CN1275915A - 具有免疫刺激和转移抑制功能的植物性发酵物质 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有免疫刺激和转移抑制功能的发酵干燥植物性物质、含后者的药用组合物、生产方法以及上述干燥物质在生产饮食添加剂与具有免疫刺激转移抑制功能的药用组合物中的应用。根据本发明的物质可通过Saccharomyces cerevisiae存在下在液体介质中发酵麦芽和干燥发酵液得到。
Description
本发明涉及具有免疫刺激和转移抑制功能的、经发酵和干燥的植物性物质，以及含有该物质的药用组合物，还涉及制备该物质的方法以及生产免疫刺激和，尤其是，转移抑制药用组合物时上述干燥植物性物质作为饮食添加剂的应用。
治疗肿瘤的一个主要目标是抑制转移，因为由于细胞的恶性生长而导致的原发性肿瘤可能通过转移扩散到邻近细胞和器官并导致后来的继发性肿瘤，继发性肿瘤不能通过外科手段除去并且可能对化学疗法具有抗性。
研究人员越来越将注意集中于发展免疫调节物质，对天然来源的物质-主要是植物来源的物质-进行了深入的研究。众所周知，具有醌结构的化合物扮演着重要的生物学角色。在植物中发现了几种醌衍生物，如泛醌、质体醌、甲基萘醌，它们在光合作用中起作用，还在脊椎动物，也因此包括人，的细胞呼吸系统中以及血液凝集中起作用。几种苯醌衍生物还被用作药物用途。阿霉素、道诺霉素和丝裂霉素C.是具有细胞生长抑制功能的醌衍生物，而其它苯醌和氢醌具有抗微生物效应，是适于治疗细菌感染的抗生素如Tetran-B、Metacyclin和Doxycyclin的活性成分。
文献报道2，6-二甲氧基-对-苯醌(2，6-DMBQ)和2-甲氧基-对-苯醌(2-MBQ)具有杀真菌和抑制细菌生长的效应，它们还对恶性肿瘤细胞具有细胞毒性。〔Int.J.Quant.Chem.：Quant.Biol.Symp.7.. 217-222(1980)，9，.27-30(1982)和 12，.257-261(1985)；Phytochemistry 27，.225(1971)和J.Agric.Food Chem.39，.266(1991)〕。有文献表明2，6-二甲氧基-对-苯醌和抗坏血酸的混合物抑制小鼠中Ehrlich ascites肿瘤细胞的生长。〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81.，2088-2091(1984)和82。1439-1442(1985)〕。2，6-二甲氧基-对-苯醌和2-甲氧基-对-苯醌以在几种植物中发现并分离〔Magy.Kem.Folyorat 102/7，.320-325(1996)〕。在小麦(Tricitumvulgaris)中，更准确地说在麦芽中，发现这两种化合物大量地以糖苷的形式存在。这些化合物被从用酵母发酵的麦芽中分离出并进行鉴定以确定加入麦芽的面包质量腐坏的程度。〔Helv.Him Acta 33.，433(1950)；J.Chem Soc.London 1952，4821-4823〕。
根据文献在麦芽中2-MBQ的量大约为重量的0.05％，2，6-DMBQ为重量的0.01％(为糖苷)。醌，尤其是甲氧基取代-对-苯醌是活泼的而它们的氢醌-糖苷则更为稳定和惰性，这解释了醌作为糖苷的存在。
在我们关于麦芽发酵的研究中我们得出了这样的结论：从用面包酵母(Saccharomices cerevisiae)发酵麦芽时产生的发酵液体得到的干燥抽提物具有惊人的免疫刺激和转移抑制效应，并且它可成功地被用作免疫刺激和转移抑制药用组合物中的活性物质。
这个发现是惊人的，因为尽管有文献报道〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80.，129(1983)〕2，6-DMBQ和抗坏血酸的混合物抑制Ehrlichascites肿瘤细胞-它们以适用于定量分析肿瘤生长和研究它们的生化功能而著名-本发明中描述的除了未鉴定成分外还含有2，6-DMBQ和2-MBQ的上述抽提物被证明对这些原发性肿瘤细胞没有作用，纵然与抗坏血酸联用时也是如此。该抽提物作用于所有的原发性肿瘤细胞，并且被证明只在治疗转移时才非常有效。对原发性肿瘤以及从原发性肿瘤发展而来的转移的治疗方面之间在本质上各不相同，所以对研究人员而言，含有已知在原发性肿瘤治疗中有效，但其化学成分还未完全清楚的组分的植物抽提物具有免疫刺激和转移抑制效应这一点并非不证自明〔Cancer Principles and Practice of Oncology，Vol 1.4th edition.J.B.Lippicott Company.Philadelphia，1993〕。
因此本发明关系到一种具有免疫刺激和转移抑制功能的、经发酵和干燥的植物物质，该物质可通过在液体介质中用面包酵母发酵麦芽，过滤发酵液除去细胞并干燥上述液体而得到。
本发明还关系到活性物质包括本发明中描述的发酵干燥植物性物质的免疫刺激和转移抑制药用组合物。
本发明还关系到上述发酵干燥植物性物质在免疫刺激和转移抑制药用组合物生产中的应用。
本发明还关系到用本发明描述的药用组合物刺激免疫系统和抑制转移而治疗哺乳动物的方法。
本发明进而关系到一种含有本发明中描述的发酵干燥植物性物质和麦芽糖糊精的食品添加剂。
根据本发明发酵干燥植物性物质已在其2，6-DMBQ含量的基础上得以鉴定和检测。我们愿意在此强调通过可利用的方法完全鉴定抽提物的化学成分是不可能的，所以全部数据都是以2，6-DMBQ为基础的。
麦芽为面粉加工的副产品并可大量得到，磨成粉的脱脂麦芽或原始麦芽被证明适用于生产本发明中的发酵干燥植物性物质。使用脱脂的麦芽并没有特别的优势。发酵用面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行。这种酵母可由商业途径获得。发酵周期约为10-24小时，优选为15-20小时或约18小时。发酵温度约为25-35℃，优选约为30℃。麦芽和酵母的重量比为4∶1到2∶1，优选约为3∶1，干物质与水的比例为1∶6-1∶12，优选约为1∶9。
发酵-实验室规模-可通过在玻璃发酵罐中加入新鲜研磨的麦芽和酵母的水悬液，然后搅拌和摇晃混合物而实现。发酵过的液体容易起泡沫。
发酵后混合物2000-4500转/分钟，优选约3000转/分钟离心5-15分钟。上清煮沸冷却后以适当的方式干燥，例如通过冻干或喷雾干燥。
这种产物，一种红褐色的粉末，是根据本发明的物质。由于其吸湿特性，有必要在密闭容器中低温保存直至进一步使用。得到的干燥物质的2，6-DMBQ含量为0.4mg/g。在大规模发酵(例如，4立方米)时应进行连续通气，例如0.5L空气/L发酵液/分钟，以及缓慢搅拌。发酵时间约为18小时。为了防止泡沫形成可使用通常的添加剂-使用向日葵油是优选的。在发酵过程结束时通气和搅拌被中断，发酵液从麦芽-酵母悬浮液中以常规手段，如先用螺杆倾注器(screw decanter)，然后用分离装置(separator)和压力过滤装置(filter press)，分离出。如果有必要可加入过滤辅助物质。每立方米发酵液使用5-10kg过滤珍珠岩是合适的。发酵液被过滤清澈，过滤效果用显微镜检查。经过滤的发酵液基本上不含有细胞，这意味着每10个视野的酵母细胞少于1个。得到干物质占重量比约1.5％的发酵液在真空浓缩器中蒸发，优选在40-50℃进行，结束真空浓缩后在大气压下沸腾约15分钟。这降低了有害酶的活性。然后混合物利用喷雾干燥法，例如在旋转喷雾装置中，进行干燥。如果利用了上述的发酵方法那么得到的发酵干燥植物性物质的2，6-DMBQ的含量为0.12-0.52mg/g干物质，2-MBQ的含量为0.05-0.28mg/g干物质，它们的含量依赖于所使用麦芽的苯醌含量。
由于终产物是吸湿性的所以为了增强喷雾干燥以及终产物利用的效力可在喷雾时加入一种常用添加剂，例如麦芽糖糊精、阿拉伯树胶、瓜尔豆树胶、黄原胶、蝗虫豆粉(locust bean flour)等等。优选地使用麦芽糖糊精。适当的方法是测定真空浓缩器中蒸发的混合物的干物质含量，沸腾，加入大量麦芽糖糊精使混合物中的干物质含量大约达到重量的30％。恰当的方法是用热水溶解麦芽糖糊精冷却后加入浓缩混合物。干燥后终产物-一种粉末-按重量计算含60％的发酵干燥植物性物质和40％的麦芽糖糊精。
得到的物质的稳定性可通过检测2，6-DMBQ浓度的变化验证。定量分析可用HPLC进行。通过以上描述的方法得到的粉末在室温下3年内稳定。根据本发明的发酵干燥植物性物质可用作免疫刺激和转移抑制药用组合物的活性物质。除了上述活性物质外上述药用组合物还可含有抗坏血酸或其它细胞生长抑制物质。
发酵干燥植物性物质可被加工成用于口服施用或非肠道施用的常见固态或液态药用组合物。在生产药用组合物时应考虑发酵干燥植物性物质的吸湿特性。恰当的形式为将活性物质隔离空气中的湿气的胶囊。
生产药用组合物时可使用制药实践中常用的辅助性物质。由于这些物质和它们可能的用途在制药文献中有详尽描述，选择和制备适当的形式是一种常规作业。有效物质的一次剂量可在很大的范围内浮动，这依赖于病人的状态。合适剂量的选择永远是医生的职责。通常如果剂量在0.001-100g，优选地0.01-50g，更优选地0.1-40g每千克体重，例如在0.1-10g、1-25或10-30克时可达到合适的效果。
根据本发明的发酵干燥植物性物质也可与抗坏血酸(维生素C)混合。根据我们的实验抗坏血酸可增强本发明的物质的转移抑制效应。发酵干燥植物性物质与抗坏血酸的重量比可以是，例如，10∶1-1∶1，优选为6∶1-2∶1，更优选为3∶1，4∶1或5∶1。
本发明还关系到用根据本发明的发酵干燥植物性物质进行免疫刺激和/或转移抑制治疗。治疗的要点是给病人有效剂量的发酵干燥植物性物质。
发酵干燥植物性物质也可用作哺乳动物的饮食添加剂。在这种情况下优选使用含麦芽糖糊精以及食品工业中常用的辅助物质，如，芳香剂、甜味剂、色素等等，的混合物，饮食补充的生产可以为，例如，在液压床(fluid bed)上将含60％重量干物质和40％重量麦芽糖糊精加芳香物质和甜味剂的混合物制成粒状，然后将这种颗粒装到，如，袋子里。
附图描述如下：
图1 HPLC测量2，6 DMBQ的标准图
图2上述物质氯仿抽提物的HPLC层析图
图3上述物质乙醇抽提物的HPLC层析图
图4不同浓度冻干物存在下在置入后第60和第90分钟B16肿瘤细胞的结合(每个数值代表通过分光光度法测量的8次平行实验的平均值±标准差)
图5开始处理24小时和48小时后不同剂量冻干物对B16细胞增殖的影响(每个数值代表通过分光光度法测量的8次平行实验的平均值±标准差)。
图6在不同剂量冻干物的存在下开始处理24小时后人A2058黑色素瘤的发展。培养物的评测是在蛋白(SRB)和脱氢酶活性(MTT)的基础上通过分光光度法平行测量进行的(每个数值代表8次平行实验的平均值±标准差)。
图7用不同剂量冻干物处理A2058人黑色素瘤体外培养物后调亡细胞的定量。
以下的例子是用于示明根据本发明的发酵干燥植物性物质的生产和药用效果。
实施例1.
实验室规模的麦芽发酵
往100g磨成粉的新鲜麦芽(根据Hungarian standard MSZ-081361-80)中加入1000ml饮用水和33.3g酵母(Saccharomycescerevisiae)的悬液。该混合物在振荡器上30℃振荡18小时。在此期间发酵液产生许多泡沫并达到其初始体积的三倍。发酵后混合物在3000/min离心15min。经过沸腾和冷却后上清通过冻干而干燥。得到的冻干物质保存在冰箱里(-10℃)直至进一步使用。得到的冻干物的2，6 DMBQ的含量为0.4mg/g干物质(0.04％重量)。
实施例2
大规模的麦芽发酵
将300kg磨成粉的麦芽(根据Hungarian standard)和100kg的酵母置入5立方米的发酵罐内，加入饮用水直至体积达到4000l。发酵时间为18小时，在此期间进行连续通气(0.5l气/l发酵液/分钟)和缓慢搅拌(30转/分钟)。为了抑制泡沫生成往混合物中加入1l向日葵油/立方米。终止发酵通气和搅拌后，首先在一个螺杆倾注器中分离发酵液，然后在分离器中，最后在带编织滤膜的压力过滤器中分离。加入10kg辅助物过滤用珍珠岩/立方米。发酵液被过滤清澈，清澈度用显微镜检查。经过滤的发酵液基本上不含有细胞，这意味着每10个视野的酵母细胞少于1个。得到的干燥物质约占重量1.5％的发酵液在真空浓缩装置中在40-50℃进行蒸发。结束真空浓缩后在大气压下沸腾约15分钟。然后确定溶液中的干物质含量，加入麦芽糖糊精-先用热水溶解然后冷却-使干物质含量占溶液重量的30％。此后该溶液在剪切喷嘴旋转喷雾干燥装置(shear nozzle rotating spray drier)中进行喷雾干燥，其中流出空气的温度为90℃。得到的终产物-一种粉末-中根据本发明的发酵植物性物质含量为重量的60％，麦芽糖糊精含量为重量的40％。2，6-DMBQ的含量-根据下面实施例中描述的方法用HPLC测定-为0.4mg/g干物质。
实施例3
根据本发明物质的特征描述
可用两种方法描述根据本发明物质的特征，即通过确定2，6 DMBQ含量或通过所谓的指纹色谱(fingerprint chromatogram)。在两种情况下都使用了HPLC。
对实施例1中描述的方法和实施例2中描述的方法得到的物质都进行了分析，两种情况下的结果相同。
A. 苯醌衍生物的定量和定性分析
样品制备
分析之前有必要提高冻干物中的苯醌浓度。为了达到此目的将冻干物用蒸馏水稀释至初始浓度(干物质含量为重量的1％)-(0.5g冻干物.50ml蒸馏水)。溶液用3×25ml氯仿抽提3次。用无水硫酸钠除去氯仿相中残留的水分。经过滤后氯仿相被蒸发，往剩余物中加入氯仿使总体积达到5ml。该样品在HPLC分析时被注射上样。
用HPLC方法进行苯醌衍生物的定性和定量分析。
HPLC方法的描述
使用的HPLC设备由Beckman model 114 M泵、LaborMim紫外灯连同Merk-Hitachi-DAD mod.4500 diode array探测器和Water 740型积分器单元组成。测量用的是Chromsil C18(250×4mm)10μ层析柱。UV探测在290nm进行，流速为2ml/min。使用的洗脱液的成分为：Na2HPO425mmol.NaH2PO4 25mmol，Na2EDTA 25mmol，NH2OH HCl 20mmol，10体积％甲醇，pH＝6.05。利用上述的方法分析出了三种不同的苯醌和氢醌。这些化合物的滞留时间之间只有很小的差别。经过降低洗脱洗的强度(有机相降到10％)可极大地增强选择性。对滞留数据的分析表明对-苯醌显示出比相应氢醌更长的滞留，并且滞留时间随着甲氧基的增加而增加。所有三种标准的浓度都为0.1mg/ml。表2示明标准的滞留时间(tR)和容量因子(K’)的数据。测量的目的是检测和定量定义2，6-二甲氧基-对-苯醌，所以在下文还将详细讨论此部分。检验了以上详细描述的方法是否适于定量分析2，6-二甲氧基-对-苯醌。所使用的标准图见图1。结果为一直线，相关性常数为0.99。还检验了该方法是否可重复，每个样品进行了三次平行测量并计算了结果的离散度。表1示明了在六个月内对样品测量的平行结果和它们之间的离散度。我们的结果表明该测量方法适于精确可重复地测量2，6-二甲氧基-对-苯醌。
| 日期 | 2，6-DMBQ含量(mg/50g样品) | (σ％) | ||
| 04.27 | 3.45 | 3.54 | 3.66 | 0.08-2 |
| 04.28 | 3.27 | 3.68 | 3.31 | 0.18-5 |
| 05.10 | 1.56 | 1.49 | 1.48 | 0.03-1.9 |
| 05.10 | 3.65 | 3.42 | 0.12-3 | |
| 06.08 | 3.00 | 2.98 | 2.86 | 0.06-2 |
| 06.09 | 2.92 | 3.06 | 2.87 | 0.08-2.3 |
| 06.10 | 3.34 | 3.23 | 3.36 | 0.05-1.5 |
表1
2，6-DMBQ定性分析的平行数值和离散度结果
| 标准 | tR | k’ |
| 2，6-DMBQ | 13.4 | 5.0 |
| 2，6-DMBQ | 5.1 | 1.2 |
| 2，-MBQ | 8.5 | 2.7 |
表2
接受检测物质的持留时间(tR)和容量因子(k’)
图2示明如上文描述的方法制备的氯仿样品的HPLC层析图谱。该层析图谱示明具有2，6-DMBQ特征的单一峰。2，6-DMBQ含量的测定是建立在后者的基础上的。
B. 指纹色谱
样品制备
将50ml 96％体积比的乙醇加入到5g喷雾干燥物质中(按实施例2中的描述制备)。混合物50℃ 200/min摇晃30分钟。此后将混合物过滤，蒸干然后将剩余的物质溶于10ml甲醇中。过滤后的溶液注射上样到层析柱。
HPLC方法
使用的HPLC设备、层析柱、和条件如上文描述。但洗脱液的组分如下：Na2HPO4 1.25mmol.NaH2PO4 1.25mmol，Na2EDTA 1.25mmol，NH2OHHCl 2.50mmol，5体积％甲醇。
图3示明了HPLC层析图谱的结果。结果表明在这样的条件下分离出两个特征峰，一个在4.7分钟(5)另一个在5.8分钟(6)。在滞留时间7.3和7.7分钟两个峰(7，8)彼此紧挨着出现，这两个峰不能完全分开。一个强度较小的峰在9.8分钟出现(9)，随后是一个特征的强峰(11)在13.1分钟出现。在15分钟出现一个较小的峰(12)，另一个强峰(14)在18分钟出现。在21.8分钟图谱显示一个较小的峰(15)，在31分钟出现一个较平缓的峰，含几种物质。
C. 稳定性实验
根据本发明物质的分解是通过检测2，6-二甲氧基-对-苯醌浓度的变化进行的。我们在3个不同的温度(室温20℃、40℃和60℃)下进行储存实验。冻干物-约1g-储存在气密的试管中。实验的持续时间为8个星期。每星期对三个不同储存温度系列的样品进行三次平行实验。苯醌衍生物的定量分析通过HPLC进行。
实验表明根据本发明的干燥物质甚至在室温储存3年后仍然保持稳定，即2，6 DMBQ保持不变。同时该物质在40℃不稳定-2，6 DMBQ在几个星期内分解，并且在60℃ 2，6 DMBQ含量在几天内迅速降低。
在两个系列的实验中也研究了2-甲氧基-对-苯醌的分解。这种化合物比2，6-二甲氧基-对-苯醌更不稳定，样品在40℃或60℃储存一个星期后即不能探测到它的存在。而在室温这种化合物的浓度也保持不变。
实施例4
效力实验
测试了按实施例1所描述的方法制备的冻干物和按实施例2所描述的方法制备的喷雾干燥物质的效力。使用了2，6 DMBQ含量为0.4mg/g干燥物质、HPLC曲线如图2示明的干燥物质作为标准。两种物质给出相同的结果-所以根据本发明的物质将进而被简单地称为冻干物。下文将讨论这种冻干物的生物学和毒理学实验结果，重点强调免疫重建(immue reconstitution)和肿瘤生长以及转移抑制效应。
I.肿瘤生长和转移抑制效应(体内实验)
以下生长于小鼠或大鼠中的可注射肿瘤类型用于测试：Lewis肺肿瘤(小鼠肺癌)的高转移形成变株(3LL-HH)、B16小鼠黑素瘤和HCR-25人结肠肿瘤异种移植物。
3LL-HH(LLT-HH)和B16肿瘤在C57B1/6近亲交配系小鼠中维持。HCR-25异种移植物注射入预先通过胸腺切除术和全身辐射进行免疫抑制的CBA/CA小鼠中。3LL-HH和HCR-25肿瘤的肿瘤细胞被移植到脾脏而B16黑素瘤的肿瘤细胞被移植到左下肢的肌肉中。注射HCR-25肿瘤的治疗组和对照组在肿瘤移植后21天进行脾脏切除术。
用根据本发明的冻干物进行的治疗在注射肿瘤后24小时开始。日剂量为3g/kg体重，以0.6g/ml水悬浮液的形式通过胃饲管(stomachprobe)从口腔施用。
在3LL-HH肿瘤的实验中测试在移植后14天结束。B16肿瘤在移植后21天，HCR-25肿瘤在移植后51天，通过将麻醉的动物放血致死而结束。
表3，4和5总结了测试的结果。
P＜0.01每组含10只动物
| 处理 | 注射的细胞数 | 肝脏转移数 |
| 对照 | 3×104 | 104.0±28.2 |
| 冻干物 | 3×104 | 19.8±16.4* |
表3.
脾脏注射3LL-HH小鼠肺癌时
根据本发明的冻干物对肝脏转移数的治疗效果
| 治疗 | 生长肿瘤的脾脏重量(g) | 肝脏转移数 |
| 对照，未进行脾脏切除 | 1.02±0.59 | 42.0±25.8 |
| 冻干物，未进行脾脏切除 | 0.62±0.47 | 19.5±19.0 |
| 对照，进行脾脏切除 | 0.10±0.02 | 19.1±13.5 |
| *冻干物，进行脾脏切除 | 0.08±0.02 | 10.6±11.6 |
*脾脏切除术在脾脏注射肿瘤后21天进行
每组合12只动物
表4
HCR-25人结肠癌注射入免疫抑制的CBA/CA小鼠脾脏后51天根据本发明的冻干物对肝脏转移数的治疗效果
| 治疗 | 生长肿瘤的肢体的重量(平均) | 肺转移数(平均) |
| 对照 | 7.6±0.43 | 42.4±10.2 |
| 冻干物 | 7.2±0.38 | 6.2±3.7* |
*P＜0.01
每组含10只动物
表5.
B16黑素瘤肢端肌肉注射后21天根据本发明的冻干物对注射肿瘤的肢体重量以及肺转移数的治疗效果
上述结果表明当3LL-HH肿瘤注射进脾脏时用根据本发明的冻干物处理显著-71％-降低了肺转移数。(表3)
在HCR-25人结肠癌实验中50天的治疗同时降低了生长肿瘤的脾脏的重量以及肝脏转移数。在脾脏切除组和非脾脏切除组与对照相比转移数都降低了50％。(表4)
在肌肉注射黑素瘤实验中，肌肉中生长的肿瘤的重量并未由于处理而改变，但肺转移数的降低非常显著，与对照组相比降低了85％(表5)
II体外测试
上述测试明确表明根据本发明的冻干物能显著地降低恶性肿瘤的转移，还检测了该产品对转移形成不同时期的疗效。转移的形成由几个时期组成，其中除了原发性肿瘤细胞的增殖和调亡活性外，肿瘤细胞的粘附能力和组织抗肿瘤细胞的保护机制也起作用。在体外测试中研究了冻干物对细胞增殖、调亡与粘附的效应。
由于相当一部分的体内测试是在B16小鼠黑素瘤细胞上进行的，所以首先用此种细胞测试冻干物。
1.粘附测试
肿瘤细胞的粘附是在96孔板上进行的。冻干物的剂量为300，3000，和30000μg/ml。使用的是不含血清和含10％FCS的RPMI培养基。在常规环境下温育10、30、60、90和120分钟后测试了粘附性。测试是在SRB检测的基础上通过比色法进行的(Mossmann.T.；J.Immunol.Neth.65，55-63/1983)。该检测是基于硫氰酸盐B对培养物中总蛋白的显色进行的，在分光光度计上570nm读吸收值。图4只显示了两个时间点，但足以充分代表冻干物的效力。如果冻干物的剂量是3000μg/ml或高10倍，肿瘤细胞的粘附显著降低，在血清存在或不存在时都是如此。如果剂量是300μg/ml则没有观察到这样的效果。
2.增殖测试
在此测试中肿瘤细胞在处理前24小时被置于96孔板中。在用适当剂量的冻干物处理后24，48和72小时通过SRB检测测试了细胞的增殖活性。重复测试的结果表明900-15000μg/ml范围内的处理导致肿瘤细胞到达单层的表面并且-锥虫蓝排出实验表明-死亡。(Kaltenbach，J.P.et al.：Exp Cell Res.15，112-117/1985/)(图5)。
我们对人黑色素黑素瘤(A2058肿瘤细胞-Todaro，G.J.et al.：Proc.Natl.Acad.Sci USA 77 5258-5262/1980/)的测试表现出和小鼠黑色素黑素瘤类似的结果(图6)。在这种肿瘤的实验中与SRB检测同时还进行了反应细胞的黑色素活性的MTT检测。(Cole，S.P.C.：Cancer Chemother.Pharmacol.17，259-263/1986/)。该测试是基于以下现象：具有代谢活性的细胞主要通过其脱氢酶活性将tetrasolium盐转化成具有颜色的甲(formazan)产物。与上述活性相对应的颜色反应可通过分光光度计在570nm读数，MTT检测清楚地显示纵然剂量为300μg/ml时肿瘤细胞的功能活性也降低(图4)。由于细胞到达表面时调亡的原因不清，通过流式细胞(FACS)分析测试了全部细胞群的调亡活性(图7)。图7显示肿瘤细胞的调亡-依赖于剂量-达到了不同寻常的程度。
III.测试对免疫反应的效果
用两种不同的模型检测了根据本发明的冻干物的效果。在一系列的测试中研究了从用冻干物处理的动物脾脏中得到的单核细胞转化爆发(blast transformation)的可能性；在另一系列测试中研究了同种异体皮肤移植模型中小鼠背部区域移植皮肤的总结合。
1.测试T-淋巴细胞的转化爆发
用根据本发明的冻干物处理显著地增加了在免疫反应中起重要作用的T-淋巴细胞的转化爆发。这通过以下实验示明。
C57Bl16小鼠用本发明描述的冻干物处理六星期，每星期5次通过胃饲管经口腔施用，剂量为3g/kg(0.6g/ml水悬浮液)。完成处理后将通过灌注从脾脏得到的淋巴细胞进行细胞培养，用1μg/ml ConA处理。48小时后进行DNS合成的细胞为0.4μCi的3H timidin所标记。标记的程度用液闪计数仪(Beckman)测量。如表6显示，用ConA处理显著提高了-与对照相比-3H-TdR的掺入，即转化爆发。
| 处理 | 1μg/ml Con A | |
| 平均(cpm) | SEM | |
| 对照 | 3760.6 | 583.3 |
| 冻干物 | 8041.8 | 957.1 |
表6.
冻干物处理与对照小鼠脾脏淋巴细胞对3H-timidin的掺入
2.在同种异体皮肤移植模型中检测免疫刺激效应
说明缺陷免疫反应恢复的最好模型是通过胸腺切除(手术除去胸腺)造成部分免疫缺陷的小鼠的同种异体皮肤移植实验。C57Bl10与B10LP血统的小鼠只在H-3基因座有区别，所以从一种血统小鼠的皮肤移植到另一血统的小鼠在7天内不会发生排斥反应，而只会在3星期后发生。如果接受者已进行胸腺切除，排斥反应平均在50天后发生。任何促进淋巴细胞和骨髓成熟与分化的物质，如胸腺激素，都会减少排斥移植皮肤所需的时间。(J.Immunpharmacology 7，67-78/1985/)。在我们的实验中用根据本发明的冻干物进行处理时也能观察到同样的效应。
C57Bl10小鼠作为受体而B10LP小鼠作为供体。受体小鼠进行胸腺切除术并在7星期后移植皮肤。胸腺切除1星期后用30mg/kg体重剂量的冻干物处理，每星期5次，通过口腔施用。处理在皮肤移植后70天终止。每天观察可能发生的排斥。表7显在未切除胸腺的小鼠中排斥时间分别为21天(雄性)和28.7天(雌性)。在胸腺切除小鼠中排斥时间分别延长到52.4天和41.6天。用根据本发明的冻干物的处理大大缩短了胸腺切除并处理小鼠中皮肤移植物的存活时间。这表明处理的结果是显著减小了由于胸腺切除导致的免疫缺陷，这意味着上述冻干物具有免疫刺激效应。
| 处理 | 排斥时间 | |||
| 雄性 | 雌性 | |||
| 平均(时间) | SEM | 平均(时间) | SEM | |
| 对照(未切除胸腺) | 21.0 | 3.1 | 28.7 | 4.5 |
| 对照(胸腺切除) | 52.4 | 5.0 | 41.6 | 5.5 |
| 冻干物(30mg/kg) | 28.8* | 8.6 | 32.6** | 4.5 |
*0.001＜p＜0.01相对胸腺切除小鼠
**0.01＜p＜0.05相对胸腺切除小鼠
表7
根据本发明冻干物的处理对排斥皮肤移植物的影响(受体小鼠
C57Bl10，供体小鼠B10LP)
在几种动物实验模型中利用根据本发明的冻干物进行的体内和体外测试表明这种产物具有显著的抗转移效应。这种效应可能是与在体内与体外实验中观察到的免疫刺激效应相关的，但是转移数的减少也可能受抗增殖效应、调亡诱导效应、该物质对粘附的影响以及导致产生自由基效应的影响。
IV.自由基结合活性
由于众所周知苯醌对自由基的形成有影响，我们还测试了本发明中描述的冻干物对自由基的结合活性。用电子自旋共振方法同时测量了过氧化物(SSA)和羟基自由基(OH-SA)的结合。上述冻干物具有显著的SSA，1mg的净自由基结合活性相当于5.64μg超氧化物歧化酶(SOD)的活性。冻干物不具有OH-SA活性，但它能破坏过氧化氢/Fe羟基自由基形成系统，所以可以猜想它具有所谓的非螯合剂活性。
V.毒理测试(亚急性)
根据Registry of Industrial Toxicology Animal-data(RITA)(Exp.Toxic.Pathol.47,247-266/1995/)的建议在F344大鼠和C57Bl10小鼠上进行了77天的毒理测试。上述动物每天用3g/kg的剂量(0.6mg/ml悬浮液)进行处理。在处理过程中观察了动物体重的变化，最终的病理身体变化和自发死亡。结束实验时测量了心、肺、胸腺、脾脏、肝脏、肾脏、和睾丸的重量并对由RITA列出的34个器官进行了病理检测。未观察到自发死亡。动物体重的变化与对照组相似。与对照组相比在实验结束时不同器官的重量没有变化。在对受处理动物进行病理学处理过程中未观察到可能由于冻干物导致的变化。
上述结果表明根据本发明的发酵植物性物质没有毒性，并且由于其免疫刺激效应，在所有免疫系统受损害的情况下可用其进行治疗。由于其以上描述的生物学特性，它可在恶性肿瘤的药物治疗中作为补充手段，主要用于抑制转移。
Claims (12)
1.一种具有免疫刺激与转移抑制功能的发酵干燥植物性物质，上述物质可通过用面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)在液体介质中发酵麦芽得到。
2.根据权利要求1的物质，具有基本上与图3相应的HPLC层析图谱。
3.根据权利要求1的物质，以HPLC检测其2，6 DMBQ含量为0.12-0.52mg/g干物质，2 MBQ含量为0.05-0.28mg/g干物质。
4.根据权利要求3的物质，其2，6 DMBQ含量为0.4mg/g干物质。
5.生产具有免疫刺激与转移抑制功能的发酵干燥植物性物质的方法，其特征在于研磨的麦芽是在Saccharomyces cerevisiae的存在下在液体介质中发酵的，并且发酵液被分离、过滤至清澈、蒸发、沸腾并如此干燥或在辅助干燥物质的存在下干燥。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于发酵在约30℃、连续通气与搅拌的条件下进行约18小时。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于干燥是在麦芽糖糊精的存在下进行的。
8.一种免疫刺激与转移抑制药用产品，其活性成分为可通过Saccharomyces cerevisiae存在下在液体介质中发酵麦芽得到的干燥物质。
9.哺乳动物的饮食添加剂，其含有可通过Saccharomycescerevisiae存在下在液体介质中发酵麦芽得到的干燥物质。
10.根据权利要求9的饮食添加剂，含有通过权利要求5中的方法得到的干燥物质，该干燥物质含有占重量60％的发酵物质与占重量40％的麦芽糖糊精。
11.可通过Saccharomyces cerevisiae存在下在液体介质中发酵麦芽得到的干燥植物性物质在生产免疫刺激与转移抑制药用组合物中的应用。
12.可通过Saccharomyces cerevisiae存在下在液体介质中发酵麦芽得到的干燥植物性物质在生产哺乳动物饮食添加剂中的应用。
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