％水溶液中。然后，将所得的液体搅拌并且使用均混机乳化。在室温下搅拌3小时，使二氯甲烷蒸发，将分散液离心(约1,800rpm)，以收集微胶囊。接下来，用400mL蒸馏水洗涤微胶囊2次，接着加入0.2g D-甘露糖醇，然后冷冻干燥。此外，将所得的物质在46℃真空下干燥3天，除去剩余的溶剂。由此，获得两种含hGH的微胶囊。
实施例9
生产含hGH的微胶囊
按照实施例8所述的相同方式，通过使用实施例7制备的hGH粉，获得两种含hGH的微胶囊，其中喷雾量为50和80(每盘5min的量(mL))。
实施例10
生产含hGH的微胶囊
向1.69g乳酸/乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸(摩尔比)＝约65/35，换算成聚苯乙烯的平均分子量值＝14,500)和10mg氧化锌存在于2.7mL二氯甲烷的溶液中添加300mg通过在94mL/5min(亟待接触的量：250mL)滴速下冷冻实施例6B的制剂2并且干燥而获得的hGH粉。然后，通过使用Polyron(可商购得自Kinemachica)将其粉化。将此S/O分散液添加到800mL聚乙烯醇的0.1％水溶液中。然后，将所得的液体搅拌并且使用均混机乳化。在室温下搅拌3小时，使二氯甲烷蒸发，将分散液离心(约1,800rpm)，以收集微胶囊。接下来，用400mL蒸馏水洗涤微胶囊2次，接着加入0.2g D-甘露糖醇，然后冷冻干燥。此外，将所得的物质在46℃真空下干燥3天，除去剩余的溶剂。由此，获得两种含hGH的微胶囊。
实施例11
生产含hGH的微胶囊
向1.69g乳酸/乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸(摩尔比)＝约65/35，换算成聚苯乙烯的平均分子量值＝14,500)和10mg氧化锌存在于2.7mL二氯甲烷的溶液中添加300mg通过在80mL/5min(亟待接触的量：100mL)滴速下冷冻实施例6B的制剂3并且干燥而获得的hGH粉。然后，通过使用Polytron(可商购得自Kinemachica)将其粉化。将此S/O分散液添加到800mL聚乙烯醇的0.1％水溶液中。然后，将所得的液体搅拌并且使用均混机乳化。在室温下搅拌3小时，使二氯甲烷蒸发，将分散液离心(约1,800rpm)，以收集微胶囊。接下来，用400mL蒸馏水洗涤微胶囊2次，接着加入0.2g D-甘露糖醇，然后冷冻干燥。此外，将所得的物质在46℃真空下干燥3天，除去剩余的溶剂。由此，获得两种含hGH的微胶囊。
实施例12
生产含hGH的微胶囊
向1.69g乳酸/乙醇酸共聚物(乳酸/乙醇酸(摩尔比)＝约65/35，换算成聚苯乙烯的平均分子量值＝14,500)和10mg氧化锌存在于2.565mL二氯甲烷的溶液中添加300mg通过在94mL/5min(亟待接触的量：250mL)滴速下冷冻实施例6B的制剂2并且干燥而获得的hGH粉。然后，通过使用Polytron(可商购得自Kinemachica)将其粉化。将此S/O分散液添加到800mL聚乙烯醇的0.1％水溶液中。然后，将所得的液体搅拌并且使用均混机乳化。在室温下搅拌3小时，使二氯甲烷蒸发，将分散液离心(约1,800rpm)，以收集微胶囊。接下来，用400mL蒸馏水洗涤微胶囊2次，接着加入0.2g D-甘露糖醇，然后冷冻干燥。此外，将所得的物质在46℃真空下干燥3天，除去剩余的溶剂。由此，获得两种含hGH的微胶囊。
实验实施例1
体内释放特性
将实施例8和9获得的微胶囊给免疫抑制型SD大鼠(雄性，6周龄)皮下给药(6mg量的hGH/大鼠)。然后，随时间经过陆续收集大鼠血液。通过放射免疫测定(可从EIKEN CHEMICAL有限公司按Ab珠HGH的名称商购获得)测定血清hGH，以评价hGH释放特性。在微胶囊第一次给药之前3天，皮下注射0.4mg/大鼠量的PrografTM(可从Fujisawa药剂有限公司商购获得)，在微胶囊第一次给药时注射0.2mg/大鼠量的PrografTM，并且在第一个给药之后第4天、第7天、第11天和第14天时，皮下注射0.2mg/大鼠量的PrografTM，由此制备免疫抑制型SD大鼠。结果见图1。
从图1的结果中明显看出，施用通过洒落获得的hGH粉制备的微胶囊后，血液hGH含量高于施用通过喷雾获得的hGH粉制备的微胶囊后的血液hGH。这个结果表明，使用通过洒落获得的hGH制备的微胶囊制剂具有更高的生物利用性。
实验实施例2
通过FT-IR分析细分蛋白粉的较高有序结构
通过FT-IR(《药物科学杂志》，Vol.87，pp.1412-1420(1998))分析两种hGH粉的较高有序结构，即实施例4获得的hGH粉，其中洒落量为80(每盘5min的量(mL))和实施例7获得的hGH，其中喷雾量为80(每盘5min的量(mL))。结果以平均±S.D(n＝3)示于表13中。从表1中可以看出，实施例4通过洒落获得的hGH粉中的α-螺旋含量高于实施例7通过喷雾获得的hGH粉。由于hGH在重水中的α-螺旋含量为59％，因此与重水中的α-螺旋含量相比，实施例7通过喷雾获得的hGH粉保留了39％的α-螺旋。另一方面，与重水中的α-螺旋含量相比，实施例4通过洒落获得的hGH粉保留了59％的α-螺旋。
表13
| 实施例4洒落量：5min 80mL/盘的量 | 实施例7洒落量：5min 80mL/盘的量 | |||
| 波长(cm-1) | 比 | 波长(cm-1) | 比 | 排布 |
| 1694.3±0.3 | 3.5±1.3 | 1694.3±0.2 | 3.5±0.4 | β-折叠 |
| 1682.9±0.6 | 18.9±0.4 | 1684.8±0.1 | 13.7±0.2 | 无序 |
| 1667.3±1.8 | 22.3±0.9 | 1666.9±0.6 | 35.7±1.7 | 无序 |
| 1654.7±0.6 | 31.2±2.0 | 1653.5±0.2 | 23.3±2.0 | α-螺旋 |
| 1641.5±0.4 | 14.6±0.7 | 1641.8±0.3 | 13.8±0.7 | 无序 |
| 1630.1±0.3 | 6.0±0.9 | 1630.7±0.4 | 6.5±0.7 | β-折叠 |
| 1615.8±0.2 | 3.6±0.1 | 1615.8±0.1 | 3.5±0.1 | 无序 |
工业实用性
根据本发明，可以简单和方便地生产出可高度保留其较高有序结构的稳定蛋白粉，而无需与液化气体接触。因此，与通过在液化气中喷雾含蛋白溶液以便将溶液冷冻然后干燥来生产细分蛋白粉的工艺相比，无需大规模和昂贵的设备来应付隔热和设备材料因温度差异而热胀冷缩、保持无菌条件、排空液化气问题。
此外，通过简单和方便的粉化处理便可以将本发明获得的蛋白粉转变成细分蛋白粉，并且通过使用此细分蛋白粉，可以提供缓释制剂，此缓释制剂可以长时间地提供稳定的高血液含量的蛋白质。
另外，当使用乳酸和乙醇酸摩尔比为约60∶40至70∶30的乳酸-乙醇酸共聚物作为基料生产含生长激素的制剂时，可以生产出能够在约1个月内释放生长激素的缓释制剂。
Claims (19)
1、一种蛋白粉的生产方法，包括将含蛋白的溶液与致冷剂载体接触，以约-300至-10℃/min的冷却速率将溶液冷冻，然后干燥。
2、根据权利要求1的方法，其中将含蛋白的溶液洒落或滴落到制冷剂载体上。
3、根据权利要求2的方法，其中洒落或滴落直径为约0.1至40mm的滴落流体。
4、根据权利要求1的方法，其中冷冻是通过防止含蛋白溶液与液体制冷剂直接接触来完成。
5、根据权利要求1的方法，其中向含蛋白的溶液添加挥发性盐或水溶混性有机溶剂。
6、根据权利要求5的方法，其中挥发性盐是乙酸铵。
7、可根据权利要求1的方法获得的蛋白粉。
8、根据权利要求7的蛋白粉，其中蛋白质的分子量为约5,000至1,000,000道尔顿。
9、根据权利要求7的蛋白粉，其中蛋白质选自激素、细胞因子、造血因子、生长因子和酶。
10、根据权利要求7的蛋白粉，其中蛋白质是生长激素或胰岛素。
11、根据权利要求7的蛋白粉，其中蛋白质以含蛋白溶液中总的α-螺旋含量计保留了45％或更多的α-螺旋。
12、一种细分蛋白粉的生产方法，包括将权利要求7的蛋白粉粉化。
13、根据权利要求12的方法，其中粉化进行到致使获得平均颗粒粒度为约0.5至20μm的细分蛋白粉。
14、一种缓释制剂，含有可根据权利要求12的方法获得的细分蛋白粉。
15、根据权利要求14的缓释制剂，其中缓释制剂的基料是得自活体的材料或合成聚合物。
16、根据权利要求15的缓释制剂，其中得自活体的材料或合成聚合物是生物降解性聚合物。
17、一种缓释制剂，含有乳酸/乙醇酸摩尔比为60/40至70/60的乳酸/乙醇酸共聚物和生长激素。
18、一种缓释制剂的生产方法，包括使用根据权利要求12的方法获得的细分蛋白粉。
19、权利要求7的细分蛋白粉在制造缓释制剂中的用途。
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