CN101362768A - 白芷中单体化合物的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种从白芷中分离纯化高纯度的单体化合物花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素的方法，国内外多采用柱层析或重结晶等传统方法来分离纯化，最近也有人采用高速逆流色谱来分离纯化，但分离效果均不理想。本发明先用水或乙醇水溶液浸泡或回流制备白芷粗提物，采用大孔吸附树脂先分别以水和低浓度乙醇洗脱去除水溶性杂质，再用较高浓度乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩得白纸大孔吸附树脂提取物，再采用二维柱切换高效制备液相色谱对该提取物进行分离纯化，即得纯度高于99％的花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素。本发明的方法操作简便，分离效率高、产品纯度好，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种从白芷中分离纯化高纯度的单体化合物花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素的方法。
背景技术
白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHoo k.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根，是中医临床常用中药之一，它始载于《神农本草经》，性温、味辛，具有祛风、除湿、行气、止痛、消疮、止血、美容的功效；用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛、鼻渊、牙痛、疮疡肿痛等。现代药理学研究表明白芷具有抗炎、解热、镇痛、抗病原微生物的作用，能抑制银屑病，治疗白癜风，具有桔抗副交感神经的作用，有解痉止痛效果等。目前普遍认为香豆素类化合物是白芷的主要活性成分，其中包括花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素(ChenY，et al.J PharmBiomed Anal.2006，41：105；XieY，et al.J Pharm Biomed Anal.2007，44：166)，它们的结构式如下：
花椒毒酚
奥斯生诺
水合氧化前胡素
白当归素
欧前胡素
目前，国内外多采用柱层析或重结晶等传统方法分离纯化白芷中的活性单体，这类方法或成本高且分离效果不理想，如硅胶柱层析需要大量有机溶剂，难分离成分比较复杂或结构相近的成分；或耗时长，如重结晶一次操作周期长，难以实现连续化生产(卢艳花等.中药有效成分提取分离技术.2005，230；Yongsoo K，et al.Phytochemistry.1997，44：887)。近几年，国内也有人采用高速逆流色谱这种较新的液液分配色谱技术来分离纯化白芷中的活性单体，但是该方法的柱效不高，分离的组分不够多(Liu RM，et al.J Chromatogr A.2004，1052：223；Wei Y，et al.J Chromatogr A.2006，1115：112)。
二维柱切换高效制备液相色谱(Two-dimensional preparativehigh-performance liquid chromatography with column switch technology)是一种新型的液相色谱分离技术，是将具有一定正交性的两只不同制备型色谱柱串联起来构成的分离系统。极性相近、在第一维制备色谱柱上不能完全分离的组分通过六通切换阀被选择性地部分或全部转移到第二维的制备色谱柱中，继而进一步分离(Zhou TT，et al.J Chromatogr B.2007，858：296；Zhao WQ，etal.J Sep Sci.2007，30：2370)。与传统的分离纯化技术相比，二维柱切换高效制备液相色谱技术是一种更有效的分离方法，具有高分辨率、高效率、高产率的优点，在天然产物的分离和纯化方面有着广阔的应用前景。
目前国内外尚未见有将二维柱切换高效制备液相色谱应用于白芷中单体化合物的分离纯化。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备工艺简单快速、回收率高、纯度高且适于工业化生产的，从白芷中分离纯化单体化合物花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素的方法。
白芷中主要成分为香豆素类成分，成分比较复杂，其中大多结构十分相近，传统的一维高效制备液相色谱技术无法在较短的时间内使各极性相近的香豆素类化合物获得有效的分离。本发明采用二维柱切换高效制备液相色谱技术，利用第一维和第二维不同的色谱分离条件将目标化合物花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素与其他极性相近的干扰成分分离，从而获得高纯度的目标化合物。
本发明提供一种从白芷中分离纯化单体化合物花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素的方法，包括以下步骤：
1.制备白芷粗提物：
按常规将干燥白芷根粗粉以水或乙醇水溶液浸泡或回流提取1～3次，过滤，将滤液减压浓缩至无醇味，得白芷粗提液.
2.纯化：
(a)用大孔吸附树脂纯化：将上述制得的白芷粗提液加适量水混悬后，过大孔吸附树脂柱。先依次用水、10％～30％浓度的乙醇溶液充分洗脱，弃去洗脱液，再用60～70％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，即得提取物，经分析型高效液相色谱检测，含有70％以上花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素，得率为0.5％～1％；
(b)用二维柱切换高效制备液相色谱将花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素分离纯化：
第一维高效制备液相色谱分离条件为色谱柱Lichrospher C18(100mm×10mm i.d.；5μm)，流动相为0min～11min：乙腈:甲醇:水＝20:12:68，11min～15min：乙腈:甲醇:水＝60:12:28；流速为10.0ml/min；检测波长为311nm；柱温为30℃；
第二维高效制备液相色谱分离条件为色谱柱YMC ODS-C18(250mm×10mm i.d.；5μm)，流动相为乙腈:甲醇:水＝20:12:68；流速为3.5ml/min；检测波长为311nm；柱温为30℃；
取步骤(a)所得提取物粉末溶解于流动相，由第一维的六通进样阀进样，采用二维高效制备液相色谱分离白芷提取物，通过连接第一维和第二维的六通切换阀将第一维难以分离的组分切入第二维进行分离，这些组分完全切入后，又通过六通切换阀将样品重新切回至第一维继续分离，根据检测器图谱接收流分“I”、“II”、“III”、“IV”、“V”。采用分析型高效液相色谱对接收的流分进行纯度检测(峰面积归一化法)，测得流分“I”、“II”、“III”、“IV”、“V”均为单一色谱峰，峰纯度高于99％；挥干溶剂后对流分“I”、“II”、“III”、“IV”、“V”进行MS、1HNMR和13CNMR分析，根据所得数据进行结构确认，流分“I”为花椒毒酚，流分“II”为奥斯生诺，流分“III”为水合氧化前胡素，流分“IV”为白当归素，流分“V”为欧前胡素。
上述方法制备白芷粗提液时，用70％乙醇回流提取。
上述方法中用大孔吸附树脂纯化时，先依次用水、10％和30％浓度的乙醇溶液充分洗脱，弃去洗脱液，再用60％～70％浓度的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥即得提取物。
上述方法中所述的大孔吸附树脂为1300或D101或AB-8型大孔吸附树脂。
本发明采用大孔吸附树脂对样品进行前处理，只使用水和低浓度乙醇洗脱，成分低廉，不污染环境；在对目标组分分离纯化过程中，针白芷中香豆素类成分结构、极性均十分相近的情况，利用二维柱切换高效制备液相色谱技术中第一维和第二维不同的色谱分离条件将目标化合物与干扰组分分离，从而从白芷中制备得到高纯度的花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素，方法简单快速且回收率高，克服了传统制备方法操作繁琐，分离周期长、分离组分不够多等缺点，并具有分离效率高、产品纯度好、简便、适于工业化生产等优点。
附图说明
图1为经大孔吸附树脂纯化的提取物的分析型高效液相色谱图
图2为经大孔吸附树脂纯化的提取物的一维高效制备液相色谱图
图3为经大孔吸附树脂纯化的提取物的二维柱切换高效制备液相色谱图(第一维)
图4为经大孔吸附树脂纯化的提取物的二维柱切换高效制备液相色谱图(第二维)
图5为经大孔吸附树脂纯化的提取物连续进样时的二维柱切换高效制备液相色谱图(第一维)
图6为经大孔吸附树脂纯化的提取物连续进样时的二维柱切换高效制备液相色谱图(第二维)
图7为二维柱切换高效制备液相色谱分离所得流分“I”(花椒毒酚)的分析型高效液相色谱图
图8为二维柱切换高效制备液相色谱分离所得流分“II”(奥斯生诺)的分析型高效液相色谱图
图9为二维柱切换高效制备液相色谱分离所得流分“III”(水合氧化前胡素)的分析型高效液相色谱图
图10为二维柱切换高效制备液相色谱分离所得流分“IV”(白当归素)的分析型高效液相色谱图
图11为二维柱切换高效制备液相色谱分离所得流分“V”(欧前胡素)的分析型高效液相色谱图
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。
实施例1：
1.制备白芷粗提液：
取干燥白芷根药材粗粉90g，用10倍量70％乙醇70℃水浴下回流提取2次，每次2小时，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至无醇味，得白芷粗提液。
2.纯化
(1)用大孔吸附树脂纯化：取上述白芷粗提液，加水混悬后总体积为60ml。加入到装有100g经预处理过的1300型大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸附2小时。先依次用水、10％及30％乙醇各200ml洗脱(弃去)，再用400ml70％乙醇洗脱，乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得提取物粉末0.79g，得率为0.9％，经分析型高效液相色谱检测，其中花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素总含量为78.2％，色谱图见图1。
(2)用二维柱切换高效制备液相色谱将花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素分离纯化：第一维高效制备液相色谱分离条件为色谱柱Lichrospher C18(100mm×10mm i.d.；5μm，汉邦公司)；流动相为0min～11min：乙腈:甲醇:水＝20:12:68，11min～15min：乙腈:甲醇:水＝60:12:28；流速为10.0ml/min；检测波长为311nm；柱温为30℃。第二维高效制备液相色谱分离条件为色谱柱YMC ODS-C18(250mm×10mm i.d.；5μm，YMC公司)；流动相为乙腈:甲醇:水＝20:12:68；流速为3.5ml/min；检测波长为311nm；柱温为30℃。取步骤(1)所得提取物粉末0.76g溶解于50ml流动相(乙腈:甲醇:水＝20:12:68)，由第一维的六通进样阀进样，每次进样量为2.0ml。采用一维高效制备液相色谱分离白芷提取物的完整图谱见图2，整个分离时间为22min，其中柱平衡时间为5min。采用二维高效制备液相色谱分离白芷提取物，当第一维上分离时间达到5.5min时，通过连接第一维和第二维的六通切换阀将第一维难以分离的三个组分切入第二维进行分离，当第一维上分离时间达到11.5min时，通过六通切换阀将样品重新切回至第一维继续分离，根据检测器图谱接收流分“I”、“II”、“III”、“IV”、“V”，第一维和第二维图分别见图3和图4。三次连续进样时，第一维和第二维图分别见图5、图6。用分析型高效液相色谱对接收的流分进行分析表明流分“I”、“II”、“III”、“IV”、“V”均为单一色谱峰，峰纯度分别为99.0％、99.3％、99.4％、99.8％、99.2％。分析型高效液相色谱条件为色谱柱YMC ODS-C18(250mm×4.6mm i.d.；5μm)；流动相为0min～48min：乙腈:甲醇:水＝20:12:68，48min～70min：乙腈：甲醇:水＝60:12:28；流速为0.75ml/min；检测波长为311nm；柱温为30℃；进样量为20μl。在此条件下所得各分析型高效液相色谱图见图7、图8、图9、图10、图11，其中峰I为花椒毒酚，峰II为奥斯生诺，峰III为水合氧化前胡素，峰IV为白当归素，峰V为欧前胡素。将分离所得的“I”、“II”、“III”、“IV”、“V”流分挥干，得流分“I”粉末87.6mg，得率为0.10％；流分“II”粉末65.1mg，得率为0.07％；流分“III”粉末283.1mg，得率为0.31％；流分“IV”粉末90.7mg，得率为0.10％；流分“V”粉末17.6mg，得率为0.02％。
对流分“I”、“II”、“III”、“IV”、“V”在Varian INOVA-500型核磁共振仪和Varian MAT-212型质谱仪上，进行1HNMR、13CNMR和MS分析，经结构解析并与文献数据比对，确定流分I为花椒毒酚，流分II为奥斯生诺，流分III为水合氧化前胡素，流分IV为白当归素，流分V为欧前胡素。具体数据为：
流分“I”：1HNMR(500MHz，CDCl3)δ：7.8(1H，d，J＝9.6Hz，H-4)，7.7(1H，d，J＝2.4Hz，H-2’)，7.3(1H，s，H-5)，6.8(1H，d，J＝2.4Hz，H-3’)，6.4(1H，d，J＝9.6Hz，H-3)，6.18(1H，br.s，OH).13CNMR(500MHz，CDCl3)δ：160.1(C-2)，114.4(C-3)，144.8(C-4)，110.7(C-5)，126.1(C-6)，144.4(C-7)，129.4(C-8)，139.1(C-9)，115.8(C-10)，147.1(C-2’)，106.8(C-3’)。
流分“II”：1HNMR(500MHz，CDCl3)δ：7.6(1H，d，J＝9.6Hz，H-4)，7.3(1H，d，J＝8.4Hz，H-5)，6.8(1H，d，J＝8.4Hz，H-6)，6.2(1H，d，J＝9.6Hz，H-3)，5.2(1H，m，H-2’)，4.9(1H，s，OH)，3.5(2H，d，J＝7.2Hz，H-1’)，1.8(3H，s，H-4’)，1.7(3H，s，H-5’).13CNMR(500MHz，CDCl3)δ：162.3(C-2)，112.1(C-3)，144.8(C-4)，126.3(C-5)，112.1(C-6)，159.2(C-7)，115.1(C-8)，154.7(C-9)，111.8(C-10)，22.1(C-1’)，121.0(C-2’)，135.8(C-3’)，25.4(C-4’)，17.8(C-5’)。
流分“III”：1HNMR(500MHz，CDCl3)δ：8.2(1H，d，J＝9.6Hz，H-4)，7.6(1H，d，J＝2.4Hz，H-2’)，7.1(1H，s，H-8)，7.0(1H，d，J＝2.4Hz，H-3’)，6.3(1H，d，J＝9.6Hz，H-3)，4.6(1H，dd，J＝2.8，9.7Hz，H-1”a)，4.5(1H，dd，J＝2.8，9.7Hz，H-1”b)，3.9(1H，m，H-2”)，3.1(1H，d，J＝4.4Hz，OH)，2.4(1H，s，OH)，1.4(3H，s，H-5”)，1.3(3H，s，H-4”).13CNMR(500MHz，CDCl3)δ：161.2(C-2)，113.0(C-3)，139.2(C-4)，148.6(C-5)，114.3(C-6)，158.1(C-7)，94.8(C-8)，152.5(C-9)，107.3(C-10)，145.3(C-2’)，104.7(C-3’)，71.8(C-1”)，74.5(C-2”)，76.6(C-3”)，26.7(CH3)，25.2(CH3)。
流分“IV”：1HNMR(500MHz，CDCl3)δ：8.1(1H，d，J＝9.6Hz，H-4)，7.6(1H，d，J＝2.4Hz，H-2’)，7.0(1H，d，J＝2.4Hz，H-3’)，6.3(1H，d，J＝9.6Hz，H-3)，4.6(1H，dd，J＝3.0，9.0Hz，H-1”a)，4.2(1H，dd，J＝3.0，9.0Hz，H-1”b)，4.1(3H，s，OCH3)，3.8(1H，m，H-2”)，2.3(2H，br.s，OH)，1.3(3H，s，H-4”)，1.2(3H，s，H-5”).13CNMR(500MHz，CDCl3)δ：160.1(C-2)，112.8(C-3)，139.4(C-4)，144.8(C-5)，114.5(C-6)，150.1(C-7)，126.7(C-8)，143.9(C-9)，107.5(C-10)，145.1(C-2’)，105.2(C-3’)，71.5(C-1”)，76.1(C-2”)，76.2(C-3”)，26.5(C-4”)，25.1(C-5”)，60.8(OCH3)。
流分“V”：1HNMR(500MHz，CDCl3)δ：6.4(1H，d，J＝9.5Hz，H-3)，7.8(1H，d，J＝9.5Hz，H-4)，7.4(1H，s，H-5)，7.7(1H，d，J＝2.2Hz，H-2’)，6.8(1H，d，J＝2.2Hz，H-3’)，5.0(2H，d，J＝7.2Hz，H-1”)，5.6(1H，d，J＝7.2Hz，H-2”)，1.7(3H，s，H-4”)，1.8(3H，s，H-5”).13CNMR(500MHz，CDCl3)δ：160.5(C-2)，116.5(C-3)，131.8(C-4)，144.3(C-5)，119.9(C-6)，148.7(C-7)，106.7(C-8)，146.6(C-9)，114.8(C-10)，143.9(C-2’)，113.3(C-3’)，70.2(C-1”)，125.9(C-2”)，139.8(C-3”)，25.8(C-4”)，18.3(C-5”)。
实施例2：
1.制备白芷粗提液：
取干燥白芷根药材粗粉90g，用10倍量70％乙醇70℃水浴下回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至无醇味，得白芷粗提液。
2.纯化
(1)用大孔吸附树脂纯化：取上述白芷粗提液，加水混悬后总体积为60ml。加入到装有100g经预处理过的D101型大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸附2小时。分别用200ml水及10％、30％乙醇洗脱(弃去)。再用400ml60％乙醇洗脱，乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得提取物粉末0.72g，得率为0.8％，经分析型高效液相色谱检测，其中花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素总含量为73.6％。
(2)用二维柱切换高效制备液相色谱将花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素分离纯化：花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素分离纯化、纯度检测以及结构鉴定的方法、步骤同实施例1，根据检测器图谱接收流分“I”、“II”、“III”、“IV”、“V”，花椒毒酚“I”得率为0.10％，奥斯生诺“II”得率为0.07％，水合氧化前胡素“III”得率为0.28％，白当归素“IV”得率为0.09％，欧前胡素“V”得率为0.02％。
实施例3：
1.制备白芷粗提液：
取干燥白芷根药材粗粉90g，用10倍量70％乙醇70℃水浴下回流提取2次，每次3小时，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至无醇味，得白芷粗提液。
2.纯化
(1)用大孔吸附树脂纯化：取上述白芷粗提液，加水混悬后总体积为60ml。加入到装有100g经预处理过的AB-8型大孔吸附树脂层析柱上，上样完毕后吸附2小时。分别用200ml水及10％、30％乙醇洗脱(弃去)。再用400ml60％乙醇洗脱，乙醇洗脱流份减压浓缩后，真空干燥(60℃)，得提取物粉末0.78g，得率为0.9％，经分析型高效液相色谱检测，其中花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素总含量为76.2％。
(2)用二维柱切换高效制备液相色谱将花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素分离纯化：花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素分离纯化、纯度检测以及结构鉴定的方法、步骤同实施例1，根据检测器图谱接收流分“I”、“II”、“III”、“IV”、“V”，花椒毒酚“I”得率为0.09％，奥斯生诺“II”得率为0.08％，水合氧化前胡素“III”得率为0.32％，白当归素“IV”得率为0.11％，欧前胡素“V”得率为0.02％。
Claims (5)
1、一种从白芷中分离纯化单体化合物花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
A.制备白芷粗提物：
将干燥白芷根粗粉以水或乙醇水溶液浸泡或回流提取1～3次，过滤，将滤液减压浓缩至无醇味，得白芷粗提液；
B.纯化：
(a)用大孔吸附树脂纯化：
将上述制得的白芷粗提液加水混悬后，过大孔吸附树脂柱，先依次用水、10％～30％浓度的乙醇溶液充分洗脱，弃去洗脱液，再用60～70％浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，即得提取物；
(b)用二维柱切换高效制备液相色谱将花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素分离纯化：
第一维高效制备液相色谱分离条件为色谱柱Lichrospher C18(100mm×10mm i.d.；5μm)，流动相为0min～11min:乙腈:甲醇:水＝20:12:68，11min～15min:乙腈:甲醇:水＝60:12:28；流速为10.0ml/min；检测波长为311nm；柱温为30℃；
第二维高效制备液相色谱分离条件为色谱柱YMC ODS-C18(250mm×10mm i.d.；5μm)，流动相为乙腈:甲醇:水＝20:12:68；流速为3.5ml/min；检测波长为311nm；柱温为30℃；
取步骤(a)所得提取物粉末溶解于流动相，由第一维的六通进样阀进样，采用二维高效制备液相色谱分离白芷提取物，通过连接第一维和第二维的六通切换阀将第一维难以分离的组分切入第二维进行分离，这些组分完全切入后，又通过六通切换阀将样品重新切回至第一维继续分离，根据检测器图谱接收流分“I”、“II”、“III”、“IV”、“V”；采用分析型高效液相色谱对接收的流分进行纯度检测，测得流分“I”、“II”、“III”、“IV”、“V”均为单一色谱峰，峰纯度高于99％；挥干溶剂后对流分“I”、“II”、“III”、“IV”、“V”进行MS、1HNMR和13CNMR分析，根据所得数据进行结构确认，流分“I”为花椒毒酚，流分“II”为奥斯生诺，流分“III”为水合氧化前胡素，流分“IV”为白当归素，流分“V”为欧前胡素。
2、根据权利要求1所述的一种从白芷中分离纯化单体化合物花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素的方法，其特征在于制备白芷粗提液时，用70％乙醇回流提取。
3、根据权利要求1或2所述的一种从白芷中分离纯化单体化合物花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素的方法，其特征在于用大孔吸附树脂纯化时，先依次用水、10％和30％浓度的乙醇溶液充分洗脱，弃去洗脱液，再用60％～70％浓度的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩干燥，即得提取物。
4、根据权利要求1或2所述的一种从白芷中分离纯化单体化合物花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素的方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂为1300、D101或AB-8型大孔吸附树脂。
5、根据权利要求3所述的一种从白芷中分离纯化单体化合物花椒毒酚、奥斯生诺、水合氧化前胡素、白当归素和欧前胡素的方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂为1300、D101或AB-8型大孔吸附树脂。
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