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CN1360638A - 用编码腺病毒e1蛋白的序列在人体细胞中生产重组蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使用编码腺病毒的至少一种E1蛋白的序列在人体细胞系中生产重组蛋白的方法和组合物,其中所述细胞的基因组不编码腺病毒结构蛋白。本发明的方法和组合物特别适用于产生经翻译后修饰如糖基化的感兴趣人重组蛋白的稳定表达。这种蛋白质与其在非人系统如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产的相应物相比可具有有利的性质。

Description

用编码腺病毒E1蛋白的序列在人体细胞中生产重组蛋白
本发明涉及重组蛋白质生产的领域，尤其涉及使用人体细胞生产蛋白质。本发明还涉及单克隆抗体生产的领域，尤其用人体细胞生产单克隆抗体。本发明还涉及病毒蛋白生产的领域。本发明尤其用于生产疫苗，以助于脊椎动物，尤其哺乳动物特别是人抗病毒病原体的防护作用。
本发明揭示了生产重组蛋白的方法和组合物。本发明尤其用于蛋白质的生产，该蛋白质需要翻译后或翻译时期(peritranslational)修饰，如糖基化和适当折叠。
人重组蛋白在异源细胞中的表达已充分记录。许多重组蛋白的生产系统是可用的，如细菌，酵母，和真菌及昆虫细胞，植物细胞和哺乳动物细胞。然而尽管有这些生产系统，但有些生产系统仍不是最佳的，或只适于生产特殊类别的蛋白质。例如，在原核生产系统中不能生产需要翻译后或翻译时期修饰如糖基化，γ-羧基化或γ-羟基化的蛋白质。原核表达系统的另一熟知问题是在一些情况下经常产生错误折叠的产物，甚至产生不溶的包涵体。真核系统是生产特别是真核细胞衍生的蛋白质的一改良系统，但可用的生产系统仍有许多弊端。例如酵母菌株中的高甘露糖化影响酵母正确表达糖蛋白的能力。高甘露糖化通常甚至导致免疫反应，当这样制备的治疗性蛋白质施用于病人时。另外，酵母分泌信号不同于哺乳动物信号，导致哺乳动物蛋白包括人多肽输送至细胞外更有问题，这又导致持续生产和/或分离的问题。哺乳动物细胞广泛用于生产这种蛋白质，因为它们具有进行精确的翻译后修饰的能力。重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达在过去的几年里已取得明显进展，在许多情况下成为常规技术。尤其中国仓鼠卵巢细胞(CHO)已成为生产生物药学蛋白质和有诊断用处的蛋白质的通用及常规生产系统。有许多特征使CHO非常适用作宿主细胞：CHO细胞中可达到的生产水平非常高；此细胞系提供了安全的生产系统，其没有感染性或类病毒颗粒；CHO细胞已精确定性，尽管其来源的细胞系的历史是模糊的；CHO细胞用无血清的培养基，可在生物反应器中悬浮生长直至高密度；CHO的dhfr-突变体(DG-44克隆，Urlaub等，1983)已产生，通过导入外源dhfr基因，之后用氨甲碟呤良好控制dhfr基因和转基因的扩增，从而获得简易的选择系统。然而，糖蛋白或包含至少两个(不同)亚单位的蛋白质仍会产生问题。糖基化蛋白质的生物活性可由于寡糖组分的精确性质而深远影响。糖基化的类型对糖蛋白的免疫原性，定向及药物动力学性质也有明显作用。近年来，在确定糖基化的细胞因子领域已取得重大进展，并已克隆了许多糖基转移酶。由此导致研究方向针对于糖基化机制的代谢工程化(Fussenegger等，1999；Lee等，1989；Vonach等，1998；Jenkim等，1998；Zhang等，1998；Muehmore等，1989)。这种策略例如见于以下所述。CHO细胞缺失功能性α-2，6-唾液酸转移酶，导致唾液酸通过α-2，3-键特有地添加于半乳糖中。已知α-2，6-键缺失可增强蛋白质从血流中清除。为解决这个问题，CHO细胞通过适当的糖基转移酶转染，已遗传工程化为模拟人聚糖分布。CHO细胞也不能生产Lewis×寡糖，现已产生表达人N-乙酰-D-葡糖胺转移酶和α-1，3-岩藻糖基转移酶III的CHO细胞系。相反已知啮齿动物细胞包括CHO细胞，产生糖基化CMP-N-乙酰神经氨酸的CMP-N-乙酰神经氨酸水解酶(Jenkine等，1996)，这是一种人体没有的酶。携带这种糖基化的蛋白质当注射时，可产生强免疫应答(Kawashima等，1993)。对编码此水解酶的啮齿动物基因的新近鉴别，很可能促进缺失此活性的CHO细胞的产生，并避免这种啮齿动物修饰。
本领域因此教导可通过表达人糖基转移酶，而改变哺乳动物宿主细胞的糖基化趋势。尽管在重组蛋白上CHO衍生的聚糖结构可模拟在其天然人相应蛋白上的结构，但仍发现它们很不相同。另一潜在问题是不是所有的糖基化酶都已克隆并因此适于代谢工程化。治疗性施用不同于其天然人体相应蛋白的蛋白质，可导致激活病人的免疫系统，并产生影响治疗效果的非所需应答。使用非人细胞的其它问题是在翻译期间或之后可产生蛋白质的错误折叠，这可取决于不同陪伴蛋白的存在情况。发生异常折叠，可导致蛋白质生物活性的降低或丧失。另外，非常重要的是同时表达分离的多肽，这些分离的多肽以正确的相对丰度一起形成包含不同亚单位的蛋白质，如单克隆抗体。人体细胞能更好地提供正确表达和加工人体蛋白所必需的所有便利条件。
因此，更需要生产人体重组蛋白的方法，其包括一种细胞，其提供一致的人类型加工如翻译后或翻译期间修饰，如糖基化，其优选还适于大规模生产。
因此，本发明提供了一种在细胞中生产至少一种蛋白质物质的方法，所述细胞包括真核细胞，其在其基因组中具有编码腺病毒的至少一种E1蛋白，或其功能性同源物，片段和/或衍生物的序列，该细胞不从其基因组或整合入其中的序列编码结构性腺病毒蛋白；所述方法包括提供编码重组蛋白质物质的基因给所述细胞，将此细胞在适当的培养基中培养，并从所述细胞和/或培养基中收集至少一种蛋白质物质。蛋白质物质是一种包含通过肽键连接的至少两个氨基酸的物质。此物质还可进一步包含与所述氨基酸部分物理连接的一或多个其它分子或不包含这些分子。这些其它分子的非限制性例子包括碳水化合物和/或脂质分子。由于许多原因，编码腺病毒结构蛋白的核酸不应存在。原因之一是在所生产的蛋白质制备物中存在腺病毒结构蛋白在这种所生产的蛋白的应用中是非常不希望的。从产物中除去这种结构蛋白最好通过避免其在制备中发生而实现。优选地，所述真核细胞是哺乳动物细胞。在一优选的实施方案中，从细胞中收获的蛋白质物质和细胞自身是衍生自相同物种的。例如，如果将蛋白质施用于人，优选细胞和收获自所述细胞的蛋白质物质均来源于人。人体细胞的一优点是商业上大多数引人注意的蛋白质是人源的。收获自所述细胞的蛋白质物质可以是由所述细胞产生的任何蛋白质物质。在一实施方案中，至少一种收获的蛋白质物质是由所述基因编码的。在另一实施方案中，将基因提供给所述细胞，以增强和/或诱导一或多种内源性存在的基因在细胞中表达。例如，提供编码蛋白质的基因给所述细胞，能增强在所述细胞中蛋白质物质的表达。
基因是指包含一种处于可表达形式如表达盒的感兴趣核酸的一种核酸。感兴趣的核酸可以从天然启动子或其衍生物或完全异源启动子表达，感兴趣核酸可包含或不包含内含子。相似地，其可以是cDNA或cNDA样核酸。感兴趣核酸可编码蛋白质。或者，感兴趣核酸可编码反义RNA。
本发明还提供了一种在细胞中生产至少一种人重组蛋白的方法，包括将编码所述人重组蛋白的核酸提供给一种人体细胞，该细胞在其基因组中具有编码至少一种无限增殖化腺病毒E1蛋白质或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，此细胞不产生结构性腺病毒蛋白；将所述细胞在适当培养基中培养，并从所述细胞和/或培养基中收获至少一种人重组蛋白。直至本发明，几乎没有发现有任何人体细胞适于以任何可再生及大规模方式生产人重组蛋白。我们现已发现在其基因组中至少包含无限增殖化腺病毒E1序列的细胞，能相对非依赖于外源生长因子而生长(它们通过E1而无限增殖化)。另外，这些细胞能大量生产重组蛋白，并能正确加工生产的重组蛋白。当然这些细胞也能生产非人体蛋白。已用于大量生产重组蛋白的人体细胞系通常是肿瘤(转化)细胞系。大多数用于生产重组蛋白的人体细胞是肿瘤衍生的这一事实，增加了使用这些特殊细胞系的危险性，并导致分离重组蛋白的步骤要非常严格，以避免在任何蛋白质或其制备物中有转化活性或致瘤性物质。根据本发明优选使用的方法，所述细胞衍生自原代细胞。为能使其无限生长，原代细胞需以一些方式无限增殖化，在本发明中已通过导入腺病毒E1而达到。本领域还不清楚转化和无限增殖化的界线。本文中其不同之处是指无限增殖化的细胞无限地生长，而其表型仍存在；转化的细胞也无限生长，但其表型也明显改变。为通过细胞培养而达到大规模(持续性)生产重组蛋白，本领域优选使细胞能不需贴壁地生长。本发明的细胞具有此能力。当细胞在其基因组中包含编码E2A或其功能性衍生物或类似物或其片段的序列时，细胞的非依赖于贴壁的生长能力得以改善，其中优选所述E2A编码序列编码一种温度敏感性的突变E2A，如ts125。为获得从中可易于分离所需重组蛋白的纯净及安全的生产系统，优选使用本发明的方法，其中所述人体细胞不包含其它腺病毒序列。本发明使用的最优选的细胞是以ECACC保藏号96022940保藏的PER.C6，或其衍生物。PER.C6比例如转化的人293细胞在运用中表现更佳，其也已经通过腺病毒的E1区而无限增殖化。对PER.C6细胞已经定性并已非常深入地研究，它们在大规模加工，悬浮生长和不依赖于生长因子方面表现更好。特别是PER.C6可在悬浮液中以高度可再生方式生长，这使其非常适于大规模生产。另外，已证明PER.C6细胞系可在生物反应器中生长至非常高的密度。
本发明的细胞，尤其PER.C6具有另外的优点，其可在无动物或人衍生的血清或动物或人衍生的血清组分的培养基中培养。因此分离更加容易，而安全性由于培养基中没有额外的人或动物蛋白而提高，且此系统是非常可靠的(合成培养基是再生性最好的)。另外，腺病毒早期区域1A(E1A)的存在与缺失此特殊基因的(人)细胞系相比，又有另外的优点：作为转录激活剂的E1A已知增强从巨细胞病毒介导的早期基因的增强子/启动子中转录(Olive等，1990；Gorman等，1989)。当产生的蛋白质在CMV增强子/启动子控制下时，所述细胞中表达水平提高，而缺失EIA的细胞中表达水平不提高。本发明因此还提供了一种在原核细胞中增加重组蛋白质物质产量的方法，包括提供编码所述蛋白质物质至少一部分的核酸给原核细胞，所述编码序列在CMV启动子，E1A启动子或其功能性同源物，衍生物和/或片段的控制下，并且进一步提供给所述细胞以E1A活性或类E1A活性。与CMV启动子相似，E1A启动子在表达一或多种E1A产物的细胞中，比在不表达这种产物的细胞中更有活性。已知实际上E1A表达增强作用是一些其它启动子的特性。就本发明而言，这种启动子是E1A启动子的功能同源物。E1A的作用可通过转录激活物引诱E1A启动子或其同源物，和/或通过除去/避免转录阻抑物附着启动子而介导。激活物与阻抑物与启动子的结合，以序列依赖方式发生。E1A启动子或其同源物的功能衍生物或片段至少包含一种E1A蛋白调节的激活物和/或阻抑物的核酸结合序列。
本发明的细胞的另一个优点是其具有并持续表达腺病毒E1B基因。腺病毒E1B是熟知的细胞程序死亡的抑制剂。此抑制是通过其55K E1B产物与转录因子p53结合，或随后抑制而发生的(Yew和Berk，1992)。E1B区域的其它产物，19K E1B，可通过结合并从而抑制细胞死亡蛋白Bax和Bak而防止细胞程序死亡，这两种蛋白均在p53的控制下(White等，1992；Debbas和White，1993；Han等，1996；Farrow等1995)。这些特点特别可用于表达这样的重组蛋白，即当此重组蛋白过表达时，可通过依赖p53途径诱导细胞程序死亡。
本发明还提供了人体细胞在生产人重组蛋白中的应用，所述细胞在其基因组中具有编码腺病毒的至少一种无限增殖化E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，该细胞不产生结构性腺病毒蛋白。在另一实施方案中，本发明提供了这种应用，其中所述人体细胞衍生自原代细胞，优选所述细胞是PER.C6细胞或其衍生物。本发明还提供了一种应用，其中所述细胞在其基因组中还包含编码E2A或其功能性衍生物或类似物或片段的序列，优选其中所述E2A是温度敏感性的。
本发明还提供了可根据本发明方法或本发明的应用获得的人重组蛋白，所述人重组蛋白具有不同于分离的天然人相应蛋白的人糖基化模式。
在另一实施方案中，本发明提供了一种人体细胞，其基因组中具有编码腺病毒的E1或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，该细胞不产生结构性腺病毒蛋白，并还具有编码人重组蛋白的基因，优选此人体细胞衍生自ECACC保藏号96022940的PER.C6。在另一实施方案中，本发明提供了这样一种人体细胞，PER.C6/E2A，其基因组中还包含编码E2A或其功能性衍生物或类似物或片段的序列，优选所述E2A是温度敏感性的。
在这些细胞中表达的蛋白质和使用本发明的方法，是本领域技术人员熟知的。这些蛋白优选是人体蛋白，优选经过一些天然加工，如分泌，陪伴折叠和/或转运，与其它亚单位共合成，糖基化，磷酸化。典型的治疗性或诊断性用途例如包括由一些亚单位组成的单克隆抗体，组织特异性纤溶酶原激活物(tpA)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和人促红细胞生成素(EPO)。EPO是一种典型的产物，尤其在体内，其活性和免疫原性主要依赖于其糖基化模式。因此，相对高水平的EPO可通过使用CHO细胞而达到，当与纯化自人尿液的EPO相对比时，其糖基化不同，但增加红细胞产生的活性相同。然而这种EPO的不同糖基化在受体中产生免疫原性问题，和半衰期改变的问题。
本发明为此还揭示了一种新的无限增殖化的人细胞系，及其进行生产的应用。PER.C6细胞(WO 97/00326)是通过用含有腺病毒血清型5(Ad5)E1A编码序列和E1B编码序列(Ad5的459-3510位核苷酸)的质粒，在人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的控制下，转染原代人胚胎视网膜细胞而产生的。
以下特点使PER.C6特别适用作生产重组蛋白的宿主：1.充分定性的人体细胞系；2，按照GLP产生；3.可作为悬浮培养物在没有任何人或动物衍生的蛋白质的限定的无血清培养基中生长；4.适合在滚瓶，摇瓶，旋动瓶和生物反应器中生长，倍增时间大约35小时；5.存在E1A使在CMV增强子/启动子的控制下的基因表达被正调节；6.存在E1B，防止依赖于p53的细胞程序死亡可能通过重组转基因的过表达而增强。
在一实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述细胞与常规哺乳动物细胞系相比，能产生2-200倍的更多重组蛋白和/或蛋白质物质。优选地，所述常规哺乳动物细胞选自CHO，COS，Vero，Hela，BHK和Sp-2细胞系。
在本发明的一方面，蛋白质物质或蛋白质是单克隆抗体。抗体或免疫球蛋白(Igs)是在体液免疫应答，结合抗原并灭活抗原，或触发炎症应答以消除抗原中起主要作用的血清蛋白。抗体能高度特异性地与多种配体相互作用，包括肿瘤相关标记，病毒外壳蛋白，和淋巴细胞表面的糖蛋白。因此，它们是诊断和治疗人体疾病的潜在的非常有用的制剂。重组单克隆和单链抗体技术展示了开发新的治疗和诊断制剂的新前景。小鼠单克隆抗体在许多临床试验中已用作治疗剂，以治疗感染性疾病和癌症。用小鼠单克隆抗体治疗病人的第一篇报道发表于1980年(Nadler等，1980)。然而，使用这些制剂所观测到的效果通常非常令人失望(参见Lowder等，1986；Mellstedt等，1991；Baldwin和Byers，1986)。传统地，重组单克隆抗体(免疫球蛋白)是在B细胞杂交瘤中生产的。这种杂交瘤是通过将初始通过其特异性选择的产生免疫球蛋白的B细胞，与小鼠骨髓瘤融合并从而无限增殖B细胞而产生的。无限增殖小鼠B细胞的原始方案产生于1975年(Kohier和Milstein)。然而，在这种杂交瘤中产生的免疫球蛋白有缺陷，即其来源于小鼠，导致低抗体特异性，低抗体亲和性和严重的宿主抗小鼠抗体应答(HAMA，Shawler等，1985)。此HAMA应答可导致病人出现炎症，发热甚至死亡。小鼠抗体在人体内亲和性较低且与人抗体相比，原因不明地在人体循环中半衰期非常短，人抗体半衰期为21天(Frodin等，1990)，小鼠抗体半衰期为19-42小时。结合HAMA应答的严重性，促使开发另外的产生更多人或完全人化的免疫球蛋白的方案(参见Owens和Young1994，Sandu1992，Vaswani等，1998)。一个这种方案是用人免疫球蛋白的恒定区置换小鼠的相应部分，产生新的“嵌合”和“人化”抗体。由于HAMA应答主要由于恒定区所致，因此采取该方案(Oi等，1983；Morrison等，1984)。这种嵌合抗体例如是CAMPATH-1H(Reichmann等，1988)。用于治疗非Hodgkin’sB细胞淋巴瘤的CAMPATH-1HAb，抗存在于所有淋巴细胞和单核细胞中，但不在其它类型细胞中的人抗原CAMPATH-1[CDw52]，(Hale等，1988；Isaacs等，1992)。其它例如是抗人CD20的Rituxan[Rituximab](Reff等，1994)，和用于血液凝血显影中的抗人片段D二聚体产生的嵌合抗体，15C5(Vandamme等，1990；Bulens等，1991)。然而，由于这些新产生的嵌合抗体仍有部分是小鼠的，其在体内可诱导免疫应答，尽管此应答没有抗全部源自小鼠的HAMA应答严重。
在另一更复杂的方法中，抗体可变区中存在的但明显不是识别抗原所必需的残基，用更类人的氨基酸序列置换，产生第二代或高嵌合的抗体(Vaswani等，1998)。此方法熟知的例子是Herceptin(Carter等，1992)，其是一种95％是人的抗HER2(一种肿瘤特异性抗原)的抗体，并用于乳腺肿瘤的病人。
一种更优选的代替小鼠重组免疫球蛋白的方式是导致人免疫球蛋白产生的方式。重要地，由于用试验性生物制品免疫接种人体是不合乎规定的，因此不能继之选择特异的B细胞进行如小鼠B细胞所示的无限增殖化(Kohler和Milstein 1975)。尽管用病人的B细胞选择抗癌抗原的特异抗体，但与小鼠抗体相比技术上更难于从人体物质中制备人免疫球蛋白(Kohler和Milstein，1975)。通过使用表达人源可变区的噬菌体展示的抗体文库，一种生产全部人抗体的重组方法成为可能(McCafferty等，1990；Clarkson等，1991；Barbas等，1991；Garrard等，1991；Winter等，1994；Burton和Barbas，1994)。这些可变区是通过它们对一些抗原的特异亲和性选择的，随后与人免疫球蛋白的恒定区连接，产生人重组免疫球蛋白。这一方法例如是单链的Fv抗体17-1A(Riethmuller等，1994)，其被转变成称为UBS-54的完整人IgG1κ免疫球蛋白，抗肿瘤相关的EpCAM分子(Huls等，1999)。
产生重组免疫球蛋白的生产系统是多种多样的。首先用于临床试验的小鼠免疫球蛋白是在其亲代特异性B细胞中大量产生的，并融合于小鼠骨髓瘤细胞以无限增殖化。此系统的缺点是产生的免疫球蛋白全部源自小鼠，且在病人体内产生明显的免疫应答(HAMA应答，如上述)。部分人化的或人抗体缺少可无限增殖的亲代B细胞，并因此不得不在其它系统如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仓鼠肾(BHK)细胞中生产。也可使用一般适于免疫球蛋白生产的细胞，如肿瘤衍生的人或小鼠骨髓瘤细胞。然而，当与最初鉴别的无限增殖的B细胞中获得的抗体产量相比时，在骨髓瘤细胞中获得的抗体产量通常相对较低(±0.1μg/ml)，前者产生充足的小鼠免疫球蛋白(±10μg/ml，Sandu 1992)。
为解决这些及其它问题，正在开发不同的系统以生产较高产量的人化或人免疫球蛋白。
例如，近来研究表明可产生转基因小鼠品系，其中小鼠IgG基因用人的相应部分置换(Bruggeman等，1991；Lonberg等，1994；Lonberg和Huszan，1995；Jacobovits，1995)。将含有人重链和轻(k)链免疫球蛋白(Ig)基因座的大片段的酵母人工染色体(YACs)，导入Ig失活的小鼠中，产生人抗体产物，其与在人体中所见的抗体在包括基因重排，装配和所有组成成分方面十分相似(Mendez等，1997；Green等，1994)。类似地，Fishwild等(1996)已经构建人Ig转基因，以随后用常规的杂交瘤方法获得人免疫球蛋白。此杂交瘤细胞分泌的人免疫球蛋白的性质类似于在野生型小鼠中产生的性质，包括稳定性，生长和分泌水平。产生自这种转基因小鼠品系的重组抗体不携带非人氨基酸序列。
然而，这样产生的人免疫球蛋白的缺点是其是在非人细胞中产生的，导致非人翻译后修饰如糖基化和/或亚单位的折叠。所有抗体均在其恒定区的保守部位糖基化且碳水化合物的存在对抗原清除功能如补体激活是关键性的。附着的碳水化合物的结构也可影响抗体活性。抗体糖基化可受产生其的细胞，抗体的构象和细胞培养条件影响。例如，在小鼠细胞中产生的抗体携带含有Gal-α1-3Gal残基的聚糖，其在人体细胞中产生的蛋白质中不存在(Borrebaeck等，1993；Borrebaeck，1999)。人体中存在非常高效价的抗Gal-α1-3Gal抗体(100μg/ml，Galili，1993)，导致在其聚糖中携带此残基的(小鼠)蛋白质迅速清除。
很快显而易见的是为发挥作用，病人需长期用非常高剂量的重组免疫球蛋白治疗。对不是在人体细胞中产生的人或人化的免疫球蛋白的翻译后修饰，明显影响这些抗体从血流中清除的速率。
现还不清楚为什么在CHO细胞中产生的免疫球蛋白也需要以非常高的剂量应用，因为Gal-α1-3Gal残基在衍生自此细胞系的蛋白质上的聚糖中并不存在(Rother和Sauinto，1996)。因此，除Gal-α1-3Gal残基之外的其它翻译后修饰，可能参与人体抗在这种CHO细胞中产生的完全人或人化的免疫球蛋白的特异免疫应答。
本领域因此教导可产生不具有小鼠衍生的蛋白质序列的人化抗体。然而，目前产生的重组免疫球蛋白仍不同于其天然人相应物，如翻译后修饰如糖基化和折叠。这可导致病人免疫系统激活，并导致可影响治疗效果的非所需应答。因此，尽管研制出嵌合抗体，但目前的生产系统仍需最佳化，以产生完全人或人化的活性抗体。
因此明显需要一种生产完全人抗体并以高于在人骨髓瘤细胞中观测的产量生产的方法。
因此提供一种人体细胞，其产生类似翻译后和翻译期间加工例如但非限于糖基化的人类型蛋白质，这对本领域来讲是一大进展。另外，提供一种生产重组哺乳动物细胞，及从此重组哺乳动物细胞中大规模生产免疫球蛋白的方法，也是有益的。
本发明因而进一步提供了一种在重组哺乳动物细胞中生产免疫球蛋白的至少一个可变区的方法，包括提供一种哺乳动物细胞，该细胞在其基因组中包含编码腺病毒的至少一种无限增殖的E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物和/或其片段的核酸，并进一步另外还包含编码所述免疫球蛋白的第二种核酸，将所述细胞在适当培养基中培养，并从所述细胞和/或培养基中收获至少一种单克隆抗体。
在此之前，几乎没有发现以可再生及可大规模生产方式适于生产免疫球蛋白的人体细胞。本发明的细胞包含至少一种无限增殖化腺病毒E1蛋白，并能相对不依赖于外源生长因子而生长。
另外，这些细胞能大量生产免疫球蛋白，并能正确加工产生的免疫球蛋白。已用于生产免疫球蛋白的细胞是肿瘤衍生的这一事实，增加了使用这些特殊细胞系的额外危险性，并使分离免疫球蛋白的步骤非常严格，以避免在任何制备物中有转化活性或致瘤性物质。因此优选使用本发明的方法，其中所述细胞衍生自原代细胞。为能无限地生长，原代细胞需要无限增殖化，这在本发明中已通过导入腺病毒E1蛋白而达到。为通过细胞培养而大规模(持续)生产免疫球蛋白，优选细胞能不需贴壁而生长。本发明的细胞具有此能力。当细胞在其基因组中包含编码E2A(或其功能性衍生物或类似物或片段)的腺病毒衍生的序列时，非依赖贴壁的细胞生长能力得以改善。在一优选的实施方案中，E2A编码序列编码温度敏感性的突变体E2A，如ts125。另外，所述细胞还可包含一种核酸(如编码tTa的核酸)，当其置于启动子的控制下(如Teto启动子)时，可调节相应基因的表达。核酸可编码免疫球蛋白的重链，轻链和/或可变轻链。或者，一种分离的或独立的核酸可编码Ig(或其功能性衍生物，同源物和/或其片段)的一或多个可变区，作为第一种核酸(如上述)的相应物。本文所述的一或多种核酸可编码ScFv并可以是人或人化的。本发明的核酸优选置于可诱导的启动子(或其功能性衍生物)的控制下。
为获得从中易于分离所需免疫球蛋白的洁净且安全的生产系统，优选使用本发明方法，其中所述人体细胞不包括其它腺病毒序列。本发明的方法最优选的细胞是ECACC保藏号96022940的PER.C6或其衍生物。已发现PER.C6与例如通过腺病毒E1区而无限增殖化的转化的人293细胞相比更稳定，尤其更易使用。PER.C6细胞已精确定性并证实，表明具有良好的大规模生产，在悬浮液中生长及非依赖于生长因子等特点。另外，PER.C6可以高度可再生方式掺入悬浮液中，使其更适于大规模生产。为此，已确定PER.C6细胞系在生物反应器中可生长至非常高的密度。
本发明的细胞，尤其PER.C6，具有可在无动物或人血清，或动物或人血清组分的培养基中培养的优点。因此，分离单克隆抗体很简单，且由于培养基中没有另外的人或动物蛋白从而安全性增加。没有血清存在还提高系统的可靠性，因为使用本发明的合成培养基增强了再生性。本发明还提供了重组哺乳动物细胞在生产免疫球蛋白的至少一个可变区中的应用，所述细胞在其基因组中具有编码腺病毒的至少一种E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，该细胞不产生结构性腺病毒蛋白。在另一实施方案中，本发明提供了这样一种应用，其中所述细胞衍生自原代细胞，优选其中所述人体细胞是PER.C6细胞或其衍生物。
本发明还提供了一种应用，其中所述细胞在其基因组中还包含编码E2A(或其功能性衍生物，同源物或片段)的序列，优选E2A是温度敏感性的。另外，本发明提供了一种使用本发明的方法，其中所述细胞还包含反式激活蛋白以诱导所述可诱导的启动子。本发明还提供了根据本发明所得的免疫球蛋白。在另一实施方案中，本发明提供了一种人体细胞，该细胞在其基因组中具有编码腺病毒E1蛋白(或其功能性衍生物，同源物或片段)的序列，该细胞不产生结构性腺病毒蛋白，并具有编码人重组蛋白的基因，优选人体细胞衍生自保藏在ECACC中保藏号No.96022940的PER.C6。
在又一实施方案中，本发明提供了这样一种人体细胞，PER.C6/E2A，其在基因组中还包含编码E2A(或其功能性衍生物或类似物或片段)的序列，优选其中所述E2A是温度敏感性的。欲在本发明的细胞中表达的免疫球蛋白是本领域技术人员所知的。重组免疫球蛋白例如包括但非限于Herceptin，Rituxan(Rituximab)，CAMPATH-1H和15C5。
本发明还提供了在重组哺乳动物细胞中生产至少一个免疫球蛋白可变区的方法，其利用本发明的无限增殖的重组哺乳动物细胞，在适当培养基中培养，并从重组哺乳动物细胞和/或培养基中收获所选择的Ig的至少一个可变区。免疫球蛋白，免疫球蛋白的可变区，或其衍生物，可用于治疗哺乳动物或生产药物组合物。
本发明另一方面提供了生产非腺病毒或腺病毒蛋白的用作疫苗的病毒蛋白的方法，包括提供一种细胞，其具有编码腺病毒的E1基因或其功能性衍生物的至少一个基因产物的至少一个序列，提供给所述细胞以编码所述病毒蛋白的核酸，将所述细胞在适当培养基中培养，使所述病毒蛋白表达，并从所述培养基和/或所述细胞中收集病毒蛋白。直至本发明，很少发现(人体)细胞适于以任何可再生及可大规模生产方式和/或足够高的产量和/或易纯化方式，生产用作疫苗的病毒蛋白。我们现在发现优选在其基因组中包含腺病毒E1序列的细胞能大量生产病毒蛋白。
本发明优选的细胞衍生自人体原代细胞，优选细胞通过所述E1基因的产物而无限增殖。为了能生长，原代细胞当然需要无限增殖化。这种细胞例如是衍生自人胚胎成视网膜细胞的细胞。
本发明的细胞中重要的是在细胞周期期间，E1基因序列不丧失。因此优选编码E1基因的至少一个基因产物的所述序列存在于所述(人体)细胞的基因组中。考虑到安全原因，在本发明的细胞中最好避免有非所需的腺病毒序列。因此本发明的另一实施方案提供了不产生腺病毒结构蛋白的细胞。然而，为通过细胞培养大规模(持续)生产病毒蛋白，优选使细胞能不需贴壁而生长。本发明的细胞具有此能力。为获得从中易于回收及如果需要纯化病毒蛋白的洁净及安全的生产系统，优选使用本发明的方法，其中所述人体细胞不包含其它腺病毒序列。本发明使用的优选的细胞是在ECACC中保藏号No.96022940的PER.C6，或其衍生物。
因此，本发明提供了一种使用本发明细胞的方法，其中所述细胞还包含编码E2A或其功能性衍生物或类似物或片段的序列，优选细胞中所述编码E2A或其功能性衍生物或类似物或片段的序列，存在于所述人体细胞的基因组中，更优选的是细胞中所述E2A编码序列编码温度敏感性突变体E2A。另外，本发明还提供了一种方法，其中所述(人体)细胞能在悬浮液中生长。
本发明还提供了一种方法，其中所述人体细胞能在无血清的培养基中培养。本发明的细胞，尤其PER.C6所具有的另一优点是，其可在无血清或血清组分的培养基中培养。因此，分离是容易的，安全性增加且此系统的可靠性良好(合成培养基是再现性最好的)。本发明的人体细胞，尤其那些基于原代细胞和HER细胞的细胞，能正常翻译后及翻译期间修饰及装配。这意味着它们非常适用于制备用于疫苗中的病毒蛋白。
因此本发明提供了一种方法，其中所述病毒蛋白包含一种经过翻译后和/或翻译期间修饰的蛋白质，尤其其中所述修饰包含糖基化。此疫苗可用于接种人体，然而此疫苗在动物体内也有效。在此实施方案中，疫苗优选是根据本发明生产的，其中衍生所述细胞的物种与衍生疫苗中病毒蛋白的物种相同。病毒蛋白可以是完整病毒蛋白或其功能性等价物。病毒蛋白的功能等价物是病毒蛋白的至少一个免疫原部分。迄今无法以任何可靠方式生产的病毒疫苗例如是流感疫苗。本发明提供了一种方法，其中所述病毒蛋白包含至少流感病毒神经氨酸酶和/或血凝素之一。可根据本发明的方法生产的其它病毒蛋白(亚单位)包括来自如下病毒的蛋白，如肠道病毒如鼻病毒，口蹄疫病毒，或脊髓灰质炎病毒，疱疹病毒，如单纯疱疹病毒，假狂犬病病毒或牛疱疹病毒，正粘病毒如流感病毒，副粘病毒如新城疫病毒，呼吸道合胞病毒，腮腺炎病毒或麻疹病毒，逆转录病毒，如人免疫缺陷病毒或细小病毒或乳多空病毒，轮状病毒或冠状病毒，如传染性胃肠炎病毒或黄病毒，如壁虱脑炎病毒或黄热病病毒，披膜病毒，如风疹病毒或东方、西方或委内瑞拉马脑脊髓炎病毒，肝炎病毒，如甲型或乙型肝炎病毒，瘟病毒属，如猪瘟病毒，或弹状病毒，如狂犬病毒。本发明还提供了一种人体细胞在生产用于疫苗的至少一种病毒蛋白中的应用，该细胞在其基因组中具有编码腺病毒的至少一个E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，该细胞不产生结构性腺病毒。当然，对于这种应用，本发明方法中优选使用的细胞也是优选的。本发明还提供了得自本发明方法的产物，尤其根据本发明获得的病毒蛋白，特别是与适当的赋形剂和一些形式(亚单位)的佐剂组成药物组合物。如果从已注册的疫苗中不能得出，施用的剂量和途径通过正常临床测试而加以区分。
因此，本发明还提供了一种用于疫苗中的病毒蛋白，所述病毒蛋白没有任何非人哺乳动物蛋白质物质，本发明还提供了包含这种病毒蛋白的药物配方。
在一优选的实施方案中，本发明提供了根据本发明方法或应用获得的流感疫苗。
本发明另一方面提供了具有抗细胞程序死亡活性的腺病毒E1B蛋白或其功能性衍生物，同源物和/或片段在真核细胞中增加蛋白质物质产生中的应用，所述应用包括提供所述E1B蛋白，其衍生物，同源物和/或片段给所述真核细胞。在一优选的实施方案中，所述应用包括本发明的细胞。在另一优选的实施方案中，本发明还提供了所述应用在本发明方法和/或应用中的应用。
实施例
为举例说明本发明而提供了以下实施例，无限制本发明之意。人红细胞生成素(EPO)分子含有4个碳水化合物链，其中3个含有与天冬酰胺的N键，一个含有与丝氨酸残基的O键。糖基化在EPO的生物活性中的重要性已充分证实(Delorme等，1992；Yamaguchi等，1991)。将编码人EPO的cDNA克隆入PER.C6细胞和PER.C6/E2A细胞中并在其中表达，显示表达，并分析糖基化模式。
实施例1：构建基本表达载体
将质粒pcDNA3.1/Hygro(-)(Invitrogen)用NruI和EcoRV消化，在5’末端通过虾碱性磷酸酶(SAP，GIBCOLifeTech.)去磷酸化，并从凝胶中纯化出缺失巨细胞病毒CMV的立即早期增强子和启动子的质粒片段。将含有全长CMV增强子/启动子(-735～+95)及产生重组腺病毒的重叠腺病毒衍生序列的质粒pAdApt，用AvrII消化，用Klenow聚合酶补平，并用HpaI消化；从琼脂糖凝胶中纯化含有CMV增强子和启动子的片段。将此CMV增强子和启动子片段平端对平端地连接于pcDNA3.1/Hygro(-)的NruI/EcoRV片段。所得质粒称为pcDNA2000/Hyg(-)。
将质粒pcDNA2000/Hyg(-)用PmlI消化，并从凝胶中纯化出缺失潮霉素抗性标记基因的线性化质粒，并再连接。所得质粒称为pcDNA2000。将质粒pcDNA2000用PmlI消化并通过SAP在两端去磷酸化。将含有野生型人DHFR cDNA的质粒pIG-GC9(Havenga等，1998)，通过聚合酶链反应(PCR)在cDNA上游和下游导入非编码的PmlI位点，而获得野生型DHFR基因。所用PCR引物是：DHFR上游：5’GAT CCA CGT GAG ATC TCC ACC ATG GTT GGTTCG CTA AAC TG-3′，和DHFR下游：5’GAT CCA CGT GAG ATCTTT AAT CAT TCT TCT CAT ATAC-3′。将PCR产物用PmlI消化并连接于pcDNA2000(用PmlI消化并用SAP去磷酸化)中，以获得pcDNA2000/DHFRwt(图1)。野生型序列和正确使用的克隆位点通过双链测序证实。另外，人DHFR基因的突变体(DHFRm)，通过选择在具有高转录活性的基因组区域可能整合的转基因，用于在PER.C6和PER.C6/E2A细胞中达到10,000倍高的氨甲喋呤抗性。此突变体含有通过PCR导入的32位(苯丙氨酸取代为丝氨酸)和159位(亮氨酸取代为丙氨酸)氨基酸取代。对质粒pIG-GC12(Havenga等，1998)进行PCR用于获得人DHFR的突变体。此突变体的克隆与野生型DHFR克隆相似。用突变体DHFR所获质粒称为pcDNA2000/DHFRm。
将pIPspAdapt 6(Galapgos)用限制酶AgeI和BamHI消化。所得多接头片段具有以下序列：5’- ACC GGT GAA TTC GGC GCGCCG TCG ACG ATA TCG ATC GGA CCG ACG CGT TCG CGA GCGGCC GCA ATT CGC TAG CGT TAA C GG ATC C-3′。划线处为所用的AgeI和BamHI识别位点。此片段含有一些单一限制酶识别位点，经琼脂糖凝胶纯化及连接于AgeI/BamHI消化的并经琼脂糖凝胶纯化的质粒pcDNA2000/DHFRwt质粒。所得载体称为pcDNA2001/DHFRwt(图2)。
pIPspAdapt 7(Galapgos)用AgeI和BamHI限制酶消化，并具有以下序列：5’- ACC GGT GAA TTG CGG CCG CTC GCG AACGCG TCG GTC CGT ATC GAT ATC GTC GAC GGC GCG CCG AATTCG CTA GCG TTA AC G GAT CC-3′。下划线处是所用的AgeI和BamHI识别位点。此多接头片段含有一些单一限制酶识别位点(不同于pIPspAdapt 6)，其纯化自琼脂糖凝胶，并连接于AgeI/BamHI消化的及经琼脂糖凝胶纯化的pcDNA2000/DHFRwt。获得pcDNA2002/DHFRwt(图3)。
将pcDNA2000/DHFRwt用限制酶PvuII部分消化。在此质粒中有两个PvuII位点，在SV40 poly(A)和CoLEl之间的位点而非在BGH poly(A)下游的PvuII位点进行克隆。将质粒的单位点消化的混合物用SAP去磷酸化，并用Klenow酶平端化及自琼脂糖凝胶中纯化。将pcDNA2001/DHFRwt用MunI和PvuII限制酶消化，及用Klenow酶和游离核苷酸补平，使两端均为平端。将所得含有CMV启动子-接头-BGH poly(A)的片段从凝胶中分离，并与载体分离。将此片段连接于部分消化及去磷酸化的载体，检测方向及插入位点。所得质粒称为pcDNAs3000/DHFRwt(图4)。
实施例2：构建EPO表达载体
在成年人肝脏cDNA文库中使用寡核苷酸引物EPO-START：5’AAA AAG GAT CCG CCA CCA TGC GGG TGC ACG AAT GTCCTG CCT G-3′，和EPO-STOP：5’AAA AAG GAT CCT CAT CTGTCC CCT GTC CTG CAG GCC TC-3′(CambridgeBioscience公司)，通过PCR克隆全长人EPOcDNA。将扩增的片段克隆入用BamHI线性化的pUC18中。通过双链测序法检测序列。将含有在pUC18中的EPO cDNA的此质粒用BamHI消化，并将EPO插入序列自琼脂糖凝胶中纯化。质粒pcDNA2000/DHFRwt和pcDNA2000/DHFRm用BamHI线性化，并通过SAP在5’突出端去磷酸化，并将质粒从琼脂糖凝胶中纯化。将EPOcDNA片段连接于pcDNA2000/DHFRwt和pcDNA2000/DHFRm的BamHI位点；所得质粒称为pEPO2000/DHFRwt(图5)和pEPO2000/DHFRm。
质粒pMLPI.TK(如WO97/00326所述)是设计与改良的包装细胞系如PER.C6(如WO97/00326和US 08/892 873所述)组合使用的衔接子质粒的一实例。首先，用以下引物从pZipΔMo+PyF101(N-)模板DNA(见于PCT/NL96/00195所述)中产生PCR片段：LTR-1(5’-CTG TAC GTA CCA GTG CAC TGG CCT AGG CATGGA AAA ATA CAT AAC TG-3′)和LTR-2(5’-GCG GAT CCTTCG AAC CAT GGT AAG CTT GGT ACC GCT AGC GTT AAC CGGGCG ACT CAG TCA ATCG-3′)。然后将PCR产物用BamHI消化，并连接于用Pvu II和BamHI消化的pMLP10(Levrero等，1991)中，从而产生载体pLTR10。此载体含有腺病毒1-454bp序列，后接由Mo-MuLV的一部分组成的启动子，其野生型增强子由多瘤病毒突变体(PyF101)的增强子所取代。此启动子片段称为L420。接着，插入小鼠H SA基因的编码区。将p LTR10用BstBI消化随后通过Klenow处理及用NcoI消化。用以下引物在pUC18-H SA(Kay等，1990)上进行PCR扩增而获得HSA基因：HSA1(5’-GCG CCA CCATGG GCA GAG CGA TGG TGG C-3’)和HSA2(5’-GTT AGATCT AAG CTT GTC GAC ATC GAT CTA CTA ACA GTA GAG ATGTAG AA-3′)。将269bp的PCR片段用NcoI和Bgl II位点亚克隆入穿梭载体中。测序分析证实掺入正确的HSA基因编码序列，但在TAG终止密码子之后有额外的TAG插入体。包括TAG重复的HSA基因的编码区然后用NcoI/SalI酶切为片段，并克隆入经NcoI/BstBI酶切的3.5kb的p LTR 10中，产生p LTR-HSA10。将此质粒用EcoRI和BamHI消化，之后将含有剩余的ITR，包装信号，L420启动子和HSA基因的片段插入用相同酶消化的载体pMLPI.TK中，从而置换启动子和基因序列，产生新的衔接子质粒pAd5/L420-HSA。
将pAd5/L420-HSA质粒用Avr II和Bgl II消化，随后用Klenow处理，并连接于平端的1570bp的pcDNA1/amp[Invitrogen]的片段中，该片段是通过用HhaI和AvrII消化，随后用T4 DNA聚合酶处理而获得的。此衔接子质粒称为pAd5/CLIP。
为能从剩余的ITR中除去载体序列，将pAd5/L420-HSA用EcoRI部分消化，并分离线性化的片段。将序列为5’-TTA AGTCGA C-3′的寡聚物自身退火，产生具有SalI位点和EcoRI突出端的接头。将此接头连接于部分消化的pAd5/L420-HSA载体，并选择这样的克隆，该克隆中接头插入pAd5/L420-HSA中剩余的腺病毒ITR上游23bp的EcoRI位点中，产生pAd5/L420-HSA.sal。
为能从剩余的ITR中除去载体序列，将pAd5/CLIP也用EcoRI部分消化，并分离线性化的片段。将EcoRI接头5’-TTA AGT CGAC-3′连接于部分消化的pAd5/CLIP载体，并选择这样的克隆，该克隆中接头插入剩余的腺病毒ITR上游23bp的EcoRI位点中，产生pAd5/CLIP.sal。对载体pAd5/L420-HSA也进行修饰以产生位于剩余的ITR上游的PacI位点。之后，将pAd5/L420-HSA用EcoRI消化，并连接于PacI接头(5’-AAT TGT CTT AAT TAA CCG CTTAA-3’)。将此连接混合物用PacI消化，并在琼脂糖凝胶中分离线性化DNA以除去串联的接头之后再连接。由此产生衔接子质粒pAd5/I420-HSA.pac。
将此质粒用AvrII和Bgl II消化。将此载体片段与用相同限制酶消化的接头寡核苷酸连接。此接头是通过退火以下序列的寡聚物而产生的：PLL-1(5’-GCC ATC CCT AGG AAG CTT GGT ACCGGT GAA TTC GCT AGC GTT AAC GGA TCC TCT AGA CGA GATCTG G-3′)和PLL-2(5’-CCA GAT CTC GTC TAG AGG ATCCGT TAA CGC TAG CGA ATT CAC CGG TAC CAA GCT TCC TAGGGA TGG C-3’)。将退火的接头分别连接于Avr II/Bgl II消化的pAd5/L420-HSA.pac片段，产生pAdMire.pac。随后，将含有sal接头的0.7kb的pAd5/CLIP.sal的ScaI/BsrGI片段，在除去含有pal接头的片段之后，克隆入pAdMire.pac质粒的ScaI/BsrGI位点中。所得质粒称为pAdMire.sal。
将质粒pAd5/L420-HSA.pac用AvrII消化，并将5’突出端用Klenow酶补平。用HindIII的第二次消化除去L420启动子序列。分离载体片段并分别连接于含有CMV启动子序列的PCR片段中。此PCR片段是用以下引物从pCMVLacI(Stratagene)中扩增CMV序列之后而获得的：CMVplus(5’-GAT CGG TAC CAC TGC AGTGGT CAA TAT TGG CCA TTA GCC-3’)和CMVminA(5’-GATCAA GC TTC CAA TGC ACC GTT CCC GGC-3’)。将此PCR片段首先用PstI消化，然后通过T4 DNA聚合酶处理除去3’突出端。接着将此DNA用Hind III消化并连接于经Avr II/Hind III消化的pAd5/L420-HAS.pac载体中。所得质粒称为pAd5/CMV-HAS.pac。将此质粒随后用Hind III和BamHI消化，分离载体片段并连接于经Hind III/Bgl II消化后的pAdMire.pac的多接头序列中。所得质粒称为pAdApt.pac，并含有人CMV启动子/增强子(BoshartM等，1985)的-735～+95位核苷酸。将含有用于正确翻译的完全Kozak序列的全长人EPOc DNA(Genbank登记号：M11319)，在经BamHI消化后从pUC18主链中取出。将此cDNA插入体经琼脂糖凝胶纯化并连接于pAdApt.pac中，该pAdApt.pac也用BamHI消化，接着在5’和3’插入位点用SAP去磷酸化，并也经琼脂糖凝胶纯化，以除去短BamHI-BamHI接头序列。将所得环状质粒用KpnI，DdeI和NcoI限制消化检测，均示出正确条带。另外，通过双链测序法确定方向和序列。所得具有正确方向的人EPOc DNA的质粒称为pAdApt.EPO(图6)。
实施例3：构建UBS-54表达载体
包含内含子序列和连接(“铰链”)区的人免疫球蛋白G1(IgG1)基因的重链恒定区(CH1，CH2和CH3)，是用上游和下游引物通过PCR产生的。上游引物(CAMH-UP)序列是5’-GAT C GA TAT CGC TAG CAC CAA GGG CCCATC GGT C-3′，其中退火核苷酸以斜体字表示，两个相接的限制酶识别位点(EcoRV和NheI)是下划线处。
下游引物(CAMH-DOWN)的序列是：5’-GAT C GT TTA AAC TCA TTT ACC CGG AGA CAG-3’，其中退火核苷酸以斜体字表示，导入的PmeI限制酶识别位点是划线处。
人IgG1重链的各区域如下排列：CH1-内含子-铰链-内含子-CH2-内含子-CH3。在质粒(pCMgamma NEO Skappa VgammaCgamma hu)上进行PCR，所述质粒含有抗人血纤蛋白原的D二聚体(Vandamme等，1990)的人化抗体的重链。此抗体称为15C5，且其人化是通过导入包括内含子序列的人恒定区而进行的(Bulens等，1991)。
PCR产生1621个核苷酸的产物。导入NheI和PmeI位点以易于克隆入pcDNA2000/Hyg(-)多接头中。NheI位点编码二个氨基酸(Ala和Ser)，其是恒定区CH1的一部分，但不与模板中存在的DNA杂交(Crowe等，1992)。
将PCR产物用NheI和PmeI限制酶消化，经琼脂糖凝胶纯化，并连接于经NheI和PmeI消化及琼脂糖凝胶纯化的pcDNA2000/Hygro(-)中。产生质粒pHC2000/Hyg(-)(图7)，其可用于将包括内含子的人重链恒定区连接于任何鉴别的免疫球蛋白重链的任何可能的可变区，以进行人化。
人免疫球蛋白(IgG1)基因的轻链恒定区，是用上游和下游引物通过PCR产生的。上游引物(CAML-UP)的序列是5’-GAT C CG TAC GGT GGC TGC ACC ATC TGT C-3′，其中退火核苷酸以斜字体表示，导入的SunI限制酶识别位点是下划线处。下游引物(CAML-DOWN)的序列是5’-GAT C GT TTA AAC CTA ACA CTC TCCCCT GTT G-3’，其中退火核苷酸以斜字体表示，导入的PmeI限制酶识别位点是下划线处。在质粒(pCMkappa DHFR13 15C5 kappa人化的)上进行PCR，该质粒携带连接于人IgG1轻链恒定区的15C5小鼠信号序列和小鼠轻链可变区(Vandamme等，1990；Bulens等，1991)。
PCR产生340个核苷酸的产物。导入SunI和PmeI位点以克隆入pcDNA2001/DHFRwt多接头。SunI位点编码两个氨基酸(Arg和Thr)，其苏氨酸残基是人免疫球蛋白轻链恒定区的一部分，而精氨酸是CAMPATH-1H(Crowe等，1992)的可变区的一部分。这使得随后可进行3’克隆入质粒唯一的SunI位点。将PCR产物用SunI和PmeI限制酶消化，经琼脂糖凝胶纯化，连接于经BamHI，PmeI消化的及琼脂糖凝胶纯化的用Klenow酶和游离核苷酸平端化的pcDNA2001/DHFRwt中。正确方向的连接导致在5’端丧失BamHI位点，及保留SunI和PmeI位点。所得质粒称为pLC2001/DHFRwt(图8)，该质粒可用于将人轻链恒定区连接于任何鉴别的免疫球蛋白轻链的任何可能的可变区以人化。
pNUT-C gamma(Huls等，1999)含有人IgG1重链恒定区，内含子和绞链区(Huls等，1999)，并在第一个恒定区上游接受由以下前导肽序列为先导的完全人化的单克隆抗体UBS-54的γ链可变区，所述前导肽序列为：MACPGFLWALVISTCLEFSM(序列：5’-ATG GCA TGC CCT GGC TTC CTG TGG GCA CTT GTG ATCTCC ACC TGT CTT GAA TTT TCC ATG-3′)。所产生的插入体长度大约为2kb。完整的γ链是用上游引物(UBS-UP)和下游引物CAMH-DOWN通过PCR扩增的。UBS-UP的序列为5′-GAT C AC GCG TGC TAG CCA CCA TGG CAT GCC CTG GCT TC-3′其中导入的MluI和NheI位点是下划线处，完全的Kozak序列是斜体字处。将所得PCR产物用NheI和PmeI限制酶消化，经琼脂糖凝胶纯化并连接于pcDNA2000/Hygro(-)质粒，该质粒也是用NheI和PmeI消化，用tSAP去磷酸化并经凝胶纯化的。所得质粒称为pUBS-Heavy2000/Hyg(-)(图9)。pNUT-C kappa含有人IgG1 kappa(Huls等，1999)轻链恒定区，及接受由以下前导肽为先导的完全人化的单克隆抗体UBS-54kappa链的可变区，所述前导肽为：MACPGFLWALVISTCLEFSM(序列：5’-ATG GCA TGC CCT GGCTTC CTG TGG GCA CTT GTG ATC TCC ACC TGT CTT GAA TTTTCC ATG-3’，关于此质粒的详述见UbiSys所述)。产生的插入体长度大约为1.2kb。完整的插入体是用上游引物UBS-UP和下游引物CAML-DOWN通过PCR扩增的，以此修饰翻译起始位点。将所得PCR产物用NheI和PmeI限制酶消化，经琼脂糖凝胶纯化，并连接于pcDNA2001/DHFRwt中，产生pUBS-Light2001/DHFRwt(图10)，pcDNA2001/DHFRwt也是用NheI和PmeI消化的，用tSAP去磷酸化并经凝胶纯化的。为除去位于pNUT-Cgamma中可变区和第一个恒定区之间的额外内含子，及将信号肽和可变区与野生型人IgG1重链恒定区连接，缺失pNUT-Cgamma中羧基末端恒定区中的许多多态性，用UBS-UP和具有以下序列的UBSHV-DOWN引物产生PCR产物：5’-GAT C GC TAG CTG TCG AGA CGG TGACCA G-3′，其中导入的NheI位点是下划线处，退火核苷酸以斜体字表示。所得PCR产物用NheI限制酶消化，经凝胶纯化并连接于经NheI消化和SAP去磷酸化的，及经凝胶纯化的pHC2000/Hyg(-)质粒中。具有正确方向的插入体和开放读框称的该质粒为pUBS2-Heavy2000/Hyg(-)(图11)。
为除去位于pNUT-Ckappa中可变区和恒定区之间的额外内含子，及将信号肽和可变区连接于人IgG1轻链的野生型恒定区，用UBS-UP和具有以下序列的UBSLV-DOWN引物产生PCR产物：5’-GAT C CG TAC GCT TGA TCT CCA CCT TGG TC-3′，其中导入的SunI位点是下划线处，退火核苷酸是黑体字处。然后将所得PCR产物用MluI和SunI限制酶消化，经凝胶纯化，并连接于经MluI和SunI消化的，经凝胶纯化的pLC2001/DHFRwt质粒中。所得质粒称为pUBS2-Light2001/DHFRwt(图12)。UBS-54的全长重链的PCR产物用NheI和PmeI限制酶消化，并用Klenow酶平端化。将此片段连接于质粒pcDNAS3000/DHFRwt中，该质粒用BstXI限制酶消化，平端化，通过SAP去磷酸化并经凝胶纯化。具有重链插入体的质粒称为pUBS-Heavy3000/DHFRwt。接着，将轻链的PCR产物用MluI和PmeI限制酶消化，平端化，经凝胶纯化，并连接于pUBS-Heavy3000/DHFRwt中，该质粒用HpaI消化，通过tSAP去磷酸化并经凝胶纯化。所得载体称为pUBS-3000/DHFRwt(图13)。将编码不含可变区和第一个恒定区之间的内含子，但具有野生型羧基端恒定区的UBS-54的重链的基因(2031个核苷酸)，在用EcoRI和PmeI消化pUBS2-2000/Hyg(-)，及用Klenow酶和游离核苷酸平端化EcoRI位点之后，经凝胶纯化。接着，将该插入体连接于pcDNAs3000/DHFRwt质粒，该质粒用BstXI消化，平端化，用SAP去磷酸化并经凝胶纯化。所得质粒称为pUBS2-Heavy3000/DHFRwt。然后将pUBS2-Light2001/DHFRwt用EcoRV和PmeI消化，并将含有信号肽以及相连接的UBS-54的Kappa链的可变区和没有内含子序列的人IgG1Kappa链的恒定区的755个核苷酸插入体经凝胶纯化，并连接于pUBS2-Heavy3000/DHFRwt中，该质粒用HpaI消化，用tSAP去磷酸化并经凝胶纯化。所得质粒称为pUBS2-3000/DHFRwt(图14)。
将质粒pRc/CMV[Invitrogen]用BstBI限制酶消化，用Klenow酶平端化，接着用XmaI酶消化。将含有新霉素抗性基因的此片段经琼脂糖凝胶纯化，并连接于pUBS-Light2001/DHFRwt质粒，该质粒用XmaI和PmlI限制酶消化，随后用SAP去磷酸化并经凝胶纯化以除去DHFRcDNA。所得质粒称为pUBS-Light2001/Neo。将此片段也连接于经XmaI/PmlI消化及凝胶纯化的pcDNA2001/DHFRwt质粒，产生pcDNA2001/Neo。将UBS-54可变区的PCR产物和消化及纯化的恒定区PCR产物用于与MluI/PmeI消化的pcDNA2001/Neo三点连接。所得质粒称为pUBS2-Light2001/Neo。
实施例4：构建CAMPATH-1H表达载体
Cambridge生物科学公司(英国)生产了一种396个核苷酸的片段，其含有完整的Kozak序列，后接公布的CAMPATH-1H轻链的信号序列和可变区(Crowe等，1992)。此片段在5’末端含有导入的和单一的Hind III位点，在3’末端含有导入的和单一的SunI位点，将此片段导入适当的穿梭载体中。将此质粒用Hind III和SunI消化，并将所得CAMPATH-1H轻链片段经凝胶纯化，并连接于经Hind III/SunI消化和琼脂糖凝胶纯化的pLC2001/DHFRwt中。所得质粒称为pCAMPATH-Light2001/DHFRwt。Cambridge生物科学公司(英国)生产了一种438个核苷酸的片段，其含有完整的Kozak序列，后接CAMPATH-1H重链可变区的信号序列和公布的可变区(Crowe等，1992)，将此片段克隆入适当的克隆载体中。此产物在5’末端含有单一的Hind III限制酶识别位点，在3’末端含有单一的NheI限制酶识别位点。此质粒用Hind III和NheI消化，所得CAMPATH-1H重链片段经凝胶纯化，并连接于纯化的及经Hind III/NheI消化的pHC2000/Hyg(-)中。所得质粒称为pCAMPATH-Heavy2000/Hyg(-)。
实施例5；构建15C5表达载体
抗人血纤蛋白片段D二聚体的人化形式的单克隆抗体15C5的重链(Bulens等，1991；Vandamme等，1990)，由包含内含子序列的人恒定区，绞链区和可变区及前导的来自15C5kappa轻链的信号肽组成，其是用质粒“pCMgamma NEO Skappa Vgamma Cgammahu”作模板用CAMH-DOWN作下游引物，和15C5-UP作上游引物，通过PCR而扩增。15C5-UP引物具有以下序列：5’-GA TC A CGC GTG CTA GCC ACC ATG GGT ACT CCT GCT CAG TTT CTT GGAATC-3′，其中导入的MluI和NheI限制酶识别位点是下划线处，完整的Kozak序列是斜体字处。为适当的导入合适的Kozak结构，在+4位的腺嘌呤(ATG起始密码子中腺嘌呤是+1位)用鸟嘌呤置换，导致精氨酸突变为甘氨酸。为防止引物二聚体化，将+6位的鸟嘌呤用胸腺嘧啶置换，+9位的胞嘧啶用胸腺嘧啶置换。后一种突变中苏氨酸残基保持原样。所得PCR产物用NheI和PmeI限制酶消化，经凝胶纯化并连接于经NheI和PmeI消化的，及通过SAP去磷酸化和凝胶纯化的pcDNA2000/Hygro(-)中。所得质粒称为p15C5-Heavy2000/Hyg(-)。抗人血纤蛋白片段D二聚体的人化形式单克隆抗体15C5的轻链(Bulens等，1991；Vandamme等，1990)，由人恒定区和可变区以及前导的20个氨基酸的信号肽组成，将其用质粒pCMkappaDHFR1315C5 kappahu作模板，用CAML-DOWN作下游引物，15C5-UP作上游引物，通过PCR扩增。所得PCR产物用NheI和PmeI限制酶消化，经凝胶纯化并连接于经NheI和PmeI消化的，及通过SAP去磷酸化及经琼脂糖凝胶纯化的pcDNA2001/DHFRwt中。所得质粒称为p15C5-Light2001/DHFRwt。
实施例6：确定氨甲喋呤、潮霉素和G418选择水平
将PER.C6和PER.C6/E2A以不同密度种植。在这些敏感性研究中氨甲喋呤(MTX)的起始浓度范围在0nM至2500nM之间。确定这两种细胞系的致死浓度；当在6孔平皿中细胞以100,000个细胞/孔的密度种植时，在10nM浓度每孔仍100％铺满，在25nM浓度，90-100％铺满，而在50nM浓度大多数细胞被杀死，在温育6-15天之后则更多细胞被杀死。这些结果概括示于表1。对PER.C6细胞测试其对潮霉素和G418组合的抗性，以选择突出生长的稳定集落，该集落表达由携带潮霉素或新霉素抗性基因的质粒编码的各重组单克隆抗体的重链和轻链。当细胞在含有100μg/ml潮霉素和250μg/ml G418的正常培养基上生长时，未转染的细胞被杀死，稳定的集落可显现(见实施例7)。
将CHO-dhfr细胞ATCC：CRL9096以不同浓度种植于各自的培养基中。在这些敏感性研究中氨甲喋呤的起始浓度范围在大约0.5nM至500nM之间。确定此细胞系的致死浓度，接着在IgG重链选择(hyg)和轻链选择(dhfr)的情况中在潮霉素中生长选择之后，直接使用。
实施例7：转染EPO表达载体以获得稳定的细胞系
将PER.C6和PER.C6/E2A细胞系的细胞以大约2-3×106个细胞/平皿种植于40个组织培养平皿(直径10cm)中，并在各自的条件下保持过夜(PER.C6/E2A的条件为39℃，10％ CO2浓度，PER.C6的条件为37℃，10％ CO2浓度)。第二天，在37℃用Lipofectamine(Gibco)进行转染。在用新鲜培养基(DMEM)置换4小时之后，将PER.C6/E2A细胞再移至39℃环境中，而PER.C6/E2A细胞保持37℃。将每个细胞系的20个平皿用5μg经ScaI消化的pEPO2000/DHFRwt转染，另20个平皿用5μg经ScaI消化的pEPO2000/DHFRm转染。另13个平皿作为氨甲喋呤杀伤力和转染效率的阴性对照，转染效率为大约50％。第二天，在溶解于含有透析的FBS的培养基中的DHFRwt中加入浓度为100-1000nM的MTX，在DHFRm中加入浓度为50.000-500.000nM的MTX。将细胞温育4-5周。每2-3天更换一次组织培养基(含有MTX)。监测细胞每天的死亡情况，将阳性与阴性对照结果相比较。挑取突出生长的集落并亚克隆。在接受突变体DHFR基因的转染体中不能传代培养阳性克隆，主要是由于所应用的高浓度MTX的毒性效应所致。从用野生型DHFR基因转染的PER.C6和PER.C6/E2A细胞中，只有当细胞在100nMMTX中生长时在第一代中可建立细胞系。尽管在250和500nM MTX的平皿中呈现集落，这些克隆在传代培养期间无价值，将其杀死。
实施例8：转染的细胞的传代培养
将从每个细胞系中选择的大约50个对MTX阈值浓度有抗性的集落，以其各自的培养基加上MTX生长于96孔，24孔，6孔平板和T25瓶中。当细胞在T25组织培养瓶中生长时，将每个克隆的至少一个小瓶冷冻储存，随后测试人重组EPO的产生。为此，使用购自R&D系统的ELISA试剂盒(Quantikine IVD human EPO，Quantitative Colorimetric Sandwich ELISA，cat.#DEPOO)。由于不同的克隆呈现不同的生长特性和生长曲线，EPO生产标准设定如下：开始时将细胞种植于T25组织培养瓶中，浓度为0.5-1.5×106个细胞/瓶。在第4天，取上清并用于EPOELISA中。由此生产水平设定为ELISA单位/106个种植的细胞/天(U/1E6/天)。这些克隆中的一些见表2所示。
良好生产克隆是基于高表达，培养行为及生存性选择的。为检测在延期生长期间在滚瓶和生物反应器中的长期生存性，悬浮生长能力，将最佳生产克隆的多个小瓶冷冻，并选择以下每个细胞系的最佳生产者进行进一步研究：P8，P9，E17和E55，其中“P”代表PER.C6，“E”代表PER.C6/E2A。将这些克隆传代培养并在2个月内提高氨甲喋呤剂量。从区域值浓度开始，并提高至0.2m M。在这两个月期间，定期进行EPO ELISA试验，以检测EPO产生量的增加情况。在最高氨甲喋呤浓度，选择最稳定的生产者，与得自最佳CHO克隆的数量进行对比，并用于细胞存库(RL)。将所有其它克隆的5个小瓶冷冻。通过Southern印迹分析检测扩增的EPOc DNA拷贝数目。
实施例9：在生物反应器中生产EPO
将产生EPO的最佳转染PER.C6的稳定细胞系，P9，置于悬浮液中并按比例扩容至1-2升发酵罐中。为将P9置于悬浮液中，用PBS冲洗贴壁细胞，接着用PER.C6的JRHExCeLL525培养基(JRH)温育，之后细胞自瓶中脱落，形成悬浮培养物。将细胞保持在两种浓度的MTX中：0nM和100nM。在这些浓度中(在滚瓶)达到的EPO的一般生产水平分别为1500和5700单位/106种植的细胞/天。尽管在没有MTX的情况下产量较低可解释为由于整合的DNA除去所致，但似乎也有整合的DNA的抑制效应，因为在较低浓度MTX中长期保持的细胞当它们再一次移至100nMMTX浓度时能达到它们从前的产量(见实施例11)。
将悬浮的P9细胞与100nM MTX正常培养生长，并用于接种生物反应器。对两种生物反应器设定进行测试；灌流和重复分批培养。
A：在2升生物反应器中灌流
将细胞以0.5×106个细胞/ml浓度种植，并在细胞达到大约2.3×106个细胞/ml密度之后3天开始灌流。灌流速率为每24小时1体积，流量为每24小时250ml。在此设定中，P9细胞停留在大约5×106细胞/ml的恒定密度下，且几乎95％的生存力超过一个月。定期确定EPO浓度并示于图15。在2升灌流的生物反应器中，P9细胞能保持大约6000ELISA单位/ml的生产水平。灌流速率为1工作体积/天(1.5-1.6升)时，这意味着在此2升生物反应器中，在没有MTX的情况下，P9细胞生产大约1×107单位/天/2升生物反应器。
B.在2升生物反应器中重复分批培养
将在滚瓶中生长的P9悬浮细胞接种于没有MTX的2升生物反应器中，并至生长为大约1.5×106个细胞/ml密度，之后除去1/3的细胞群(每2-3天±1升)，并将剩余的培养物用新鲜培养基稀释至密度为0.5×106个细胞/ml。将此步骤重复3周，工作体积保持在1.6升。确定除去的培养基中EPO浓度，结果示于图16。平均浓度为大约3000 ELISA单位/ml。对平均2天后将细胞群稀释，这意味着在此2升生物反应器中，在没有MTX的情况下，P9细胞生产大约1.5×106单位/天。
C.在具有不同浓度溶解氧，温度和pH设定值的1升生物反应器中重复分批培养
将P9悬浮细胞在存在100nM MTX的情况下，在滚瓶中生长，并用于接种4×1升生物反应器，至在JRH ExCeLL525培养基中密度为0.3×106个细胞/ml。在3′5和7天后确定EPO产量。测试的第一种设定值是：溶解氧的浓度(％DO)为0.5％，10％，150％，阳性对照为50％。50％DO是正常保持PER.C6和P9细胞的条件。在另一试验中，在不同温度下(32℃，34℃，37℃和39℃)接种P9细胞并测试EPO产量，其中37℃是PER.C6和P9细胞的正常设定值。在又一试验中，在不同pH值(pH6.5，pH6.8，pH7.0和pH7.3)下接种新鲜P9细胞并测试EPO产量。PER.C6细胞在pH7.3的情况下正常保持。EPO产量(在种植3天后)结果示于图17。明显地，当温度从32℃升至39℃时，EPO浓度增加，PER.C6/E2A细胞在39℃也可见到此结果(表4)，且50％DO对P9细胞而言是测试范围内最佳的。在pH6.5，细胞不能存活，因为在此生物反应器中的存活性在7天之后降低80％。对在这些设定值中产生的EPO样品检测糖基化及在2D电泳中的电荷情况(也见于实施例17)。
实施例10：扩增DHFR基因
将实施例8所述的一些细胞系用于扩增试验，以确定在2个月以上的时间内，通过提高MTX浓度而发生的DHFR基因数目增加的可能性。起始浓度为阈值浓度(100nM)，并以200nM，400nM，800nM和1200nM梯度加至1800nM。在此期间，定期进行EPO ELISA试验，以检测每天每106个种植的细胞的ELISA单位数(图18)。在最高MTX浓度(1800nM)，冷冻一些小瓶。从中获取细胞沉淀，提取DNA并接着用Bgl II消化，因为此酶在p EPO2000/DHFRwt中的野生型DHFR基因附近切割(图5)，因此这种大小的独特DHFR条带可与Southern印迹中内源性DHFR条带相区别。将此DNA进行印迹，并将印迹与放射性DHFR探针杂交，接着用腺病毒E1探针作背景对照(图19)。在磷光显影仪中测定杂交条带的强度，并对背景水平校正。结果示于表3。明显地，尽管在此情况下只有内源性DHFR而无整合的载体，仍可在PER.C6细胞中获得扩增的DHFR基因。
实施例11：在稳定的细胞系中EPO表达的稳定性
将实施例8中所述的一些细胞系在有或无MTX的情况下长期培养。定期测定EPO浓度，其中细胞以1.0-1.5×106个细胞/T25瓶的密度种植，培养4天，计算每天每106个种植的细胞产生的EPO的水平。结果示于图20。从中可得出当细胞在存在MTX的情况下培养时，EPO在P9细胞中相对稳定表达，在没有MTX的情况下，EPO产量降低。然而，当P9细胞在无MTX的情况下长期培养之后再置于100nM MTX中时，EPO表达水平达到其原始水平(±3000ELISA单位/106个种植的细胞/天)，推测整合的质粒被抑制但是稳定整合的，并能再次恢复生产。P8和P9细胞之间似乎有差异，因为在存在MTX的情况下P8的生产水平在后期降低(图20A)，而P9的生产水平至少稳定62代(图20B)。
实施例12：在质粒DNA转染后，在贴壁细胞和悬浮细胞中重组EPO的瞬时表达
pEPO2000/DHFRwt，pEPO 2000/DHFRm和pAdApt.EPO质粒经层析纯化自大肠杆菌，并用Lipofectamine，电穿孔，PEI或其它方法转染。计数PER.C6或PER.C6/E2A细胞，并种植于DMEM+血清或JRHExCell 525培养基或适当的培养基中，以悬浮转染。根据本领域技术人员已知方法，依赖于所用的转染方法，在37℃进行转染16小时。接着将细胞置于不同温度下，并将培养基用有或无血清的新鲜培养基置换。在必需获取完全没有血清组分的培养基的情况下，在3小时后再除去无血清的新鲜培养基，再用无血清组分的培养基置换。为确定重组EPO产量，在不同时间取样品。重组蛋白的产量用ELISA试剂盒(R&D Systems)确定，其中1单位等于大约10ng重组的CHO细胞产生的EPO蛋白(100,000单位/mg)。用于这些试验的细胞，由于其起源，特性和温度不同，而以不同速率生长。考虑用于ELISA试剂盒中的抗血清在非糖基化和高糖基化的重组EPO之间没有辨别力，因此重组EPO的产量以ELISA单位/106种植的细胞/天计算。通常地，用于这些计算的样品在转染后置换培养基4天后取得。
在37℃用Lipofectamine转染，接着在39℃在有血清的情况中生长的PER.C6/E2A细胞，典型地生产3100单位/106个细胞/天。在不用任何无血清培养基再置换而不存在血清组分时，这些Lipofectamine转染的细胞典型地生产2600单位/106个细胞/天。在37℃用Lipofectamine转染，接着在37℃在有血清的情况下生长的PER.C6细胞，典型地生产750单位/106个细胞/天，在无血清情况下生产590单位/106个细胞/天。为进行对比，将相同表达质粒pEPO2000/DHFRwt和pEPO 2000/DHFRm用于转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO，ECACCNo.85050302)，使用Lipofectamine，PEI，磷酸钙方法及其它方法。当CHO细胞用Lipofectamine转染，接着在有血清的HamsF12培养基中培养时，产量为190单位/106个细胞/天。在无血清培养基中培养时，产量为90单位/106个细胞/天，在DMEM中转染时可获得较高产量。
将含有贴壁的PER.C6/E2A细胞的不同平板在37℃也用pEPO2000/DHFRwt质粒转染，接着置于32℃，34℃，37℃或39℃下，以确定温度对重组EPO产生的影响。从培养4天的样品中计算结果是温度依赖性产量水平在250-610单位/106个种植的细胞/天，由此推测在PER.C6和PER.C6/E2A之间观测到的产量水平不同部分是由于温育温度所致(也见于实施例17)。由于PER.C6/E2A在37℃生长良好，其它研究均在37℃进行。
将含有贴壁的PER.C6和PER.C6/E2A细胞的不同平板，用pEPO2000/DHFRwt，pEPO2000/DHFRm和pAdApt.Epo经Lipofectamine转染。在转染4小时后，将DMEM用另一含血清的DMEM培养基或无血清的JRH培养基置换，几天后EPO在上清中累积，确定在不同培养基中产生的EPO浓度。将PER.C6细胞在37℃温育，而PER.C6/E2A细胞保持在39℃。从不同质粒所得数据进行平均，因为它们含有相似的表达盒。从培养6天的样品中计算结果如下：在DMEM中生长的PER.C6产量为400单位/106种植细胞/天，当它们保持在JRH培养基中时，其产量为300单位/106种植细胞/天。在DMEM中生长的PER.C6/E2A产量为1800单位/106种植细胞/天，当它们保持在JRH培养基中时，其产量为1100单位/106种植细胞/天。在PER.C6和PER.C6/E2A中再一次观测到产量水平明显不同，尽管这可部分是由于温度不同所致(如上所述)。然而在DMEM培养基和JRH培养基中，PER.C6/E2A细胞的产量也明显不同，这种效果在PER.C6细胞中几乎完全不存在。
在此系统中所得的EPO表达数据概括示于表4。PER.C6及其衍生物可按比例扩大用于DNA转染系统。根据Wurm和Bernard(1999)所述，对悬浮细胞的转染可在1-10升装置中进行，其中经电穿孔可得到1-10mg/L(0.1-1pg/细胞/天)的重组蛋白产量。需要这样的系统，其能良好控制且产量更高，尤其筛选在稳定装置中不能产生的大量蛋白质和毒性蛋白时。对最佳的PER.C6细胞在无血清的情况下用Lipofectamine转染，所得产量为590单位/106细胞/天(±5.9pg/细胞/天，当1ELISA单位大约为10ngEPO时)，而PER.C6/E2A的产量为31pg细胞/天(在有血清的情况下)。用于悬浮培养PER.C6和PER.C6/E2A的培养基(JRH ExCell 525)不支持用类似PEI的组分有效地瞬时DNA转染。因此将培养基调节为在用含有重组人EPO cDNA的pEPO2000/DHFRwt和pEPO2000/DHFRm，和含有编码重组蛋白的其它cDNA’s的pcDNA2000/DHFRwt转染后，能产生重组EPO。
在经调节的支持用纯化的质粒DNA瞬时DNA转染的培养基中生长的1-10升PER.C6和PER.C6/E2A的悬浮培养物，通过电穿孔或其它方法，用相同表达质粒进行转染。几小时后，除去转染培养基，用无血清的新鲜培养基置换。使重组蛋白在上清中累积几天，之后收集上清并除去所有细胞。将上清用于下游加工以纯化重组蛋白。
实施例13：产生AdApt.EPO重组腺病毒
在适当细胞系中通过本领域技术人员已知方法，用pWE/Ad.Afl II-rITR.tetO-E4，pWE/Ad.Afl II-rITR.ΔE2A，pWE/Ad.Afl II-rITR.ΔE2A，tetO-E4粘粒与pAd.Apt.EPO共转染。接着将细胞在其适当温度下保持几天，直至观测到全部cpe。然后将细胞通过几次冷冻/融解步骤以从细胞中释放所有病毒，之后将细胞碎片离心。就IGAd5/AdAptEPO.dE2A而言，将上清用于感染细胞，随后通过几次稀释经琼脂糖覆盖而进行噬斑纯化。几天后，当在最高稀释液中可明显见到单个的噬斑时，挑取9个噬斑和一个阴性对照(在明显的噬斑之间挑取细胞，从而几乎不含病毒)，并检测在A549细胞上的EPO产量。所有挑取噬斑的病毒均是阳性的，阴性对照不产生重组蛋白。将一阳性生产者用于感染适当的细胞，并将病毒从T25烧瓶开始增殖至滚瓶装置中。滚瓶中上清用于纯化病毒，之后确定病毒颗粒(vp)数目，并与通过本领域已知方法确定的感染单位(IU′s)数目相对比。然后确定vp/IU比率。
实施例14：用IGAd5/AdAptEPOdE2A感染贴壁和悬浮的PER.C6细胞
将实施例13中纯化的病毒用于在PER.C6细胞及其衍生物中瞬时表达重组EPO。IG.Ad5/AdApt.EPO.d E2A病毒用于感染PER.C6细胞，而IG.Ad5/AdApt.EPO.tetOE4和IG.Ad5/AdApt.EPO.d E2A.tetOE4病毒可用于感染PER.C6/E2A细胞，以使复制的可能性较低，并另外防止由于复制所致的重组蛋白产生受抑制。在适当的培养基中，在感染复数(moi)在20，200，2000，20000vp/细胞范围，对贴壁的细胞及悬浮的细胞进行感染。在6孔平板至滚瓶的不同装置中，进行4小时感染，之后除去含有病毒的上清。用PBS冲洗细胞或直接更换新培养基。然后使细胞产生重组EPO若干天，其间取样并确定EPO产量。对与死亡细胞相比存活的细胞数也进行检测。再以ELISA单位/1E6种植的细胞/天计算产生的EPO量，因为不同的细胞系由于代次和环境因素如温度及选择压力而有不同的生长特性。将生长PER.C6细胞的悬浮液种植于滚瓶中的250ml JRHExCell525培养基中(106个细胞/ml)，接着用纯化的IG.Ad5/AdApt.EPO.dE2A病毒，以moi为200vp/细胞感染。用于vp测定的估值较高(vp/IU比率为330，表示moi为0.61 IU/细胞)。因此，不是所有的细胞均被感染病毒击中。在取自此设定值培养6天的样品中，重组EPO的典型产量为190单位/106种植的细胞/天，而在包括存活和死亡细胞的培养基50％由新鲜培养基更换的情况下，产量为大约240单位/106细胞/天。更换培养基不影响存活细胞的存活性，但除去的重组蛋白可加入在试验末期所得的量中。将moi设定为20vp/细胞，类似于大约0.06感染单位/细胞，进行相同试验。不更换培养基所得产量为70ELISA单位/106细胞/天，而在50％培养基在第3天被更换的情况下，测定的产量为80单位/106细胞/天。这表明当用于感染PER.C6细胞的感染单位数量增加时，存在剂量应答效应。
另外，将生长于DMEM中的PER.C6细胞种植于6孔平板中，并置于有血清的2mlDMEM中过夜以贴壁。第二天，将细胞用另一批IG.Ad5/AdApt.EPO.dE2A病毒感染(vp/IU＝560)，感染复数(moi)为200vp/细胞(0.35感染单位/细胞)。4小时后，将含有病毒的培养基除去，置换以含有血清的新鲜培养基，并每天换用新鲜培养基两周以上，使细胞产生重组EPO。在培养4天的样品中计算的重组EPO产量为60单位/106细胞/天。在此系统中所得表达数据概括示于表5。
由于腺病毒早期区4(E4)的tTA-tetO调节的表达削弱了重组病毒在没有活性E4的情况下的复制能力，也可使用潜在产生蛋白质的PER.C6/E2A以及其亲本PER.C6细胞系，以产生重组蛋白，其中设定重组腺病毒携带作为转基因的人EPO c DNA，且E4基因在tet操纵子的控制下。这时在PER.C6/E2A细胞系中产生非常低的E4mRNA水平，导致非常低但可检测的重组和复制病毒，在PER.C6中检测不到此病毒。为了以此方式生产重组EPO，将两个病毒IG.Ad5/AdApt.EPO.tet OE4和IG.Ad5/AdApt.EPO.d E2A.tet OE4用于感染PER.C6细胞及其衍生物。在小装置(6孔平板和T25培养瓶)和大装置(滚瓶和发酵罐)中，以不同moi的纯化腺病毒感染贴壁和悬浮的细胞。在不同时间取样品，并确定EPO水平。
由于在病毒主链中缺失E1和E2A的病毒可在PER，C6/E2A细胞中被互补而在原始PER.C6细胞中不能互补，所用设定条件为将这两种细胞系的混合物在有IG.Ad5/AdApt.EPO.d E2A.病毒的情况下培养。病毒在PER.C6/E2A中复制，接着感染的细胞裂解，随之感染PER.C6或PER.C6/E2A细胞系。相反，在PER.C6中病毒不复制，且细胞不会由于病毒颗粒产生导致裂解，但产生分泌于上清中的重组EPO。设立稳态培养/复制/EPO生产系统，其中恒流加入新鲜培养基和新鲜PER.C6和PER.C6/E2A细胞，同时除去已用的培养基，死亡的细胞和碎片。同时，从此系统中取重组EPO，并通过除去病毒颗粒的下游处理方法加以纯化。
实施例15：纯化和分析重组EPO
在生物反应器中大批生产生长的细胞，并根据本领域已知方法纯化分泌的重组人EPO蛋白。对取自PER.C6和PER.C6/E2A稳定克隆或转染子的纯化的重组人EPO蛋白，通过本领域已知方法，检测与商购的EPO和纯化自人源(尿液)的EPO对比的糖基化与折叠情况(见实施例16和17)。在体内试验和鼠脾(如Krystal[1983]所述)及在体外分析中，测试得自PER.C6和PER.C6/E2A的纯化的及糖基化的EPO蛋白的生物活性(见实施例18)。
实施例16：在PER.C6中的β-半乳糖苷-α-2，6-唾液酸转移酶活性
已知中国仓鼠卵巢(CHO)细胞不含有β-半乳糖苷-α-2，6-唾液酸转移酶，导致在这些CHO细胞中产生的内源性和重组糖蛋白的N及O联寡糖的末端没有α-2，6-连接的唾液酸。由于CHO细胞中存在α-2，3-唾液酸转移酶基因，在这些细胞中产生的蛋白质典型是2，3键连类型的。然而纯化自人尿液的EPO不含有α-2，3-和α 2，6-连接的唾液酸。为确定人体细胞系PER.C6细胞是否能生产含有α-2，3-和α-2，6-键的重组EPO，在用EPO表达载体转染后对在PER.C6细胞中生产的EPO进行直接神经氨酸酶分析。作为对照，使用商购的Eprex样品，其衍生自CHO细胞，并只含有α-2，3型的唾液酸连接。所用的神经氨酸酶来自新城疫病毒(NDV)，其特异地酶切来自N联和O联的聚糖的α-2，3-连接的神经氨酸(唾液酸)，及来自霍乱弧菌(VC)，其非特异地酶切所有N-和O-联唾液酸(α-2，3′α-2，6和α-2，8连接)。这两种神经氨酸酶均购自Bbehringer，并根据生产者提供的指导，将样品与其温育。结果示于图21A。与1泳道(未处理的PER.C6 EPO)相比，在2和3泳道(用NDV神经氨酸酶处理的)观测到轻微位移。当此EPO样品与VC衍生的神经氨酸酶温育时，与NDV处理的样品相比观测到较快的迁移带。然而对于商购的Eprex，只在应用NDV衍生的神经氨酸酶时观测到位移(6和7泳道，与5道中未处理样品相比)，而在使用VC衍生的神经氨酸酶时未观测到位移。
为进一步示出CHO细胞中确实不存在α-2，6-连接类型的唾液酸，但它们确实存在于PER.C6细胞表面的蛋白质中，进行以下试验：将CHO细胞经胰蛋白酶-EDTA自固体支持物中释出，而对PER.C6使用的是悬浮细胞。将这两种悬浮液均用Mem-5％FBS冲洗一次，并在此培养基中在37℃温育1小时。在用PBS冲洗之后，将细胞以大约106细胞/ml再悬浮于结合培养基中(Tris缓冲盐水，pH7，5，0.5％BSA，和均为1mM的MgCl2，MnCl2，和CaCl2)。将细胞等份在室温下用DIG标记的凝集素，Sambucus nigra凝集素(SNA)和Maackia amurensis凝集素(MAA)温育1小时，所述凝集素分别特异结合α-2，6-Gal和α-2，3-Gal型的唾液酸连键。将对照细胞用无凝集素的培养基温育。1小时之后，将经凝集素处理的和对照细胞均用PBS冲洗，然后在室温用FITC标记的抗DIG抗体(Boehringer.Mannheim)温育1小时。接着，将细胞用PBS冲洗，在FACsorb装置上(Becton Dickinson)分析荧光强度。FACS分析结果示于图21B。当用SNA凝集素温育CHO细胞时，与未处理的细胞相比未观测到位移，而当用此凝集素温育PER.C6细胞时，与未处理的细胞(空心区域)相比观测到明显位移(黑色区域)。当这两种细胞均用MAA凝集素温育时，与未处理的细胞相比均呈现明显位移。
从这些EPO消化和FACS结果推断，在PER.C6细胞中存在α-2，6-唾液酸转移酶活性，而在CHO细胞中没有。
实施例17：确定PER.C6中生产的EPO中唾液酸含量
在EPO的N-或O-联聚糖上存在的末端神经氨酸(或唾液酸)，保护该蛋白质不会通过肝脏中的酶而从血流中清除。另外，由于这些唾液酸是负电荷的，因此可依赖于其电荷或特异pI分辨不同EPO形式。因此，将PER.C6和CHO细胞生产的EPO用于2维电泳，其中第一维电泳基于电荷分离蛋白质(pH3-10)，第二维电泳基于分子量进一步分离蛋白质。接着，将蛋白质在western印迹中印迹，并用抗EPO抗体检测。
也可通过用Coomassie蓝或银染色法将凝胶染色，然后从凝胶中除去不同的斑点而检测分离的EPO蛋白，并通过质谱法确定蛋白质中不同N或O联糖基化的特异聚糖组合物。
在图22A中，示出衍生自P9上清的许多EPO样品。P9是稳定表达重组人EPO的PER.C6细胞系(见实施例8)。将这些样品与商购的Eprex相比，Eprex只含有具有大约9-14个唾液酸的EPO形式，Eprex因此应是负电荷的，并聚集于凝胶的pH3一侧。图22B示出衍生自贴壁装置中P9的EPO，与衍生自CHO细胞的EPO之间的对比，在贴壁装置中细胞在DMEM培养基中培养，而CHO细胞是用pEPO2000/DHFRwt载体转染的。在CHO样品中明显不能检测到较低形式的EPO，而在P9样品中可见到所有形式的EPO。唾液酸含量通过计数在第一维中分离的1-14条带而得出。由于通过使用ECL进行western印迹，并且由于还不清楚是否抗体用于检测印迹上EPO分子，及由于未知糖基化是否能抑制抗体识别或移至硝酸纤维素，因此还不能确定这些混合物中每种形式EPO的百分率。然而，可确定含有唾液酸的分离形式的EPO分子的存在。可推断PER.C6细胞能产生全部14种含有唾液酸的重组人EPO的异构体。
实施例18：PER.C6产生的EPO的体外功能性
重组EPO在体内的功能通过其在血流中的半衰期确定。通过肝脏中结合未被唾液酸保护的聚糖中半乳糖残基的酶及通过肾脏清除而清除EPO。通过肾脏的这种过滤是否由于错误折叠或由于糖基化不足或错误糖基化所致还未知。另外，到达骨髓中其靶位并与祖细胞上EPO受体结合的EPO分子，也自循环中清除。与EPO受体结合及下游信号传导主要依赖于EPO分子的适当糖基化状态。唾液酸在一定程度上可抑制EPO与其受体的结合，导致该蛋白质的功效较低。然而，由于唾液酸阻止EPO被清除，因此这些糖是其保护朝向与EPO受体运动的蛋白质这一功能所必需的。当唾液酸在体外自EPO中除去时，发生与受体更好的结合，导致更强的下游信号传导。这意味着在体内和体外的功能性明显不同，尽管唾液酸化不是可导致体内半衰期短但在体外可检测到恰当的EPO受体结合性(Takeuchi等，1989)。
一些关于EPO功能性的体外分析已经阐述，其中刺激IL3′GM-CSF和EPO依赖性人体细胞系TF-1是最常使用的。由此可确定每mg的体外单位数(Kitamura等，1989；Hammerling等，1996)。其它体外分析是在骨髓细胞琼脂糖层下由EPO刺激分化的红色集落形成，59Fe在培养的小鼠骨髓细胞(Krystal等，1981和1983；Takeuchi等，1989)，和大鼠骨髓细胞(Goldwasser等，1975)中的亚铁血红素中的掺入，及放射免疫分析(RIA)，在RIA中确定抗血清对EPO的识别。将PER.C6生产的EPO如下用于刺激TF-1细胞：将细胞以约10,000个细胞/孔密度种植于96孔平板中，培养基中不含IL3或GM-CSF，它们是可刺激所培养的这些细胞非限制生长的生长因子。接着加入培养基至终浓度为0.0001，0.001，0.01，0.1，1和10单位/ml。这些单位是通过ELISA确定的，同时已知阳性对照Eprex的单位(4000单位/ml)，并将其稀释为相同浓度。将细胞与这些EPO样品温育4天，之后进行MTS分析(Promega)，以在490nm经荧光测定检测存活细胞(在将MTS移至formazan中后可检测到荧光)。图23示出衍生自PER.C6/E2A细胞的两个样品的活性，所述PER.C6/E2A细胞用EPO表达载体转染，接着在37℃和39℃温育4天。结果提示在39℃所得样品比在37℃所得样品更有活性，这可表明唾液酸含量在较高温度是亚适的。由此示出PER.C6生产的EPO在体外分析中可刺激TF-1细胞，强烈提示在此人体细胞系中生产的EPO可与EPO受体相互作用，并刺激分化。
实施例19：在PER.C6和PER.C6/E2A中生产重组的小鼠抗体、人化抗体及人单克隆抗体
A.瞬时DNA转染
将编码小鼠单克隆抗体，人化单克隆抗体的和人单克隆抗体(mAbs)重链和轻链的cDNA在两种不同系统中克隆：一个系统是将重链和轻链整合入一个单一质粒中(一种修饰的pcDNA2000/DHFRwt质粒)，另一个系统将重链和轻链cDNA’s分别克隆入两个不同质粒中(见实施例1，3′4和5)。这些质粒可携带相同选择标记(如DHFR)，或者它们可携带自己的选择标记(一个含有DHFR基因，一个含有例如neo抗性标记)。就瞬时表达系统而言，载体主链中存在何种选择标记不是问题，因为接着不再进行选择。在本领域通用及常用的转染方法中，等量的质粒被转染。在一个单一质粒上整合重链和轻链的缺点是驱动这两个cDNA’s表达的启动子可彼此互相影响，导致这两个亚单位的表达水平不相等，尽管每个基因的cDNA拷贝数非常一致。
将含有小鼠和人化的单克隆抗体重链和轻链的cDNA’s的质粒转染，几天后通过本领域已知方法确定正确折叠的抗体的浓度。检查培养PER.C6和PER.C6/E2A细胞的条件如温度和使用的培养基。生产的重组抗体的功能性通过确定特异抗原的亲和性而控制。
B.瞬时病毒转染
将编码重链和轻链的cDNA’s在两个不同系统中克隆：一个是将重链和轻链整合入一个单一衔接子质粒中(一种修饰的pAdApt.pac)，另一个将重链和轻链cDNA’s分别克隆入两个不同的衔接子中(每个分别在pAdApt.pac中)。在第一个系统中，增殖病毒，其在腺病毒主链中携带E1缺失体(dE1)和E2A缺失体(dE2A)，或在tetoE4插入体中的这两个缺失体。在第二个系统中，将重链和轻链分别克隆在pAdApt.pac中，并分别增殖为具有相同腺病毒主链的病毒。这些病毒用于对贴壁的和悬浮生长的PER.C6和PER.C6/E2A细胞进行单独或共转染。几天后，取样品确定全长重组抗体的浓度，之后在亲和性研究中通过特异抗原确定这些抗体的功能性。
C.整合质粒的稳定生产和扩增
将同时携带重链和轻链的表达质粒与分别携带重链和轻链的质粒，用于转染贴壁的PER.C6和PER.C6/E2A和CHO-dhfr细胞。接着将细胞暴露于MTX和/或潮霉素和新霉素，选择不同质粒的整合。另外，用G418和潮霉素进行双选择，以选择携带潮霉素和新霉素抗性基因的质粒的整合。确定功能性全长单克隆抗体的表达，并将最佳表达克隆用于接下来的研究中，包括整合的稳定性，拷贝数检测，确定两个亚单位的水平，及在最佳生产细胞系用于在较大装置如灌流的和(补料)分批生物反应器中生产mAb之后，确定随着MTX浓度提高的扩增能力，之后对mAbs的数量和质量进行优佳化。
实施例20：转染mAb表达载体以获得稳定细胞系
将PER.C6细胞以大约2.5×106个细胞/平皿的密度，种植于47个组织培养平皿(直径10cm)中的DMEM加10％PBS中，并在其标准条件(10％ CO2浓度，37℃)培养过夜。第二天，在39个平皿中在37℃使用标准Lipofectamine方法，每个平皿用1ug经MunI消化的及纯化的pUBS-Heavy2000/Hyg(-)，和1ug经ScaI消化的及纯化的pUBS-Light2001/Neo(见实施例3)进行共转染，作为对照在另两个平皿中用1ug经MunI消化的及纯化的pcDNA2000/Hyg(-)，和1ug经ScaI消化的及纯化的pcDNA2001/Neo进行共转染。作为转染效率的对照，另4个平皿用LacZ对照载体转染，另2个平皿不进行转染以作为阴性对照。
5小时后，将细胞用DMEM冲洗两次，再补充无选择剂的新鲜培养基。第二天，将培养基用含有不同选择试剂的新鲜培养基置换：将33个重链和轻链共转染物平皿，2个用空载体转染的平皿和2个阴性对照平皿(未转染)，只与50ug/ml潮霉素温育，将2个重链和轻链共转染物平皿和2个转染效率平皿(LacZ载体)只占500ug/mlG418温育，另2个转染效率平皿未用选择培养基处理但转染效率大约为40％。将2个平皿与50ug/ml潮霉素和250ug/ml G418组合温育，另2个平皿用25ug/ml潮霉素和500ug/ml G418组合温育。
由于细胞在只与潮霉素温育时是过生长的，确定潮霉素和G418选择组合会立即杀死只整合转染的两种载体之一的细胞。因此在种植7天后，将所有共转染物用100ug/ml潮霉素和500ug/ml G418组合进一步温育。2或3天用含有相同浓度选择剂的培养基更新细胞。在种植14天后，将浓度调节为250ug/ml G418和50ug/ml潮霉素。在种植22天后，已有大量集落生长至可选择，挑取及传代培养的程度。从10cm平皿中选择并挑取大约300个分离的集落，接着经由96孔和/或24孔平板经6孔平板至T25烧瓶中生长。在此阶段，将细胞冷冻(4小瓶/传代培养的集落)，并经实施例26所述的ELISA确定上清中重组UBS-54mAb的产量水平。
将CHO-dhfr细胞以大约106个细胞/平皿的密度，种植于含有DMEM加10％PBS并包括次黄嘌呤和胸苷的组织培养平皿(直径10cm)中，在标准条件下培养过夜，并在第二天用pUBS-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS-Light2001/DHFRwt，经标准Lipofectamine方法共转染。几小时后，更换新鲜培养基，并分为不同密度，以在发生稳定整合时，使细胞适合选择培养基并且不会发生未转染细胞的过度生长。首先针对潮霉素抗性选择集落，接着加入MTX以在这些传代培养的细胞系中选择这两个质粒的双整合体。
如用pUBS-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS-Light2001/Neo转染所述，用pUBS2-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS2-Light2001/Neo在PER.C6和PER.C6/E2A中进行转染，并通过接着用潮霉素随后用G418温育选择，或如上述用两种选择剂组合选择。将CHO-dhfr细胞用pUBS2-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS2-Light2001/DHFRwt，如用pUBS-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS-Light2001/DHFRwt转染所述转染，并相继进行选择，其中细胞首先用潮霉素选择，之后通过在MTX上选择控制轻链载体整合。另外，将PER.C6和PER.C6/E2A细胞用pUBS-3000/Hyg(-)和pUBS2-3000/Hyg(-)转染，而CHO-dhfr细胞用pUBS-3000/DHFRwt和pUBS2-3000/DHFRwt转染，之后通过提高MTX浓度进行整合质粒的选择和扩增。在pcDNAs3000质粒的情况下，预期重链和轻链的mRNA’s数目相同，而在两个独立载体的情况下，还不清楚在免疫球蛋白的两个亚单位之间是否达到恰当平衡。另外用实施例4和5所述的表达载体对PER.C6和PER.C6/E2A及CHO-dhfr细胞进行转染，以获得分别表达人化的IgG1mAb CAMPATH-1H和人化的IgG1 mAb 15C5的稳定细胞系。
实施例21：传代培养转染的细胞
从用pUBS-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS-Light2001/Neo转染的PER.C6细胞中，取在含有潮霉素和G418的培养基中生长的大约300个集落，将它们生长于具有其各自的培养基加上各自选择剂的96孔，24孔，和6孔平板中。对能在24孔平板中生长的细胞，通过实施例26所述的ELISA检测mAb的产生情况。如果细胞表现阳性，将每个克隆的至少一个小瓶冷冻并贮存，随后将细胞进行测试及传代培养。在高表达，培养性质和存活性的基础上选择良好的生产克隆。为检测长期存活性，整合质粒的扩增以及在延长的期间的悬浮生长，将最好的生产克隆冷冻，从中选择每个细胞系的一些最佳生产者，以进行进一步研究。对用不同质粒转染的CHO-dhfr细胞，和用重链和轻链的其它组合及选择标记的其它组合转染的PER.C6和PER.C6/E2A细胞，进行相似的试验。
实施例22：在生物反应器中生产mAb
将PER.C6的最佳生产UBS-54的转染的细胞系形成悬浮液，即通过用PBS洗细胞，然后在JRH ExCell 525培养基中培养此细胞，首先在小培养瓶随后在滚瓶中培养，并放大至1-2升发酵罐。将细胞用潮霉素和G418选择，直至整合的载体长期稳定。这是在细胞还处于贴壁阶段或当细胞处于悬浮液中时进行。
悬浮生长的生产mAb的PER.C6细胞通常用潮霉素和G418培养，并用于从滚瓶中接种生物反应器。在细胞在灌流生物反应器及补料分批培养装置中生长之后，检测产生的mAb的产量，功能性和质量。
A.在2升生物反应器中灌流
将细胞以大约0.5×106个细胞/ml的浓度种植于无选择剂的悬浮培养基中，在几天后细胞密度达到大约2-3×106个细胞/ml时，开始灌流。灌流速率通常为1体积/24小时，流量大约为250ml/24小时。在此装置中，细胞密度恒定在大约5×106个细胞/ml，且在一个月以上时间内几乎为95％的存活性。常规基础上确定mAb的产量水平。
B.在2升生物反应器中补料分批培养
在开始阶段，将在滚瓶中生长的生产mAb的PER.C6悬浮细胞，用于接种无选择剂的2升生物反应器，密度为在300-500ml工作体积中0.3-0.5×106个细胞/ml，并培养生长至细胞培养物的存活性降至10％。培养物生存时间标准是在接种后，存活细胞密度降至0.5×106个细胞/ml之下的天数。细胞通常生长至密度为2-3×106个细胞/ml，之后培养基组分变得有限，及存活性降低。另外，确定培养基中有多少必需组分如葡萄糖和氨基酸被细胞消耗。接着，确定产生了何种氨基酸和在培养物中有何其它累积的产物。基于此，产生浓缩的补料样品，其在规定的时间点加入以提高培养物生存时间，从而提高上清中mAb浓度。在另一装置中，配制10倍浓缩的培养基样品，并在不同时间加入细胞中，也提高细胞的存活性至更长一段生存时间，最终在上清中产生较高浓度的mAb。
实施例23：瞬时表达人化的重组单克隆抗体
将正确组合的含有的UBS-54重链和轻链基因载体，用于在PER.C6细胞进行瞬时转染试验。为此，何种选择标记导入质粒主链中不是重要的，因为表达持续很短的时间(2-3天)。转染方法一般是lipofectamine法，但也可使用其它阳离子脂质化合物以有效转染。瞬时方法是从T25培养瓶装置推至至少10升生物反应器装置。在第一天，将大约3.5×106的PER.C6和PER.C6/E2A细胞种植于T25烧瓶中。在第二天，将细胞用8ug质粒DNA经lipofectamine法转染，并在2-4小时后更换培养基，培养2天。然后，收集上清，在用于人IgG1免疫球蛋白的定量ELISA中测定抗体滴度(CLB，见实施例26)。在此系统中，就PER.C6而言，人抗体的总水平大约为4.8ug/106种植的细胞，就PER.C6/E2A而言，为11.1ug/106种植的细胞。为确定产生的抗体中有多少是完整的并由两个重链和两个轻链构成的，以及单独的，及通过二硫键的连接的重链和/或轻链的表达水平，进行分别识别亚单位的对照ELISA。使用检测人(人化的)IgG1亚单位的不同捕捉和染色抗体组合。检测PER.C6转染物(用对照载体或pUBS-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS-Light2001/DHFRwt转染的)的上清中完整大小的mAb产量(图24)。将样品用及不用DTT处理，由此可分辨完整大小的mAb(未还原)与重链或轻链(还原的)之间的不同。正如所期望的，只有当轻链被共表达时，才分泌重链，大多数抗体是完整大小的。
实施例24：用于进行瞬时转染的放大系统
PER.C6及其衍生物用于DNA转染放大系统。根据Wurm和Bernard(1999)所述，转染悬浮细胞可在1-10升的装置中进行，其中经电穿孔所得重组蛋白质的产量为1-10mg/l(0.1-1pg/细胞/天)。
需要一种能被良好控制及产量更高的系统，尤其是用于筛选在稳定装置中不能生产的大量蛋白质和毒性蛋白。另外，由于细胞系如CHO受细胞程序死亡诱导剂如lipofectamine的严重影响，因此本领域需要一种对此有抗性的细胞。由于PER.C6几乎不受转染方法影响，因此PER.C6及其衍生物可用于此目的。在调节的培养基中生长的，以支持用纯化的质粒DNA瞬时转染的PER.C6和PER.C6/E2A的1-50升悬浮培养物，用于经电穿孔或其它方法，用相同表达质粒进行转染。在几个小时之后，除去转染培养基，并用无血清的新鲜培养基置换。使重组蛋白质在上清中累积几天，之后收集上清并除去所有细胞。将上清用于下游加工以纯化重组蛋白。
实施例25：用于进行病毒感染的放大系统
将实施例3′4和5所述抗体的重链和轻链cDNA’s，分别及组合地克隆入重组腺病毒衔接子质粒中。进行的组合要保证形成的抗体的重链和轻链表达水平相同。当分别克隆重链和轻链，然后分别产生病毒并增殖时，确定病毒颗粒的感染能力和浓度，最后共同感染PER.C6及其衍生物，以在上清中产生重组mAbs。衔接子载体和重组腺病毒的产生及mAbs的产生如关于重组EPO所述(见实施例13和14)。
实施例26：开发ELISA以测定人mAbs
将Greiner microlon平板#655061用抗人IgG1κ单克隆抗体(Pharmingen#M032196 0.5)，以在PBS中4ug/ml浓度，100ul/孔包被。在4℃温育过夜，或在37℃温育90分钟。然后，用0.05％ Tween/PBS(400ul/孔)将孔冲洗3次，接着用100ul溶于0.05％ Tween/PBS中的5％奶/孔，在37℃封闭30分钟。然后用400ul 0.05％ Tween/PBS/孔将平板冲洗3次。作为标准物，使用纯化的人IgG1抗体(Sigma，#108H9265)，在0.5％奶/0.05％ Tween/PBS中稀释为50-400ng/ml。将每孔100ul的标准物在37℃温育1小时。然后，将平板用400ul/孔的0.05％ Tween/PBS冲洗3次。作为二抗，使用生物素标记的小鼠单克隆抗人IgG1抗体(Pharmingen #M045741)，浓度为2ng/ml。加入100ul/孔的此抗体，在37℃温育1小时，并用400ul 0.05％Tween/PBS将孔冲洗3次。
接着，加入缀合物：100ul/孔的1∶1000稀释的链霉亲和素-HRP溶液(Pharmingen #M045975)，在37℃温育1小时，并将平板再用400ul 0.05％ Tween/PBS冲洗3次。
将一片ABTS(Boehringer Mannheim #600191-01)溶解于50mlABTS缓冲液(Boehringer Mannheim #60328501)中，并将100ul此溶液加入每个孔中，在室温或37℃温育1小时。最后，在405nm测定OD。将得自用编码mAb载体转染的细胞的上清样品溶解并稀释于0.5％奶/0.05％ Tween/PBS中。如果样品不符合标准曲线的线性范围，使用其它稀释液。
实施例27：在人体细胞中生产用于重组亚单位疫苗的流感HA和NA蛋白
确定编码已知的和规律性出现的新流感病毒株的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白的基因的cDNA序列，并用引物通过PCR产生这些cDNA序列，以方便地克隆入pcDNA2000，pcDNA2001，pcDNA2002和pcDNAs3000载体中(见实施例1)。接着，将这些所得表达载体转染入PER.C6及其衍生物中，以稳定和瞬时表达重组蛋白，使重组HA和NA蛋白因此可在严格的和限定的条件下，用人体细胞经完全标准化方式生产。将细胞在标准时间内培养以累积这些重组HA和NA蛋白。当使用pcDNAs3000载体时，可同时克隆这两个cDNA’s，并使细胞同时生产这两种蛋白。从分离的或组合的培养物中，通过标准方法纯化蛋白质，及通过本领域已知方法确定最终HA和NA滴度，并检测蛋白质的活性。然后，将纯化的重组蛋白用于免疫接种研究，并最终用于大规模免疫接种。
猪流感病毒A/猪/Oedenrode/7C/96的HA1片段(Genbank登记号AF092053)，是通过PCR获得的，使用具有以下序列的正向引物：5’-ATT GGC GCG CCA CCA TGA AGA CTA TCA TTG CTT TGAGCT AC 3’，和具有以下序列的反向引物：5’-GAT GCT AGC TCATCT AGT TTG TTT TTC TGG TAT ATT CCG 3’。将所得1.0kb的PCR产物用AscI和NheI限制酶消化，并与经AscI和NheI消化的及纯化的pcDNA2001/DHFRwt载体连接，产生pcDNA2001/DHFRwt-swHA1。另外，将相同病毒的HA2片段通过PCR扩增，使用与HA1相同正向引物，和具有以下序列的另一种反向引物：5’GATGCT AGC TCA GTC TTT GTA TCC TGA CTT CAG TTC AAC ACC3’。将所得1.6kb的HA2 PCR产物以与HA1相同方式克隆，产生pcDNA2001/DHFRwt-swHA2。
实施例28：整合编码翻译后修饰酶的cDNA′s
由于在稳定及瞬时转染和感染的PER.C6和PER.C6/E2A中重组蛋白的生产水平非常高，及由于MTX浓度提高在依赖于DHFR的扩增时通常获得更高表达水平，所以参与翻译后修饰的酶的内源水平可发生“超出滴定范围”。因此，编码参于不同种类翻译后修饰和加工如糖基化，磷酸化，羧化，折叠和运输的人类酶的cDNA’s，在PER.C6和PER.C6/E2A中是过表达的，在小和大装置中均能生产更有功能的重组蛋白至极限水平。CHO细胞可遗传工程化以导入α-2，6-唾液酸转移酶，从而增强tPA和人红细胞生成素的表达和生物活性(Zhang等，1998；Minch等，1995；Jenkins等，1998)。其它基因如β-1，4-半乳糖基转移酶也可导入昆虫和CHO细胞中，以改良N联寡糖分支结构，和增强唾液酸在末端残基的浓度(Weikert等，1999；Hollister等，1998)。PER.C6细胞通过整合编码α-2，3-唾液酸转移酶，α-2，6-唾液酸转移酶和β-1，4一半乳糖基转移酶的cDNA’s而修饰，以进一步提高在人体细胞系中产生的重组蛋白的唾液酸含量。
实施例29：通过腺病毒E1B在CHO-dhfr细胞中的过表达而抑制细胞程序死亡
已知过表达重组外源蛋白的中国仓鼠卵巢细胞，对细胞程序死亡信号高度敏感，与野生型或衍生这些细胞的起源细胞相比，导致在这些稳定生产细胞系中死亡率通常较高。另外，当在转染中使用如Lipofectamine时，CHO细胞死于细胞程序死亡。因此，CHO细胞在生产重组蛋白中存在很大弊端，即细胞非常容易由于不同原因而死于细胞程序死亡。由于已知腺病毒的E1B基因有抗细胞程序死亡作用(White等，1992；Yew和Berk，1992)，将表达所述抗体重链和轻链的稳定CHO-dhfr细胞(见实施例3′4，和5)，用腺病毒E1BcDNA’s转染，以稳定或瞬时表达E1B蛋白，最终保证在这些细胞中细胞程序死亡的作用较低，从而提高重组蛋白的产量。将瞬时转染的细胞和稳定转染的细胞与野生型的CHO-dhfr细胞，在FACS分析中对比由于转染方法或由于它们过表达重组蛋白所致的细胞死亡情况。产生稳定的CHO细胞系，其中腺病毒的E1B蛋白是过表达的。接着，将由于这些稳定的产生E1B的CHO细胞中Lipofectamine的作用而产生的细胞程序死亡应答，与没有E1B基因的亲本细胞的细胞程序死亡应答相对比。这些试验是用FACS分析和能确定细胞程序死亡率的商购试剂盒进行的。
实施例30：通过腺病毒E1B在人体细胞中过表达抑制细胞程序死亡
PER.C6细胞及其衍生物确实表达腺病毒的E1A和E1B基因。其它人体细胞如A549细胞用于稳定过表达腺病毒E1B，以确定存在腺病毒E1B基因对抗细胞程序死亡的作用，如关于CHO细胞所述内容(见实施例29)。大多数细胞确实对转染剂如Lipofectamine或其它阳离子脂质应答，导致严重细胞程序死亡，最终导致分泌的重组蛋白浓度较低，主要是由于在此处理中只有少量细胞存活。比较稳定的E1B过表达细胞与亲本的细胞系对毒性蛋白过表达或细胞程序死亡诱导蛋白的应答，及对转染剂如Lipofectamine的应答。
实施例31：产生缺失功能性DHFR蛋白的PER.C6衍生的细胞系
将PER.C6细胞用不同的系统剔除DHFR基因，以获得可用于扩增外源性整合的DHFR基因的细胞系，所述DHFR基因是在实施例1-5所述的载体上或其它DHFR表达载体上编码的。筛选PER.C6细胞的不同染色体存在情况，并选择携带人DHFR基因的低拷贝数的染色体。接着，将这些细胞用于剔除试验，其中DHFR基因的开放读框被破坏并由选择标记取代。为获得双剔除的细胞系，除去这两个等位基因，通过用不同的选择标记同源重组或其它系统如关于CHO细胞所述的系统(Urlaub等，1983)进行。
也可使用其它系统，其中DHFR蛋白的功能性较低或完全除去，例如通过使用抗有义RNA或经RNA/DNA杂交体，其中此基因未除去或剔除，但此基因的下游产物的功能被干扰。
实施例32：用蛋白酶和神经氨酸酶抑制剂长期生产重组蛋白
将实施例8所述的稳定克隆用于在有或无MTX，血清和蛋白酶抑制剂的情况下长期表达。稳定或转染的细胞在累积重组人EPO蛋白的几天期间，观测到平坦曲线而非直线增加，表明累积的EPO随着时间而降解。这也许是由于外在因素如光线或温度等所致灭活也可由于由存活的细胞产生的或死亡的细胞裂解释放的特异蛋白酶消化重组EPO蛋白所致。因此，转染后在培养基中加入提高浓度的CuSO4，并对稳定生产细胞检测更稳定的生产曲线：将细胞培养几天并在不同时间确定EPO数量。已知CuSO4是蛋白酶活性的抑制剂，其在下游处理和EPO纯化期间可易于除去。在基于DNA转染和病毒感染的瞬时表达之后，最佳浓度的CuSO4用于生产重组人EPO蛋白。另外，最佳浓度的CuSO4还用于在稳定的克隆中生产EPO。在EPO中存在末端唾液酸对保证重组蛋白的长半衰期是重要的情况下，必需生产高唾液酸化的EPO。由于活细胞产生神经氨酸酶，该酶可由应力因素活化而分泌，由于这些应力因素使得产生的EPO释放其唾液酸并产生神经氨酸酶。为防止唾液酸的剪掉，在培养基中加入神经氨酸酶抑制剂，导致唾液酸长期吸附于产生的EPO。
实施例33：在人体细胞中用可扩增的谷氨酰胺合成酶系统稳定表达重组蛋白质
将PER.C6及其衍生物通过谷氨酰胺合成酶(GS)系统，用于稳定表达重组蛋白。首先，检测细胞在不含谷氨酰胺培养基中的生长能力。如果细胞在不含谷氨酰胺培养基中不能生长，意味着这些细胞不表达足够的GS，最终导致细胞死亡。GS基因可作为选择标记整合入表达载体中(如针对DHFR基因所述内容)，并可通过提高甲硫氨酸sulphoximine(MSX)浓度，引起相应重组蛋白过表达而扩增，因为完全稳定整合的载体将被共扩增，如DHFR所示出的一样。在Sanders等(1984)报道之后，GS基因表达系统具有可行性，而且Cockett等(1990)比较了DHFR选择系统与GS之间的不同。使用GS生产重组mAbs首先由Bebbington等(1992)阐述。
如实施例1所述将GS基因克隆入载体主链中，或将编码重组蛋白和mAbs的重链和轻链的cDNA’s克隆入携带GS基因的适当载体中。接着，将这些载体转染入PER.C6中，并在使细胞通过载体的稳定整合而生长的MSX浓度下选择。
实施例34：在人体细胞中生产重组HIV gp120蛋白
确定编码来自人免疫缺陷病毒(HIV)的高度糖基化的包膜蛋白gp120的cDNA，并用引物通过PCR获得该cDNA，所述引物在上游具有完全Kozak序列以正确开始翻译，及具有常规的限制识别序列以克隆入实施例1所述的表达载体中。接着，对PCR产物的两个链均进行测序，以确定没有引入PCR错误。
将表达载体转染入PER.C6，其衍生物和CHO-dhfr细胞中，以获得稳定的生产细胞系。CHO产生的和PER.C6产生的gp120之间糖基化不同，是在2D电泳试验和随后的质谱试验中确定的，因为gp120是具有主要为O-联的寡糖的重度糖基化的蛋白质。通过本领域已知方法纯化重组蛋白，接着用于功能性及其它分析中。纯化的蛋白质用于免疫接种目的，以预防HIV感染。
附图说明
1.pcDNA2000/DHFRwt
2.pcDNA2001/DHFRwt
3.pcDNA2002/DHFRwt
4.pcDNAs3000/DHFRwt
5.pEPO2000/DHFRwt
6.pAdApt.EPO
7.pHC2000/Hyg(-)
8.pLC2001/DHFRwt
9.pUBS-Heavy2000/Hyg(-)
10.pUBS-Light2001/DHFRwt
11.pUBS2-Heavy2000/Hyg(-)
12.pUBS2-Light2001/DHFRwt
13.pUBS-3000/DHFRwt
14.pUBS2-3000/DHFRwt
15.在2升灌流生物反应器中以ELISA单位/ml给定的EPO浓度。
16.在2升重复分批生物反应器中EPO浓度，其中每2-3天将细胞密度调整为0.5×106个细胞/ml。
17.在不同条件的4×1升重复分批生物反应器中，在用0.3×106个细胞/ml接种3天后，来自稳定生产的P9细胞中的EPO浓度。左侧，溶解氧的不同设定值。中间，不同温度。右侧，不同的恒定pH值。对P9细胞的标准设定为50％DO，37℃和pH7.3。在每轮发酵中进行具有这些设定值的单独对照发酵，如每系列的第4条所述。
18.在PER.C6衍生的细胞系P8和P9中，随着MTX浓度提高的EPO产量，以ELISA单位/106个种植的细胞/天计算。
19.随着MTX浓度提高，DHFR基因的扩增。衍生自正常PER.C6细胞(在存在MTX的情况下不生长)及P8和P9细胞(在存在100nM，800nM和1800nM MTX的情况下培养)的，经BgIII消化的DNA的Southern印迹。此印迹首先与放射性的DHFR探针杂交，接着剥离，然后与放射性腺病毒E1探针作内部对照温育。
20.两个细胞系P8(A)和P9(B)的重组EPO表达的稳定性。将细胞在有或无MTX的情况下，在4个月以上的时间内培养大约60代，EPO产量以ELISA单位/106个种植的细胞/天计算。
21.与CHO细胞对比，在PER.C6细胞中β-半乳糖苷-α-2，6-唾液酸转移酶的活性。A用EPO表达质粒(左)和Eprex(右)转染的PER.C6细胞上清中EPO的Western印迹。PER.C6-EPO在未处理的(1泳道)，用NDV衍生的神经氨酸酶在两个单独的缓冲液中处理后的(2和3泳道)，及用VC衍生的神经氨酸酶处理后的(4泳道)条件一电泳。Eprex也是在未处理的(5泳道)，和用神经氨酸酶相似处理的(5-8泳道)条件下电泳。B.与用非凝集素处理的细胞(空心区域)进行的FACS分析相对比，PER.C6(右侧组)和CHO细胞(左侧组)的FACS分析位移，这两种细胞用识别与细胞温育的两种DIG连接的凝集素的抗DIG抗体处理(产生黑色区域)，所述两种DIG连接的凝集素特异性识别唾液酸和半乳糖之间的α-2，6-连接(Sambucus nigra凝集素，上组)，和α-2，3唾液酸-半乳糖连接(Maackia amurensis凝集素，下组)。
22.在不同培养装置下产生的重组EPO的2D/Western分析。A.将稳定表达重组人EPO的P9细胞生长于T175烧瓶中的DMEM培养基中，和滚瓶和生物反应器中的JRH ExCell 525培养基中，并进行2D电泳分离，印迹并与H162温育，H162是一种抗EPO抗血清。将含有全部范围的含有唾液酸的EPO样品(来自P9上清)，与商购的Eprex(左侧)相对比，商购的Eprex只包含含有较高唾液酸的EPO。B.将衍生自生长于贴壁装置的DMEM培养基中的贴壁P9细胞的EPO，与衍生自瞬时转染的CHO细胞的EPO相对比，CHO细胞也是在DMEM中培养的。在培养期间存在PBS，但在EPO开始累积之前除去。这些样品(1-14)中推测的唾液酸含量在两个印迹之间表示。
23.与在CHO细胞中产生的商购的Eprex相比，用人TF-1细胞在37℃生产的PER.C6/E2A-EPO的体外功能分析，
24.用抗人IgG1重链抗体，对用pUBS-Heavy2000/Hyg(-)和pUBS-Light2001/DHFRwt共转染(6泳道)，或用各自的载体转染(4和5泳道)的PER.C6细胞上清，进行Western印迹。作为阳性对照，加样稀释的人血清(IgG，泳道1)，作为阴性对照，用编码LacZ的表达载体转染(对照，泳道3)，及加样标记物(M，大小未标示)(泳道2)。上面一组得自用转染物的样品加样的凝胶，该转染物未用DTT处理，其中重链和轻链的二硫键保持完整，并对大约220kD的全长mAb进行检测。下面一组示出用DTT处理的相同转染物的样品，其中二硫键被除去，导致重链和轻链完全分离。将印迹与识别人IgG1重链的抗体温育。由于用于ECL-western步骤的二抗(多克隆)的背景识别，轻链被染色。
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表：重组EPO的产量
表1：在与不同浓度MTX温育6和15天后，氨甲喋呤(MTX)杀死PER.C6和PER.C6/E2A的概况。细胞在0天接种，在第1天开始与MTX温育，并持续温育6天。然后评价铺满率(％)，并将培养基用加上MTX的新鲜培养基更换，再持续温育9天。之后再评价铺满率(％)(第15天)。
PER.C6 0 1 5 10 25 50 100 250 500 1000 2500 nM MTX
1E5细胞/孔6孔平板 第6天 70 70 70 60 ＜5 ＜1 0.5 0 0 0 0 ％铺满率
第15天 100 100 100 100 ＜10 ＜5 0 0 0 0 0 ％铺满率
PER.C6/E2A 0 1 5 10 25 50 100 250 500 1000 2500 nM MTX
1E5细胞/孔6孔平板 第6天 100 100 100 100 ＜100 5 5 4 1 ＜1 ＜1 ％铺满率
第15天 100 100 100 100 ＜10 ＜5 0 0 0 0 0 ％铺满率
表2：稳定表达重组人EPO的贴壁的PER.C6和PER.C6/E2A细胞系。细胞系是通过稳定整合和表达pEPO2000/DHFRwt产生的(图5)。在含有100nM MTX的T25烧瓶中生长4天后，在上清中确定产量水平。
PER.C6细胞系   ELISA单位/1E6接种的细胞/天
 P3  735
 P5  0
 P7  1733
 P8  2522
 P9  3839
 P13  0
 P15  0
 P42 ＜1
 PER.C6/E2A细胞系   ELISA单位/1E6接种的细胞/天
 E17  325
 E55  1600
表3：内源性和整合的DHFR DNA的扩增率。图19中Southern印迹中的杂交带的强度是在磷光显影计中测定的，并校正背景水平以最终计算内源性和整合的DHFR基因的大约扩增率。
 P8  E1探针  整合的dhfr 扩增 内源性dhfr 扩增
 100nM  719624  3375  18649
 800nM  913578  2976 ×0.882  45283 ×2.428
 1800nM  831952  2950 ×0.874  81506 ×4.371
 P9  E1探针 整合的dhfr 扩增 内源性dhfr 扩增
100nM  804142  16606 31161
1800nM  842268  14430 ×0.869 69542 ×2.232
表4：在瞬时DNA转染中EPO的产量。每106个种植的细胞的产量是经EPO ELISA在PER.C6，PER.C6/E2A和CHO细胞的上清中确定的，所述细胞用pEPO2000/DHFRwt表达载体转染，并在有或无胎牛血清，在不同温度下温育，如实施例12所述。
细胞系 ±FBS 温度 EPO产量(ELISA单位/1E6细胞/天)
 PER.C6/E2A + 39℃ 3100
 PER.C6/E2A - 39℃ 2600
 PER.C6 + 37℃ 750
 PER.C6 - 37℃ 590
 CHO + 37℃ 190
 CHO - 37℃ 90
表5：在病毒感染后所得EPO产量。每106个种植的细胞的产量是经EPO ELISA在PER.C6细胞的上清中确定的，PER.C6细胞用重组IG.Ad5.AdApt.EPO.dE2A腺病毒感染，如实施例14所述。在两个不同装置(滚瓶悬浮培养和6孔贴壁培养)，以不同vp/IU比率(330和560)使用两批不同的病毒。
感染复数(病毒颗粒/细胞) 比率(病毒颗粒/感染单位) 培养条件 培养基 更新 EPO产量(ELISA单位/1E6细胞/天)
 200  330 滚瓶 JRH 3天 240
 200  330 滚瓶 JRH 无 190
 20  330 滚瓶 JRH 3天 80
 20  330 滚瓶 JRH 无 70
 200  560 6孔 DMEM+FBS 每天 60

Claims (81)

1.一种在细胞中生产至少一种蛋白质物质的方法，包括提供一种真核细胞，该细胞在其基因组中具有编码腺病毒的至少一种E1蛋白，或其功能性同源物，片段和/或衍生物的序列，该细胞不从其基因组或整合入其中的序列编码结构性腺病毒蛋白，所述方法包括提供编码重组蛋白质物质的基因给所述细胞，在适当的培养基中培养所述细胞，并从所述细胞和/或所述培养基中收获至少一种蛋白质物质。
2.一种在真核细胞中增加重组蛋白质物质生产的方法，包括提供编码至少一部分所述蛋白质物质的核酸给所述真核细胞，其中所述编码序列在CMV启动子，E1A启动子或其功能性同源物，衍生物和/或片段的控制下，并且进一步提供E1A活性或类E1A活性所述细胞。
3.权利要求1或2的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
4.权利要求1-3的任一方法，其中所述细胞是人体细胞。
5.权利要求1-4的任一方法，其中所述收获的至少一种蛋白质物质是由所述基因编码的。
6.一种在细胞中生产至少一种人体重组蛋白的方法，包括提供一种编码所述人体重组蛋白的基因给人体细胞，该细胞在其基因组中具有编码腺病毒的至少一种E1蛋白，或其功能性同源物，片段和/或衍生物的序列，且该细胞不产生结构性腺病毒蛋白，在适当的培养基中培养所述细胞，并从所述细胞和/或所述培养基中收获至少一种蛋白质物质。
7.根据前述任一权利要求的方法，其中所述腺病毒的至少一种E1蛋白包括E1A蛋白或其功能性同源物，片段和/或衍生物。
8.根据前述任一权利要求的方法，其中所述腺病毒的至少一种E1蛋白包括E1B蛋白或其功能性同源物，片段和/或衍生物。
9.权利要求1-8的任一种方法，其中所述细胞与通常的哺乳动物细胞系相比，能生产2-200倍多的重组蛋白和/或蛋白质物质。
10.权利要求9的方法，其中所述通常的哺乳动物细胞系选自CHO，COS，Vero，Hela，BHK，和Sp-2细胞系。
11.根据前述任一权利要求的方法，其中所述重组蛋白和/或蛋白质物质是经过翻译后和/或翻译期间修饰的蛋白质。
12.权利要求11的方法，其中所述修饰包括糖基化。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述重组蛋白和/或蛋白质物质是红细胞生成素，或其功能性衍生物，同源物或片段。
14.权利要求13的方法，其中所述人体细胞在24小时内每一百万个细胞能产生超过100单位的红细胞生成素或其功能性衍生物。
15.权利要求13的方法。其中所述人体细胞在24小时内每一百万个细胞能产生超过500单位的红细胞生成素或其功能性衍生物。
16.权利要求13的方法。其中所述人体细胞在24小时内每一百万个细胞能产生超过1000单位的红细胞生成素或其功能性衍生物。
17.权利要求13的方法。其中所述人体细胞在24小时内每一百万个细胞能产生超过5000单位的红细胞生成素或其功能性衍生物。
18.一种通过存在至少一种腺病毒E1蛋白或其功能性衍生物，同源物和/或片段而无限增殖化的重组哺乳动物细胞，其进一步包括一种功能性形式的核酸，以表达免疫球蛋白的至少一个可变区或其功能性衍生物，同源物和/或片段。
19.权利要求18的重组哺乳动物细胞，其中所述至少一种腺病毒E1蛋白包括E1A蛋白或其功能性同源物，片段和/或衍生物。
20.权利要求18或19的重组哺乳动物细胞，其中所述至少一种腺病毒E1蛋白包括E1B蛋白或其功能性同源物，片段和/或衍生物。
21.权利要求18-20任一项的重组哺乳动物细胞，其包含编码至少一种腺病毒E1蛋白的衍生自腺病毒的核酸。
22.权利要求21的重组哺乳动物细胞，其中所述衍生自腺病毒的核酸编码E1A和/或E1B蛋白。
23.权利要求18-22任一项的重组哺乳动物细胞，其中所述细胞衍生自原代细胞。
24.权利要求18-23任一项的重组哺乳动物细胞，其衍生自人体细胞。
25.权利要求24的重组哺乳动物细胞，其是ECACC保藏号为96022940的PER.C6或其衍生物。
26.权利要求18-25的任一项的重组哺乳动物细胞，其中所述细胞还包括编码E2A或其功能性同源物，片段和/或衍生物的核酸。
27.权利要求26的重组哺乳动物细胞，其中所述编码E2A的的核酸包括温度敏感性突变体E2A。
28.权利要求18-27任一项的重组哺乳动物细胞，其中所述功能性形式的用以表达至少一个可变区的核酸编码免疫球蛋白的重链，可变重链，轻链和/或可变轻链。
29.权利要求18-28任一项的重组哺乳动物细胞，还包括另一种功能性形式的核酸，用以表达所述至少一个可变区的至少一个相应物(counterpart)。
30.权利要求18-29任一项的重组哺乳动物细胞，其中所述功能性形式的用以表达至少一个可变区和/或其至少一个相应物的核酸编码ScFv。
31.权利要求18-30任一项的重组哺乳动物细胞，其中至少一个所述可变区包括人或人化的氨基酸序列。
32.权利要求18-31任一项的重组哺乳动物细胞，其中至少一个所述可变区是由在可诱导启动子控制下的核酸编码的。
33.一种生产免疫球蛋白的至少一个可变区的方法，包括将权利要求18-32任一项重组哺乳动物细胞在适当的培养基中培养，并从所述重组哺乳动物细胞和/或所述培养基中收获所述免疫球蛋白的至少一个可变区。
34.权利要求33的方法，其中所述重组哺乳动物细胞每天每106个细胞能生产超过10μg的所述免疫球蛋白的至少一个所述可变区。
35.权利要求18-34任一项的重组哺乳动物细胞在生产免疫球蛋白的至少一个可变区中的应用，所述免疫球蛋白的至少一个可变区具有不同于其分离的天然相应物(counterpart)的翻译后修饰。
36.权利要求35的应用，其中所述细胞每天每106个细胞能生产超过10μg的所述免疫球蛋白的至少一个所述可变区。
37.一种免疫球蛋白或其功能性部分，同源物和/或衍生物，其可通过权利要求33或34的方法，或权利要求35或36的应用获得。
38.一种药物组合物，其包含权利要求37的免疫球蛋白的至少一个可变区。
39.权利要求37的免疫球蛋白或其功能性部分，同源物和/或衍生物在治疗个体中的应用。
40.权利要求1-12任一项的方法，其中所述重组蛋白和/或所述蛋白质物质包括一种非腺病毒蛋白的病毒蛋白。
41.权利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括至少一种流感病毒神经氨酸酶和/或血凝素。
42.权利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括肠道病毒或其功能性等价物。
43.权利要求42的方法，其中所述肠道病毒包括鼻病毒，口蹄疫病毒或脊髓灰质炎病毒蛋白。
44.权利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括疱疹病毒蛋白或其功能性等价物。
45.权利要求44的方法，其中所述疱疹病毒蛋白包括单纯疱疹病毒，假狂犬病病毒或牛疱疹病毒蛋白。
46.权利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括正粘病毒蛋白。
47.权利要求46的方法，其中所述正粘病毒蛋白包括流感病毒，副粘病毒，如新城疫病毒，呼吸道合胞病毒，腮腺炎病毒或麻疹病毒蛋白。
48.权利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括逆转录病毒，细小病毒或乳多空蛋白。
49.权利要求48的方法，其中所述逆转录病毒蛋白包括人免疫缺陷病毒蛋白。
50.权利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括轮状病毒或冠状病毒蛋白。
51.权利要求50的方法，其中所述轮状病毒或冠状病毒蛋白包括传染性胃肠炎病毒或黄病毒，如壁虱脑炎病毒，或黄热病病毒蛋白。
52.权利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括披膜病毒，如风疹病毒蛋白，或东方、西方或委内瑞拉马脑脊髓炎病毒蛋白。
53.权利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括肝炎病毒蛋白，如甲型肝炎病毒蛋白或乙型肝炎病毒蛋白。
54.权利要求40的方法，其中所述病毒蛋白包括瘟病毒属蛋白，如猪瘟病毒蛋白或弹状病毒属蛋白，如狂犬病毒蛋白。
55.一种人体细胞在生产用于疫苗的至少一种病毒蛋白中的应用，所述人体细胞的基因组中具有编码腺病毒的至少一种E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，该细胞不产生结构性腺病毒蛋白。
56.权利要求1-17，33，34，40-54的任一项的方法，其中所述细胞衍生自原代细胞。
57.权利要求1-17，33，34，40-54或56任一项的方法，其中所述人体细胞通过存在所述E1编码序列而无限增殖化。
58.权利要求1-17，33，34，40-54，56或57任一项的方法，其中所述细胞在其基因组中还包括编码E2A，或其功能性衍生物，或类似物或片段的序列。
59.权利要求58的方法，其中所述E2A编码序列编码温度敏感性突变体E2A。
60.权利要求1-17，33，34，40-54，56-59任一项方法，其中所述人体细胞不包括其它腺病毒序列。
61.权利要求1-17，33，34，40-54，56-60任一项的方法，其中所述人体细胞能悬浮培养。
62.权利要求1-17，33，34，40-54，56-61任一项的方法，其中所述细胞是ECACC保藏号为96022940的PER.C6，或其衍生物。
63.权利要求1-17，33，34，40-54，56-62任一项的方法，其中所述人体细胞能在无血清的培养基中培养。
64.一种人体细胞在生产重组蛋白中的应用，所述人体细胞基因组中具有编码腺病毒的至少一种E1蛋白，或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，该细胞不产生结构性腺病毒蛋白。
65.权利要求64的应用，其中所述人体细胞与通常的哺乳动物细胞系相比，能产生2-200倍多的重组蛋白。
66.权利要求64或65的应用，其中所述细胞衍生自原代细胞。
67.权利要求64-66的应用，其中所述人体细胞是PER.C6或其衍生物。
68.权利要求64-67的应用，其中所述细胞基因组中还包括编码E2A或其功能性衍生物或类似物或片段的序列。
69.权利要求68的应用，其中所述E2A编码序列编码温度敏感性突变体E2A。
70.一种根据权利要求1-17，33，34，40-54，56-63任一项的方法获得的重组蛋白，所述重组蛋白具有不同于分离的天然相应蛋白的人糖基化模式。
71.一种重组红细胞生成素分子，通过权利要求1-17，56-63的方法，或权利要求64-69的人体细胞的应用而获得。
72.一种人体细胞，其基因组中具有编码腺病毒的至少一种E1蛋白或其功能性衍生物，同源物或片段的序列，该细胞不产生结构性腺病毒蛋白，并具有编码重组蛋白的基因。
73.权利要求72的人体细胞，其衍生自ECACC保藏号为96022940的PER.C6。
74.权利要求72或73的人体细胞，在其基因组中还包括编码E2A或其功能性衍生物，类似物或片段的序列。
75.权利要求74的人体细胞，其中所述E2A是温度敏感性的。
76.权利要求18-32，72-76任一项的细胞，其中内源性DHFR核酸至少功能性缺失。
77.权利要求76的细胞在权利要求1-17，33，34，40-54，56-63任一项方法中的应用，或在权利要求35，36，39，55，64-69任一项应用中的应用。
78.通过权利要求1-12，40-63的任一项的方法，或 64-69任一项的应用而获得的用于疫苗中的一种病毒蛋白，所述病毒蛋白不含任何非人哺乳动物蛋白质物质。
79.具有抗细胞程序死亡活性的腺病毒E1B蛋白，或其功能性衍生物，同源物或片段在增强真核细胞中蛋白质物质生产中的应用，所述应用包括提供所述E1B蛋白，其衍生物，同源物和/或片段给所述真核细胞。
80.权利要求79的应用，包括权利要求18-32，72-78的细胞。
81.权利要求79或80的应用，用于权利要求1-17，33，34，40-54，56-63任一项的方法中，或权利要求35，36，39，55，64-69任一项的应用中。
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