CN1176102C - 三萜化合物及其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有抗肿瘤作用的结构式(I)的三萜化合物，其中R₁表示氢或C₁～C₈的酰基；R₂表示氢或羟基；R₃表示氢或CH₃；R₄表示氢或CH₃；R₅表示CH₃；R₆表示氢或C₁～C₈的烷基。本发明还涉及该化合物的制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及本发明化合物和药用组合物在治疗肿瘤方面的用途。

Description

三萜化合物及其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物

                          技术领域

本发明涉及三萜化合物及其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物，以及它们在抗肿瘤、抑制肿瘤生长的应用。

                          背景技术

肿瘤是当今世界最大的疑难病症之一，全世界每年有700万人发生肿瘤，500万人被肿瘤夺去生命，现肿瘤患者在1000万人以上。我国每年肿瘤发病人数约160万，全国每年死于肿瘤病的人数已达130万人，并且仍有上升趋势，其正在超过心血管疾病而成为人口死亡的第一原因。因此，世界各国都高度重视肿瘤的防治研究。

目前临床上使用的抗肿瘤药物大多对肿瘤细胞抑制的选择性不强、全身用药毒性较大、且多具有免疫抑制作用。因此，研究开发高效、低毒、新颖的抗肿瘤药物仍是一项极为紧迫而重要的全球性课题。

近年来，大量的临床和实验研究证明，中医药在肿瘤的防治和康复方面具有重要的作用。落新妇为虎耳草科植物落新妇Astilbe chinese(Maxim.)Franch.et Sav.的干燥根茎，广泛分布于我国南北各地区，资源十分丰富。民间用于治疗恶性肿瘤。经临床初步观察，其对各种恶性肿瘤如肝癌、胃癌和肺癌等都有较好的疗效，尤其在抑制肿瘤发展和延长生命方面有一定作用。体内抗肿瘤动物实验也证实落新妇具有较强的抗肿瘤活性。

                          发明内容

本发明的目的是提供一类具有抗肿瘤作用的三萜化合物。

本发明的另一个目的是提供从民间草药落新妇中提取分离三萜化合物的方法。

本发明的进一步目的是提供治疗肿瘤的药物组合物。

本发明的还有一个目的是提供上述化合物和组合物在制备治疗肿瘤的药物方面的用途。

本发明的三萜化合物包括从中草药落新妇中提取分离的落新妇三萜酸A、落新妇三萜酸B、落新妇三萜酸C、落新妇三萜酸D以及包含有这4种三萜化合物的混合物——落新妇总三萜，这4种落新妇三萜酸A、B、C、D均具有下式的化学结构式(I)，其中R为取代基

对于落新妇三萜酸A：式中R₁表示氢，R₂表示氢，R₃表示氢，R₄表示CH₃，R₅表示CH₃，R₆表示氢；

对于落新妇三萜酸B：式中R₁表示乙酰基，R₂表示氢，R₃表示氢，R₄表示CH₃，R₅表示CH₃，R₆表示氢；

对于落新妇三萜酸C：式中R₁表示氢，R₂表示氢，R₃表示CH₃，R₄表示氢，R₅表示CH₃，R₆表示氢。

对于落新妇三萜酸D：式中R₁表示氢，R₂表示羟基，R₃表示氢，R₄表示CH₃，R₅表示CH₃，R₆表示氢。

本发明的三萜化合物还包括上述三萜化合物落新妇三萜酸A、落新妇三萜酸B、落新妇三萜酸C、落新妇三萜酸D的衍生物，对于衍生物，化学结构式(I)中的R₁表示氢或C₁～C₈的酰基，R₂表示氢或羟基，R₃表示氢，R₄表示CH₃，R₅表示CH₃，R₆表示氢或C₁～C₈的烷基。

本发明提供的落新妇三萜酸A(Astilbotriterpenic acid A)、落新妇三萜酸B(Astilbotriterpenic acid B)、落新妇三萜酸C(Astilbotriterpenic acidC)、落新妇三萜酸D(Astilbotriterpenic acid D)以及包含有这4种三萜的混合物——落新妇总三萜，是从虎耳草科植物落新妇Astilbe chinese(Maxim.)Franch.et Sav.的干燥根茎中提取的，制备方法包括以下步骤：

a.将落新妇根茎粉碎后，以乙醇提取；

b.浓缩乙醇提取液，以水混悬，用有机溶剂萃取；

c.浓缩后的萃取液在硅胶或氧化铝柱中进行色谱分离，以甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、石油醚、苯或它们的混合物为洗脱剂；

d.硅胶薄层检查层析流份，具有相同斑点的流份合并，浓缩，分得得到落新妇总三萜；

e.落新妇总三萜再硅胶柱层析，以洗脱剂洗脱、分离，得到落新妇三萜酸A、落新妇三萜酸B、落新妇三萜酸C、落新妇三萜酸D。

上述步骤b中所说的有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯、氯仿。步骤e中所说的洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、石油醚、苯或它们的混合物。

以上述落新妇三萜酸A、落新妇三萜酸B、落新妇三萜酸C、落新妇三萜酸D为原料，按照化学领域常规的方法酰化，例如在溶剂如吡啶中用酸酐进行酰化，可得到三萜化合物酰化衍生物，其中R₁表示C₁～C₈酰基。

以上述落新妇三萜酸A、落新妇三萜酸B、落新妇三萜酸C、落新妇三萜酸D为原料，按照化学领域常规的方法酯化，可得到三萜化合物的酯化衍生物，其中R₆表示C₁～C₈的烷基。

本发明的药物组合物含有治疗有效量的上述结构式(I)的三萜化合物、混合物或衍生物为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

本发明的化合物和药物组合物可用于制备治疗肿瘤的药物。

上文所述药学上可接受的载体是指药学领域的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、海藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇等。另外换可以在组合物中加入其它辅料如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠、肠胃外或经皮给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊籍、丸剂、缓释微丸、固体分散体、包含物等，制成的液体制剂如混悬剂、乳剂、溶胶剂、糖浆剂、合剂、溶液剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性混悬剂、乳剂、脂质体、微囊、微球、毫微粒等。优先的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、微丸、栓剂和注射剂，特别优先特定部位靶向释放的制剂。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有活性成分占总重量比为0.1％～99.5％。最优选含有活性成分占总重量比为0.5％～95％。

本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者年龄、体重、所治疗的肿瘤种类和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～100mg/Kg体重，优选0.1～10mg/Kg体重。可以一次或多次施用。

试验表明，本发明的化合物及药物组合物有明显抗肿瘤和抑制肿瘤生长的作用。例如对人卵巢癌HO-8910细胞、人宫颈癌Hela细胞和人早幼粒白血病HL60细胞明显的抑制作用，并能诱导人卵巢癌HO-8910细胞的凋亡。动物试验中显示出显著治疗肿瘤作用。本发明人还发现结构式(I)化合物的毒性很小。

                          附图说明

图1是落新妇三萜酸A 40μg/ml作用48小时后HO-8910细胞荧光照片

图2是落新妇三萜酸A 20μg/ml作用48小时后HO-8910细胞荧光照片

图3是落新妇三萜酸A 10μg/ml作用48小时后HO-8910细胞荧光照片

图4是落新妇三萜酸A 5μg/ml作用48小时后HO-8910细胞荧光照片

图5是落新妇三萜酸A 2.5μg/ml作用48小时后HO-8910细胞荧光照片

图6是DMSO作用48小时后HO-8910细胞荧光照片。

                         具体实施方式

以下通过实例进一步说明本发明。

实施例1：落新妇三萜制备

制备落新妇总三萜

落新妇干燥根茎20kg粉碎后，以乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物。以水混悬，用石油醚萃取。石油醚部分进行硅胶柱层析，先以石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，用薄层层析检查层析流份，具有相同斑点的流份合并，浓缩，分得得到落新妇总三萜。

落新妇总三萜为红棕色粘稠浸膏。Lieberman-Burchard反应均呈阳性，示含三萜类化合物。

制备落新妇三萜酸A

落新妇干燥根茎20kg粉碎后，以乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物。以水混悬，用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分以进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯和甲醇进行梯度洗脱，用薄层层析检查层析流份，具有相同斑点的流份合并，浓缩，分得流份1、2、3、4、5、6、7、8、9，将其中流份5再经硅胶柱层析、以氯仿和乙酸乙酯洗脱分离、纯化，得到落新妇三萜酸A。

落新妇三萜酸A  白色针晶，mp 240.5-242.5℃，L-B反应阳性。IR(KBr)ν_max：3460，3420-2650，1710，1630cm^-1。HR-EI-MS：456.3594[C₃₀H₄₈O₃(M⁺)，calcd456.3603]。EI-MSm/z：456[M]⁺，438[M-H₂O]⁺，423[M-H₂O-CH₃]⁺，412[M-CO₂]397[M-COOH-CH₃]⁺，248[C₁₆H₂₄O₂]⁺，207[C₁₄H₂₃O]⁺，190[C₁₄H₂₂]⁺，175[C₁₃H₁₉]⁺.¹³CNMR、¹HNMR、¹H-¹H COSY和HMBC数据见表1。

表1  落新妇三萜酸A的¹³CNMR、¹HNMR、¹H，¹H-COSY和HMBC数据(CD₃OD)

Position      ¹³CNMR      ¹HNMR             H，H-COSY          HMBC

1             38.6(t)      1.65，m；1.69，m                  C-2，C-3，C-5，C-9，C-10，C-25

2             27.5(t)      1.68，m；2.03，m     C-3          C-1，C-3

3             79.4(d)      3.20，dd(5，14Hz)    C-2          C-2，C-4，C-24

4             38.67(s)

5             55.2(d)      0.69，d(13Hz)        C-6          C-4，C-6，C-10，C-25

6             18.2(t)      1.50，m；1.53，m     C-5          C-5，C-7，C-8，C-10

7             36.3(t)      1.65，m；1.22，m                  C-5，C-6，C-8，C-9，C-14，C-26

8             39.74(s)

9             47.2(d)      2.05，m                           C-8，C-10，C-11，C-12，C-13，C-25，C-26

10            37.1(s)

11            22.8(t)      1.95，m；1.08，m     C-12         C-9，C-10，C-12，C-13，C-25，C-26

12            126.2(d)     5.66，t(4.5Hz)       C-11         C-9，C-11，C-14，C-18

13            138.2(s)

14            55.8(s)

15            22.2(t)      1.73，m；2.03，m                  C-27

16            26.9(t)      1.66，m                           C-15，C-17，C-28

17            32.8(s)

18            49.0(d)      2.03，m                           C-13，C-19

19            43.9(t)      1.33，m；0.99，m                  C-13，C-17，C-18，C-20，C-21，C-30

20            31.1(s)

21            36.5(t)      1.14，m；1.22，m                  C-17，C-19，C-20，C-22

22            34.3(t)      0.99，m；1.08，m                  C-16，C-17，C-20，C-2

23            28.1(q)      0.97，s                           C-3，C-4，C-5，C-24

24            16.0(q)      0.78，s                           C-3，C-4，C-5，C-23

25     16.4(q)        0.96，s              C-1，C-5，C-9，C-10

26     18.0(q)        1.02，s              C-7，C-8，C-9，C-14

27     179.4(s)

28     28.2(q)        0.85，s              C-16，C-17，C-18，C-22

29     33.5(q)        0.82，s              C19，C-20，C-21，C-30

30     23.6(q)        0.84，s              C19，C-20，C-21，C-29

制备落新妇三萜酸B

落新妇干燥根茎20kg粉碎后，以乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物。以水混悬，用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分以进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯和甲醇进行梯度洗脱，用薄层层析检查层析流份，具有相同斑点的流份合并，浓缩，分得流份1、2、3、4、5、6、7、8、9，将其中流份6再经硅胶柱层析、以氯仿和乙酸乙酯洗脱分离、纯化，得到落新妇三萜酸B。

落新妇三萜酸B  白色针晶，mp：229-232℃，L-B反应阳性。IR(KBr)ν_max：3460，3420-2650，1710，1630cm^-1。HR-EI-MS：472.3553[C₃₀H₄₈O₄(M⁺)，calcd472.3553]。EI-MS m/z：472[M]⁺，454[M-H₂O]⁺，436[M-2H₂O]⁺，428[M-CO₂]⁺，413[M-H₂O-CO₂]⁺，248[C₁₆H₂₄O₂]⁺，224[C₁₄H₂₄O₂]⁺，223[C₁₄H₂₃O₂]⁺，206[C₁₄H₂₂O]⁺，191[C₁₃H₂₁O]⁺，180，123。¹³CNMR、¹HNMR、¹H-¹H COSY和HMBC数据见表2。

表2  落新妇三萜酸B的¹³CNMR、¹HNMR、¹H，¹H-COSY和HMBC数据(CDCl₃)

Position   ¹³CNMR     ¹HNMR               H，H-COSY             HMBC

1          41.5(t)     1.24，m；1.75，m                           C-2，C-3，C-5，C-10，C-25

2          28.5(t)     0.97，m；1.86，m        C-3H               C-1，C-3

3          78.4(d)     3.30，dd(5.5，14.5Hz)   C-2H               C-2，C-4，C-24

4          40.4(s)

5          56.1(d)     1.09，m                 C-6                C-3，C-4，C-6，C-10，C-25

6          67.5(t)     4.84(-H)                C-5，C-6OH，C-7H   C-5，C-7，C-8，C-10

                       5.69(-OH)               C-6H

7          45.1(t)     2.37，m；2.04，m        C-7H               C-5，C-6，C-8，C-9，C-14，C-26

8          39.6(s)

9     48.1(d)    2.91，t(9Hz)        C-11H          C-1，C-8，C-10，C-11，C-12，C-13，C-25，

                                                    C-26

10    37.3(s)

11    23.6(t)    1.80，m；2.25，m    C-9H，C-12H    C-9，C-10，C-12，C-13

12    125.9(d)   5.85，t(4.5Hz)      C-11H          C-9，C-11，C-14，C-18

13    138.1(s)                                      C-27

14    56.9(s)

15    23.1(t)    2.04，m；2.47，m                   C-13，C-14，C-27，C-28

16    28.5(t)    2.08，m；2.47，m                   C-15，C-17，C-28

17    33.5(s)

18    49.9(d)    2.19，m                            C-13，C-19

19    44.5(t)    1.36，m；1.79，m                   17，C-18，C-20，C-21，C-30

20    31.2(s)

21    37.1(t)    1.20，m；1.38，m                   C-17，C-19，C-20，C-22

22    34.8(t)    1.05，m；1.30，m                   C-16，C-17，C-20，C-2

23    28.7(q)    1.257，s                           C-3，C-4，C-5，C-24

24    18.1(q)    1.72，s                            C-3，C-4，C-5，C-23

25    18.0(q)    1.70，s                            C-1，C-5，C-9，C-10

26    20.4(q)    1.68，s                            C-7，C-9，C-14

27    178.8(s)

28    28.5(q)    1.01，s                            C-16，C-17，C-18，C-22

29    33.5(q)    0.72，s                            C19，C-20，C-21，C-30

30    23.8(q)    0.88，s                            C19，C-20，C-21，C-29

制备落新妇三萜酸C

落新妇干燥根茎20kg粉碎后，以乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物。以水混悬，用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分以进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯和甲醇进行梯度洗脱，用薄层层析检查层析流份，具有相同斑点的流份合并，浓缩，分得流份1、2、3、4、5、6、7、8、9，将其中流份7再经硅胶柱层析、以氯仿和乙酸乙酯洗脱分离、纯化，得到落新妇三萜酸C。

落新妇三萜酸C  白色针晶，mp 239-241℃，L-B反应阳性。IR(KBr)ν_max：3420-2650，1710，1630cm^-1。HR-EI-MS：456.3606[C₃₀H₄₈O₃(M⁺)，calcd456.3604]。EI-MS m/z：456[M]⁺，438[M-H₂O]⁺，423[M-H₂O-CH₃]⁺，411[M-COOH]⁺，395[M-COOH-OH]⁺，248[C₁₆H₂₄O₂]⁺，207[C₁₄H₂₃O]⁺，190[C₁₄H₂₂]⁺，175[C₁₃H₁₉]⁺.¹³CNMR、¹HNMR、¹H-¹H COSY和HMBC数据见表3。

表3  落新妇三萜酸C的¹³CNMR、  ¹HNMR、¹H，¹H-COSY和HMBC数据(CD₃OD)

Position  ¹³CNMR     ¹HNMR              H，H-COSY        HMBC

1         38.7(t)    1.07，m；1.70，m                      C-2，C-3，C-5，C-9，C-10，C-25

2         27.0(t)    1.65，m；2.03，m        C-3H          C-1，C-3

3         79.1(d)    3.21，dd(6.5，14Hz)     C-2H          C-2，C-4，C-24

4         38.6(s)

5         55.1(d)    0.71，d(14.5Hz)         C-6H          C-4，C-7，C-10，C-25

6         18.2(t)    1.56，m                 C-5H          C-5，C-7，C-8，

7         36.6(t)    1.15，m；1.67，m                      C-5，C-6，C-8，C-9，C-14，C-26

8         39.8(s)

9         46.8(d)    2.21，dd(6.5，14.5Hz)   C-11H         C-8，C-10，C-1 1，C-25，C-26

10        36.9(s)

11        22.7(t)    1.92，m；2.034，m       C-9H，C-12    C-8，C-9，C-10，C-12，C-13

12        128.5(d)   5.55，brs               C-11          C-9，C-11，C-14，C-18

13        133.2(s)

14        55.9(s)

15        22.4(t)    1.76，m；1.98，m        C-16H         C-8，C-16，C-27

16        28.9(t)    0.90，m；2.08，m        C-15H         C-15，C-17，C-18，C-28

17        33.7(s)

18        60.2(d)    1.34，m                               C-12，C-13，C-14.C-19，C-28

19        39.8(d)    0.862，m                              C-18，C-20，C-21，C-29

20        37.5(d)    0.852，m                              C-19，C-21，C-30

21        30.4(t)    1.24，m；1.34，m                      C-17，C-19，C-20，C-22，C-30

22        40.9(t)    1.18，m；1.41，m                      C-17，C-20，C-21，C-28

23    28.1(q)    0.96，s              C-3，C-4，C-5，C-24

24    15.7(q)    0.78，s              C-3，C-4，C-5，C-23

25    16.5(q)    0.96，s              C-1，C-5，C-9，C-10

26    18.2(q)    1.02，s              C-7，C-8，C-9，C-14

27    179.8(S)

28    29.0(q)    0.80，s              C-16，C-17，C-18，C-22

29    17.8(q)    0.79，s              C18，C-19，C-20

30    21.3(q)    0.86，s              C19，C-20，C-21

制备落新妇三萜酸D

落新妇干燥根茎20kg粉碎后，以乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物。以水混悬，用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部分以进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯和甲醇进行梯度洗脱，用薄层层析检查层析流份，具有相同斑点的流份合并，浓缩，分得流份1、2、3、4、5、6、7、8、9，将其中流份8再经硅胶柱层析、以氯仿和乙酸乙酯洗脱分离、纯化，得到落新妇三萜酸D。

落新妇三萜酸D    白色针晶，mp：235-237℃，L-B反应阳性。IR(KBr)ν_max：3420-2650，1710，1630cm^-1。HR-EI-MS：498.3705[C₃₂H₅₀O₄(M⁺)，calcd498.3709]；EI-MS m/z：498[M]⁺，480[M-H₂O]⁺，454[M-CO₂]⁺，438[M-CH₃COOH]⁺，423[M-CH₃COOH-CH₃]⁺，395[M-CH₃COOH-CH₃-CO₂]⁺，250[C₁₆H₂₆O₂]⁺，248[C₁₆H₂₄O₂]⁺，203[C₁₆H₂₄O₂-COOH]⁺，190[C₁₆H₂₆O₂-CH₃COOH]⁺，175[C₁₆H₂₆O₂-CH₃COOH-CH₃]⁺。¹³CNMR、¹HNMR、¹H-¹H COSY和HMBC数据见表4。

表4  落新妇三萜酸D的¹³CNMR、¹HNMR、¹H，¹H-COSY和HMBC数据(CDCl₃)

Position  ¹³CNMR    ¹HNMR                 H，H-COSY      HMBC

1         38.0(t)    1.65，m；1.69，m                      C-2，C-3，C-5，C-9，C-10，C-25

2         23.5(t)    1.67，m；1.98，m          C-3         C-1，C-3

3         80.8(d)    4.51，dd(6.25，14.3Hz)    C-2         C-2，C-4，C-24，C-1`

4         37.6(s)

5     55.1(d)    0.79，d(2.5Hz)          C-6       C-4，C-6，C-10，C-25

6     18.2(t)    1.30，m；1.47，m        C-5       C-5，C-7，C-8，C-10

7     36.3(t)    1.22，m；1.70，m                  C-5，C-6，C-8，C-9，C-14，C-26

8     39.9(s)

9     46.9(d)    2.12，m                           C-8，C-10，C-11，C-12，C-13，C-25，C-26

10    36.9(s)

11    22.7(t)    1.08，m；1.89，m        C-12      C-9，C-10，C-12，C-13，C-25，C-26

12    126.2(d)   5.70，dd(3，11.5Hz)     C-11      C-9，C-11，C-14，C-18

13    137.4(s)

14    55.7(s)

15    22.2(t)    1.71，m；2.00，m                  C-27

16    27.5(t)    1.71，m；2.10，m                  C-15，C-17，C-28

17    32.9(s)

18    49.2(d)    2.00，m                           C-12，C-13，C-19

19    43.8(t)    1.04，m；1.30，m                  -13，C-17，C-18，C-20，C-21，C-30

20    31.0(s)

21    36.5(t)    1.20，m；1.34，m                  C-17，C-19，C-20，C-22

22    34.3(t)    0.99，m；1.16，m                  C-16，C-17，C-20，C-2

23    28.1(q)    0.84，s                           C-3，C-4，C-5，C-24

24    16.5(q)    0.85，s                           C-3，C-4，C-5，C-23

25    16.8(q)    0.99，s                           C-1，C-5，C-9，C-10

26    18.1(q)    1.03，s                           C-7，C-8，C-9，C-14

27    180.7(s)

28    28.5(q)    0.84，s                           C-16，C-17，C-18，C-22

29    33.4(q)    0.82，s                           C-19，C-20，C-21，C-30

30    23.6(q)    0.84，s                           C-19，C-20，C-21，C-29

31    21.4(q)    2.06，s

32    171.3(s)   0.84，s

实施例2

静注乳剂：活性成分    10.0g

          注射用油    150.0g

    注射用大豆磷脂     12.0g

    泊洛沙姆F68        20.0g

制备方法：取活性成分10.0g加入150.0g注射用油中，边搅拌加热至70℃，作为油相；泊洛沙姆F68 20.0g及辅助表面活性剂适量加入800ml注射用水中.在70℃下将磷脂12g经高速搅匀混恳于其中，作为水相；将油相缓馒加入水相中，20000rpm下高速搅拌制得初乳，用注射用水加至1000ml后经过二步高压乳勾机，第1次压力为20MPa，策2次为40MPa，循环5次，镜检合格后灌装于1ml安死中充氮气，封口后流通蒸气灭菌30min。每支2ml，活性成分含量为20mg。

实施例3

片剂：活性成分         1.0g

      乳糖             18.7g

      玉米淀粉         5.0g

      硬脂酸镁         0.3g

制备方法：将活性成分、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，活性成分含量10mg。

实施例4

片剂：活性成分         1.0g

      乳糖             18.8g

      硬脂酸镁         0.2g

制备方法：将活性成分与乳糖、硬脂酸镁混合，过筛，装入硬胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量10mg。

实施例5 MTT法测定落新妇三萜酸A、B、C、D及落新妇总三萜对体外培养的肿瘤细胞的抑制作用

取处于指数生长期的人卵巢癌HO-8910细胞、人宫颈癌Hela细胞和人早幼粒白血病HL60细胞，加入适量Trypsin-EDTA液，使贴壁细胞脱落，用10ml含5％胎牛血清的RPMI1640培养液配成悬液。计数后用完全培养液稀释成5×10⁴个/ml的细胞悬液。取24孔板，每孔加上述细胞悬液1.0ml，放入培养箱48h。依次加入5个浓度的受试药物和DMSO，每个浓度4孔。在37℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱中培养48h。每孔加入浓度5mg/ml的MTT100μl，孵育48h，倾去各孔内液体，加入0.5mlDMSO，摇匀，每孔吸出0.1ml于96孔板，以酶标仪在550nm处测定各孔的OD值。重复3次试验。按下式计算细胞生长抑制率和用Bliss法计算IC₅₀。

落新妇三萜酸A、B、C、D及落新妇总三萜作用48hr对体外培养的人卵巢癌H0-8910细胞、人宫颈癌Hela细胞和人早幼粒白血病HL60细胞的抑制率和IC₅₀见表5～表9。落新妇三萜酸A、B、C、D对3种细胞株均有较强的体外抑制作用，最大抑制率在80％以上。

表5 落新妇总三萜作用48小时对对三种细胞株的抑制率(％)及IC₅₀

提取物              提取物浓度(ug/ml)            IC₅₀及95％可信限

         5       10      20      40      80          (μg/ml)

HO-8910  7.1     18.6    25.7    44.3    87.2       ＜62.5

Hela     11.4    17.5    53.4    87.4    89.9       23.1(13.1～40.8)

HL60     11.8    26.6    33.2    66.6    91.3       27.4(17.9～41.8)

表6  落新妇三萜酸A作用48hr对三种细胞株的抑制率(％)及IC₅₀(n＝3)

细胞株                     浓度(μg/ml)                            IC₅₀

名称     1.25       2.5        5          10         20           μg/ml

HO-8910  2.3±1.2   14.5±3.9  20.7±0.6  57.7±5.3  87.8±5.5    8.01±0.89

Hela     16.2±0.7  31.0±1.5  49.8±1.0  84.0±0.9  93.7±1.5    3.94±0.13

HL60     14.8±3.8  30.1±2.6  48.3±1.7  91.9±1.9  96.4±0.9    3.67±0.19

表7  落新妇三萜酸B作用48hr对三种细胞株的抑制率(％)及IC₅₀(n＝3)

细胞株                      浓度(μg/ml)                              IC₅₀

名称      2.5         5         10          20         40           (μg/ml)

HO-8910   0.3±0.6   1.5±0.6   12.1±3.7   33.5±3.6  85.2±1.8    22.24±0.57

Hela      4.5±0.9   17.7±2.7  30.2±5.1   71.9±3.2  93.1±4.5    11.91±1.02

HL60      1.1±1.1   5.2±4.8   13.8±3.1   29.5±8.6  79.7±13.5   24.24±3.82

表8落新妇三萜酸C作用48hr对三种细胞株的抑制率(％)及IC₅₀(n＝3)

细胞株                        浓度(μg/ml)                           IC₅₀

名称     1.25        2.5          5          10         20           μg/ml

HO-8910  0.7±0.6    3.6±1.7     7.6±3.7   69.5±6.2  91.9±5.6    8.71±1.83

Hela     15.6±2.1   25.7±2.1    63.4±2.8  79.0±1.6  92.7±2.1    4.05±0.33

HL60     2.9±2.8    11.6±9.2    32.8±7.2  71.3±9.7  90.0±3.0    7.22±0.96

表9落新妇三萜酸D作用48hr对三种细胞株的抑制率(％)及IC₅₀(n＝3)

细胞株                   浓度(μg/ml)                              IC₅₀

名称     2.5        5          10          20        40           (μg/ml)

HO-8910  2.7±1.6   11.1±4.1  24.9±8.3  76.3±6.6  86.7±3.6    12.90±1.92

Hela     27.7±2.2  37.0±3.7  65.5±1.9  80.1±1.5  94.6±1.1    6.11±0.38

HL60     2.3±2.0   19.2±1.4  37.0±4.2  73.2±8.4  94.4±1.1    12.55±1.27

实施例6  生长曲线法测定落新妇三萜酸A、B、C、D对人卵巢癌HO-8910细胞生长的抑制作用

取指数生长期的人卵巢癌HO-8910细胞用完全培养液稀释成3×10⁴个/ml的细胞悬液。取21只25ml培养瓶，每瓶加入5ml细胞悬液，分3组：溶剂对照组、给药组A(药物终浓度为1.0μg/ml)和给药组B(药物终浓度为4.0μg/ml)，每组7瓶。置培养箱中，分别培育1、2、3、4、5、6、7d后每组各取1瓶，用0.25％的胰蛋白酶液消化，使贴壁细胞脱落，用0.7ml完全培养液制成细胞悬液，再加0.3ml0.4％台盼蓝液，计数。重复3次试验。以每ml拒染的活细胞数的对数与时间作图，从图中读出生长饱和密度(N_s)，根据下列公式计算细胞的杀伤率和细胞倍增时。

药物对细胞的杀伤率(％)＝(N₀-N₀’)/N₀×100

细胞倍增时(TD)＝0.301t/(log N_t-log N0)

落新妇三萜酸A、B、C、D对人卵巢癌HO-8910细胞生长的影响结果见表10～表13。落新妇三萜酸A、B、C、D在4μg/ml浓度下均可显著使细胞倍增时间延长，细胞生长饱和密度减少，呈现一定的杀伤作用。

   表10  落新妇三萜酸A对人卵巢癌HO-8910细胞生长的影响

药物浓度    细胞倍增时(TD)   杀伤百分率    细胞生长饱和密度(N_s)

(μg/ml)      (h)              (％)            (×10⁶个/ml)

0            46.2               -                 2.14

1.5          47.8              7.75               1.82

4.0          71.4              33.17              0.83

    表11  落新妇三萜酸B对人卵巢癌HO-8910细胞生长的影响

药物浓度    细胞倍增时(TD)    杀伤百分率    细胞生长饱和密度(N_s)

(μg/ml)    (h)                  (％)          (×10⁶个/ml)

0            39.6                -                1.51

1.5          41.0               4.48              1.32

4.0          49.0               25.87             1.12

    表12  落新妇三萜酸C对人卵巢癌HO-8910细胞生长的影响

药物浓度    细胞倍增时(TD)      杀伤百分率    细胞生长饱和密度(N_s)

(μg/ml)        (h)                (％)         (×10⁶个/ml)

0              44.4                 -              1.51

1.5            47.4                10.97           1.35

4.0            60.2                30.97           1.05

    表13  落新妇三萜酸D对人卵巢癌HO-8910细胞生长的影响

药物浓度    细胞倍增时(TD)    杀伤百分率    细胞生长饱和密度(N_s)

(μg/ml)        (h)              (％)          (×10⁶个/ml)

0              51.1               -               1.44

1.5            54.5              6.67             1.32

4.0            59.6              15.84            0.87

实施例7  落新妇三萜酸A诱导人卵巢癌HO-8910细胞凋亡试验

取处于指数生长期的人卵巢癌HO-8910细胞，加入适量Trypsin-EDTA液，使贴壁细胞脱落，用10ml含5％胎牛血清的RPMI1640培养液配成悬液。计数后用完全培养液稀释成4×10⁴个/ml的细胞悬液。取24孔板，每孔加上述细胞悬液1.0ml，放入培养箱48小时。依次加入不同浓度的落新妇三萜酸A 10μl，使终浓度分别为40、20、10、5、2.5μg/ml和DMSO，每个浓度4孔。培养48小时后每孔加吖啶橙(100μg/ml)40μl，温育10分钟后，吸去培养液，在荧光显微镜下观察。

结果表明，浓度分别为5、10、20、40μg/ml的落新妇三萜酸A作用48小时，在相差显微镜下观察，可见人卵巢癌细胞HO-8910核裂解、核固缩、出现凋亡小体、细胞出泡、贴附能力下降等典型的细胞凋亡特征，凋亡细胞比例呈浓度依赖关系，采用丫啶橙染色法，在荧光显微镜下观察，可见致密浓染的黄绿色荧光(见图1～6)。说明落新妇三萜酸A可诱导HO-8910细胞出现凋亡。

实施例8 落新妇三萜酸A的体内抗肿瘤作用

分别将小鼠肉瘤S₁₈₀和小鼠肝癌H₂₂肿瘤细胞悬液接种于NIH种小鼠右腋下，每种肿瘤接种120只小鼠，雌雄各半。采用灌胃和肌内注射2种给药途径，每种给药途径60只小鼠随机分成五组，分别为阳性对照环磷酰胺50mg/kg组、落新妇三萜酸A高剂量组(80mg/kg，ig)、中剂量组(40mg/kg，ig)、低剂量组(20mg/kg，ig)及溶剂对照组(0.25％CMC-Na溶液)。连续给药9天，于第10天剖杀小鼠，取出肿瘤组织称重，计算抑瘤率。

结果表明：落新妇三萜酸A对S₁₈₀肉瘤和小鼠H₂₂肝癌均具有较好的治疗作用，灌胃给以落新妇三萜酸A 20.0、40.0、80.0mg/kg对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑瘤率分别达到了11.18％、24.34％和38.16％，对小鼠H₂₂肝癌的抑瘤率分别达到了27.50％、18.00％和58.00％(见表14、15)。说明落新妇三萜酸A具有明显体内抗肿瘤作用。

表14  灌胃给药落新妇三萜酸A对小鼠S180肉瘤的治疗作用

组别       剂量    给药    动物数    肿瘤重量        抑瘤率

          (mg/kg)  途径    (只)          (g)          (％)

对照组             im       10        1.52±0.57

SUN1       80.0    ig       10        0.94±0.55     38.16

           40.0    ig       10        1.15±0.56     24.34

           20.0    ig       10        1.35±0.78     11.18

环磷酰胺   50.0    im       10        0.83±0.25^**  45.39

^**P＜0.01，vs对照组，t检验

     表15  灌胃给药落新妇三萜酸A对小鼠H22肝癌的治疗作用

组别    剂量      给药    动物数    肿瘤重量     抑瘤率

       (mg/kg)    途径    (只)        (g)         (％)

对照组             im      10      2.00±0.49      -

SUN1      80.0     ig      10      0.84±0.28^**  58.00

          40.0     ig      10      1.64±0.57     18.00

          20.0     ig      10      1.45±0.48     27.50

环磷酰胺  50.0     im      10      1.06±0.50^**  47.00

^**P＜0.01，vs对照组，t检验

Claims (10)

1、三萜化合物，其特征是从中草药落新妇中提取分离的落新妇三萜酸A、落新妇三萜酸B、落新妇三萜酸C和落新妇三萜酸D，落新妇三萜酸A、B、C、D均具有下式的化学结构式(I)，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆为取代基

对于落新妇三萜酸A：式中R₁表示氢，R₂表示氢，R₃表示氢，R₄表示甲基，R₅表示甲基，R₆表示氢；

对于落新妇三萜酸B：式中R₁表示乙酰基，R₂表示氢，R₃表示氢，R₄表示甲基，R₅表示甲基，R₆表示氢；

对于落新妇三萜酸C：式中R₁表示氢，R₂表示氢，R₃表示甲基，R₄表示氢，R₅表示甲基，R₆表示氢；

对于落新妇三萜酸D：式中R₁表示氢，R₂表示羟基，R₃表示氢，R₄表示甲基，R₅表示甲基，R₆表示氢。

2、权利要求1所述的落新妇三萜酸A、落新妇三萜酸B、落新妇三萜酸C和落新妇三萜酸D的衍生物，其中R₁表示C₁～C₈的酰基，R₆表示C₁～C₈的烷基，R₂、R₃、R₄、R₅为权利要求1所定义。

3、制备落新妇总三萜以及权利要求1中涉及的落新妇三萜酸A、落新妇三萜酸B、落新妇三萜酸C、落新妇三萜酸D的方法，该方法包括以下步骤：

a.将落新妇根茎粉碎后，以乙醇提取；

b.浓缩乙醇提取液，以水混悬，用石油醚萃取；

c.浓缩后的萃取液在硅胶或氧化铝柱中进行色谱分离，以石油醚与乙酸乙酯为洗脱剂；

d.硅胶薄层检查层析流份，具有相同斑点的流份合并，浓缩，得到落新妇总三萜；

e.落新妇总三萜再硅胶柱层析，以乙酸乙酯和甲醇或氯仿和乙酸乙酯洗脱、分离，得到落新妇三萜酸A、落新妇三萜酸B、落新妇三萜酸C、落新妇三萜酸D。

4.用于治疗肿瘤的药物组合物，其中包含治疗有效量的权利要求1所述的落新妇三萜酸A、落新妇三萜酸B、落新妇三萜酸C和落新妇三萜酸D和药学上可接受的载体。

5.用于治疗肿瘤的药物组合物，其中包含治疗有效量的用权利要求3的方法制备得到的落新妇总三萜和药学上可接受的载体。

6.用于治疗肿瘤的药物组合物，其中包含治疗有效量的权利要求2所述的落新妇三萜酸A、落新妇三萜酸B、落新妇三萜酸C和落新妇三萜酸D的衍生物和药学上可接受的载体。

7.根据权利要求4、5、6所述的药物组合物，其特征在于活性成分占总重量的0.1％～99.5％。

8、根据权利要求1的化合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

9、根据权利要求2的衍生物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

10、根据权利要求3的方法制备得到的落新妇总三萜在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

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