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CN1370230A - Dna的同时分离和定量 - Google Patents

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CN1370230A
CN1370230A CN00811856.6A CN00811856A CN1370230A CN 1370230 A CN1370230 A CN 1370230A CN 00811856 A CN00811856 A CN 00811856A CN 1370230 A CN1370230 A CN 1370230A
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dna
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particle
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艾伦·M·特雷巴
雷克斯·M·比特纳
苏珊·C·科勒
克雷格·E·史密斯
丹尼尔·D·凯法特
史蒂文·J·埃肯贝里
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Promega Corp
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Abstract

本发明提供了从介质中的其它物质中分离确定量的DNA靶物质的方法。该方法可用已知量的含二氧化硅固体支持物如二氧化硅磁性颗粒进行,所述固体支持物能可逆结合确定量的DNA靶物质,DNA靶物质相对于该颗粒的结合量是过量的。本发明方法涉及在介质和颗粒的混合物中形成二氧化硅磁性颗粒与DNA靶物质的复合物,用外部磁力从混合物中分离该复合物,然后可从该复合物洗脱DNA靶物质。洗脱的DNA靶物质的量可基于校准模型确定。本发明方法使得分离在已知数量范围内的DNA靶物质。本发明方法消除了在进一步加工如扩增、短串联重复(STR)分析和DNA测序前定量所纯化的生物样品的步骤。DNA靶物质的样品可得自液体或固体介质,如液态血或纸。

Description

DNA的同时分离和定量
发明领域
本发明涉及从介质中的其它物质中分离确定量的DNA靶物质的方法，以产生适量分离的DNA靶物质以供进行进一步加工或分析。本发明尤其涉及用含有二氧化硅的固体支持物分离确定量的DNA靶物质的方法，所述固体支持物能可逆结合确定量的DNA靶物质，例如含有二氧化硅或二氧化硅衍生物的磁性反应颗粒。
发明背景
许多涉及测试特定介质中存在的DNA靶物质的分析方法，只有当DNA靶物质与介质中的其它物质分离且在分离后进行定量后，才能良好进行。从法医学样品(例如收集自犯罪现场的体液，收集自嫌疑人的血液或口腔细胞)的其它组分中分离DNA靶物质，对保证样品中存在的其它组分不干扰DNA靶物质的分析是关键的。不幸的是，法医学样品通常量少且会降解，从而对从其中分离的DNA靶物质的定量是费时而困难的。另外，个体之间给定体积的血液中白细胞数量的不同，进一步提高了分离的DNA数量的差异。
将DNA分型作为测试亲子关系和鉴别犯罪现场存在的生物样品的工具，需要研制分离和定量小量基因组DNA的可靠方法。在美国，开发这种系统的需要来自联邦调查局建立的得自人类基因组DNA的13个短串联重复(STR)基因座的分析结果的数据库。将这些结果加入称为组合DNA指数系统(CODIS)的集中数据库中。STR分析系统是基于使用扩增反应，其能使人们分析非常少量的DNA，甚至低于亚纳克的数量。然而，只有当待扩增的DNA数量在限定范围内，且其基本上与可抑制或干扰扩增反应的污染物分离时，扩增才可以良好进行。因此，在STR基因座可扩增和分析之前，靶DNA必须是纯化和定量的，以降低扩增假象的几率。在其它应用如DNA测序中，定量是重要的。
目前用于分离和定量基因组DNA以用于遗传相同性分型的方法，要消耗大量时间，且太杂乱不能自动操作。例如，以下方法典型用于分离和定量基因组DNA，以扩增和分析STR基因座，如CODIS基因座。首先，使用各种装置和体积从个体获得血液或口腔擦拭物。其次，将这些样品加工为各种纯度和完整性的分离DNA。第三，将DNA定量以用于下游方法，以便可使用适当数量以避免假象。第四，将DNA用包括特异于每个待分析的STR基因座的引物的反应扩增。最后，将扩增产物在凝胶或毛细电泳系统上分析，以鉴别基因型。一种设计用于共扩增和分析所有13个CODIS基因座的商购系统，见GenePrintPowerPlexTM 1.1和GenePrintPowerPlexTM 2.1系统(Promega公司，Madison，Wisconsin)
血液中白细胞是DNA的主要来源。由于个体差别或基于取样品时个体健康情况所致的取自给定个体的样品差别，血液中白细胞含量有显著差异。由于所用擦拭物类型和样品加工前的贮存条件不同，口腔擦拭物样品中也存在相似差异。
通过聚合酶链反应(PCR)扩增基因组DNA以进行如上述DNA分型分析，太少的模板产生低条带密度或不发生条带扩增。过量的DNA模板随之产生过扩增。过扩增可通过过量假象峰和打滑条带(直在主要等位基因峰之下的次要峰)加以识别。还可能有高发的背景活性和“pull-up”，这是指在多重反应中不能分离不同颜色的条带。如果存在过量的假象，需要再扩增较少量的DNA。当存在过量DNA并用毛细电泳分离PCR扩增产物时，打滑带是特别明显的。同样，在测序时，当存在太多的DNA模板时，全长扩增产物的产生受抑制。换而言之，在PCR扩增中，过量的DNA模板可导致存在部分纯化的片段和低量的完整扩增产物。
更特别的，当使用PCR或其它扩增方法扩增DNA时，当在一个反应中扩增太多的DNA时，则该样品过扩增，预期带的信号强度趋于落在检测仪器期望范围之外。传统的，这些困难可通过在纯化DNA后对其进行定量而最小化，这需要另外的步骤，时间和金钱。在遗传相同性测试中，在推荐使用的分析系统中存在过量DNA常常导致无法解释的结果；这可浪费非常有限的样品，尤其在法医学分析的情况下。
另一种需要精确定量核酸的DNA应用是测序。DNA测序是在这样的靶DNA的样品上最佳进行的，该靶DNA已经从介质中可干扰测序反应的其它物质中分离。还必需在测序反应开始之前，对靶DNA样品进行定量。例如，在DNA测序方面，测序反应中DNA模板的数量必须在相当狭窄范围内。例如，当使用质粒DNA时，当用BigDyeChemistry(Perkin Elmer Biosystems)时，推荐使用150-300ng的DNA。当使用相同测序系统用PCR产物作测序模板时，推荐使用40-80ng DNA。太多的模板可产生短序列阅读长度，较低的分辨力或较高的误差率。太少的模板，信号强度太弱而不能进行最佳序列阅读。
质粒DNA是测序反应的DNA的典型来源。由于每个细胞的质粒拷贝数的差异，所用生长培养基的不同，和细胞量的浓度的差异等因素，细菌培养物群体中质粒DNA的含量也相当不同。
有许多方法通用于定量样品中DNA靶物质。一种这样的方法是分光光度确定。在此方法中，未知浓度样品的吸光度，在相当于DNA靶物质的最大吸光度的波长读取。例如，在260nm的吸光度(A260)用于确定溶液中DNA的浓度，在280nm的吸光度(A280)用于确定溶液中蛋白质的浓度。在260nm读取的1个吸光度相当于大约50μg/ml双链DNA，40μg/ml的单链DNA和RNA，和大约20μg/ml单链寡核苷酸。260nm和280nm读数之间的比率(A260/A280)可用于评估给定的靶核酸与在280nm吸收的蛋白质和任何其它物质的分离的程度。纯化的核酸制品的A260/A280至少为大约1.8。分光光度分析法的限制是没有足够的灵敏度用于检测和定量少量的核酸。如果样品中核酸浓度少于大约500ng/ml，或如果样品被吸收或猝灭紫外线辐射的其它物质污染，则得到不准确的结果。
在DNA分离后对其进行定量的另一种方法，是使用嵌入染料如溴化乙锭，SyberGreen(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)，或PicoGreen(Molecular Probes，Eugene，OR)。当没有足够的DNA准确进行分光光度法测定时，通常使用染料。当用紫外线(UV)光源观测时，溴化乙锭的荧光数量与DNA总量成比例。因此，已知量的DNA的标准曲线和已知数量但未知浓度的样品可于琼脂糖凝胶中电泳，然后将此凝胶用溴化乙锭染色，并用UV观测。这种类型凝胶称为生产凝胶。样品中DNA数量可通过将样品的荧光与标准荧光对比而确定。相似的，此方法可在溶液中用DNA嵌入染料进行。DNA水平低于大约25pg/ml可用PicoGreen检测。生产凝胶方法或使用染料确定溶液中DNA数量的限制是需要将产量的目测、分光光度或荧光近似值与另一DNA样品对比。用这种方法所得结果的可变性较高，且其还由于DNA样品中存在污染成分而导致误差。
至少有两个商购试剂盒适于在分离后确定少量的人体基因组DNA。这些是ACESTM 2.0人DNA定量探针Plus系统，由LifeTechnologies公司生产(Gaithersburg，MD)，和Quantiblot人DNA定量试剂盒，由PE应用生物系统生产(Foster City，CA)。这些试剂盒典型用于实验室中用人DNA进行遗传相同性试验。Quantiblot系统是基于灵长类动物特异性生物素酰化的寡核苷酸探针与分离的DNA样品的杂交。可通过比色或化学发光检测；两种检测法能定量0.15-10ng的人DNA。然而，试验需要2小时。另外，化学发光法需要X光胶片和处理能力，且只可用于灵长类DNA。ACESTM系统是一种类似的系统，其需要DNA样品与膜结合，并与人特异性DNA探针杂交，通过发光进行观测。此系统能定量0.04-40ng的人DNA。这两种系统均具有与嵌入染料相同的限制；即它们要求通过与另一种DNA样品相比估测产量。
本领域需要一种能从含有过量DNA靶物质的样品中取出确定量的DNA靶物质的方法。这些确定量的DNA然后可用于其中存在过量的DNA对获得有效结果不利的方法。这种方法包括但非限于PCR扩增，STR分析，DNA测序和遗传相同性测试。
另外，现有的定量系统不易于自动操作，并对DNA制品中残余的污染物敏感。由于要分析和数据库化大量的样品，需要结合常规STR基础的步骤的高通量方法，而不损失低通量的需要。用于从样品中分离DNA并在纯化过程中定量DNA的系统将不需要加工步骤，并将对本领域是显著的贡献。对假象比常规定量方法更不敏感的方法也是需要的。
发明概述
本发明使得可以在限定条件下将介质中DNA靶物质吸附于固体支持物，并将确定量的生物物质移至第二种溶液中。根据本方法移至第二种溶液中的靶DNA可用作测序模板，或扩增反应的模板，而无需单独的定量步骤。因为此方法不需单独对分离的靶物质在下游的加工或分析之前定量，所以此方法节省时间并易于自动操作。
本系统包括用基于磁性颗粒的分离方法从细胞样品的其它物质中分离DNA靶物质。此方法操作灵活，因为磁性分离可采用低通量手工形式或高通量自动形式。
简而言之，本发明一方面包括一种从介质中的其它物质中分离确定量DNA靶物质的方法，其通过(a)提供一种包括DNA靶物质的介质；(b)提供能可逆结合可限定量DNA靶物质的个别量(discrete quantity)二氧化硅磁性颗粒；(c)通过组合二氧化硅磁性颗粒和介质形成二氧化硅颗粒和DNA靶物质的复合物；(d)通过应用外部磁场从介质中除去含有DNA靶物质的复合物；及(任选地)(e)通过洗脱DNA靶物质从复合物中分离DNA靶物质，从而获得确定量的DNA靶物质。优选的，(a)步中提供的DNA靶物质的数量相对于颗粒可逆结合量是过量的。根据随后的应用和所提供的二氧化硅磁性颗粒的量，洗脱步骤可以是非必需的。
除了二氧化硅磁性颗粒之外，以上方法还可用含有二氧化硅的固体支持物进行。当使用其它含有二氧化硅的固体支持物时，含有DNA靶物质的复合物可从介质中通过各种方法除去，如离心或过滤。
本发明方法的一优选实践包括以下步骤：将含有DNA靶物质的某一类型介质样品与磁性颗粒在存在离液盐的情况下混合，其中磁性颗粒具有已知或可确定的吸附介质中DNA靶物质的能力。当样品是细胞时，细胞裂解释放DNA靶物质至溶液中，从而与颗粒形成复合物。在洗掉其它细胞成分后，可将DNA靶物质以个别体积洗脱，产生具有确定的DNA靶物质浓度的溶液。此方法适用于从众多不同类型样品中分离DNA靶物质，样品类型包括但非限于全血，血白细胞，精细胞，口腔细胞或细菌细胞。在一优选的实施方案中，样品中DNA数量相对于颗粒结合量是过量的。这种样品可以任何众多不同形式之一存在，包括但非限于液体形式，冻干形式，干燥于在犯罪现场发现的材料上，或位于固体支持物上(例如在棉签上的颊细胞或滤纸上的血细胞)。如果需要可应用附加的步骤以从固体支持物除去细胞。纯化的DNA靶物质可贮存于洗脱缓冲液中，或附着于磁性颗粒。因此，可获得DNA靶物质的多个样品，并在需要时使用。
本发明另一方面涉及一种从介质中的其它物质中分离确定量的DNA靶物质的方法，使用一种优选形式的二氧化硅磁性颗粒，即硅质氧化物(siliceous oxide)包被的磁性颗粒，其中该优选的颗粒每ml能可逆结合可限定量的DNA靶物质。本发明的此方面包括以下步骤：形成一种包含包括DNA靶物质的介质，硅质氧化物包被的磁性颗粒和离液盐的混合物。盐浓度是足以使DNA靶物质吸附于颗粒。将此混合物温育，或以混合物形式保持，直至DNA吸附于混合物中硅质氧化物包被的磁性颗粒。然后将硅质氧化物包被的磁性颗粒用磁力从混合物中除去。通过将颗粒与洗脱缓冲液接触，将确定量的DNA靶物质从硅质氧化物包被的磁性颗粒中洗脱。
本发明另一方面涉及一种试剂盒，以从含有DNA靶物质的介质中分离确定量DNA靶物质。此试剂盒包括悬浮于第一种容器水溶液中的硅质氧化物包被的个别量的磁性颗粒，其中此颗粒具有可逆结合特异类型样品介质中可限定量的DNA靶物质的能力。任选的，此试剂盒可包括根据本发明的方法从含有DNA靶物质的介质中分离确定量DNA靶物质所需的其它成分。例如，此试剂盒还可包含在第二种容器中的离液盐和在第三种容器中的清洗缓冲液，和说明书。
本发明的另一方面涉及一种确定校准模型以定量相应类型样品中DNA靶物质的方法。此方法包括：(a)提供第一种介质，其包括个别量的相应类型样品；(b)提供第二种介质，其包括不同的个别量的相应样品；(c)将第一种个别量的二氧化硅磁性颗粒与第一种介质混合，其中二氧化硅磁性颗粒能可逆结合介质中确定量的DNA靶物质；(d)将第二种确定量的二氧化硅磁性颗粒与第二种介质混合，其中二氧化硅颗粒能可逆结合确定量的DNA靶物质，从而形成二氧化硅磁性颗粒与第二种介质中DNA靶物质的第二种复合物；(e)应用外部磁场，从第一种介质中除去第一种复合物，从第二种介质中除去第二种复合物；(f)从第一种复合物和第二种复合物中分别洗脱DNA靶物质，从第一种复合物中产生分离的DNA靶物质的第一种洗脱液，从第二种复合物中产生分离的DNA靶物质的第二种洗脱液；(g)确定第一种和第二种洗脱液中DNA靶物质的量。优选的，(c)步中提供的颗粒的第一种个别量与(d)步中提供的第二种颗粒个别量相同。
如实施例3例证的一种校准方法，包括确定从最小规格样品中(可得DNA的最小量)纯化靶DNA所必需的颗粒数量，以便DNA靶物质过量存在，且所得纯化的靶DNA也在所需的靶范围内。在确定最小规格样品所需的颗粒数量后，重要的是保证从较大规格样品中的纯化也产生在所需浓度或产量范围的纯化的靶DNA。此方法通常确定易于得自所需规格范围样品的最大量的DNA，其中得自每个样品的靶DNA数量在靶DNA的所需靶范围内。
如实施例8所例证，另一种校准方法是依赖于使用已知含有大量过量DNA靶物质的样品，以便用于纯化的颗粒范围已知是限制所得DNA靶物质的数量的因素。使用这种方法，使为应用提供所需实用性(在实施例8中，此应用是DNA测序)的最高和最低量靶DNA与使靶DNA数量的纯化在该应用所需的范围内的用于纯化的粒子量相关。当靶物质是DNA时，在每种产生的用于如上所述构建校准模型的洗脱液中的靶物质的数量优选通过DNAQuant或PicoGreen分析确定。
有许多可利用本发明的应用。其中两种应用包括DNA测序，尤其自动DNA测序，和遗传分析包括核酸扩增反应，如聚合酶链反应(PCR)。在每种应用中，DNA靶物质的数量必须保持在熟知的范围内。遗传分析可包括例如用于法医学或亲子鉴定中的遗传鉴别，和用于临床实验室中的遗传分析。在这种情况中，其有助于在每个扩增反应中具有几乎相同数量DNA靶物质。一致的数量在凝胶分析中产生一致的条带密度和有限的假象。本发明还用于与其它扩增系统联合，如转录介导的扩增。
优选的，此方法易于自动操作，从多个样品中同时分离和定量DNA靶物质。例如，此方法可易于从取自人群中多个个体的血液或其它组织样品中，分离确定量的靶基因组DNA。分离及定量的基因组DNA的相应基因座，如STR基因座，然后可用任一种已知的遗传分析方法扩增和分析。见例如Promega公司的GenePrintSTR分析系统。当将其用于如上述在多个反应中分离，定量和共扩增多个STR基因座，如CODIS基因座时(如使用Promega公司的GenePrintPowerPlex系统)，这种DNA分型结果数据库中信息量可迅速提高。在这种数据库中存在更多的数据，就有更多有效的数据用于鉴别个体，尤其在法医学应用中。
用本发明的方法分离的DNA靶物质完全没有污染物，可用标准分子生物学技术另外加工或分析。从各种不同的介质中分离和定量各种不同的DNA靶物质的此方法的具体应用，通过以下详细阐述将显而易见。
通过以下详细阐述和权利要求书，本领域技术人员将清楚本发明的其它特点，优点和应用。
附图说明
图1示出通过凝胶电泳和用溴化乙锭染色后，分级分离的基因组DNA样品的照片，其中基因组DNA样品使用无孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒如实施例3所述分离自不同的个别量的人全血。
图2是如实施例7所述，在存在不同量MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒的情况下扩增STR基因座后，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分级分离后，通过荧光检测扩增的人基因组DNA的和分离自K562组织培养细胞的DNA的STR基因座产生的激光打印图，。
图3示出通过凝胶电泳和用溴化乙锭染色后，分级分离的基因组DNA样品的照片，其中基因组DNA样品如实施例10所述使用多孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒分离自人全血。
发明详述
本发明部分参考以下术语加以阐述：
本文中术语“确定量(defined quantity)”是指相对狭窄范围内的量。如果此范围未知，则可如以下所述确定适用于特异样品类型和颗粒类型的范围(即可限定量)。此范围的差异部分由于所用构建校准模型的定量方法所限。
“样品类型”是指含有DNA靶物质的样品的形式和来源。各种样品类型包括但非限于液态血液，在固体支持物如纸或棉签上的干燥血液，或口腔细胞，唾液等。
“DNA靶物质”是指包括但非限于质粒DNA，基因组DNA，染色体DNA，经限制酶消化产生的DNA片段，通过扩增反应如聚合酶链反应(PCR)产生的扩增的DNA，和单链DNA。
“校准模型”是指特异于特定反应条件，样品类型和颗粒类型的一系列数据，其将颗粒和样品数量与得自纯化过程的DNA靶物质的确定量相关。
“含有二氧化硅的固体支持物”是指一种包含二氧化硅或二氧化硅衍生物的固体支持物(如二氧化硅纸或二氧化硅膜)，其能可逆结合确定量的DNA靶物质。二氧化硅可包被于固体支持物上或掺入其中。二氧化硅磁性颗粒是特别优选的含有二氧化硅的固体支持物。尽管详细说明中涉及了使用特别优选的二氧化硅磁性颗粒，本发明还包括应用其它含有二氧化硅的固体支持物的方法。
“分离”和“分离自”是指将一些污染物从靶物质中除去。
“磁性颗粒”是指没有磁场但暴露于磁场时形成磁偶极子的物质，即在有磁场的情况下可被磁化，但不在这种磁场中自身无磁性的物质。“磁性”包括顺磁性或超顺磁性物质。“磁性”也包括暂时磁性材料，如具有低居里温度的铁磁性或亚铁磁性材料，条件是在根据本发明的方法使用含有这种物质的二氧化硅磁性颗粒分离生物物质时，这种暂时磁性材料是顺磁性的。
使用磁性颗粒分离和纯化多肽分子如蛋白质或抗体已有多年。近年来，研制了分离核酸物质的磁性颗粒和使用磁性颗粒的方法。文献中阐述了一些不同类型的用于核酸分离的磁性颗粒，这些类型的颗粒有许多可商购。一个这种颗粒类型是磁性反应玻珠，优选是可控孔规格的。见例如CPG公司的磁性多孔玻璃(MPG)颗粒(LincolnPark，美国新泽西)；或如美国专利No.4395271；4233169；或4297337所述的多孔磁性玻璃颗粒，在此并入参考。核酸物质趋于紧密结合玻璃，然而一旦结合则难以将其除去。因此，从磁性玻璃颗粒中的洗脱效率与从含有更少量核酸结合物质如二氧化硅的颗粒中的洗脱效率相比较低。另一种设计用于直接结合和分离核酸的磁性反应颗粒，是由包埋有较小铁磁性颗粒并用玻璃包被的琼脂糖颗粒。见例如美国专利5395498。
“二氧化硅磁性颗粒(silica magnetic particle)”是指由硅胶，硅质氧化物，固体二氧化硅如玻璃或硅藻土形式的二氧化硅组成的或上述两或多种形式的混合物组成的磁性颗粒。“硅胶”是指层析级硅胶，一种可从许多不同来源商购的物质。最通常的是通过将含有硅酸盐如硅酸钠的溶液酸化为pH小于10或11，然后使酸化的溶液胶凝而制备的硅胶。见例如Kirk-Othmer Encyclopedia of ChemicalTechnology，第6卷，第4版，Mary Howe-Grant编辑，John Wiley&Sons出版，1993，pp773-775。“二氧化硅磁性颗粒”优选是指具有上述特性的每mg二氧化硅磁性颗粒结合可限定量DNA靶物质能力的颗粒。本发明使用的二氧化硅磁性颗粒优选还包含掺入硅胶基质中的铁磁性物质。
本发明分离和定量DNA靶物质的方法，可使用任何二氧化硅包被的固体支持物进行，该支持物能可逆结合确定量的DNA靶物质。然而，本发明的方法优选用硅质氧化物包被的二氧化硅磁性颗粒(SOCM颗粒)进行，SOCM颗粒是PCT出版物WO98/31840揭示的，在此并入参考。本发明优选用具有以下物理特性的二氧化硅磁性颗粒进行。
本发明方法中使用的二氧化硅磁性颗粒可以是任一种不同规格的。所用颗粒类型将被校准以确定其对一种样品类型的DNA的结合量。较小的二氧化硅颗粒提供更多的吸附表面积(每重量单位基础为1)，但较小的颗粒与较大的颗粒相比，在向其中掺入磁性材料的量方面受限。本发明所用的多孔二氧化硅磁性颗粒大小的中间值为大约1-25微米，优选大约3-15微米。颗粒大小分布也可以变化。然而，优选相对狭窄的颗粒大小分布。优选颗粒大小分布是这样的，大约80％重的颗粒在中间值的约10微米范围内，更优选在8微米范围，最优选在6微米范围内。
本发明的磁性颗粒可以是多孔或无孔的。当磁性颗粒是多孔的时，此孔优选是在可控范围内足够大的，以使靶核酸物质进入固相颗粒内部，并结合在孔内表面上的功能基团或二氧化硅上。当磁性颗粒是多孔二氧化硅磁性颗粒时，每个二氧化硅磁性颗粒的总孔体积，通过氮BET方法测定，优选为至少大约0.2ml/g颗粒质量。特别优选用作pH依赖型离子交换层析基质组分的多孔二氧化硅磁性颗粒的总孔体积，通过氮BET方法测定，优选为至少大约50％的孔体积包含于直径为600或更大的孔中。高度优选的多孔二氧化硅磁性颗粒具有以下特性：平均颗粒直径为大约5.0-8.5微米，BET表面积为大约18-55微米/gm，及酸浸提抗性小于大约7ppm Fe2O3。这种颗粒可以是得自Promega公司的多孔MagneSilTM颗粒。
术语“无孔“是指本发明所用的二氧化硅磁性颗粒，如果它们确实有孔，则其具有比上述多孔二氧化硅磁性颗粒更小的孔。特别地，“无孔”磁性颗粒的孔太小以至于不能通过DNA靶物质。与相同直径的多孔颗粒相比，无孔颗粒还具有更小的表面积和更小的吸附任何给定的DNA靶物质的能力。这一差异的结果是，当使用相同克重量的颗粒从相同介质中分离DNA靶物质时，多孔颗粒比无孔颗粒具有较大的结合和释放更大量DNA靶物质的能力。然而，用无孔颗粒分离的DNA靶物质趋于含有较少的污染物。优选的无孔二氧化硅磁性颗粒具有以下特性：平均颗粒直径为大约14.5微米，BET表面积为大约3微米/gm，酸浸提抗性小于大约2ppm Fe2O3。这种颗粒可以是得自Promega公司的无孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒。
至少有两种商购二氧化硅磁性颗粒特别优选用于本发明中，得自PerSeptive生物系统的BioMag磁性颗粒，和得自Promega公司的多孔和无孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒。
“复合物”是指有DNA靶物质吸附于其的二氧化硅磁性颗粒或其它含有二氧化硅的固体支持物。DNA靶物质的至少一部分能在适当条件下，从二氧化硅磁性颗粒中释放(即可逆结合)。释放的DNA靶物质的精确百分率不重要，只要其与给定的反应条件相对一致。
“离液盐”是指特定离子的盐，当其在水溶液中以足够高的浓度存在时，使其中的蛋白质不折叠及核酸丧失二级结构。离液离子具有这些作用据认为是因为它们破坏存在于液态水中的氢键网，从而使变性的蛋白质和核酸比其正确折叠或构成的相应物在热力学方面更稳定。离液离子包括胍盐，碘化物，高氯酸盐，和三氯乙酸盐离子。离液盐包括盐酸胍，硫氰酸胍(其有时是指异硫氰酸胍)，碘化钠，高氯酸钠，和三氯乙酸钠。
同时分离和定量DNA靶物质的方法可如下进行：第一步是构建校准模型，用于确定使用个别量的颗粒期望从特定样品类型中获得的DNA靶物质的数量。任何给定的具有一般物理特征的磁性颗粒，在相同条件下每mg颗粒具有确定的吸附DNA靶物质的能力。特别地，就给定的反应条件而言(包括二氧化硅磁性颗粒的数量)，当DNA超过所用颗粒的结合量时，从特异样品类型中获得相同数量的DNA靶物质。因此，对给定的反应条件，样品类型和颗粒类型而言，构建校准模型的步骤只需进行一次。
在构建校准模型后，在相同溶液条件下使用获得校准模型所使用的颗粒类型，将DNA靶物质从相同类型介质中分离。
当待分离的DNA类型存在于细胞中时，细胞优选在裂解缓冲液中破坏，其将DNA靶物质释放至裂解缓冲液中。当DNA靶物质存在于细胞包含的核酸靶物质中时，细胞优选在将溶液中的蛋白质和其它物质与核酸分离的裂解缓冲液中裂解，尽管当组合时促进核酸与二氧化硅磁性颗粒的吸附。具有靶物质附着于其的颗粒可用磁场从其它细胞物质中分离，并可洗掉颗粒。然后可将核酸靶物质在个别体积的水或其它洗脱液中洗脱，产生确定量的DNA靶物质。
为获得代表性的校准模型，应在相同反应条件下进行实际样品分析，用于产生校准模型。这些条件包括如下：样品类型，颗粒类型，与磁性颗粒组合的溶液条件，清洗方法包括任何清溶液的组分，任何洗脱溶液的组分，和进行各种方法步骤的温度。反应条件可通过实验而最佳化。然而，对本发明方法而言，反应条件的一致性比最佳化更重要。
校准模型可如下获得：将裂解缓冲液加入裂解样品细胞中，并释放DNA靶物质，以便其不与二氧化硅磁性颗粒复合。向待分析的各种已知或测定量的样品类型中加入个别量(已知及优选常量)的二氧化硅磁性颗粒。将裂解缓冲液在将磁性颗粒加入样品之前，期间或之后加入。对全血而言，裂解缓冲液在加入二氧化硅包被的磁性颗粒之前或与其一起加入样品中。优选地，将裂解缓冲液与二氧化硅包被的磁性颗粒一起加入样品中。将二氧化硅磁性颗粒与裂解的细胞在颗粒与DNA靶物质形成复合物的条件下组合。
将DNA靶物质和二氧化硅磁性颗粒的复合物，在存在磁场的情况下从裂解液中分离，除去并弃掉裂解液。将剩余的复合物优选清洗至少一次以除去另外的污染物。如果包括清洗步骤，在最后的清洗步骤后，通过向复合物中加入已知体积的洗脱溶液，将DNA靶物质从复合物中洗脱，并在磁场下从洗脱溶液中分离颗粒。洗脱溶液优选是水。然后将含有洗脱的DNA靶物质的已知体积的溶液进一步分析，例如扩增，在凝胶上电泳或通过已知方法定量。基于定量结果，可确定在洗脱液中分离的DNA靶物质的总量。此数据提供了关于特定样品类型的各种量的样品的可逆结合于颗粒的DNA靶物质的数量信息。
将额外量的任何给定介质样品加入个别量的颗粒中，自其中分离的DNA靶物质的数量将提高直至颗粒达到饱和点。基于饱和点，再提供另外的样品，所得的DNA靶物质的数量不再明显提高。当DNA靶物质超过颗粒的结合量时，过量的样品和过量的DNA靶物质可完全洗掉。优选地，存在的DNA靶物质超过颗粒的结合量。因此，在相同条件下，及提供的DNA超过颗粒的结合量，不管样品的规格，从样品中相同数量的颗粒将分离和释放几乎相同数量的DNA。
在低样品浓度，可加入非常少的可控制数量的颗粒，由此DNA浓度略超过结合量。不同颗粒的结合量不同，但对特定颗粒类型，样品类型和反应条件只需确定一次(例如通过如实施例7所述的试验)。因为对分离自特定样品的DNA数量加以控制，可避免过扩增信号。
实施例1阐述了一种确定校准模型的方法。实施例1示出无孔二氧化硅磁性颗粒可逆结合来自人液体全血的DNA的饱和点或容量(500μg或700μg)。实施例1示出血液增加4倍导致分离的DNA的增加大大少于4倍。如实施例1类似，实施例3示出怎样用较大的样品规格(200μl-1ml全血)获得校准模型。在实施例3中，DNA明显超过颗粒的可逆结合量。因此，饱和点已达到，当所用体积超过饱和点时，不同样品体积的产量相对一致。将这些DNA样品浓缩以足以通过分光光度法定量。A260/A280数据示出使用本发明方法样品纯度高。如实施例1和实施例3的校准模型示出通过将处理条件保持恒定，并可控改变样品和颗粒的量，可从给定的样品类型中分离和定量相对狭窄范围的DNA靶物质。
为进行基因组分型分析如STR，分离的DNA靶物质的精确量不重要，只要该量在可用于分析范围内。此范围依赖于所用系统。例如，用Promega的GenePrintPowerPlexTM1.1系统扩增，每次分析应用大约0.5-5ng的DNA(优选大约1ng DNA)以避免过扩增并获得易于基因分型的样品。因此，通过对比校准模型和所用系统的可用范围，可确定分离可用量的DNA靶物质所需的样品和颗粒的量，之后从相应的样品中分离DNA靶物质。
基于要将样品置于其中进行分析的系统生产者的指导和方案，可确定所需样品范围。因此，为获得所需量DNA靶物质，可将校准模型用于确定适当参数如颗粒量，样品量，和总分离的DNA靶物质的适当体积或组分。
用本发明方法分离和定量的DNA靶物质，可得自培养的真核或原核细胞，或得自取自或得自组织，多细胞生物体包括动物和植物的细胞；体液如血液，淋巴，尿液，大便，或精液；胚胎或胎儿；食品；化妆品；或任何其它来源的细胞。一些DNA是根据本发明的方法从感染细胞的细胞器，病毒，噬菌体，质粒，类病毒等中分离的。将细胞裂解及将裂解物通常以本领域已知的各种方式加工，以获得DNA的水溶液，对其应用本发明的分离方法。发现在这种溶液中的DNA典型具有其它成分如蛋白质，RNAs或其它类型成分。
DNA靶物质可来自固体支持物如滤纸上的样品。可通过将固体支持物上的至少一部分样品置于含有离液盐的溶液中，除去DNA靶物质(见实施例4-5)。为促进从固体支持物上除去DNA靶物质，溶液温度优选在60-100℃，更优选在90-100℃范围内。优选地，离液盐溶液还包括一种pH缓冲液。
不管这种物质的来源的性质如何，在本发明方法中分离的DNA靶物质是在包含DNA靶物质和其它物质的介质中提供的。DNA靶物质必须存在于介质中，以可吸附于二氧化硅磁性颗粒的形式存在。当DNA靶物质包含于细胞内时，细胞壁或细胞膜可产生不适于吸附于颗粒的物质。甚至将这种细胞裂解或充分破坏，以使包含于其中的DNA靶物质释放于周围溶液中，溶液中的细胞碎片仍可干扰靶物质吸附于二氧化硅磁性颗粒。因此，在用本发明的方法分离的靶物质包含于细胞内的情况下，优选首先通过将细胞裂解或破坏产生裂解物，及更优选另外清除细胞碎片裂解物(例如离心或真空抽滤)，这些细胞碎片裂解物存在于介质中时，可干扰靶物质吸附于二氧化硅磁性颗粒。
许多不同的已知裂解或破坏细胞以释放含于其中的DNA物质的任一种方法，均适用于从细胞产生介质以用于本发明。选择从细胞中释放DNA物质的方法依赖于含有此物质的细胞的性质。例如，为使具有相对硬的细胞壁的细胞如真菌细胞或植物细胞释放包含于其中的核酸物质，可能需要使用剧烈处理，如用有效的蛋白酶处理，及用匀浆器剪切或用超声器经声波破坏。相反，只通过将细胞悬浮于水溶液中，并加入去污剂，DNA物质就可易于从具有脂双层膜的细胞如大肠杆菌细胞或动物血细胞中释放。
一旦如上述DNA物质从裂解或破坏的细胞中释放，可用许多不同的方法或组合这些方法除去干扰DNA物质吸附二氧化硅磁性颗粒的细胞碎片。优选将裂解或破坏的细胞的溶液离心以除去微粒细胞碎片。任选的，然后在上清中加入另一种溶液，该溶液使另外的其它物质形成沉淀，然后通过离心从所得溶液中除去沉淀，由此对上清进一步加工。
当相应的DNA物质是初始包含于大肠杆菌细胞中的质粒DNA时，优选通过加入碱性溶液，如氢氧化钠溶液，形成裂解物，从细菌细胞中释放DNA物质。优选在所得上清中加入一种中和溶液，如酸性缓冲液，使另外潜在的干扰物质形成沉淀。由此形成的沉淀优选通过离心或过滤除去。澄清的裂解物中剩余的上清是含有相应DNA的介质。
本发明方法的第一步提供的介质不需含有直接从细胞释放的核酸物质。核酸物质可以是扩增反应的产物，如使用聚合酶链反应(PCR)产生的扩增的DNA。核酸物质也可以是用限制酶消化DNA产生的DNA片段形式。介质也可以是熔解的或酶促消化的电泳凝胶和核酸物质的混合物形式。在使生物学靶与周围细胞成分中脱离后，DNA物质不与二氧化硅磁性颗粒吸附。
二氧化硅磁性颗粒和DNA靶物质的复合物是在促进复合物形成的条件下通过将颗粒暴露于含有DNA靶物质的介质而形成的。该复合物优选是二氧化硅磁性颗粒，介质，和离液盐的混合物形式。
在本发明的实际应用中形成的混合物中离液盐离子的浓度优选在大约0.1-7.0M之间，但更优选在大约0.8-4.5M之间。混合物中离液盐离子的浓度必须足以使DNA靶物质吸附于混合物中的二氧化硅磁性颗粒，但不能太高以防止靶物质不可逆变性，降解或导致靶物质在混合物中沉淀。大分子的双链DNA，如染色体DNA，在0.5-2M的离液盐浓度是稳定的，但在大约2M以上的离液盐浓度已知发生沉淀。见例如美国专利No.5346994，Piotr Chomczynski，第2列，第56-63行。对比之下，较小分子的DNA如质粒DNA，染色体DNA的限制或PCR片段，或单链DNA，在2-5M离液盐浓度在溶液中仍未降解。
就本发明所用的任何离液盐而言，在使用这种盐进行本发明的任何溶液中的盐浓度，在进行本发明的所有条件下，需保持在溶液中盐的溶解度之下。
在本发明方法的一实践中，将介质和样品的混合物温育，直至至少一些DNA靶物质吸附于二氧化硅磁性颗粒形成复合物。此温育步骤是在至少0℃，优选至少4℃，更优选至少20℃进行的，温育温度不超67℃。此温育步骤必须在低于二氧化硅磁性颗粒开始丧失其可逆结合核酸物质的能力的温度下进行。温育步骤更优选在室温(即大约25℃)下进行。
当DNA靶物质包含于细胞内时，需要在含有离液盐的裂解溶液中裂解细胞，以便在相同的溶液中达到细胞裂解和复合物形成。
除了离液盐之外，裂解溶液可含有双极性或非离子型去污剂，如CHAPS[3-[3-胆酰胺丙基二甲基氨基]-1-丙磺酸]，或Triton X-100(Sigma，St.Loμis，MO)。优选地，裂解溶液包括pH缓冲液使pH稳定在大约7.0，以保持DNA结构完整。此裂解溶液还可含有二价阳离子鳌合剂，如EDTA。此裂解溶液还可用于从固体支持物中除去DNA靶物质。
在复合物形成后，用磁场将复合物从混合物中除去。除了磁场之外其它形式的外部力量，也可根据本发明的方法在初始除去步骤之后，用于分离DNA靶物质。适当的其它外部力量包括但非限于重力过滤，真空抽滤和离心。
用于从介质中除去复合物的外部磁场，可用已知的不同方法中任一种在介质中适当产生。例如，可将磁体置于装有含有颗粒的溶液的容器外面，使颗粒通过溶液迁移并集中在容器附着磁体部位的内表面。然后将磁体保持在容器的外表面，这样颗粒由于磁体产生的磁场附于容器的内表面，同时将容器内溶液轻轻倒出并弃去。然后在容器内加入第二种溶液，并除去磁体以使颗粒移至第二种溶液中。或者，将可磁化的探针插入溶液中并使探针磁化，这样颗粒堆积在浸入溶液中的探针的末端。然后将探针从溶液中取出，同时保持磁性，插入第二种溶液中，不再保持磁场使颗粒进入第二种溶液中。足以从溶液中分离二氧化硅磁性颗粒的任何磁力来源，均适用于本发明分离核酸的方法中。磁性分离仪器是可商购的。见例如MagneSphereTechnology磁性分离台或PolyATractSeries 9600TMMulti-Magnet，均得自Promega公司；MagneTight分离台(Novagen，Madison，WI)；或Dynal磁性颗粒集中器(Dynal，Oslo，Norway)。磁力优选是以磁性分离台形式提供的，如Promega公司的MagneSphereTechnology磁性分离台(Catalog Nos.Z5331-3或Z5341-3)。
本发明提供了常规和有效的从各种不同样品类型中分离相应DNA靶物质的方法。以上简要阐述了此方法的一优选方面，其中用磁力从介质中除去颗粒，比其中DNA靶物质与其它二氧化硅物质可逆结合的常规分离方法具有明显优势。特别地，用此方法的磁性除去步骤代替常规二氧化硅结合和洗脱分离方法中所需的真空抽滤或离心步骤。因此，特别适于自动操作。
在本发明方法的一优选方面，将从介质中除去的复合物至少清洗一次，在清洗液中漂洗。清洗除去除相应DNA靶物质之外的任何另外的杂质。用于此方法优选附加的步骤的清洗溶液优选包含能从二氧化硅磁性颗粒中除去污染物的的溶液。此清洗溶液优选包含盐和溶剂，优选醇。醇促进清洗溶液的蒸发。在该最后的优选形式的此清洗溶液中，醇浓度优选至少为30％体积，更优选至少40％体积，最优选至少50％体积。所用的醇优选是乙醇或异丙醇或其组合物，更优选是乙醇。盐优选是缓冲液形式，最优选是乙酸盐形式。清洗溶液中盐浓度要足够高，以保证核酸物质在清洗期间不被从磁性颗粒中洗脱。
在通过将复合物重悬于清洗溶液中从介质中除去后，优选将复合物清洗。复合物优选在第一次清洗后从清洗溶液中除去，每次清洗步骤用新鲜清洗溶液至少清洗一次，更优选清洗3次。
复合物中DNA靶物质的数量可限定。在一些分析或分子生物学处理方法中，少量的磁性颗粒将不毒害或明显干扰进程。因此在适当的方法中，复合物可直接处理，而不用首先从二氧化硅磁性颗粒中分离DNA靶物质。
然而优选地，在进一步处理之前将DNA靶物质从二氧化硅磁性颗粒中洗脱。这可通过将复合物暴露于洗脱液而进行。洗脱效率(或从颗粒中除去的结合的DNA靶物质的百分率)不重要。只要给定的反应条件，颗粒类型和样品类型的洗脱物百分率相对一致。只要确定量的DNA靶物质可一致的吸附于颗粒和洗脱掉，然后可进行定量。
洗脱溶液优选是低离子强度的水溶液，更优选是在核酸物质稳定和基本完整的pH下的水或低离子强度缓冲液。任何相同于或低于TE缓冲液(即10mM Tris-HCl，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH8.0)离子强度的水溶液适用于此方法的洗脱步骤中，但洗脱溶液优选缓冲为pH在6.5-8.5之间，更优选在7.0-8.0之间。TE缓冲液和蒸馏水或去离子水是特别优选用于本发明的洗脱溶液。上述优选的低离子强度形式的洗脱溶液保证核酸物质从离子中释放。其它适用于本发明方法的洗脱溶液对本领域技术人员是显而易见的。在此方法洗脱步骤从复合物中洗脱的DNA物质优选是从二氧化硅磁性离子中分离的。
用本发明方法洗脱的DNA靶物质，适于通过分子生物学方法分析或进一步加工，不需进一步分离。洗脱的DNA可通过例如通过测序，限制分析，或核酸探针杂交进行分析。因此，本发明的方法可用作基于DNA分析的方法的一部分，以诊断疾病；鉴别病原体；检验食品，化妆品，血液或血液制品，或其它被病原体污染的产品；法医学检测；亲代检测；和对胎儿和胚胎进行性别检测。优选地，洗脱的基因组DNA在DNA分型方法中分析。例如，一旦纯化，此DNA可用于常规扩增和DNA分型系统。PowerPlexTM1.1和PowerPlexTM2.1系统(Promega)在两管扩增系统中提供扩增13个核心CODIS基因座加上性鉴别基因座，amelogenin，和低打滑五核苷酸重复基因座Penta E的扩增。这两个系统一般具有3个基因座以防止样品混合。
本发明的方法提供的洗脱的DNA可进一步以各种方式加工，例如测序，转录，酶反应。洗脱的DNA的限制片段可与载体连接，并转化入适当宿主中以克隆或表达。洗脱的DNA节段可通过本领域已知各种方法扩增，以扩增靶核酸节段。如果洗脱的DNA是质粒或另一类型的自主复制DNA，可将其转化入适当宿主中，以克隆或表达能在转化的宿主中表达的DNA上的基因。
可将进行本发明的所需的组分置于试剂盒中，以从介质中分离已知量的DNA靶物质。这种试剂盒最基本应含有：悬浮于第一种容器中水溶液中个别量的硅质氧化物包被的磁性颗粒，其中此颗粒具有可逆结合样品类型介质中可限定量的DNA靶物质的能力。优选地，此试剂盒还包括离液盐。离子可悬浮于离液盐的溶液中。优选地，此试剂盒还包括清洗溶液。
就液态血和血迹(大约5μl-10ml血)而言，适当的试剂盒可包括以下成分：裂解缓冲液，清洗缓冲液，二氧化硅磁性颗粒，及任选的洗脱溶液和/或磁性台。优选地，裂解溶液是清洗溶液的两倍。高通量系统可包括上述成分加上96孔平板。
纯化质粒的适当试剂盒可包含：细胞重悬液，裂解溶液，中和溶液，二氧化硅磁性颗粒，清洗溶液和洗脱溶液。
以下非限制性实施例阐述了本发明的各种实施方案。在实施例中，及在说明书和权利要求中，除非特别说明，体积，pH和浓度均在室温下。在以下每个实施例中，使用最优选的形式的二氧化硅磁性颗粒，即多孔和无孔MagneSilTM颗粒。然而，本领域技术人员可根据本发明的教导，选择和使用除了多孔和无孔MagneSilTM颗粒之外的二氧化硅磁性颗粒，在以下实施例中例证了本发明方法的各个方面。
实施例
以下实施例例证了本发明的各个方面，无限制之意。实施例1：用无孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒从血液中分离DNA
在此实施例中，使用不同数量的无孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒(Promega公司)，从各种规格的人血液样品中分离DNA。在EDTA包被的vacμtainer管中收集血液，并在4℃贮存直至使用(两周)。将表1所列的6μl-25μl之间的各种数量的液态血液置于1.5ml锥形管中。然后加入含有93μl裂解缓冲液(4.5M硫氰酸胍，1％ TritonX-100，1％ CHAPS[3-[3-胆酰胺丙基二甲基氨基]-1-丙磺酸]，10mMEDTA，10mM Tris pH7.3调节为pH 6.8-7.0)和5μl或7μl含有100μg/μl无孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒的水的100μl溶液。将溶液短暂涡旋。然后将此管在室温温育5分钟，短暂涡旋并置于磁性台(Promega)上以从溶液中分离颗粒。将溶液小心移出，加入100μl清洗液(100mM NaCl，25％乙醇，25％异丙醇)。然后将管从磁性台取下，短暂涡旋并再置于磁性台上。除去清洗液，并重复两次清洗，共三次清洗。在除去最后的清洗液后，将颗粒在室温下在空气中干燥5分钟。将管从磁性台取下，加入100μl水并将此管短暂涡旋。将管在60℃放置5分钟，短暂涡旋，然后置于磁性台上。除去DNA溶液并贮存于0.5ml锥形管中。
表1示出使用500μg或700μg无孔MagneSilTM得自6-25μl液态血液的总DNA数量。DNA浓度是根据生产者的介绍用PicoGreenDNA染料确定的(分子探针，Eugene，OR)。使用的MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒数量表明近乎饱和动力学。500μg数量是接近饱和值，700μg数量是略低于饱和值。分离的DNA数量的差异明显低于血液体积尤其在10-25μl体积范围内的差异。表1
      洗脱的DNA(ng)
  血液体积(μl)   500μg颗粒   700μg颗粒
        6      68     78
        6      60     69
        8      74     66
        8      79     91
        10      85     106
        10      84     106
        15      87     121
        15      79     119
        20      124     123
        20      96     118
        25      96     146
        25      110     170
实施例2：分析分离的DNA
在此实施例中，将实施例1中制备的DNA用于分析在8个短串联重复(STR)基因座上的等位基因的相同性。将如实施例1所述用700μg无孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒(Promega)从血液样品中纯化的1μl DNA样品，用Promega的GenePrintPowerPlexTM1.1系统(Promega #DC6091)根据生产者指导进行扩增。生产者推荐使用此系统每次分析用0.5-5ngDNA，最优选用1ng DNA。
将1μl扩增产物加样于变性聚丙烯酰胺凝胶上，并如GenePrintPowerPlexTM1.1系统技术手册所述进行电泳。将凝胶用FMBIOII荧光扫描仪(Hitachi，Soμth San Francisco，CA)扫描。对每个观测的等位基因确定峰高度并归一化。数据点代表每个样品的15个等位基因的平均值，从10μl血液样品中制备的DNA产生的组合等位基因的高度设为1。这些数据点和标准偏差列于下表2。峰高度只变化大约2倍，且在10-25μl的血液样品中几乎相同。数据表明所有样品均是易于基因分型的。
表2
    Soln 从中制备DNA的血液量   平均归一化的峰高度     标准偏差
    1        6μl          0.52      0.15
    2        8μl          0.70      0.12
    3        10μl          1.0      0.11
    4        15μl          1.04      0.23
    5        20μl          1.01      0.26
    6        25μl          1.17      0.21
实施例3：无孔二氧化硅磁性颗粒和硫氰酸胍
在此实施例中，基因组DNA纯化自人全血。将血液预先抽吸在EDTA包被的vacμtainer中并在4℃贮存。除非特别说明，所有纯化以三份进行，所有步骤和温育在室温大气压下进行。磁性清除血液裂解物和纯化基因组DNA使用硫氰酸胍经Promega的WizardTMGenomic DNA纯化试剂盒(A1620)的溶液和无孔二氧化硅磁性颗粒进行。
将1ml，800μl，600μl，400μl和200μl血液置于含有3.0ml Wizard基因组细胞裂解溶液的15ml试管中，混合，并温育10分钟。然后将试管在800×g离心10分钟。除去溶液，剩下白细胞(wbc)沉淀于试管底。
将wbc沉淀涡旋并加入1.0ml核裂解溶液。然后涡旋试管并在37℃温育1小时。加入330μl WizardTM Genomic蛋白质沉淀溶液，涡旋试管并在800×g离心10分钟。从试管中除去溶液，并移至含有100μl(100mg/ml)无孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒的清洁试管中，并将溶液涡旋。
将2ml的5M硫氰酸胍(GTC)加入试管中，混合并温育2分钟。然后将试管置于磁性架上5分钟。将分离自颗粒的溶液除去并弃去。加入5ml SV总RNA层析柱清洗液(Promega，Z3100)，涡旋试管5秒钟，然后将试管再置于磁性架上2分钟。将分离自颗粒的溶液除去并弃去。重复进行清洗。最后用5.0ml 80％乙醇清洗。涡旋试管5秒钟，并置于磁性架上2分钟。将分离自颗粒的溶液除去并弃去。用80％乙醇清洗重复两次清洗，共三次。然后将试管在磁性架上在空气中干燥60分钟。在从磁性架上取下后，将颗粒上的DNA在400μl的WizardTM Genomic复性溶液中洗脱5分钟。然后将试管再置于磁性架上5分钟，并将含有DNA的溶液移出至清洁的试管中。
通过分光光度分析(在样品缓冲液中DNA稀释为1∶2)，根据生产者指导通过PicoGreen分析(分子探针)和根据生产者指导通过DNAQuant分析(Promega公司)获得DNA纯化结果，并列于下表3。此结果也示于图1。第1-5泳道分别相当于100，80，60，40，和20ng Promega基因组DNA标准Part#6304A。第6泳道及之后是用10μl样品加样的。
表3
血液μl A260  A280  A260/A280 产量μg PicoGreenμg DNAQuantμg 凝胶泳道
 200  0.0643  0.0287  2.2371  2.57  1.3  1.9  20
 200  0.0646  0.0285  2.2632  2.58  1.3  1.8  19
 200  0.0620  0.0273  2.2702  2.48  1.1  1.8  18
 400  0.0898  0.0423  2.1213  3.59  2.0  2.6  17
 400  0.0875  0.0415  2.1088  3.50  1.9  2.6  16
 400  0.0889  0.0418  2.1242  3.55  1.8  2.6  15
 600  0.0769  0.0355  2.1653  3.07  1.6  1.8  14
 600  0.0752  0.0335  2.2423  3.00  1.5  1.9  13
 600  0.0748  0.0337  2.2175  2.99  1.5  2.2  12
 800  0.0950  0.0447  2.1255  3.80  1.6  2.2  11
 800  0.0823  0.0373  2.2047  3.29  1.9  2.4  10
 800  0.0868  0.0403  2.1536  3.47  2.0  2.6  9
 1.0ml  0.0739  0.0330  2.2353  2.95  1.9  2.3  8
 1.0ml  0.0686  0.0304  2.2557  2.74  1.5  2.0  7
 1.0ml  0.0747  0.0338  2.2047  2.98  1.7  2.4  6
应用分光光度分析，平均产量为3.11μg。最低值为2.48μg或平均值的79.8％。最高值为3.8μg或平均值的122.3％。应用PicoGreen分析，进一步见图1，平均产量为1.6μg。最低值为1.1μg或平均值的33％，最高值为2.0μg或高于平均值20％。所有样品均在平均值的33％内。应用DNAQuant分析，最低值为1.8μg，最高值为2.6μg。A260/A280值高于1.7-1.9的期望范围，可反映出残余的污染物的存在。实施例4：从血染的S&S 903纸中分离DNA
在此实施例中证明以下步骤使用如实施例1所述的裂解缓冲液，从干燥在S&S 903纸(Schleicher & Schuell)上的血液中释放了DNA。然后将无孔磁性颗粒用于纯化释放的DNA。切下在S&S 903纸上的范围在14mm2-100mm2及含有5μl-50μl血液的人体血迹，并置于1.5ml锥形管底。然后在含有50mm2或更少的S&S 903纸的试管中，加入如实施例1所述的100μl裂解缓冲液，在含有100mm2S&S 903纸的试管中加入200μl裂解缓冲液。将试管置于95℃，30分钟。然后将试管从热源移开，并用无菌移液管的尖端除去纸。通过将纸在管壁上用移液管尖端加压除去过量的液体。然后加入含有700μg无孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒的7μl水，轻轻涡旋混合。如实施例1所述进行其余的DNA纯化步骤。
将纯化自每个血迹的1μl DNA用GenePrintPowerPlexTM1.1系统扩增，如实施例2所述。将1μl扩增产物加样于变性凝胶上，并如GenePrintPowerPlexTM1.1系统技术手册所述进行电泳。将凝胶用FMBIOII荧光扫描仪(Hitachi，South San Francisco，CA)扫描。确定每个观测的等位基因的峰高度并归一化。下表4中所列的数据点表示每个样品的15个等位基因的平均值及其标准偏差，在10μl血液样品中制备的DNA产生的组合等位基因的高度设为1。每个样品的平均归一化峰高度均在5％内，表明不论DNA是否自5，10，25，或50μl血迹中分离，扩增是一致的。
                                   表4
   Soln. 从中制备DNA的血液量     平均归一化的峰高度     标准偏差
    1         5μl            1.05      0.07
    2         10μl            1.0       0
    3         25μl            1.05      0.14
    4         50μl            0.95      0.12
下表5列出每个样品内峰高度之间的标准偏差。此偏差在16-20％之间，表明不管样品的大小，小和大等位基因均同样扩增。表5
    Soln     从中制备DNA的血液量     标准偏差
    1            5μl      0.16
    2            10μl      0.16
    3            25μl      0.21
    4            50μl      0.17
实施例5：从血染的FTATM纸中分离DNA
在此实施例中，示出附着于FTATM纸(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的DNA，用实施例1所述的裂解缓冲液从纸中释放。然后将释放的DNA用MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒纯化，并用于STR分析。
将人血染的所示规格的FTATM纸(113mm2，57mm2和28mm2)，在实施例2所述的100μl裂解缓冲液中，在95℃加热30分钟。将纸和溶液置于没有滤膜的自旋篮(Millipore，Bedford，MA)中，并在14000rpm在微量离心管中离心2分钟。然后将含有700μg无孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒的7μl水加入试管中，短暂涡旋，并在室温温育5分钟。将试管短暂涡旋，然后置于磁性台(Promega公司)上，在此颗粒自溶液中分离出，并除去溶液。将颗粒用100μl清洗缓冲液清洗3次(如实施例1所述)。然后将颗粒在室温于空气中干燥5分钟。向具有颗粒的试管中加入100μl水，并将此试管在60℃温育5分钟。将试管短暂涡旋，然后在室温置于磁性台上，除去DNA溶液并贮存在4℃。将1μl的每种溶液用GenePrintPowerPlexTM1.1扩增，将扩增产物置于变性凝胶上，并如实施例2所述用FMBIOII荧光扫描仪分析凝胶。将峰高度归一化，并列于下表6。在此实施例中，数据示出当使用无孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒的量保持一致时，纯化自不同量血染FTATM纸的DNA几乎等量。
表6
            归一化的峰高度
    基因座     等位基因     113mm2     57mm2     28mm2
    CSF1PO       12     0.80     1.07     1.00
    CSF1PO       10     0.99     1.28     1.00
    TPOX       10     0.55     1.09     1.00
    TPOX       8     0.62     0.92     1.00
    TH01       9     0.64     1.35     1.00
    TH01       6     0.58     1.26     1.00
    vWA       17     0.61     1.05     1.00
    vWA       16     0.72     1.11     1.00
    D16S539       14     0.66     1.19     1.00
    D16S539       11     0.75     1.42     1.00
    D7S820       13     0.54     1.15     1.00
    D7S820       12     0.42     1.11     1.00
    D13S317       12     1.45     1.78     1.00
    D13S317       8     1.17     1.86     1.00
    D5S818       12     1.06     1.51     1.00
实施例6：DNA纯化时变化血液保存时间
在此实施例中，对比血液贮存0-131天时用本发明的方法分离的DNA的数量。在超过此时间贮存的血液中，本领域技术人员已知DNA会不同程度降解。将人血液收集在EDTA包被的vacutainer管中，并在4℃贮存。在0，22，29，和131天后，收集血液，将来自10μl血液的DNA，如实施例1所述通过用无孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒纯化。将1μl每个纯化的DNA溶液(每个样品以三份分析)如实施例2所述用Promega GenePrintPowerPlex1.1系统扩增。将扩增的DNA在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并用FMBIO扫描仪确定峰高度，并相对于0天的数值归一化，如实施例2所述。表7列出所得的归一化峰高度的平均值和标准偏差。
表7
  抽吸血液后的天数   归一化的平均峰高度   标准偏差
        0          1.00       0
        22          0.97      0.1
        29          0.98      0.08
        131          0.98      0.24
所有样品的归一化平均峰高度的变化很小，表明适于此定量纯化程序的DNA可得自贮存多达4个月的血液。第131天的样品具有基本相同的平均峰高度，但小等位基因有些高于平均值，大等位基因有些低于平均值，这可由在使用抽吸和贮存131天后制备的样品时，观测到的标准偏差较大表明。然而，所有的样品均易于进行基因分型，且峰高度在可接受的范围内。
令人感兴趣的是，实施例6示出DNA的大小不明显影响结合和洗脱量。因此，不用基于样品时间(较长时间的样品趋于降解并因此提供较小规格的DNA)调节初始校准模型，即可获得可靠的结果。实施例7：在STR分析中直接使用MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒分离的基因组DNA
此实施例是确定DNA是否需要从MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒洗脱，以用于STR分析。
将6个685ng等分的人基因组DNA K562(Promega公司)置于1.5ml锥形管的50μl GTC裂解缓冲液(6M硫氰酸胍，10mMEDTA，10mM Tris pH6.0，1％CHAPS，1％Triton X-100)中。在并列的实验中，将50μl等分人全血置于含有100μl GTC裂解缓冲液的1.5ml锥形管中。将降低量的二氧化硅磁性颗粒(2.5，0.5，0.1，0.02，0.004，0.0008μg)加入每个系列中。将样品如下加工：在1.5ml锥形管中加入400μl GTC裂解缓冲液，50μl多孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒(100mg/ml)和200μl全血。将试管涡旋大约15秒。然后将试管在室温温育10分钟，并短暂涡旋5分钟。通过将试管置于磁性台上捕获颗粒。然后将分离自颗粒的上清除去，并加入650μl清洗缓冲液(25％异丙醇，25％乙醇，100mM NaCl，10mM Tris，pH8.0)，并将试管短暂涡旋。重复两次清洗，共三次清洗。然后，除去最后一次清洗液，并将颗粒重悬于20μl清洗缓冲液中。移出1μl每种分离液，并置于扩增管底，在空气中干燥10分钟。然后将这些样品用于STR分析，并与1ng K562的STR分析相对比，根据生产者的指导和如实施例2所述使用GenePrintPowerPlexTM1.1系统。所得凝胶示于图2。标记为“L”的泳道相当于等位基因梯。
表8
    样品 STR反应中颗粒的数量(μg) 凝胶泳道
K562 DNA(1ng)       0(阳性对照)     1
    K562DNA           2.5     2
    K562DNA           0.5     3
    K562DNA           0.1     4
    K562DNA           0.02     5
    K562DNA           0.004     6
    K562DNA           0.0008     7
    血液            2.5     8
    血液            0.5     9
    血液            0.1     10
    血液            0.2     11
    血液           0.004     12
    血液          0.0008     13
用降低量MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒分离的样品和1ng K561DNA之间的对比表明：极少量的基因组DNA被分离；结合于颗粒的DNA能直接用于STR反应；通过在上述STR分析中条带密度确定，捕获大约相当于1ng K562 DNA的DNA所需的颗粒量对于K562DNA为大约0.1μg，对于全血为大约0.5μg。实施例8：对通过在多孔和无孔二氧化硅磁性颗粒上捕获分离的DNA进行测序
此实施例证实通过限制加入到制备的含有比颗粒结合DNA的最大能力还多的DNA的细菌裂解物中的多孔和无孔二氧化硅包被的磁性颗粒的量，可以可靠地分离适用于自动测序数量的DNA。此方法不需通过分光光度法或其它定量分析确定DNA的浓度和数量，DNA的浓度和数量由于DNA制备中存在污染而会有偏差。
将1ml用pGEM3Zf(+)质粒(Promega公司，Madison，WI)转化的DH5α细胞(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)在Beckman 2ml BioBlock(140504)的每个孔中生长过夜。在600nm细胞密度为大约2-3 OD。质粒存在的理论数量可以为300-700个拷贝/细胞，得到产量为1.8-4.1μg/ml培养物(Sambrook等，1989，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，NY)。将细胞在BioBlock中通过在2000×g离心10分钟而沉淀。将培养基轻轻倒出，并将平板在纸巾上轻轻拍压，以吸干任何剩余的液体。
然后，将75μl细胞重悬缓冲液(Promega，A711T)加入细胞沉淀中，并将沉淀通过来回抽吸重悬。加入75μl细胞裂解缓冲液(Promega，A712T)，并通过来回抽吸4次将溶液混合。加入100μlWizardTM Plus SV中和溶液(Promega，A713T)，并通过来回抽吸4次将溶液混合。
将BioBlock中的试管在2000×g离心10分钟。从每个试管中取出裂解物，并置于96孔平板的适当孔中。
在使用之前，将MagneSilTM二氧化硅包被的磁性颗粒(多孔和无孔)通过摇动重悬。然后将如下表9所列的不同数量的每型稀释的颗粒加入各孔中，轻轻混合并在室温温育10分钟。将平板置于磁体上并使溶液澄清(大约10秒钟)。从每个孔中除去裂解物并弃去，注意近可能不除去颗粒。将平板从磁体上取下并在每个孔中加入40μl80％的乙醇。
将颗粒通过来回抽吸重悬。将平板再置于磁体上并除去澄清的裂解物。重复进行清洗。在第二次清洗后，将平板在磁体上放置10分钟。如果在此时间后有任何液体流至孔底，用移液管除去。然后在每个孔中加入10μl纳米纯水，并通过来回抽吸混合。将平板置于磁体上使其澄清，并将上清移至清洁平板中。
然后不用再进一步加工，用如下所列的正向和反向质粒特异性引物(Promega公司，Madison，WI)，在ABI 377设备上根据生产者指导(ABI)，用Big-DyeTMChemistry对完整的样品测序。尽管具有不同程度的信号强度和精确性，仍可对所有的样品多至800个碱基测序。精确性列于下表9，信号强度列于下表10。正向引物  5’GTTTTCCCAGTCACGAC 3’(SEQ ID NO：1)反向引物  5’CAGGAAACAGCTATGAC 3’(SEQ ID NO：2)表9
样品制备物中颗粒量(ng)                        精确性％
  500个碱基   600个碱基   700个碱基   800个碱基
  1000多孔     100     100     100     98
  500多孔     100     100     99     97
  250多孔     100     100     99     98
  125多孔     100     99     97     99
  63多孔     100     100     98     96
  1000无孔     100     100     99     97
  500无孔     100     100     98     95
  250无孔     99     99     96     93
  125无孔     75     0     0     0
  63无孔     97     94     90     0
表10
    样品     样品制备中颗粒量(ng) 相对信号强度
    1          1000多孔      100
    2            500      53
    3            250      43
    4            125      65
    5            63      27
    6          1000无孔      39
    7            500      36
    8            250      18
    9            125      8
    10            63      15
结果表明当第一次使用新质粒类型，颗粒类型，或样品类型时，需要用各种量的颗粒确定校准模型。表9的结果表明无孔颗粒比等量的多孔颗粒具有较低的结合量。这将保证在同时分离/定量步骤之后存在足够数量的DNA，以进行DNA测序反应。在用此类型的质粒的所有随后的反应中，不再需要校准，因为已知多少数量的颗粒能在所用条件下通过确定量的颗粒纯化。实施例9：对比根据生产者指导使用的在FTA纸上血液样品及与细胞裂解缓冲液和二氧化硅磁性颗粒分离方法一起使用的FTA纸上血液样品
FTA纸(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)是一种贮存血迹的常规方式。然而，当分析在FTA纸上的DNA时，存在一些技术问题。因为与FTA纸的高结合性，及不能通过任何已知的方法从滤纸中容易地分离DNA，所以必须使用非常小孔(punches)的纸，以消除在扩增反应中过量的DNA。另外，还有FTA纸的吸收给定体积液体的能力。因此，具有高或低白细胞计数的血液或具有过量体积血液的样品产生不一致的结果。由生产者推荐的纯化方法在将滤纸直接用于扩增反应之前，需要花费20-30分钟的5次清洗步骤，加上另外20分钟在60℃的干燥步骤。此步骤在每次扩增DNA时必须重复进行。
在此实施例中，对比了根据生产者推荐的方法从FTA纸上分离DNA，和用无孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒从FTA纸上分离DNA。将在FTA纸上相当于100μl血液的113mm2的血迹，根据生产者的方法纯化。在纸上打一个1mm的孔，并将此孔分成两半(等于0.5mm2或0.4μl血液)。将此孔用GenePrintPowerPlexTM1.1系统根据生产者的指导纯化(Promega公司，#DC6090)，并如实施例2所述在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳。
或者，将57mm2 FTA纸上的血迹在95℃在200μl裂解缓冲液中加热30分钟，然后将纸置于自旋篮上并离心两分钟以从纸上分离溶液。然后加入含有700μg无孔MagneSilTM二氧化硅磁性颗粒的7μl水，并将溶液在室温温育5分钟。将试管置于磁性台上从上清中分离颗粒。除去上清并弃去。将颗粒用清洗缓冲液如实施例1所述清洗3次，然后在室温在空气中干燥5分钟。然后加入100μl水并将样品在60℃温育5分钟。将颗粒在磁性台上分离，收集含有DNA的溶液并移至清洁试管中。将1μl(等于大约0.6mm2 FTA孔或大约0.5μl血液)样品用GenePrintPowerPlexTM1.1DNA系统扩增，并如实施例2所述在变性聚丙烯酰胺上电泳。
分析在丙烯酰胺凝胶上观测的扩增产物扫描图，并将每个峰高度用平均峰高度除以获得归一化值。将在每个基因座上的两个等位基因的峰高度平均。结果列于下表11。结果示出根据生产者的方法FTA样品在STR扩增反应中峰不平衡，大等位基因扩增不足，小等位基因过扩增。如上所述用二氧化硅磁性颗粒从FTA滤纸从除去DNA，提供正确量的DNA用于STR扩增反应，并观测到不同大小的等位基因无优先的扩增。表11
       归一化峰高度
    基因座     FTA纯化 二氧化硅磁性纯化
    CSF1PO     0.59        0.90
    TPOX     0.95        1.11
    TH01     1.01        1.10
    vWA     1.45        0.89
实施例10：多孔二氧化硅磁性颗粒和全血：增加样品规格限制颗粒体积
在此实施例中，将浓度为100mg/ml的常量(7μl)多孔二氧化硅磁性颗粒用在下述方法中以从各三份的100，200和300μl人全血样品中分离DNA。洗脱的DNA通过UV分光光度法，琼脂糖凝胶电泳，和PicoGreen分析(Molecμlar Probes，Eμgene，OR)测定。
将7μl充分混合的多孔二氧化硅磁性颗粒(100mg/ml)移液入9个2ml旋盖锥形管中。然后将100，200和300μl的各三份人全血样品加入3个管中。将管涡旋20秒。然后在室温温育10分钟，在此期间通过涡旋混合一次。将样品再次混合并置于磁性架上。5分钟后，将磁性颗粒在室温从上清中分离。然后除去上清并弃去。再重复清洗两次，共3次。
然后，加入400μl醇清洗液，并通过涡旋混合管内容物。将管置于磁性台上，除去上清并弃去。用醇重复清洗两次清洗，共三次。在除去最后的上清后，将管打开盖在室温在空气中干燥10分钟。然后将颗粒与50μl TE(10mM Tris，1mM EDTA，pH7.3)组合。将此管混合并在5℃放置过夜。在磁性台上将颗粒从上清中分离，并将含有洗脱的DNA的上清移至清洁试管中。将颗粒再与50μl TE合并混合，并在65℃放置过夜。将颗粒在磁性台上从上清中分离，并将上清集合为组合的DNA洗脱物，体积为100μl。
然后组合70μl此溶液与280μl TE，通过UV分光光度仪测定溶液中DNA浓度，并在用TE为空白的UV分光光度仪上测定在260nm和280nm的吸光度。结果列于下表12。表12
  样品     血液 OD260：280 浓度(μg/ml)   产量(μg) 凝胶上泳道
    1     100μl     1.55      0.020      2.0      6
    2     100μl     1.54      0.033      3.3      7
    3     100μl     1.65      0.030      3.0      8
    4     200μl     1.63      0.037      3.7      9
    5     200μl     1.50      0.028      2.8      10
    6     200μl     1.49      0.038      3.8      11
    7     300μl     1.53      0.032      3.2      12
    8     300μl     1.57      0.031      3.1      13
    9     300μl     1.58      0.040      4.0      14
然后将10μl每种样品在1％琼脂糖凝胶上与Promega G304A基因组DNA标准物(泳道2-4分别为200，100和50ng)，和λHindIII标记G171A(泳道1)一起电泳。将凝胶用溴化乙锭染色，并在UV光下将样品泳道与标准泳道目测对比。结果示于图3。样品1呈现含有150ng总产量，样品6呈现含有800ng总产量，其它样品总产量大约为250ng。这表明UV分光光度数据错误提高到大约4-10倍，这可能由于残余的醇或蛋白质污染所致，如可通过低OD260：280比率表明。
根据生产者的指导进行PicoGreen分析。结果列于下表13。从凝胶图和PicoGreen数据中可见，9个样品的总产量在大约250-959ng范围内。样品6呈现在此范围之外，可能由于此样品中DNA不均衡再水合所致。
表13
样品10μl  Raw# Corr# Conc 产量(ng)
#1  94  57  1.25  250.8
#2  120  83  1.83  365.2
#3  107  70  1.54  308
#4  153  116  2.55  510.4
#5  117  80  1.76  352
#6  255  218  4.80 (959.2)
#7  117  80  1.76  352
#8  100  63  1.39  277.2
#9  126  89  1.96  391.6
使用PicoGreen定量数据，平均产量为418ng。最低点为250.8ng或平均值的60％。最高点为959ng(#6，大概是异常值)或平均值的229％。如果此点在计算平均值时忽略不计，平均值为350ng，最低点为250ng或平均值的71％，最高点为510ng或平均值的145％。
本发明结合上述优选的实施方案已加以详细阐述。在本发明原理和所附权利要求范围内可对本发明加以改动。

Claims (43)

1.一种从介质中的其它物质中分离确定量的DNA靶物质的方法，包括：
(a)提供包含DNA靶物质的介质；
(b)提供个别量的能可逆结合可限定量DNA靶物质的含有二氧化硅的固体支持物；
(c)通过组合含有二氧化硅的固体支持物与介质，形成含有二氧化硅的固体支持物与DNA靶物质的复合物；
(d)从介质中除去具有DNA靶物质的复合物；
(e)从复合物中分离DNA靶物质，从而获得确定量的DNA靶物质。
2.一种从介质中的其它物质中分离确定量的DNA靶物质的方法，包括：
(a)提供包含DNA靶物质的介质；
(b)提供个别量的能可逆结合可限定量DNA靶物质的二氧化硅磁性颗粒；
(c)通过组合二氧化硅磁性颗粒与介质，形成二氧化硅磁性颗粒与DNA靶物质的复合物；
(d)通过应用外部磁场，从介质中除去具有DNA靶物质的复合物；
(e)通过洗脱DNA靶物质，从复合物中分离DNA靶物质，从而获得确定量的DNA靶物质。
3.权利要求2的方法，其中(a)步中提供的DNA靶物质的量相对于颗粒的结合量是过量的。
4.权利要求2的方法，其中二氧化硅磁性颗粒是多孔的。
5.权利要求2的方法，其中二氧化硅磁性颗粒是无孔的。
6.权利要求2的方法，其中二氧化硅磁性颗粒是硅质氧化物包被的磁性颗粒。
7.权利要求2的方法，其中介质包括离液盐。
8.权利要求7的方法，其中离液盐包含硫氰酸胍。
9.权利要求2的方法，其中(a)步中提供的DNA靶物质是聚合酶链反应的产物。
10.权利要求2的方法，其中DNA靶物质是基因组DNA。
11.权利要求2的方法，其中DNA靶物质是质粒DNA。
12.权利要求10的方法，还包括在DNA分型方法中分析洗脱的基因组DNA。
13.权利要求2的方法，其中介质是含有DNA靶物质的固体支持物，其中DNA靶物质在(c)步之前，通过将固体支持物与含有离液盐的混合物组合而分离自固体支持物。
14.权利要求13的方法，其中固体支持物是纸。
15.权利要求13的方法，其中将混合物从60℃加热至大约100℃。
16.权利要求2的方法，还包括对洗脱的DNA靶物质的至少一部分进行测序。
17.权利要求2的方法，还包括在从介质除去复合物之后清洗该复合物的步骤，之后从复合物中洗脱DNA靶物质。
18.权利要求17的方法，其中复合物是用包含醇和盐的清洗溶液清洗的。
19.权利要求2的方法，其中在(e)步中洗脱的DNA靶物质是用水洗脱的。
20.一种从介质中其它物质中分离确定量的DNA靶物质的方法，包括：
(a)提供包含DNA靶物质的介质；
(b)提供个别量的二氧化硅磁性颗粒，其具有每mg颗粒能可逆结合可限定量的DNA靶物质的能力；
(c)形成包含介质，二氧化硅磁性颗粒，和离液盐的混合物，其中混合物中离液盐浓度足以使DNA靶物质吸附于颗粒；
(d)温育此混合物直至至少一些DNA靶物质吸附至二氧化硅磁性颗粒；
(e)通过外部磁力从混合物中除去二氧化硅磁性颗粒和吸附的DNA靶物质；
(f)通过将颗粒暴露于洗脱溶液，从二氧化硅磁性颗粒中洗脱DNA靶物质。
21.权利要求20的方法，其中(a)步中提供的DNA靶物质的量相对于颗粒的结合量是过量的。
22.权利要求20的方法，其中DNA靶物质是基因组DNA。
23.权利要求20的方法，其中DNA靶物质是质粒DNA。
24.权利要求20的方法，还包括对洗脱的DNA靶物质的至少一部分进行测序。
25.权利要求20的方法，其中离液盐包含硫氰酸胍。
26.权利要求20的方法，其中(c)步中形成的混合物中离液盐浓度在大约0.1M-7M之间。
27.权利要求20的方法，其中二氧化硅磁性颗粒是多孔的。
28.权利要求20的方法，其中二氧化硅磁性颗粒是无孔的。
29.权利要求20的方法，还包括在从介质除去二氧化硅磁性颗粒后清洗该二氧化硅磁性颗粒的步骤，之后从该颗粒中洗脱DNA靶物质。
30.权利要求29的方法，其中该颗粒是用包含醇和盐的清洗溶液清洗的。
31.权利要求20的方法，其中洗脱溶液是水。
32.一种从介质中分离确定量DNA靶物质的试剂盒，此试剂盒包括：
在第一个容器中的水溶液中悬浮的个别量的二氧化硅磁性颗粒，其中该颗粒具有可逆结合样品类型介质中可限定量的DNA靶物质的能力。
33.权利要求32的试剂盒，其中样品类型是液态血液。
34.权利要求32的试剂盒，其中样品类型是固体支持物上的血液。
35.权利要求32的试剂盒，还包含离液盐。
36.权利要求35的试剂盒，其中二氧化硅磁性颗粒悬浮于具有离液盐的溶液中。
37.权利要求35的试剂盒，还包含清洗溶液。
38.一种确定校准模型，以定量相应样品类型中的DNA靶物质的方法，此方法包括
a.提供第一种介质，其中该第一种介质包括个别量的相应样品类型；
b.提供第二种介质，其中该第二种介质包括不同的个别量的相应样品类型；
c.将个别量的二氧化硅磁性颗粒与第一种介质混合，其中二氧化硅磁性颗粒能可逆结合确定量的DNA靶物质，从而形成二氧化硅磁性颗粒与第一种介质中的DNA靶物质的第一种复合物；
d.将个别量的二氧化硅磁性颗粒与第二种介质混合，其中二氧化硅磁性颗粒能可逆结合确定量的DNA靶物质，从而形成二氧化硅磁性颗粒与第二种介质中的DNA靶物质的第二种复合物；
e.通过施加外部磁场，从第一种介质中除去第一种复合物，从第二种介质中除去第二种复合物；
f.从第一种复合物和第二种复合物中分别洗脱DNA靶物质，从第一种复合物中产生分离的DNA靶物质的第一种洗脱物，从第二种复合物中产生分离的DNA靶物质的第二种洗脱物；
g.确定第一种洗脱物和第二种洗脱物中DNA靶物质的量。
39.权利要求38的方法，其中(c)步中提供的个别量的颗粒与(d)步中提供的个别量的颗粒数量相同。
40.一种从固体支持物中分离DNA靶物质的方法，此方法包括：将含有DNA靶物质的固体支持物与离液盐溶液在大约60℃-100℃的温度下接触，从而从固体支持物中分离至少一部分DNA靶物质。
41.权利要求40的方法，其中固体支持物是纸。
42.权利要求40的方法，其中离液盐溶液包含离液盐和pH缓冲液。
43.权利要求40的方法，还包括分离确定量的DNA靶物质的步骤，其是通过在分离的DNA靶物质中加入个别量的二氧化硅磁性颗粒形成复合物；通过施加外部磁场从溶液中除去具有DNA靶物质的复合物；通过从复合物中洗脱DNA靶物质而分离DNA靶物质，从而获得确定量的DNA靶物质。
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