CN1307191C

CN1307191C - 用栀子果实制备栀子苷、京尼平－1－β－D－龙胆双糖苷的方法

Info

Publication number: CN1307191C
Application number: CNB2005100261426A
Authority: CN
Inventors: 范国荣; 周婷婷; 柴逸峰; 吴玉田; 洪战英
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2005-05-24
Filing date: 2005-05-24
Publication date: 2007-03-28
Anticipated expiration: 2025-05-24
Also published as: CN1706858A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是一种从栀子果实中分离纯化高纯度栀子苷、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的方法。包括用水或乙醇水溶液浸泡或回流制备栀子果实粗提物，采用大孔吸附树脂先用大量水充分洗脱直至洗脱液无色，再用低浓度乙醇洗脱，减压浓缩得栀子果实大孔吸附树脂提取物，再采用高速逆流色谱和制备液相色谱相结合的方法对该提取物进行分离纯化，即得高纯度栀子苷、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷。本发明制备方法分离效率高、产品纯度好、操作简便，适于工业化生产。

Description

用栀子果实制备栀子苷、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是一种从栀子果实中分离纯化高纯度栀子苷、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的方法。

背景技术

栀子又名山栀子，是茜草科植物山栀Gardenia jasminoides Ellis.的果实，性苦寒，无毒。栀子始载于《神农本草经》，具有利胆、促胰腺分泌、降压、镇静、降温、抗菌抗炎作用。临床主要用于治疗小儿发热、食管炎和口疮、扭挫外伤、冠心病、急性病毒性肝炎高胆红素血症、急性卡他性结膜炎等。其主要的化学成分为环烯醚萜、黄酮、三萜、有机酸酯等，此外还有d-甘露醇、甾醇类、三萜皂苷类、长链烷烃、醇以及色素等，栀子苷(geniposide)和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷(genipin-1-β-D-geniobioside)属于环烯醚萜苷类化合物，是栀子果实中的主要活性成分[王钢力，陈德昌等.栀子属植物化学成分研究进展.中国中药杂志，1996，21(2)：67；黄胜阳.中国栀子属植物的研究概况.江西中医学院学报，1991，3(1)：59]，它们的结构式如下：

目前，国内外用栀子果实制备栀子苷多采用柱色谱法和重结晶等传统方法分离纯化栀子果实中的有效单体，这类方法或需使用有毒有机溶剂，如硅胶柱层析使用氯仿、甲醇，会造成环境污染；或成本高且操作繁琐，如小性氧化铝填料，价格昂贵[Inouye H，et al.Chem Pharm Bull.1970，18(5)：1066；Inouye H，et al.Phytochemistry.1974，13：2219；Endo T. et al.ChemPharm Bull.1973，21(12)：2684]，而且所用固定相对样品有不可逆性吸附作用。也有采用制备液相色谱法分离纯化栀子苷的[王兰，张鉴.RP-HPLC制备色谱法分离栀子苷单体.2003，25(9)：764]，但其前处理仍需借助上述传统柱层析法，并且采用多次重复制备进行纯化造成栀子苷损失较多。高速逆流色谱(High-speed counter-current chromatography HSCCC)是一种较新的液液分配色谱技术，它不用任何固体支撑体或载体而克服了传统分离方法对样品的不可逆性吸附作用，因而样品回收率高，同时还具有应用范围广、仪器操作简单、分离量大等优点，但目前国内外还未见有将高速逆流色谱应用于栀子中单体化合物的分离纯化。

发明内容

本发明提供一种制备工艺简单快速、回收率高、纯度高且适于工业化生产的用栀子果实制备栀子苷、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的万法。

栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷是栀子果实中的主要成分，鉴于其极性在环烯醚萜苷类成分中相对较弱，故本发明先用大量水将杂质和强极性环烯醚萜苷类成分洗去，再以低浓度乙醇选择性洗脱，得到栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷含量占95％以上的提取物。然后再用高速逆流色谱和制备液相色谱进行分离和纯化。

本发明方法包括如下步骤：

1.制备栀子果实粗提物：

按常规将干燥栀子果实粗粉以水或乙醇水溶液浸泡或回流提取1～3次，过滤，将滤液减压浓缩至稀浸膏，再真空干燥得栀子果实粗提物，得率为25％～30％。

2.纯化：

(1)用大孔吸附树脂纯化：将上述制得的栀子果实粗提物加适量水混悬后，过大孔吸附树脂柱。先用水充分洗脱直至洗脱液无色，水的洗脱体积通常不少于4倍树脂量，弃去洗脱液，再用10％～30％低浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，即得提取物，经高效液相色谱(HPLC)检测，含有95％以上栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷，得率为4％～6％；

(2)用高速逆流色谱和制备液相色谱将栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷分离纯化：构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3或2∶1.5∶3或正丁醇∶水＝1∶1。在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相。先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，取步骤(1)中所得的提取物溶于少量下相，由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“I”、“II”。采用高效液相色谱法对所得流分进行纯度检测(峰面积归一化法)，测得流份“II”纯度高于99％，流份“I”纯度高于85％。再应用制备液相色谱对流份“I”分离纯化，得流份“III”，按上述高效液相色谱法检测，纯度高于99％。挥干溶剂后对流分“II”“III”进行MS、¹HNMR和¹³CNMR分析，根据所得数据进行结构确认，流分“II”为栀子苷，流分“III”为京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷。

本发明采用大孔吸附树脂对样品进行前处理，只使用水和低浓度乙醇洗脱，成本低廉，不污染环境；在洗脱过程中，由于京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷和栀子苷在环烯醚萜类化合物中极性偏小，故首先以大量水洗脱除去其它强极性环烯醚萜苷类成分，再以低浓度乙醇洗脱，得到含京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷和栀子苷95％以上的提取物，操作简单。最后采用高速逆流色谱和制备液相色谱对该提取物中的栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷进行分离纯化，方法简单快速且回收率高，克服了传统制备方法操作繁琐、分离周期长等缺点，并具有分离效率高、产品纯度好、简便、适于工业化生产等优点。

附图说明

图1为经大孔吸附树脂纯化的提取物的高效液相色谱图

图2为经大孔吸附树脂纯化的提取物的高速逆流色谱(HSCCC)的色谱图

图3为本发明京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的制备液相色谱的色谱图

图4为HSCCC分离流分“I”(高速逆流分离所得含京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的流份)高效液相色谱图

图5为制备液相色谱流分“III”(京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷)高效液相色谱图

图6为HSCCC分离流份“II”(栀子苷)高效液相色谱图

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明进行详细描述。

实施例1：

1.制备栀子果实粗提物：

取干燥栀子果实药材粗粉500g，用10倍量50％乙醇回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至稀浸膏，真空干燥得栀子果实粗提物，得率为29.8％。

2.纯化：

(1)用大孔吸附树脂纯化：取上述栀子果实粗提物，加水混悬后总体积为2000ml。加入到装有1500g经预处理过的1300大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸附2小时。用6000ml水洗脱(弃去)。再用6000ml 20％乙醇洗脱，乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得提取物粉末29.51g，得率为5.9％，经HPLC检测，其栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷总含量为95.3％。

(2)应用高速逆流色谱(深圳同田生化有限公司)和制备液相色谱将栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷分离纯化：构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3。在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相。先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，逆流色谱柱体积为300ml，固定相保留率60％，流速2.0ml/min，转速800rpm，检测波长254nm，取步骤(1)所得提取物粉末300mg溶解于10ml下相中，由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“I”、“II”，见图1。对该部分进行HPLC分析表明“II”为单一色谱峰，峰纯度为99.7％，流份“I”纯度为87.6％。再应用制备液相色谱分离纯化流份“I”。HPLC制备条件为色谱柱YWG C₁₈(10.0×200mm i.d.10μm)；流动相为乙腈∶水＝10∶90；流速2.0ml/min；柱温25℃；检测波长238nm。根据检测器谱图接收目标成份，得流分“III”，对该流分进行高效液相分析表明其为单一色谱峰，峰纯度为99.8％。制备液相色谱图见图2。HPLC分析条件为色谱柱Lichrospher C₁₈(4.6×250mmi.d.5μm)；流动相为乙腈∶1％醋酸水溶液＝10∶90；流速0.9ml/min；柱温25℃；检测波长238nm。在此条件下所得各高效液相色谱图见图3、图4、图5、图6，其中峰1为京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷，峰2为栀子苷。将分离得到的“II”、“III”流分挥干，得流分“II”黄色粉末209.4mg，得率为4.1％；流分“III”黄色粉末47.1mg，得率为0.9％。对流分“II”、“III”在VarianINOVA-500型核磁共振仪和Varian MAT-212型质谱仪上，进行¹HNMR、¹³CNMR和MS分析，经结构解析确定流分II为栀子苷，流分III为京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷。所得数据为：流分“II”UVλmax(nm MeOH)：239。ESI-MS：389(M+1)，227，209(M-glu)。¹HNMR(500 MHz，DMSO-d₆)δ：5.12(1H，d，J＝7.0Hz，H-1)，7.5(1H，brs，H-3)，5.6(1H，brs，H-7)，4.2(1H，d，J＝15.0Hz，H-10)，4.0(1H，d，J＝14.0Hz，H-10)，3.6(3H，s，H-12)，4.53(1H，d，J＝8.0Hz，H-1′)。¹³CNMR(500MHz，DMSO-d₆)δ：95.7(C-1)，151.5(C-3)，110.9(C-4)，45.9(C-5)，37.9(C-6)，125.4(C-7)，144.1(C-8)，51(C-9)，59.3(C-10)，166.9(C-11)，34.4(C-12)，98.6(C-1′)，73.3(C-2′)，77.2(C-3′)，70(C-4′)，76.6(C-5′)，61(C-6′)。流分“III”UVλmax(nm MeOH)：239。ESI-MS：549(M-H)，573(M+Na)。¹HNMR(500 MHz，DMSO-d₆)δ：5.12(1H，d，J＝8.0Hz，H-1)，7.5(1H，brs，H-3)，5.7(1H，brs，H-7)，4.2(1H，d，J＝15.0Hz，H-10)，4.0(1H，d，J＝14.0Hz，H-10)，3.6(3H，s，H-12)，4.53(1H，d，J＝8.0Hz，H-1′)，4.24(1H，d，J＝8.0Hz，H-1＂)。¹³CNMR(500 MHz，DMSO-d₆)δ：96.4(C-1)，151.4(C-3)，110.6(C-4)，45.5(C-5)，37.9(C-6)，125.9(C-7)，143.9(C-8)，50.8(C-9)，59.2(C-10)，166.8(C-11)，34.6(C-12)，98.9(C-1′)，73.5(C-2′)，76.5(C-3′)，70.1(C-4′)，76.5(C-5′)，68(C-6′)，103.2(C-1＂)，76.5(C-2")，73(C-3＂)，70(C-4")，76.5(C-5")，61(C-6＂)。

实施例2：

1.制备栀子果实粗提物：

取干燥栀子果实药材粗粉500g，用10倍量水回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至稀浸膏，真空干燥得栀子果实粗提物，得率为28.7％。

2.纯化：

(1)用大孔吸附树脂纯化：取上述栀子果实粗提物，加水混悬后总体积为2000ml。加入到装行1500g经预处理过的AB-8大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸附2小时。用7000ml水洗脱(弃去)。再用4000ml 30％乙醇洗脱，乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得栀子果实大孔吸附树脂提取物粉末32.88g(栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷占94.5％)，得率为6.6％。

(2)应用高速逆流色谱(深圳同田生化有限公司)和制备液相色谱将栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷分离纯化：构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1.5∶3。栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的分离纯化、纯度检测以及结构鉴定的方法、步骤同实施例1。栀子苷得率为4.3％，纯度为99.6％；京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷得率为1.1％，纯度为99.7％。

实施例3：

1.制备栀子果实粗提物：

取干燥栀子果实药材粗粉500g，用10倍量50％乙醇浸泡提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至稀浸膏，真空干燥得栀子果实粗提物，得率为20.3％。

2.纯化：

(1)用大孔吸附树脂纯化：取上述栀子果实粗提物，加水混悬后总体积为2000ml。加入到装有1500g经预处理过的1300大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸附2小时。先用6000ml水洗脱(弃去)。再用8000ml 10％低浓度乙醇洗脱，乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得栀子果实大孔吸附树脂提取物粉末23.47g(栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷占97.5％)，得率为4.7％。

(2)应用高速逆流色谱(深圳同田生化有限公司)和制备液相色谱将栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷分离纯化：构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为正丁醇∶水＝1∶1。栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的分离纯化、纯度检测以及结构鉴定的方法、步骤同实施例1。栀子苷得率为3.9％，纯度为99.8％；京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷得率为0.7％，纯度为99.9％。

实施例4：

1.制备栀子果实粗提物：

2.纯化：

(1)用大孔吸附树脂纯化：取上述栀子果实粗提物，加水混悬后总体积为2000ml。加入到装有1500g经预处理过的D101大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸附2小时。先用7000ml水洗脱(弃去)。再用7000ml 30％乙醇洗脱，乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得栀子果实大孔吸附树脂提取物粉末30.23g(栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷占97.2％)，得率为6.0％。

(2)应用高速逆流色谱(深圳同田生化有限公司)和制备液相色谱将栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷分离纯化：构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3。栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的分离纯化、纯度检测以及结构鉴定的方法、步骤同实施例1。栀子苷得率为4.1％，纯度为99.7％；京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷得率为0.9％，纯度为99.8％。

Claims

1.一种从栀子果实中制备高纯度栀子苷、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的方法，包括如下步骤：

1.1制备栀子果实粗提物：

按常规将干燥栀子果实粗粉以水或乙醇水溶液浸泡或回流提取1～3次，过滤，将滤液减压浓缩至稀浸膏，再真空干燥得栀子果实粗提物；

1.2纯化：

1.2.1用大孔吸附树脂纯化：将上述制得的栀子果实粗提物加适量水混悬后，过大孔吸附树脂，先用水充分洗脱直至洗脱液无色，再用10％～30％低浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，得提取物；

1.2.2用高速逆流色谱和制备液相色谱将栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷分离纯化：构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3或2∶1.5∶3或正丁醇∶水＝1∶1，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相，先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，将步骤1.2.1中所得的提取物溶于少量下相中，由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“I”、“II”，再应用制备液相色谱对流分“I”分离纯化，得流分“III”，流分“II”、“III”分别为栀子苷和京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷。

2.按权利要求1所述的用栀子果实制备高纯度栀子苷、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的方法，其特征在于制备栀子果实粗提物时，用50％乙醇回流提取。

3.按权利要求1或2所述的用栀子果实制备高纯度栀子苷、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的方法，其特征在于用大孔吸附树脂纯化时，水的洗脱体积不少于4倍树脂量。

4.按权利要求1或2所述的用栀子果实制备高纯度栀子苷、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的方法，其特征在于用大孔吸附树脂纯化时，所说的低浓度乙醇为20％乙醇。

5.按权利要求3所述的用栀子果实制备高纯度栀子苷、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的方法，其特征在于用大孔吸附树脂纯化时，所说的低浓度乙醇为20％乙醇。

6.按权利要求1或2或5所述的用栀子果实制备高纯度栀子苷、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的方法，其特征在于所说的大孔吸附树脂为1300或D101或AB-8型大孔吸附树脂。

7.按权利要求3所述的用栀子果实制备高纯度栀子苷、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的方法，其特征在于所说的大孔吸附树脂为1300或D101或AB-8型大孔吸附树脂。

8.按权利要求4所述的用栀子果实制备高纯度栀子苷、京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的方法，其特征在于所说的大孔吸附树脂为1300或D101或AB-8型大孔吸附树脂。