CN1280304C

CN1280304C - 蕨麻有效部位与化合物蕨麻苷及分离与纯化方法

Info

Publication number: CN1280304C
Application number: CN 03150986
Authority: CN
Inventors: 蔡光明
Original assignee: Beijing Meite Biotechnology Co Ltd; 302th Hospital of PLA
Current assignee: Beijing Meite Biotechnology Co Ltd; 302th Hospital of PLA
Priority date: 2003-09-12
Filing date: 2003-09-12
Publication date: 2006-10-18
Anticipated expiration: 2023-09-12
Also published as: CN1537864A

Abstract

本发明属于天然药物技术领域。本发明公开了从中药蕨麻中提取有效部位的方法，并且确证了其中主要化学成分蕨麻苷的结构和分离纯化的方法。通过药效学研究，表明本发明的蕨麻苷具有抗肝炎病毒活性、对HbsAg和HbeAg有抑制作用，并有保肝、降酶和利胆作用。

Description

蕨麻有效部位与化合物蕨麻苷及分离与纯化方法

技术领域

本发明属天然药物技术领域。具体涉及蕨麻有效部位与化合物蕨麻苷及分离与纯化方法。

背景技术

中药蕨麻(Potentilla anserina L)属蔷薇科鹅绒委陵菜，以根入药，异名人参果，莲菜花，戳玛(藏名)。该药始载于《西藏常用中草药》，已由《青海省药品标准(1992年版)》、《中药大辞典(下)》和《中国高等植物图鉴》、《中华药海》、《中华天然补品资源大辞典》等书收载。本品主要分布于西部地区河西走廊一带。青海、甘肃、西藏为主要产地。蕨麻属高原高寒地区生长的植物，一般生长环境在海拔2000-3000m以上的草原、山坡地。本品药源丰富，全年可采收，一般集中在夏、秋季，仅甘肃省甘南地区年收购量可达上千吨。此外，甘肃甘南州农科所已经完成了蕨麻人工栽培技术的试验研究，为扩大蕨麻资源创造了重要条件。蕨麻由于富含氨基酸、维生素、糖类及多种活性成分，因此，作为营养滋补品在西北地区民间被广泛应用。次外，当地民间有将蕨麻用于治疗恶性肿瘤的报道。有关蕨麻研究的现状进行了系统的文献资料调研。据最近的文献查新：文献报道胡本祥等对蕨麻进行了生药学鉴定的研究：汪宝琪等对蕨麻微量元素锗含量测定；王晋等对蕨麻中营养成分维生素、氨基酸糖类成份的研究；贾守宁等对蕨麻抗缺氧作用进行了实验研究；林娜等研究了蕨麻对免疫功能低下小鼠影响作用的研究：Mccutcheon-AR..et al.报道了委陵菜属Potentill argut的水提取物可抑制呼吸全胞体病毒的研究结果。关于蕨麻化学成份的研究，杨桦等报道了蕨麻中多糖成分及其含量测定的研究；Morri wolfred，et al和P.Tunmann.Arch对蕨麻的同科属植物化学成分进行了研究并报道了研究结果。查新显示：有关蕨麻抗病毒、抗肝炎药效学方面及与其相应的化学成份的分离与结构方面的研究，国内外尚无报道。自九七年以来，发明人开展了对蕨麻主要化学成份的研究及其抗病毒、抗肝炎药理药效学方面的研究，其中重点开展了对蕨麻不同部位的提取物及其活性部位和主要活性成分在抗肝炎、抗病毒方面的实验研究。实验以鸭乙肝病毒(DHBVDNA)实验动物模型为整体抗乙肝病毒药效学筛选评价模型、以2215细胞方法为体外抗的乙肝病毒试验方法，对蕨麻的水提取物、70％的乙醇提取物等不同提取部位进行了抗病毒、抗肝炎药效学研究。经过系统的试验评价，取得了重要的实验结果与进展。发现蕨麻的乙醇提取物具有显著的体外和体内抗乙肝病毒作用。与此同时，实验研究结果还进一步显示：蕨麻醇提取物抗小鼠急性肝损伤(降ALT)作用显著、结果重现性良好。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于寻找蕨麻有效部位(JMS)，设计分离与纯化化合物蕨麻苷的方法。

本发明提供了一种命名为蕨麻苷化合物

化合物(蕨麻苷)的名称、化学名、化学结构式、分子式与分子量

(1)中文名：蕨麻苷

(2)汉语拼音：Jue Ma Gan

(3)英文名：potentilla anserine

(4)化学结构式：

(5)中文化学名：2α，3β，19β-三羟基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸-28-O-β-D-吡喃半乳糖苷·结晶水

(6)英文化学名：2α，3β，19β-trihydroxy-12-en-urs-28-oicacid-28-O-β-D-galactopyranesyl ester·H₂O

(7)分子式：C₃₆H₅₈O₁₀·H₂O

(8)分子量：650.848+18.015＝668.86

一、供确证化合物化学结构用样品的纯度及检查纯度的方法

(一)供试品的来源

供试品由解放军第302医院药物研究中心(蕨麻课题组)提供。

供试品批号：20010526

(二)供试品的纯度

供试品纯度为98.85％(测定方法为HPLC，见图1)

(三)供试品纯度的检查方法

(1)薄层层析法：见<中国药典2000版>一部附录P37。

(2)高效液相色谱法：见<中国药典2000版>一部附录P38。

二、确证化学结构的方法

(一)物理性状与理化常数

熔点：DSC：231.7℃；

比旋度： (MeOH，C＝0.5625％)

(二)定性鉴别

(1)Lieberman-Burchard呈紫红色阳性反应

(2)Molish反应亦为阳性

(三)元素分析

1.分析方法：C、H两种元素采用Flash EA 1112型元素分析仪测定。

2.测定元素：本品含C、H、O三种元素，测定了其中两种即C和H。

3.测定结果：详见表1。

表1 供试品蕨麻苷的元素分析数据

元素	C(％)	H(％)	备注
元素	C(％)	H(％)	备注	理论值供试品 12	66.43(无水物)64.65(一水物)*64.4964.23	8.98(无水物)9.04(一水物)*9.088.95	按分子式C₃₆H₅₈O₁₀计算*按分子式C₃₆H₅₈O₁₀·H₂O计算

4.讨论与说明

(1)本品含C、H、O三种元素，除O外，测定了C和H两种元素的含量，由表1可见，供试品蕨麻苷的元素分析测定结果显示碳的数值与含一水物的理论值基本一致；氢的数值与含一水物的理论值更为接近。证明此化合物应含有一个结晶。

(2)此结果亦为核磁和热重分析结构信息所证实，可以认为本品的元素分析结果与含一水物的分子式是相符的。

(四)红外吸收光谱(IR)

1.仪器型号：美国尼高力(Nicolef)公司Nexus-470型付立叶变换红外光谱仪。

2.仪器校正

药典2000年版二部附录27而IVc的红外分光度法校正和检定方法，录制聚苯乙烯薄膜(厚度为0.05mm)的光谱结果见表2。

表2 聚苯乙烯薄膜校正结果

实测波数(cm^-1)	标准波数(cm^-1)	误差(cm^-1)
实测波数(cm^-1)	标准波数(cm^-1)	误差(cm^-1)	3026.02923.92849.61870.51802.41601.31583.21181.51154.71069.31028.5906.7697.2	3027.12924.02840.71871.01801.01601.31583.11181.41154.31069.11028.0906.7698.9	-1.1-0.1-1.1-0.51.400.10.10.40.20.50-1.7

由上表可见：在4000-2000cm^-1区间内，误差在±8cm^-1以内，2000-400cm^-1区间内，误差在±4cm^-1以内，符合规定要求。

3.样品制备方法

按照国家药典委员会“药品红外制备光谱集”2000年版说明中的试样制备方法要求，采用KBr压片法录制光谱图。

4.测定结果：详见表3和图2。

表3蕨麻苷供试品的IR图谱数据与解析

5.讨论与说明

(1)表3和附图中各数据表明，供试品的化学结构式中各主要官能团：三种烷基(-CH₃、-CH₂-和 )、三取代烯基(

)、酯羰基( )、两种醇羟基(

和

)以及β-D-吡喃糖等主要的红外吸收峰和相关峰都存在，说明本品化学结构式中的各官能团确实存在且与实际情况相符。

(2)由于分子中有缔合现象存在(即有氢键形成)所以图中相当一部分吸收峰都有缔合加宽现象。

(3)根据文献*(I.L.Allsop，A.R.Cole etc.J.Chem.Soc.4968，(1956)介绍，ν_C-O(-CHOH)的数据大小可以用来区分三萜类化合物的C-3位3-OH的构型。由于C-4位上有偕二甲基的影响，3β-OH的ν_C-O略小于3α-OH的ν_C-O且此β-OH为e键，则在1045-1050cm^-1和1013-1031cm^-1处有两个吸收。本品符合此情况(1050和1031cm^-1)。此结果与本品的氢谱情况完全吻合。有关文献表明：现在多采用NMR来区分C-3位的竖键(a)和横键(e)的取代基。**(L.M.Jackmanetc“Application of NMR in Org.Chem.”2nd Edition.PergammonPress NY(1969)，P288)椅式构象的六元环中的3-OH和2-OH的构型，可以利用³J_HH(H-2和H-3)大小来决定二者是竖键还是横键。通常H-2和H-3，如为³Jaa＝8-13Hz；如为³Jae＝2-6Hz，³Jee＝l-5Hz，三者有明显差异；目前，最有效的办法是利NOESY谱中的相关关系。根据以上几方面信息，此五环三萜类化合物其2位OH应是2α-OH(横键)。而3位OH则是3β-OH(横键)。由氢谱中可见³J_H-2/H-3＝9.5z且NOESY谱的相关情况，也与氢谱、红外信息相吻合。(详见本资料(六))

(4)根据文献***介绍1380(cm^-1)是各种-CH₃的主要特征峰，不同类型的甲基其峰位和峰形、峰强等皆有一定的差异。如为同碳二甲基(偕二甲基则比峰分裂为二分别在1391-1381和1368-1366处出现信号，且后者强度约为前者的4/5)，由此证实分子中有偕二甲基存在。

(5)根据文献***介绍：

①当苷元分子中不含有强的吸收官能团时，该苷的光谱与糖相似，即在3400和1100(cm^-1)附近有强的ν_OH和δ_C-O吸收峰。本品红外符合此情况。(ν_OH为3423cm^-1，δ_C-O1075cm^-1且二者为全谱中最强峰)。

②如糖为六元吡喃糖则在1100-1010(cm^-1)间出现3个强峰(五元呋喃糖出现两个强峰)本品符合此情况，(本品有1074，1050和1032三个强峰。)

③如此吡喃糖为β-D构型则在890cm^-1处有吸收(而α-L构型在840cm^-1附近有吸收)。本品附合此情况(在896cm^-1处有吸收)。另：如为β-构型其H-1为直立键，其δ_C-H在891±7cm^-1处，环振动为774±9cm^-1。本品符合此情况(δ_CH为896cm^-1环振动为773cm^-1)。

④三萜皂苷元中三种类型(齐墩果烷型、乌苏烷型和四环三萜类皂甙)可以利用红外光谱中区域A(1355-1392cm^-1)和区域B(1225-1330cm^-1)的吸收峰的数目和峰位情况加以区别。乌苏烷型在A区中有3个峰，在B区中也有三个峰。本品符合此情况。(其峰位分别是1390，1384，1390和1325，1262，1226cm^-1)

以上情况表明：

(i)本品的苷元为不含有强吸收基团的乌苏烷型五环三萜类化合物。

(ii)本品是六元吡喃糖；

(iii)本品为β-D构型吡喃糖。

(6)表3中各符号含义分别是：

ν^as——不对称(反称)伸缩振动

ν^s——对称伸缩振动

δ^as——不对称弯曲振动(面内弯曲振动)

δ^s——对称弯曲振动(面内弯曲振动)

γ——面外弯曲振动(扭曲振动)

vs——非常强吸收

s——强吸收

m——中等吸收

w——弱吸收

br——宽吸收

(五)紫外吸收光谱(UV)

1.仪器型号：HP8452A(美国HP公司)

2.仪器校正和检定

按中国药典2000版二部附录26页IV_A的规定检查吸收度的精确性和杂散光，结果符合药典要求。

3.样品溶液制备

中性溶液：取本品以CH₃OH为溶剂，配成适宜浓度的溶液(0.2mg/ml甲醇制)。

酸性溶液：取本品以0.1mol/L盐酸溶液甲醇为溶剂，配成适宜浓度的供试品溶液(0.2mg/ml甲醇制)。

碱性溶液：取本品以0.1mol/L氢氧化钠甲醇为溶剂，配成适宜浓度的供试品溶液。

4.测定结果

按中国药典2000版二部附录IV_A要求，用分光光度法，在200-400nm的波长范围内扫描，由比尔定律(A＝εCL)计算出摩尔吸收系数ε，结果见表4和图3、图4和图5。

表4蕨麻苷供试品的紫外图谱数据与解析

5.讨论与说明

本品为含孤立双键的五环三萜类皂苷元，故仅在205-220nm处有一中等强度的紫外吸收，与本品的实际情况相符。

(六)核磁共振一维和二维氢谱(¹H-NMR，D₂O交换，¹H-¹HCOSY、DSNOE、NOESY和一维及二维TOCSY)

1.仪器型号

德国布鲁克(Bruker)公司Avance 500型超导核磁共振仪，美国瓦里安(Varian)公司Inova 600型超导核磁共振仪。

2.测定条件

溶剂为DMSD-d₆，其它条件见附件图谱上的说明。

3.活泼氢取代测试

DMSO-d₆+D₂O

4.测定结果

详见表5及图6。

表5 蕨麻苷供试品的一维和二维氢谱数据与解析

表5(续)

表5(续)

表5(续)

表5(续)

表5(续)

5.讨论与说明

(1)由分子式可知(C₃₆H₅₈O₁₀·H₂O)：本品共含有60个质子，其中有7个CH₃，9个-CH₂和7个-OH，其余皆为CH和＝CH(共12个)，以及一个水分子。氢谱积分结果共有7个-CH₃、7个OH和32个单一质子峰，累计共60个质子，重水交换后，7个OH和一个H₂O信号皆消失或减弱，表明分子中有9个活泼质子。其积分数值为51个质子。表明分子式与实际情况相符。

(2)供试品图谱中5.19-5.15ppm处积分数为5个质子，其中有一个12-烯氢和一个糖环端基C-1’处上的质子(H-1’)表明其余3个为糖环上三个-OH质子(2’，3’，6’-OH)。

(3)供试品图谱中5.16ppm处质子数为1的三重峰(J＝3.6Hz)为C环上的烯氢质子信号。¹H-¹H COSY谱表明其分别与H-11ab和H-18有相关；NOESY谱证明其分别与H-11、H-18、H-29和19-OH有空间相关。

(4)供试品图谱中5.15ppm处质子数为1的双峰为糖环上端氢1位质子。¹H-¹H COSY谱表明其H-2’有偶合(J＝8Hz)表明J_H-1/H-2为aa键偶合。NOESY谱证明其分别与H-3’，5’和4’及2’-OH有空间相关结合分子模型并根据区分糖环上α或β键的规定此质子应为α(a)键即H-1’α，故此糖甙应为O-β-D型。

(5)供试品图谱中4.40ppm处质子数为2的单宽峰D₂O交换后峰消失，表明此2质子应为分子中1个结晶水的信号。¹H-¹H COSY谱显示无相关质子。

(6)供试品图谱中3.78ppm处质子数为1的单峰的E环上19-OH信号。¹H-¹H COSY谱显示其与同一环上H-18有相关；NOESY谱证明其与C环上H-12烯氢质子，D环上16a质子，E环上H-21a、H-22a、H-29和H-30各质子有空间相关。结合分子模型可以肯定此19-OH应为β构型，即应为19β-OH。换言之，同C上的29位甲基则应为α-型，即为29α-CH₃。

(7)供试品图谱中3.58ppm处质子数为1，J＝11.2Hz的双峰为糖环侧链上6’位伯醇基的6’a质子信号；¹H-¹H COSY谱显示其与H-6’a和H-5’有相关；NOESY谱证明其与糖环(F环)上的H-2’，4’，5’，6’b和4’-OH，6’-OH有空间相关。

(8)供试品图谱中3.43ppm处质子数为1，J＝10.8Hz的双峰为糖环侧链上伯醇基的6’b的质子信号，由于5’位手性C原子的影响，显然此亚甲基6’-CH₂上的两个质子为前手性而不等价。NOESY谱证明其一F环上H-4’，5’，6’a和6’-OH有空间相关。

(9)供试品图谱中3.40ppm处质子数为1，J＝10.5和4.2Hz的多重峰为A环上2位质子信号。¹H-¹H COSY谱显示其分别与同一环上H-1a，1b和H-3有相关；NOESY谱证明其分别与同一环上两个直立的甲基H-24和H-25以及直立的3-OH和同碳上的2’-OH有空间相关。结合分子模型，可以判断此质子应为直立键，即其构型应为2β-H。换言之，其同C上的2-OH应为α构型即应为2α-OH(平伏)。

(10)供试品图谱中3.31ppm处质子数为1的单宽峰应为糖环(F环)上4’位OH信号，¹H-¹H COSY谱显示其无相关质子；NOESY谱则证明其与同一糖环上H-2’，4’，H-6’a，6’b和3’-OH有空间相关。结合分子模型和本节的第(3)条中有关说明，此4’-OH应为直立的β键，即4’β-OH。而与其同C上的H-4’则应为平伏的α键，即为4’α-H。

(11)供试品图谱中3.17ppm处质子数为1，J＝4.8和8.4Hz的多重峰，为F糖环上的H-3’信号；¹H-¹H COSY谱显示其与同一环上H-2’和H-4’两个质子有相关；NOESY谱证明其与同一环上H-1’，H-4’和H-5’和2’-OH有空间相关。结合分子模型和本节(3)条中有关说明，H-3’应为直立向下的α键，即3’α-H，同C上的3’-OH则为3’β-OH(平伏)。

(12)供试品图谱中3.11ppm处质子数为1，J＝4.8和9.6Hz的多重峰为F环上H-5’质子信号；¹H-¹H COSY谱显示其与同一环上H-4’和H-6’ab质子相关；NOESY谱则证明其与同一环上H-1’，3’，H-6’a，H6’b和6’-OH有空间相关。结合分子模型和本节第(3)和第(9)条中的有关说明：H-5’应为直立的α键即为5’α-H。

(13)供试品图谱中3.08ppm处质子数为1，J＝4.8和8.4Hz的双双峰。为糖环上H-4’质子信号；¹H-¹H COSY谱显示其与同一环上H-3’和H-5’b相关；NOESY谱证明其与同一环上H-1’，3’和5’H有空间相关。结合分子模型和本节第(3)条中的有关说明：H-4’应为平伏的α键，即为4’α-H。

(14)供试品图谱中3.06ppm处质子数为1，J＝8.4和4.8Hz的双双峰为F环上H-2’质子信号；¹H-¹H COSY谱显示其与同一环上H-1’和H-3’有相关；NOESY谱则证明其与同一环上的3’-OH，4’-OH和H-6’ab有空间相关。结合分子模型和本节第(3)条中的有关说明：H-2’应为直立的β键，即为2’β-H。与其同C的2’-OH则应为平伏的α键，即为2’α-OH。

(15)供试品图谱中2.72ppm处质子数为1，J＝9.6Hz的双峰，为A环上的3位质子；¹H-¹H COSY谱显示其与同一环上的H-2有相关；NOESY谱证明其与同环上H-1a，5，23和2-OH有空间相关。结合分子模型，确认与此质子有空间相关的H-1a，5为直立向下的α键，H-23和2-OH亦为α键，故此H-3质子亦应为直立向下的α键，故与其同C上的3-OH应为平伏的β键，即应为3β-OH。

(16)供试品图谱中2.52ppm处质子数为1，J＝9.6和3.6Hz的多重峰为D环上16a质子信号，由于16-CH₂-为固定环的亚甲基故其两个质子为不等价并且受相邻酯羰基的各向异性效应影响二者的Δδ_H值较大(0.94ppm)。¹H-¹H COSY谱显示此质子分别与同一环上H-15a、15b和16b有偶合相关；NOESY谱则证明同环的H-15a、16b质子，E环的22a，b和C-8的26位甲基质子均与其有空间相关。

(17)供试品图谱中2.36ppm处质子数为1的单峰为连接D环和E环的18位质子信号。¹H-¹H COSY谱显示其D环上的H-16b和E环上的22b，以及C环上的12位烯氢质子及19-OH有偶合相关；NOESY谱则证明C环的H-12，D环上H-15b、H-27，E环上的H-20、H-22a和H-29等质子与其有空间相关；结合分子模型确认其中H-15a、H-20、H-22a和H-27和H-29等皆为直立向下的α键，故此质子(H-18)则也应该为直立向下的α键即应为18α-H。

(18)供试品图谱中1.88ppm处质子数为2，J＝9.6Hz的宽峰为C环上H-11亚甲基的两个质子。受相邻的9位手性C的影响，此亚甲基应有一定的前手性，两个质子的δ值应有一定的关异，故其信号在分辨较好时或进行必要的扩展应能观察到其裂分情况，此处是一宽峰并稍有裂分，也可看出两个质子间的差异。1600MHz图谱上也测出其J＝9Hz。¹H-¹H COSY谱显示其与同核上的H-9和H-11a，b间有偶合相关；NOESY谱证明A环的H-1a，b，B环上的H-25、26同环上的H-9和H-12皆与其有空间相关。其中H-1a和H-9结合分子模型知其为直立向下的α键，H-25、26为直立向上的β键，显然此亚甲基上的两个质子(H-11a和H-11b)二者不是完全等价和具有完全相同的构型。

(19)供试品图谱中1.78ppm处质子数为1，J＝10.6和4.2Hz的宽的双双峰为A环上直立向下的H-1a质子，由于受H-2手性的影响。加之A环为固定的刚性环故1位亚甲基上的两个前手性质子具有较大的δ值差异(Δδ值＝1.03ppm)。¹H-¹H COSY谱显示其与同环上H-1b和H-2有偶合相关；NOESY谱则证明同环上的H-1b、H-3，5、H-23和C环上的H-9和H-11a皆与其有空间相关。结合分子模型H-3、H-5、H-9和H-23皆为直立向下的α键，故此质子显然也应该是直立向下的α键即应为H-1α。

(20)供试品图谱中1.75ppm处质子数为1的J＝13.2和4.8Hz的多重峰为D环上的H-15a质子信号。¹H-¹H COSY谱显示其与同环上的H-15b、H-16a，b和C环上的H-26有偶合相关；NOESY谱证明H-7a、H-11、H-15b、16b和C环上的H-26有偶合相关，NOESY谱证明H-7a、H-11、H-5b、16b和H-26、27有空间相关。

(21)供试品图谱中1.65ppm处质子数为1的J＝12.0Hz的宽的多重峰为E环上H-22a质子信号；¹H-¹H COSY谱显示其同环上的H-21a和H-22b与其有偶合相关；NOESY谱则证明D环上的H-16a，b、H-18和H-27，同环上H-20，21b，22b皆与其有空间相关。由于E环为固定的刚性环，加之受相邻的酯羰基C＝O双键的各向异性效应影响，此亚甲基上的两个质子H-22a和H-22b也有较大的Δδ_H值(0.16ppm)，显然H-22a为直立氢H-22b为平展氢。

(22)供试品图谱中1.62ppm处质子数为1的J值为9.6和10.0Hz的多重峰，为E环上H-21a质子信号。受相邻的20位手性C的影响，此亚甲基也具有前手性，加之是在固定环上，故其两个质子H-21a和H-21b有较大的Δδ_H值(0.48ppm)。¹H-¹H COSY谱显示其与同环上的H-20、H-21b和H-22a有偶合相关；NOESY谱证明D环上的H-16a，b和E环上的H-21b、H-22b、H-30和19-OH皆有空间相关，结合分子模型，H-30和19-OH皆为β键故此质子也应为直立的β键即为21β-H。显然H-21b应为21α-H。

(23)供试品图谱中1.60ppm处质子数为1的J＝9.6Hz的三重峰应为C环上H-9信号。¹H-¹H COSY谱显示其与同环相邻的H-11a，b两个质子有偶合相关；NOESY谱证明，A环的H-1a、H-5；B环的H-7a，同环上的H-11b和H27皆与其空间相关。结合分子模型确认H-1a、H-5、H-7a、H-27皆为直立向下的α键，显然H-9也应为直立向下的α键即应为H-9α。

(24)供试品图谱中1.58ppm处质子数为1的J＝3.6和12.0Hz的多重峰应为D环上H-16b质子的信号。在本节(15)中已经指出：由于在固定环上并受相邻的酯羰基C＝O的各和异性效应的影响此亚甲基上的两个质子H-16a和H-16b为不等价，其Δδ_H值较大(0.94ppm)。¹H-¹H COSY谱显示其与同环上H-15a，b、H-16a和H-18有偶合相关；NOESY谱则证明H-15a，b、H-16a和H-21a与其有空间相关。

(25)供试品图谱中1.49ppm处质子数为1的J＝6.6和12.6Hz的多重峰为E环上H-22b质子信号。本节(21)中已经指出由于E环是固定环加之受相邻的酯羰基C＝O的各向异性效应影响，22位亚甲基上的两个质子是不等价的且Δδ_H值有一定的差异(0.16ppm)。¹H-¹HCOSY谱显示其与同一环上H-18、H-21a和H-22a有偶合相关。NOESY谱则证明H-16a，21ab和22a与其有空间相关。

(26)供试品图谱中1.47ppm处质子数为1的J＝6.6和8.4Hz的多重峰为B环上H-7a的信号。由于B环也是固定环故此亚甲基的两个质子H-7a和H-7b也为不等价。其Δδ_H值＝0.32ppm。¹H-¹H COSY谱显示与同一环上的H-5，6ab和H-7有偶合相关；NOESY谱证明同环上的H-5、H-6b、H-9和C环上的H-27皆与其有空间相关，结合分子模型H-5、H-9和H-27皆为直立向下的α键，故此H-7a也应为向下直立的α键，即H-7α显然H-7b应为H-7β。

(27)供试品图谱中1.43ppm处质子数为1的J＝6.5和5.5Hz的多重峰应为B环上H-6a质子信号。由于6位亚甲基是在固定的B环上加之相邻的C-5为手性C，故此亚甲基也是前手性，两个质子H-6a和H-6b为不等价，其Δδ_H＝0.13ppm。¹H-¹H COSY谱显示其与同一环上H-5和H-6b及H-7a，b有偶合相关；NOESY谱证明A环上的H-24，25和同一环上的H-6b，7b和H-26有空间相关。结合分子模型H-24，25和26皆为直立向上的β键，故此H-6a也应为直立向上的β键，即H-6β。显然H-6b则应为平伏的H-6α。

(28)供试品图谱中1.30ppm处质子数为1的多重峰为B环上H-6b质子的信号。前节已指出6位亚甲基上的H-6a和H-6b为不等价质子，其Δδ_H＝0.13ppm。¹H-¹H COSY谱显示其与同环上的H-5和H-6a以及H-7a，b有偶合相关；NOESY谱则证明除以上几个质子外，还与A环上的H-23有空间相关。正如前节所指出此质子应为平伏的H-6α。

(29)供试品图谱中1.27ppm处质子数为3的单峰是C和D环结合处与C-14相连的H-27甲基信号。¹H-¹H COSY谱显示其与D环上的15亚甲基上的两个质子H-15a，b有偶合相关；NOESY谱证明B环上的H-7a和H-9质子，D环上H-15b、H-16a，b和H-18质子，E环上的H-22a质子和糖环上的一个OH质子皆与其有空间相关。结合分子模型确认H-7a、H-9、H-18和H-22a皆为直立向下的α键，故此甲基也应为直立向下的α键，即为27α-CH₃。

(30)供试品图谱中1.21ppm处质子数为1的J＝9.0和9.6Hz的多重峰为E环上H-20质子的信号；¹H-¹H COSY谱显示其与同环上H-21a，b和H-30有偶合相关；NOESY谱证明同环上H-18、H-21b、H-22a和H-30有空间相关。结合分子模型和有关数据可确认H-18、H-22a和H-29、H-30皆为直立向下的或平伏的α键，故此质子显然也应为α键即为H-20α，显然与其同一C上的H-30甲基应为β键，即30β-CH₃。

(31)供试品图谱中1.15ppm处质子数为1的J＝6.5Hz的多重峰应为B环上H-7b质子信号。如本节中(27)条所述，由于此亚甲基是在固定的B环上，故H-7a和H-7b为两个不等价的质子(Δδ_H＝0.32ppm)。¹H-¹H COSY谱显示其与同环上H-6a，b和H-7a有同核相关；NOESY谱证实与同环上H-6a，b、H-7和H-26以及D环上H-15b和H-27有空间相关，前已指出此质子为β键，即7β-H。

(32)供试品图谱中1.14ppm处质子数为1的J＝6.0和10.2Hz的多重峰为E环上H-21b质子信号。如在本节(23)条中所述，由于20’位手性C和固定环的影响，此亚甲基上的两个质子(H-21a和H-21b)有较大的Δδ_H值(0.48ppm)。¹H-¹H COSY谱显示其与同环上的H-20、H-21a和H-22ab有偶合相关；NOESY谱证明同环上除上述几个质子外，还与H-30有空间相关。前已指出此质子为α键即H-21α。

(33)供试品图谱中1.08ppm处质子数为3的单峰是E环中29位-CH₃信号。¹H-¹H COSY谱显示其无相关质子；NOESY谱证明：C环上12位烯氢质子；D环上18位质子；E环上H-20、H-30和19-OH皆与其有空间相关；结合分子模型和前面的各有关数据可确认H-18、H-20皆为向下直立的α键，而同一C上的19-OH已证明其为直立向上的β键，故此甲基应该是α键即为29α-CH₃。

(34)供试品图谱中0.98ppm处质子数为1的单宽峰，为A环上2-OH质子信号。¹H-¹H COSY谱显示其无相关质子；NOESY谱证实其同一环上H-1b、H-2、H-3和3-OH有空间相关。结合分子模型和前面有关数据，已确认H-3为直立向下的α键，而H-2为与其同一C上并已确认其为直立向上的β键，故此2-OH应为平伏的α键，即应为2α-OH。

(35)供试品图谱中0.91ppm处质子数为3的单峰，应为A环上23位甲基质子信号。¹H-¹H COSY谱显示其无相关质子；NOESY谱则证明同一环上H-3、H-24、3-OH和B环上的H-5和H-6b与其有空间相关结合分子模型和前面有关数据已得确认H-3和H-5为直立向下的α键、H-6b也为α键(平伏)，故H-23甲基也应为α键，即为23α-CH₃。

(36)供试品图谱中0.89ppm处质子数为3的单峰为A环上H-24甲基信号。¹H-¹H COSY谱显示其无相关质子；NOESY谱证明：A环上的H-2、H-23，25、3-OH B环上的H-6a，b和H-26均与其有空间相关。结合分子模型和前述有关数据，已确认H-2、H-6a、H-25、H-26均为直立向上的β键，3-OH为平伏的β键，H-23为与其同C的平伏的α键，故此甲基也一定是直立向上的β键，即24β-CH₃。

(37)供试品图谱中0.84ppm处质子数为3的J＝9.0Hz的双峰应为E环上与20α-H在同一C上的30-CH₃的信号。¹H-¹H COSY谱显示其与H-20有偶合相关；NOESY谱证明：同环上的H-20、21a，b，29和19-OH均与其有空间相关。结合分子模型和前述的各有关数据已确认H-21a、19-OH为直立向上的β键，而H-29和H-21b则为与其空间相当接近的α键，H-20则已肯定为与其同C的直立向下的α键，故此认为该甲基肯定是平伏的β键，即应为30β-CH₃。

(38)供试品图谱中0.78ppm处质子数为1的单宽峰为A环上的3-OH信号。¹H-¹H COSY谱显示其无相关偶合质子，但NOESY谱证明，同环上的H-2、H-23，24，25和B环上的H-26皆与其有空间相关。结合分子模型确定其中H-2、H-24、H-25和H-26皆为直立向上的β键，加之与其在同一C上的H-3已确定其为直立的α键，故此3-OH应为平伏的β键，即为3β-OH(e)。

(39)供试品图谱中0.75ppm处质子数为1的J＝12.0和5.4Hz的多重峰应是A环上H-1b质子的信号。正如本节(18)条中指出的那样：由于受相邻的2位手性C的影响，1位亚甲基为前手性，加之A环为固定环，故H-1a和H-1b的不等价有相当大的差异，再加上相邻的25-CH₃和24-CH₃的位阻影响，使二者的Δδ_H值高达1.03ppm。¹H-¹HCOSY谱显示该质子与同一环上的H-1a，H-2和H-25有偶合相关；NOESY谱证明：同一环上H-1a、H-25、2-OH和C环上的H-9和H-11b均与其有空间相关。结合分子模型和前面的各有关数据已经认定H-9、H-11b和2-OH均为直立的或平伏的α键。H-2、H-25尽管为直立向上的β键，但其空间位置则与该质子相当接近，H-1a则为已确定了与其在同一C上的直立向下的α键质子，故此质子应该是平伏的β键，即为1β-H。

(40)供试品图谱中0.73ppm处质子数为1的J＝5.4和6.6Hz的多重峰，应为A和B两环连接处的H-5质子信号。¹H-¹H COSY谱显示其分别与A环上的H-23和B环上的H-6a，b有偶合相关；NOESY谱则证明：A环上的H-1a、H-3和H-23，B环上的H-6b、H-7a、H-9均与其有空间关系。结合分子模型和前述各相关数据，以上各质子均已确认为或直立向下(H-1a、H-3a、H-7a和H-9)或平伏的(H-23和H-6b)α键，故此质子只能是直立向下的α键，即就为5α-H。

(41)供试品图谱中0.70ppm处质子数为3的单峰为与A、B连接处C-10相连的25-CH₃信号。¹H-¹H COSY谱显示其与A环上的H-1b有偶合相关。NOESY谱证明：A环上的H-1b、H-2、H-24和3-OH，B环上的H-6a、H-2b和C环上的H-11a均与其有空间相关。结合分子模型和前述的各有关数据已确认H-2、H-6a、H-11a、H-24和H-26均为直立向上的β键，H-1b和3-OH为平伏的β键，故此甲基也一定是直立向上的β键，即为25β-CH₃。

(42)供试品图谱中0.66ppm处质子数为3的单峰为B环上与8位C相连的26-CH₃。¹H-¹H COSY谱显示无相关氢；NOESY谱证明同一环上的H-6a，7b，A环上的H-24，25，C环上的H-11，12，D环上的H-15a，b均与其有空间相关。结合分子模型和前面各有关数据已确认上述各空间相关质子中，H-24，25、H-6a，11a，15a待皆为直立向上的β键，H-7b、H-12和H-15b是与其空间相近的非直立的β键或α键。故此可以肯定该甲基应是直立向上的β键，即应为26β-CH₃。

(43)本品的二维TOCSY谱的结果确认了A，B，C，D，E和F六种环中处在同一个大的自旋体系中各个质子间的相关性。即：A环中的H-1a，H-1b，H-2，H-3，H-23，H-24，H-5等；B环中的H-5，H-6a，b，H-7a，b，H-9，H-25，H-26等；C环中的H-9，H-11a，b，H-12，H-27等，D环中的H-15a，b，H-16a，b和H-18等；E环中的H-18，H-19(OH)，H-29，H-30，H-20，H-21a，b，H-22a，b等，此结果与一维氢谱和¹H-¹HCOSY谱的结果相吻合。

(44)本品的一维TOCSY的结果证实了糖环(β环)的归属是正确的，它们(H-1’，2’，3’，4’，5’，6’a，b)都在同一个大的自旋体系内。

(45)本品的一维NOE结果也与2D NOESY结果相符。

结论：综上所述，本品的分子结构应为：

因此化合物首次是由中药蕨麻中提取、分离、纯化而得到的一个新的化合物，故命名其为蕨麻苷，其中文化学名，可定为：2α，3β，19β-三羟基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸-28-O-β-D-吡喃半乳糖甙；或可命名为：2α，3β，19β-三羟基-12-熊果-28-酸-28-O-β-D-吡喃半乳糖甙。

此结果也得到了：(1)本资料中其它有关谱(如碳谱、质谱等)的相关信息(详见本资料中各部分的有关内容)；(2)本资料中的综合分析(详见后述)；(3)文献*中已知类似结构化合物的有关数据等强烈支持。

因此本结构鉴定应与实际相符。

*附：有关文献资料中的相关数据。

①文献I：Acta Pharmacentica Sinica 1996，31(11)：844-848

(i)化合物A的氢谱数据。(2α，3β，19β-三羟基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，C₃₆H₅₈O₁₀)：

¹H-NMR(500MHz，CD₃COCD₃，δppm)：5.36(1H，d，J＝8.1Hz，糖上的端基H，H-1’)，5.28(1H，brs，H-12)，3.75-3.22(6H，m，糖上的H)，3.62(1H，m，H-2)，2.90(1H，d，J＝9.5Hz，H-3)，2.52(1H，s，H-18)，1.31，1.17，0.98，0.97，0.78，0.76(各3H，s，6×CH₃)，0.91(3H，d，J＝6.5Hz，30-CH₃)。

(ii)化合物B的氢谱数据(2α，3α，19β-三羟基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，C₃₆H₅₈O₁₀)：

¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆，δppm)：5.17(1H，brs，H-12)，5.14(1H，d，J＝8.1Hz，糖的端基氢，H-1’)，3.42(1H，m，H-2)，3.9-3.05(m，糖上的H，H-2’，3’，4，5’和6’)，3.13(1H，brs，H-3)，2.35(1H，s，H-18)，1.28，1.07，0.87，0.76，0.64(各3H，s，6×CH₃)，0.83(3H，d，J＝6.5Hz，30-CH₃)。

(iii)化合物C的氢谱数据(2α，3β，19β-三羟基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸，C₃₀H₄₈O₅)：

¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆，δppm)：5.16(1H，s，H-12)，3.40(1H，m，H-2)，2.73(1H，d，J＝9.3Hz，H-3)，2.35(1H，s，H-18)，1.28，1.11，0.91，0.70，0.69(各3H，s，6×CH₃)，0.83(3H，d，J＝4.5Hz，30-CH₃)。

②文献II：中国中药杂志，1998年第23卷第1期P37-38：

(iv)化合物D的氢谱数据(2α，3α，19α-三羟基-12-乌苏烷-28-羧，C₃₀H₄₈O₅)：

¹H-NMR(400MHz，C₅D₅N，δppm)：5.57(1H，brs，H-12)，4.29(1H，brs，J＝11Hz，2β-H)，3.75(1H，brs，3β-H)，3.02(1H，brs，H-18)，1.45，1.28，1.10(各3H，s，3×Me)，1.10(3H，d，J＝7.5Hz，Me)，0.96，0.88，0.80(各3H，s，3×Me)。

③文献III：植物学报，1988，30(4)：409-413：

(v)化合物E的氢谱数据(2α，3α，19α-三羟基熊果-12-烯-28-羧酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖甙，C₃₆H₅₈O₁₀·2H₂O)：

¹H-NMR(100MHz， δppm)：5.55(1H，d，J＝8Hz，C₁’-H)，5.40(1H，m，C₁₂-H)，4.60-3.24(m，糖环上-OH)，4.28(1H，m，C₂-H)，3.77(1H，d，J＝3Hz，C₃-H)，3.06(1H，s，C₁₉-H)，2.74(1H，s，C₁₈-H)，1.67(3H，s，C₁₉-CH₃)，1.46(3H，s，C₂₉-CH₃)，1.44(3H，s，C₂₇-CH₃)，1.29(3H，s，C₂₅-CH₃)，1.15(3H，d，J＝7Hz，C₃₀-CH₃)，1.13(3H，s，C₂₄-CH₃)，1.01(3H，s，C₂₃-CH₃)，0.93(3H，s，C₂₆-CH₃)。

(vi)化合物F的氢谱数据(2α，3β，19α-三羟基-熊果-12-烯-28-羧酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖甙，

¹H-NMR(100MHz，C₅D₅N，δppm)：5.52(1H，d，J＝8Hz，C₁’-H)，5.50(1H，m，C₁₂-H)，3.90-3.24(m，糖环上-OH)，4.76(1H，d，J＝10Hz，C₂-H)，4.27，4.02(2H，m，C₆-H)，3.80(1H，m，C₅-H)，2.89(1H，s，C₁₈-H)，1.62(3H，s，C₂₉-CH₃)，1.42(3H，s，C₂₇-CH₃)，1.22(3H，s，C₂₅-CH₃)，1.10(3H，d，J＝7Hz，C₃₀-CH₃)，1.06(6H，s，C₂₃，C₂₄-2×CH₃)，1.01(3H，s，C₂₆-CH₃)。

④文献IV：药学学报，18(4)：314-316，1983：

(vii)化合物G的氢谱数据(2α，3α，19α-三羟基-熊果酸-(28-1)-β-D-葡萄糖酯，C₃₆H₅₈O₁₀)：

¹H-NMR(JEDL FX-60Q，CDCl₃，δppm)：5.32(1H，m，C₁₂-H)，5.12(1H，t，J＝10和4.5Hz，C₂-H)，2.90(1H，d，J＝9.6Hz，C₃-H)，2.51(1H，s，C₁₈-H)，1.33(3H，s)，1.20(3H，s)，1.00(6H，s)，0.87(3H，s)，0.80(3H，s)，0.77(3H，s)。

(七)核磁共振一维和二维碳谱(¹³C-NMR：PBB、DEPT、HMQC和HMBC)

1.仪器型号

德国布鲁克(Bruker)公司Avance 125MHz超导核磁共振仪；美国瓦里安(Varian)公司Inova 150MHz超导核磁共振仪。

2.测定条件

溶剂为DMSO-D₆，其它条件见附件图谱上的说明。

3.测定结果

详见表6。

表6 蕨麻苷供试品核磁一维和二维碳谱数据与解析

表6(续)

表6(续)

4.讨论与说明

(1)由供试品分子式C₃₆H₅₈O₁₀·H₂O可知本品共含有36个C原子，碳谱全去偶谱(PBB)中有36条谱线，说明36个C全部为不等价，与实际情况相符。

(2)由供试品结构式可知，本品共有7个伯C、9个仲C、11个叔C(内有1个烯叔C)和9个季C(内有一个酯羰基)。DEPT谱的结果与实际情况相符。

(3)供试品图谱中175.53ppm峰为28位酯羰基C原子的信号。DEPT谱证实其为季C；HMQC谱未发现任何与此C有直接相关的质子；HMBC谱证明糖环上的端基质子H-1’，E环上的H-18、H-22a，b、H-16a，b等质子与其有远程异核相关，结果与实际相符。

(4)供试品图谱中138.18ppm峰为C环中C-13烯C信号。DEPT谱证实其为季C；HMQC谱中未发现任何与其直接相关连的质子；HMBC谱证明C环上的H-11、12、26和27和D环上的H-18与其有远程异核相关。

(5)供试品图谱中126.94ppm峰为C环中C-12的烯C信号。DEPT谱证实其为叔烯C；HMQC谱发现其与氢谱中5.16ppm(H-12)信号相关；HMBC谱证明C环上的H-11和D环上H-18两个质子与其有远程异核相关。

(6)供试品图谱中94.05ppm峰为糖环上端基C(C-1’)信号；DEPT谱证实其为叔C；HMQC谱发现其与氢谱中5.15ppm(H-1’)信号相关；HMBC谱证明糖环上的H-2’质子与其有远程异核相关。

(7)供试品图谱中82.31ppm峰为A环上C-3信号。DEPT谱证实其为叔C；HMQC谱发现其与氢谱中2.72ppm(H-3)信号相关，HMBC谱证明A环(同环)中H-2、3-OH、H-5、H-23和H-24均与其有异核远程相关。

(8)供试品图谱中77.58ppm峰为糖环上C-5’信号。DEPT谱证实其为叔C；HMQC谱发现其与氢谱中3.11ppm(H-5’)信号相关；HMBC谱证明其与糖环上H-4’，6’a，6’b和H-1’有异核远程相关。

(9)供试品图谱中76.70ppm峰为糖环上C-3’信号。DEPT谱证实其为叔C；HMQC谱发现其与氢谱中3.17ppm(H-3’)信号相关；HMBC谱证明其与糖环上H-5’，H-4’和H-2’各质子有异核远程相关。

(10)供试品图谱中72.24ppm峰为糖环上C-2’信号。DEPT谱证实其为叔C；HMQC谱证实其与氢谱中3.06ppm(H-2’)信号相关；HMBC谱显示其与糖环上H-1’和H-3’两个质子有异核远程相关。

(11)供试品图谱中71.65ppm峰为E环上C-19信号。DEPT谱证实其为季C；HMQC谱未发现与其直接相关的质子；HMBC谱证实其与同环上H-18、H-29和H-30以及19-OH各质子间有异核远程相关。

(12)供试品图谱中69.51ppm峰为糖环上C-4’信号。DEPT谱证实其为叔C；HMQC谱发现其与氢谱中3.08ppm(H-4’)信号相关；HMBC谱证明其与糖环上H-3’和H-5’质子有异核远程相关。

(13)供试品图谱中67.13ppm峰为A环上C-2信号。DEPT谱证认其为叔C。HMQC谱显示其与氢谱中3.40ppm的多重峰(H-2)相关。HMBC谱证实同一环上H-1b、H-3、H-5、H-23和3-OH等各质子与其有异核远程相关。

(14)供试品图谱中60.64ppm峰为糖环侧链上C-6’信号。DEPT谱证实其为仲C。HMQC谱发现证实此信号与氢谱中3.58和3.43ppm两组信号(H-6’a和H-6’b)相关。HMBC谱证明糖环上的H-5’和H-4’和其有远程异核相关。

(15)供试品图谱中54.82ppm峰为A环和B环相连处的C-5信号。DEPT谱证实其为叔C。HMQC谱显示其与氢谱中0.73ppm信号(H-5)相关。HMBC谱证明A环上的H-23、24，B环上的H-6b和H-7a诸质子与其有异核远程相关。

(16)供试品图谱中53.15ppm峰为D环和E环连接处的C-18信号。DEPT谱证实其为叔C。HMQC谱显示其与氢谱中2.36ppm(H-18)信号相关。HMBC谱证实C环上的H-12、E环上的H-20、H-21a，b、H-22a和H-29等质子皆与其有异核远程相关。

(17)供试品图谱中47.33ppm峰为D环和E环的另一相连处C-17信号。DEPT谱证实其为季C。HMQC谱表明其无相关质子。HMBC谱证明D环上的H-16a，b、H-18和E环上H-21a和22ab诸质子分别与其有异核远程相关。

(18)供试品图谱中47.09ppm峰为A环上C-1信号。DEPT谱证实其为仲C。HMQC谱表明其分别与氢谱中1.78ppm(H-1a)和0.75ppm(H-1b)两组信号相关。HMBC谱证明A环上的H-2、H-3、H-5和B环上H-9、H-25等质子与其有异核远程相关。

(19)供试品图谱中46.71ppm峰为B环和C环交接处C-9信号。DEPT谱证实其为叔C。HMQC谱表明其与氢谱中1.60ppm(H-9)信号相关。HMBC谱证明A环上的H-1、H-5 B环上的H-7a、H-25，26 C环上的H-11各质子皆与其有远程异核相关。

(20)供试品图谱中41.18ppm峰为E环上C-20信号。DEPT谱证实其为叔C。HMQC谱发现表明其与氢谱上1.21ppm(H-20)信号相关；HMBC谱证明同一环上H-18、21、29、30和19-OH皆与其有远程异核相关。

(21)供试品图谱中41.10ppm峰为C环和D环连接处C-14信号。DEPT谱证实其为季C。HMQC谱表明其无直接相关质子。HMBC谱证明C环上的H-9、H-12和H-26，D环上的H-15a，b、16a，b和H-27诸质子皆与其有远程异核相关。

(22)供试品图谱中40.00ppm峰为(此峰与溶剂峰稍有重叠)为A环上C-4信号。DEPT谱显示其为季C。HMQC谱表明其无直接相关的质子。HMBC谱证明同环上的H-3、H-23，24，25和B环上的H-9、H-5等质子均与其有远程异核相关。

(23)供试品图谱中38.88ppm峰为A环和B环相连处C-10信号。DEPT谱证实其为季C；HMQC谱表明其无直接相关质子；HMBC谱证明A环上的H-1a，b、H-23，24，B环上的H-5，H-9和H-25诸质子均与其有异核远程相关。

(24)供试品图谱中37.53ppm峰为连接B环和C环的C-8信号。DEPT谱证实其为季C；HMQC谱显示其无直接相关的质子；HMBC谱证明A环上的H-1、5，B环上的H-6、7、9、26，C环上的H-15和27诸质子皆与其有异核远程相关。

(25)供试品图谱中36.55ppm峰为E环上C-22信号。DEPT谱显示其为仲C；HMQC谱表明此信号分别与氢谱中1.65ppm(H-22a)和1.49ppm(H-22b)两组质子信号有直接相关；HMBC谱证明D环上的H-15ab、H-16ab和E环上的H-20、21和30诸质子皆与其有远程异核偶合相关。

(26)供试品图谱中32.50ppm峰为B环上C-7信号。DEPT谱表明其为仲C。HMQC谱显示其与氢谱中1.47ppm(H-7a)和1.15ppm(H-7b)两组质子信号有直接相关。HMBC谱证明同一环上的H-5、H-6、H-9和H-26质子均与其有远程异核相关。

(27)供试品图谱中28.77ppm峰为A环上C-23信号。DEPT谱显示其为伯C。HMQC谱表明其与氢谱中0.91ppm质子信号有直接相关；HMBC谱证明同一环上H-3、H-5、H-24和3-OH各质子皆与其有异核远程相关。

(28)供试品图谱中28.00ppm峰为C环上的C-15信号。DEPT谱显示其为仲C。HMQC谱表明其与氢谱上的1.75ppm(H-15a)和0.87ppm(H-15b)两组质子峰有直接相关。HMBC谱证明同环上的H-16a，b、H-18和H-27诸质子均与其有远程异核相关。

(29)供试品图谱中26.37ppm峰为E环上C-29信号。DEPT谱表明其为伯C。HMQC谱显示其与氢谱中108ppm(H-29)单峰有直接相关；HMBC谱证明同一环上的H-18、20、21ab和19-OH各质子均与其有远程异核相关。

(30)供试品图谱中25.77ppm峰为E环上C-21信号，DEPT谱表明其为仲C。HMQC谱显示其与氢谱中1.62ppm(H-21a)和1.14ppm(H-21b)两组质子信号有直接相关。HMBC谱证明同一环上的H-18、20、22、29和30各质子皆与其有远程异核相关。

(31)供试品图谱中25.08ppm峰为D环上C-16信号。DEPT谱表明其为仲C。HMQC谱显示其与氢谱中2.52ppm(H-16a)和1.58ppm(H-16b)两组质子信号有直接相关。HMBC谱证明D环上的H-15ab、H-18和E环上H-22ab各质子均与其有远程异核相关。

(32)供试品图谱中23.82ppm峰为连接C和D环的C-14上的甲基(C-27)；DEPT谱显示其为伯C。HMQC谱表明其与氢谱中1.27ppm(H-27)信号有直接相关。HMBC谱证明B环上的H-7ab，D环上的H-15a，b和H-18等质子与其有远程相关。

(33)供试品图谱中23.22ppm峰为C环上C-11信号；DEPT谱显示其为仲C。HMQC谱表明其与氢谱中1.88ppm(H-11ab)有直接相关。HMBC谱证明B环上H-7a，b，同环上的H-9、12和26与其有异核远程相关。

(34)供试品图谱中18.09ppm峰为B环上C-6信号。DEPT谱显示其为仲C。HMQC谱表明其与氢谱中1.43ppm(H-6a)和1.30ppm(H-6b)两个质子信号有直接相关。HMBC谱证明A环上的H-1，3，5，23和B环上的H-7ab，H-26皆与其有异核远程相关。

(35)供试品图谱中17.09ppm峰为A环和B环连接处C-10上的甲基(C-25)信号。DEPT谱表明其为伯C。HMQC谱显示其与氢谱上0.70ppm(H-25)的单峰有直接相关。HMBC谱证明A环上H-1a，b和H-5，B环上的H-9各质子均与其有远程间接相关。

(36)供试品图谱中16.43ppm峰为C环中C-26信号。DEPT谱表明其为伯C。HMQC谱显示其与氢谱上0.89ppm(H-26)信号有直接相关。HMBC谱证明B环中H-7a，b，C环上H-9，D环上H-15ab和H-27各质子均与其有异核远程间接相关。

(37)供试品图谱中16.39ppm峰为A环上C-24信号。DEPT谱表明其为伯C。HMQC谱显示其与氢谱上的0.66ppm(H-24)信号有直接相关。HMBC谱证明同一环上的H-3、H-5、H-23和3-OH各质子均与其有远程间接相关。

(38)供试品图谱中16.22ppm峰为E环上C-30信号。DEPT谱证明其为伯C。HMQC谱表明其与氢谱中0.84ppm(H-30)信号有直接相关。HMBC谱证明同一环上的H-20和H-21a，b各质子与其有远程间接相关。

结论：综上所述，本品的¹³C-NMR各一维和二维谱(PBB、DEPT、HMQC和HMBC等)的结果与实际结构完全相符。此结论不仅与一维和二维氢谱等相关信息一致，而且与有关文献*中已知类似结构化合物的有关数据相比较也证实了该结论的合理和可靠性。

*附：有关文献资料中的相关数据：

①文献I：Acta Pharmacentica Sinica 1996，31(11)：844-848

(i)化合物A(2α，3β，19β-三羟基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖甙，C₃₆H₅₈O₁₀)的碳谱数据：

¹³C-NMR(125MHz，CD₃COCD₃，δppm)：176.8(C-28)，139.2(C-13)，128.8(C-12)，95.1(糖上的端基C，C-1’)，83.9(C-3)，79.0(C-5’)，78.7(C-3’)，73.7(C-2’)，73.1(C-19)，71.2(C-4’)，68.8(C-2’)，62.5(C-6’)，56.2(C-5)，54.4(C-18)，48.8(C-17)，48.1(C-1)，47.7(C-9)，42.2(C-14)，41.3(C-20)，40.9(C-8)，39.8(C-10)，38.9(C-4)，37.8(C-22)，33.8(C-7)，29.3(C-15)，29.2(C-23)，27.1(C-21)，26.7(C-29)，26.2(C-16)，24.5(C-27)，24.4(C-11)，19.2(C-6)，17.4(C-25)，17.0(C-26)，16.5(C-30)。

(ii)化合物B(2α，3α，19α-三羟基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖甙，C₃₆H₅₈O₁₀) 的碳谱数据：

¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆，δppm)：175.4(C-28)，138.1(C-13)，127.0(C-12)，94.0(糖上的端基C，C-1’)，77.7(C-3)，77.4(C-3’)，76.6(C-5’)，72.1(C-2’)，7 1.7(C-19)，69.4(C-4’)，64.5(C-2’)，60.6(C-6’)，53.1(C-18)，47.6(C-18)，47.6(C-5)，47.3(C-17)，46.5(C-9)，41.6(C-1)，41.3(C-20)，39.9(C-14)，39.8(C-8)，37.9(C-4)，37.8(C-10)，36.5(C-22)，32.5(C-7)，28.7(C-15)，27.9(C-23)，26.3(C-21)，26.3(C-29)，25.7(C-16)，23.9(C-27)，23.1(C-11)，21.8(C-6)，17.6(C-26)，16.4(C-30)，16.1(C-25)，16.1(C-24)。

(iii)化合物C(2α，3β，19α-三羟基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸，C₃₀H₄₈O₅)的碳谱数据：

¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆，δppm)：178.9(C-28)，138.6(C-13)，126.7(C-12)，82.2(C-3)，71.6(C-19)，67.1(C-2)，54.8(C-5)，53.1(C-18)，46.9(C-17)，46.8(C-1)，46.7(C-9)，41.4(C-20)，41.1(C-14)，39.0(C-8)，38.9(C-4)，37.6(C-10)，37.2(C-22)，32.6(C-7)，28.8(C-23)，28.0(C-15)，26.4(C-29，25.9(C-21)，25.1(C-16)，23.9(C-27)，23.2(C-11)，18.1(C-6)，17.1(C-26)，16.6(C-30)，16.3(C-25)，16.3(C-24)。

②文献II：中国中药杂志，1998年第23卷第1期P37-38：

(iv)化合物D(2α，3α，19α-三羟基-12-乌苏烷-28-酸，C₃₀H₄₈O₅)的碳谱数据：

¹³C-NMR(100MHz，C₅D₅N，δppm)：180.0(C-28)，142.0(C-13)，128.0(C-12)，79.3(C-3)，72.7(C-19)，66.1(C-2)，54.6(C-18)，48.8(C-5)，48.3(C-17)，47.6(C-9)，42.9(C-1)，42.4(C-20)，42.4(C-14)，40.6(C-8)，38.8(C-10)，38.7(C-4)，38.5(C-22)，33.5(C-7)，29.5(C-23)，29.5(C-15)，27.1(C-29)，27.0(C-16)，26.4(C-21)，24.7(C-27)，24.1(C-11)，23.3(C-24)，18.8(C-6)，17.3(C-26)，16.8(C-25)，16.6(C-30)。

③文献III：药学学报，18(4)：314-316，1983：

(v)化合物E(2α，3α，19α-三羟基-熊果酸-(28-1)-β-D-葡萄糖酯，C₃₆H₅₈O₁₀)的碳谱数据：

¹³C-NMR(JEOL FX-60Q，CD₃OD，δppm)：178.4(糖酯C＝O)，139.5(s)，129.5(d)，95.7(d)，84.5(s)，78.4(d)，78.3(d)，73.8(d)，73.6(d)，71.2(d)，69.5(d)，62.5(t)。

④文献IV：植物学报，1988，30(4)：409-413：

(vi)化合物F(2α，3α，19α-三羟基雄果-12-烯-28-羧酸-28-O-β-D-葡萄糖甙，C₃₆H₅₈O₁₀·2H₂O)的碳谱数据：

¹³C-NMR(JEOL FX-100Q，C₅D₅N，δppm)：42.0(t，C-1)，65.5(d，C-2)，78.3(d，C-3)，38.0(s，C-4)，47.9(d，C-5)，17.3(t，C-6)，32.7(t，C-7)，40.1(s，C-8)，46.9(d，C-9)，38.0(s，C-10)，23.9(t，C-11)，127.5(d，C-12)，138.3(s，C-13)，41.5(s，C-14)，28.8(t，C-15)，26.0(t，C-16)，47.9(s，C-17)，53.6(d，C-18)，71.9(s，C-19)，42.0(d，C-20)，25.6(t，C-21)，36.9(t，C-22)，28.8(q，C-23)，21.6(q，C-24)，16.1(q，C-25)，16.8(q，C-26)，23.2(q，C-27)，176.2(s，C-28)，26.4(q，C-29)，16.1(q，C-30)，95.0(d，C-1’)，73.1(d，C-2’)，78.3(d，C-3’)，70.5(d，C-4’)，78.0(d，C-5’)，61.6(t，C-6’)。

(八)质谱

1.仪器型号

英国VG公司Zabspec质谱仪。

2.测定条件

HS/MS(高分子质谱)，FAB/MS(快原子轰击质谱)，EI/MS(电子轰击质谱)。

3.测定结果

详见表7和图7

表7 蕨麻苷三种质谱数据与解析

质谱方式	质荷比(m/z)	相对峰度(％)	碎片离子化学组成	备注
质谱方式	质荷比(m/z)	相对峰度(％)	碎片离子化学组成	备注	FAB⁺FAB^-EI	651649488470442424264246223219205201189146119	1553010620182032302010034	[C₃₆H₅₉O₁₀ ⁷]⁺[C₃₆H₅₇O₁₀ ⁷]⁺[C₃₀H₄₈O₅ ⁷]⁺[C₃₀H₄₆O₄ ⁷]⁺[C₂₉H₄₄O₂ ⁷]⁺[C₂₉H₄₂O⁷]⁺[C₁₆H₂₄O₃ ⁷]⁺[C₁₆H₂₂O₂ ⁷]⁺[C₁₄H₂₃O₂ ⁷]⁺[C₁₅H₂₃O⁷]⁺[C₁₄H₂₁O⁷]⁺[C₁₅H₂₁ ⁷]⁺[C₁₄H₂₁ ⁷]⁺[C₁₁H₁₄ ⁷]⁺[C₉H₁₁ ⁷]⁺	M+1峰M-1峰M-糖基(162)甙元M’M’-H₂O(18)M’-HCOOH(46)M’-HCOOH-H₂OM’-224

4.讨论与说明

(1)由表7可见，FAB正谱(651)和FAB负谱(649)表明本品的分子离子峰应为650，即本品无水物的分子量应为650，其元素组成应为C₃₆H₅₈O₁₀。

(2)m/z488峰为分子离子峰去掉糖基(162)后所得到的甙元的分子量，质量数162的互补碎片离子表明此糖基应为六碳糖。

(3)本品中的C₁₂-C₁₃双键是重要的裂解因素，在电子撞击下C环很容易进行RDA裂解把分子离子分成含A，B环和含D，E环的两部分。即223(A，B环)和264(D，E环)两大碎片离子。这两大碎片离子进一步裂解分别得189(20)和246(20)，219(25)，205(35)，201(30)，146(100)有119(34)等碎片离子。后者各碎片离子的相对峰度都较大，其中146为基峰(100)。此基峰是m/z264碎片在失去C-17位的取代基和一个H原子，然环E环进行RDA裂介并失去一个C₄H₈O碎片后而形成。这是Δ¹²-乌苏烯三萜化合物当19位或20位有β-OH后带有特征性的碎片离子。

(4)以上各碎片离子裂解途径和机理可能如下：

(九)粉末x-射线衍射谱

1.仪器

日本理学Rigaku D/MAX RC型粉晶衍射谱。

2.样品

供试品1，2，3

3.测定条件

CuKo₁种(λα)＝1.54056A)，单色辐射，50kY，80mA激发。

4.测定结果

详见表8和图8。

表8 蕨麻苷供试品粉末x-射线衍射谱数据与解析

样品	2θ(°)	面间距d(A)	相对强度(I/Io，％)
样品	2θ(°)	面间距d(A)	相对强度(I/Io，％)	供试品1	5.8009.30012.24013.88014.36015.60016.82019.44022.78024.320	15.2259.5027.2256.3756.1635.6765.2674.5623.9013.657	213564100954837384639
供试品2	5.7409.18012.44013.76014.20015.54016.66019.30022.76024.200	15.3849.6267.1106.4306.2325.6985.3174.5953.9043.675	213665100944935384435	供试品1	5.8009.30012.24013.88014.36015.60016.82019.44022.78024.320	15.2259.5027.2256.3756.1635.6765.2674.5623.9013.657	213564100954837384639
供试品2	5.7409.18012.44013.76014.20015.54016.66019.30022.76024.200	15.3849.6267.1106.4306.2325.6985.3174.5953.9043.675	213665100944935384435	供试品3	5.8009.24012.20013.82014.30015.58016.74019.42022.82024.200	15.2259.5637.2496.4036.1895.6835.2924.5673.8943.675	223863100965539424639

结论：本品为结晶性粉末，且不同批次的样品晶型相同。

(十)差示扫描热分析和热重分析(DSC和TG)

1.仪器：NETZSCH DSC 204

2.样品：供试品

3.测定条件：起始温度40℃，终止温度300℃，升温速度10.0℃/min。

4.测定结果：

5.结论：①供试品的熔点为231.7℃(DSC)；②供试品的含水量为3.4％，说明分子中除表面湿存水外，还应含有一个结晶水(相当于2.7％)(TG)。

综合解析

一、分子式和分子量的推断和确定

1.分子量的推断和确定

(1)三种质谱(FAB⁺、FAB^-、HS)结果显示，本品无水物的分子式应为C₃₆H₅₈O₁₀。

(2)由元素分析(EA)的结果：C％64.49，H％9.08；氢谱(¹H-NMR和D₂O)交换的结果：60个质子(其中共9个活泼H)；热重分析(TG)；3.4％等表明分子中有一个结晶水存在。

结论：本品的准确分子式应为：C₃₆H₅₈O₁₀·H₂O(或C₃₆H₆₀O₁₀)。

2.分子量的推断与确定：

(1)本品的无水物分子式为C₃₆H₅₈O₁₀，其分子量应为650.85。

(2)本品的一水物分子式为C₃₆H₅₈O₁₀·H₂O，其分子量应为668.87。

二、结构式的推断

1.不饱和度的计算和推断

(1)计算：

根据不饱和度计算公式：Ω＝(2+2n_IV+n_III-n_I)/2

本品的不饱度Ω应为8。

(2)推断：

①由定性鉴别反应，以及IR，¹H-NMR、¹³C-NMR和MS有关信息判断本品为乌苏酸(熊果酸)型五环三萜类化合物。即分子中有5个脂肪环(A、B、C、D、E)和存在于C-12和C-13间的一个双键，以及在C-28位上的一个酯基。由此，它们共贡献出7个不饱和度。

②由氢谱、碳谱、质谱和红外等有关信息，确认分子中有一糖环，此环也贡献出一个不饱和度。

结论：本品不饱和度的计算和推论结构完全与本品的分子式、结构式和实际情况相符。

2.基本结构单元的存在和确定

由本品的定性鉴别(Molish和Libermann-Burchard的阳性反应)和其各谱的相关信息可知：本品是一个由取代的乌苏酸(熊果酸)型五环三萜为甙元与一个单糖分子结合而成的酯皂苷。故可认为本品的分子结构实际上仅仅由两大结构单元(即乌苏酸三萜和一分子糖基)所组成。

(1)苷元部分的结构推断和确定：

①母核的类型推断和确定：

(i)Molish和Libermann-Buurchard的阳性反应表明本品的苷元的五环三萜类化合物。

(ii)由于本品五环三萜苷元部分中氢谱和碳谱皆显示C-19位上有一个甲基(δ_H：1.08ppm，S，3H和δ_C：26.67ppm，伯C，HMBC谱显示其与H-18，20，21ab和19-OH有远程异核相关)，C-28为酯羰基(δ_C：175.53，季C，与H-1’，18，22ab有远程相关)，故表明此苷元为乌苏酸类五环三萜。

②母核上三个取代羟基的位置和构型的推断和确定：

经氢谱和D₂O交换后证实本品分子中有9个活泼氢，除去一个水分子和糖环上的四个-OH后，确认本品母核上应有三个取代的-OH。

(i)2α-OH的确定：

由氢谱和碳谱的相关信息(0.98ppm的单宽峰，D₂O交换证明其为活泼质子，NOESY谱显示其与H-1b，H-2，H-3，3-OH有空间相关，H-1b和H-3为α键，H-2和3-OH为β键故此OH应为α构型，δC-2的数值(67.13ppm)和类型(叔C)也进一步确认了C-2位上α-羟基的存在。

(ii)3β-OH的确定：

δ_C-3的数值(82.31ppm)和类型(叔C)表明此C上有一电负性很大的基因(-OH)存在；氢谱的0.78ppm，D₂O交换证实其为活泼质子；NOESY谱显示其与H-1a，2，24，25，26有空间相关；这些质子皆为直立的β键，结合分子模型表明此OH也为β键。证实了C-3位上平伏的3β-OH的存在。此结论亦为红外的相关信息所证实(详见本资料IR光谱部分的解析)。与其在同一C上的H-3被证明为直立向下的α键也证实了3β-OH的结果的正确可靠。

(iii)19β-OH的确定：

δ_C-19的数值(71.65ppm)和类型(季C)表明此C上也有一电负性大的-OH存在；其氢谱δ_H3.78ppm，D₂O交换证实其为一活泼质子，COSY谱表明其H-18有相关，NOESY谱证实其与H-12，16a，21a，22a，29，30各质子均有空间关系，其中H-16a，21a，22a和H-30均为β键，结合分子模型可确认此C-19位上19-OH亦应为直立向上的β-构型。与其在同一C上的C-29甲基被证明为平伏的α键也进一步表明此结果的可靠。

③母核上7个角甲基的位置和构型的推断和确定：

经碳谱(DEPT)和氢谱证实本品母核上应有7个取代的角甲基。

(i)23α-CH₃和24β-CH₃的确定：

DEPT谱证实A环上C-4(40.00ppm)为季C；HMBC谱显示其与H-3，5，6ab，H-23，24和3-OH有远程相关；碳谱中28.77ppm的伯C(C-23)HMQC谱表明其与H-23(0.91ppm，s，3H)相连；HMBC谱显示其与H-3，5，24，3-OH有远程相关；NOESY谱表明H-23(甲基)与H-3，5，6b，24和3-OH有空间相关，其中H-3，5，6b为α键，结合分子模型，可确认此23-CH₃亦为α键；与其在同一C上的24-CH₃，其IR(1384，1370cm^-1)、氢谱(0.89ppm，s，3H)、NOESY谱(与H-2，3-OH，H-6ab，H-23，25，26均有空间相关)、碳谱(16.43ppm，伯C与H-24有直接相关，与H-3，5，23，3-OH有远程相关)等均表明此24 CH₃为一β型甲基。以上各种信息表明此五环三萜A环的4位季C原子上分别连有一个α-CH₃(C-23)和一个β-CH₃(C-24)。IR也证明分子中有一同C偕二甲基的存在。

(ii)25β-CH₃和26β-CH₃的确定：

DEPT谱证实二者皆为伯C(δ_C-25：17.09ppm，δ_C-26：16.39ppm)，HMQC谱证明二者分别与δH 0.70ppm(s，3H)和0.66ppm(s，3H)相连；HMBC谱显示其与H-1a，b，H-5和H-9有远程相关；NOESY谱表明25-CH₃分别与H-1b，2，6a，11a，24，26，3-OH有空间相关；26-CH₃分别与H-6a，7b，11，112，15a，b，24，25有空间相关。结合分子模型表明，二者皆为直立的β键。结合相关信息证明25β-CH₃应连在C-10的季C上；26β-CH₃则应连接在C-8位的季C原子上。

(iii)27α-CH₃和29α-CH₃的确定：

DEPT谱证实二者皆为伯C(δ_C-27：23.82ppm，δ_C-29：26.67ppm)；HMQC谱证实二者分别与δ_H-27(1.27ppm，s，3H)和δ_H-29(1.08ppm，s，3H)相关；HMBC谱表明23.82ppm的甲基峰分别与H-7a，b，15a，b和18质子有远程相关；氢谱1.27ppm(s，3H)峰在二维NOESY谱中分别与H-7ab，H-9，H-15b，H-16a，b，H-18，H-22a等质子有空间相关，其中H-9，H-15b，H-18和H-22a均为直立向下的α键，结合分子模型确认C-27甲基亦应为直立向下的α键。同理，HMBC谱表明26.67ppm甲基分别与H-18，H-20，H-21a，b和19-OH有远程相关；氢谱中1.08ppm(s，3H)甲基峰，在NOESY谱中表明分别与H-12，H-18，H-20，H-30和19-OH有空间相关，其中，H-18和H-20亦为α键，19-OH已证实为β键故在同一C上(C-19)的29-CH₃亦应为α键，此结果亦可从分子模型中被证实。结合相关信息证明27α-CH₃应连接在C-14位的季C原子上；而29α-CH₃则应连接在C-19位的季C原子上。

(iv)30β-CH₃的确定：

氢谱0.84ppm(d，J＝9.0Hz，3H)峰证实了H-20质子(1.21ppm，m，J＝9.0，9.6Hz，1H)有偶合，碳谱16.22ppm峰，DEPT谱确认其为伯C，HMQC谱证明与0.84ppm甲基峰有直接相关，HMBC谱表明其与H-20，H-21a，b有远程相关，在NOESY谱中30-CH₃分别与H-20，21a，b，H-29和19-OH有空间相关，结合分子模型可确认此角甲基应为β键并应连接在C-20位的叔C原子上。

④母核上羧酸基的位置的确定：

DEPT谱确认175.53ppm峰为季C原子，δ值表明是羧基C原子，其HMBC谱确认其与H-1’(糖环上端基C原子)，H-18，H-22a，b有远程相关。结合17位季C原子的δ值和HMBC谱的情况(与H-16a，b，H-18，H-22ab和H-21a有远程相关)可确认此羧基应在17位季C原子上。

⑤四个α质子(5，9，18和20)的位置和构型的推断和确定：

(i)氢谱中0.73ppm(m，br，J＝5.4，6.6Hz，1H)信号HMQC谱证实其与C-5(54.82ppm)位的叔C原子相连。NOESY谱表明其与H-1a，3，6b，7a，9和23各α质子有空间相关，结合分子模型证实其亦应为连在C-5位上直立向下的α质子。

(ii)氢谱中1.60ppm(t，9.6Hz，1H)峰在HMQC谱中证实其C-9叔C原子相连；NOESY谱中表明其分别与α键的H-1a，5，7a，11b和27位各质子有空间相关。结合分子模型确认此质子也应为连在C-9位直立向下的α质子。

(iii)氢谱中2.36ppm(s，1H)峰在HMQC谱中证实其与C-18叔C原子相连；NOESY谱表明其分别与α键的H-5，11a，15b，20，22a，27和29各南子峰有空间相关。结合分子模型确认此质子也应为直立向下的α键。

(iv)氢谱中1.21ppm信号在HMQC谱中证实其与41.18ppm的叔C原子相连；NOESY谱表明其分别与α键的H-18，29有空间相关，证明此质子亦应连在C-20位直立向下的α质子。

综上所述，可以确认本品的苷元部分应具有如下的结构：

此结构在本品的质谱中亦得到了488(1 5)、442(35)和424(10)等各重要碎片离子的有力支持。

(2)糖基的存在和糖基类型的推断和确定：

①糖基的存在确定：

(i)高分子质谱、元素分析、氢谱和热重分析等各相关信息，已经证实本品的分子式为：C₃₆H₅₈O₁₀·H₂O。除去前面已经讨论和证实了的甙元(五环三萜类)的组成C₃₀H₄₈O₅和H₂O后，分子中尚有一个C₆H₁₀O₅基团，根据此基团的δ_H和δ_C数值可以判断此基团为一单糖分子。其中6个C的δ_C值分别是94.05(叔C，C-1’)，77.85(叔C，C-5’)，76.70(叔C，C-3’)，72.24(叔C，C-2’)，69.51(叔C，C-4’)和60.64(仲C，C-6’)；对应质子的δH值分别是：5.15(d，8.4Hz，1H，H-1’)，3.58(d，11.2Hz，1H，H-6’a)，3.43(d，10.8Hz，1H，H-6’b)，3.17(m，4.8，8.4Hz，1H，H-3’)，3.11(m，4.8，8.4，1H，H-5’)，3.08(dd，8.4，4.8Hz，1H，H-4’)，3.06(dd，8.4，4.8Hz，1H，H-2’)。

(ii)糖环上的5个OH有一个已与甙元相连，其余4个OH的位置经氢谱和重水交换证实，有三个羟基(2’-OH，3’-OH和6’-OH)集中分布在氢谱的5.20-5.15ppm处。另一个(4’-OH)在3.31ppm处。由此证实了分子中一个糖基的存在。

②糖基构型的确定：

根据此糖的端基质子(H-1’)的化学位移(5.15ppm)和偶合常数(³J_1，2＝8.4Hz)表明此糖基的H-1’和H-2’均为直立的a键，即³J_1，2为a，a相交，故此糖基应为β构型。此结果亦为H-1’和H-2’在一维DSNOE和二维NOESY谱中的情况所证实(H-1’与3’，4’和2’-OH有空间关系；H-2’与H-6’a，b，3’-OH和4’-OH有空间关系)。

③糖基类型的确定：

根据一维NOE差谱(DSNOE)和二维NOESY谱的结果可以判断：

(i)H-1’为直立向下的α键，H-2’为直立向上的β键，二者的J＝8.4Hz证明为Jaa偶合；在DSNOE和NOESY谱中H-1’分别与H-3’，4’和2’-OH有空间相关，证明三者皆为α键(H-3’和H-4’为a键，2’-OH为e键)。

(ii)H-3’和4’-OH分别为直立的α键和β键，H-4’和3’-OH则分别为平伏的α键和β型。在DSNOE和NOESY谱中H-3’分别与H-1’，4’和2’-OH有空间关系；H-4’分别与H-3’，5’，3’-OH和4’-OH有空间关系。4’-OH则分别与H-2’，3’-OH，6’a，6’b和6’-OH有空间关系。

(iii)H-5’为α键，H-6’ab则为β型a键。在DSNOE和NOESY谱中，H-5’分别与H-4’，4’-OH，6’a，b和6’-OH有空间关系；H-6’ab则分别与H-2’，5’，3’-OH和4’-OH有空间关系。结实上所述本品糖基类型的结构如下：

显然此结构应是β-吡喃半乳糖。此糖基的各δ_C值分别为：94.05(C-1’)，77.58(C-5’)，76.70(C-3’)，72.24(C-2’)，69.51(C-4’)和60.64(C-6’)。这些数值与单一的β-D-半乳糖各δ_C值相比：97.7(C-1’)，76.31(C-5’)，74.2(C-3’)，73.3(C-2’)，70.1(C-4’)和62.3(C-6’)其数值大小和排序情况基本相符。进一步支持了此糖基结构的合理可靠性。

(3)苷元和糖基连接点的推断和确定：

根据HMBC谱中显示的C-28(酯羰基)与H-1’的远程相关表明本品的五环三萜皂甙元显然是通过28位的酯羰基( )与糖基中端基碳(C-1’)相连接而形成的皂甙。故此皂苷的完整的正确结构应是：

根据此结构，本品的全名应是：

2α，3β，19β-三羟基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸-28-O-β-D-吡喃半乳糖苷

由于此化合物是首次从药用植物蕨麻中提取、分离纯化而得到的一个新的具有皂苷结构的单体化合物，故命为蕨麻苷。其分子式是C₃₆H₅₈O₁₀·H₂O。

说明：(1)此分子式中一分子水的存在可由：

①元素分析的结果(C％64.49，H％9.08，与含一分子水的理论计算值64.65(C％)和9.04(H％)相符)。

②氢谱和重水交换的结果(重水交换前积分值为60个质子，重水交换后积分值为51个质子，9个活泼氢中有7个为-OH质子(4个糖OH和3个母核上的取代OH)剩余的两个活泼质子显然为一个结晶水所提供)。

③热重分析(TG)的结果(一个结晶水在C₃₆H₅₈O₁₀·H₂O所占的数量为2.7％，实测值为3.4％超过的0.7％占1/4个水分子可能是表面湿存水未能完全烘干之故。

显然三种方法的分析结果都确认本品中应含有一个结晶水。

(2)此分子式和结构式的合理可靠性除得到了各种一维和二维核磁共振谱(PMR，D₂O，DSNOE，1D-TOCSY，COSY，NOESY，2D-TOCSY；PBB，DEPT，HMQC和HMBC等)的各类信息所证实和支持外，EA，IR，FAB/MS，HSMS，EI/MS，PXR，DSC和TG等各类相关信息也给予了有力的支持。尤其是质谱的651(M-H₂O+1)，649(M-H₂O-1)，488(M-糖基1162)，470(M-糖基-H₂O)，442(M-H₂O-HCOOH)，424(M-H₂O-HCOOH-H₂O)等各种重要的碎片离子的化学组成和裂解机理都进一步确认了此皂苷的皂苷元组成和糖基的组成情况。

结论：本品的结构鉴定确定无疑

根据上述化合物结构鉴定结果，经中国科学技术信息研究所通过国际联机检索，查找国际STN系统有关数据库(化学物质登记数据库、美国化学文摘)以及国内联机检索。确认该化合物为首次发现并鉴定的新化合物。

本发明的另一目的是提供了上述蕨麻有效部位(JMS)与蕨麻苷化合物的分离与纯化方法，该方法包括下列步骤，见流程图，见图9。

附图说明

图1蕨麻苷供试品的HPLC图谱

图2蕨麻苷供试品的IR图谱

图3蕨麻苷供试品在中性条件下的UV吸收图谱(中性)

图4蕨麻苷供试品在酸性条件下的UV吸收图谱(酸性)

图5蕨麻苷供试品在碱性条件下的UV吸收图谱(碱性)

图6蕨麻苷供试品的′H-NMR图(0-7.5ppm)

图7蕨麻苷供试品的质谱图(HSMS)

图8蕨麻苷供试品的质谱图粉末X-射线图III及其数据

图9蕨麻苷化合物的分离与纯化方法流程图

具体实施方式

实施例1

取蕨麻原药材粉碎过20目筛，以70％乙醇浸润4-6小时，70％-95％乙醇回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩得浸膏，浸膏以浸膏：水为1∶5的水溶液上大孔树脂柱，D-101型树脂；生药为1.5∶1，水洗脱以TCL监控终点，30-95％乙醇洗脱，以TCL监控终点，收集醇洗脱部分、置真空干燥得蕨麻有效部位，取蕨麻有效部位以水溶解制成10％溶液，上硅胶柱进行VLC减压梯度柱层析，洗脱剂为CH₂CL₂∶CH₃OH为7∶3，分步收集洗脱液，减压浓缩，上硅胶柱常压层析以CH₂CL₂∶CH₃OH为20∶1的洗脱液，分步收集洗脱液，减压浓缩得蕨麻苷粗品纯度＜80％，粗品以甲醇制成10％溶液，上硅胶柱层析洗脱剂为石油醚∶丙酮为5∶2，得蕨麻苷粗品纯度＞85％；粗品通过HPLC制备色谱仪；流动相为CH₃OH∶H₂O为65∶35，分步收集洗脱液、减压浓缩，再用石油醚、甲醇混合溶剂重结晶处理得蕨麻苷纯品纯度＞98％。压浓缩，重结晶处理(石油醚∶甲醇)得蕨麻苷纯品纯度＞98％。

本发明的蕨麻有效部位的药效评价如下：

(一)蕨麻活性部位(以下简称JMS)抗肝炎病毒活性的评价。

1.材料

(1)供试药物蕨麻活性部位(JMS)白色无定型结晶(中国人民解放军第302医院药学部药物研究室制备，批号：0010526)。拉咪呋定，规格100mg/片，(英国Wellcome fumdation产品，批号：990812)；

(2)胎牛血清(美国Gibco公司产品)；G-418(美国Sigma公司产品)；HBeAg，HBsAg固定相放射免疫测定盒(中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品)；a-32P-dCTP(北京福瑞生物技术工程公司，批号：981206)：缺口翻译药盒(Promega公司，批号：990426)；鸭乙型肝炎病毒为鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)强阳性上海麻鸭血清(中国医学科学院北京医科大学医药生物技术研究所病毒室提供，-70℃保存)

(3)2.2.15细胞为转染了HBV(Aayw亚基)全基因组，能分泌HBsAg、HBeAg、HBV-DNA颗粒的人肝母瘤细胞系，美国Mount sinai医学中心构建，中国医学科学院医药生物技术所病毒室传代培养)

(4)动物1日龄北京维鸭购自北京南苑养鸭场

2.方法：

(1)药物对细胞的毒性试验：

(2)将不同浓度含药培养液加入96孔细胞培养板，每浓度4孔，每4d换同浓度药液，设无药细胞对照组。以观察细胞病变为指标，第8天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为4，75％破坏为3，50％破坏为2，25％为1，无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制率。按Reed Meuench法计算TC50，TC0。

(3)2.2.15细胞培养及药物应用(11 2.2.1 5细胞用含10％胎牛血清及G418(380ug/ml)的DMEM培养基按常规方法培养。开始实验时，用0.25％胰蛋白酶将2.2.15细胞分散成单个细胞悬液，3’105个×L-1，24h后换用含药培养液，每4d换新鲜含药培养液，收集4d、8d上清液，-20C保存，待检。

(4)鸭乙型肝炎病毒感染及药物治疗[2]1日龄北京雏鸭经胫静脉注射DHBV-DNA鸭血清毒种，每只0.3ml。7天后取血，分离血清，-70℃保存，待检。雏鸭DHBV感染7d血清检测为阳性后，随机分组，每组6只，进行药物治疗试验，疗程10d。JMS分高、中低3个剂量组，即0.15g/kg日-1.d-1、0.3g/kg.日-1.d-1、0.6g/kg.日-1.d-1，ig，bid；拉米呋啶为阳性对照组，0.1g/kg.日-1.d-1，ig，bid；设生理盐水组为DHBV对照组，ig，bid。分别于用药后5天(T5)、10天(T10)和停药后3天(P3)自鸭胫静脉取血，分离血清，70℃保存，待测。

(5)2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg检测采用北方免疫试剂研究所生产的固相放射免疫测定盒检测，方法按说明书用9口计数器测定每孔药液min-1(cpm)值。

(6)鸭血清DHBV-DNA的检测按缺口翻译试剂说明书方法，用32P标记DHBV-DNA探针，按陈渊清等方法做血清直接斑点杂交及放射自显影，用酶联免疫检测仪(滤光片入为490nm)测定放射自显影膜片杂交斑点的OD值，以此作为鸭血清标本DHBV-DNA水平值。将同组鸭用药前后血清DHBV-DNA的平均OD值及不同组鸭同一时间血清DHBV-DNA平均抑制率进行比较，判断药物疗效。DHBV-DNA抑制率计算公式：

3.结果评价：

(1)JMS对体外病毒标志物分泌的抑制

(2)JMS对2.2.15细胞的毒性作用：分别以含JMS2，1.5，1，0.5，0.25mg/ml的培养基与2.2.15细胞共同培养，观察不同浓度药物对细胞的毒性作用。结果表明，JMS的最大无毒浓度为1mg/ml，品对细胞产生50％毒性的浓度为1.38mg/ml，见表9。(补表)

(3)JMS对2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用小剂量JMS(250μg×ml-1)对2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制率在4d，8d两个时相分别为16.5％和51％，中剂量JMS(500μg×ml-1)在4d，8d两个时相的抑制率分别为26.5％和44.8％。与生理盐水对照组比较，小剂量和中剂量JMS组在8d时对HBsAg的抑制率有显著性意义(P＜0.05)。大剂量JMS(1000μg×ml-1)在两个时相均可显著抑制HBsAg的复制和表达。(P＜0.05，P＜0.01)，见表10。

(4)JMS对2.2.15细胞分泌的HBeAg的抑制作用除小剂量JMS(250μg×ml-1)在4d时对2.2.15细胞分泌的HBeAg无明显抑制作用(P＞0.05)，其余各剂量组对HBeAg的分泌均有显著性抑制作用。(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)。同时具有明显的剂量依赖性和时间依赖性，见表11。

(5)JMS对DHBV-DNA复制的抑制作用雏鸭感染乙肝病毒后DHBV-DNA全部阳性。JMS高、中剂量组在给药5天(T5)、10天(丁10)，无论给药前后比较(横向)还是与对照组比较(纵向)，鸭血清中DHBV-DNA水平都显著降低(P＜0.05，P＜0.01)。并且呈一定的时间依赖性和剂量依赖性。低剂量组则无明显抑制作用(P＞0.05)，但停药3天后抑制率有所上升。抑制率升高程度与病毒对照组比较虽无显著性差异，但体现了JMS抑制DHBV-DNA复制的时间依赖性。阳性药拉米呋啶作用药期间可显著抑制鸭DHBV-DNA，但停药后下降至18.63％，出现“反跳”现象，见表12。

表9 JMS对2.2.15细胞的毒性作用

表10 JMS对2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用x±s

表11 JMS对2.2.15细胞分泌HBeAg的抑制率作用x±s

表12 JMS对鸭血清DHBVDNA的抑制作用x±s

4.化合物单体—蕨麻苷抗肝炎病毒作用的评价

(1)试验方法：2.2.15细胞法

试验设HBsAg、HBeAg阳性对照组，阴性对照组，细胞对照组及含不同蕨麻苷浓度的药物组。2.2.15细胞以1×106·L-1个接种于24孔细胞培养板，每孔1ml，37℃ 5％CO2培养24小时，试验药液无毒浓度以下2倍稀释，4个稀释度分别为100、50、25、12.5μg/ml，每浓度4孔，37℃ 5％CO2培养，每4天换原浓度药液培养，第8天时收获培养液，-20℃冰冻保存。分别进行蕨麻苷对2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的抑制试验；蕨麻苷对2.2.15细胞上清中HBV-DNA斑点杂交试验及对2.2.15细胞内HBV-DNA Southern blot试验。

(2)结果评价：见表13、14、15、16、17、18、19

表13 蕨麻苷在2215细胞培养内对细胞毒性和HbsAg，HbeAg的抑制作用

实验批次	细胞毒性		对HBV抗原抑制
	细胞毒性		对HBV抗原抑制				TC50(μg/ml	TC0(μg/ml)	HbsAg		HBeAg
	IC50(μg/ml	SI	IC50(μg/ml	SI					HbsAg		HBeAg
	IC50(μg/ml	SI	IC50(μg/ml	SI	123	317.48282.84			200200	81.6974.9194.71	3.674.013.17	87.788.298.18	3.423.43.06

三批平均	300.16±24.49	200±0	83.77±10.06	3.62±0.42	91.36±5.91	3.29±0.20
三批平均	300.16±24.49	200±0	83.77±10.06	3.62±0.42	91.36±5.91	3.29±0.20	拉米夫定拉米夫定二批平均	1130.031267.911198.97±97.50	800800800±0	＞800＞800＞800	---	＞800＞800＞800	---

表14 蕨麻苷在2215细胞培养内对HbsAg和HbeAg的抑制作用(％)

实验批次	蕨麻素浓度(μg/ml)	抑制％
		抑制％		HbsAg	HBeAg
		1	100502512.5	HbsAg	HBeAg	33.1521.2115.6314.18	26.5621.7618.2918.00
2	100502512.5	1	100502512.5	31.5821.2418.8516.63	23.2119.5920.8115.58	33.1521.2115.6314.18	26.5621.7618.2918.00
2	100502512.5	3	100502512.5	31.5821.2418.8516.63	23.2119.5920.8115.58	26.2915.8919.1410.00	20.5719.5719.0614.37
蕨麻素三批实验平均	100502512.5	3	100502512.5	30.37±3.6119.43±3.0617.87±1.9713.6±3.34	23.47±3.0120.3±1.2719.4±1.2816.0±1.83	26.2915.8919.1410.00	20.5719.5719.0614.37
蕨麻素三批实验平均	100502512.5	拉米夫定	40020010050	30.37±3.6119.43±3.0617.87±1.9713.6±3.34	23.47±3.0120.3±1.2719.4±1.2816.0±1.83	12.6716.3517.4813.20	8.102.3512.056.24
拉米夫定	40020010050	拉米夫定	40020010050	13.3219.3114.1914.99	08.995.150.65	12.6716.3517.4813.20	8.102.3512.056.24
拉米夫定	40020010050	拉米夫定二批平均	40020010050	13.3219.3114.1914.99	08.995.150.65	19.55±2.4323.50±0.2520.53±3.0916.60±7.29	4.05±5.735.67±4.78.6±4.883.45±3.95

表15 蕨麻苷在2215细胞培养上清液中对HBV-DNA的作用HBV-DNA斑点密度值/抑制率％：

药物浓度(μg/ml)	细胞上清液HBV-DNA稀释倍数/抑制率％
	细胞上清液HBV-DNA稀释倍数/抑制率％				原液(CPM)	抑制率％	稀释1/2(CPM)	抑制率％
	100502512.5细胞对照	412.948419.516589.36687.988892.751	53.7453.0133.9822.94	253.409268.488403.193394.847472.899	原液(CPM)	抑制率％	稀释1/2(CPM)	抑制率％	46.4143.2314.7416.51
IC50/SI：原：IC50 45.13μg/ml/SI 6.65 _：IC50 63.06μg/ml/SI 4.76									46.4143.2314.7416.51

表16 拉米夫定在2215细胞培养内对上清液中HBV-DNA的作用HBV-DNA斑点相对密度值/抑制率％：

药物浓度(μg/ml)	细胞上清液HBV-DNA稀释倍数/抑制率％
	细胞上清液HBV-DNA稀释倍数/抑制率％				原液(CPM)	抑制率％	稀释1/2(CPM)	抑制率％
	40020010050细胞对照	1767.021573.282063.22406.24344.61	59.328563.787852.503944.6164	305.135161.533243.224911.1851488.76	原液(CPM)	抑制率％	稀释1/2(CPM)	抑制率％	79.504189.149883.662638.7957
IC50/SI：原：IC50 119.61μg/ml/SI 10.02 _：IC50 71.66μg/ml/SI16.733									79.504189.149883.662638.7957

表17 蕨麻苷在2215细胞培养内HBV-DNA Southern Blot的抑制数据

第一批	100μg/ml	抑制％	50μg/ml	抑制％	25μg/ml	抑制％	12.5μg/ml	抑制％	细胞对照
第一批	100μg/ml	抑制％	50μg/ml	抑制％	25μg/ml	抑制％	12.5μg/ml	抑制％	细胞对照	Rows	(IOD)		(IOD)		(IOD)		(IOD)		(IOD)
r1	2834.7	36.66	2974.4	33.53	2293.1	48.76	1571.4	64.89	4475.1	Rows	(IOD)		(IOD)		(IOD)		(IOD)		(IOD)
r1	2834.7	36.66	2974.4	33.53	2293.1	48.76	1571.4	64.89	4475.1	r2	668.81	92.01	569.93	94.63	719.53	91.41	603.2	92.8	8379.5
r3	2850.3	91.96	4645.7	86.9	4543.3	87.19	2431.8	93.14	35457	r2	668.81	92.01	569.93	94.63	719.53	91.41	603.2	92.8	8379.5
r3	2850.3	91.96	4645.7	86.9	4543.3	87.19	2431.8	93.14	35457	Sum	6353.9	86.85	8070	83.3	7555.9	84.36	4003.2	91.71	48311
In Lane	14445	84.18	18366	79.88	21513	76.44	22063	75.83	91293	Sum	6353.9	86.85	8070	83.3	7555.9	84.36	4003.2	91.71	48311
In Lane	14445	84.18	18366	79.88	21513	76.44	22063	75.83	91293	不同浓度蕨麻素接种细胞内总HBV-DNA in lane计算的抑制作用：IC50：57.13μg/ml SI：5.25

表18 蕨麻苷在2215细胞内HBV-DNA Southern Blot的抑制数作用

第一批

400μg/ml

抑制％

200μg/ml

抑制％

100μg/ml

抑制％

50μg/ml

抑制％

细胞对照

Rows	(IOD)		(IOD)		(IOD)		(IOD)		(IOD)
Rows	(IOD)		(IOD)		(IOD)		(IOD)		(IOD)	r1	368	70.37	526.41	57.62	530.96	57.26	619.28	50.15	1954.3
r2	303.91	72.31	314.07	71.39	271.12	75.30	311.56	71.62	2367	r1	368	70.37	526.41	57.62	530.96	57.26	619.28	50.15	1954.3
r2	303.91	72.31	314.07	71.39	271.12	75.30	311.56	71.62	2367	r3	214.35	82.10	330.9	72.36	416.24	65.24	465.81	61.10	2498.4
Sum	976.26	77.05	1171.4	72.46	1218.3	71.36	1396.6	67.17	2786.6	r3	214.35	82.10	330.9	72.36	416.24	65.24	465.81	61.10	2498.4
Sum	976.26	77.05	1171.4	72.46	1218.3	71.36	1396.6	67.17	2786.6	In Lane	1954.3	76.10	2367	71.05	2498.4	69.44	2786.6	65.91	8175.3
不同浓度蕨麻素接种细胞内总HBV-DNA in lane计算的抑制作用：IC50：72.81μg/ml SI：16.47										In Lane	1954.3	76.10	2367	71.05	2498.4	69.44	2786.6	65.91	8175.3

表19 蕨麻苷和拉米夫定在2215细胞培养内对HBV抑制作用总结表

药品	细胞毒性TC50μg/ml	HbsAg		HBeAg		HBV-DNADot Blot		HBV-DNASouthern Blot
		HbsAg		HBeAg		HBV-DNADot Blot		HBV-DNASouthern Blot		IC50μg/ml	SI	IC50μg/ml	SI	IC50μg/ml	SI	IC50μg/ml	SI
		蕨麻素	300.16±24.49	83.77±10.06	3.62±0.42	91.36±5.91	3.29±0.20	54.44±13.17	5.68±1.37	IC50μg/ml	SI	IC50μg/ml	SI	IC50μg/ml	SI	IC50μg/ml	SI	62.17±7.13	4.76±0.55
拉米夫定	1198.97±97.50	蕨麻素	300.16±24.49	83.77±10.06	3.62±0.42	91.36±5.91	3.29±0.20	54.44±13.17	5.68±1.37	＞800	-	＞800	-	122.13±3.56	9.82±0.28	77.49±6.62	15.53±1.33	62.17±7.13	4.76±0.55

5.JMS抗急性肝损伤作用的评价。

材料与方法

(1)材料

药物：JMS，白色无定型粉末，以蒸馏水配成适当浓度的混悬液。临用时振摇。批号：020526)；联苯双酯片(biphenyl dimethyldicarboxylate，BDD，1.5mg.粒-1，北京协和制药厂，批号990918)；茵栀黄口服液(茵栀黄，0.4g.10ml-1，北京第四制药厂，批号990824)；四氯化碳(ccl4，分析纯，北京化工厂，批号980712)；α萘异硫氰酸酯(ANIT，分析纯，中国人民解放军防化学院)；谷丙转氨酶试剂盒(北京北化精细化学品有限责任公司，批号000321)；总胆红素测定试剂盒(北京中生生物工程高技术公司，批号000301)。动物：昆明种小鼠，体重18-22g，军事医学科学院动物中心提供，合格证号：军协动字BDW-95007。

仪器：4010半自动生化分析仪(北京生化分析仪器厂)病理切片机，高倍显微镜(日本Olympus公司)。

方法：

(1)小鼠ccl4肝损伤模型

健康小鼠60只，设正常对照组、ccl4肝损伤模型组、联苯双酯组(BDD，0.058g.kg-1，g-1)和JMS的高、中、低剂量3个组(0.33，0.165，0.0825g.kg-1.g-1)共6组，每组小鼠10只，各组均ig给药，每只每次0.4mi，bid。正常对照组和模型组给同体积生理盐水。给药第3天，除正常对照组外，各组小鼠均ip 0.1％ccl4橄榄油20ml.kg-11次，全部动物于实验第7天最后一次给药1h后(中毒后36-40h)，摘取小鼠眼球，取眼眶静脉丛血液，收集血样，以生化测定仪检测血清ALT水平，并切取肝脏标本作病理检查。

(2)小鼠ANIT肝损伤模型动物分组同ccl4模型，阳性药对照组为茵栀黄口服液，0.4L.kg.d-1，给药第3天，除正常对照组外，各组均ig ANIT麻油液12mg.kg-1。中毒24h后，取小鼠眼眶静脉搏丛血液，以生化测定仪测定血清中SB水平。

(3)统计处理实验结果以x±s表示，并进行t检验。

结果

(1)JMS对小鼠转氨酶水平影响

与正常对照组相比，ccl4模型组小鼠血清转氨酶明显升高(P＜0.01)。联苯双酯组和JMS高剂量组(0.33g.kg-1.d-1)、中剂量组(0.165g.kg-1.d-1)可显著降低ccl4肝损伤小鼠血中ALT水平(P＜0.01)，JMS低剂量组(0.0825g.kg-1.d-1)对ALT没有影响(P＞0.05)。中、高剂量组JMS对ccl4致损伤小鼠肝脏具有明显保护作用。见表9。

(2)JMS对小鼠胆红素水平影响

阳性药茵栀黄组、JMS高剂量组(0.33g.kg-1.d-1)可显著降低ANIT所致的小鼠血清胆红素升高(P＜0.01)。JMS中剂量组(0.165g.kg-1.d-1)低剂量组(0.0828g.kg-1.d-1)对小鼠血清SB无显著影响(P＞0.05)。高剂量组FGN对ANIT所致小鼠肝损伤具有保护作用(P＞0.05)见表10。

6.JMS利胆作用的评价。

Wistar大鼠60只，按体重随机分为6组，每组10只，设正常对照组、肝损伤模型组、优思弗组0.135g/kgX日及JMS高、中、低(0.6g、0.3g、0.15g/kg×日)三个剂量组。给药5次后，除正常对照组外，其它各组用4％ANIT油剂1.75ml/kg(70mg/kg)灌胃，造成大鼠胆汁淤积模型，中毒后继续给药。在造模型后48小时，采用复合麻醉(氯胺酮∶地西泮＝1∶1)麻醉大鼠，分离总胆管，插入胆汁收集管，收集4小时胆汁。计算每个时间段、每只动物、每100g体重胆汁流量。结果显示，JMS可使ANIT肝损伤大鼠4小时胆汁分泌量由模型组的1.38±0.58ml增加至3.19±0.36(高剂量)、2.52±0.52ml(中剂量)、2.05±0.47ml(高剂量)，提示JMS具有利胆作用。

实施例2

蕨麻原药材粉碎过40目筛，以45％乙醇浸润4小时以上，以70％-％乙醇回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩得浸膏，浸膏以20％-乙醇按1∶10比例充分混合，然后静置12小时以上，除去沉淀，上清液上大孔吸附树脂层析柱(树脂型号D-101)样品量按树脂∶生药量(1.5∶1)上柱子，以5-7倍量纯水洗脱弃除水洗液，以(3-5倍量)30％乙醇洗脱，弃除洗脱液，以(6-8倍量)60％-80％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得干燥浸膏粉(蕨麻活性部位)，余下，余下化合物蕨麻苷的分离、纯化方法参照实施例一。

实施例3

取蕨麻原药材粉碎过40目筛，以50％乙醇浸润4小时以上，60％-80％乙醇回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩得浸膏，浸膏以20％-45％乙醇按1∶20比例充分混合，然后静置12小时以上，除去沉淀，上清液上大孔吸附树脂柱(树脂型号D-101)样品量按树脂∶生药量(1.5∶1)上柱子，以5-7倍量纯水洗脱，弃除水洗液，以(5-7倍量)40-50％乙醇洗脱，弃除洗脱液，以(6-8倍量)60％-90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩除尽溶剂，得干燥浸膏粉(蕨麻活性部位)，余下化合物蕨麻苷的分离、纯化方法参照实施例一。

实施例4

取蕨麻原药材粉碎过40目筛，以50％乙醇浸润4小时以上，50％-60％乙醇回流提取二次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩得浸膏，浸膏以30％-50％乙醇按1∶25比例充分混合，然后静置12小时以上，除去沉淀，上清液上大孔吸附树脂柱(树脂型号D-101)样品量按树脂∶生药量(1.5∶1)上柱子，以5-7倍量纯水洗脱，弃除水洗液，以(5-7倍量)40％-50％乙醇洗脱，弃除洗脱液以(6-8倍量)55％85％乙醇洗脱，收集此洗脱液，减压浓缩，除尽溶剂，得干燥浸膏粉(活性部位)，余下化合物蕨麻苷的分离、纯化方法参照实施例一。

Claims

1.一种蕨麻苷化合物，其特征在于该化合物具有下列特征：

(1)化学结构式：

(2)中文化学名：2α，3β，19β-三羟基-12-烯-乌苏烷-28-羧酸-28-O-β-D-吡喃半乳糖苷·结晶水

(3)英文化学名：2α，3β，19β-trihydroxy-12-en-urs-28-oicacid-28-O-β-D-galactopyranesyl ester·H₂O

(4)分子式：C₃₆H₅₈O₁₀·H₂O

(5)分子量：650.848+18.015＝668.86。

2.一种如权利要求1所述的蕨麻苷化合物的分离纯化方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

取蕨麻原药材粉碎过20目筛，以70％乙醇浸润4-6小时，70％-95％乙醇回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，减压浓缩得浸膏，浸膏以浸膏∶水为1∶5的水溶液上大孔树脂柱，D-101型树脂；生药为1.5∶1，水洗脱以TCL监控终点，30-95％乙醇洗脱，以TCL监控终点，收集醇洗脱部分置真空干燥得蕨麻有效部位，取蕨麻有效部位以水溶解制成10％溶液，上硅胶柱进行VLC减压梯度柱层析，洗脱剂为CH₂CL₂∶CH₃OH为7∶3，分步收集洗脱液，减压浓缩，上硅胶柱常压层析以CH₂CL₂∶CH₃OH为20∶1的洗脱液，分步收集洗脱液，减压浓缩得蕨麻苷粗品纯度＜80％，粗品以甲醇制成10％溶液，上硅胶柱层析洗脱剂为石油醚∶丙酮为5∶2，得蕨麻苷粗品纯度＞85％；粗品通过HPLC制备色谱仪；流动相为CH₃OH∶H₂O为65∶35，分步收集洗脱液减压浓缩，再用石油醚、甲醇混合溶剂重结晶处理得蕨麻苷纯品纯度＞98％。

3.一种如权利要求1所述的蕨麻苷化合物在制备抗肝炎病毒药物中的应用。