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CN118995536B - 对蝗虫微孢子虫有增效作用的食窦魏斯氏菌及其应用 - Google Patents

对蝗虫微孢子虫有增效作用的食窦魏斯氏菌及其应用 Download PDF

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CN118995536B CN202411479065.9A CN202411479065A CN118995536B CN 118995536 B CN118995536 B CN 118995536B CN 202411479065 A CN202411479065 A CN 202411479065A CN 118995536 B CN118995536 B CN 118995536B
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Abstract

本发明涉及对蝗虫微孢子虫有增效作用的食窦魏斯氏菌及其的应用。其中，所述食窦魏斯氏菌的菌株为1‑64，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 31406。这为防治蝗虫提供了新的生防资源。

Description

对蝗虫微孢子虫有增效作用的食窦魏斯氏菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及对蝗虫微孢子虫有增效作用的食窦魏斯氏菌及其应用。
背景技术
东亚飞蝗隶属于昆虫纲直翅目蝗总科（Acridoidea），属于重要且典型的农业害虫之一。蝗虫取食量大，而且食性广泛，多数绿色植物都可以成为蝗虫的取食目标，同时蝗虫具有强大的迁飞能力和繁殖能力，因此蝗灾爆发时，不仅会给农业生产带来严重的损失，也会给社会造成严重的威胁和恐慌。
蝗虫微孢子虫是一种专性寄生于蝗虫的微孢子虫，其对人类或其他非靶标生物无毒害作用，使用安全性高，蝗虫微孢子虫已成为生物防治草原蝗虫的主要生防手段之一。但蝗虫微孢子虫防治蝗虫的作用效果缓慢，在蝗虫大爆发时难以快速应用蝗虫微孢子虫以控制蝗灾的蔓延，这成为了限制蝗虫微孢子虫发展的重要原因之一。
发明内容
本发明之一提供了一株食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）菌株1-64，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 31406。
本发明之二提供了一种工程菌，其通过对如本发明之一所述的食窦魏斯氏菌菌株1-64进行遗传改良后得到。其中，由于该工程菌是以本发明的食窦魏斯氏菌CGMCC No.31406为靶标，而且采取的手段一般是向其中转入和/或敲除特定的基因和/或DNA片段等，因此，该工程菌仍然为食窦魏斯氏菌。另外，该工程菌可以为提高蝗虫微孢子虫（Paranosema locustae）防治蝗虫活性的工程菌。还可以为兼具其他病虫害活性和/或被赋予了其他有益特性的工程菌株。
在一个具体实施方式中，所述遗传改良后得到的工程菌为转入携带有功能基因的质粒后所得到的工程菌株，或将功能基因重组到野生菌株的基因组中得到的工程菌株。
在一个具体实施方式中，所述功能基因为用于防治为害植物害虫的基因、用于防治为害植物病原微生物的基因和增强所述食窦魏斯氏菌菌株1-64提高蝗虫微孢子虫（Paranosema locustae）防治蝗虫效果的基因中的至少一种。
本发明之三提供了根据权本发明之一所述的食窦魏斯氏菌菌株1-64或本发明之二所述的工程菌在用于提高蝗虫微孢子虫（Paranosema locustae）防治蝗虫中的应用。其中，所述蝗虫为蝗总科（Acridoidea）的蝗虫。
在一个具体实施方式中，所述蝗虫为东亚飞蝗。
本发明之四提供了一种组合物，其包括如发明之一所述的食窦魏斯氏菌菌株1-64或如发明之二所述的工程菌，和蝗虫微孢子虫（Paranosema locustae）。
在一个具体实施方式中，所述组合物还包括可接受的载体。
在一个具体实施方式中，所述组合物的剂型为悬浮剂、粉剂和颗粒剂中的一种。
在一个具体实施方式中，所述组合物的剂型为油悬剂或可湿性粉剂。
本发明之五提供了本发明之四所述的组合物在用于防治蝗虫中的应用。其中，所述蝗虫为蝗总科（Acridoidea）的蝗虫。
在一个具体实施方式中，所述蝗虫为东亚飞蝗。
本发明的有益效果：本发明发现食窦魏斯氏菌菌株1-64在短期内可以提高蝗虫微孢子虫（Paranosema locustae）对蝗虫，特别是飞蝗的杀虫活性，这有利于加快微孢子虫对蝗虫的防治速度，及早控制蝗虫对农业和畜牧业生产造成的危害，减少生产损失。为防治蝗虫提供了新的生防资源。
菌种保藏：本发明筛选的提高蝗虫微孢子虫（Paranosema locustae）对蝗虫有杀虫活性的菌株被定名为1-64，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 31406，保藏日期为2024年08月01日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为食窦魏斯氏菌Weissella cibaria。
附图说明
图1显示了1-64、蝗虫微孢子虫及两者组合的杀虫活性分析结果。
图2显示了蝗虫微孢子虫及蝗虫微孢子虫与分离株1-64组合的毒力曲线、LT25、LT50及显著性。
图3显示了1-64菌株的菌落形态。
图4显示了1-64菌株的革兰氏染色结果。
图5显示了1-64菌株的系统发育树。
图6显示了1-64菌株对抗生素的抗性结果。
具体实施方式
以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
本发明使用的蝗虫微孢子虫（Paranosema locustae）的株系编号为PL-GM1，其保藏号为CGMCC No. 19390。
实施例1：菌株的分离。
解剖饥饿处理12小时的健康的东亚飞蝗，取出整条肠道，截取中、后肠部位，分别装入灭菌的1.5毫升离心管中，加入少许PBS缓冲液进行充分研磨，分别获得中肠悬液和后肠悬液。其中，中、后肠各设置3个重复，每个重复处理5头飞蝗。
在蒸馏水中加入0.3%牛肉膏、0.5%蛋白胨和2%琼脂粉，调节pH为7.2，制作牛肉膏蛋白胨固体培养基，灭菌，通过倒平板获得牛肉膏蛋白胨固体培养基平板，将中肠悬液和后肠悬液均分别通过平板涂布和平板划线的方法，在平板上对东亚飞蝗的肠道微生物进行分离纯化。37摄氏度下培养12小时后在平板上挑取大小、形态、颜色不一致的单菌落，经平板划线多次分离培养纯化，得到纯化的分离菌株。对分离菌株进行编号。
实施例2：分离株对东亚飞蝗的生物活性分析。
将分离菌株从平板上挑取单菌落接种入装有500微升牛肉膏蛋白胨液体培养基的1.5毫升离心管中，在37摄氏度的摇床中进行再次培养24小时，离心，洗涤菌体，然后将菌体用无菌超纯水稀释成1×104菌落形成单位/毫升（cfu/mL）、1×105菌落形成单位/毫升、1×106菌落形成单位/毫升、1×107菌落形成单位/毫升，制得分离株稀释液。接种量依此为20菌落形成单位/头、200菌落形成单位/头、2000菌落形成单位/头、20000菌落形成单位/头蝗蝻。
在室内挑选健康的3龄东亚飞蝗的蝗蝻，分装在上下直径分别为11.9厘米和8.5厘米的塑料盒中，饥饿处理12小时。
利用血球计数板计算蝗虫微孢子虫（Paranosema locustae）母液浓度。根据实验所需处理蝗虫的数量，吸取相应的蝗虫微孢子虫液，进行离心获得蝗虫微孢子虫沉淀。
使用无菌超纯水重新悬浮蝗虫微孢子虫沉淀，制得微孢子虫悬浮液，其中，微孢子虫悬浮液中的蝗虫微孢子虫的浓度为1×108个/毫升。接种量为200000个/头蝗蝻。
使用4种不同浓度的分离株稀释液，即重新悬浮蝗虫微孢子虫沉淀，制得分离株-微孢子虫悬浮液。其中，分离株-微孢子虫悬浮液中的蝗虫微孢子虫的浓度为1×108个/毫升（cfu/mL）。取2微升分离株稀释液、微孢子虫悬浮液以及分离株-微孢子虫悬浮液分别均匀涂抹在裁剪成大致面积相同且刮磨处理过的玉米叶片上，用针头与三角卡片固定玉米叶片，饲喂3龄蝗蝻。即每一头蝗蝻均接种相同剂量的分离株或蝗虫微孢子虫。此外，设置无菌超纯水阴性对照组（CK）。
3小时后挑选出已将玉米叶片全部吃完的蝗蝻，放入养虫盒中，用新鲜小麦苗饲喂，每个养虫盒中放入10头接种成功的蝗蝻，每个处理使用3个养虫盒，设置3个生物学重复。每日观察蝗虫每日的死亡情况并计算死亡率以及基于超纯水阴性对照计算校正死亡率，总共持续20天。
使用GraphPad作图软件对各分离菌株、微孢子虫以及分离株与微孢子虫组合的室内生测结果进行分析，制作东亚飞蝗蝗蝻存活曲线图和不同时间节点东亚飞蝗蝗蝻死亡率的柱状图。
其中，对蝗虫微孢子虫增效较为明显且容易培养的分离株为1-64。经分离菌株1-64、微孢子虫以及分离株1-64与微孢子虫组合处理后，东亚飞蝗蝗蝻死亡率柱状图如图1所示。其中，图中分离株1-64的接种量为20菌落形成单位/头，蝗虫微孢子虫的接种量为2×105个/头。
图1的结果表明，在第0至10天，分离株1-64对东亚飞蝗的致死效果与阴性对照均没有显著性差异，即其被认为对东亚飞蝗基本没有毒性，但当其与蝗虫微孢子虫组合使用后，可以显著地提高东亚飞蝗的死亡率，说明其对蝗虫微孢子虫杀东亚飞蝗有增效作用。
在蝗虫微孢子虫接种量为2×105个/头；以及蝗虫微孢子虫与分离株1-64组合中分离株接种量为20菌落形成单位/头，蝗虫微孢子虫接种量为2×105个/头的情况下，使用SPSS软件基于时间和飞蝗死亡率获得毒力曲线及相关性R值，其中，x代表实验进行天数，y代表飞蝗随时间变化而表现出的死亡率。基于毒力曲线计算LT25和LT50。蝗虫微孢子虫及蝗虫微孢子虫与分离株1-64组合的毒力曲线、LT25、LT50及显著性见图2。
实施例3：活性分离菌株的分类鉴定。
1-64分离株的菌落形态：1-64分离株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上37摄氏度下正置培养2小时，随后倒置培养24小时，观察菌落形态并拍照，见图3。根据图3可知，1-64分离株的菌落形状近圆形，边缘整齐且微隆起，中央凹陷，呈现黄白色，表面光滑且湿润，半透明状。
1-64分离株的革兰氏鉴定：向载玻片滴一滴无菌水，用接种环轻轻挑取1-64的菌苔放入无菌水中，轻轻搅动使菌液均匀，按照革兰氏染色液操作方法进行染色脱色后放到油镜下观察，1-64的染色结果均呈红色，表明其为革兰氏阴性菌。染色结果见图4。
1-64分离株的分子鉴定—16S rDNA鉴定：按照细菌DNA基因组试剂盒操作步骤提取各分离株的总DNA，以341F（如SEQ ID No. 1所示）/806R（如SEQ ID No. 2所示）为引物，以1-64分离株的总DNA为模板，进行16S rDNA的PCR扩增。扩增后的PCR产物经凝胶电泳检测后，将扩增产物送至博迈德基公司测序。其中，1-64菌株所测16S rDNA的序列（如SEQ IDNo. 3所示）。将所测16S rDNA的序列结果在NCBI上进行比对分析，结果表明1-64菌株与食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）亲缘关系最近。采用MEGA7.0构建系统发育树，其中，1-64菌株的系统发育树见图5。根据图5的系统发育树可知，1-64菌株与食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）菌株亲缘关系最近。
综上，1-64菌株的系统分类为食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）。
将1-64菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 31406，保藏日期为2024年08月01日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为食窦魏斯氏菌Weissella cibaria。
1-64分离菌株的抗性检测：配制五种抗生素：硫酸庆大霉素，工作浓度50微克/毫升；硫酸链霉素，工作浓度50微克/毫升；卡那霉素，工作浓度25微克/毫升；氯霉素，工作浓度25微克/毫升；氨苄西林，工作浓度50微克/毫升。制作牛肉膏蛋白胨固体培养基的抗性平板，在平板中央滴加1-64菌液，在37摄氏度培养箱中正置培养2小时，随后倒置培养24小时，观察细菌能否生长，判断细菌对不同抗生素的抗性情况。结果见图6。根据图6的结果可知，在含有硫酸链霉素、卡那霉素和氯霉素的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（依次为b、c、d）上不能生长，即对硫酸链霉素、卡那霉素和氯霉素无抗性；在含有硫酸庆大霉素和氨苄西林的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（依次为a、e）上可以生长，说明其对硫酸庆大霉素和氨苄西林有抗性。

Claims (10)

1. 一株食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）菌株1-64，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 31406。
2.一种工程菌，其通过对如权利要求1所述的食窦魏斯氏菌菌株1-64进行遗传改良后得到；
所述遗传改良后得到的工程菌为转入携带有功能基因的质粒后所得到的工程菌株，或将功能基因重组到野生菌株的基因组中得到的工程菌株；
所述功能基因为用于防治为害植物害虫的基因、用于防治为害植物病原微生物的基因和增强所述食窦魏斯氏菌菌株1-64提高蝗虫微孢子虫（Paranosema locustae）防治蝗虫效果的基因中的至少一种。
3. 根据权利要求1所述的食窦魏斯氏菌菌株1-64或权利要求2所述的工程菌在用于提高蝗虫微孢子虫（Paranosema locustae）防治蝗虫中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述蝗虫为东亚飞蝗。
5. 一种组合物，其包括如权利要求1所述的食窦魏斯氏菌菌株1-64或如权利要求2所述的工程菌，和蝗虫微孢子虫（Paranosema locustae）。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括可接受的载体。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为悬浮剂、粉剂和颗粒剂中的一种。
8.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为油悬剂或可湿性粉剂。
9.根据权利要求5至8中任意一项所述的组合物在用于防治蝗虫中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述蝗虫为东亚飞蝗。
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