CN1302866A - 具优良基因组合的高效Bt15A3菌株、分离及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是具有优良基因组合的苏云金芽孢杆菌科默尔亚种15A3株及分离筛选方法;其独特的cry基因的组合,这些基因分别是:cry1Aa,cry1Ac,cry1C,cry1D,cryII和cryV,利用多种cry基因特异引物的PCR方法及生物活性测定方法筛选到的Bt15A3菌株;可湿性粉剂和液剂对重大害虫甜菜夜蛾、棉铃虫、小菜蛾和美国白蛾均收到很好的田间防治效果。
Description
本发明涉及对鳞翅目重大害虫甜菜夜蛾及棉铃虫等均具高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bt)科默尔亚种15A3菌株，由这一菌株携带的编码杀虫晶体蛋白(ICP)的基因及其优良组合，以及由此菌株所开发的高效细菌杀虫剂。
Bt制剂是世界范围内广泛使用的细菌杀虫剂，占全部生物杀虫剂产量的95％，在微生物防治害虫的实践中具有十分重要的地位(喻子牛等苏云金芽孢杆菌北京科学出版社1990)。Bt的杀虫活性来源于其自身携带的cry基因编码的ICP，每种ICP都有特定的杀虫谱，ICP基因中cry1Aa,cry1Ab,cry1Ac是杀虫毒力最高，且目前市场销售的Bt制剂生产菌主要携带的基因种类，其中cry1Ac是被认为对棉铃虫毒力最高的基因，对棉铃虫有特异性高毒力的YBT-1520菌株(孙明等CN1055310C)和Bt.ken-Ag菌株(刘春勇等，南开大学学报200032(3):163-168)均含有上述cry1Ac类基因，但上述三种基因产物对甜菜夜蛾、海灰翅夜蛾等几种害虫无毒或低毒，而Cry1C,Cry1D蛋白对这类害虫具高毒力(Frankenhuyzen K.V.The challenge ofBacillus thuringiensis.In: Entwistle P.F.et al.ed.Bacillus tburingiensis,an environmental biopesticide:theory and practice.Chichester:John willey &sons Ltd. 1993.p9-l0)。由含有cry1C基因菌株，如B.t.subs.aziwai生产的杀虫剂多用于这类害虫的防治。含有cryⅠC和cryⅠA的Bt菌，其杀虫活性比不含cryIC的HD-1菌株，对spodoptera fruqiperda的活性高三倍，对小菜蛾的活性高两到数倍(CN 1240002A)，由此认为具有对棉铃虫类和甜菜夜蛾类害虫广谱杀虫活性的Bt菌株应在其细胞内带有上述cryⅠAc和cryⅠC两类基因的组合。
为了使Bt菌株具有所期望的基因组合，从而达到广谱杀虫活性，近年来研究人员投入大量的人力财力对现有的Bt菌株进行遗传改良，利用诱变、基因重组、接合转移等手段试图构建同时含有cry1A类和cry1C重要基因组合的Bt工程菌株。美国的Sandoz公司1994年发明了一种用于Bt之间带有cry基因的质粒能有效接合转移的方法(Eur.pat.0582541Az)，首次将Bt entomocidus 6.1菌株带有cry1C基因的质粒通过接合转移方法导入只含有cry1A类的Bt kurstaki HD562菌株，获得工程菌cg92004.24，这一菌株同时含有cry1Aa,cry1Ab,cry1Ac,cry1C和cryⅡA。经生物活性检测，对甜菜夜蛾的毒力比原亲本菌株扩大了1.7倍。由于所期望的供体及所要求的质粒不能有效的接合转移，转移进受体的新质粒与原有质粒的不亲合性，以及筛选重组接合子的选择标记等客观因素的存在，使获得工程菌必需经5次以上的接合杂交及多次电穿孔转化和大量的筛选等复杂的过程，最终获得的目的工程菌株还带有红霉素及四环素的抗性标记，而且除cry1C基因外，cry1Ac基因也来自其它菌株，即两个高效基因均不是Bt kurstaki菌株原有基因，外源质粒的稳定性及选择压力等因素会使生产工艺复杂化。此外，凡是利用基因工程菌生产的制剂，在环境释放之前必须通过国家农业部有关农业生物基因工程安全评价的审批，方可进行田间试验。
正是由于工程菌用于生产的不便，人们一直没有放弃筛选具有新的cry基因、或者具有期望的优良基因组合的Bt菌株。尾山和彦等人(CN 1240002A)分离到一株Bt新菌株，属血清型H7，其携带的编码ICP基因与cry9Ca1比较接近，其氨基酸序列有71％的同源性，证明此菌株携带有新的ICP基因，表现出广谱的杀虫活性，不但对某些鳞翅目害虫如斜纹夜蛾有高的杀虫活性，同时对三种鞘翅目及两种双翅目昆虫均有活性。
研究表明由多种cry蛋白构成的晶体往往比单一蛋白构成的晶体有更高的杀虫毒力(Lee M.il et.al.,App.Environ.Microbio.1996.62:583-585),而且CryV的作用有助于延缓抑制昆虫产生抗性(Poncet S.et.al.,J.Invertebt.Pathol.1995,66:131-135)。多年用于防治小菜蛾的Bt kurstaki HD-1(简称HD-1)制剂,在防治对化学农药产生抗性的小菜蛾方面贡献突出，然而近几年来已发现小菜蛾对HD-1产生了明显的抗性。因此筛选比HD-1菌株的基因具有更加优势组合的Bt生产菌株，不仅可以扩大杀虫谱，而且可有效的扼制并延缓昆虫对Bt的抗性。
本发明目的是提供具优良基因组合的高效苏云金芽孢杆菌科默尔亚种15A3菌株和它的分离方法及其应用。本发明是从我国丰富的Bt资源中筛选同时具有对棉铃虫高效的cry1Ac基因及对甜菜夜蛾高效的cry1C基因，还含有cryⅡ及cryV延缓抗性基因等优势基因组合的菌株，不仅扩大了杀虫谱延缓抗性，而且可以节省人工构建工程菌的巨额耗资，还可以克服利用工程菌生产的种种不足。
本发明是经过土壤分离、形态观察、PCR基因检测及生物活性实验，筛选到本发明的菌株，编号为15A3。菌种保藏号：CGMCC NO.0528。它不仅含有我们所期望的基因cry1Ac，cry1C和cryV，还含有cry1Aa，cry1D和cryⅡ六种ICP基因。其中cry1Aa的限制性片断长度多态性分析(RFLP)与标准的cry1Aa不同，多出一个pstⅠ切点。经鉴定此菌株属苏云金芽孢杆菌血清型为H21的科默尔亚种。室内活性测定发现15A3菌株对棉铃虫的毒力与本组“八五”期间开发的棉铃虫高效菌株Bt ken-Ag相当，而后者对甜菜夜蛾几乎无毒力。经摇瓶发酵及6立开自控罐的小试后，发现15A3菌株具优良的生产性能，随即进行中试生产试验，获得广谱杀虫剂产品-NK Bt-Ⅱ，此产品分别在河北省、天津市等地做了小区药效试验，在对供试虫种的广谱性方面明显优于国内同类产品。
本发明突出的实质性特点和显著进步可以从下述实施例中得以体现。但它们不会对本发明作任何限制。
图1是15A3菌株及H21标准株cry基因PCR结果。
如图所示，泳道1是分子量指示物(λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)，泳道2、4、6、8是15A3菌株cryⅠAc,Ⅰc,Ⅱ,V基因，泳道3、5、7、9是H21标准株cryⅠAc,Ⅰc,Ⅱ,V基因。
实施例1 Bt15A3菌株的分离筛选
(1)称取约1克土壤样品至10ml无菌水中，充分混匀后取1ml至混有多粘菌素及青霉素的NB培养基中，30℃培养72小时。挑选类似苏云金芽孢杆菌的菌落，涂片染色后镜检，将芽孢晶体形成同步率高并同时含有菱形、方形等多型晶体的菌落进一步纯化。
(2)依据各类cry基因的保守区设计特异引物，对纯化好的Bt菌株进行各类cry基因的检测，将具有期望的基因组合的菌株选出。
(3)将所筛选到的菌株及参比菌株分别接种M1发酵培养基，其配方为：鱼粉3.0-3.5％，玉米淀粉1.2-1.5％，牛肉膏0.2-0.5％，无机盐0.1-0.2％,pH7.5-8.0。30℃，180-220rpm/分培养26-30小时。
(4)将培养液进行500、1000倍稀释，混入人工饲料，饲喂初孵棉铃虫及甜菜夜蛾，筛选出对两种试虫毒力均高的菌株。
(5)用冷冻干燥法制备所筛选菌株及参比菌株的芽孢晶体复合物冻干粉，用一定浓度的冻干粉制备人工饲料，饲喂初孵棉铃虫及甜菜夜蛾，参比菌株有两个：一是主要含有cry1Ac基因，对棉铃虫特异高效菌株Bt ken-Ag；另一个是主要含有crv1C基因，对甜菜夜蛾高效菌株9510，结果见表1。
表1 15A3株对棉铃虫和甜菜夜蛾的LC50(ppm)
| 棉铃虫 | 甜菜夜蛾 | |
| 15A3Btken-Ag(CK)Bta:9510(CK) | 16.4814.9035.16 | 15.63毒力极低26.12 |
表1的实验结果说明15A3株对棉铃虫及甜菜夜蛾均有较高的活性。对棉铃虫的毒力与Bt ken-Ag相当，而后者对甜菜夜蛾几乎没有毒力，15A3株与9510株相比，对棉铃虫的毒力高2.1倍，对甜菜夜蛾的毒力高1.7倍。
最终筛选到本发明的菌株Bt15A3。
实施例2．Bt15A3株的生物学特性及cry基因的检测
用普通NB斜面培养48小时，95％以上的细胞形成芽孢晶体，晶体形态及大小多种多样，有大小菱形、方形、卵园形及镶嵌形，较大形的晶体大于芽孢。用经典的血清学实验方法，测定15A3株的鞭毛抗原属H21型，是苏云金芽孢杆菌科默尔亚种(Bacillus thuringiensis subsp.colmeri)。抗生素谱测定结果：ampr、polymyr、strs、erys、rets、chls。
用特异性引物的PCR方法分别检测15A3株及H21标准菌株的cry基因证明，15A3株含有cry1Ac,cry1C,cryⅡ和cryVgane，特异性产物扩增片断的大小依次为：1.84kb,288bp,600bp和700bp，而H21标准菌株不含cry1Ac的1.84kb的特异性扩增产物，其它基因均相同(见图1)，经检测15A3株不含cry1E,cryⅢ.cry1V和cyt基因。
用kuo W.S.等人的限制性片断长度多态性(RFLP)方法(Appl.andEnviro.Microbi.1996 62(4):1369-1377)对cry1类基因分类检测发现，15A3菌株含有4个cry1类基因：除PCR已检测的cry1Ac和cry1C外，还会有cry1Aa,cry1D两个基因，其中cry1Aa基因的PFLP结果证明，与已发现的cry1Aa基因序列不同，仅含有726bp和237bp两个酶切片断而缺少496bp的片断，在这段序列中多出一个pstⅠ切点，有可能是一个新的cry1Aa基因序列，而其它三个cry1类基因均符合标准的确切图谱。
实施例3．15A3株的液体发酵及产品
(1)斜面菌种
NB培养基斜面：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，琼脂粉1.8％，pH7.2-7.4。培养基制备好后分装试管或克氏瓶，121℃高压蒸气灭菌30分钟，取出后摆成斜面，置30℃温箱培养24-48小时，无杂菌生长便可以接种：取保藏菌种一环接种新鲜斜面，30℃培养10-12小时，涂片染色后显微镜观察，菌体为粗杆状，两端钝圆，原生质均匀无杂菌。
(2)克氏瓶扩大培养
将上述活化的菌种取一环接入液体NB培养基中，30℃ 180rpm/min振荡培养5-6小时，取2ml至克氏瓶内，使其均匀分布于培养基表面，置30℃培养72小时，检查菌苔厚而丰满，菌落表面灰白色无光泽无杂菌，镜检芽孢晶本形成率为98％以上。
(3)发酵罐种子液制备
将100ml无菌水倒入克氏瓶洗下菌苔，移入装有少量玻璃珠的无菌烧瓶内，充分振荡将菌苔打散，移入专用接种瓶，置75℃水浴20分钟。
(4)发酵罐培养
发酵培养基配方：豆并粉4.0％，玉米淀粉1.5％，棉籽粉1.5％，酵母粉1.0％，无机盐类0.5％，泡敌0.03-0.05％，全部原料需达到180μm筛的细度，pH8.5-9.0。按发酵容积的60-75％投料，灭菌后冷却至40℃左右，按投料体积的0.02％接入种子液，搅伴转数为250转，温度30℃±1℃，罐压0.5kg，通气量1∶1.0-1∶1.3，发酵周期35-45小时，视30％左右的孢晶游离，发酵液pH达8.0以上终止发酵。液剂及高含量粉剂产品后加工按Bt ken-Ag中试方法进行(梁风来等南开大学学报1998 31(2):28-32)。产品质量检测按中华人民共和国农业行业标准：苏云金芽孢杆菌制剂(1995.10.1.实施)。
实施例4
由本发明菌株15A3生产的杀虫剂NK Bt-Ⅱ(其液剂及高含量粉剂产品是按Btken-Ag中试方法进行得到的，梁风来等南开大学学报1998 31(2):28-32)，经河北省农林科学学院和天津市农科院对棉铃虫，甜菜夜蛾和小菜蛾的田间药效试验证明，对三种试虫都可达到很好的防治效果，广谱性方面明显优于国内同类产品。
(1)粉剂500倍稀释，对1-2龄甜菜蛾的防效达82％，是对照组(湖北农科院Bt中心生产的16,000IU/mg可湿性粉剂)同样稀释倍数的1.78-2倍。见表2：
表2 NK Bt-Ⅱ粉剂防治1-2龄甜菜夜蛾田间药效实验结果
| 稀释倍数 | 用药4天的平均防效(％) | |
| NK Bt-Ⅱ | 5001000 | 8253 |
| CK | 5001000 | 4626 |
(2)粉剂500倍释释，防治三代棉铃虫效果达90％以上，与对照组(样品同表2)相当，见表3：
表3 NKBt-Ⅱ防治三代棉铃虫田间药效实验结果
| 稀释倍数 | 平均防治效果(％) | ||
| 2天 | 4天 | ||
| NK Bt-Ⅱ | 5001000 | 72.165.5 | 91.581.9 |
| CK | 5001000 | 69.360.2 | 88.970.8 |
(3)粉剂500倍稀释，防治2龄甘蓝小菜蛾平均效果达82％，与对照组BtA粉剂(福建绿十字生物工程联合发展中心生产，添加有阿维菌素的Bt新产品)防效相当，见表4：
表4：NK Bt-Ⅱ防治2龄甘蓝小菜蛾田间药效实验结果
| 稀释倍数 | 平均防治效果(％) | |
| KN Bt-Ⅱ | 500 | 82.1 |
| CK | 500 | 85.9 |
(4)液剂100倍稀释，对田间破网后4-5龄美国白蛾防治效果达95％以上。
Claims (6)
1．一种生产细菌杀虫剂的高效广谱菌株，其特征在于所述的菌株是苏云金芽孢杆菌(Bt)科默尔亚种15A3菌株，保藏号为CGMCC NO.0528，包括：
A．该菌株鞭毛抗原属H21型，为苏云金芽孢杆菌科默尔亚种(Bacillusthuringiensis subsp.colmer)，具有菱、方、镶嵌、不规则多型晶体及正常的芽孢形态，但与标准的colmer亚种的基因组成有差异；
B．该菌株编码杀虫晶体蛋白(ICP)的基因有：cryⅠAa,cryⅠAc,cryⅠC,cryⅠD,cryⅡ和cryV.；
C．该菌株cryⅠAa基因与已发现的cryⅠAa基因的序列不同，仅含有726bp和237bp的酶切片断而缺少496bp的片断，在N-末端1.5kb内多出一个pstⅠ切点；
D．该菌株含有两种分子量的ICPs，一种为130KD，另一种为65KD。
2．权利要求1所述的Bt科默尔亚种15A3菌株的分离筛选方法，其特征在于它包括下述步骤：
A．称取1克土壤样品置于10ml无菌水中，充分混匀后取1ml加入混有多粘菌素及青霉素的NB培养基中，30℃培养72小时，挑选类似苏云金芽孢杆菌的菌落，涂片染色后镜检，将芽孢晶体形成同步率高并同时含有菱形、方形、多型晶体的菌落进一步纯化；
B．依据各类cry基因的保守区设计特异引物，对纯化好的Bt菌株进行各类cry基因的检测，将具有期望的基因组合的菌株选出；
C．将所筛选到的菌株及参比菌株分别接种No.1发酵培养基，其配方为：鱼粉3.0-3.5％，玉米淀粉1.2-1.5％，牛肉膏0.2-0.5％，无机盐0.1-0.2％，pH7.5-8.0，30℃，180-220rpm/分培养26-30小时；
D．将培养液稀释至500、1000倍，混入人工饲料，饲喂初孵棉铃虫及甜菜夜蛾，筛选出对两种试虫毒力均高的菌株。
3．权利要求1所述的Bt科默尔亚种15A3菌株所产生的ICP及其芽孢。
4．权利要求3所述的具杀虫活性的ICP及其芽孢的生产方法，其特征在于它包括下述步骤：
A．生产用菌种用NB培养基斜面，其配方为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，琼脂粉1.8％，pH 7.2-7.4，培养基制备好后分装试管或克氏瓶，121℃C高压蒸气灭菌30分钟，取出后摆成斜面，置于30℃温箱中培养24-48小时；无杂菌生长便可以接种：取保藏菌种一环接种新鲜斜面，30℃培养10-12小时，涂片染色后显微镜观察，菌体为粗杆状，两端钝圆，原生质均匀无杂菌：
B．克氏瓶扩大培养，将上述活化的菌种取一环接入液体NB培养基中，30℃180rpm/min振荡培养5-6小时，取2ml至克氏瓶内，使其均匀分布于培养基表面，置30℃培养72小时，检查菌苔厚而丰满，菌落表面灰白色、无光泽、无杂菌，镜检芽孢晶体形成率为98％以上；
C．发酵罐种子液制备，将100ml无菌水倒入克氏瓶洗下菌苔，移入装有少量玻璃珠的无菌烧瓶内，充分振荡将菌苔打散，移入专用接种瓶，置75℃水浴20分钟；
D．发酵罐培养
发酵培养基配方：豆饼粉4.0％，玉米淀粉1.5％，棉籽粉1.5％，酵母粉1.0％，无机盐类0.5％，泡敌0.03-0.05％，全部原料需达到180μm筛的细度，pH8.5-9.0。按发酵容积的70-75％投料，灭菌后冷却至40℃左右，按投料体积的0.02％接入种子液，搅伴转数为250转，温度30℃±1℃，罐压0.5kg，通气量1∶1.0-1∶1.3，发酵周期35-48小时，视30％左右的孢晶游离，发酵液pH达8.0以上终止发酵。
5．权利要求3所述的ICP及其芽孢用作防治鳞翅目夜蛾科害虫的细菌杀虫剂主成分。
6．权利要求5所述的害虫包括：甜菜夜蛾、棉铃虫、小菜蛾及美国白蛾。
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