[go: up one dir, main page]

CN114657097B - 一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1及其应用 - Google Patents

一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114657097B
CN114657097B CN202210302471.2A CN202210302471A CN114657097B CN 114657097 B CN114657097 B CN 114657097B CN 202210302471 A CN202210302471 A CN 202210302471A CN 114657097 B CN114657097 B CN 114657097B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lgt
bacillus
fermentation
tobacco
velezii
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210302471.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114657097A (zh
Inventor
杨建明
申国明
王兆宝
张鹏
周杰
李贵童
张育榛
张艳萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Xihai Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Qingdao Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Agricultural University filed Critical Qingdao Agricultural University
Priority to CN202210302471.2A priority Critical patent/CN114657097B/zh
Publication of CN114657097A publication Critical patent/CN114657097A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114657097B publication Critical patent/CN114657097B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K17/00—Soil-conditioning materials or soil-stabilising materials
    • C09K17/14—Soil-conditioning materials or soil-stabilising materials containing organic compounds only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Soil Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌LGT‑1及其应用。所述贝莱斯芽孢杆菌LGT‑1分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏编号为CGMCC No.24342，其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述贝莱斯芽孢杆菌LGT‑1具有较强的青枯病拮抗能力，对烟草青枯病病原菌的抑菌圈直径达到47.9 mm，能够直接阻止青枯菌的定植；同时该菌株活力高，培养方法简单，可直接用于烟草青枯病的防治，也可制备成多种剂型的菌剂用于制备土壤病原菌防治剂，并且能够降低烟草对致病菌抗药性。因此，所述贝莱斯芽孢杆菌LGT‑1具有广阔的应用前景。

Description

一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1及其应用。
背景技术
烟草青枯病是由茄科罗尔氏菌引起的细菌性土传植物病害，能够寄生于50多个科、数百种植物，给许多农作物及经济作物生产造成严重损失。烟草青枯病自首次在我国报道以来，其发生范围和危害程度就在不断蔓延和加重，每年给烟草行业带来巨大的经济损失，田间烟株一旦感染青枯病，伴随高温高湿的有利发病条件，病株就会迅速发病萎蔫死亡。目前烟草青枯病的防治以化学防治为主，辅以其他防治方法(包括抗病品种筛选、农艺措施管理、化学防治等)。尽管化学防治对烟草青枯病具有较好的防治效果，但会提高致病菌抗药性、减少烟田土壤生物群落多样性，影响烟田土壤环境质量。
近年来，烤草品质及烟田土壤质量越来越受到重视，减少化学防治的食物和使用是必然的趋势，因此，烟草青枯病防治剂的开发及其推广应用对土壤改良及烤烟产质提升具有十分重要的意义。
发明内容
本发明目的在于提供一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1及其应用。所述贝莱斯芽孢杆菌LGT-1抑制烟草青枯病菌作用强，其可以直接使用或发酵成菌剂，用于制备烟草青枯病的防治菌剂。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
本发明提供了一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏编号为CGMCC No.24342。
进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌LGT-1的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌LGT-1的gyrA核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其gyrB核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1在用于制备抑制土壤病原菌的防治菌剂中的应用。
进一步的，所述防治菌剂中包含活菌含量不低于109CFU/mL的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1或其菌剂。
进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌LGT-1菌剂的制备步骤为：
(1)将活化的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1接种到种子培养基中，25℃～35℃，培养20h～24h，制成LGT-1种子液；
(2)将LGT-1种子液转入发酵罐中，25℃～35℃发酵培养40h～50h，制成LGT-1发酵液；
(3)将LGT-1发酵液再次转入发酵罐中，25℃～35℃发酵培养40h～50h，制得的二次发酵液，直接包装或离心后取沉淀进行干燥，包装后得到防治菌剂。
进一步的，所述LGT-1种子液或LGT-1发酵液转入发酵罐的接种量均为1％-5％。
优选的，所述LGT-1种子液或LGT-1发酵液转入发酵罐的接种量均为2％。
进一步的，所述种子培养基的配方为：蛋白胨10g·L-1，酵母粉5g·L-1，氯化钠10g·L-1，pH值7.2～7.4。
进一步的，所述发酵罐中的发酵培养基的配方为：可溶性淀粉6g·L-1～12g·L-1，大豆蛋白胨10g·L-1～15g·L-1，CaCl2 5g·L-1～10g·L-1，pH为7～7.5。
优选的，所述发酵罐中的发酵培养基的配方为：可溶性淀粉10g·L-1，大豆蛋白胨14g·L-1，CaCl2 6g·L-1，pH为7.5。
优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌LGT-1菌剂的制备步骤为：
(1)将活化的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1接种到种子培养基中，30℃，200r/min培养24h，制成LGT-1种子液；
(2)将LGT-1种子液以2％的接种量转入发酵罐中，30℃，180r/min发酵培养48h，制成LGT-1发酵液；
(3)将LGT-1发酵液以2％的接种量再次转入发酵罐中，30℃，180r/min发酵培养48h，制得的LGT-1二次发酵液，直接包装或离心后取沉淀进行干燥，包装后得到贝莱斯芽孢杆菌LGT-1菌剂。
进一步的，所述土壤病原菌为烟草青枯病病菌。
进一步的，所述贝莱斯芽孢杆菌LGT-1明显地抑制烟草青枯病病菌的活性。
本发明还提供了所述的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1在用于制备降低或抑制烟草致病菌抗药性的制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果和优点是：
本发明从湖北恩施烟区被青枯病感染的土壤中健康植株的根际土中分离筛选出了一株高效拮抗烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的芽孢杆菌贝莱斯芽孢杆菌LGT-1。该菌株具有高效抑制烟草青枯病活性的特点，对烟草青枯病病原菌的抑菌圈直径达到47.9mm，能够直接阻止青枯菌的定植；同时该菌株活力高，培养方法简单，可直接用于烟草青枯病的防治，也可制备成多种剂型的菌剂用于制备土壤病原菌防治剂，并且能够降低烟草对致病菌抗药性。因此，应用前景广阔。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌LGT-1的菌落特征图；
图2为贝莱斯芽孢杆菌LGT-1的16S rRNA系统发育树；
图3为贝莱斯芽孢杆菌LGT-1的gyrA系统发育树；
图4为贝莱斯芽孢杆菌LGT-1的gyrB系统发育树；
图5为不同培养基对贝莱斯芽孢杆菌LGT-1发酵液活菌数量的影响；
图6为不同C源培养基对贝莱斯芽孢杆菌LGT-1活菌数的影响；
图7为不同N源培养基对贝莱斯芽孢杆菌LGT-1活菌数的影响；
图8为无机盐种类对贝莱斯芽孢杆菌LGT-1活菌数量的影响；
图9为不同发酵温度对贝莱斯芽孢杆菌LGT-1活菌数量的影响；
图10为不同发酵初始pH对贝莱斯芽孢杆菌LGT-1活菌数量的影响；
图11为不同接种量对贝莱斯芽孢杆菌LGT-1活菌数量的影响；
图12为不同装液量对贝莱斯芽孢杆菌LGT-1活菌数量的影响；
图13为贝莱斯芽孢杆菌LGT-1对青枯菌的拮抗性效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
实施例1：菌株LGT-1的分离筛选和鉴定
一、菌株LGT-1的分离筛选
在湖北省恩施州植烟种植基地，从受青枯病侵染的土地中，选取健康植株，取附着于根上的根际土100g左右，放于灭菌的自封袋中，带回实验室。采用常规稀释平板法进行菌株分离，以烟草青枯病病原菌(Ralstonia solanacearum)为指示菌，筛选拮抗菌株，结果得到一株拮抗性较强的菌株，命名为LGT-1。
二、菌株LGT-1的鉴定
1.形态学鉴定
将菌株接种在LB平板(胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，琼脂粉18％，pH＝7)上，30℃恒温培养12-48h，观察菌落特征。挑取培养12h的菌株，进行革兰氏染色，挑取培养48h的菌株进行芽孢染色。
结果如图1表明，菌落初期无色透明，表面光滑、湿润、粘稠、边缘不整齐，后期为乳白色，表面有明显凸起、褶皱。菌体杆状，产芽孢，革兰氏阳性。
2.生理生化鉴定
参阅《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对筛选出的菌株进行生理生化测定。结果见表1，结合形态学观察，初步将LGT-1鉴定为芽孢杆菌属菌株。
表1：LGT-1生理生化反应特性鉴定
Figure BDA0003566036980000041
注：“+”为阳性，“-”为阴性。
3.分子生物学鉴定
利用购自艾科睿(上海)股份有限公司的细菌基因组提取试剂盒提取菌株LGT-1的基因组DNA，采用通用引物进行16S rRNA基因序列和gyrA、gyrB基因序列扩增。反应条件见表2。
表2：基因序列扩增反应条件
Figure BDA0003566036980000051
将PCR扩增产物送至生物工程(上海)股份有限工程公司检测，得到菌株LGT-1的16S rRNA片段为1041bp，gyrA片段986bp，gyrB基因片段1028bp。
测序得到的LGT-1的16SrDNA基因序列如SEQ ID No.1所示；测序得到的gyrA基因序列如SEQ ID No.2所示；测序得到的gyrB基因序列如SEQ ID No.3所示。
将16SrDNA、gyrA、gyrB基因序列提交NCBI进行在线比对，LGT-1与贝莱斯芽孢杆菌相似度分别为96.89％、99.17％和98.73％，利用MEGA X软件构建系统发育树。如图2-4所示，LGT-1均与贝莱斯芽孢杆菌聚类一起。结合菌株的形态学特征、生理生化鉴定，确定菌株LGT-1为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
将菌株LGT-1进行菌种保藏，所述贝莱斯芽孢杆菌LGT-1的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2022年01月19日；贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis的保藏编号为：CGMCC No.24342。
实施例2：贝莱斯芽孢杆菌LGT-1的培养
一、种子液的制备
供试菌株：贝莱斯芽孢杆菌LGT-1菌株由青岛农业大学光合固碳产能研究中心实验室提供。
供试培养基：LGT-1菌株种子培养基：蛋白胨10g·L-1，酵母粉5g·L-1，氯化钠10g·L-1，pH值7.2～7.4。
LGT-1菌株的活化：将实验室保存的LGT-1菌种移接到平板固体培养基中，在恒温培养箱30℃恒温培养24h待用。
种子液制备：取一环活化后的LGT-1菌株接种于盛有40mL种子培养基的100mL三角瓶中，30℃、200r·min-1条件下摇床振荡培养24h。
摇瓶发酵初始条件：按5％的接种量将LGT-1菌株的种子液接种到有40mL发酵培养基的100mL三角瓶里，在30℃、200r·min-1的条件下摇床振荡培养24h。进行单因素试验、培养基正交优化试验和发酵条件的优化试验。
LGT-1发酵液活菌计数：活菌数的测定采用稀释平板计数法。
二、基础培养基筛选
选择4种不同的培养基(见表3)，将LGT-1菌株在不同的基础培养基中进行摇瓶发酵，分别测定LGT-1菌株发酵液的活菌数。
表3：培养基成分
Figure BDA0003566036980000061
实验结果如图5所示，菌株LGT-1在2号培养基中摇瓶发酵培养下，单位体积的活菌数量最高，为10.20×108cfu·mL-1，1号培养基单位体积发酵液的活菌数量为8.62×108cfu·mL-1，3号培养基单位体积发酵液的活菌数量为7.83×108cfu·mL-1，4号培养基发酵液对应的单位体积内活菌数量为8.96×108cfu·mL-1。所以，选择2号培养基作为贝莱斯芽孢杆菌菌株LGT-1摇瓶发酵的基础培养基。
三、单因素试验
(1)碳源种类及其浓度筛选
分别用等量的葡萄糖、玉米粉、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇替代基础培养基中的碳源(C源)，以不加C源的基础培养基为对照(CK)，其他发酵条件不变，进行摇瓶发酵，每处理重复3次。采用活菌计数法测定不同C源发酵液的活菌数，筛选最佳C源。在筛选出最佳C源种类的基础上，在相同条件下设置0.4％，0.6％，0.8％，1.0％，1.2％，1.4％即4，6，8，10，12，14g·L-16种不同浓度C源的培养基进行摇瓶发酵，以筛选出最佳C源浓度。
结果如图6所示，不同C源对贝莱斯芽孢杆菌LGT-1的活菌数量有较大的影响，其中，以可溶性淀粉作为培养基C源时，单位体积的活菌数量达到最大值，为17.53×108cfu·m L-1，所以选择可溶性淀粉作为贝莱斯芽孢杆菌LGT-1摇瓶发酵培养基的C源。
(2)氮源种类及其浓度筛选
在C源筛选的基础上，分别用等量的蛋白胨、牛肉膏、尿素、硫酸铵、大豆蛋白胨、玉米浆干粉、酵母粉代替发酵培养基中的氮源(N源)，以不加N源的培养基为对照(CK)，其他发酵条件不变，进行摇瓶发酵，每处理重复3次。用活菌计数法计算不同N源发酵液的活菌数，筛选最佳N源。在筛选出最佳N源的基础上，在相同条件下设置0.4％，0.6％，0.8％，1.0％，1.2％，1.4％即4，6，8，10，12，14g·L-1 6种不同浓度N源的培养基进行摇瓶发酵，以筛选出最佳N源浓度。
结果如图7所示，贝莱斯芽孢杆菌LGT-1以不同的N源为培养基成分时，对单位体积的活菌数量影响显著。其中，以大豆蛋白胨作为单一N源时活菌数量最大，为17.5×108cfu·m L-1，因此，选择大豆蛋白胨作为贝莱斯芽孢杆菌LGT-1摇瓶发酵培养基的N源。
(3)无机盐种类及其浓度筛选
在C源、N源优化的基础上，分别添加0.6％的ZnSO4，NaCl，CaCl2，MnSO4，MgSO4，KCl代替发酵培养基中的无机盐，以不加无机盐的培养基作为对照(CK)，其他发酵条件不变，每处理重复3次。采用活菌计数法计算不同无机盐发酵液的活菌数，筛选最佳无机盐。在筛选出最佳无机盐的基础上，在相同条件下考察在大量元素无机盐不同浓度(0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％即2，3，4，5，6，7g·L-1)发酵液中的活菌数，筛选出最佳无机盐的浓度。
结果如图8所示，无机盐种类对贝莱斯芽孢杆菌LGT-1单位体积发酵液的活菌数量影响显著，以CaCl2为无机盐时，LGT-1对无机盐的利用最好，单位体积发酵液的活菌数量达到最大值，为20.06×108cfu·mL-1，以ZnSO4，MnSO4，MgSO4为无机盐时，单位体积发酵液的活菌数量都小于不加无机盐的对照组。因此，选择CaCl2作为贝莱斯芽孢杆菌LGT-1摇瓶发酵培养基的无机盐。
四、发酵培养基正交试验优化
筛选得到的培养基最佳C源为可溶性淀粉，最佳N源为大豆蛋白胨，最佳无机盐为CaCl2。将可溶性淀粉(A)、大豆蛋白胨(B)和CaCl2(C)三因素按L9(33)设计正交试验的因素与水平，如表4所示，见表4。按正交验设计，在30℃、200r·min-1、pH 7.2的条件下振荡培养24h，以发酵液的活菌数为优化指标，比较不同组合发酵液的活菌数，确定最佳培养基配方。
表4：正交因素与水平
Figure BDA0003566036980000081
结果如表5所示，正交试验结果通过极差分析可知，N源大豆蛋白胨对贝莱斯芽孢杆菌LGT-1单位体积发酵液中的活菌数量影响最大，其次是无机盐CaCl2，C源可溶性淀粉，对应的组合为4号培养基A2B1C2，其单位体积发酵液中的活菌数量为32.23×108cfu·mL-1。因此，确定贝莱斯芽孢杆菌LGT-1的发酵培养基配方为可溶性淀粉10g·L-1，大豆蛋白胨14g·L-1，CaCl2 6g·L-1。
表5：发酵培养基正交实验结果
Figure BDA0003566036980000082
Figure BDA0003566036980000091
五、摇瓶发酵条件优化
在培养基的优化基础上，对摇瓶发酵的发酵温度、初始pH、接种量、装液量进行优化。每个试验组设置3次重复，进行一个因素优化期间保证其他条件不变，计数不同条件下摇瓶发酵液的活菌数。发酵温度：将LGT-1菌株接种后分别在25，28，31，34，37℃条件下摇床发酵；初始pH：用HCl和NaOH调节培养基的初始pH值分别为6.5，7.0，7.5，8.0，8.5；接种量：将LGT-1菌株按照体积分数分别为为1％，2％，3％，4％，5％的接种量进行接种；装液量：将LGT-1菌株分别接种到按体积分数为10％，20％，30％，40％，50％装液量的培养基中(即100mL三角瓶分别装入盛有10，20，30，40，50mL培养基)摇瓶发酵。
发酵温度如图9所示，在28℃时摇瓶得到发酵液中最大单位体积的活菌数量，为37.4×108cfu·m L-1；发酵初始pH如图10所示，在发酵初始pH 7.5时单位体积发酵液中的含菌量最高，其活菌数量为37.03×108cfu·m L-1；发酵接种量如图11所示，在2％接种量时单位体积发酵液中的活菌数量达到最大值，为34.17×108cfu·m L-1；发酵装液量如图12所示，培养基为20％的装液量时，单位体积发酵液中的活菌数量显著高于其他装液量的活菌数，其有效含菌量最高值为37.4×108cfu·m L-1。
实施例3：贝莱斯芽孢杆菌LGT-1的抑菌性
1、病原菌活化
将烟草青枯病病原菌接到NA平板上进行活化，用NB发酵培养48h后待用。
2、拮抗实验
将培养好的烟草青枯病病原菌，按照1％的量稀释为菌悬液。将实施例2制备的50μL LGT-1种子液经过12000rpm离心10min，取上清液加入5mm打孔的LB平板中，在板上均匀喷洒病原菌稀释液，培养观察。
结果如图13所示，贝莱斯芽孢杆菌LGT-1对烟草青枯病病原菌的抑菌圈直径达到了47.9mm。
实施例4：贝莱斯芽孢杆菌LGT-1菌剂的制备
(1)挑取贝莱斯芽孢杆菌LGT-1的单菌落接种在装有10～30mL LB液体培养基(胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH＝7.2-7.4)的三角瓶中，在30℃温度下，200r/min振荡培养24h左右，培养至OD600值大于0.6，制成种子液；
(2)将种子液以2％的接种量转入发酵罐发酵(发酵培养基配方：可溶性淀粉10g·L-1，大豆蛋白胨14g·L-1，CaCl2 6g·L-1，蒸馏水1000mL，pH调至7.5)，30℃，180r/min，培养48h左右，制成发酵液；
(3)根据不同的应用方面制备不同的菌剂剂型：
a)液体制剂：将发酵液再次以2％的接种量转入发酵罐发酵，30℃，180r/min，培养48h后中止发酵，发酵菌液达到每毫升菌液含有109～1010个活菌数，再采用塑料瓶或者塑料袋包装发酵液，即为贝莱斯芽孢杆菌液体菌剂。
b)固体粉剂：将发酵液再次转入发酵罐发酵，30℃，180r/min，培养48h后中止发酵，离心发酵液，向得到菌体中加入木炭粉吸附菌体，菌体个数每克菌剂含有1012～1014个活菌数，再用塑料袋进行密封包装，即为贝莱斯芽孢杆菌固体菌剂。
上述制备的菌剂能够作为生物防治制剂用来防治植物病原菌，该菌剂中菌株活力高，且培养方法简单。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1及其应用
<141> 2022-03-25
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1041
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggggggtgc tataatgcaa gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg 60
gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac 120
cggggctaat accggatggt tgtctgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg 180
ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa 240
ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc 300
cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag 360
caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca 420
agtgccgttc aaatagggcg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta 480
cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540
agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt 600
cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg 660
aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga 720
cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780
aaacgatgag tgctaagtgg ttagggggtt tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt 840
aagcactccg cctgggggag tacggtcgca agactgaact caagggaatt gacggggccg 900
cacagcgggg ggagcatgtg gtttattcga agcacgcaag aaccttacca ggcttggatc 960
ttgcacccct aaaaaaagac gcccttcggg gaaaggaaag gggggggggt ggtggccccc 1020
ctctcccggg agagtgatgt g 1041
<210> 2
<211> 986
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagtcatgca tgagcgttat cgtatcccgg gcgcttccgg atgtgcgtga cggtctgaag 60
ccggttcaca gacggatttt gtacgcgatg aatgatttag gcatgaccag tgacaaacca 120
tataaaaaat ctgcccgtat tgtcggtgaa gttatcggta agtaccaccc gcacggtgac 180
tcagcggttt acgaatcaat ggtcagaatg gcgcaggatt ttaactaccg ctacatgctt 240
gttgacggac acggcaactt cggttcggtt gacggcgact cagcggccgc gatgcgttac 300
acagaagcga gaatgtcaaa aatcgcaatg gaaatcctac gggacattac gaaagatacg 360
attgattatc aagataacta tgacggcgca gaaagagaac ctgtcgtcat gccttcgaga 420
tttccgaatc tgctcgtcaa cggagctgcc ggtattgcgg tcggaatggc gacaaatatt 480
cctccgcatc agcttgggga agtcattgaa ggcgtgcttg ccgtaagtga gaatcctgag 540
attacaaacc aggagctgat ggaatacatc ccgggcccgg attttccgac tgcaggtcag 600
attttaggcc ggagcggcat ccgcaaggca tatgaatccg gacggggatc cattacgatc 660
cgggctaagg ctgaaatcga agagacatca tcgggaaaag aaagaattat tgtcacagaa 720
cttccttatc aggtgaacaa agcgagatta attgaaaaaa tcgcagatct tgtccgggac 780
aaaaaaatcg aaggaattac ggatctgcgt gacgaatccg accgtaacgg aatgagaatc 840
gtcattgaga ttcgccgtga cgctaatgct cacgtcattt tgaataacct gtacaaacaa 900
acggccctgc agacgtcttt cggaatcaac ctgctggcgc tcgttgacgg acagccgaag 960
gtctaagctg acacgcgggg gccgaa 986
<210> 3
<211> 1028
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcagtcga ggagcggata taaagtatcc ggcggtcttc acggtgtagg ggcgtctgtc 60
gtaaacgcct tgtcgaccac tcttgacgtt acggttcatc gtgacggaaa aatccactat 120
caggcgtacg agcgcggtgt acctgtggcc gatcttgaag tgatcggtga tactgataag 180
accggaacga ttacgcactt cgttccggat ccggaaattt tcaaagaaac aaccgtatac 240
gactatgacc tgctttcaaa ccgtgtccgg gaattggcct tcctgacaaa aggcgtaaac 300
atcacgattg aagacaaacg tgaaggacaa gaacggaaaa acgagtacca ctacgaaggc 360
ggaatcaaaa gctatgttga gtacttaaac cgttccaaag aagtcgttca tgaagagccg 420
atttatatcg aaggcgagaa agacggcata acggttgaag ttgcgttgca atacaacgac 480
agctatacaa gcaacattta ttctttcaca aataacatca acacatacga aggcgggacg 540
cacgaagccg gatttaaaac cggtctgacc cgtgtcataa acgactatgc aagaagaaaa 600
gggattttca aagaaaatga tccgaattta agcggggatg atgtgagaga agggctgact 660
gccattattt caattaagca ccctgatccg caattcgaag ggcagacgaa aacgaagctc 720
ggcaactccg aagcgagaac gatcactgat acgctgtttt cttctgcgct ggaaacattc 780
cttcttgaaa atccggactc agcccgcaaa atcgttgaaa aaggtttaat ggccgcaaga 840
gcgcggatgg cagcgaaaaa agcacgggaa ttgacccggc gcaaaagtgc gcttgagatt 900
tcaatctgcc gggcaactgg cggactgttc ttctaaaatc cgagcattcc gagctgttat 960
cgtaaagggg gctctgcggg cggatcagcg aacaggggcg ggatcgcctt tccaagcctt 1020
ctggccgt 1028
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgccgacct agtggaggaa 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagtcaggaa atgcgtacgt cctt 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caaggtaatg ctccaggcat tgct 24
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaagtcatca tgaccgttct gcaygcnggn ggnaarttyg a 41
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agcagggtac gcatgtgcga gccrtcnacr tcngcrtcng tcat 44

Claims (7)

1.一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1，其特征在于，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，保藏编号为CGMCC No.24342。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1在用于制备抑制土壤病原菌的防治菌剂中的应用，其特征在于，所述土壤病原菌为烟草青枯病病菌。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述防治菌剂中包含活菌含量不低于109CFU/mL的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1或其菌剂。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌LGT-1菌剂的制备步骤为：
(1)将活化的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1接种到种子培养基中，25℃～35℃，培养20h～24h，制成LGT-1种子液；
(2)将LGT-1种子液转入发酵罐中，25℃～35℃发酵培养40h～50h，制成LGT-1发酵液；
(3)将LGT-1发酵液再次转入发酵罐中，25℃～35℃发酵培养40h～50h，制得的LGT-1二次发酵液，直接包装或离心后取沉淀进行干燥，包装后得到贝莱斯芽孢杆菌LGT-1菌剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵罐中的发酵培养基的配方为：可溶性淀粉6g·L-1～12g·L-1，大豆蛋白胨10g·L-1～15g·L-1，CaCl2 5g·L-1～10g·L-1，pH为7～7.5，余量为水。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述LGT-1种子液或LGT-1发酵液转入发酵罐的接种量均为1％-5％。
7.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌LGT-1在用于制备降低或抑制烟草致病菌抗药性的制剂中的应用，其特征在于，所述烟草致病菌为烟草青枯病病菌。
CN202210302471.2A 2022-03-25 2022-03-25 一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1及其应用 Active CN114657097B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210302471.2A CN114657097B (zh) 2022-03-25 2022-03-25 一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210302471.2A CN114657097B (zh) 2022-03-25 2022-03-25 一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114657097A CN114657097A (zh) 2022-06-24
CN114657097B true CN114657097B (zh) 2023-04-07

Family

ID=82031865

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210302471.2A Active CN114657097B (zh) 2022-03-25 2022-03-25 一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114657097B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116333927A (zh) * 2023-02-24 2023-06-27 中国农业科学院植物保护研究所 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在瓜类细菌性果斑病防治中的应用
CN116676213B (zh) * 2023-04-27 2025-04-01 青岛农业大学 一株贝莱斯芽孢杆菌菌株hmqau20041、生防合剂及其制备方法和应用
CN118126903B (zh) * 2024-04-19 2024-10-18 青岛农业大学 一株耐酸产碱的多功能贝莱斯芽孢杆菌、其微生物菌剂及其应用
CN118222458B (zh) * 2024-05-06 2024-09-03 青岛农业大学 一株贝莱斯芽孢杆菌f046、其微生物菌剂及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111925966A (zh) * 2020-08-28 2020-11-13 山东省果树研究所 一株贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法与应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101659932B (zh) * 2009-09-18 2010-10-20 南京农业大学资产经营有限公司 防除连作烟草青枯病的拮抗菌及用其微生物有机肥料
CN107779420B (zh) * 2017-06-27 2020-10-30 湖北省烟草公司恩施州公司 一种两株拮抗烟草青枯病的内生贝莱斯芽胞杆菌及其应用
CN107964514B (zh) * 2017-09-08 2019-10-01 卢志军 一种贝莱斯芽孢杆菌及其在植物上的应用
CN108004185B (zh) * 2018-01-09 2020-04-17 中国农业科学院植物保护研究所 一株具防病、促生、抗旱功能植物内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用
BR112020016351A2 (pt) * 2018-02-12 2020-12-15 Boost Biomes, Inc Composições microbianas para a prevenção ou redução do crescimento de fungos patogênicos em plantas
CN109266586B (zh) * 2018-10-18 2021-04-20 淮海工学院 贝莱斯芽孢杆菌bmf 03及其用途与发酵方法
CN112375700B (zh) * 2020-11-11 2022-10-21 云南省烟草农业科学研究院 一株贝莱斯芽孢杆菌05-1205、获取方法及其应用
CN112322536B (zh) * 2020-11-11 2024-07-16 云南省烟草农业科学研究院 一株贝莱斯芽孢杆菌z002、获取方法及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111925966A (zh) * 2020-08-28 2020-11-13 山东省果树研究所 一株贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114657097A (zh) 2022-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112458012B (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌微生物菌剂及其应用
CN114657097B (zh) 一株高效拮抗青枯病菌的贝莱斯芽孢杆菌lgt-1及其应用
CN108034618B (zh) 暹罗芽孢杆菌菌株及其应用
CN111876351A (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在减轻苹果连作障碍中的应用
CN106754557A (zh) 枯草芽孢杆菌ybm‑4及其在防治烟草黑胫病和促生长中的应用
CN104164394A (zh) 一株拮抗植物病原菌的菌株及其应用
CN106754489A (zh) 甲基营养型芽孢杆菌f7及其应用
CN112779192B (zh) 一株对植物疮痂病有抑制作用的卡氏芽孢菌株dm4-2及其菌剂和应用
CN110452832A (zh) 一株耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5及其应用
CN102154164B (zh) 一株抗病毒解淀粉芽孢杆菌的分离及其应用
CN113801807B (zh) 一种诱导加工番茄系统抗性的促生菌剂及其应用
CN110172423A (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治根结线虫中的应用
CN113151101B (zh) 一种粘质沙雷氏菌及其应用
CN112359000B (zh) 一株高效生防假单胞菌及其在水稻病害防治中的应用
CN110846262B (zh) 一株粘质沙雷氏菌sz201及其应用
CN117546873A (zh) 极端东方假单胞菌在防治辣椒轻斑驳病毒中的应用
CN114774301B (zh) 一株拮抗食用菌病原真菌的内生枯草芽孢杆菌jl-b16及其应用
CN102747005B (zh) 一种用于防治棉铃疫病的萎缩芽孢杆菌及其微生物菌剂
CN115960766A (zh) 一种防治青枯病的微生物及其应用
CN118995536A (zh) 对蝗虫微孢子虫有增效作用的食窦魏斯氏菌及其应用
CN112063554B (zh) 一种生物防治菌Pantoea jilinensis D25及其应用
CN108753666A (zh) 一株耐盐拮抗菌m4-1及其菌剂的制备和应用
CN105349457B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其在玉米大斑病生防中的应用
CN118109371A (zh) 一株用于抑制松赤枯病原菌的生防细菌制备方法
CN117535210A (zh) 一种耐盐促生菌、菌剂、菌剂制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240820

Address after: Room 506, Building A, No. 69 Haimen Road, Shinan District, Qingdao City, Shandong Province, China 266000

Patentee after: Qingdao Xihai Biotechnology Co.,Ltd.

Country or region after: China

Address before: No. 700, Changcheng Road, Chengyang District, Qingdao City, Shandong Province, Shandong

Patentee before: Qingdao Agricultural University

Country or region before: China