ES2717154T3 - Formación de partículas de péptido o proteína submicrométricas estables mediante congelación de película fina - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Formación de partículas de péptido o proteína submicrométricas estables mediante congelación de película fina

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere, en general, al campo de la formación de partículas, y más particularmente, a la formación de partículas de proteína submicrométricas estables.

Antecedentes de la invención

Sin limitar el alcance de la invención, se describen sus antecedentes en relación con métodos de producción de partículas de péptido y de proteína submicrométricas estables.

Por ejemplo, la patente de EE.UU. n.° 6.723.347 enseña un proceso de producción de proteína en polvo. La patente .347 describe un proceso para producir convenientemente una proteína en polvo estable que conserva la estructura de orden superior a un nivel alto que comprende congelar una solución que contiene proteínas a una velocidad de enfriamiento de aproximadamente -300 a -1o °C/min, y luego secar.

Se puede encontrar otro ejemplo en la patente de EE.UU. n.° 6.284.282, en la que Maa et al. enseñan un método de criodesecación por pulverización de proteínas para la administración farmacéutica. La solicitud de Maa se refiere a la preparación mediante criodesecación por pulverización de formulaciones secas en polvo de proteínas terapéuticas adecuadas para la administración por vía pulmonar.

Otro ejemplo más se encuentra en la patente de EE.UU. n.° 6.862.890, titulada “Process for Production of Nanoparticles and Microparticles by Spray Freezing into Liquid”. La patente .890 proporciona un sistema y un método para la producción de micropartículas y nanopartículas de materiales que se pueden disolver. El sistema y el método proporcionan tiempos de congelación más rápidos, lo que, a su vez, produce una distribución más uniforme de los tamaños de partícula, partículas más pequeñas, partículas con mayor porosidad y una mezcla más íntima de los componentes de las partículas. El sistema y el método de la patente .890 también producen partículas con mayor área superficial que los métodos convencionales, y un método para la preparación de partículas. Un ingrediente eficaz se mezcla con agua, uno o más disolventes, o una combinación de los mismos, y la mezcla resultante se pulveriza a través de una boquilla aislante ubicada en o por debajo del nivel de un líquido criogénico. La pulverización genera partículas congeladas.

En la patente de EE.UU. n.° 6.254.854 de Edwards et al., titulada “Porous particles for deep lung delivery”, se muestra otro ejemplo más. La patente .854 enseña partículas porosas mejoradas para la administración de fármacos al sistema pulmonar, y métodos para su síntesis y administración. Las partículas porosas están hechas de un material biodegradable y tienen una densidad de masa inferior a 0,4 g/cm3. Las partículas pueden estar formadas de materiales biodegradables tales como polímeros biodegradables. Por ejemplo, las partículas pueden estar formadas por un copolímero de injerto de poliéster funcionalizado que consiste en una estructura principal de poliéster de a-hidroxiácido lineal que tiene al menos un grupo de aminoácidos incorporado en la misma y al menos una cadena lateral de poli(aminoácido) que se extiende desde un grupo de aminoácidos en la estructura principal de poliéster. Las partículas porosas que tienen un diámetro medio relativamente grande, por ejemplo, superior a 5 pm, pueden usarse para mejorar la administración de un agente terapéutico en la región alveolar del pulmón. Las partículas porosas que tienen incorporado un agente terapéutico se pueden aerosolizar eficazmente para su administración en el tracto respiratorio para permitir la administración sistémica o local de una amplia variedad de agentes terapéuticos.

El documento WO 02/060411 A2 se refiere a la producción de nanopartículas y micropartículas mediante congelación por pulverización en líquido.

Rogers et al. (Drug Development and Industrial Pharmacy 27(10), 2007: 1003-1015) se refiere a la formación de partículas a base de una solución de polvos farmacéuticos mediante CO² fluido supercrítico o comprimido y congelación criogénica por pulverización.

Por último, la patente de EE.UU. n.° 5.019.400 enseña un moldeo a muy baja temperatura de microesferas de liberación controlada. La patente .400 describe un proceso de preparación de microesferas usando temperaturas muy frías para congelar mezclas de agentes biológicamente activos y polímeros en microesferas poliméricas con una retención muy alta de la actividad biológica y del material. El polímero se disuelve en un disolvente junto con un agente activo que bien se puede disolver en el disolvente o dispersar en el disolvente en forma de micropartículas. La mezcla de polímero/agente activo se atomiza en un recipiente que contiene un líquido no disolvente, solo, o se congela y se cubre con un gas licuado, a una temperatura por debajo del punto de congelación de la solución de polímero/agente activo. El gas o líquido licuado en frío congela inmediatamente las pequeñas gotas de polímero. A medida que se calientan las gotículas y el no disolvente para el polímero, se descongela el disolvente en las gotículas y se extrae en el no disolvente, dando lugar a microesferas endurecidas.

Una desventaja de las técnicas mencionadas anteriormente cuando se usan con proteínas y péptidos es que las proteínas y los péptidos suelen formar agregados cuando el tamaño de partícula se vuelve inferior a aproximadamente 1 |jm, ya que se exponen a grandes superficies de contacto de vapor-líquido durante la extracción del agua. Estos agregados permanecen tras la reconstitución en tampón. Por lo tanto, dichas técnicas pueden no conducir a proteínas micronizadas en polvo biológicamente activas.

Además, en muchos casos, es difícil controlar la distribución del tamaño de partícula en estos procesos. Se necesitan métodos de extracción del agua de las soluciones de péptidos y proteínas para producir partículas pequeñas, con el control de la distribución de tamaño, sin formar agregados de proteínas.

Sumario de la invención

Los presentes inventores se dieron cuenta de la necesidad de un proceso sencillo, eficaz y robusto para la congelación bien de pequeñas cantidades de una solución de proteína (<1 ml) o de cantidades comerciales, que pueda producir partículas submicrométricas estables, por ejemplo, partículas de proteína.

Más particularmente, la presente invención incluye un método de preparación de partículas de tamaño micrométrico o de tamaño submicrométrico, que, opcionalmente, comprende además al menos un excipiente, mediante la disolución de un ingrediente eficaz hidrosoluble en uno o más disolventes; la pulverización o el goteo de gotículas de disolvente de manera que el ingrediente eficaz quede expuesto a una superficie de contacto de vapor-líquido inferior a 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400 o incluso 500 cirr1 de área/volumen; y el contacto de la gotícula con una superficie de congelación que tenga una diferencia de temperatura de al menos 30 °C entre la gotícula y la superficie, en el que la superficie congela la gotícula en una película fina con un espesor inferior a 500 micrómetros y una proporción del área superficial con respecto al volumen de entre 25 y 500 cm-1, en el que el ingrediente eficaz es una proteína o un péptido. En un aspecto, el método incluye además la etapa de extraer el disolvente del material congelado para formar partículas. En un aspecto, las gotículas se congelan al entrar en contacto con la superficie en aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 500, 1.000 y 2.000 milisegundos. En otro aspecto, las gotículas se congelan al entrar en contacto con la superficie en aproximadamente 50 y 150 milisegundos. En otro aspecto, la gotícula tiene un diámetro de entre 2 y 5 mm a temperatura ambiente. En otro aspecto, la gotícula forma una película fina sobre la superficie de entre 50 y 500 micrómetros de espesor. En otro aspecto, las gotículas tienen una velocidad de enfriamiento de entre -223,15 y -23,15 °C/s (50-250 K/s). En otro aspecto, las partículas, tras la extracción del disolvente, tienen un área superficial de 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150 o 200 m2/g.

En una realización, el ingrediente eficaz es una proteína o un péptido, y la partícula tiene menos del 50 % del péptido o de la proteína en la superficie de la partícula. El ingrediente eficaz o agente activo puede ser una proteína o un péptido, y la partícula tiene menos del 25, 15, 10 o 5 % del péptido o de la proteína en la superficie. En otro aspecto, las partículas tienen un diámetro submicrométrico e incluso pueden incluir fibras de partículas de diámetro inferior a un micrómetro. En otro aspecto, el ingrediente eficaz incluye un péptido tensioactivo o un péptido o una proteína, una ADNasa y antitripsina a-1, una interleucina, un inhibidor de proteasa, un receptor de interleucina, un anticuerpo monoclonal, un dipéptido de muramilo, una catalasa, una fosfatasa, una quinasa, un antagonista de receptor, un agonista de receptor, una dismutasa, una calcitonina, una hormona, un interferón, insulina, un factor de crecimiento, eritropoyetina, heparina, vasopresina, péptidos, sulfato de albuterol, sulfato de terbutalina; insulina, péptido de tipo glucagón, péptido C, eritropoyetina, calcitonina, hormona del crecimiento humano, hormona luteinizante, prolactina, hormona adrenocorticotrópica, leuprolida, interferón a-2b, interferón beta-1a, sargramostim, aldesleucina, interferón a-2a, interferón alfa, péptido n3a o inhibidor de proteinasa; etidronato, nafarelina, gonadotropina coriónica, prostaglandina E2, epoprostenol, acarbosa, metformina o desmopresina, ciclodextrina, antibióticos; y las sales orgánicas e inorgánicas farmacológicamente aceptables o sus complejos metálicos.

En una realización, la superficie es enfriada por un sólido criogénico, un gas criogénico, un líquido criogénico o un fluido de transferencia de calor capaz de alcanzar temperaturas criogénicas o temperaturas por debajo del punto de congelación del disolvente. En otro aspecto, el disolvente incluye además uno o más excipientes seleccionados entre azúcares, fosfolípidos, tensioactivos, tensioactivos poliméricos, vesículas, polímeros, incluyendo copolímeros, y homopolímeros y biopolímeros, adyuvantes de dispersión y albúmina sérica. En otro aspecto, el ingrediente eficaz incluye una enzima, y la actividad enzimática de la enzima es superior al 90 %. En otro aspecto, el ingrediente eficaz incluye un péptido o una proteína, y la agregación de péptidos o proteínas es inferior al 3 %. En otro aspecto, la diferencia de temperatura entre la gotícula y la superficie es de al menos 50 °C.

Se desvela una formulación farmacéutica que incluye partículas de fármaco preparadas mediante la preparación de partículas de tamaño micrométrico o submicrométrico mediante la disolución de un ingrediente eficaz o agente activo hidrosoluble en uno o más disolventes; la pulverización o el goteo de gotículas de disolvente de manera que el ingrediente eficaz quede expuesto a una superficie de contacto de vapor-líquido inferior a 50 cirr1 de área/volumen; y el contacto de la gotícula con una superficie de congelación que tenga una diferencia de temperatura de al menos 30 °C entre la gotícula y la superficie, en la que la superficie congela la gotícula en una película fina con un espesor inferior a 500 micrómetros y una proporción del área superficial con respecto al volumen de entre 25 y 500 cm-1.

Otra realización de la presente invención incluye un método de preparación de partículas de disolvente de tamaño micrométrico o de tamaño submicrométrico que incluye: la pulverización o el goteo de gotículas de un péptido o de una proteína hidrosoluble en un disolvente, en el que la gotícula se expone a una superficie de contacto de vaporlíquido de área/volumen inferior a 250 cm-1; la puesta en contacto de la gotícula con una superficie de congelación que tiene una diferencia de temperatura de al menos 30 °C entre la gotícula y la superficie, en el que la gotícula se congela en una película fina con un espesor inferior a 500 micrómetros y una proporción del área superficial con respecto al volumen de entre 25 y 500 cm-1. El método puede incluir además la etapa de extracción del disolvente del material congelado para formar partículas. En otro aspecto, el disolvente incluye además al menos uno o más excipientes o estabilizantes seleccionados entre, por ejemplo, azúcares, fosfolípidos, tensioactivos, tensioactivos poliméricos, vesículas, polímeros, incluyendo copolímeros, y homopolímeros y biopolímeros, adyuvantes de dispersión y albúmina sérica. En otro aspecto, el péptido o la proteína incluye una enzima, y la actividad enzimática de la enzima es superior al 90 %. En otro aspecto, la agregación de péptidos o proteínas es inferior al 3 %. En otro aspecto, la diferencia de temperatura entre el disolvente y la superficie es de al menos 50 °C. En otro aspecto, la partícula tiene menos del 50 % del péptido o de la proteína en la superficie. En otro aspecto, la partícula tiene menos del 25, 15, 10 o 5 % del péptido o de la proteína en la superficie. En otro aspecto, el péptido o la proteína incluye, por ejemplo, un péptido o una proteína tensioactivos, DNasa y a-1-antitripsina, interleucina, interferón, inhibidor de la proteasa, receptor de interleucina, anticuerpo monoclonal, dipéptido de muramilo, catalasa, fosfatasa, quinasa, antagonista de receptor, agonista de receptor, dismutasa, calcitonina, hormona, insulina, un factor de crecimiento, eritropoyetina, heparina, vasopresina, péptidos, péptido de tipo glucagón, péptido C, eritropoyetina, hormona del crecimiento humano, hormona luteinizante, prolactina, hormona adrenocorticotrópica, leuprolida, interferón, interferón a-2b, interferón beta-1a, sargramostim, aldesleucina, interferón a-2a, interferón alfa, péptido n3a o inhibidor de proteinasa; y las sales orgánicas e inorgánicas farmacológicamente aceptables o sus complejos metálicos.

Se desvela una formulación, por ejemplo, una formulación farmacéutica o un agente activo, que incluye partículas de fármaco preparadas mediante la preparación de partículas de disolvente de tamaño micrométrico o submicrométrico que incluye: la pulverización o el goteo de gotículas de un péptido o de una proteína hidrosoluble en un disolvente, en el que la gotícula se expone a una superficie de contacto de vapor-líquido de área/volumen inferior a 50 cm-1; la puesta en contacto de la gotícula con una superficie de congelación que tiene una diferencia de temperatura de al menos 30 °C entre la gotícula y la superficie, en el que la gotícula se congela en una película fina con un espesor inferior a 500 micrómetros y una proporción del área superficial con respecto al volumen de entre 25 y 500 cm'1.

Sin embargo, otra realización más incluye métodos de preparación de partículas de tamaño micrométrico o de tamaño submicrométrico mediante la preparación de una emulsión que incluye un ingrediente eficaz hidrosoluble en la solución; la pulverización o el goteo de gotículas de la solución de manera que el ingrediente eficaz se exponga a una superficie de contacto de vapor-líquido de área/volumen inferior a 50 cm-1; y el contacto de la gotícula con una superficie de congelación que tenga una diferencia de temperatura de al menos 30 °C entre la gotícula y la superficie, en el que la superficie congela la gotícula en una película fina con un espesor inferior a 500 micrómetros y una proporción del área superficial con respecto al volumen de entre 25 y 500 cm-1, en el que dicho ingrediente eficaz hidrosoluble es una proteína o un péptido.

Se desvela un sistema de preparación de nanopartículas o micropartículas de disolvente que incluye una fuente de disolvente compuesta de uno o más disolventes; un recipiente que contiene un líquido criogénico seleccionado de un líquido criogénico seleccionado del grupo que consiste en dióxido de carbono, nitrógeno, etano, propano, helio, argón o isopentano; y una boquilla aislante que tiene un extremo y una punta, en el que el extremo de la boquilla está conectado a la fuente de disolvente y la punta se coloca arriba, en o por debajo del nivel del líquido criogénico. En un aspecto, la fuente de solución incluye además agua, al menos un disolvente orgánico, o una combinación de los mismos. En un aspecto, el disolvente orgánico se selecciona del grupo que consiste en etanol, metanol, tetrahidrofurano, acetonitrilacetona, alcohol ferc-butílico, dimetilsulfóxido, W,W-dimetilformamida, dietiléter, cloruro de metileno, acetato de etilo, acetato de isopropilo, acetato de butilo, acetato de propilo, tolueno, hexanos, heptano, pentano y combinaciones de los mismos.

En otra realización, un método para la congelación de pulverización que incluye: la pulverización de un disolvente a través de una boquilla aislante situada por encima, en o por debajo del nivel de un líquido criogénico, en el que la pulverización genera rápidamente partículas de disolvente congeladas que tienen un intervalo de tamaño de 10 nm a 10 micrómetros. En un aspecto, las partículas de disolvente producidas tienen un tamaño de partícula inferior a 10 micrómetros. En otro aspecto, la partícula de disolvente tiene un área superficial superior a 50 m2/g. En un aspecto, el material criogénico es un líquido, un gas, un sólido o una superficie. En otro aspecto, el uno o más disolventes comprenden un primer disolvente que es menos volátil que un segundo disolvente, en el que se extrae el disolvente más volátil, pero no el segundo disolvente. En otro aspecto más, el uno o más disolventes comprenden un primer disolvente que es menos volátil que un segundo disolvente, en el que el disolvente más volátil se extrae por evaporación, liofilización, al vacío, por calor o químicamente.

Se desvela un método de una sola etapa y de un solo vial para preparar partículas de tamaño micrométrico o de tamaño submicrométrico mediante la reducción de la temperatura de un vial, en el que el vial tiene una diferencia de temperatura de al menos 30 °C entre el disolvente y el vial; y la pulverización o el goteo de gotículas de disolvente de un ingrediente eficaz hidrosoluble disuelto en uno o más disolventes directamente en el vial, de manera que el ingrediente eficaz quede expuesto a una superficie de contacto de vapor-líquido de área/volumen inferior a 500 cm-1, en la que la superficie congela la gotícula en una película fina con un espesor inferior a 500 micrómetros y una proporción del área superficial con respecto al volumen de entre 25 y 500 cm-1. Las gotículas se pueden congelar al entrar en contacto con la superficie en aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 500, 1.000 y 2.000 milisegundos, e incluso pueden congelarse al entrar en contacto con la superficie en aproximadamente 50, 150 a 500 milisegundos. En un ejemplo, una gotícula tiene un diámetro de entre 0,1 y 5 mm a temperatura ambiente o incluso un diámetro de entre 2 y 4 mm a temperatura ambiente. En otro ejemplo, la gotícula forma una película fina sobre la superficie de entre 50 y 500 micrómetros de espesor. En un ejemplo específico, las gotículas tendrán una velocidad de enfriamiento de entre -223,15 y -23,15 °C/s (50-250 K/s). El vial puede ser enfriado por un sólido criogénico, un gas criogénico, un líquido criogénico, un fluido de congelación, un gas de congelación, un sólido de congelación, un intercambiador térmico o un fluido de transferencia de calor capaz de alcanzar temperaturas criogénicas o temperaturas por debajo del punto de congelación del disolvente. El vial puede incluso rotarse a medida que se administran la pulverización o las gotículas para permitir la formación de capas, o una o más capas de las partículas finales. En un ejemplo, el vial, el ingrediente eficaz hidrosoluble y los uno o más disolventes se esterilizan previamente antes de la pulverización o el goteo.

El método también puede incluir la repetición de la etapa de pulverización o goteo para superponer una o más películas finas una encima de otra para llenar el vial hasta cualquier nivel deseado o incluso hasta llenarlo por completo. Breve descripción de los dibujos

Para una comprensión más completa de las características y ventajas de la presente invención, se hace referencia ahora a la descripción detallada de la invención junto con las figuras adjuntas, y en las que:

La Fig. 1A es un diagrama del proceso de congelación de película fina que muestra la caída de la gotícula.

La Fig. 1B es un diagrama de la propagación de la gotículas que caen tras el impacto en la superficie de acero inoxidable.

La Fig. 1C es un diagrama de una gotícula durante el enfriamiento y la congelación en forma de una película fina. Las Fig. 2A y 2B son fotografías de infrarrojos (IR) de una gotícula acuosa que incide y que se congela en una superficie de acero inoxidable a -50,15 °C (223 K) y a -140,15 °C (133 K), respectivamente.

La Fig. 3 es un diagrama de la intensidad de IR en función del tiempo para una película fina acuosa sobre una superficie de acero inoxidable a -50,15 °C (223 K).

La Fig. 4 es un diagrama de la dispersión de la luz láser de partículas formadas mediante congelación de película fina.

Las Fig. 5A y 5B son imágenes de micrografía electrónica de barrido (SEM) de partículas de soluciones de lisozima a 5 mg/ml procesadas mediante congelación de película fina a temperaturas superficiales de -50,15 °C (223 K) y -140,15 °C (133 K), respectivamente.

La Fig. 5C es una micrografía electrónica de barrido (SEM) de partículas de soluciones de lisozima a 5 mg/ml usando congelación por pulverización en líquido con nitrógeno líquido.

Las Fig. 6A a 6C son imágenes de SEM de partículas de solución de lisozima a 50 mg/ml procesada mediante congelación de película fina, mediante congelación por pulverización en nitrógeno líquido y mediante criodesecación por pulverización -10 pm en nitrógeno líquido, respectivamente.

La Fig. 7A es un gráfico de los perfiles de temperatura en función de la profundidad de películas acuosas finas enfriadas en una superficie a -50,15 °C (223 K) para una película fina de 220 pm.

La Fig. 7B es un gráfico de los perfiles de temperatura en función de la profundidad de películas acuosas finas enfriadas en una superficie a -140,15 °C (133 K) para una película fina de 320 pm.

La Fig. 8A es una imagen de la nucleación y el crecimiento de partículas de proteína en canales descongelados entre dominios de agua congelada y vítrea con alto sobreenfriamiento en los procesos de congelación de película fina, de congelación por pulverización en líquido y de criodesecación por pulverización.

La Fig. 8B es una imagen de la nucleación y el crecimiento de partículas de proteína en canales descongelados entre dominios de agua congelada y vítrea con bajo sobreenfriamiento en la liofilización en plataforma.

La Fig. 9 es un gráfico del tiempo de congelación en función de la exposición a la superficie de contacto de gaslíquido para la liofilización, la congelación de película fina (TFF), la congelación por pulverización en líquido (SFL) y la criodesecación por pulverización (SFD).

La Fig. 10A es una imagen de SEM de la parte superior de la película fina de lisozima seca en el centro.

La Fig. 10B es una imagen de SEM de la parte superior de la película fina de lisozima seca a aproximadamente 10 |jm del borde.

La Fig. 11 es un gráfico que muestra la congelación en película fina de lisozima con diversas cantidades de etanol a la concentración original medida tras 10 minutos de ultrasonidos por Malvern Mastersizer.

La Fig. 12 es un gráfico que muestra diversas concentraciones solubilizadas iniciales altas de lisozima congeladas mediante TFF y luego liofilizadas.

Las Fig. 13A y 13B muestran las morfologías de la lisozima de TFF preparada en un vial de vidrio (lis de TFF: alimentación = 5 mg/ml preparada directamente en un vial de vidrio) frente a una lisozima de TFF preparada en un tambor (Figuras 13C a 13D) (lis de TFF: alimentación = 5 mg/ml preparada en tambor de TFF).

La Fig. 14 muestra la suspensión resuspendida de partículas de TFF en un disolvente adecuado para la administración parenteral.

Descripción detallada de la invención

A continuación, se describen detalladamente la preparación y el uso de diversas realizaciones de la presente invención. El alcance de la invención se define en las reivindicaciones.

Para facilitar la comprensión de la presente invención, a continuación, se define una serie de términos y expresiones. Los términos y las expresiones que se definen en el presente documento tienen los significados comúnmente entendidos por los expertos en los campos relativos a la presente invención. Los términos tales como “un”, “una”, “el” y “ la” no pretenden referirse solamente a una sola entidad, sino que incluyen la clase general de la que se puede usar un ejemplo específico con fines ilustrativos. La terminología del presente documento se usa para describir realizaciones específicas de la invención, pero su uso no delimita la invención, excepto en lo que se describe en las reivindicaciones.

La capacidad para producir partículas de proteína de tamaño submicrométrico y micrométrico estables de alta área superficial crearía nuevas oportunidades para aplicaciones de administración oral, de liberación prolongada, pulmonar y transdérmica (1-9). En la administración pulmonar, se pueden depositar partículas porosas de alta área superficial con diámetros aerodinámicos de entre 1 y 3 jm más eficazmente en las profundidades del pulmón en comparación con partículas densas de diámetros aerodinámicos similares (1, 8). En la administración de liberación prolongada, las partículas de proteína submicrométricas de 300-500 nm se han encapsulado de manera uniforme en microesferas de 10-50 jm de diámetro para lograr altas cargas de proteína, a la vez que se reduce al mínimo la liberación en estallidos (4, 6, 10, 11).

Las partículas de proteína sólidas, estabilizadas mediante crioprotectores entre los que se incluyen azúcares, suelen ser menos susceptibles a la desestabilización durante el almacenamiento (1, 12-17) en comparación con las proteínas en solución. Sin embargo, la formación de partículas de proteína submicrométricas estables con áreas superficiales que superan los 10 m2/g (4, 18, 19) es altamente desafiante, ya que la extracción del agua expone las moléculas de proteína a grandes superficies interfaciales. La adsorción de proteína en las superficies de contacto de gas-líquido y de hielo-líquido suele producir el desplegamiento y la agregación (1, 18-22). En la liofilización, el proceso más común para producir partículas de proteína estables, el crecimiento de partículas durante el enfriamiento lento (-272,15 °C/min [~1 K/min]) limita el diámetro de las partículas a un mínimo de unos cuantos micrómetros con áreas superficiales inferiores a 1 m2/g (21). La misma limitación se cumple cuando se congelan en gotas pequeñas alícuotas (~20-50 j l) de solución proteica en nitrógeno líquido (23), se congelan películas gruesas (>500 jm ) en una plataforma refrigerada (24) y se congelan por inmersión tubos de PCR de paredes ultra finas llenos con solución de proteína en nitrógeno líquido (23). En estas técnicas, la solución de proteína se enfrió a velocidades de entre -272,15 y -263,15 °C/s (entre 1 y 10 K/s) (23, 24). Aunque las partículas secas pueden molerse para formar partículas submicrométricas, los rendimientos pueden ser limitados, las distribuciones de tamaño suelen ser amplias y la tensión mecánica puede conducir a la desnaturalización (1, 21). Las partículas de proteína submicrométricas pueden precipitarse de la solución acuosa mediante una variedad de procesos entre los que se incluyen el secado por pulverización (11, 21, 22, 25), la aerosolización asistida por CO² supercrítico y el secado por burbujas (scCO²A-BD) (26), la criodesecación por pulverización (SFD) (1, 18, 19, 21) y la congelación por pulverización en líquidos (SFL).

Como se usa en el presente documento, “biodisponibilidad” es un término que significa el grado en que un fármaco se vuelve disponible para el tejido diana tras su administración en el organismo. Una baja biodisponibilidad es un problema importante encontrado en el desarrollo de las composiciones farmacéuticas, en particular, en aquellas que contienen un principio activo que no es altamente hidrosoluble. En determinadas realizaciones, las proteínas pueden ser hidrosolubles, poco hidrosolubles, no muy hidrosolubles o no hidrosolubles. El experto en la materia reconocerá que se pueden usar diversas metodologías para aumentar la solubilidad de las proteínas, por ejemplo, el uso de diferentes disolventes, excipientes, vehículos, formación de proteínas de fusión, manipulación dirigida de la secuencia de aminoácidos, glicosilación, lipidación, degradación, combinación con una o más sales y la adición de varias sales.

Como se usa en el presente documento, la expresión “ingrediente eficaz” se refiere a un compuesto o compuestos, ya sea en forma pura o parcialmente purificada (por ejemplo, extractos) que tiene/n un efecto conocido en la diana. Por ejemplo, los agentes farmacéuticos son ingredientes eficaces para su diana conocida, por ejemplo, la penicilina es un ingrediente o agente eficaz contra bacterias susceptibles. Otro ejemplo de un ingrediente eficaz es un insecticida que tiene un insecto diana conocido. La presente invención se puede usar para fabricar y administrar ingredientes eficaces contra dianas de una manera que mejorará su administración, como se describe específicamente a continuación.

Como se usa en el presente documento, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de entre disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y agentes de retraso de la absorción. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse a las composiciones principios activos complementarios.

En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente el 0,1 % de un compuesto activo. En otras realizaciones, el compuesto activo puede comprender entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 75 % del peso de la unidad, o entre aproximadamente el 25 % y aproximadamente el 60 %, por ejemplo, y cualquier intervalo derivado de los mismos. En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 microgramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 10 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 50 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 100 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 200 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 350 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 500 miligramo/kg/peso corporal, a aproximadamente 1.000 mg/kg de peso corporal o más por administración y cualquier intervalo que pueda derivarse a partir de los mismos. En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 5 microgramos/kg/peso a aproximadamente 500 miligramos/kg/peso corporal, etc., se puede administrar, basándose en los números descritos anteriormente.

Las tecnologías de formación de partículas se pueden clasificar bien como cualquiera de los procesos de micronización mecánica o procesos de separación de fases basados en soluciones. Los métodos de micronización mecánica incluyen técnicas de molienda tales como las citadas en las patentes de EE. UU. n.° 5.145.684. Sin embargo, la fricción generada durante estos procesos de molienda puede conducir a una degradación térmica o mecánica del principio activo farmacéutico. El secado por pulverización, otro método común usado para micronizar sustancias farmacológicas, requiere temperaturas extremadamente altas, del orden de 150 °C, para extraer el disolvente del fármaco tras la atomización. Las temperaturas elevadas pueden acelerar la degradación del principio activo.

Los ejemplos no limitantes de ingredientes eficaces son productos farmacéuticos, agentes farmacéuticos, péptidos, ácidos nucleicos, proteínas, antibióticos, agentes de genoterapia, catalizadores, adsorbentes, pigmentos, recubrimientos, productos para el cuidado personal, abrasivos, partículas de sensores, metales, aleaciones, cerámicas, materiales de membrana, sustancias nutricionales, agentes contra el cáncer, así como productos químicos usados en las industrias agrícolas tales como fertilizantes, pesticidas y herbicidas. Se apreciará que esta lista no es exhaustiva y que solo tiene fines demostrativos. Se apreciará además que es posible que un compuesto se incluya en más de una clase de ingredientes eficaces, por ejemplo, péptidos y productos farmacéuticos.

Los ejemplos de ingredientes eficaces que son agentes farmacéuticos incluyen, pero sin limitación, antibióticos, analgésicos, anticonvulsionantes; agentes antidiabéticos, agentes antifúngicos, agentes antineoplásicos, agentes antiparkinsonianos, agentes antirreumáticos, supresores del apetito, modificadores de la respuesta biológica, agentes cardiovasculares, estimulantes del sistema nervioso central, agentes anticonceptivos, agentes de diagnóstico, agonistas del receptor de la dopamina, agentes para la disfunción eréctil, agentes para la fertilidad, agentes gastrointestinales, hormonas, inmunomoduladores, agentes antihipercalcemia, estabilizadores de los mastocitos, relajantes musculares, agentes nutricionales, agentes oftálmicos, agentes para la osteoporosis, agentes psicoterapéuticos, agentes parasimpatomiméticos, agentes parasimpatolíticos, agentes respiratorios, agentes hipnóticos sedantes, agentes para la piel y membranas mucosas, agentes para dejar de fumar, esteroides, agentes simpaticolíticos, agentes de las vías urinarias, relajantes uterinos, agentes vaginales, vasodilatador, antihipertensor, hipertiroideos, antihipertiroideos, antiasmáticos y agentes para el vértigo. Otros ejemplos de ingredientes eficaces incluyen un fármaco cardiovascular, fármaco respiratorio, fármaco simpaticomimético, fármaco colinomimético, fármaco adrenérgico o bloqueador de neuronas adrenérgico, antidepresivo, agente antihipertensivo, antiinflamatorio, agente ansiolítico, agentes inmunosupresores, agentes antimigraña, sedantes/hipnóticos, agentes antianginosos, agentes antipsicóticos, agentes antimaníacos, antiarrítmicos, agentes antiartríticos, agentes antigotosos, anticoagulantes, agentes trombolíticos, agentes antifibrinolíticos, agentes hemorreológicos, agentes antiplaquetarios, anticonvulsionante, antihistamínico/antiprurítico, agente útil para la regulación del calcio, agentes antivíricos, antiinfeccioso, broncodilatador, hormona, agente hipoglucemiante, agente hipolipidémico, proteína, ácido nucleico, agente útil para la estimulación de la eritropoyesis, agente antiulceroso/antirreflujo, antináuseas/antiemético, vitamina liposoluble, mitotano, visadina, halonitrosourea, antraciclina o elipticina.

Los ingredientes farmacéuticos eficaces se pueden usar en una variedad de modalidades de aplicación, incluyendo la administración oral en forma de comprimidos, cápsulas o suspensiones; administración pulmonar y nasal; administración tópica en forma de emulsiones, pomadas o cremas; y administración parenteral en forma de suspensiones, microemulsiones o formulaciones de liberación prolongada. El polvo resultante se puede volver a dispersar en cualquier momento conveniente en un medio acuoso adecuado en forma de solución salina, solución salina tamponada, agua, medios acuosos tamponados, soluciones de aminoácidos, soluciones de vitaminas, soluciones de carbohidratos o similares, así como combinaciones de dos cualquiera o más de los mismos, obteniéndose una suspensión que se pueda administrar a los mamíferos.

El agente de solución usado en la solución puede ser acuoso tal como agua, uno o más disolventes orgánicos, o una combinación de los mismos. Cuando se usan, los disolventes orgánicos pueden ser hidrosolubles o no hidrosolubles. Los disolventes orgánicos adecuados incluyen, pero sin limitación, etanol, metanol, tetrahidrofurano, acetonitrilo, acetona, alcohol ferc-butílico, dimetilsulfóxido, W,W-dimetilformamida, dietiléter, cloruro de metileno, acetato de etilo, acetato de isopropilo, acetato de butilo, acetato de propilo, tolueno, hexanos, heptano, pentano y combinaciones de los mismos.

Los excipientes y adyuvantes que pueden usarse en la presente invención, aunque pueden tener cierta actividad por sí mismos, por ejemplo, antioxidantes, se definen en general para la presente solicitud como compuestos que mejoran la eficiencia y/o la eficacia de los ingredientes eficaces. También es posible tener más de un ingrediente eficaz en una solución dada, de modo que las partículas formadas contengan más de un ingrediente eficaz.

Como se ha indicado, se pueden usar excipientes y adyuvantes para mejorar la eficacia y la eficiencia de los ingredientes eficaces. Los ejemplos no limitantes de compuestos que pueden incluirse en las soluciones que se van a congelar por pulverización de acuerdo con la presente invención incluyen: crioprotectores, lioprotectores, tensioactivos, cargas, estabilizantes, polímeros, inhibidores de proteasas, antioxidantes y potenciadores de la absorción. Los excipientes pueden seleccionarse para modificar la función prevista del ingrediente eficaz mejorando el flujo o la biodisponibilidad, o para controlar o retrasar la liberación del ingrediente eficaz. Los ejemplos no limitantes específicos incluyen: sacarosa, trehalosa, Span 80, Tween 80, Brij 35, Brij 98, Pluronic, sucroéster 7, sucroéster 11, sucroéster 15, laurilsulfato de sodio, ácido oleico, laureth-9, laureth-8, ácido láurico, vitamina E TPGS, Gelucire 50/13, Gelucire 53/10, Labrafil, dipalmitoil-fosfaditilcolina, ácido glicólico y sales, ácido desoxicólico y sales, fusidato de sodio, ciclodextrinas, polietilenglicoles, labrasol, alcoholes polivinílicos, polivinilpirrolidonas y viniloxapol. Usando el proceso de la presente invención, se puede modificar la morfología de los ingredientes eficaces, dando lugar a micropartículas y nanopartículas altamente porosas.

En determinadas realizaciones, la presente invención demuestra un nuevo método para producir partículas de proteína submicrométricas estables. El método se denomina en el presente documento congelación de película fina (TFF). La Fig. 1 ilustra una realización de TFF. En la TFF, las gotículas de líquido, en general, caen desde una altura dada e impactan, se esparcen y se congelan en un sustrato sólido enfriado. En la Fig. 1A, una gotícula 10 cae desde una altura dada e impacta sobre una superficie de centrifugación 12 que tiene una temperatura de -50,15 °C (223 K). A medida que la gotícula se disemina, se forma un frente de congelación 14 antes que el líquido descongelado 16 que se muestra en la Fig. 1B. Por lo general, el tamaño de la gotícula completamente congelada 18 es de aproximadamente 12 mm de diámetro, con una altura de aproximadamente 216 pm. Recientemente, se usó la TFF para formar un polvo con alto contenido de SSA (25-29 m2/g) del fármaco poco hidrosoluble danazol (45). Se dispensaron gotículas de líquido (~2-4 mm de diámetro) desde una pipeta sobre una superficie de metal enfriada criogénicamente (46, 47). Tras el impacto, las gotículas se dispersaron en películas finas (~100-400 pm) que se congelaron en escalas de tiempo de 70 a 1.000 ms, lo que corresponde a una velocidad de enfriamiento de D-173,15 °C/s (D102 K/s) (42-44, 47-57). Las velocidades de enfriamiento previstas con un modelo de transferencia de calor 1-D coincidieron con las mediciones de laboratorio con una cámara de infrarrojos (IR) (45). Dado que las velocidades de enfriamiento en la TFF y SFL son comparables, cabe esperar que la TFF sea un proceso deseable para formar partículas de proteína de alta área superficial.

Como será evidente para los expertos en la materia, as gotículas se pueden administrar en la superficie fría o de congelación en una variedad de maneras y configuraciones. Por ejemplo, para proporcionar capacidades de alto rendimiento, las gotículas pueden administrarse en paralelo, en serie, en el centro, en el medio o en la periferia de una superficie de una platina, un plato, una placa, un rodillo, un transportador. La superficie helada o fría puede ser un rodillo, una correa, una superficie sólida, circular, cilíndrica, cónica, ovalada y similares que permitan que la gotícula se congele. Para un proceso continuo, una correa, una platina, una placa o un rodillo puede ser particularmente útil. En funcionamiento, las gotículas congeladas pueden formar perlas, cadenas, películas o líneas de sustrato congelado e ingrediente eficaz que se eliminan de la superficie con un raspador, alambre, ultrasonido u otro separador mecánico antes del proceso de liofilización. Una vez que el material se retira de la superficie de la correa, platina, rodillo o placa, la superficie queda libre para recibir más material en un proceso continuo.

En determinadas realizaciones, la presente invención demuestra que se pueden formar partículas de LDH y de lisozima submicrométricas (>10 m2/g) con una actividad enzimática del 100 % con TFF seguida de liofilización. La velocidad de enfriamiento se diseñó para que fuera lo suficientemente rápida como para detener el crecimiento de las partículas, mientras que el área superficial de la superficie de contacto de líquido-gas relativamente pequeña ayuda a prevenir la adsorción, el despliegue y la agregación de proteínas. La presente invención presenta las dimensiones de las películas finas, las estabilidades (actividad enzimática) de los polvos de LDH tras la reconstitución y las morfologías de las partículas de lisozima determinadas mediante mediciones de SEM y BET del área superficial. La presente invención también proporciona velocidades de enfriamiento de las películas finas determinadas por un modelo de transferencia de calor 1-D y una medición de IR. Las velocidades de enfriamiento, las morfologías de las partículas y las estabilidades de las proteínas para los procesos de velocidad de enfriamiento intermedia, TFF y SFL, en relación con el proceso de enfriamiento ultrarrápido, SFD, y con el proceso lento, la liofilización, también se compararon. Se presenta un mecanismo de nucleación y crecimiento de proteínas para ilustrar las morfologías de las partículas en términos de velocidades de enfriamiento. En la TFF, se muestra que el área mucho menor de la superficie de contacto de gas-líquido de la gotícula que cae y la película esparcida en relación con las gotículas atomizadas en SFD produce una cantidad significativamente menor de adsorción de proteínas y, por consiguiente, una desnaturalización y agregación mínimas. Además, se muestra que la velocidad de enfriamiento intermedia (D-173,15 °C/s [D102 K/s]) es suficiente para detener el crecimiento de las partículas, dando un área superficial de >30 m2/g.

En comparación con la SFD y SFL, la TFF ofrece la ventaja de la simplificación en las etapas de procesamiento, además de la mejora en la estabilidad de la proteína. La t Ff en una superficie metálica fría evita la necesidad de mantener condiciones asépticas de un criógeno líquido, por ejemplo, nitrógeno líquido, en los procesos de SFD y SFL (24). La velocidad de enfriamiento de las películas finas en la TFF se puede controlar fácilmente variando la temperatura de la superficie del metal. Asimismo, la temperatura de la superficie de la película se puede medir directamente (45). Para la SFL y SFD, la compleja geometría de la pulverización turbulenta en el nitrógeno líquido (LN²) combinada con el efecto de Leidenfrost puede ser algo difícil de controlar y de monitorizar (36). En la TFF, se pueden procesar soluciones más concentradas y, por lo tanto, más viscosas, ya que las gotículas no necesitan ser atomizadas. En la TFF, la recogida de las películas congeladas conduce a casi el 100 % del rendimiento. Sin embargo, en el proceso de SFD, los rendimientos fueron solo del aproximadamente 80 % como resultado del arrastre de partículas no capturadas en la corriente acuosa atomizada, partículas adheridas a los lados de los recipientes de recogida y separación ineficaz del criógeno de las partículas congeladas de 10-100 pm (11,21).

Materiales. La lisozima se adquirió de Sigma, y L-LDH, de corazón porcino suspendido en una solución de sulfato de amonio 3,2 M de Roche Applied Science. La trehalosa, NADH y el piruvato se adquirieron de Sigma. El agua se desionizó haciendo fluir agua destilada a través de una serie de recipientes de lecho mixto de 2 x 7 l (Water and Power Technologies) que contenían mezclas de resina aniónica:catiónica de 60:40.

Preparación de enzima LDH y ensayo de actividad catalítica. La preparación de la enzima LDH y el ensayo de actividad catalítica usados en la presente invención se describen en detalle en una referencia previa (32). Se sometió a diálisis la LDH en sulfato de amonio frente a tampón de KPO⁴ 10 mM (pH 7,5) a 4 °C durante 3 horas antes de su uso (58, 59). Se midieron las actividades de LDH para la reacción de piruvato y NADH en lactato y NAD+. Las unidades de actividad de LDH (U) se calcularon midiendo la disminución en la absorción de NADH a A = 340 nm cada 15 segundos durante 1 minuto debido a la conversión de NADH en NAD a lo largo del tiempo (U = Apmol de NADH/min) y luego dividiendo entre la masa (mg) de la proteína LDH en solución para determinar la actividad específica (U/mg). La estabilidad de la formulación de LDH en 30 mg/ml de trehalosa se midió a lo largo del tiempo. La actividad específica de LDH se mantuvo estable durante una hora y luego comenzó a disminuir. Todos los resultados se realizaron en el período de tiempo en el que la actividad específica de LDH no se había deteriorado. Durante este período de tiempo, se definió la actividad específica como el 100 %.

Ejemplo del procedimiento de congelación de película fina (TFF). Se pasaron soluciones acuosas de proteína de LDH o lisozima a un caudal de 4 ml/min a través de una aguja de jeringa de acero inoxidable de calibre 17 (1,1 mm de diámetro interior, 1,5 mm de diámetro exterior) produciendo gotículas de 3,6 mm de diámetro, o a través de un tubo de acero inoxidable de un diámetro interior de 3,9 mm y un diámetro exterior de 6,4 mm, produciendo gotículas de 5,6 mm de diámetro. Las gotículas cayeron desde una altura de 10 cm por encima de un tambor de acero inoxidable giratorio de 17 cm de largo y 12 cm de diámetro. El tambor de acero inoxidable estaba hueco con paredes de 0,7 cm de espesor, y se llenó con hielo seco o nitrógeno líquido para mantener la temperatura de la superficie del tambor de -50,15 °C a -140,15 °C (223 K o 133 K), respectivamente. Antes de cada serie, se verificó la temperatura de la superficie del tambor con un termómetro DiGi-Sense® Tipo K usando un accesorio de termopar de sonda de superficie de ángulo de 45 ° (Eutech Instruments). El tambor giró a aproximadamente 12 rpm y fue impulsado por un agitador mecánico superior Heidolph RZR2041 (ESSLAB) conectado a un reductor de la velocidad. Al impactar, las gotículas se deformaron en películas finas (Fig. 1) y se congelaron. Se retiraron las películas finas congeladas del tambor con una cuchilla de acero inoxidable montada a lo largo de la superficie del tambor giratorio. Las películas finas congeladas cayeron 5 cm en un vaso de precipitados Pyrex® de 400 ml lleno de nitrógeno líquido. Para la lisozima, las películas finas congeladas en los vasos de precipitados Pyrex® de 400 ml se transfirieron directamente a un congelador a 80 °C para evaporar el exceso de nitrógeno líquido. Para la LDH, las películas finas congeladas se transfirieron de los vasos de precipitados Pyrex® de 400 ml a tubos de polipropileno de 50 ml (número de pieza UP2255, United Laboratory Plastics) de 2 cm de diámetro y 16 cm de altura usando una espátula previamente enfriada en nitrógeno líquido.

Fotografías de infrarrojos de películas finas en enfriamiento. Se colocó una cámara InSb de matriz de plano focal (FPA) (sistema de adquisición digital Phoenix (cámara DAS, Indigo Systems) para adquirir imágenes infrarrojas sobre la película fina en enfriamiento en una placa plana. La cámara FPA detectó una radiación de 3-5 pm, y Las imágenes se adquirieron a 100 cuadros por segundo (10 ms/imagen). Las dimensiones de cada cuadro fueron 256 píxeles por 256 píxeles (15 mm x 15 mm). La resolución espacial de la imagen fue de aproximadamente 40 pm por píxel. Se calcularon los valores de intensidad media usando MATLAB® versión 6 (20 x 20 píxeles cuadrados dentro del centro de la gotícula) y se representaron gráficamente en función del tiempo para determinar el tiempo hasta que el centro de la película fina alcanzaría el equilibrio térmico con la placa.

Secado y carga en la plataforma. Se usó un liofilizador Virtis Advantage (The Virtis Company, Inc.) para secar las suspensiones congeladas. Se cubrieron los vasos de precipitados de 400 ml que contenían suspensiones congeladas de lisozima y los tubos de polipropileno de 50 ml que contenían las suspensiones congeladas de LDH con una capa de Kim-wipe. El secado primario se llevó a cabo a -40 °C durante 36 h a aprox. 0,040 MPa (300 mTorr), y el secado secundario, a 25 °C durante 24 h a 0,013 MPa (100 mTorr). Se usó una rampa lineal de 12 horas de la temperatura de la plataforma de -40 °C a 25 °C a 0,013 MPa (100 mTorr).

Reconstitución de la LDH y ensayo de concentración. Los polvos de LDH secos se reconstituyeron con 1 ml de agua DI y el ensayo enzimático se realizó de inmediato. Tras analizar todas las muestras de proteínas para determinar la actividad enzimática, se midió la concentración de proteínas con el kit de análisis de proteínas de BCA (ácido bicinconínico) (Sigma Chemical Company). Una vez determinadas las concentraciones de proteína, se pudo calcular la actividad específica de cada medición. La actividad de cada muestra de LDH se normalizó por la actividad específica del control medida inmediatamente antes del proceso de congelación.

Transferencia y almacenamiento de polvos secos. Una vez completado el ciclo de liofilización, se purgó el liofilizador con nitrógeno al liberar el vacío para reducir el tiempo de exposición de los polvos de proteína al vapor de agua en el aire ambiente antes de la transferencia. Las muestras se transfirieron rápidamente a una caja seca mantenida a una HR del 14 %, y los polvos se transfirieron a viales de centelleo de 20 ml. Luego, se cubrieron los viales con septos de silicona con revestimiento de Teflon® de 24 mm (Wheaton) que se mantuvieron en su sitio mediante tapones de rosca de parte superior abierta. Se purgaron los viales con nitrógeno seco durante 2 minutos por medio de una aguja a través de los septos y una aguja adicional para el efluente de gas.

Medición del área superficial. Las áreas superficiales de los polvos secos se midieron con un aparato BET Quantachrome Nova 2000 (Quantachrome Corporation). Se transfirieron los polvos secos a las celdas de muestra BET de vidrio en una caja seca. Las muestras se desgasificaron al vacío durante un mínimo de 12 horas. Se usó la ecuación de Brunauer, Emmett y Teller (BET) (60) para ajustar los datos de adsorción de nitrógeno a -196,15 °C (77 K) en un intervalo de presión relativa de 0,05-0,30. Las muestras se midieron dos veces.

Contenido de humedad residual. Se dispensaron partes alícuotas de metanol a través del septo de los viales de centelleo para formar una concentración de suspensión de 10-100 mg/ml. Luego se colocaron los viales en un baño de ultrasonidos (Mettler Electronics) durante 5 minutos a máxima potencia para garantizar la suspensión completa del polvo. Se midió el contenido de humedad para una alícuota de 200 pl con un valorador Aquatest 8 Karl-Fischer (Photovolt Instruments). Los valores de humedad se corrigieron con un control de blanco de metanol de 200 pl. Todas las muestras tenían un contenido de humedad de entre 6-8 % (p/p) tras el secado, comparables a los valores del 2­ 7 % (p/p) para la BSA preparada mediante SFD (18).

Análisis del tamaño de partícula. La distribución del tamaño de los polvos secos se midió mediante dispersión de luz láser de múltiples ángulos con un Malvern Mastersizer-S (Malvern Instruments). Se suspendió una masa de 30-100 mg de polvo en 10 ml de acetonitrilo y luego se sometió a ultrasonidos la suspensión en hielo durante 1 minuto usando un Branson Sonifier 450 (Branson Ultrasonics Corporation) con un convertidor 102, y la punta se manejó en modo de pulso a 35 W. Los valores típicos de oscurecimiento variaron entre el 11 % y el 13 %. Las partes alícuotas de la suspensión sometida a ultrasonidos se dispensaron luego en un baño de acetonitrilo de 500 ml para su análisis.

Microscopía electrónica de barrido (SEM). Se recogieron imágenes de SEM en un microscopio electrónico de barrido Hitachi modelo S-4500 (Hitachi Ltd). Las muestras se prepararon en una caja seca. Se sumergieron suavemente plataformas de aluminio dotadas de cinta conductora de carbón adhesivo doble en viales de muestra hasta que se cubrieron con polvo. Las plataformas se colocaron luego en viales tapados con septos y se purgaron con nitrógeno para la transferencia. Para minimizar el tiempo en que las muestras se expusieron a la humedad atmosférica, las plataformas se transfirieron rápidamente a un dispositivo de recubrimiento por pulverización Pelco Modelo 3. Se aplicó una capa dorada conductora, y las muestras se transfirieron luego rápidamente a la SEM. La exposición total a la atmósfera fue inferior a 1 minuto.

La Tabla 1 (a continuación) muestra la caracterización de las películas finas formadas a partir de gotículas de agua desionizada en función de la temperatura superficial y del diámetro de las gotículas.

Tabla 1.

Las gotículas se extendieron sobre la superficie metálica fría y formaron un disco fino cilíndrico. El diámetro del disco disminuyó con una disminución de la temperatura de la superficie de -50,15 °C (223 K) a -140,15 °C (133 K), y aumentó con un aumento del radio de las gotículas que caían. Dado que las películas finas congeladas eran discos cilíndricos, los espesores de las películas finas se calcularon a partir del volumen conocido de la gotícula de líquido y del diámetro del disco medido. Los volúmenes de las gotículas descendentes se determinaron contando el número de gotículas necesarias para ocupar 1 ml en un cilindro graduado. El espesor medio de la película fina para superficies a -50,15 °C (223 K) a -140,15 °C (133 K) fueron de 220 pm y 320 pm, respectivamente. En la Tabla 1, también se muestran las proporciones de área superficial/volumen correspondientes para las superficies superiores de los cilindros. Los espesores de la película eran esencialmente independientes del diámetro de gotícula descendente. Para muestras acuosas que contenían concentraciones de lisozima de entre 5 y 50 mg/ml o trehalosa a 30 mg/ml, los volúmenes de las gotículas, los diámetros del disco y, por lo tanto, los espesores de la película no cambiaron en relación con el agua pura. Las proporciones de área superficial/volumen para las gotículas descendentes de 3,6 mm y 5,6 mm en TFF fueron de 17 cm-1 y 11 cm-1, respectivamente. Como se muestra en la Tabla 1, tras el impacto, las gotículas descendentes se diseminan en películas finas con proporciones finales de área superficial/volumen de entre 31 y 46 cm-1. En una referencia previa (36) de SFD y SFL, las proporciones de área superficial/volumen correspondientes fueron de 6.000 y 600 cm-1, respectivamente. En relación con estos valores, cabe esperar que la proporción mucho menor de área superficial/volumen para la TFF disminuya el grado de desestabilización de la proteína por la exposición a la superficie de contacto de gas-líquido.

Las películas finas se caracterizaron además mediante la determinación de las velocidades de enfriamiento a partir de mediciones de infrarrojos. La cámara de IR emite valores de intensidad, indicando el blanco una intensidad alta, y el negro, una intensidad baja en relación con la cantidad de energía radiante E (densidad de energía por unidad de tiempo por unidad de longitud de onda) emitida por la gotícula (45, 61). La energía radiante E está relacionada con la temperatura del objeto según la ley de Planck como la ecuación (1)

Ecuación (1)

en la que A es la longitud de onda, c es la velocidad de la luz, k es la constante de Boltzmann, h es la constante de Planck y T es la temperatura en grados Kelvin (61). Por lo tanto, el resultado de la intensidad de la cámara de IR es directamente proporcional a la temperatura.

Para la película fina sobre la superficie a -50,15 °C (223 K) mostrada en la Fig. 2A, el diámetro de la película era de 12 mm y el borde era uniforme y liso. A medida que avanzaba el enfriamiento, un frente de enfriamiento se movía radialmente hacia adentro desde el borde de la película hacia el centro. El centro de la película alcanzó el equilibrio térmico en 1,6 s como se muestra en la Fig. 2A y en la Fig. 3. Para la película fina sobre la superficie a -140,15 °C (133 K) demostrada en la Fig. 2B, el diámetro fue de 10 mm y se observaron “dedos” oscuros e irregulares en el borde, indicando los dominios más fríos. Al principio, el frente de enfriamiento se movió radialmente hacia adentro desde el borde hacia el centro. A continuación, el centro se volvió negro, y una región anular entre el centro y el borde irregular exterior permaneció gris. El frente de enfriamiento luego invirtió la dirección moviéndose desde el centro hacia el borde de la película. La Figura 3 muestra que el centro de la película alcanzó el equilibrio térmico un poco más lentamente, en aproximadamente 3 s, en relación con -50,15 °C (223 K). En cada caso, en el centro de la película, se observó una meseta y luego una desintegración final abrupta al equilibrio térmico.

Las actividades de LDH para una formulación acuosa de LDH a 0,25 mg/ml con trehalosa a 30 mg/ml congelada por liofilización, SFL (32) y TFF fueron extremadamente altas y no significativamente diferentes (p < 0,05) de acuerdo con una prueba t de Student mostrada en la Tabla 2. La Tabla 2 muestra las actividades para LDH a 0,25 mg/ml, formulaciones de trehalosa a 30 mg/ml congeladas mediante diversas técnicas en tampón de KPO⁴ 10 mM a pH 7,5 en réplicas de 3.

Tabla 2

En comparación con el proceso de SFD para tres tamaños de gotícula, las actividades de LDH para cada condición de TFF fueron significativamente mayores (p <0,05). Las actividades de LDH muy altas se mantuvieron en el proceso de TFF a lo largo de las tensiones en serie de la caída y diseminación de las gotículas, la congelación, el secado y la reconstitución.

Dadas las altas actividades enzimáticas para las partículas de LDH formadas mediante TFF, el otro objetivo clave era demostrar morfologías de partículas con tamaños submicrométricos de partícula y grandes áreas superficiales de las partículas. La Tabla 3 muestra las medidas de área superficial específica y las distribuciones del tamaño de partícula para polvos de lisozima formados mediante congelación de película fina, SFL y SFD.

Tabla 3

En el caso de la LDH, la proporción de LDH:trehalosa fue de 1:120 en masa. Como se ha descrito anteriormente (32, 36), el área superficial de la partícula para la trehalosa disminuyó tras la exposición a la humedad atmosférica, lo que reduce considerablemente la Tg. (Esta limitación se puede resolver en el futuro con el uso de tapones de liofilización para cerrar herméticamente los viales de la humedad). Por lo tanto, se escogió la lisozima como una proteína modelo para investigar la morfología del polvo en lugar de LDH: trehalosa. Las muestras de lisozima obtenidas y transferidas a temperatura ambiente tenían contenidos de humedad de entre el 6 y el 8 % según lo determinado por la valoración de Karl Fischer. Para contenidos de humedad de entre 7-8 % en peso, la Tg se mantuvo alta, entre 50-60 °C (62). Por lo tanto, cabe esperar que la pérdida de lisozima SSA durante la transferencia sea despreciable. Para la mayoría de los casos, los valores de SSA fueron similares, variando entre 30 y 55 m2/g. Para la lisozima a 5 mg/ml, las películas más finas a -50,15 °C (223 K) produjeron una SSA significativamente superior, de 73 m2/g, en relación con las películas a -140,15 °C (133 K). En una referencia anterior (36), soluciones de lisozima a 5 y 50 mg/ml procesadas mediante SFL resultaron tener mediciones de SSA en polvo de 114 m2/g y 34 m2/g, respectivamente, similares a los valores producidos mediante TFF (36). Aunque la SSA de 126 m2/g para la SFD fue aproximadamente 2 veces superior a la de la TFF, la actividad de la enzima fue mucho menor, como se muestra en la Tabla 2.

Como se muestra en la Tabla 3, el porcentaje de volumen de partículas submicrométricas, determinado mediante dispersión de luz láser, tras el tratamiento de ultrasonidos de la formulación de lisozima a 5 mg/ml preparada mediante TFF a -50,15 °C (223 K), varió del 88 al 92 %. La similitud en estos dos valores era de esperar, ya que cabía esperar que los espesores de película fina casi idénticos produjeran velocidades de enfriamiento similares. Estos valores fueron similares a los de los polvos de la SFL (36). Para la TFF, los polvos de proteína resultaron ser friables, pudiéndose dividir fácilmente en partículas submicrométricas con un mínimo de ultrasonidos. Como se muestra en la Fig. 4, el D(v,50) fue de 300 nm. Por el contrario, la misma formulación de lisozima a 5 mg/ml preparada mediante liofilización resultó tener una fracción muy baja, del 7 % de partículas submicrométricas, mostradas en la Fig. 4 y la Tabla 3. A medida que la concentración de carga de lisozima se elevaba hasta 50 mg/ml, la fracción submicrométrica disminuía hasta el 66 y 62 % en las superficies de -50,15 °C (223 K) y -140,15 °C (133 K), respectivamente. El valor correspondiente para la SFL fue inferior (48 %), mientras que para la SFD fue mayor (74 %) (36). Para los polvos de SFD, el D(v,50) fue de aproximadamente 300 nm (36). Un segundo máximo con partículas de tamaño micrométrico estuvo presente para la solución de lisozima de 50 mg/ml preparada mediante SFL y TFF como se muestra en la Tabla 3. Sin embargo, 50 mg/ml es una concentración de proteína inusualmente alta, y la TFF normalmente se aplicaría a concentraciones en el orden de 5 mg/ml, no estando presente el segundo máximo más alto como se muestra en la Fig. 4.

Las imágenes de SEM seleccionados de los resultados de la Tabla 3 se muestran en la Fig. 5 y 6. Para la lisozima a 5 mg/ml, se produjeron partículas primarias finas de 50 nm mediante TFF a -50,15 °C (223 K), como se demuestra en la Fig. 5A, comparables a las producidas mediante SFL (36) en la Fig. 5C. A -140,15 °C (133 K), se mezclaron partículas de 50-100 nm de diámetro más grandes con varillas de 50-100 nm de diámetro y más de 500 nm de longitud como se ve en la Fig. 5B. Los tamaños de partículas más grandes que se muestran en la Fig. 5B en comparación con la Fig. 5A coinciden con el contenido ligeramente inferior de partículas submicrométricas medido mediante dispersión de luz enumerados en la Tabla 3.

Para soluciones de lisozima altamente concentradas a 50 mg/ml y una temperatura superficial de -50,15 °C (223 K), se observaron grandes láminas con características de entre 1 y 2 pm como se muestra en la Fig. 6A. Se observaron características similares para la SFL (36). Por el contrario, la SFD (36) produjo una banda fina con características de 100 nm como se ve en la Fig. 6C, coincidiendo con los tamaños de partícula más pequeños medidos mediante dispersión de luz en la Tabla 3. Las características más grandes observadas en los procesos de TFF y SFL para las soluciones de 50 mg/ml frente a las de 5 mg/ml coinciden con las distribuciones de tamaño de partícula medidas mediante dispersión de luz. La similitud de las morfologías de las partículas para los polvos preparados mediante los procesos de SFL y TFF a las concentraciones de 5 y 50 mg/ml también se examinan en términos de velocidades de enfriamiento.

Modelización de la velocidad de enfriamiento de películas finas. Se ha descrito la dispersión de gotículas para formar películas finas de metal líquido y agua en términos del número de Weber, (fuerza inercial frente a fuerza interfacial) donde está la velocidad de impacto, está el diámetro de la gotícula y está la tensión interfacial de la gotícula en el aire. Para We > 30 inmediatamente antes de impactar el sustrato sólido enfriado (42, 48-50, 56, 63), las gotículas se deformaron en películas finas cilíndricas antes de la congelación. Para el régimen bajo de We <1, las gotículas impactantes se congelaron en forma de cúpulas esféricas con una dispersión mínima de las gotículas (49, 64). Para las gotículas líquidas descendentes, y (aire-agua) = 72 mN/my V = (2gH)1/2 (65), en la que la altura de caída, H, de la gotícula fue de 10 cm, dando lugar a V = 1,4 m/s. La formación observada de discos cilíndricos finos coincidió con este We de 97, pero cuando H se redujo a menos de 1 cm (We = 9,8), las gotículas de agua impactantes se congelaron en forma de cúpulas esféricas que tenían solo 4 mm de diámetro.

Anteriormente, se ha demostrado con estudios de generación de imágenes IR de películas finas formadas con acetonitrilo y f-butanol que la propagación de las gotículas se produjo en el primer intervalo de 10 ms, lo que indica que el tiempo de propagación de las gotículas fue mucho menor que el tiempo de congelación (45). El mismo comportamiento se observó en la Fig. 2 para el agua. La predicción de la velocidad de enfriamiento de la película con un modelo de transferencia de calor analítico simplificado coincidió con los datos de IR producidos en el laboratorio (45). En el presente documento, este enfoque se extiende a la congelación de las gotículas de agua en películas finas.

En resumen, el modelo supone que la gotícula se disemina para formar una película cilindrica en una escala de tiempo mucho más breve que la transferencia de calor. Dado que la altura (espesor) de la película fina está del orden de 200­ 400 |jm, en proporción con un diámetro mucho mayor, de 10-12 mm, se ignora la transferencia de calor radial. La difusividad térmica, a = k/p*C ^p , En la que k es la conductividad térmica, p es la densidad C^p es la capacidad calorífica, se trata como constante en todo el intervalo de temperatura. Para el caso del agua congelada, se promedian las difusividades térmicas del agua y del hielo. La transferencia de calor unidimensional para una placa finita con una condición de límite de aislamiento en la superficie superior de la película fina (aire) y una condición de límite de temperatura constante en la parte inferior se describe mediante la ecuación (2) (66):

en la que x es la distancia desde la parte superior de la gotícula propagada, T es la temperatura en la película, T^p es la temperatura de la placa en contacto con la superficie de la película fina inferior y L es el espesor de la película.

Los perfiles de temperatura calculados a partir de la ecuación (2) se muestran en la Fig. 7 y las velocidades de enfriamiento y los tiempos se muestran en la Tabla 4, en la que se enumeran las velocidades de enfriamiento, los tiempos de enfriamiento y el tiempo de exposición a la superficie de contacto de gas-líquido calculados para la SFD, SFL y TFF. Las dimensiones de la gotícula se dan en la Tabla 1.

Tabla 4

El tiempo de enfriamiento se definió como el tiempo para que la temperatura de la superficie superior de la película, T(0,t), disminuya desde la temperatura ambiente (25 °C) hasta un valor un 5 % superior al de la superficie metálica. La velocidad de enfriamiento (C/s [K/s]) se determinó dividiendo la diferencia de temperatura en la parte superior de la película entre el tiempo de enfriamiento. Como se muestra en la Fig. 7A y en la Tabla 4, el tiempo predicho para enfriar la superficie superior de la película fina de 220 jm de espesor sobre la superficie de -50,15 °C (223 K) es de 2,0 x 102 ms (velocidad de enfriamiento de 116,85 °C/s [3,9 x 102 K/s]). La velocidad de enfriamiento calculada es un orden de magnitud inferior que para SFL 6.926,85 °C/s [7,2 x 103 K/s]) y 4 órdenes de magnitud menores que para SFD (379.9726,85 °C/s [3,8 x 106 K/s)]). Las velocidades de enfriamiento mucho más bajas en la TFF en comparación con la SFD pueden explicarse por una proporción de área superficial/volumen 100 veces inferior y un espesor de la película del orden de 20-30 veces superior al radio de la gotícula en la SFD.

Las morfologías de las partículas que se muestran en la Fig. 5 y las SSA de las partículas de la Tabla 3 fueron similares para la congelación en las superficies de -50,15 °C (223 K) y de -140,15 °C (133 K), como consecuencia de la rápida refrigeración en cada caso.

Los tiempos de enfriamiento de ensayo para alcanzar el equilibrio térmico resultaron ser más largos, en el orden de 3­ 4 veces superiores, en comparación con los tiempos de enfriamiento modelizados que se muestran en la T abla 4. Esta diferencia es pequeña en comparación con la diferencia en órdenes de magnitud en proporción con otros procesos tales como la SFL y liofilización. La diferencia puede ser el resultado de la incertidumbre en la calibración de la medición de la temperatura, las diferencias en las definiciones de la temperatura final para el modelo y la cámara de IR, y la liberación del calor de fusión del agua que no se incluyó en el modelo. Para velocidades de enfriamiento del agua extremadamente rápidas, el agua puede formar un vidrio con cristalización limitada (67). Como lo muestran los datos y el cálculo, se necesita una velocidad de enfriamiento de 999.726,85 °C/s (106 K/s) para vitrificar el agua (67-70). La velocidad de enfriamiento de -173,15 °C/s (102 K/s) observada en la TFF indica que el calor latente de fusión puede haber sido significativo.

Mecanismos de nucleación y crecimiento frente a la velocidad de enfriamiento. Para colocar los resultados de la TFF en perspectiva, es instructivo considerar las condiciones límite de vitrificación/congelación extremadamente rápida de la SFD y la congelación lenta de la liofilización. Anteriormente, las morfologías de los polvos de lisozima preparados mediante SFL y SFD se mostraron similares a las soluciones de lisozima diluidas a 5 mg/ml. Las SSA fueron > 100 m2/g para partículas primarias esféricas de 50-100 nm, a pesar de una velocidad de enfriamiento de 726,85 °C/s (103 K/s) para la SFL frente a 999.726,85 °C/s (106 K/s) para la SFD, como se muestra en la Tabla 4 (36).

El mecanismo de congelación implica muchos cambios simultáneos en las propiedades de la solución no congelada. A medida que el agua se congela, cambia las concentraciones, el pH, la resistencia iónica, la viscosidad, los coeficientes de difusión, las colisiones entre las partículas nucleadas y el tamaño geométrico, y la forma de la solución no congelada. La velocidad de crecimiento de las partículas de proteína depende de todos estos factores, por lo que sería un desafío desarrollar un modelo para el tamaño de partícula final. Los canales líquidos finos entre los dominios de agua congelada reducen el número de colisiones entre las partículas de proteína (azúcar) y, por lo tanto, inhiben el crecimiento mediante coagulación, como se muestra en la Fig. 8. Además, la viscosidad de los canales finos aumenta rápidamente para detener el crecimiento de las partículas, y el canal se congela por completo. Además, el azúcar del agua aumenta la viscosidad frente a la del agua pura. Para el caso del enfriamiento lento en la liofilización, el grado muy bajo de sobreenfriamiento crea relativamente pocos dominios de hielo nucleado en comparación con los procesos de enfriamiento rápido, dejando canales gruesos de solución líquida entre estos dominios. Para una velocidad de enfriamiento de -272,15 °C/min (1 K/min), como en el caso de enfriar lentamente una solución de 5 mg/ml en un congelador a -20 °C, los tamaños de partículas liofilizadas fueron del orden de 30-100 pm. En estos canales gruesos, las partículas de proteína tienen suficiente tiempo para agregarse y crecer formando partículas grandes antes de que los canales se congelen por completo. Aunque teóricamente es posible mitigar este crecimiento de partículas parcialmente mediante la reducción de la concentración de la solución de proteína significativamente por debajo de 1 mg/ml, dichas bajas concentraciones de proteína pueden conducir a requisitos de liofilización excesivos (21).

En la SFD, los presentes inventores han encontrado que la exposición de la proteína a la superficie de contacto de gas-líquido tiene un efecto mayor en la estabilidad de proteínas que a la superficie de contacto de hielo-líquido o de agua cristalina-líquido (19, 31, 32). No está claro si la superficie de contacto de hielo-líquido frente a la de agua cristalina-líquido tienen diferentes efectos sobre las estabilidades de las proteínas (19, 20, 71). Como se describe en las referencias anteriores (68, 69), se necesitan velocidades de enfriamiento del orden de 999.726,85 °C/s (106 K/s) para vitrificar el agua, pero la velocidad de enfriamiento necesaria para la vitrificación se puede disminuir en presencia de azúcar en la solución (67, 70). Para las velocidades de enfriamiento más lentas observadas en la TFF (-173,15 °C/s [102 K/s]) en proporción con la SFD, es probable que se formen dominios de partículas de hielo en lugar de dominios de agua vitrificada. Las actividades de LDH fueron del orden del 100 % para la TFF. Por lo tanto, la presente invención no sugiere que la superficie de contacto de hielo-líquido tenga un efecto perjudicial sobre la estabilidad de la proteína.

Para la formulación de lisozima de 5 mg/ml a -50,15 °C (223 K), la SSA era bastante grande, aunque modestamente más pequeña que para la SFD, y los tamaños de partícula tras los ultrasonidos fueron similares a los de tanto la SFL como la SFD como se ve en la Tabla 3. La velocidad de enfriamiento más baja en la TFF (-173,15 °C/s [102 K/s]) en comparación con la SFD (999.726,85 °C/s [106 K/s]) y la SFL (726,85 °C/s [103 K/s]) fue todavía suficiente para producir una rápida nucleación y para evitar un crecimiento significativo de las partículas durante la congelación. Sin embargo, para la TFF, el tamaño de los canales no congelados era lo suficientemente fino y el aumento de la viscosidad de la solución no congelada lo suficientemente rápido para lograr tamaños de partículas y morfologías similares a los del proceso moderadamente más rápido, la SFL y el proceso mucho más rápido, la SFD. Por lo tanto, las velocidades de enfriamiento extremadamente rápidas en la SFD fueron mucho más rápidas de lo necesario para formar partículas de proteína submicrométricas. Se llegó a una conclusión similar en la comparación de la SFL y la SFD (32).

Para soluciones altamente concentradas a 50 mg/ml, la fracción de mayor volumen de dominios de soluto vitrificados de los canales de agua descongelada conducen a una mayor frecuencia de colisión y al aumento del crecimiento de las partículas (36). Como se ha observado anteriormente (36), la velocidad de enfriamiento más lenta en la SFL en comparación con la SFD conduce a un mayor crecimiento de partículas antes de que los grandes canales de líquido descongelado se vitrifiquen, lo que conduce a partículas de proteína más grandes y a SSA en polvo inferiores (36). Como se muestra en la Tabla 3, las SSA fueron similares para la TFF y la SFL. Para estas soluciones altamente concentradas, las partículas más grandes formadas en la TFF (y la SFL) frente a la SFD se deben a más tiempo para el crecimiento en los canales descongelados de mayor espesor. Esta limitación normalmente no se encuentra en los procesos de congelación rápida, ya que la mayoría de los estudios previos examinaron concentraciones mucho menores, del orden de 5 mg/ml.

Minimización de la superficie de contacto de gas-líquido en el proceso de TFF. Las estabilidades de LDH fueron esencialmente del 100 % tras la TFF, lo que indica que ninguna de las etapas, la caída de gotículas, la diseminación y la congelación y el secado causaron una pérdida mensurable en la actividad de la enzima. De los cálculos anteriores (32), se demostró que la exposición de las gotículas atomizadas a la superficie de contacto de gas-líquido fue un orden de magnitud inferior en el proceso de SFL (600 cm-1) en proporción con la SFD (6.000 cirr1) (19). Esta mayor exposición a la superficie de contacto de gas-líquido produjo actividades de LDH más bajas en la SFD (32). En la TFF, la proporción de área superficial/volumen de la superficie de contacto de gas-líquido de la TFF (46 cm'1) fue 2 órdenes de magnitud inferior que en la SFD, conduciendo a una adsorción y agregación de proteínas mucho menor. Como se muestra en la Fig. 9, las velocidades de enfriamiento intermedias en la TFF y SFL ofrecen un medio para producir partículas submicrométricas de gran área superficial en oposición con la liofilización, con cantidades más pequeñas de adsorción de proteínas en las superficies de contacto de gas-líquido en comparación con la SFD, que da lugar a una mayor estabilidad de las proteínas.

La minimización de la superficie de contacto de gas-líquido puede mejorar la estabilidad de la proteína al limitar la cantidad de proteína que puede adsorberse en la superficie de contacto. Para las proteínas radiomarcadas tensioactivas, el exceso de concentración en la superficie, r, (72, 73) a la saturación plena para la p-caseína, lisozima y BSA fueron de 2,6, 3,0 y 3,3 mg/m2, respectivamente (33, 72, 73). Para la LDH, se supone un valor similar de aproximadamente 3 mg/m2. Para la superficie superior de una película de 12 mm de diámetro, en la que el área superficial es de 1,13 x 10'4 m2, la proteína adsorbida total en equilibrio sería de 3,4 x 10'4 mg. Para una gotícula líquida de 3,6 mm de partida que contiene 0,25 mg/ml de LDH, la proteína total es de 6,2 x 10'3 mg. Por lo tanto, si toda la proteína alcanzara la superficie de contacto y se desnaturalizara, la disminución máxima en la actividad de la proteína sería del 5,5 %. La exposición de 1 s puede no conducir a una adsorción de equilibrio total. Además, el aumento de la viscosidad en función de la altura y el tiempo de congelación detendrá la difusión de proteínas a la superficie de contacto de aire-agua. Para gotículas de ~10 pm de diámetro en la SFD, se determinó que el 25-30 % de la LDH total en la gotícula se adsorbe a la superficie de contacto de gas-líquido en solo 0,4 ms (22). La desnaturalización de parte de la proteína adsorbida coincide con las importantes disminuciones en la actividad de la proteína observadas en el proceso de SFD en la Tabla 2.

Se utilizó el proceso de TFF para producir partículas de lisozima de 300 nm con áreas superficiales del orden de 31 a 73 m2/g y el 100 % actividades de LDH. A pesar de una velocidad de enfriamiento de —173,15 °C/s (~102 K/s) en la TFF, los tamaños de partícula y las áreas superficiales fueron similares a los observados en el proceso ampliamente informado, La SFD de criodesecación por pulverización, en la que las velocidades de enfriamiento alcanzan los 999.726,85 °C/s (106 K/s). En la TFF, los canales de líquido finos entre los dominios de hielo fueron suficientemente delgados y las velocidades de congelación de los canales finos fueron suficientemente rápidas para lograr morfologías de partículas similares. Por lo tanto, la velocidad de enfriamiento extremadamente rápida en el proceso de SFD no fue necesaria para formar las partículas de proteína submicrométricas deseadas. Aunque la LDH se expuso a la superficie de contacto de gas-líquido de la película fina durante un máximo de ~ 1 s en la TFF, la proporción de área superficial/volumen de 45 cirr1 fue lo suficientemente pequeña como para que la adsorción produjera una agregación y una desnaturalización insignificantes. Incluso si esta superficie de contacto de gas-líquido se saturara con proteína, seguida de una desnaturalización irreversible, la pérdida de actividad máxima para una formulación de LDH de 0,25 mg/ml sería del 5 %. Para la SFD con un tamaño de gotícula de 10 pm, la pérdida máxima podría alcanzar el 25 % en solo 0,4 ms desde la difusión a la superficie de contacto y la adsorción (22), en consonancia con la disminución significativa de la actividad enzimática (80 %). En la SFD, se han observado pérdidas en la estabilidad de la proteína en varios estudios previos (1, 11, 18, 19, 21). Aunque las estabilidades de LDH son altas en la liofilización convencional, las velocidades de enfriamiento son del orden de -272,15 °C/min (1 K/min), lo que produce partículas grandes de tamaño de 30 a 100 pm (21). Por lo tanto, la pauta de velocidad de enfriamiento intermedio para la TFF (y también para la SFL), en proporción con la SFD y la liofilización, ofrece una vía prometedora para formar las partículas de proteína submicrométricas estables de interés en aplicaciones de administración pulmonar y parenteral.

Ejemplo 1. Las soluciones congeladas usando el proceso de TFF tienen una concentración final de 5 mg de lisozima/ml de disolvente, en las que el disolvente era una mezcla de agua/etanol a una concentración diferente. La solución de alimentación se pasó luego a través de una aguja de calibre 17 a un caudal de 4 ml/min que caía desde una altura de 10 cm en un tambor de acero inoxidable giratorio mantenido a una temperatura de -50,15 °C (223 K), donde las gotículas se dejaron diseminar en discos y congelar. Los discos congelados se liofilizaron luego usando el procedimiento de liofilización convencional descrito anteriormente. Los tamaños de partículas resultantes (Fig. 11) se midieron usando el Mastersizer de Malvern como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 2: Se congelaron soluciones a diferentes concentraciones iniciales de lisozima en agua como se ha descrito anteriormente y después se liofilizaron para producir micropartículas. Las partículas congeladas se congelaron en el tambor giratorio y luego se desecharon en un pequeño vial para dosis individuales. Los tamaños de partícula producidos se midieron usando el Malvern Mastersizer como se ha descrito anteriormente (Fig. 12).

Las figuras 13A a 13D comparan las morfologías de lisozima de la TFF preparada en el vial de vidrio frente a la TFF en un tambor. En resumen, la congelación en película fina se realizó directamente en un vial que se enfrió sumergiéndolo parcialmente en un líquido criogénico líquido, o un líquido compuesto de hielo seco y disolvente. La alimentación fue lisozima a 5 mg/ml. A continuación, se extrajo el agua del material congelado mediante la liofilización del vial. El producto permaneció en el vial. Se extrajo una muestra del vial y se analizó mediante microscopía electrónica de barrido. La morfología fue similar a una muestra preparada directamente en un tambor de metal. La ventaja de esta técnica es que la TFF se puede realizar directamente en un vial de vidrio para fabricar partículas con características submicrométricas. La forma farmacéutica final se puede formular luego mediante la adición de excipientes a las partículas en el vial.

La TFF se realizó usando una alimentación de 150 mg/ml de lisozima en agua DI. Una vez que se liofilizaron estas muestras, se volvieron a dispersar en acetonitrilo para separar las partículas. El acetonitrilo se extrajo mediante TFF. Las partículas finales tras la liofilización se volvieron a dispersar en benzoato de bencilo para formar una suspensión estable (Figura 14).

La presente invención demuestra un proceso sencillo, eficaz y robusto para la congelación bien de pequeñas cantidades de una solución de proteína (<1 ml) o de cantidades comerciales, que pueda producir partículas submicrométricas de proteína estables.

El uso del término “un” o “una” cuando se usa en combinación con la expresión “que comprende” en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar “uno/a”, pero también coincide con el significado de “uno/a o más”, “al menos uno/a”, y “uno/a o más de uno/a”. El uso del término “o” en las reivindicaciones se usa con el significado de “y/o” a menos que se indique explícitamente que se refiere solo a alternativas o que las alternativas se excluyen entre sí, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere solo a alternativas y a “y/o”. A lo largo de la presente solicitud, el término “aproximadamente” se usa para indicar que un valor incluye la variación de error inherente para el dispositivo, el método que se está empleando para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos de estudio.

Como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, las expresiones “que comprende” (y cualquier forma de que comprende, tal como “comprenden” y “comprende”), “que tiene” (y cualquier forma de que tiene, tal como “tienen” y “tiene”), “que incluye” (y cualquier forma de que incluye, tal como “incluye” e “incluyen”) o “que contiene” (y cualquier forma de que contiene, tal como “contiene” y “contienen”) son inclusivas o abiertas, y no excluyen elementos o etapas de método no mencionados adicionales.

La expresión “o combinaciones de lo/as mismo/as” tal como se usa en el presente documento se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los elementos enumerados que preceden a la expresión. Por ejemplo, “A, B, C o combinaciones de lo/as mismo/as” pretende incluir al menos uno de: A, B, C, AB, Ac , BC o ABC, y si el orden es importante en un determinado contexto, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente las combinaciones que contienen repeticiones de uno o más elementos o términos, tales como BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, etc. El experto en la materia entenderá que, por lo general, no hay límite en el número de elementos o términos en cualquier combinación, a menos que el contexto lo demuestre lo contrario.

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Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un método de preparación de partículas de tamaño micrométrico o de tamaño submicrométrico, que, opcionalmente, comprende además al menos un excipiente, que comprende:

disolver un ingrediente eficaz hidrosoluble en uno o más disolventes;

pulverizar o aplicar por goteo gotículas de disolvente de manera que el ingrediente eficaz se exponga a una superficie de contacto de vapor-líquido inferior a 500 cm-1 de área/volumen; y

poner en contacto la gotícula con una superficie de congelación que tiene una diferencia de temperatura de al menos 30 °C, preferentemente, al menos 50 °C, entre la gotita y la superficie, en el que la superficie congela la gotícula en una película fina con un espesor inferior a 500 micrómetros y una proporción del área superficial con respecto al volumen de entre 25 y 500 cm-1, en el que el ingrediente eficaz es una proteína o un péptido.

2. El método de la reivindicación 1, en el que las gotículas se congelan al entrar en contacto con la superficie en aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 500, 1.000 y 2.000 milisegundos, preferentemente en 50, 150 o 500 milisegundos.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la gotícula tiene un diámetro de entre 0,1 y 5 mm a temperatura ambiente, preferentemente, entre 2 y 4 mm a temperatura ambiente, y/o en el que la gotícula forma una película fina sobre la superficie de entre 50 y 500 micrómetros de espesor, y/o las gotículas tienen una velocidad de enfriamiento de entre -223,15 y -23,15 °C/s (50-250 K/s).

4. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de extraer el disolvente del material congelado para formar partículas, preferentemente, en el que las partículas, tras la extracción del disolvente, tienen un área superficial de 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150 o 200 m2/g y/o la partícula tiene menos del 50 %, preferentemente, menos del 25, 15, 10 o 5 %, del péptido, o péptido o proteína en la superficie de la partícula, en particular, en el que las partículas tienen un diámetro submicrométrico, en especial, en el que las partículas contienen fibras de menos de un micrómetro de diámetro.

5. El método de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la superficie es enfriada por un sólido criogénico, un gas criogénico, un líquido criogénico, un fluido de congelación, un gas de congelación, un sólido de congelación, un intercambiador térmico o un fluido de transferencia de calor capaz de alcanzar temperaturas criogénicas o temperaturas por debajo del punto de congelación del disolvente.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el ingrediente eficaz comprende una enzima y la actividad enzimática de la enzima es superior al 90 %, y/o el ingrediente eficaz comprende un péptido o una proteína con una agregación de la proteína o del péptido inferior al 3 %.

7. Un método de preparación de partículas de disolvente de tamaño micrométrico o de tamaño submicrométrico que comprende:

pulverizar o hacer gotear gotículas de un péptido o de una proteína hidrosoluble en un disolvente, en el que la gotícula se expone a una superficie de contacto de vapor-líquido de área/volumen inferior a 250 cirr1; poner en contacto la gotícula con una superficie de congelación que tiene una diferencia de temperatura de al menos 30 °C, preferentemente, al menos 50 °C, entre la gotita y la superficie, en el que la gotícula se congela en una película fina con un espesor inferior a 500 micrómetros y una proporción del área superficial con respecto al volumen de entre 25 y 500 cm-1, que, opcionalmente, comprende además la etapa de extraer el disolvente del material congelado para formar partículas, preferentemente, en el que el disolvente comprende además al menos uno de entre azúcares, fosfolípidos, tensioactivos, tensioactivos poliméricos, vesículas, polímeros, incluyendo copolímeros, y homopolímeros y biopolímeros, adyuvantes de dispersión y albúmina sérica, en especial, en el que el péptido o la proteína comprende preferentemente una enzima, y la actividad enzimática de la enzima es superior al 90 %, y/o en el que la agregación de péptido o de proteína es inferior al 3%, en particular, en el que la partícula tiene menos del 50 %, preferentemente, menos del 25, 15, 10 o 5 %, del péptido o de la proteína en la superficie.

8. Un método de preparación de partículas de tamaño micrométrico o de tamaño submicrométrico que comprende:

la preparación de una emulsión que comprende un ingrediente eficaz hidrosoluble en solución;

la pulverización o el goteo de gotículas de la solución de manera que el ingrediente eficaz se exponga a una superficie de contacto de vapor-líquido de área/volumen inferior a 50 cm'1; y

la puesta en contacto de la gotícula con una superficie de congelación que tiene una diferencia de temperatura de al menos 30 °C entre la gotícula y la superficie, en el que la superficie congela la gotícula en una película fina con un espesor inferior a 500 micrómetros y una proporción del área superficial con respecto al volumen de entre 25 y 500 cm-1,

en el que dicho ingrediente eficaz hidrosoluble es una proteína o un péptido.

9. Un método de una sola etapa y en un solo vial de preparación de partículas de tamaño micrométrico o de tamaño submicrométrico que comprende:

reducir la temperatura de un vial en el que el vial tiene una diferencia de temperatura de al menos 30 °C entre el disolvente y el vial; y

pulverizar o hacer gotear gotículas de disolvente de un ingrediente eficaz hidrosoluble disuelto en uno o más disolventes directamente en el vial de manera que el ingrediente eficaz se exponga a una superficie de contacto de vapor-líquido de menos de 500 cm-1 de área/volumen, en el que la superficie congela la gotícula en una película fina con un espesor inferior a 500 micrómetros y una proporción del área superficial con respecto al volumen de entre 25 y 500 cm-1, preferentemente, en el que las gotículas se congelan al entrar en contacto con la superficie en aproximadamente 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 500, 1.000 y 2.000 milisegundos, preferentemente en aproximadamente de 50 a 500 milisegundos, en particular, preferentemente en de aproximadamente 50 a 150 milisegundos, y/o en el que preferentemente las gotículas tienen una velocidad de enfriamiento de entre -223,15 y -23,15 °C/s (50-250 K/s) y opcionalmente el vial, el ingrediente eficaz hidrosoluble y el uno o más disolventes se esterilizan previamente antes de la pulverización o el goteo, y opcionalmente que comprende además la etapa de volver a suspender la composición en un disolvente en un vial dosificado individualmente para crear una suspensión o solución para el suministro del ingrediente eficaz,

en el que dicho ingrediente eficaz hidrosoluble es una proteína o un péptido.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la gotícula tiene un diámetro de entre 0,1 y 5 mm, preferentemente de entre 2 y 4 mm, a temperatura ambiente.

11. El método de las reivindicaciones 9 o 10, en el que el vial es enfriado por un sólido criogénico, un gas criogénico, un líquido criogénico, un fluido de congelación, un gas de congelación, un sólido de congelación, un intercambiador térmico o un fluido de transferencia de calor capaz de alcanzar temperaturas criogénicas o temperaturas por debajo del punto de congelación del disolvente.

12. El método de las reivindicaciones 9 a 11, en el que se repite la etapa de pulverización o goteo para superponer una o más películas finas una encima de otra para llenar el vial hasta cualquier nivel deseado o incluso hasta llenarlo por completo.