CN1286460C - 槐果碱在制备由冠状病毒引起的疾病的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种槐果碱在制备由冠状病毒引起的疾病的药物中的用途，具体地，本发明还公开了一种槐果碱在制备严重急性呼吸综合症药物中的用途。槐果碱能有效阻止冠状病毒的生物合成，并进入到细胞内发挥抗病毒作用。本发明还公开了槐果碱作为制备严重急性呼吸综合症的药物的制备方法。应用槐果碱作为严重急性呼吸综合症的药物，可有效提高SARS的治疗率、减少死亡率，而且没有明显的细胞毒性作用。槐果碱的药源丰富，且制备简便，成本低廉，适用于工业化生产。

Description

槐果碱在制备由冠状病毒引起的疾病的药物中的用途

技术领域

本发明涉及一种抗病毒药物的用途及制备，进一步地，本发明涉及槐果碱作为抗病毒药物的用途及其制备方法。

背景技术

严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndromes，SARS)是近来流行于我国和世界其他地区的一种新型的呼吸道传染性疾病，由于其具有较强的传染性和较高的死亡率，它的流行和发展已经严重威胁到我国人民的生命安全和身体健康，并造成了一定的社会恐慌。SARS是主要通过近距离空气飞沫和密切接触传播的呼吸道传染病，临床主要表现为肺炎，在家庭和医院有显著的群发现象。起病急，以发热为首发症状，体温一般高于38℃，偶有畏寒；可伴有头痛、关节酸痛、肌肉酸痛、乏力、腹泻；可有咳嗽，多为干咳、少痰，偶有血丝痰；可有胸闷，严重者出现呼吸加速，气促，或明显呼吸窘迫。现已确定SARS的病原体是一种冠状病毒，许多国家和地区都在着手研究临床诊断、预防和治疗SARS的方法。

目前发现SARS患者痊愈后体内产生抗体，从其血液中获得的免疫球蛋白具有一定的治疗效果。但是，这种途径局限性很大。一方面，很难获得足够的血液来源，不能规模生产。另一方面，这种途径获得的血液数量很少，无法象规模生产的产品那样进行严格、系统的检验鉴定，很容易造成其他疾病的传播。另一方面，可以从基因工程领域着手研究，开发可批量生产的抗体药物，但是这一方案存在研究时间过于缓慢、开发资金过于庞大的弊端。

SARS病毒属于RNA病毒，在现有技术中，柯萨奇B病毒(CVB)也是一种RNA病毒。本发明人通过多年的研究，已从众多的中药中筛选出唯一一味低毒而明显对抗CVB作用的中药——苦参，其中含有对抗CVB的有效成分——槐果碱单体(sophocarpine，简称SC)，现已制成纯度较高的槐果碱注射液，有关该项技术内容已经在本发明人的申请号为CN99119850的专利中公开。基于SARS病毒与柯萨奇B病毒存在的共同点，发明人针对SARS病毒进行测试，发现槐果碱也有明显的抗SARS病毒、保持未感染细胞的活性作用，由此可确定槐果碱对抗SARS病毒是有效果的。

苦参是我国历史悠久的传统药物之一，始载于我国最早的医学文献《神农本草经》，列为中品，具有清热燥湿、祛风杀虫的功能，主治心腹痞满胀气、症瘕积聚、黄疸等。我国药典1997年版及部分地方药品标本已将《苦豆草流浸片》收载主治菌痢及肠炎(<中草药学(中册)>，1976年8月第一版，494-495)。晚近的动物实验证明，苦参生物碱对中枢神经有抑制、镇痛及降温作用，能提高机体免疫力，并有抗癌作用。苦参提取物苦参生物碱能治疗乙肝，有改善临床症状及肝功能、使部分患者HbeAg转阴的效果。有文献记载苦参生物碱具有平喘及抗心律失常的作用。本发明人的申请号为CN99119850的专利中公开了从苦参中提取的生物碱——槐果碱作为制备治疗柯萨奇B病毒性心肌炎的药物的应用。但至今未见使用苦参生物碱制备治疗SARS病毒药物的报导。

从豆科槐属植物苦参(Sophora flavescens Ait)及豆科槐属植物苦豆子(Sophora alopecuroides L.)的干燥根及其地面部分中所提取的物质，已可分离出20余种生物碱，其中槐果碱是其中主要的一种，分子式为C15H22ON2，熔点为53-54℃，[α]D-32.9°，(t＝15，乙醇)，其结构式为：

发明内容

本发明的目的在于提供一种槐果碱在制备由冠状病毒引起的疾病的药物中的用途，所述的药物的剂型为药剂学上认可的任何一种剂型。

进一步地，本发明目的还在于提供了一种槐果碱在制备由冠状病毒引起的严重急性呼吸综合症(SARS)的药物中的用途。

本发明所要解决的技术问题还在于提供槐果碱作为制备由冠状病毒引起的严重急性呼吸综合症药物的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)将苦豆子粉碎，加入5-10％氢氧化氨湿润，经氯仿回流加热提取，加入7-15％硫酸萃取，获得总生物碱；

(2)总生物碱通过加入甲苯萃取，然后加入5-10％盐酸提取槐果碱；

(3)调节pH5-10，抽滤，再以丙酮重结晶，获槐果碱精品；

(4)将槐果碱精品溶解于注射用水中，过滤，含量测定，调节pH4.0-4.5；

(5)通过0.65um微孔滤膜灌装、封口，经流通蒸汽100℃灭菌30分钟即可制得注射针剂。

在本发明的槐果碱作为制备由冠状病毒引起的严重急性呼吸综合症药物的制备方法中，注射针剂中槐果碱的浓度介于100-800μg/ml之间。更佳的，注射针剂中槐果碱的浓度介于100-600μg/ml之间。

本发明所述的槐果碱能够有效阻止冠状病毒的生物合成(包括蛋白合成)，并进入到细胞内发挥抗病毒作用，槐果碱的结构如下：

本发明的发明人在以前的研究中，针对一种RNA病毒——柯萨奇B病毒(CVB)，从众多中药中筛选出一味低毒而明显抗CVB的中药——苦参，其中含有对抗CVB的有效成分——槐果碱单体。由于SARS病毒是一种冠状病毒，也属于RNA病毒，根据槐果碱对抗病毒的机理，认为其也有抗SARS病毒的效果，并经实验验证，确定槐果碱可作为一种治疗SARS的有效药物。

为了验证槐果碱的抗病毒功效，尤其是抗SARS病毒功效，本发明人作了深入的研究。在槐果碱药物体外抗SARS病毒活性筛选中，以Vero-E6细胞作为病毒宿主细胞(易感细胞)，检测样品抵抗病毒感染细胞的作用，其检测指标为细胞病变反应(Cell Pathogenic Effect，CPE)以及感染细胞保护率。实验结果显示，在体外筛选模型中，槐果碱样品在100μg/ml以上浓度时显示明显的抗SARS病毒、保护感染细胞的活性。接着进行复筛，再次实验筛选结果进一步表明，槐果碱在100μg/ml以上浓度时显示有明显的抗SARS病毒、保护被感染细胞的活性作用，在100μg/ml以下浓度时也有一定的活性，并且在上述的实验浓度中对Vero-E6细胞未见明显的细胞毒性作用。

由于冠状病毒所致的SARS以呼吸道症状为突出，槐果碱在中药中有平喘作用。在本发明的一个实施方式中，对犬的相关血流动力学进行研究，发现槐果碱能使已经升高的肺毛细楔嵌压(PCWP)下降至正常水平，在本发明的一个实施例中，其PCWP由给药前的18mmHg下降至12mmHg，并保持稳定。槐果碱的使用还有利于降低肺循环阻力，改善肺郁血，降低心脏的前负荷、后负荷，有利于对心脏功能的保护。

在本发明的实施方式中，对大鼠的体内药代动力学试验还证明，由于槐果碱在肺脏中的浓度远远超过血浓度，而且维持时间较长，有利于改善肺部症状，以及有利于SARS病毒的去除。

在本发明的实施方式中，采用细胞抑制病变法显示，槐果碱的浓度在312ug/ml时，病毒对培养细胞的毒性消失。低于毒性浓度的槐果碱，即使是5ug/ml也能抑制病毒对培养细胞的致病变作用。³H-TdR渗入法证实、以及MTT微量检测法和结晶紫染色法证实，槐果碱在高浓度和低浓度时，对感染病毒后培养细胞的DNA合成、能量代谢以及细胞存活数均有影响，并目随药物浓度的增加呈正相关。

在本发明中，槐果碱已经验证具有明显的抗SARS病毒功效，由于SARS病毒属于一种冠状病毒，因此本领域技术人员应该理解，槐果碱对于SARS病毒以外的其他类似的冠状病毒也可能有一定的抗病毒作用，并能阻止它们的生物合成。

在本发明的用途中，有效成分槐果碱以注射液形式给药，但是本领域技术人员应该理解，包含槐果碱的药物也可以是其他有效的形式，比如含有槐果碱有效成分的片剂等。

应用槐果碱作为SARS的药物，可以有效提高SARS的治疗率、减少死亡率，而且没有明显的细胞毒性作用。

槐果碱可以从豆科槐属植物苦参以及苦豆子中提取获得，因此使用槐果碱作为药物，药源丰富，毒副作用小，且制备方法操作简便，成本低廉，适用于大规模工业化生产。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：

实施例1槐果碱的提取以及针剂的制备

将10kg苦豆子(含叶、花、茎干)粉碎，加入5％氢氧化氨湿润，经氯仿回流加热提取，8％硫酸萃取，获得总生物碱；对总生物碱用甲苯萃取，并通过足量7％盐酸提取槐果碱，调节pH8，抽滤，再以丙酮重结晶，获槐果碱精品，得率为0.12％。

取一定量的槐果碱溶解于注射用水中，经过滤、含量测定，调节pH4.0-4.5，再通过0.65um微孔滤膜灌装、封口，最后经流通蒸汽100℃灭菌30分钟即可制得注射针剂。

实施例2槐果碱药物抗SARS病毒活性筛选(病毒-细胞水平模型)

测试样品为槐果碱；病毒株为BJ-01，来源于北京军事科学院微生物流行病研究所。

1.初试实验

以Vero-E6细胞作为病毒宿主细胞(易感细胞)，检测样品抵抗病毒感染细胞的作用，检测指标为细胞病变反应(Cell Pathogenic Effect，CPE)以及感染细胞保护率。

槐果碱样品溶于培养液或DMSO，配成适宜的初始浓度，2倍稀释，7个稀释度。

把Vero-E6细胞接种于96孔培养板，置于37℃，5％CO2培养，SARS病毒感染细胞后，分别加入不同稀释浓度的样品，设病毒对照、细胞对照和样品对照。每日镜下观察结果，记录CPE，并用中性红染色测定OD值，参照对照进行样品抗SARS病毒活性作用的计算和评估。

测试结果见表1。

	表1细胞病变反应和感染细胞保护率检测结果
				最终浓度(μg/ml)	CPE	细胞保护率(EC)％	细胞毒性率(CC)％
100204	+++++++++	78148	233316

细胞病变法(CPE)：以“+”表示细胞病变程度，＜25％+，25％-50％++，50％-75％+++，＞75％++++。

被感染细胞保护率：通过比较病毒对照、细胞对照和样品对照的OD值，计算样品对病毒感染细胞的保护活性，保护率＞EC₂₀初步被认为样品对病毒感染的细胞具有一定的保护作用，有抗病毒活性。

样品细胞毒性：如果样品的细胞毒性与细胞对照比大于50(＞CC₅₀)时，不给评价和保护率计算。

可见，槐果碱样品在体外筛选模型中，在100μg/ml以上浓度时显示明显的抗SARS病毒、保护感染细胞的活性。

2.复试实验(复筛)

通过细胞培养，连续观察多个不同剂量的槐果碱样品抗SARS病毒的药效。步骤为(1)以Vero-E6作为宿主细胞；(2)感染病毒；(3)细胞病变(CPE)直接显微镜观察；(4)细胞活性染色法染色，直接用中性红染色。

所测样品在体外抗SARS病变活性筛选中，经再次实验筛选结果表明，在100μg/ml以上浓度时显示有明显的抗SARS病毒、保护被感染细胞的活性作用，其EC50约为127μg/ml，并在上述的实验浓度中对Vero-E6细胞未见明显的细胞毒性作用。

采用细胞抑制病变法显示，槐果碱高浓度(如312μg/ml)时，病毒对培养细胞的毒性消失。低于毒性浓度的槐果碱也能抑制病毒对培养细胞的致病变作用，用微量细胞测定法证实当槐果碱在200μg/ml时对体内病毒的抑制率为99％，25μg/ml时对病毒的抑制率为67％。

另外，当病毒感染复数为5时(MOI＝5)，通过³H-TdR渗入法证实，槐果碱在200-3.125μg/ml时，以及MTT微量检测法、结晶紫染色法证实槐果碱在200μg/ml-1.5625μg/ml时，对感染病毒后培养细胞的DNA合成、能量代谢以及细胞存活数均有影响，其测定值随药物浓度的增加呈正相关，γ分别为0.9818，0.9727，0.9219。

实施例3动物的槐果碱药理实验

1.犬

在犬类动物中，用漂浮导管经头颈或股静脉插入肺动脉，进入肺毛细血管，连续监测肺毛楔压，动态观察槐果碱对肺毛楔压变化的影响，测试结果证实，槐果碱能使已经升高的肺毛楔压下降至正常水平。

将A犬经麻醉并作气管插管后测血压为149/89mmHg，HR(EKG)示148/分，PCWP为17-18mmHg并保持平稳。将6mg/kg槐果碱注射液加入5％GS20ml中，以每分钟1ml速度缓慢推注，PCWP由17mmHg降至9mmHg，10分钟后回升至13mmHg，相隔20分钟后再以8mg/kg槐果碱注射液加入5％GS20ml以每分钟1ml速度缓慢推注，未见PCWP继续下降，而稳定于12-13mmHg水平，此时血压119/70mmHg，HR130/分左右。实验结果表明A犬注射后血压下降，使已升高的PCWP逐渐下降至一定水平时即稳定，不再下降。

将B犬经麻醉并作气管插管后，由右侧股静脉插入光纤Swan-Ganz漂浮导管测毛楔压，待犬的心率及血压稳定后，测其PCWP，麻醉后发现该犬有高血压心力衰竭，并同时呼吸道分泌物增多，开胸后发现心脏增大，第一次测血压为270/206mmHg，PCWP为23mmHg。将槐果碱注射液6mg/kg(11.5kg，总量为69mg)加入5％GS250ml中，以每分钟1ml(含槐果碱0.27mg)的速度持续静脉点滴，90分钟后，该犬血压下降至154/114mmHg，PCWP为12mmHg，心率下降至116次/分。结果表明注射后血压下降的同时使已经升高的PCWP也逐渐下降，但降至稳定趋势后即保持平稳，不再下降。

2.大鼠

在大鼠离体心脏冠状动脉灌流的实验中，证实槐果碱能增加冠状动脉流量，在低氧灌流情况下，提高对心肌的耐缺氧作用。

槐果碱的在Wist ar大鼠药代动力学试验中，证实在肺脏内药物浓度远超过血浓度，且维持时间较长。当血药浓度为7.3350μg/ml时，肺脏组织中的药浓度为13.104μg/ml；当血药浓度为4.7870μg/ml时，肺脏中的药浓度为10.402μg/ml；当血药浓度为2.8479μg/ml时，肺脏中的药浓度为5.1240μg/ml；当血药浓度为1.222μg/ml时，肺脏中的药浓度为2.5091μg/ml；并且，药浓度在9-15小时内能测到。

Claims (2)

1.槐果碱在制备由SARS病毒引起的疾病的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，所述的槐果碱在制备由SARS病毒引起的严重急性呼吸综合症的药物中的用途。