CN1304450A - 具有增强的锌结合力的新型胰岛素类似物 - Google Patents
具有增强的锌结合力的新型胰岛素类似物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及具有增强的锌结合力的胰岛素类似物及其稳定的锌复合物,与人胰岛素相比,它们具有延迟的活性。本发明还涉及所述胰岛素类似物的生产方法及用途,尤其是作为药物制剂用于治疗Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病的用途。
Description
本发明涉及具有增强的锌结合力的胰岛素类似物及其稳定的锌复合物，与人胰岛素比较，它们具有延迟作用性，本发明还涉及它们的制备方法和用途，尤其是用作药物制剂，治疗Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病。
全世界大约1亿2千万人患有糖尿病，其中约1千2百万人是Ⅰ型糖尿病，对这些人来说，替代所缺少的内分泌胰岛素分泌是目前唯一可行的疗法。患者需要注射胰岛素，通常每天数次，持续一生。与Ⅰ型糖尿病不同，Ⅱ型糖尿病基本上不缺少胰岛素，但是大量病例，尤其是晚期病例，使用胰岛素治疗，并适当地配以一种口服抗糖尿病药物，据认为是最佳治疗方案。
健康人中，胰腺释放胰岛素与血糖浓度密切相关。血糖水平的升高，如餐后，由相应增加胰岛素的分泌量迅速补偿。空腹状态，血浆胰岛素水平回落到基础值，足以保证对胰岛素敏感型组织和器官持续供应葡萄糖，并维持夜间肝糖的低量产生。利用外源胰岛素代替内源性胰岛素分泌物，通常大多通过皮下给药方式，几乎达不到上述血糖生理调节的质量。经常会失去对血糖向上或向下的控制，这在那些非常严重的病例中可能会危及生命。另外，没有原始症状下血糖水平多年升高对健康也具有相当大危险。在美国，大量的DCCT研究(糖尿病控制及并发症试验研究组(1993)，新英格兰医学杂志329,977-986)清楚证明，血糖水平的慢性升高是引起糖尿病晚期损伤发展的主要因素。糖尿病的晚期损伤是微小血管和大血管的损伤，在一定环境下表现为视网膜病、肾病或神经病，导致失明、肾衰竭和肢端损失，并常伴有高危险性的心血管病。因此，一种完善的糖尿病治疗方案，其首要目的必须是尽可能地将血糖水平保持在生理范围内。按照强化胰岛素治疗的概念，这要靠每天大量注射快速和缓慢作用的胰岛素制剂来达到。进餐时给予快速作用制剂，以平衡饭后血糖升高，而缓慢作用基础胰岛素应保证胰岛素的基本供应，特别是在晚上，不至导致低血糖。
目前可用的基础胰岛素不足以满足上述要求，特别是常用的NPH胰岛素，最大作用太强，而全程作用又太短。晚上给药时，会陷于夜间低血糖和清晨高血糖的危险。
EP 0 821 006公开了具有增强的锌结合力的胰岛素类似物，结合锌后与人胰岛素相比，它具有延迟作用形式。基本上这些类似物与人胰岛素不同在于其A链的A21位氨基酸变异，并在B链的B30位加入一个His残基或一段含有1-5个His残基的长度为2-35个氨基酸残基的肽。
本发明的目的在于进一步提供胰岛素类似物(人或动物胰岛素的类似物)，它们具有增强的锌结合力，能形成一种包含胰岛素类似物六聚体和锌的稳定复合物，并用在合适的制剂中，由于其与人胰岛素相比所具有的延迟作用形式，使改善皮下注射治疗Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病成为可能。
胰岛素类似物来自天然产生的胰岛素，即人胰岛素(见SEQ ID NO:1：人胰岛素A链及SEQ ID NO:2：人胰岛素B链)或动物胰岛素，通过在天然胰岛素的A链和/或B链中替换或缺失至少一个天然氨基酸残基和/或添加至少一个氨基酸残基获得。
本发明目的通过以下方式达到
1．式Ⅰ的一种胰岛素类似物或其生理可耐受盐
其中
(A1-A5)为人胰岛素(参见SEQ ID NO:1)或动物胰岛素A链A1-A5位点的氨基酸残基，
(A15-A19)为人胰岛素(参见SEQ ID NO:1)或动物胰岛素A链A15-A19位点的氨基酸残基，
(B8-B18)为人胰岛素(参见SEQ ID NO:2)或动物胰岛素B链B8-B18位点的氨基酸残基，
(B20-B29)为人胰岛素(参见SEQ ID NO:2)或动物胰岛素B链B20-B29位点的氨基酸残基，
R8为Thr或Ala，
R9为Ser或Gly，
R10为Ile或Val，
R14为Tyr、His、Asp或Glu，
R21为Asn、Asp、Gly、Ser、Thr、Ala、Glu或Gln，
R1为任意合乎需要的遗传上可编码的氨基酸残基、缺失或氢原子，
R2为Val、Ala或Gly，
R3为Asn、His、Glu或Asp，
R4为Ala、Ser、Thr、Asn、Asp、Gln、Gly或Glu，
R30为任意合乎需要的遗传上可编码的氨基酸残基或-OH，
Z为氢原子或一段含有1-4个遗传上可编码的氨基酸残基的肽，包括1-4个His残基，
附带条件是当Z为氢原子时，R1或R3为His、Glu或Asp，如果R1为中性或带负电荷氨基酸残基，R3则为His，或者附带条件是如果其中Z为氢原子，R14为His、Asp或Glu，此外附带条件是式Ⅰ的胰岛素类似物或其生理可耐受盐与人胰岛素相比，差异不是只在于式Ⅰ中R3位点，或R3和R21位点，或R3和R4位点氨基酸残基变异(参见SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)。
优选地，此胰岛素类似物或其生理可耐受盐是其中
2．R8为Thr，R9为Ser和R10为Ile，
3．R1为Phe、His、Asn、Asp或Gly，
4．R30为Thr、Ala或Ser，或
5．其中R21为Asn和R1为Phe。
6．本发明优选的实施方案是一种式Ⅰ的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中R2为Val，R3为Asn和R4为Gln。
一种式Ⅰ的胰岛素类似物或其生理可耐受盐另外的优选方案，其区别在于R14为
7．Tyr，
8．His，
9．Asp或
10．Glu。
一种式Ⅰ的胰岛素类似物或其生理可耐受盐另外的优选方案，其区别在于R30为
11．Thr，
12．Ala，
13．Ser或
14．-OH。
一种式Ⅰ的胰岛素类似物或其生理可耐受盐另外的优选方案，其区别在于Z为
15．His，
16．His-Ala-或
17．His-Ala-Ala-。
根据本发明胰岛素类似物的实例是
18．一种式Ⅰ的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其区别在于B链具有序列His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu TyrLeu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys(SEQ ID NO:3)，例如His(B0),des(B30)人胰岛素，
19．一种式Ⅰ的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其区别在于B链具有序列His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu TyrLeu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
(SEQ ID NO:4)，例如His(B0)-人胰岛素，
20．一种式Ⅰ的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其区别在于B链具有序列His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala LeuTyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
(SEQ ID NO:5)，例如His(B-1),Ala(B0)人胰岛素或
21．一种式Ⅰ的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其区别在于B链具有序列His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu AlaLeu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
(SEQ ID NO:6)，例如His(B-2),Ala(B-1),Ala(B0)-人胰岛素。
本发明还涉及制备本发明胰岛素类似物或其生理可耐受盐的方法，包括构建一种复制型表达载体，该载体含有编码具有氨基酸序列Ⅱ的胰岛素类似物前体的DNA序列：Met-X2m-(Arg)p-Z-R1-R2-R3-R4-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B29)-R30-X1n-Arg-(A1-A5)-Cys-Cys-R8-R9-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(A15-A19)-Cys-R21Ⅱ，
其中
X1n为含有n个氨基酸残基的肽链，n为0-34的整数，
X2m为含有m个氨基酸残基的肽链，m为0-20的整数，
p为0、1或2，
R30为任意合乎需要的遗传上可编码的氨基酸残基，或者缺失以及
Z缺失或为一具有1-4个遗传上可编码的氨基酸残基的肽段，包括1-4个His残基，
其它变量具有上面No.1所述含义，上述附带条件仍然适用，
在宿主细胞中表达以及利用化学和/或酶学方法从其前体释放胰岛素类似物。
宿主细胞优选细菌，特别优选大肠杆菌(E.coli)。
宿主细胞优选酵母，特别优选酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
在大肠杆菌中表达时，所述融合蛋白(SEQ ID NO:7-9)通常形成不溶性的包涵体，可在细胞破碎后离心分离，用变性剂(例如8M尿素或6M盐酸胍)重新溶解。可将溶解的融合蛋白进行亚硫酸盐解，将巯基(SH)转变为S-磺酸盐(例如R.C.Marshall和A.S.Iglis，实用蛋白质化学手册，A.Darbre编写(1986)，49-53页)，从而改善该融合蛋白的溶解性，易于诸如利用阴离子交换或凝胶渗透层析方法纯化。
将衍生化的融合蛋白转变为具有天然空间结构是和正确形成的二硫桥(折叠)的前胰岛素原(preproinsulin)在稀释的水溶液中，加入一定量的巯基试剂，如巯基乙醇、Cys或谷胱甘肽，随后进行空气氧化作用进行的。作为一个替代方法，未溶解、未衍生化的融合蛋白也可以在类似的条件下直接进行折叠(EP-A-0 600 372,EP-A-0 668292)。
然后通过有限的蛋白裂解作用，将前胰岛素原转变成生物活性胰岛素。为此，可能利用胰蛋白酶将式Ⅱ的前体序列Met-X2m-(Arg)p去除，并在X1n-Arg所示的肽链处断裂，从而分开B链和A链。通常，序列X1始于Arg、Arg2或不存在(n=0)，因此裂解后得到的胰岛素衍生物在B链的C端被Arg、Arg2了，这些氨基酸可用羧肽酶B去除。也可提高胰蛋白酶浓度或延长作用时间进行胰蛋白酶裂解作用，使在Lys(B29)处再次断裂，这种情况下，产生一种des(B30)胰岛素衍生物。
裂解过程中形成的胰岛素类似物可以用标准的层析步骤(例如离子交换和反相层析)进行纯化，最后通过沉淀、结晶或简单的冻干得到分离。
优选地，该胰岛素类似物前体含有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgHis Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu ValCys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro GlyAla Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn TyrCys Asn
(SEQ ID NO:7)，例如His(B0)-前胰岛素原序列，或序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgHis Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr LeuVal Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro GlyAla Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn TyrCys Asn
(SEQ ID NO:8)，例如His(B-1),Ala(B0)-前胰岛素原序列，或序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgHis Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu TyrLeu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro GlyAla Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile CysSer Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
(SEQ ID NO:9)，例如His(B-2),Ala(B-1),Ala(B0)-前胰岛素原序列。
本发明还涉及上述本发明胰岛素类似物的前体，特别是前胰岛素原，及编码本发明胰岛素类似物前体的DNA序列，含有编码本发明新型胰岛素类似物前体的DNA序列的表达载体，以及利用此种表达载体转化的宿主细胞。
根据本发明，本发明还涉及一种药物制剂，其中包含至少一种胰岛素类似物和/或至少一种生理可耐受盐。
优选地，该药物制剂区别在于它包含溶解、无定型和/或结晶形式的本发明胰岛素类似物和/或其生理可耐受盐。
该药物制剂还可另外包含一种贮存辅助物，优选硫酸鱼精蛋白，其中胰岛素类似物和/或其生理可耐受盐优选地以与硫酸鱼精蛋白共结晶的形式存在。
根据本发明的药物制剂还可另含有未修饰的人胰岛素和/或其它胰岛素类似物，优选Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-人胰岛素。
根据本发明，本发明还涉及一种具有胰岛素活性的注射液其中包括溶解形式的本发明药物制剂，优选含1μg-2mg锌/ml，特别优选含5μg-200μg锌/ml。
本发明还涉及本发明胰岛素类似物和/或其生理可耐受盐在制备具有延迟起始作用形式的胰岛素活性的药物制剂方面的用途。
开始处所列的目的还通过一种胰岛素-锌复合物达到，该复合物包括胰岛素六聚体和4-10个锌离子/胰岛素六聚体，其中该胰岛素六聚体由六分子式Ⅰ的胰岛素类似物组成
其中，
(A1-A5)为人胰岛素或动物胰岛素A链A1-A5位点的氨基酸残基，
(A15-A19)为人胰岛素或动物胰岛素A链A15-A19位点的氨基酸残基，
(B8-B18)为人胰岛素或动物胰岛素B链B8-B18位点的氨基酸残基，
(B20-B29)为人胰岛素或动物胰岛素B链B20-B29位点的氨基酸残基，
R8为Thr或Ala，
R9为Ser或Gly，
R10为Ile或Val，
R14为Tyr、His、Asp或Glu，
R21为Asn、Asp、Gly、Ser、Thr、Ala、Glu或Gln，
R1为任意合乎需要的遗传上可编码的氨基酸残基、缺失或为氢原子，
R2为Val、Ala或Gly，
R3为Asn、His、Glu或Asp，
R4为Ala、Ser、Thr、Asn、Asp、Gln、Gly或Glu，
R30为任意合乎需要的遗传上可编码的氨基酸残基或-OH，
Z为氢原子或一段含有1-4个遗传上可编码的氨基酸残基的肽，包括1-4个His残基，
优选地，该胰岛素-锌复合物中包括每胰岛素六聚体5-8个锌离子。
优选地，该胰岛素-锌复合物含有胰岛素六聚体，该胰岛素六聚体由6分子的本发明上述式Ⅰ的胰岛素类似物组成。
根据本发明，优选地，该胰岛素-锌复合物也可以是其中式Ⅰ的胰岛素类似物B链含有序列Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val CysGly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
(SEQ ID NO:10)，例如His(B3)-人胰岛素，或其中式Ⅰ的胰岛素类似物的B链含有序列Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val CysGly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
(SEQ ID NO:11)，例如Asp(B3)-人胰岛素。
本发明也涉及一种包括至少一种本发明胰岛素-锌复合物的药物制剂，还涉及一种包括至少一种胰岛素类似物和/或其生理可耐受盐的酸性溶液并含有合适量的锌离子的药物制剂，所述锌可以使形成本发明的胰岛素-锌复合物成为可能，该胰岛素类似物和/或其生理可耐受盐优选包含本发明上述式Ⅰ的胰岛素类似物，或B链具有编号SEQ IDNO:3,4,5,10或11序列的式Ⅰ的胰岛素类似物。
优选地，该药物制剂是一种包含溶解的、无定形的和/或结晶形式的胰岛素一锌复合物的制剂。
本发明也涉及一种具有胰岛素活性的可注射溶液，其中包含溶解形式的药物制剂，优选含1μg-2mg锌/ml，特别优选含5μg-200μg锌/ml。
本发明还涉及胰岛素-锌复合物在制备具有延迟起始作用的胰岛素活性的药物制剂方面的用途。
根据本发明的胰岛素类似物具有生物活性，在每周给狗皮下注射含80μg Zn++/ml(锌/ml)的酸性透明溶液后，呈现很强的延迟作用。如果胰岛素类似物B链N端因存在His而延长，例如His(BO),des(B30)-人胰岛素(参见SEQ ID NO:3)，其作用形式显著依赖于加入锌离子的量。无锌制剂根本没有贮存效应(总作用6-8小时，实施例8)，其药效学与人胰岛素几乎没有差别，当加入锌离子(80μg/ml)后，发现延迟作用强烈(总作用约16小时，实施例8)，观察到的贮存效应远较NPH-胰岛素显著。另外，该类似物具有可在一定范围内预先设定锌浓度，以控制其药效学的优点，这在人胰岛素是不可能的。快速起始作用的制剂可以象那些中等或强烈延迟作用的制剂一样利用活性物质，通过改变锌浓度来制备。因此，作用形式可分别适应病人的需要，或者应用具有合适预设锌浓度的制剂，或者由医师或病人自己用高锌浓度和低锌浓度的制剂相混合完成。
此处所述类似物还包括与人胰岛素相比，具有与锌离子增强的亲和力的类似物。
在中性水溶液中，人胰岛素通过His(B10)侧链络合两个锌离子，形成六聚体，这些锌离子在中性溶液中不能通过透析去除。相同条件下，此处所述的类似物可结合4个以上的锌离子。根据本发明，在His(B0)-des(B30)-和His(B3)-胰岛素中，每个六聚体约有7个锌离子，在Asp(B3)-胰岛素中，测量到每个六聚体有4.2个锌离子(实施例9)。
众所周知，在中性溶液中锌导致形成相对高分子量的结合物，并导致胰岛素沉淀。注射溶解成透明溶液的胰岛素弱酸性含锌制剂后，由于中和作用，胰岛素-锌复合物的形成导致胰岛素在皮下组织中沉淀。胰岛素从沉淀处重新溶解，透过血管，延迟地到达作用部位。对人胰岛素来说，这种延迟作用只是很微弱，但此处所述类似物具有增强的锌亲和力，因而其作用延迟显著增强。因此，增强的锌结合力是上述锌依赖性作用延长的基础。
因此，本发明不仅涉及所述胰岛素类似物，还涉及有关的胰岛素-锌复合物。该复合物与相应的人胰岛素-锌复合物不同在于前者含有高浓度的稳定结合的锌。很明显，除了锌，其它过渡金属离子，如钴或铜，也能用于形成相应的复合物。
实施例1：构建编码His(B3)-前胰岛素原突变体的质粒pINT345d。
美国专利5358857号描述了质粒pINT90d，该质粒DNA被用作构建质粒pINT345d的原始材料。与pINT90d相比，pINT345d特征在于具有两个新特性。一方面，它编码一种前胰岛素原类似物，该类似物在B链位点3处含有His，而不是Asp。另一方面，在该前胰岛素原突变体编码序列起点前紧接有限制酶BssH2的识别序列，若考虑到前胰岛素原序列中的Dra3切割位点，这样易于操作编码前胰岛素原类似物的N端10个氨基酸的序列。为构建质粒pINT345d，由限制酶NcoⅠ和Dra3在284bp和351bp处双酶切质粒pINT90d的DNA，产生两个片段。凝胶电泳分离酶切混合物，分离质粒DNA大片段。
然后将该DNA片段与以下形式的合成DNA片段进行T4连接酶作用，
Nco1 BssH2 B1 B2 His B4 B5 B65′- C ATG GCA ACA ACA TCA ACA GGA AAT TCG GCG CGC TTT GTG CAC CAG CAC CTG3′-CGT TGT TGT AGT TGT CCT TTA AGC CGC GCG AAA CAC GTG GTC GTG GACB7 B8 B9 Dra3TGC GGC TCC CAC CTA -3′ACG CCG AGG GTG -5′
将连接混合物转化大肠杆菌K12感受态细胞。将转化混合物涂在含有20mg/ml氨苄青霉素的NA平板上，37℃温育过夜。从出现的克隆中提取质粒DNA，并用限制酶BssH2酶切，所需要的质粒DNA则被切成线性，而与pINT90d质粒DNA不同，后者由于其不含BssH2酶切位点，所以不能被酶切。
酶切正确的质粒DNA称作pINT345d。
它用于构建以下所述前胰岛素原突变体的起始材料。
实施例2：构建编码His(B0)-前胰岛素原突变体的质粒pINT342d
pINT345d质粒DNA利用酶BssH2和Dra3双酶切，利用凝胶电泳分离质粒大片段，将该片段与以下形式的合成DNA片段进行T4连接酶作用，
His B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B105′- CG CGC CAC TTT GTT AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA-3′3′-G GTG AAA CAA TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG -5′
BssH2 Hpa1 Dra3形成的pINT342d质粒与起始质粒相比，包含一个另外的HpaⅠ酶切位点，该质粒编码B0位置为His的前胰岛素原突变体。
实施例3：构建编码His(B-1),Ala(B0)-前胰岛素原突变体的质粒pINT343d
将在实施例b中所述的剩余质粒DNA片段与形式为
His Ala B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B115′-CG CGC CAC GCT TTT GTT AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA-3′3′-G GTG CGA AAA CAA TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG -5′
BssH2 Hpa1 Dra3的合成DNA片段进行T4连接酶作用，形成质粒pINT343d，它同pINT342d一样，与起始载体相比，也包含一个另外的HpaⅠ酶切位点。
实施例4：构建编码His(B-2),Ala(B-1),Ala(B0)-前胰岛素原突变体的质粒pINT344d
将在实施例b中所述的剩余质粒DNA片段与形式为
His Ala Ala B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B115′- CG CGC CAC GCT GCT TTT GTT AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA-3′3′-G GTG CGA CGA AAA CAA TTG GTC GTG GAC ACG CCG AGG GTG -5′
BssH2 Hpa1 Dra3的合成DNA片段进行T4连接酶作用，形成质粒pINT344d，它与起始载体相比，也包含一个另外的HpaⅠ酶切位点。
实施例5：构建的胰岛素突变体的表达
举例来说，将质粒pINT342d、343d和344d分别转化大肠杆菌K12W3110。根据美国专利5227293号实施例4，将包含相应突变体质粒的重组细菌进行发酵，获得制备相应胰岛素突变体所需的原材料。
实施例6：His(B0),des(B30)-胰岛素的制备
根据实施例5，在大肠杆菌中表达前胰岛素原突变体，细胞破碎后离心，以包涵体形式分离。在尿素(8mol/l)中溶解包涵体，经亚硫酸盐解，阴离子交换(Q-Sepharose)和凝胶渗透层析(SephacrylS200)纯化。层析用缓冲液包含4M尿素和50mM Tris/HCl(三羟甲基氨基甲烷/HCl)pH8.5。阴离子交换剂上的分级洗脱通过用0-0.5MNaCl梯度进行。然后通过超滤和稀释，将尿素浓度降到低于1M，在pH4条件下经沉淀分离前胰岛素原-S-磺酸盐，最后干燥。
为形成与天然胰岛素原中相同的正确的二硫桥，将前胰岛素原-S-磺酸盐溶于含有20mM甘氨酸的缓冲液pH10.8中，浓度为0.3g/l，在巯基乙醇(约25-50mol/mol前胰岛素原)作用下，4℃搅拌过夜，然后用磷酸将pH值调节到3.5后，离心。上清中加入Tris(25mM)调节pH至8.2，前胰岛素原转换成胰岛素，然后用胰蛋白酶(1.5mg/g前胰岛素原)处理。经反相HPLC监测蛋白质水解过程。约6小时后，产物中含有高浓度的His(B0),des(B30)-胰岛素，作用在酸化至pH3.5后结束。通过离子交换层析(S-Hyper-D,Sepracor)和反相层析(PLRP-S RP300,Polymer Laboratories)纯化胰岛素类似物。离子交换层析在含30％2-丙醇和50mM乳酸(pH3.5)的缓冲液中进行。结合的胰岛素用0-0.5M NaCl线性梯度洗脱。反相层析在0.1％三氟乙酸中进行，其中不断提高乙腈的掺入量进行洗脱。在pH5.4沉淀分离产物，冻干。
实施例7：非肠道使用的胰岛素类似物制剂
该制剂每毫升pH4的无菌水溶液中含有40或100IU胰岛素(1IU相当于约6.2nmol)，20mg 85％甘油，2.7mg间甲酚以及适合时含有Zn++(氯化锌)。
实施例8：狗中His(B0),des(B30)-胰岛素的作用形式
6条狗(比格尔犬)每条皮下注射含40U/ml(实施例7)及指示量锌的制剂，剂量为0.3IU/kg。后续实验过程中，在所指示时间测量血糖浓度。测量值以各自的起始值作百分比标准化换算，并平均。
| 时间(小时) | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 12 |
| 无锌80μg Zn++/ml | 100100 | 5997 | 5083 | 6175 | 7565 | 8456 | 8951 | 9858 | 10368 | 9772 | 10478 | 10082 |
实施例9：胰岛素类似物的锌结合
胰岛素制剂(0.3mM胰岛素，0.13mM NaCl,0.1％苯酚，100μg/mlZn++(氯化锌)，25mM tris/HCl,pH7.4)在不含锌的中性缓冲液(0.15MNaCl,10mM tris/HCl pH7.4中室温3小时，10mM tris/HCl pH7.4中15℃72小时，再10mM tris/HCl pH7.4中15℃16小时)中充分透析，透析物酸化后分析。利用反相HPLC测定胰岛素浓度，锌浓度由原子吸收光谱测定。利用不合胰岛素的对照物中的锌含量校正锌值。
锌结合
| 胰岛素 | mol锌/mol六聚体 |
| 人胰岛素 | 2.5 |
| His(B3)-胰岛素 | 6.9 |
| Asp(B3)-胰岛素 | 4.2 |
| His(B0),des(B30)-胰岛素 | 6.8 |
序列表(1)一般信息：(ⅰ)申请人：(A)姓名：Hoechst Marion Roussel Deutschland Gmbh(B)街道：-(C)城市：法兰克福(D)州：-(E)国家：德国(F)邮政编码：65926(G)电话：069-305-5307(H)传真：069-357175(I)电报：-(ⅱ)申请名称：治疗糖尿病的新型胰岛素衍生物(ⅲ)序列数：11(ⅳ)计算机可读格式：(A)介质类型：软盘(B)计算机：IBM PC兼容机(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：PatentIn Release#1.0,Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO:1信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：21个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：蛋白质(B)位置：1..21 (ⅹⅰ)序列详述：SEQ ID NO:1:Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 10 15Glu Asn Tyr Cys Asn
20(2)SEQ ID NO:2信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：30个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：蛋白质(B)位置：1..30(ⅹⅰ)序列详述：SEQ ID NO:2:Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30(2)SEQ ID NO:3信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：30个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：蛋白质 (B)位置：1..30(ⅹⅰ)序列详述：SEQ ID NO:3:His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu1 5 10 15Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25 30(2)SEQ ID NO:4信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：31个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：蛋白质(B)位置：1..31(ⅹⅰ)序列详述：SEQ ID NO:4:His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu1 5 10 15Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30(2)SEQ ID NO:5信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：32个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅸ)特征： (A)名称/关键词：蛋白质(B)位置：1..32(ⅹⅰ)序列详述：SEQ ID NO:5:His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala1 5 10 15Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30(2)SEQ ID NO:6信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：33个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：蛋白质(B)位置：1..33(ⅹⅰ)序列详述：SEQ ID NO:6:His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu1 5 10 15Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25 30Thr(2)SEQ ID NO:7信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：98个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性 (ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：蛋白质(B)位置：1..98(ⅹⅰ)序列详述：SEQ ID NO:7:Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Phe Val Asn Gln1 5 10 15His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly
20 25 30Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp
35 40 45Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser
50 55 60Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val65 70 75 80Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr
85 90 95Cys Asn(2)SEQ ID NO:8信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：99个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：蛋白质(B)位置：1..99(ⅹⅰ)序列详述：SEQ ID NO:8:Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Phe Val Asn1 5 10 15Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys
20 25 30 Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu
35 40 45Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly
50 55 60Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile65 70 75 80Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn
85 90 95Tyr Cys Asn(2)SEQ ID NO:9信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：100个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：蛋白质(B)位置：1..100(ⅹⅰ)序列详述：SEQ ID NO:9:Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg His Ala Ala Phe Val1 5 10 15Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val
20 25 30Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala
35 40 45Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala
50 55 60Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly65 70 75 80Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu
85 90 95Asn Tyr Cys Asn
100(2)SEQ ID NO:10信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：30个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：蛋白质(B)位置：1..30(ⅹⅰ)序列详述：SEQ ID NO:10:Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30(2)SEQ ID NO:11信息：(ⅰ)序列特征：(A)长度：30个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅸ)特征：(A)名称/关键词：蛋白质(B)位置：1..30(ⅹⅰ)序列详述：SEQ ID NO:11:Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
Claims (67)
1．一种式Ⅰ的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中
(A1-A5)为人胰岛素或动物胰岛素A链A1-A5位点的氨基酸残基，
(A15-A19)为人胰岛素或动物胰岛素A链A15-A19位点的氨基酸残基，
(B8-B18)为人胰岛素或动物胰岛素B链B8-B18位点的氨基酸残基，
(B20-B29)为人胰岛素或动物胰岛素B链B20-B29位点的氨基酸残基，
R8为Thr或Ala，
R9为Ser或Gly，
R10为Ile或Val，
R14为Tyr、His、Asp或Glu，
R21为Asn、Asp、Gly、Ser、Thr、Ala、Glu或Gln，
R1为任意所需要的遗传上可编码的氨基酸残基、缺失或为氢原子，
R2为Val、Ala或Gly，
R3为Asn、His、Glu或Asp，
R4为Ala、Ser、Thr、Asn、Asp、Gln、Gly或Glu，
R30为任意所需要的遗传上可编码的氨基酸残基或-OH，
Z为氢原子或一段含有1-4个遗传上可编码的氨基酸残基的肽，包括1-4个His残基，
附带条件是当Z为氢原子，R1或R3为His、Glu或Asp，如果R1为中性或带负电荷氨基酸残基，R3则为His，或者附带条件是如果其中Z为氢原子，则R14为His、Asp或Glu，此外附带条件是式Ⅰ的胰岛素类似物或其生理可耐受盐与人胰岛素相比，差异不是仅仅式Ⅰ中R3位点，或R3和R21位点，或R3和R4位点氨基酸残基变异。
2．如权利要求1所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中R8为Thr，R9为Ser及R10为Ile。
3．如权利要求1或2所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中R1为Phe、His、Asn、Asp或Gly。
4．如权利要求1-3中一项或多项所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中R30为Thr、Ala或Ser。
5．如权利要求1-4中一项或多项所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中R21为Asn及R1为Phe。
6．如权利要求1-5中一项或多项所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中R2为Val，R3为Asn及R4为Glu。
7．如权利要求1-6中一项或多项所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中R14为Tyr。
8．如权利要求1-6中一项或多项所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中R14为His。
9．如权利要求1-6中一项或多项所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中R14为Asp。
10．如权利要求1-6中一项或多项所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中R14为Glu。
11．如权利要求1-10中一项或多项所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中R30为Thr。
12．如权利要求1-10中一项或多项所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中R30为Ala。
13．如权利要求1-10中一项或多项所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中R30为Ser。
14．如权利要求1-10中一项或多项所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中R30为-OH。
15．如权利要求1-14中一项或多项所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中Z为His。
16．如权利要求1-14中一项或多项所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中Z为His-Ala-。
17．如权利要求1-14中一项或多项所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中Z为His-Ala-Ala-。
18．如权利要求15所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中B链具有序列His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu ValCys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys(SEQ ID NO:3)。
19．如权利要求15所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中B链具有序列His Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu ValCys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(SEQ ID NO:4)。
20．如权利要求16所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中B链具有序列His Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr LeuVal Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(SEQ ID NO:5)。
21．如权利要求17所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐，其中B链具有序列His Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu TyrLeu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(SEQ ID NO:6)。
22．如权利要求1-21中一项或多项所述的胰岛素类似物或其生理可耐受盐的制备方法，包括构建一种可复制的表达载体，该载体包含一段编码具有氨基酸序列Ⅱ的胰岛素类似物前体的DNA序列Met-X2m-(Arg)p-Z-R1-R2-R3-R4-His-Leu-Cys-(B8-B18)-Cys-(B20-B29)-R30-X1n-Arg-(A1-A5)-Cys-Cys-R8-Ser-R10-Cys-Ser-Leu-R14-(A15-A19)-Cys-R21
Ⅱ，
其中
X1n为含有n个氨基酸残基的肽链，n为0-34的整数，
X2m为含有m个氨基酸残基的肽链，m为0-20的整数，
p为0、1或2，
R30为任意所需要的遗传上可编码的氨基酸残基或缺失，以及
Z缺失或为一具有1-4个遗传上可编码的氨基酸残基的肽段，包括1-4个His残基，
其它变量具有权利要求1所述含义，权利要求1所述附带条件仍然适用，
在宿主细胞中表达以及利用化学和/或酶学方法从其前体释放胰岛素类似物。
23．如权利要求22所述的方法，其中宿主细胞是细菌。
24．如权利要求23所述的方法，其中细菌是大肠杆菌。
25．如权利要求22所述的方法，其中宿主细胞是酵母。
26．如权利要求25所述的方法，其中酵母是酿酒酵母。
27．如权利要求22-26中任一项所述的制备如权利要求19所述的胰岛素类似物的方法，其中胰岛素类似物前体具有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgHis Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu ValCys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro GlyAla Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn TyrCys Asn(SEQ ID NO:7)。
28．如权利要求22-26中任一项所述的制备如权利要求20所述的胰岛素类似物的方法，其中胰岛素类似物前体具有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgHis Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr LeuVal Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro GlyAla Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn TyrCys Asn(SEQ ID NO:8)。
29．如权利要求22-26中任一项所述的制备如权利要求21所述的胰岛素类似物的方法，其中胰岛素类似物前体具有序列Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala ArgHis Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu TyrLeu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys ThrArg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro GlyAla Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys ArgGly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile CysSer Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(SEQ ID NO:9)。
30．如权利要求22所述的胰岛素类似物前体。
31．如权利要求27所述的胰岛素类似物前体。
32．如权利要求28所述的胰岛素类似物前体。
33．如权利要求29所述的胰岛素类似物前体。
34．编码如权利要求30所述的胰岛素类似物前体的DNA序列。
35．编码如权利要求31所述的胰岛素类似物前体的DNA序列。
36．编码如权利要求32所述的胰岛素类似物前体的DNA序列。
37．编码如权利要求33所述的胰岛素类似物前体的DNA序列。
38．一种表达载体，其包含如权利要求34所述的DNA序列。
39．一种表达载体，其包含如权利要求35所述的DNA序列。
40．一种表达载体，其包含如权利要求36所述的DNA序列。
41．一种表达载体，其包含如权利要求37所述的DNA序列。
42．一种宿主细胞，其转化了如权利要求38-41中任一项所述的表达载体。
43．一种药物制剂，其包含如权利要求1-21中一项或多项所述的至少一种胰岛素类似物和/或至少一种其生理可耐受盐。
44．如权利要求43所述的药物制剂，其包含溶解、无定形和/或晶体形式的胰岛素类似物和/或其生理可耐受盐。
45．如权利要求43或44所述的药物制剂，其另外包含一种贮存辅助物。
46．如权利要求45所述的药物制剂，其中贮存辅助物为硫酸鱼精蛋白，并且胰岛素类似物和/或其生理可耐受盐与硫酸鱼精蛋白以共结晶方式存在。
47．如权利要求43-46中一项或多项所述的药物制剂，其另外包含未改性的人胰岛素。
48．如权利要求43-47中一项或多项所述的药物制剂，其另外包含一种胰岛素类似物。
49．如权利要求48所述的药物制剂，其中胰岛素类似物为Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-人胰岛素。
50．一种具有胰岛素活性的可注射溶液，其包含溶解形式的如权利要求43-49中一项或多项所述的药物制剂。
51．如权利要求50所述的可注射溶液，其包含1μg-2mg锌/ml。
52．如权利要求51所述的可注射溶液，其包含5μg-200μg锌/ml。
53．如权利要求1-21中一项或多项所述的胰岛素类似物和/或其生理可耐受盐在制备具有延迟作用起始的胰岛素活性的药物制剂中的用途。
54．一种胰岛素-锌复合物，其包含一种胰岛素六聚体及4-10个锌离子/胰岛素六聚体，其中所述胰岛素六聚体由六个式Ⅰ的胰岛素类似物组成，
其中，
(A1-A5)为人胰岛素或动物胰岛素A链A1-A5位点的氨基酸残基，
(A15-A19)为人胰岛素或动物胰岛素A链A15-A19位点的氨基酸残基，
(B8-B18)为人胰岛素或动物胰岛素B链B8-B18位点的氨基酸残基，
(B20-B29)为人胰岛素或动物胰岛素B链B20-B29位点的氨基酸残基，
R8为Thr或Ala，
R9为Ser或Gly，
R10为Ile或Val，
R14为Tyr、His、Asp或Glu，
R21为Asn、Asp、Gly、Ser、Thr、Ala、Glu或Gln，
R1为任意合乎需要的遗传上可编码的氨基酸残基、缺失或为氢原子，
R2为Val、Ala或Gly，
R3为Asn、His、Glu或Asp，
R4为Ala、Ser、Thr、Asn、Asp、Gln、Gly或Glu，
R30为任意合乎需要的遗传上可编码的氨基酸残基或-OH，
Z为氢原子或一段含有1-4个遗传上可编码的氨基酸残基的肽，包括1-4个His残基。
55．如权利要求54所述的胰岛素-锌复合物，其中每胰岛素六聚体包含5-8个锌离子。
56．如权利要求54或55所述的胰岛素-锌复合物，其中胰岛素六聚体由6分子的如权利要求1-21中一项或多项所述的式Ⅰ的胰岛素类似物组成。
57．如权利要求54或55所述的胰岛素-锌复合物，其中式Ⅰ的胰岛素类似物B链具有序列Phe Val His Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val CysGly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(SEQ ID NO:10)。
58．如权利要求54或55所述的胰岛素-锌复合物，其中式Ⅰ的胰岛素类似物B链具有序列Phe Val Asp Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val CysGly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr(SEQ ID NO:11)。
59．一种药物制剂，其包含至少一种如权利要求54-58中一项或多项所述的胰岛素-锌复合物。
60．一种药物制剂，其包含至少一种如权利要求54-58中一项或多项所述的胰岛素类似物和/或其生理可耐受盐及适量锌离子的酸性溶液，使形成如权利要求54-58中一项或多项所述的胰岛素-锌复合物成为可能。
61．如权利要求60所述的药物制剂，其包含如权利要求1-21中一项或多项所述的胰岛素类似物和/或其生理可耐受盐及适量锌离子的酸性溶液，使形成如权利要求56所述的胰岛素-锌复合物成为可能。
62．如权利要求60所述的药物制剂，其包含至少一种如权利要求57或58中一项所述的胰岛素类似物和/或其生理可耐受盐及适量锌离子酸性溶液，使形成如权利要求57或58所述的胰岛素-锌复合物成为可能。
63．如权利要求59-62中一项或多项所述的药物制剂，其包含溶解、无定形和/或晶体形式的胰岛素-锌复合物。
64．一种具有胰岛素活性的可注射溶液，其包含溶解形式的如权利要求63所述的药物制剂。
65．如权利要求64所述的可注射溶液，其包含lμg-2mg锌/ml。
66．如权利要求65所述的可注射溶液，其包含5μg-200μg锌/ml。
67．如权利要求54-58中一项或多项所述的胰岛素-锌复合物在制备具有延迟作用起始的胰岛素活性的药物制剂中的用途。
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