BR9811936B1 - Material vegetal fermentado imunoestimulante e inibidor de metástase, processo para sua produção e seus usos - Google Patents

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MATERIAL VEGETAL FERMENTADO IMUNOESTIMULANTE E INIBIDOR DE ME- TÁSTASE, PROCESSO PARA SUA PRODUÇÃO E SEUS USOS". A invenção refere-se a um material vegetal seco e fermentado imunoestimulante e inibidor de metástase, composições farmacêuticas con- tendo o mesmo, ao processo para a preparação do material e uso do mate- rial vegetal seco como um suplemento dietético e na produção de composi- ções farmacêuticas imunoestimulantes e, especialmente, inibidoras de me- tástase.

Um dos objetivos principais do tratamento de tumores é a inibi- ção de metástases, como o tumor primário provocado por crescimento ma- ligno dos espalhamentos de células via metástase para as células e órgãos vizinhos nos tumores secundários posteriores, que não podem ser removi- dos cirurgicamente e também podem se tornar resistentes à quimioterapia.

Os pesquisadores se concentram mais e mais no desenvolvi- mento de materiais imunomodulatórios, e os materiais de origem natural - principalmente vegetal - têm sido estudados intensivamente. É um fato bem conhecido que os compostos com uma estrutura de quinona desempenham um importante papel biológico. Vários derivados de quinona são encontrados em plantas, como ubiquinonas, plastoquinonas, menaquinonas, que desempenham um papel em fotossíntese, mas também no sistema respiratório celular de vertebrados, assim, também seres huma- nos, e na coagulação de sangue, etc. Vários derivados de benzoquinona também são testados para finalidades de medicina. Adriamicina, daunorubi- cina e mitomicina C. são derivados de quinona com um efeito citostático, enquanto que outras benzo- e hidroquinonas têm um efeito antimicrobiano e são os componentes ativos dos antibióticos adequados para os tratamentos de infecções bacterianas como Tetran-B.Metaciclina e Doxiciclina. A literatura registra que 2,6-dimetóxi-p-benzoquinona (2,6- DMBQ) e 2-metóxi-p-benzoquinona (2-MBQ) têm um efeito fungicida e bac- teriostático e também são citotóxicos para as células de tumores malignos. [Int. J. Quant. Chem.: Quant. Biol. Symp. 7., 217 - 222 (1980), 9., 27 - 30 (1982) e 12., 257 - 261 (1985); Phytochemistry 27., 225 (1971) e J. Agric.

Food Chem. 39., 266 (1991)] Foi mostrado que uma mistura de 2,6- dimetóxi-p-benzoquinona e ácido ascórbico inibe o crescimento de células de tumores de ascites de Ehrlich em camundongos. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 2088 - 2091 (1984) e 82, 1439 - 1442 (1985)]. 2,6-Dimetóxi-p- benzoquinona e 2-metóxi-p-benzoquinona foram encontrados e isolados em várias plantas [Magy. Kém. Folyóirat 102/7, 320 - 325 (1996)]. Esses dois compostos podem ser encontrados em grandes quantidades na forma de glucosídio em trigo (Tricitum vulgaris), para ser mais exato em germe de tri- go. Os compostos foram isolados nos anos cinqüenta de germes de trigo fermentados com fermento e identificados com a finalidade de exame da deterioração de qualidade de pães aos quais o germe de trigo foi adiciona- do. [Helv. Him. Acta 33, 433 (1950); J. Chem. Soc. London 1952, 4821 - 4823], De acordo com a literatura relativa a germe de trigo, a propor- ção de 2-MBQ é cerca de 0,05% em peso, aquela de 2,6-DMBQ cerca de 0,01 % em peso (como glucosídio). A presença de quinonas como glucosí- dios é explicada pelo fato de que as quinonas, especialmente as p- benzoquinonas substituídas por metóxi são reativas, enquanto que os seus hidroquinona - glucosídios são mais estáveis e inertes.

Durante os experimentos da presente invenção relativos ao es- tudo de fermentação de germe de trigo, concluiu-se que o extrato seco deri- vado do líquido fermentado produzido quando da fermentação de germe de trigo com fermento de padaria (Saccharomices cerevisiae) tem um efeito imunoestimulante e inibidor de metástase e pode ser aplicado com sucesso como o agente ativo das composições farmacêuticas imunoestimulantes e inibidoras de metástase.

Essa descoberta é surpreendente, porque embora a literatura registre [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 129 (1983)] que uma mistura de 2,6-DMBQ e ácido ascórbico inibe o crescimento de células de tumores de ascites - esses são eminentemente adequados para análise quantitativa do crescimento de tumores e para o estudo das suas funções bioquímicas - o extrato descrito na invenção, que contém além deles os componentes não- identificáveis 2,6-DMBQ e 2-MBQ - provou ser praticamente ineficaz nessas células de tumores primários, mesmo combinado com ácido ascórbico - ge- ralmente em todos os tumores primários, e provou ser apenas eficaz no tratamento de metástase. Os aspectos do tratamento de tumores primários e das metástases desenvolvidas deles são basicamente diferentes, de modo que não foi auto-evidente para o pesquisador que um extrato vegetal con- tendo os componentes que são conhecidos como sendo eficazes no trata- mento de tumores primários e ainda não inteiramente identificáveis pois a sua composição química deve ter um efeito imunoestimulante e inibidor de metástase. [Câncer, Principies and Practice of Oncology, Vol. 1, 4a edição, J. B. Lippincott Company, Filadélfia, 1993.] Desse modo, a presente invenção refere-se a um material ve- getal seco e fermentado imunoestimulante e inibidor de metástase, que é obtenível por fermentação de germe de trigo com fermento de padaria em um meio aquoso, filtração do líquido fermentado isento de células e seca- gem dele. A presente invenção também refere-se a uma composição far- macêutica imunoestimulante e inibidora de metástase, cujo agente ativo contém o material vegetal seco fermentado descrito na invenção. A presente invenção também refere-se ao uso do material ve- getal seco fermentado mencionado acima na produção de composições farmacêuticas imunoestimulantes e inibidoras de metástase. A presente invenção também refere-se aos processos de trata- mento de mamíferos para o estímulo do sistema imune e inibição de metás- tases com a composição farmacêutica descrita na invenção. A invenção refere-se ainda a um suplemento dietético compre- endendo o material vegetal seco fermentado descrito na invenção e malto- dextrina.

De acordo com a invenção, o material vegetal seco fermentado xfoi identificado e examinado com base no seu teor de 2,6-DMBQ. Gostaria- se de salientar que a identificação completa da composição química do ex- trato não foi possível com os métodos disponíveis, de modo que todos os dados se referem aos teores de 2,6-DMBQ como uma base.

Foi provado como sendo adequado para uso na produção do material vegetal seco fermentado, descrito na presente invenção, germe de trigo - que é um subproduto da moagem de farinha fina e disponível em grandes quantidades - moído para a qualidade da farinha fina, no seu esta- do original ou desengordurado. O uso de germe de trigo desengordurado não apresenta vantagens específicas. A fermentação foi feita com fermento de padaria (Saccharomyces cerevisiae). Esse tipo de fermento é comercial- mente disponível. O período de fermentação foi de cerca de 10 - 24 horas, de preferência, 15-20 horas ou cerca de 18 horas. A temperatura da fer- mentação é de cerca de 25 - 35°C, de preferência, cerca de 30°C. A razão ponderai do germe de trigo e do fermento é de 4:1 - 2:1, de preferência, cer- ca de 3:1, a razão ponderai da matéria seca e água é 1:6 -1:12, de prefe- rência, cerca de 1:9. A fermentação - em uma escala de laboratório - pode ser feita, por exemplo, por adição em um fermentador de vidro de suspensão de ger- me de trigo recém-moído - fermento em água, e por agitação ou sacudidura da mistura. O líquido fermentado fica espumoso.

Após a fermentação, a mistura é centrifugada por 5 -15 minutos a 2.000 - 4500/min, de preferência, cerca de 3.000/min. O sobrenadante é fervido, resfriado e seco de uma maneira apropriada, por exemplo, por liofi- lização ou secagem por aspersão. O produto, um pó marrom-avermelhado, é o material de acordo com a invenção. É conveniente manter o material resfriado até uso posterior e por causa do seu caráter higroscópico em recipientes vedados. O teor de 2-DMBQ do material seco resultante é cerca de 0,4 mg/g. No caso de fer- mentação em grande escala (por exemplo, 4 metros cúbicos), é adequado aplicar aeração contínua, por exemplo, 0,5 I de ar/l de líquido fermenta- do/minuto e agitação lenta. O período de fermentação é de cerca de 18 ho- ras. Para inibir a formação de espuma, podem ser aplicados aditivos usuais - é preferível usar óleo de girassol. Ao final do processo de fermentação, a aeração e a agitação são descontinuadas e o líquido fermentado é separado da suspensão de germe de trigo - fermento da maneira usual, por exemplo, em um decantador de rosca, subseqüentemente em um separador e em um filtro-prensa. Se necessário, pode ser adicionado um material auxiliar de fil- tração. É adequado usar de 5 -10 kg de perlita de filtração por metro cúbico de líquido fermentado. O líquido fermentado é rigorosamente filtrado e a qualidade da filtração é checada através de microscópio. O líquido fermen- tado não contém, praticamente, quaisquer células, o que significa que não mais do que 1 célula de fermento é encontrada por 10 observações. O líqui- do fermentado resultante, que contém cerca de 1,5% em peso de material seco é evaporado em um condensador a vácuo, de preferência, a uma tem- peratura de cerca de 40 - 50°C e após terminar o vácuo, é fervido à pressão atmosférica por cerca de 15 minutos. Isso resulta em uma diminuição das atividades nocivas da enzima. Subseqüentemente, a mistura é seca por se- cagem por aspersão, por exemplo, em um aparelho de aspersão rotativo. Se o processo de fermentação acima é usado, o teor de 2,6-DMBQ do material vegetal seco fermentado resultante é de 0,12 - 0,52 mg/g de material seco e o teor de 2 MBQ é de 0,05 - 0,28 mg/g de material seco - dependendo do teor de benzoquinona do germe de trigo usado.

Como o produto final é higroscópico, para melhorar a eficiência da secagem por aspersão e o uso do produto final, um dos aditivos usuais, por exemplo, maltodextrina, goma acácia, goma guar, xantano, farinha fina de alfarroba, etc., pode ser usado durante a secagem por aspersão. É prefe- rível usar maltodextrina. O processo adequado é determinar o teor de mate- rial seco da mistura evaporada no condensador a vácuo e fervida e adicionar maltodextrina suficiente para que o teor de material seco da mistura a ser seca seja de cerca de 30% em peso. É adequado dissolver a maltodextrina em água quente e adicionar a mesma resfriada na mistura condensada. A- pós secagem, o produto final - um pó - contém cerca de 60% em peso de material vegetal seco fermentado e cerca de 40% em peso de maltodextrina. A estabilidade do material obtido pode ser checada por monito- ração das variações da concentração de 2,6 DMBQ. A análise quantitativa pode ser feita por HPLC. O pó produzido de acordo com o processo descrito acima se mantém estável por cerca de 3 anos à temperatura ambiente. O material vegetal seco fermentado de acordo com a invenção pode ser usado como o agente ativo das composições farmacêuticas imunoestimulantes e inibidoras de metástase. A composição farmacêutica também pode conter ácido ascórbico ou outros materiais citostáticos além do dito agente ativo. O material vegetal seco fermentado pode ser processado às composições farmacêuticas sólidas ou líquidas usuais para administração peroral ou parenteral. Durante a produção das composições farmacêuticas, o caráter higroscópico do material vegetal seco fermentado deve ser consi- derado. Uma forma adequada é uma cápsula que protege o agente ativo da umidade do ar.

Na produção das composições farmacêuticas, materiais auxilia- res usualmente aplicados na prática farmacêutica podem ser usados. Como esses materiais e os seus possíveis usos são descritos na literatura farma- cêutica em detalhes, a seleção e a preparação da forma adequada é uma tarefa rotineira. A dosagem por vez do agente eficaz pode variar dentro de amplos limites, dependendo do estado do paciente, e a seleção da dosagem efetiva deve ser sempre de responsabilidade do médico. Geralmente, po- dem ser obtidos resultados adequados se a dosagem é de 0,001 - 100 g, de preferência, 0,01 - 50 g, particularmente, 0,1 - 40 g por kg de peso corpóreo, por exemplo, em dosagens de 0,1 -10,1 - 25 ou 10 - 30 g. O material vegetal seco fermentado de acordo com a invenção também pode ser misturado com ácido ascórbico (Vitamina C). De acordo com os experimentos da presente invenção, o ácido ascórbico pode melho- rar o efeito inibidor de metástase do material de acordo com a invenção. A razão ponderai do material vegetal seco fermentado e de ácido ascórbico pode ser, por exemplo, 10:1 -1:1, de preferência, 6:1-2:1, particularmente, 3:1,4:1 ou 5:1. A invenção também refere-se ao tratamento imunoestimulante e/ou de inibição de metástase com o material vegetal seco fermentado de acordo com a invenção. O ponto do tratamento é dar ao paciente uma dose efetiva do material vegetal seco fermentado. O material vegetal seco fermentado também pode ser usado como um suplemente dietético para mamíferos. Neste caso, é preferível aplicar a mistura contendo maltodextrina e os materiais auxiliares usuais aplicados na indústria alimentícia, por exemplo, materiais aromáticos, ado- çantes, agentes colorantes, etc. O suplemento dietético pode ser produzido, por exemplo, por granulação da mistura contendo 60% em peso de matéria seca e 40% em peso de maltodextrina mais os materiais aromáticos e ado- çantes em um leito fluido e embalagem do presente granulado em, por exemplo, sacos.

As figuras anexadas são descritas abaixo. A Figura 1 é um diagrama de calibração da medida de HPLC de 2,6-DMBQ. A Figura 2 é um cromatograma de HPLC do extrato de clorofór- mio do material. A Figura 3 é um cromatograma de HPLC do extrato de etanol do material. A Figura 4 é uma ligação de células de tumores B16 na presen- ça de liofilizado de diferentes concentrações no 60° e 90° minuto após colo- cação. (Cada valor representa a média de 8 medidas paralelas ± DP de avaliação por medida espectrofotométrica). A Figura 5 representa o efeito das diferentes dosagens de liofili- zado na proliferação de células B16 após 24 e 48 horas após início do tra- tamento. (Cada valor representa a média de 8 medidas paralelas ± DP de avaliação por medida espectrofotométrica). A Figura 6 representa o desenvolvimento de melanoma humano A2058 na presença de diferentes dosagens de liofilizado 24 horas após iní- cio do tratamento. A avaliação das culturas foi feita com base na atividade da proteína (SRB) e da desidrogenase (MTT) por medidas espectrofotomé- tricas paralelas. (Cada valor representa a média de 8 medidas paralelas ± DP), A Figura 7 representa a razão de células apoptoticas (análise FACS) no melanoma humano A2058 em culturas in vitro após tratamento com diferentes dosagens do liofilizado.

Os seguintes exemplos servem para ilustrar o material vegetal seco fermentado de acordo com a invenção, a sua produção e os efeitos farmacológicos Exemplo 1 Fermentação em escala de laboratório de germe de trigo Uma suspensão de 33,3 g de fermento (Saccharomyces cerevi- siae) e 1.000 ml de água potável foi adicionada a 100 g de germe de trigo fresco (de acordo com o padrão húngaro MSZ-081361-80) moídos à quali- dade de farinha fina. A mistura foi sacudida em um sacudidor por 18 horas a 30°C. Durante esse período o líquido fermentado ficou espumoso e atingiu cerca de três vezes o seu volume original. Após fermentação, a mistura foi centrifugada por 15 minutos a 3.000/min. Após ebulição e resfriamento, o sobrenadante foi seco por liofilização e a matéria liofilizada resultante foi mantida até uso posterior no congelador (-10°C). O teor de 2,6-DMBQ do liofilizado resultante foi de 0,4 mg/g de material seco (0,04% em peso).

Exemplo 2 Fermentação em grande escala de germe de trigo 3Õ0 kg de germe de trigo moídos à qualidade de farinha fina (de acordo com o padrão húngaro) e 100 kg de fermento foram colocados em um fermentador de 5 metros cúbicos e água potável foi adicionada até o volume ficar 4.000 I. O período de fermentação foi de 18 horas, durante o qual foram usadas aeração contínua (0,51 ar/l de líquido fermentado/minuto) e baixa agitação (30 rev./min). Para inibir a formação de espuma, adicionou- se 1 l/metro cúbico de óleo de girassol à mistura. Após a fermentação, a ae- ração e a agitação foram descontinuadas e o líquido fermentado foi separa- do em um decantador de rosca, depois em um separador e, finalmente, em um filtro-prensa com filtro têxtil. Como material auxiliar foram adicionados 10 kg de perlita filtrante/metro cúbico. O líquido fermentado foi filtrado à nitidez e a nitidez foi checada por microscópio. O líquido fermentado filtrado não continha, praticamente, quaisquer células, o que significou que se encon- trou o máximo de 1 célula de fermento a cada 10 observações. O líquido fermentado resultante, que continha cerca de 1,5% em peso de material seco, foi evaporado em um condensador a vácuo, a uma temperatura de 40 - 50°C, e após descontinuação do vácuo fervido a uma pressão atmosférica por cerca de 15 minutos. Após isso, o teor de material seco da solução foi determinado e suficiente maltodextrina, primeiro dissolvida em água quente e depois resfriada - foi adicionada de modo que o teor de matéria seca da solução ficasse em torno de 30% em massa. Após isso, a solução foi seca por aspersão em um secador por aspersão rotativo de bocal de cisalha- mento no qual a temperatura do ar de saída era de 90°C. O produto final resultante - um pó - continha 60% em peso do material vegetal fermentado de acordo com a invenção e 40% em peso de maltodextrina. O teor de 2,6 DMBQ foi determinado por HPLC de acordo com o método descrito no exemplo a seguir - foi de 0,4 mg/g de material seco.

Exemplo 3 Características do material de acordo com a invenção O material de acordo com a invenção pode ser caracterizado de duas maneiras, por determinação do seu teor de 2,6 DMBQ ou pelo deno- minado cromatograma de impressão digital. Em ambos os casos, é usada a cromatografia de HPLC. A análise foi feita tanto no material produzido como descrito no Exemplo 1 e naquele obtido como descrito no Exemplo 2 e, em ambos os casos, os resultados foram idênticos. A. Análise quantitativa e qualitativa de derivados de benzoquinona Preparação da amostra Antes da análise, tornou-se necessário aumentar a concentra- ção de benzoquinonas no liofilizado. Para se fazer isso, o liofilizado foi di- luído à concentração original com água destilada (teor de 1% em peso de material seco) - (0,5 g de liofilizado, 50 ml de água destilada). A solução foi extraída com 3 x 25 ml de clorofórmio em três etapas. A umidade eventual remanescente na fase de clorofórmio foi removida com sulfato de sódio isento de água. Após filtração, a fase de clorofórmio foi evaporada, ao resto foi adicionado clorofórmio a um volume total de 5 ml. Esta amostra foi inje- tada durante a análise por HPLC. A análise qualitativa e quantitativa dos derivados de benzoqui- nona foi feita pelo método de HPLC.

Descrição do método de HPLC O equipamento de HPLC aplicado consiste em uma bomba mo- delo 114 M da Beckman, um LaborMim UV, respectivamente, um detector de disposição de diodos mod. 4500 da Merck - Hitachi - DAD, e uma unidade integradora do tipo 740 da Waters. Uma coluna de 10 μ C18 (250 x 4 mm) da Chromsil foi usada para as medidas. A detecção de UV foi feita a uma freqüência de 290 nm, a vazão sendo de 2 ml/min. A composição do eluente aplicado foi a seguinte: 25 mmoles de Na2HP04, 25 mmoles de NaH2P04, 25 mmoles de Na2EDTA, 20 mmoles de NH2OH.HCI, 10% em volume de metanol, pH = 6,05.

Essas diferentes benzo- e hidroquinonas foram analisadas pelo método descrito acima. Há ainda uma pequena diferença entre o tempo de retenção dos compostos. Diminuindo-se a concentração do eluente - a fase orgânica a 10% - melhorou-se a seletividade em um alto grau. A análise dos dados de retenção mostraram que as p-benzoquinonas mostram uma reten- ção maior do que as hidroquinonas correspondentes e a retenção aumenta o número de grupos metóxi. A concentração de todos os três padrões foi de 0,1 mg/ml. A Tabela 2 mostra os dados dos tempos de retenção (tR) dos pa- drões e do fator de capacidade (k1). O objetivo das medidas foi o da detec- ção e definição quantitativa de 2,6-dimetóxi-p-benzoquinona, de modo que a seguir essa parte das medidas vai ser discutida em detalhes. Examinou-se se o processo elaborado é adequado para análise quantitativa de 2,6- dimetóxi-p-benzoquinona. O diagrama de calibração usado é mostrado na Figura 1. Com um coeficiente de correlação de 0,99, o resultado é uma linha reta. Também se checou se as medidas podem ser reproduzidas, em cada amostra foram conduzidas três medidas paralelas e a dispersão dos resul- tados foi calculada. A Tabela 1 mostra os resultados paralelos das medidas conduzidas nas amostras durante um período de seis meses e a dispersão deles. Os resultados da presente invenção mostram que o método de medi- da é adequado para uma medida exata e reprodutível de 2,6-dimetóxi-p- benzoquinona.

Tabela 1 Valores paralelos da análise quantitativa de 2,6-DMBQ e a dispersão dos resultados Tabela 2 Valores do tempo de retenção (tR) e do fator de capacidade (k1) dos materi- ais examinados A Figura 2 mostra o cromatograma de HPLC da amostra de clo- rofórmio preparada como descrito acima. O cromatograma mostra apenas um pico característico para 2,6-DMBQ. O teor de 2,6-DMBQ da amostra foi determinado com base nesse. B. Cromatograma de impressão digital Preparação da amostra 50 ml de etanol 96% em volume foram adicionados a 5 g de material seco por aspersão (preparado como descrito no Exemplo 2). A mistura foi sacudida por 30 minutos a uma temperatura de 50°C e 200/min.

Após isso, a mistura foi filtrada, evaporada a seco e o material remanes- cente dissolvido em 10 ml de metanol. A solução filtrada foi injetada na co- luna.

Método HPLC

Os instrumentos de HPLC, a coluna e as condições descritas acima foram usados também aqui, mas a composição do eluente foi a se- guinte: 1,25 mmoles de Na2HP04, 1,25 mmol de NaH2P04, 1,25 mmol de Na2EDTA, 2,5 mmoles de NH2OH.HCI, 5% em volume de metanol. A Figura 3 mostra o cromatograma de HPLC resultante. É mos- trado que sob essas condições aparecem dois picos característicos, um a cerca de 4,7 minutos (5) e um a 5,8 minutos (6). A um tempo de retenção de 7,3, respectivamente, 7,7 minutos, dois picos (7,8) seguidos entre eles rapi- damente, que não podem ser completamente separados. Um pico de menor intensidade apareceu a 9,8 minutos (9), seguido por um pico intensivo ca- racterístico (11) a cerca de 13,1 minutos. A cerca de 15 minutos, um pico menor (12) e outro pico intensivo (14) em 18 minutos. A 21,8 minutos, o cromatograma mostrou um pico menor (15) e em torno de 31 minutos um pico mais plano contendo vários materiais. C. Testes de estabilidade A decomposição do material de acordo com a invenção foi che- cada via as variações na concentração de 2,6-dimetóxi-pbenzoquinona. Fo- ram conduzidos experimentos de armazenamento em três diferentes tempe- raturas (temperatura ambiente, 20°C, 40°C e 60°C). O liofilizado - cerca de 1 g - foi armazenado em tubos de ensaio que foram selados contra ar. A du- ração dos experimentos foi de 8 semanas, cada semana foram conduzidos três medidas paralelas nas amostras tiradas de todas as três séries manti- das em diferentes temperaturas. A análise quantitativa de derivados de ben- zoquinona foi conduzida por HPLC.

Os testes mostraram que o material seco de acordo com a in- venção se manteve estável mesmo após três anos à temperatura ambiente, isto é, o teor de 2,6-DMBQ se manteve praticamente inalterado. Ao mesmo tempo, o material não é estável a 40°C - o 2,6-DMBQ decompõe-se em umas poucas semanas, e a 60°C o teor de 2,6-DMBQ diminui rapidamente em uns poucos dias. A decomposição de 2-metóxi-p-benzoquinona também foi estu- dada em ambas as séries de medidas. Esse composto é mais instável do que a 2,6-dimetóxi-p-benzoquinona e, conseqüentemente, a sua presença não é mostrada após uma semana de armazenamento nas amostras manti- das a 40 ou 60°C. À temperatura ambiente, a concentração deste composto manteve-se também inalterada.

Exemplo 4.

Testes em eficiência Ambos o liofilizado preparado como descrito no Exemplo 1 e o material seco por aspersão, preparado como descrito no Exemplo 2, foram testados para eficiência. Um material seco padronizado foi usado com um teor de 2,6-DMBQ de 0,4 mg/g de material seco e uma curva de HPLC, como aquela mostrada na Figura 2. Ambos os materiais deram os mesmos resultados - de modo que o material de acordo com a invenção vai ser cha- mado a seguir, simplesmente, de liofilizado. Abaixo os resultados dos testes biológicos e toxicológicos relativos a esse liofilizado vão ser discutidos, com uma ênfase especial na reconstituição imunológica e nos efeitos inibidores de metástase e de crescimento de tumor. I. Efeito inibidor de crescimento de tumor e de metástase (teste in vivo) Para os testes foram usados os seguintes tumores injetáveis crescendo em camundongos ou ratos: uma variante formadora de alta me- tástase (3LL-HH) de carcinoma de pulmão de Lewis (câncer de pulmão de camundongo), melanoma de camundongo B16 e xenoenxerto de carcinoma de cólon humano HCR-25.

Os tumores 3LL-HH (LLT-HH) e B16 foram mantidos em camun- dongo endógamo C57B1/6. O xenoenxerto HCR-25 foi injetado em camun- dongo CBA/CA, previamente imunossuprimidos por timectomia e irradiação corpórea completa. No caso de tumores 3LL-HH e HCR-25, as células tumo- rosas foram transplantadas no baço, no caso de melanoma B16 nos mús- culos da extremidade inferior esquerda. Um grupo tratado e um de controle dos animais injetados com o tumor HCR-25 foram também esplenectomiza- dos 21 dias após o transplante do tumor. O tratamento com o liofilizado descrito na invenção foi iniciado 24 horas após injeção do tumor. As dosagens diárias de 3 g/kg de peso cor- póreo foram administradas por osso, com uma sonda de estômago, na for- ma de suspensão aquosa de 0,6 g/ml.

Os testes foram terminados 14 dias após transplante no caso do tumor 3LL-HH. Vinte e um dias após transplante no caso do tumor B16 e 51 dias após transplante no caso de tumor HCR-25 5 por sangramento dos animais à morte sob narcose.

As Tabelas 3,4 e 5 resumem os resultados dos testes. p < 0,01 cada teste continha 10 animais Tabela 3 Efeito do tratamento com o liofilizado de acordo com a invenção no número de metástases do fígado no caso de câncer de pulmão de camundongo 3LL- HH injetado no baço *A esplenectomia foi feita 21 dias após o tumor ter sido injetado no baço Cada grupo de teste continha 12 animais Tabela 4 Efeito do tratamento com liofilizado de acordo com a invenção no número de metástases do fígado 51 dias após o carcinoma de cólon hu- mano HCR-25 ter sido injetado no baço de camundongos CBA/CA imunos- suprimidos *p < 0,01 cada grupo de teste continha 10 animais Tabela 5 Efeito do tratamento com o liofilizado de acordo com a invenção no peso da extremidade injetada com o tumor e no número de metástases do pulmão, no caso de melanoma B16 injetado nos músculos da extremidade 21 dias após o tumor ter sido injetado Os resultados acima mostram que o tratamento descrito na in- venção diminuiu significativamente - por 71% - o número de metástases do fígado, quando o tumor 3LL-HH foi injetado no baço (Tabela 3.) No caso de carcinoma de cólon humano HCR-25, o tratamento de 50 dias diminuiu tanto o peso do baço com o tumor quanto o número de metástases do fígado. O número de metástases comparado com o grupo de controle foi de cerca de 50% em ambos os grupos esplenectomizado e não- esplenectomizado (Tabela 4.) No caso de melanoma B16 injetado no músculo, o peso do tu- mor crescendo no músculo não mudou como um efeito do tratamento, mas o número de metástases do fígado diminuiu muito significativamente por 85%, comparado com o grupo de controle (Tabela 5). II. Testes in vitro Como os testes mencionados acima não mostraram ambiguida- de, pelo fato de que o liofilizado descrito na invenção pode diminuir signifi- cativamente as metástases dos tumores malignos, os efeitos dos produtos nas diferentes fases da formação de metástases também foram examinados. A formação de metástases consiste em várias fases, nas quais além da pro- liferação e da atividade apoptótica das células do tumor primário, o potenci- al de adesão das células tumorosas e dos mecanismos protetores do orga- nismo contra as células tumorosas desempenham um papel. Nos testes in vitro, o efeito do liofilizado na proliferação e apoptose e adesão das células foi estudado.

Como uma grande parte dos testes in vivo foi feita em células de melanoma de camundongo B16, na primeira etapa esse tumor foi usado para testar o liofilizado. 1. Teste de adesão A adesão das células tumorosas foi testada em uma microlâmi- na de 96 furos. As dosagens do liofilizado foram de 300, 3.000 e 30.000 μ g/ml. Foi usado o meio de cultura RPMI, tanto na ausência de soro quanto na presença de FCS 10%. A adesão foi testada 10, 30,60, 90 e 120 minutos após incubação nas circunstâncias usuais. A avaliação foi feita por proces- so de colorimetria com base no ensaio SRB (Mossmann, T., J. Immunol.

Neth. 65, 55 - 63,1983). O teste é baseado na coloração com sulforrodami- na B do teor de proteína total da cultura, a absorbência foi lida a 570 nm com um espectrofotômetro. A Figura 4. mostra apenas dois momentos no tempo, que representam, no entanto, o efeito do liofilizado adequadamente.

Mostrou-se que se a dosagem do liofilizado fosse de 3.000 pg/ml ou dez ve- zes mais alta, diminuía a adesão das células tumorosas significativamente, tanto na presença quanto na ausência de soro. Se a dosagem fosse de 300 pg/ml, nenhum desses efeitos podería ser observado. 2. Teste de proliferação Neste teste, as células tumorosas foram colocadas 24 horas antes do tratamento na microlâmina de 96 furos. Após tratamento com as dosagens apropriadas do liofilizado, a atividade de proliferação das células também foi testada pelo ensaio SRB, 24, 48 e 72 horas após tratamento. Os resultados dos testes repetidos mostraram que em virtude do efeito do tra- tamento na faixa de 900 - 15.000 pg/ml as células tumorosas vieram para a superfície da monocamada e - como mostrado pelo método de exclusão de corante de azul tripano - morreram (Kaltenbach, J. P. et al., Exp. Cell Res. 15,112- 117,1985) (Figura 5.).

Os testes da presente invenção em melanoma amelanótico hu- mano (células tumorosas A2058 - Todaro, G. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 5258 - 5262, 1980) mostraram resultados similares àqueles em melanoma melanótico de camundongo (Figura 6.). No caso desse tumor pa- ralelo ao ensaio SRB, o ensaio MTT representando a atividade metabólica da célula também foi feito (Cole, S. P. C., Câncer Chemother. Pharmacol. 17, 259 - 263,1986). O teste é baseado no fenômeno que uma célula meta- bolicamente ativa transforma o sal tetrassódico em um produto de formazan colorido, basicamente via a sua atividade de desidrogenase. A reação de coloração, que é proporcional à atividade, pode ser lida por um espectrofo- tômetro a 570 nm, o ensaio MTT mostrou, claramente, que a atividade fun- cional das células tumorosas diminuiu mesmo se a dosagem fosse de 300 μ g/ml (Figura 4.). Como no caso das células vindo para a superfície no qual a causa da apoptose era desconhecida, a atividade apoptótica da população celular completa foi testada por análise citométrica de fluxo (FACS) (Figura 7.). Como mostra a Figura 7, as células tumorosas estavam em apoptose - dependendo da dosagem - a um grau incomumente grande. III. Testes dos efeitos na reação imune O efeito do liofilizado descrito na invenção foi examinado em dois modelos diferentes. Em uma série de testes, a possibilidade da trans- formação de blastos de células mononucleares originárias do baço dos ani- mais tratados com o liofilizado foi estudada, enquanto que no outro, no mo- delo de transplante de pele de aloenxerto, a ligação total da pele trans- plantada na região das costas dos camundongos foi estudada.

1. Teste de transformação de blastos de linfócitos T 0 tratamento com o liofilizado descrito na invenção aumenta, significativamente, o transplante de blastos dos linfócitos T desempenhando um papel importante na reação imune. Isso foi mostrado pelo seguinte expe- rimento.

Camundongos C57BI16 foram tratados por seis semanas 5 vezes por semana por via com uma sonda de estômago com 0 liofilizado descrito na invenção em uma dosagem de 3 g/kg (suspensão aquosa de 0,6 g/ml).

Após conclusão do tratamento, os linfócitos originários da perfusão do baço dos animais foram transferidos para uma cultura celular, tratados com 1 μ g/ml de Con A. Após 48 horas, as células conduzindo a síntese DNS foram marcadas por 0,4 pCi 3H timidina. O grau de marcação foi definido com um contador de cintilação líquido (Beckman). Como mostra a Tabela 6, 0 trata- mento com Con A aumentou significativamente - comparado com 0 controle - a incorporação de 3H-TdR, isto é, a transformação de blastos.

Tabela 6 Incorporação de 3H-timidina nos linfócitos do baço dos camundongos de controle e tratados com liofilizado 2. Teste do efeito Imunoestimulante no modelo de transplante de pele de aloenxerto O melhor modelo para a ilustração da restituição da reação imunodeficiente é 0 teste de transplante de pele de aloenxerto em camun- dongos tornados, parcialmente, imunodeficientes por timectomia (remoção operacional do timo). As populações derivadas de um isolado de camun- dongo C57BI10 e B10LP apenas diferem no locos H-3, de modo que a pele transplantada dos membros de uma população derivada de um isolado na outra não é rejeitada dentro de 7 dias, mas apenas após cerca de 3 sema- nas. Se o recipiente tivesse sido timectomizado, a rejeição ocorre após uma média de 50 dias. Todos os materiais que avançam no amadurecimento e diferenciação dos linfócitos da medula, como os hormônios do timo, diminu- em o tempo necessário para rejeição da pele transplantada (J. Immunphar- macology, 7, 67 - 78,1985). O mesmo efeito pôde ser observado nos testes da presente invenção, quando o tratamento com o liofilizado descrito na in- venção foi aplicado.

Os camundongos Cs7BI10 foram usados como recipiente e os camundongos B10LP como doadores. Os camundongos recipientes foram timectomizados e submetidos em seguida a transplante de pele após 7 se- manas. Por osso - 5 vezes por semana, 30 mg/kg - os tratamentos com o liofilizado foram iniciados uma semana após timectomia. O tratamento foi concluído 70 dias após o transplante de pele. A rejeição eventual da pele foi observada diariamente. A Tabela 7 mostra que o tempo de rejeição em ca- mundongos não-timectomizados foi de 21 (machos), respectivamente, 28,7 (fêmeas) dias. Na rejeição de camundongos timectomizados, o tempo foi estendido para 52,4, respectivamente, 41,6 dias. O tratamento com o liofili- zado de acordo com a invenção abreviou, significativamente, em camun- dongos timectomizados e tratados a sobrevivência dos transplantes de pele (enxertos). Isso mostra que a deficiência provocada pela timectomia foi si- gnificativamente reduzida em conseqüência do tratamento, o que significa que o liofilizado tem um efeito estimulante imune. *0,001 < p < 0,01 vs. controle timectomizado **0,001 < p < 0,05 vs. controle timectomizado Tabela 7 0 efeito do tratamento com o liofilizado de acordo com a inven- ção na rejeição de enxertos de pele (camundongos recipientes C57BI10, ca- mundongos doadores B10LP) Os testes in vivo e in vitro com 0 liofilizado de acordo com a in- venção mostraram que este produto tem um efeito antimetástico em vários modelos de testes de animais. Esse efeito é provavelmente ligado ao efeito imunoestimulante observado em ambos os testes in vivo e in vitro, mas é possível que a diminuição no número de metástases também seja influenci- ado pelos efeitos causadores de apoptose antiproliferativa, 0 efeito do mate- rial na adesão e 0 efeito provocador da criação de radicais livres. IV. Teste de atividade de ligação de radicais Como as benzoquinonas conseguiram um efeito bem conhecido na formação de radicais livres, a atividade de ligação de radicais do liofili- zado descrito na invenção também foi testada. Ambas as ligações de supe- róxido (SSA) e de radical hidroxila (OH-SA) foram medidas com 0 método de ressonância da rotação do elétron. O liofilizado tinha uma SSA significativa, a atividade de ligação do radical livre de 1 mg corresponde à atividade de 5,64 \iq de superóxido dismutase (SOD). O liofilizado não tinha qualquer atividade OH-SA, mas rompe 0 sistema de formação de peróxido de hidro- gênio/Fe - radical de hidroxila, de modo que se pode supor que tem a de- nominada atividade não-queladora. V. Testes toxicológicos (subagudos) Os testes toxicológicos de 77 dias foram realizados de acordo com as recomendações do Registro de Dados de Animais de Toxicologia Industrial (RITA) (Exp. Toxic. Pathol. 47, 247 - 266, 1995) em ratos F344 e camundongos C57BI16. Os animais foram tratados diariamente com uma do- sagem de 3 g/kg (suspensão aquosa de 0,6 g/ml). Durante 0 tratamento, as variações do peso dos animais, as eventuais variações físicas patológicas, foi observada 0 sucumbimento espontâneo dos animais. Na conclusão do teste, foram medidos 0 peso do coração, pulmões, timo, baço, fígado, rins e testículos e os 34 órgãos prescritos pelo RITA foram examinados patologi- camente. Não se observou qualquer sucumbimento espontâneo, 0 peso dos animais variou como aquele do grupo de controle. Na conclusão do teste, o peso dos diferentes órgãos não mostrou qualquer variação, comparado com o grupo de controle. Durante o processamento patológico dos animais trata- dos, não se observou qualquer variação, que podería ter sido provocada pelo liofilizado.

Os resultados apresentados acima mostram que o material ve- getal fermentado de acordo com a invenção não é tóxico e em virtude do seu efeito imunoestimulante, é indicado em todos os estados nos quais o sistema imune é danificado. Por causa das suas características biológicas descritas acima, pode ter os seus usos complementares no tratamento mé- dico de tumores malignos, principalmente na inibição de metástases.

Claims (8)

1. Material seco, fermentado, imunoestimulante e inibidor de me- tástase derivado de um líquido fermentado, caracterizado pelo fato de que é obtenível a partir da fermentação de gérmen de trigo moído por 10 a 24 ho- ras a uma temperatura de 25 a 35°C na presença de Saccharomyces cerevi- siae em um meio aquoso; em que o líquido fermentado é separado, rigidamente filtrado, evaporado, fervido e seco naturalmente ou na presença de materiais de se- cagem auxiliares; em que a razão ponderai entre o gérmen de trigo e o fermento é de 4:1 a 2:1 e a razão ponderai entre a matéria seca e a água é de 1:6 a 1:12; e em que o referido material apresenta um cromatograma de H- PLC correspondente àquele mostrado na Figura 3 e compreende 0,12-0,52 mg/g de material seco de 2,6-dimetóxi-p-benzoquinona e 0,05 - 0,28 mg/g de material seco de 2-metóxi-p-benzoquinona, como determinado por HPLC.

2. Material de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende 0,4 mg/g de material seco de 2,6-dimetóxi-p-benzo- quinona.

3. Processo para produção de um material seco, fermentado, imunoestimulante e inibidor de metástase, caracterizado pelo fato de que gérmen de trigo moído é fermentado por 10 a 24 horas a uma temperatura de 25 a 35°C em um meio aquoso na presença de Saccharomyces cerevisi- ae e o líquido fermentado é separado, rigidamente filtrado, evaporado, fervi- do e seco naturalmente ou na presença de materiais de secagem auxiliares; em que a razão ponderai entre o gérmen de trigo e o fermento é de 4:1 a 2:1 e a razão ponderai entre a matéria seca e a água é de 1:6 a 1:12.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a fermentação é conduzida a uma temperatura de 30°C por 18 horas sob aeração e agitação contínuas.

5. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a secagem é conduzida na presença de maltodextrina.

6. Suplemento dietético para mamíferos, caracterizado pelo fato de que contém um material seco como definido na reivindicação 1 ou 2.

7. Suplemento dietético de acordo com a reivindicação 6, carac- terizado pelo fato de que consiste em 60% em peso de material fermentado e 40% em peso de maltodextrina.

8. Uso de um material seco como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é na produção de um suplemento dietético para mamíferos.