CN1262198C - 一种活性肽饲料添加剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种活性肽饲料添加剂，其为植物蛋白和动物蛋白的一种或几种的混合物，经芽孢杆菌等发酵降解，使其水解度控制在20～35%，经过分离后处理工艺，得到发酵上清液，将上清液或浓缩干燥或直接吸附到载体上，低温干燥后得到的产物。该活性肽饲料添加剂能明显抑制大肠杆菌、沙门氏菌的生长，可防治细菌性腹泻和消化不良性腹泻；在极低浓度下即可发挥作用，作用十分强烈；调节胃肠菌群，促进动物消化功能；剌激动物的免疫功能，增强动物对多种疫病的抗病力，大幅度降低发病率和死淘率；促进动物生长，提高生长速度；提高饲料利用率，降低生产成本。利用本发明提供的微生物发酵降解法，生产成本低，所得的肽类多，含量高，无环境污染。
Description
发明领域
本发明涉及一种活性肽饲料添加剂，具体地说是涉及一种利用动、植物蛋白制造的活性肽(或寡肽)饲料添加剂及其制备方法。
背景技术
自20世纪50年代以来，在动物饲养和饲料中广泛使用抗生素、化学合成药物、激素、β-兴奋剂、重金属、镇静剂等促生长保健剂，导致了如下的问题：畜禽和水产产品中药物残留严重，直接危害人体健康；畜禽产品品质下降，缺乏市场竞争力和信任感；细菌耐药性增强、耐药菌株增多，威胁人类安全；破坏生态环境等。由于抗生素的诸多副作用，近二三十年来，科学家们一直在寻找抗生素的替代品，同时，近年来消费者对食品安全问题十分关注，因此，世界各国家都在纷纷禁用或限制抗生素的使用，并加速开发、推广新型安全高效的绿色饲料添加剂，以减少或替代抗生素等药物添加剂。
近些年的研究成果表明，生物活性肽是一种新型安全的，并在动物的生长发育和产品形成方面发挥着重要作用的饲料添加剂。但在饲料工业方面，目前国内市场上可见到是小肽或肽蛋白饲料，而不是真正意义上的活性肽饲料添加剂，其多为进口产品，由动物的小肠和肠粘膜加工而成的肽蛋白；或是含有一定量的小肽的肽蛋白饲料。虽然它们都能提高动物的生产性能，降低腹泻率，但是大都存在以下缺陷：(1)产品的添加量较大0.1～1.5％；(2)产品功能不明确，功效不明显；(3)肽的分子量较大，一般为6000左右，仍然具有抗原性，对动物不利，易引起抗原过敏反应；(4)制备成本高或产品成本高，不适于动物养殖使用。这些产品主要用于代替饲料中的部分鱼粉。
在活性肽饲料添加剂的制备方法上，传统上，制备生物活性肽的方法主要是酶法，如使用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等植物蛋白酶，或是使用胰蛋白酶、胃蛋白酶等动物蛋白酶，但容易产生令人难以接受的腥味或苦味，且生产成本高；其次是从原料中直接提取法，产率低、成本高；第三是由化学合成法得到，用于生产高价值的短链到中长链的药理级肽，该法的缺点是成本高而且在反应过程中对健康和环境可能有害；第四，DNA重组技术法，该法因许多消费者反对使用由遗传改性生物所生产的食物产品，并担心有生物安全性和生物污染，而受到限制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术制备活性肽饲料添加剂的添加量较大、产品功能不明确，功效不明显，肽分子量较大仍然具有抗原性，易引起抗原过敏反应，和制备成本高不易于在动物养殖行业推广使用的缺陷，从而提供一种在饲料中的添加量低、功能明确，具有提高动物对营养素(如蛋白质、矿物质、维生素等)吸收利用率、提高奶、肉、蛋产量和生产能力，改善肉、蛋、奶的品质和风味，刺激动物免疫器官发育和提高抗病力和减少发病率，并能能明显改善水产动物养殖水质，提高水产动物生长速度和存活率，广泛用于禽、牛、羊、猪、水产和经济动物，可作为抗生素的替代品等优点的活性肽饲料添加剂。
本发明的另一目的在于提供所述活性肽饲料添加剂的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述活性肽饲料添加剂的用途。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明提供的活性肽饲料添加剂，其为由如下制备方法将发酵底物经发酵、水解且水解度(DH％)控制在20～35％，并且经超高温瞬时灭菌得到的蛋白水解液，所述的制备方法包括如下步骤：
1)制备种子液：
将芽孢杆菌、曲霉菌、青霉、放线菌中的一种或几种，接入灭菌后的液体培养基中，于25～35℃培养24～48小时，得到种子液；
所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，马铃薯浸液50～100ml，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，豆粕1.5～2g，生长因子1～2ml，水1000ml；其中的生长因子为含有MgSO4.7H2O 20.00～30.00mg/ml，CaCl2.2H2O 2.20～3.50mg/ml，ZnSO4.7H2O0.81～1.10mg/ml，FeSO4.7H2O 0.44～0.60mg/ml，MnSO4.H2O 0.13～0.20mg/ml ，CuSO4.5H2O 0.02～0.04mg/ml的混合物；
所述的芽孢杆菌为腊样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢样菌、巨大芽孢杆菌或短小芽孢杆菌；
所述的曲霉菌为黑曲霉菌、栖土曲霉菌、米曲霉菌、肉桂色曲霉菌或宇佐美曲霉菌；
所述的放线菌为绿色糖单孢菌、灰绿链霉菌或费式链霉菌；
所述的青霉菌为紫微青霉、产黄青霉、苹果青霉、淡黄青霉、台湾青霉、杜邦青霉或蓝棕青霉；
2)发酵降解：
将发酵底物粉碎到60～120目后放入发酵罐中，依次加入水和碳源，所加入水的重量与发酵底物所含蛋白质的重量份配比为100∶5～18，所加入碳源的含碳量与发酵底物的含氮量的重量比为1∶2～35，将发酵液在0.1～0.13MPa，115～125℃灭菌10～30分钟，冷却到20～37℃，加入步骤1)得到的种子液，种子液和发酵液的体积比为0.3～1∶10，混合均匀后在25～42℃，以0.5～2.5vvm的速度通入无菌空气，以150～300rpm速度搅拌发酵，期间用常规的茚三酮法显色法测定水解度，24小时前每6小时检测一次水解度，24～48小时之间，每4小时检测一次水解度，48小时后每2小时检测一次水解度，直到水解度达到20～35％，然后于140～145℃灭菌2～8秒，得到含活性肽的蛋白水解液，即为活性肽饲料添加剂；
所述的发酵底物为选自植物蛋白或动物蛋白中的一种或几种的混合物；
所述的植物蛋白包括大豆蛋白、豆粕、豆饼、碗豆蛋白、玉米蛋白、红豆蛋白、小麦蛋白、大麦蛋白、棉籽粕或菜籽粕；
所述的动物蛋白包括鱼粉、血粉、羽毛粉、乳蛋白、筋肉、酪蛋白、动物废弃脏器、蚯蚓蛋白粉、鱿鱼蛋白、鱼皮或其它水产动物蛋白；
所述的碳源包括玉米面、红糖、食用白糖、玉米糖浆、淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。
用于制备本发明的活性肽饲料添加剂的方法还包括步骤3)和步骤4)：
所述步骤3)为蛋白水解液的离心除渣、超滤、浓缩：
将步骤2)得到的经灭菌的蛋白水解液再经5000～7000rpm连续离心分离10～30分钟除去渣质，分出的上清液通过超滤膜过滤，得到分子量小于5000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到浓缩液；
所述步骤4)为加载体吸附干燥或喷雾干燥：
加载体吸附干燥是将步骤3)得到的浓缩液，加到预先混合好的载体中，浓缩液与载体的重量比为0.5～0.8∶1，然后在45～80℃干燥，得到活性肽饲料添加剂；所述的载体由2～5重量份有机载体和3～5重量份无机载体组成；所述有机载体包括糠麸类和饼粕类有机载体；所述糠麸类有机载体为麦麸、玉米芯粉、脱脂稻壳粉和脱脂米糠中的一种或几种的混合物；所述饼粕类有机载体为豆粕粉、豆饼粉和玉米蛋白粉中的一种或几种的混合物；所述无机载体为轻质碳酸钙、石粉、麦饭石和沸石粉中的一种或几种的混合物；
喷雾干燥是将步骤3)得到的浓缩液，按操作条件：体积比加入0.3～1％糊精和2～8％轻质碳酸钙，混合均匀后，在喷雾干燥机上按进风100℃～130℃，出风60～80℃，喷压1.8～2.3kg，流量1000～1500ml/min，进行喷雾干燥，得到活性肽饲料添加剂。
本发明提供的活性肽饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：
1)制备种子液：
将芽孢杆菌、曲霉菌、青霉、放线菌中的一种或几种，接入灭菌后的液体培养基中，于25～35℃培养24～48小时，得到种子液；
所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，马铃薯浸液50～100ml，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，豆粕1.5～2g，生长因子1～2ml，水1000ml；其中的生长因子为含有MgSO4.7H2O 20.00～30.00mg/ml，CaCl2.2H2O 2.20～3.50mg/ml，ZnSO4.7H2O0.81～1.10mg/ml，FeSO4.7H2O 0.44～0.60mg/ml，MnSO4.H2O 0.13～0.20mg/ml，CuSO4.5H2O 0.02～0.04mg/ml的混合物；
所述的芽孢杆菌为腊样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或短小芽孢杆菌；
所述的曲霉菌为黑曲霉菌、栖土曲霉菌、米曲霉菌、肉桂色曲霉菌或宇佐美曲霉菌；
所述的放线菌为绿色糖单孢菌、灰绿链霉菌或费式链霉菌；
所述的青霉菌为紫微青霉、产黄青霉、苹果青霉、淡黄青霉、台湾青霉、杜邦青霉或蓝棕青霉；
2)发酵降解：
将发酵底物粉碎到60～120目后放入发酵罐中，依次加入水和碳源，所加入水的重量与发酵底物所含蛋白质的重量份配比为100∶5～18，所加入碳源的含碳量与发酵底物的含氮量的重量比为1∶2～35，将发酵液在0.1～0.13MPa，115～125℃灭菌10～30分钟，冷却到20～37℃，加入步骤1)得到的种子液，种子液和发酵液的体积比为0.3～1∶10，混合均匀后在25～42℃，以0.5～2.5vvm的速度通入无菌空气，以150～300rpm速度搅拌发酵，期间用常规的茚三酮法显色法测定水解度，24小时前每6小时检测一次水解度，24～48小时之间，每4小时检测一次水解度，48小时后每2小时检测一次水解度，直到水解度达到20～35％，然后于140～145℃灭菌2～8秒，得到活性肽饲料添加剂；
所述的发酵底物为选自植物蛋白或动物蛋白中的一种或几种的混合物；
所述的植物蛋白包括大豆蛋白、豆粕、豆饼、碗豆蛋白、玉米蛋白、红豆蛋白、小麦蛋白、大麦蛋白、棉籽粕或菜籽粕；
所述的动物蛋白包括鱼粉、血粉、羽毛粉、乳蛋白、筋肉、酪蛋白、动物废弃脏器、蚯蚓蛋白粉、鱿鱼蛋白、鱼皮或其它水产动物蛋白；
所述的碳源包括玉米面、红糖、食用白糖、玉米糖浆、淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。
其制备方法还包括步骤3)和步骤4)：
所述步骤3)为蛋白水解液的离心除渣、超滤、浓缩：
将步骤2)得到的经灭菌的蛋白水解液再经5000～7000rpm离心10～30分钟除去渣质，分出的上清液通过超滤膜过滤，得到分子量小于5000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到浓缩液；
所述步骤4)为加载体吸附干燥或喷雾干燥：
加载体吸附干燥是将步骤3)得到的浓缩液，加到预先混合好的载体中，浓缩液与载体的重量比为0.5～0.8∶1，然后在45～80℃干燥，得到活性肽饲料添加剂；所述的载体由2～5重量份有机载体和3～5重量份无机载体组成；所述有机载体包括糠麸类和饼粕类有机载体；所述糠麸类有机载体为麦麸、玉米芯粉、脱脂稻壳粉和脱脂米糠中的一种或几种的混合物；所述饼粕类有机载体为豆粕粉、豆饼粉和玉米蛋白粉中的一种或几种的混合物；所述无机载体为轻质碳酸钙、石粉、麦饭石和沸石粉中的一种或几种的混合物；
喷雾干燥是将步骤3)得到的浓缩液，按操作条件：体积比加入0.3～1％糊精和2～8％轻质碳酸钙，混合均匀后，在喷雾干燥机上按进风100℃～130℃，出风60～80℃，喷压1.8～2.3kg，流量1000～1500ml/min，进行喷雾干燥，得到活性肽饲料添加剂。
本发明提供的活性肽饲料添加剂具有以下功效或用途：
1.提高饲料利用率，降低生产成本。主要基于活性肽能提高动物对营养素(如蛋白质、矿物质、维生素等)吸收利用率，从而提高饲料的转化利用率，减少禽类腿病和骨质疏松症的发生。
2.促进动物生长，能提高生长速度。因活性肽能促进细胞的生长分化、增殖，进而促进动物的生长和长大。同时可减少动物皮下脂肪沉积，提高瘦肉率和出肉率，而且能提高基础代谢率，促进动物微循环。
3.能显著提高瘤胃中纤维素分解菌的数量，提高粗饲料的利用率，从而提高奶牛的产奶量和肉牛、肉羊的生长速度。
4.明显提高蛋禽的产蛋率，延长产蛋高峰期，优化禽蛋中营养素结构和比例，降低胆固醇含量。
5.改善肉、蛋、奶的品质和风味，使味道更鲜、更香。
6.刺激动物免疫器官发育和提高抗病力，明显提高畜禽成活率，降低死淘率。
7.具有明显的抗氧化、抗衰老作用，提高种用动物体能和使用时间。
8.用于水产动物，能明显的改善水质，提高鱼苗的生长速度和存活率，增加虾苗采食量和苗体长度。
该活性肽饲料添加剂的使用方法为：
(1)与饲料混合或拌料(含活性肽有效成分克/吨饲料)，仔猪、肉仔鸡、牛仔、羔羊，80～120克；母猪、育肥猪、奶牛、肥育羊和牛，60～80克；产蛋鸡、鸭、鹅60～80克；水产动物80～120克。
(2)也可直接口服或加入水中饮用。
本发明提供的活性肽饲料添加剂是一种绿色饲料添加剂，与已有技术相比具有以下优越性：
(1)此活性肽饲料添加剂在饲料中的添加量低，每吨饲料仅添加100克左右，是目前肽蛋白饲料的1/10；
(2)该活性肽饲料添加剂的功能明确，具有如下的功能：
①可提高动物对营养素，如蛋白质、矿物质、维生素等重要营养素的吸收利用率，提高饲料利用率，减少禽类腿病和骨质疏松症发生；
②可提高奶、肉、蛋产量和生产能力，改善肉、蛋、奶的品质和风味；
③可刺激动物免疫器官发育和提高抗病力和减少发病率，有效防治畜禽腹泻、肉鸡腹水综合征和水样粪便的发生；
④用于水产动物，能明显的改善水质，提高鱼苗的生长速度和存活率，增加虾苗采食量和苗体长度，可广泛用于禽、牛、羊、猪、水产和经济动物；
(3)该活性肽饲料添加剂的分子量较小；
(4)本发明产品成本低，易于在薄利的养殖行业推广；
(5)本发明产品具有刺激动物免疫器官发育、提高抗病力和减少发病率等功能，可作为抗生素的替代品，降低药物残留；
(6)本发明所采用的方法是微生物发酵法，是酶法成本的1/10，酶解法水解1Kg蛋白原料需要20元成本，本发明的发酵法仅需要需1.8元；而且发酵法生产的活性肽无苦味、无臭味，产品的理化特性良好。
因此本发明提供的活性肽饲料添加剂制品的开发与研制，对于节约饲料、降低成本提高动物生产性能和抗病力具有重大的现实意义和社会意义。
具体实施方式
实施例1、制备活性肽饲料添加剂L-1(液剂)
将枯草芽孢杆菌接入灭菌后的液体培养基中，25℃培养48小时，得到种子液。
所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨1.3g，葡萄糖3g，糖蜜3g，马铃薯浸液50ml，可溶性淀粉10g，蔗糖10g，牛肉膏2g，酵母浸粉3.5g，豆粕粉(60目)1.5g，生长因子1ml，水1000ml；其中的生长因子为含有MgSO4.7H2O 20.00mg/ml，CaCl2.2H2O 2.20mg/ml，ZnSO4.7H2O 0.81mg/ml，FeSO4.7H2O 0.44mg/ml，MnSO4.H2O 0.13mg/ml，CuSO4.5H2O 0.02mg/ml的混合物。
将发酵底物——大豆蛋白粉粉碎到60目后放入发酵罐中，依次加入水和碳源——玉米面和糖蜜(重量比为1∶1)，所加入水的重量与发酵底物所含蛋白质的重量比为100∶5，所加入碳源的含碳量与发酵底物的含氮量的重量比为1∶2，将混合物在0.1MPa，121℃灭菌30分钟，冷却到37℃，加入如前所述得到的种子液，种子液和发酵液的体积比为0.3∶10，混合均匀后在25℃，以0.5vvm的速度通入无菌空气，以150rpm速度搅拌发酵，期间用常规的茚三酮法显色法测定水解度，24小时前每6小时检测一次水解度，24～48小时之间，每4小时检测一次水解度，48小时后每2小时检测一次水解度，直到蛋白水解液的水解度(DH％)达到20％，然后经超高温瞬时灭菌机于140℃灭菌8秒，得到活性肽饲料添加剂L-1(液剂)。
水解度(Degree of Hydrolysis，DH)的测定方法为常规的茚三酮法显色法，现简单介绍如下：
①标准曲线的绘制：首先配制标准甘氨酸溶液，其浓度为20ug/ml；然后依表1所列加样量顺序加样。
表1甘氨酸、茚三酮和乙醇的加样量
| 试管编号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 标准甘氨酸溶液加样量(ml) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 1.5 | 2.0 |
| 蒸馏水加样量(ml) | 2.0 | 1.8 | 1.6 | 1.4 | 1.2 | 1.0 | 0.5 | 0 |
| 终体积2ml时甘氨酸终浓度(ug/ml) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 15 | 20 |
| 茚三酮加样量(ml) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 40％乙醇加样量(ml) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
按表1所列加样量，于具塞试管中依次加入标准甘氨酸溶液、蒸馏水和茚三酮显色剂，在沸水中加热15min，然后于冷水中冷却5min；再加入40％的乙醇溶液终止反应，放置15min；以空白管调零于570nm处测定A(吸光度)值。
②水解蛋白液中-NH2含量的测定
取一定量的蛋白水解液于4000rpm下离心15min，取上清液100μl于25ml容量瓶，定容，亦即稀释250倍。吸取2ml稀释液于具塞试管中并加入1ml茚三酮显色剂，混匀后于沸水中加热15min；然后于冷水中冷却5min；再加5ml 40％的乙醇溶液终止反应，放置15min后，待测。最后，利用标准曲线计算蛋白水解液中-NH2的含量(umol/ml)。
③水解度(DH％)计算
在上式中：
蛋白水解液的相对甘氨酸浓度：是指按上述方法测出的蛋白水解液的吸光度后，由标准曲线换算出的甘氨酸浓度。
发酵底物的蛋白浓度：是指发酵底物(如大豆蛋白等)的蛋白质浓度。
75.07：是甘氨酸的分子量。
7.8mmol/g：是大豆蛋白完全水解后的肽键数(常数)。
0.33mmol/g：是发酵底物(原料)中的肽键数(常数)。
实施例2、制备活性肽饲料添加剂L-2(液剂)
将黑曲霉菌接入灭菌后的液体培养基中，35℃培养24小时，得到种子液。
所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨2.5g，葡萄糖5g，糖蜜5g，马铃薯浸液100ml，可溶性淀粉20g，蔗糖30g，牛肉膏3g，酵母浸粉5g，豆粕2g，生长因子2ml，水1000ml；其中的生长因子为含有MgSO4.7H2O 30.00mg/ml，CaCl2.2H2O3.50mg/ml，ZnSO4.7H2O 1.10mg/ml，FeSO4.7H2O 0.60mg/ml，MnSO4.H2O 0.20mg/ml，CuSO4.5H2O 0.04mg/ml的混合物。
将发酵底物——豆粕粉碎到120目后放入发酵罐中，依次加入水和碳源——玉米糖蜜和白砂糖(重量比＝3∶2)，所加入水的重量与发酵底物所含蛋白质的重量比为100∶18，所加入碳源的含碳量与发酵底物的含氮量的重量比为1∶35，将混合物在0.13MPa，125℃灭菌10分钟，冷却到20℃，加入如前所述得到的种子液，种子液和发酵液的体积比为1∶10，混合均匀后在42℃，以2.5vvm的速度通入无菌空气，以300rpm速度搅拌发酵，期间用常规的茚三酮法显色法测定水解度，24小时前每6小时检测一次水解度，24～48小时之间，每4小时检测一次水解度，48小时后每2小时检测一次水解度，直到蛋白水解液的水解度(DH％)达到35％，然后经超高温瞬时灭菌机于145℃灭菌2秒，得到活性肽饲料添加剂L-2(液剂)。
实施例3、制备活性肽饲料添加剂L-3(液剂)
将绿色糖单孢菌接入灭菌后的液体培养基中，27℃培养36小时，得到种子液。
所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨1.8g，葡萄糖4g，糖蜜4g，马铃薯浸液70ml，可溶性淀粉15g，蔗糖20g，牛肉膏2.5g，酵母浸粉4g，豆粕粉(80目)1.8g，生长因子1.5ml，水1000ml；其中的生长因子为含有MgSO4.7H2O 25.00mg/ml，CaCl2.2H2O 3.00mg/ml，ZnSO4.7H2O 1.00mg/ml，FeSO4.7H2O 0.50mg/ml，MnSO4.H2O0.17mg/ml，CuSO4.5H2O 0.03mg/ml的混合液。
将发酵底物——豆饼粉碎到80目后放入发酵罐中，依次加入水和碳源——淀粉，所加入水的重量与发酵底物所含蛋白质的重量比为100∶10，所加入碳源的含碳量与发酵底物的含氮量的重量比为1∶10，将混合物在0.11MPa，115℃灭菌20分钟，冷却到30℃，加入如前所述得到的种子液，种子液和发酵液的体积比为0.5∶10，混合均匀后在28℃，以1.5vvm的速度通入无菌空气，以180rpm速度搅拌，期间用常规的茚三酮法显色法测定水解度，24小时前每6小时检测一次水解度，24～48小时之间，每4小时检测一次水解度，48小时后每2小时检测一次水解度，直到蛋白水解液的水解度(DH％)达到25％，然后经超高温瞬时灭菌机于142℃灭菌6秒，得到活性肽饲料添加剂L-3(液剂)。
实施例4～27、制备活性肽饲料添加剂L-4～L-27(液剂)
如表2所列，制备活性肽饲料添加剂L-4到L-27(液剂)。
表2、
| 肽类饲料添加剂 | 制备方法 | 制备种子液所用菌种 | 发酵底物 | 碳源 | 蛋白水解液水解度 |
| L-4 | 同实施例1 | 腊样芽孢杆菌 | 鱼粉 | 玉米面 | 22 |
| L-5 | 同实施例2 | 地衣芽孢杆菌 | 血粉 | 红糖 | 24 |
| L-6 | 同实施例3 | 纳豆芽孢杆菌 | 豆粕、豆饼 | 食用白糖 | 34 |
| L-7 | 同实施例1 | 巨大芽孢杆菌 | 碗豆蛋白 | 玉米糖浆 | 32 |
| L-8 | 同实施例2 | 短小芽孢杆菌 | 玉米蛋白 | 甘蔗糖蜜 | 35 |
| L-9 | 同实施例3 | 栖土曲霉菌 | 筋肉 | 甜菜糖蜜 | 26 |
| L-10 | 同实施例1 | 米曲霉菌 | 蚯蚓蛋白粉 | 玉米面、红糖 | 28 |
| L-11 | 同实施例2 | 肉桂色曲霉菌 | 鱿鱼蛋白 | 红糖、食用白糖 | 27 |
| L-12 | 同实施例3 | 宇佐美曲霉菌 | 鱼皮 | 食用白糖、玉米糖浆 | 31 |
| L-13 | 同实施例1 | 灰绿链霉菌 | 红豆蛋白 | 玉米糖浆、淀粉 | 21 |
| L-14 | 同实施例2 | 费式链霉菌 | 小麦蛋白 | 淀粉、甘蔗糖蜜 | 29 |
| L-15 | 同实施例3 | 紫微青霉 | 大麦蛋白 | 淀粉、甜菜糖蜜 | 25 |
| L-16 | 同实施例1 | 产黄青霉 | 棉籽粕 | 淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜 | 23 |
| 糖蜜 | |||||
| L-17 | 同实施例2 | 苹果青霉 | 菜籽粕 | 玉米面 | 30 |
| L-18 | 同实施例3 | 淡黄青霉 | 羽毛粉 | 红糖 | 35 |
| L-19 | 同实施例1 | 台湾青霉 | 乳蛋白 | 食用白糖 | 33 |
| L-20 | 同实施例2 | 杜邦青霉 | 酪蛋白 | 玉米糖浆 | 24 |
| L-21 | 同实施例3 | 蓝棕青霉 | 动物废弃脏器 | 淀粉 | 29 |
| L-22 | 同实施例1 | 腊样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌 | 鱿鱼蛋白、鱼皮 | 甘蔗糖蜜 | 33 |
| L-23 | 同实施例2 | 米曲霉菌、栖土曲霉菌 | 酪蛋白、动物废弃脏器 | 甜菜糖蜜 | 31 |
| L-24 | 同实施例3 | 杜邦青霉、台湾青霉 | 碗豆蛋白、玉米蛋白 | 淀粉 | 28 |
| L-25 | 同实施例1 | 灰绿链霉菌、费式链霉菌 | 血粉、羽毛粉 | 玉米面 | 20 |
| L-26 | 同实施例2 | 米曲霉菌、灰绿链霉菌 | 小麦蛋白、大麦蛋白 | 甘蔗糖蜜 | 25 |
| L-27 | 同实施例3 | 蓝棕青霉、巨大芽孢杆菌 | 豆粕 | 淀粉、甜菜糖蜜 | 28 |
实施例28、制备活性肽饲料添加剂C-1
将实施例1得到的水解度(DH％)为20％的蛋白水解液经5000rpm离心30分钟除去渣质，分出的上清液通过超滤膜过滤，得到分子量小于5000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到浓缩液。
将此浓缩液加到预先混合好的载体中，所述载体为5重量份有机载体(2重量份麦麸，2重量份豆粕粉，1重量份玉米蛋白粉)和5重量份无机载体(轻质碳酸钙)组成，浓缩液与载体的重量比为0.5∶1，然后在45℃干燥，粉碎到80目，得到活性肽饲料添加剂C-1。
实施例29、制备活性肽饲料添加剂C-2
将实施例2得到的水解度(DH％)为35％的蛋白水解液经6000rpm离心20分钟除去渣质，分出的上清液通过超滤膜过滤，得到分子量小于5000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到浓缩液。
将此浓缩液加到预先混合好的载体中，所述载体为2重量份有机载体(玉米芯粉)和3重量份无机载体(石粉)组成，浓缩液与载体的重量比为0.8∶1，然后在80℃干燥，粉碎到80目，得到活性肽饲料添加剂C-2。
实施例30、制备活性肽饲料添加剂C-3
将实施例3得到的水解度(DH％)为25％的蛋白水解液经7000rpm离心10分钟除去渣质，分出的上清液通过超滤膜过滤，得到分子量小于5000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到浓缩液。
将此浓缩液加到预先混合好的载体中，所述载体为3重量份有机载体(脱脂稻壳粉)和4重量份无机载体(麦饭石)，组成，浓缩液与载体的重量比为0.7∶1，然后在60℃干燥，粉碎到80目，得到活性肽饲料添加剂C-3。
实施例31～54、制备活性肽饲料添加剂C-4～C-27
将实施例4～27得到的蛋白水解液分别按实施例28～30的方法，如表3所列，得到活性肽饲料添加剂C-4到C-27。
表3、
| 肽类饲料添加剂 | 蛋白水解液 | 制备方法 | 有机载体 | 无机载体 |
| C-4 | 实施例4 | 同实施例28 | 麦麸2重量份 | 轻质碳酸钙3重量份 |
| C-5 | 实施例5 | 同实施例29 | 玉米芯粉3重量份 | 石粉4重量份 |
| C-6 | 实施例6 | 同实施例30 | 脱脂稻壳粉4重量份 | 麦饭石5重量份 |
| C-7 | 实施例7 | 同实施例28 | 脱脂米糠5重量份 | 沸石粉5重量份 |
| C-8 | 实施例8 | 同实施例29 | 豆粕粉2重量份 | 轻质碳酸钙2重量份石粉2重量份 |
| C-9 | 实施例9 | 同实施例30 | 豆饼粉3重量份 | 石粉1重量份麦饭石1重量份沸石粉1重量份 |
| C-10 | 实施例10 | 同实施例28 | 玉米蛋白粉4重量份 | 麦饭石2重量份沸石粉1重量份 |
| C-11 | 实施例11 | 同实施例29 | 麦麸2重量份玉米芯粉3重量份 | 石粉2重量份麦饭石2重量份 |
| C-12 | 实施例12 | 同实施例30 | 麦麸1重量份 | 轻质碳酸钙2重量份 |
| 脱脂稻壳粉1重量份 | 石粉1重量份麦饭石2重量份 | |||
| C-13 | 实施例13 | 同实施例28 | 麦麸2重量份脱脂米糠1重量份 | 轻质碳酸钙2重量份石粉2重量份 |
| C-14 | 实施例14 | 同实施例29 | 麦麸1重量份豆粕粉3重量份 | 石粉2重量份麦饭石1重量份 |
| C-15 | 实施例15 | 同实施例30 | 麦麸2重量份豆饼粉3重量份 | 轻质碳酸钙3重量份 |
| C-16 | 实施例16 | 同实施例28 | 玉米芯粉1重量份脱脂稻壳粉1重量份 | 石粉4重量份 |
| C-17 | 实施例17 | 同实施例29 | 玉米芯粉1重量份豆粕粉2重量份 | 麦饭石5重量份 |
| C-18 | 实施例18 | 同实施例30 | 脱脂稻壳粉1重量份豆粕粉2重量份玉米蛋白粉1重量份 | 沸石粉5重量份 |
| C-19 | 实施例19 | 同实施例28 | 脱脂米糠1重量份豆粕粉2重量份豆饼粉2重量份 | 轻质碳酸钙4重量份 |
| C-20 | 实施例20 | 同实施例29 | 玉米芯粉1重量份豆粕粉1重量份 | 石粉3重量份 |
| C-21 | 实施例21 | 同实施例30 | 麦麸3重量份 | 麦饭石3重量份 |
| C-22 | 实施例22 | 同实施例28 | 玉米芯粉4重量份 | 沸石粉4重量份 |
| C-23 | 实施例23 | 同实施例29 | 脱脂稻壳粉5重量份 | 轻质碳酸钙5重量份 |
| C-24 | 实施例24 | 同实施例30 | 脱脂米糠2重量份 | 石粉5重量份 |
| C-25 | 实施例25 | 同实施例28 | 豆粕粉3重量份 | 麦饭石4重量份 |
| C-26 | 实施例26 | 同实施例29 | 豆饼粉4重量份 | 沸石粉3重量份 |
| C-27 | 实施例27 | 同实施例30 | 玉米蛋白粉5重量份 | 轻质碳酸钙3重量份 |
实施例55、制备活性肽饲料添加剂S-1
将实施例1得到的水解度(DH％)为20％的蛋白水解液经5000rpm离心30分钟除去渣质，分出的上清液通过超滤膜过滤，得到分子量小于5000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到浓缩液。
将此浓缩液按操作条件：体积比加入0.3％糊精和2％轻质碳酸钙，混合均匀后，在喷雾干燥机上按进风100℃℃，出风60℃，喷压1.8kg，流量1000ml/min，进行喷雾干燥，得到活性肽饲料添加剂S-1。
实施例56、制备活性肽饲料添加剂S-2
将实施例2得到的水解度(DH％)为35％的蛋白水解液经6000rpm离心20分钟除去渣质，分出的上清液通过超滤膜过滤，得到分子量小于5000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到浓缩液。
将此浓缩液按操作条件：体积比加入1％糊精和8％轻质碳酸钙，混合均匀后，在喷雾干燥机上按进风130℃，出风80℃，喷压2.3kg，流量1500ml/min，进行喷雾干燥，得到活性肽饲料添加剂S-2。
实施例57、制备活性肽饲料添加剂S-3
将实施例3得到的水解度(DH％)为25％的蛋白水解液经7000rpm离心10分钟除去渣质，分出的上清液通过超滤膜过滤，得到分子量小于5000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到浓缩液。
将此浓缩液按操作条件：体积比加入0.7％糊精和5％轻质碳酸钙，混合均匀后，在喷雾干燥机上按进风120℃，出风70℃，喷压2.0kg，流量1300ml/min，进行喷雾干燥，得到活性肽饲料添加剂S-3。
实施例58～81、制备活性肽饲料添加剂S-4～S-27
将实施例4～27得到的蛋白水解液分别经5000rpm离心除去渣质，分出的上清液通过膜孔径为5nm的超滤膜过滤；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到浓缩液；将此浓缩液按操作条件：体积比加入0.3～1％糊精和2～8％轻质碳酸钙，混合均匀后，在喷雾干燥机上按进风100℃～130℃，出风60～80℃，喷压1.8～2.3kg.流量1000～1500ml/min，进行喷雾干燥，得到活性肽饲料添加剂S-4到S-27。
根据长期的喂养试验可知，本发明提供的活性肽饲料添加剂无论是以液剂(L-1～L-27)，还是以吸附在载体上的形式(C-1～C-27)或是直接喷雾干燥得到的固体粉末(S-1～S-27)形式饲喂禽类，其效果仅与所含的蛋白水解液的水解度和饲喂量有关，而与饲料的固、液形式无关。
实施例82、活性肽饲料添加剂S-2中肽氨基酸(即活性肽)含量的测定
按照实施例56方法得到的活性肽饲料添加剂S-2，称取样品1.0013g，溶于20ml蒸馏水中，用40ml磺基水杨酸沉淀蛋白质，3000rpm离心30min后，取上清液10000rpm二次离心40min。从上清液中取出2ml溶液，45℃旋转蒸发，然后进行染生(用2ml牛磺酸溶解，在试管中加入400μL0.05mol/L的硼酸，再加入100μL溶解好的样品和600μLFMOC，放置1min)。染生充分后用2000μL正戊烷提取剩余的FMOC。取出100μL染生后的样品加入700μL洗脱液，在高压液相色谱(HPLC)上测定，结果列于表4。
表4、活性肽饲料添加剂S-2中总氨基酸(TAA)、
游离氨基酸(FAA)和肽氨基酸(PAA)的含量
| 氨基酸名称 | FAA(g/g) | TAA(g/g) | PAA(g/g) | PAA占TAA的比例 |
| Asp | 0.002166792 | 0.012578449 | 0.010411657 | 82.77％ |
| Ser | 0.008550902 | 0.02781238 | 0.019261478 | 69.26％ |
| Glu | 0.00011639 | 0.037771759 | 0.037655369 | 99.69％ |
| Thr | 9.3796E-05 | 0.004508148 | 0.004414352 | 97.92％ |
| Gly | 0.004637067 | 0.011950659 | 0.007313592 | 61.20％ |
| Arg | 0 | 0 | 0 | 0.00％ |
| Ala | 0.009697688 | 0.016944848 | 0.00724716 | 42.77％ |
| Tyr | 8.60159E-05 | 0.002721595 | 0.002635579 | 96.84％ |
| Pro | 0.008556269 | 0.023238143 | 0.014681874 | 63.18％ |
| Val | 0 | 0 | 0 | 0.00％ |
| Phe | 0.00100304 | 0.003769058 | 0.002766018 | 73.39％ |
| Ile | 0.013641658 | 0.035264777 | 0.021623119 | 61.32％ |
| leu | 0.004459154 | 0.014044763 | 0.009585609 | 68.25％ |
| His | 0.001131631 | 0.138213842 | 0.137082211 | 99.18％ |
| Lys | 0.005849348 | 0.013225191 | 0.007375843 | 55.77％ |
| 合计 | 0.059989751 | 0.342043613 | 0.282053861 | 82.46％ |
注：FAA为游离氨基酸，TAA为总氨基酸，PAA为肽氨基酸
如表4所示，活性肽饲料添加剂S-2中肽氨基酸占总氨基酸含量的82.46％，亦即肽含量为82.46％，而游离氨基酸仅占总氨基酸的17.54％。其中组氨酸的含量最高为0.138213842g/g，谷氨酸次之，含量为0.037771759g/g。游离氨基酸中的丙氨酸含量高于肽氨基酸中丙氨酸含量，其余氨基酸都是肽中含量较高。这说明发酵所得的活性肽饲料添加剂S-2中既含有肽，也含有游离氨基酸，但以活性肽为主(占82.46％)，游离氨基酸所占比例很小。
实施例83、活性肽饲料添加剂的溶解度
表5列出了豆粕发酵前及发酵后得到的产物——活性肽饲料添加剂S-2在不同酸碱度条件下的溶解度
表5、豆粕发酵前后溶解度的变化
| pH | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| S-2(％) | 32.68 | 35.92 | 33.07 | 35.04 | 37.73 | 37.36 | 36.86 | 40.45 |
| 豆粕(％) | 34.4 | 1.97 | 2.36 | 3.21 | 13.53 | 21.71 | 25.97 | 27.02 |
由表5可以看出，发酵前的豆粕的溶解度在pH＝2(极酸性条件下)时最高，为34.4％，随着酸性降低，当pH值为3、4、5时溶解度急剧下降到1.97％～3.21％，此后，随着酸性进一步降低，溶解度又逐渐回升；在pH值＝9时(强碱性条件下)达到了27.02％。而发酵后得到的产物——活性肽饲料添加剂S-2无论酸碱性如何变化(pH2～9)，均具有较高的溶解性，明显高于发酵前的豆粕，而且在不同pH值的条件下溶解性基本保持平稳状态，最低为32.68％，最高为40.45％。可见，本发明提供的活性肽饲料添加剂具有很好的溶解性和在不同酸碱酸碱度条件下的稳定性。
实施例84、大豆活性肽和大豆蛋白的热稳定性
大豆肽的热稳定性是指将大豆肽溶液在100℃水浴锅中加热30min后，测定其吸光度值(OD)，计算加热后与加热前OD值比值的百分比，计为溶解度(％)，即溶解度％＝加热后OD值/加热前OD值*100％，见表6，溶解度(％)低，说明加热后产生沉淀，沉入底部，使溶液清亮，从而OD值减小，标志着稳定性差。
大豆肽和大豆粕的热稳定性方法为：各取一定体积的1％的大豆肽溶液和豆粕溶液，分别调至不同的pH(2～9)值，4000rpm，离心15min。测定时取上清液于420nm处测其吸光值，后于100℃水浴锅中加热30min，按上述方法于420nm处测吸光值。通过比较两次OD值，反映其热稳定性。
表6、大豆肽和大豆蛋白溶解度随pH的变化
| pH值 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 大豆肽溶解度％ | 83.2 | 58.17 | 93.65 | 89.86 | 94.28 | 90.61 | 96.92 | 89.92 |
| 大豆蛋白溶解度％ | 77.40 | 36.68 | 69.23 | 65.08 | 74.60 | 61.09 | 75.76 | 87.90 |
由表6可知，大豆肽的热稳定性较其母本蛋白有大幅度提高。在pH＝2时，大豆肽和大豆蛋白的热稳定性均在80％左右，而在pH＝3时，大豆蛋白的溶解度较大豆肽有大幅度下降，说明大豆肽的溶解性好于大豆蛋白。此外，大豆肽的热稳定性pH在大幅度的变化范围内均较为平稳，说明大豆肽具有良好的热稳定性。这与其母本——大豆蛋白不同，热处理后其溶解性大幅度下降，即说明热稳定性差。
实施例85、活性肽饲料添加剂的储藏稳定性
表7、大豆蛋白发酵前后的吸光值
| A0(初始值，常温) | A1(4℃，12h) | A2(100℃，30min，然后冷却至4℃) | |
| S-1 | 1.0116 | 1.0245 | 1.1462 |
| 大豆蛋白 | 0.0123 | 0.0140 | 0.0185 |
表7列出了大豆蛋白发酵前及发酵后得到的产物——活性肽饲料添加剂S-1的吸光值。由此可知，经4℃冷藏后活性肽饲料添加剂S-1的色泽和浊度均无较大变化，说明冷藏并没有使肽溶液中肽分子产生沉淀，但经100℃，30min加热和突然冷却至4℃，其吸光值有较大变化，但与发酵前的母本大豆蛋白相比较，吸光值变化较小，说明在相同浓度的条件下，本发明的活性肽饲料添加剂的溶液储藏稳定性比其母本蛋白明显优越。
实施例86、使用本发明活性肽饲料添加剂在养猪生产中应用
为检验本发明产品的功效和在养猪业上的应用效果，以及代替抗生素的可行性。试验选取体重接近健康的35日龄断奶仔猪(公母各半)180头分为5个处理，每个处理(组)36头猪，每个处理6个重复，每个重复6头猪，均为3公3母，试验期8周(2个月)，试验结果列于表8。
五个处理如下所示：
空白对照组：不添加任何添加剂，仅饲喂猪基础日粮；
抗生素对照组：粉剂金霉素100mg/kg，均匀混合于基础日粮中；
活性肽1组：40mg/kg实施例56的活性肽饲料添加剂S-2，均匀混合于基础日粮中；
活性肽2组：120mg/kg实施例56的活性肽饲料添加剂S-2，均匀混合于基础日粮中；
活性肽3组：200mg/kg实施例56的活性肽饲料添加剂S-2，均匀混合于基础日粮中。
表8、在养猪生产中的使用效果
| 处理/重复 | 29～50日龄平均日增重(Kg) | 29～50日龄料重比 |
| 空白对照组 | 0.2707±0.01 | 2.23±0.09 |
| 抗生素对照组(金霉素100mg/kg) | 0.3261±0.02 | 1.68±0.08 |
| 活性肽1组(40mg/kg) | 0.3049±0.01 | 1.76±0.07 |
| 活性肽2组(120mg/kg) | 0.3364±0.02 | 1.68±0.07 |
| 活性肽3组(200mg/kg) | 0.3171±0.01 | 1.84±0.17 |
从表8可以看出，添加了活性肽饲料添加剂S-2的3个活性肽组的平均日增重和饲料转化效率均好于空白对照组，可明显提高猪只的生产性能，即日增重和饲料转化效率。
其中活性肽2组(有效成分120mg/kg饲料)的平均日增重和饲料转化效率显著好于空白对照组及抗生素组，完全可以替代抗生素。
实施例87、使用本发明活性肽饲料添加剂在蛋鸡饲养中的应用
为检验活性肽饲料添加剂在蛋鸡上的使用效果和在畜牧业上的应用前景，试验选用海赛褐壳蛋鸡后期鸡3000羽，分三组，每组1000只蛋鸡，分5个重复，每个重复200只鸡，喂以3种不同的日粮，即A组为空白对照组，B组每吨饲料添加20克实施例57的活性肽饲料添加剂S-3(即0.05％的活性肽添加剂)，C组每吨饲料添加40克实施例57的活性肽饲料添加剂S-3(即0.1％的活性肽添加剂)。试验期2个月，结果列于表9。检测指标为破蛋率(％)、产蛋率(％)、蛋重(克/个蛋)、死淘率(％)、饲料转化效率(耗料g/kg蛋)。
表9、在蛋鸡饲养中的应用
注：同行数字右肩标有不同小写字母者为差异显著(P＜0.05)。
从表9可以看出，随着活性肽饲料添加剂的添加量的增加，产蛋率明显增加，且A、B、C三组间均存在显著性差异(p＜0.05)，其中，添加活性肽40/mg使产蛋率提高了4.6％。在饲料转化效率(料/蛋比)方面，添加活性肽能明显降低料蛋比，即明显提高了饲料转化效率，且差异显著(p＜0.05)，但B组与C组差异不显著(p＞0.05)；在蛋鸡日粮中添加活性肽40/mg能明显增加蛋重达3.5克/枚，增加幅度达5.4％，与对照组差异显著(p＜0.05)，还明显可降低死淘率和破蛋率，这些都有助于降低养殖成本。总之，本试验表明，在蛋鸡饲料中添加活性肽饲料添加剂能可明显提高蛋禽产蛋率，增加蛋重，降低料蛋比、破蛋率，降低死淘率，提高饲料利用率、生产性能和降低生产成本。
由营养生化试验的研究表明，活性或小肽的吸收具有耗能低、不易饱和且各种肽之间运转无竞争性与抑制性的特点，同时肽本身对于氨基酸或肽的转运的促进作用，所以在蛋鸡日粮中添加本发明的活性肽饲料添加剂能提高产蛋率、降低饲料消耗和增加蛋重。
实施例88、本发明的活性肽饲料添加剂对鸡外周血T-淋巴细胞增殖活力的影响
为检测本发明的活性肽饲料添加剂对鸡外周血T-淋巴细胞增殖活力的影响，即检测本发明产品对肉仔鸡细胞免疫力的作用效果或影响程度。进行了微量法淋巴细胞转化试验，即在肉仔鸡淋巴细胞培养液中加入不同剂量的无菌活性肽液，观察活性肽对肉仔鸡血液中淋巴细胞增殖活力的影响，具体方法如下：
(1)从饲养3周龄的肉仔鸡上采血：在灭菌的采血管中加入无菌肝素，从鸡翅经脉采血4ml，轻轻摇动让肝素与血液充分混合、静置1小时，得到无菌抗凝血液。
(2)从无菌抗凝血液中分离淋巴细胞(全程进行无菌操作)：将肝素抗凝血先用无钙镁Hank’s液作1∶1稀释，在尖底离心管加淋巴细胞分层液6ml，然后沿管壁缓缓叠加3mlHank’s液稀释的肝素抗凝血，水平式离心机3000转/分离心30分钟，可见液体分为三层：上层为血浆，中层为分离液，下层为红细胞和粒细胞。在上层和中层之间的界面上可见一薄层混浊带，此为淋巴细胞和单核细胞的混合物。用吸管吸弃血浆层直至距淋巴细胞层0.5cm处，然后将淋巴细胞层及少许分离液一起吸出，移入10ml离心管中，加入5倍以上体积的pH7.2-7.4无钙镁Hank’s液，混匀，以2000rpm离心沉淀10分钟，弃去上清液，同法再洗涤二次。沉淀的淋巴细胞用RPMI1640培养(不含FCS)配成1×107/ml淋巴细胞悬液。
(3)淋巴细胞纯度鉴定：取上述淋巴细胞悬液涂片，自然干燥后，瑞氏染液染色1min，加等量PBS缓冲液继续染色4min，蒸馏水冲洗凉干，显微镜观察，淋巴细胞纯度的95％以上。
(4)细胞培养：在96孔细胞培养板上，每孔加入淋巴细胞悬液60μl，在培养液中不加或加入浓度为640μg/ml的小肽母液60μl，使小肽在培养液中的最终浓度为0、0.0234375％、0.046875％、0.09375％、0.1875％、0.375％、0.75％、1.5％，重复三孔。由RPMI1640培养液(共四组，所含FCS分别为0、5％、10％、15％)将总培养体积调整至200μl，2置5％CO2，37℃分别培养48h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液70μl(血清蛋白是细胞培养液的基本成份，血清蛋白在有机溶剂中容易变性形成絮状沉淀，影响透光度。为了减少血清的影响，加MTT前尽量去掉培养上清)，然后不同组每孔加入2.5mg/ml、5.0mg/ml、7.5mg/ml MTT 10μl，于振荡器上混匀约1分钟，继续培养4h。培养结束后，每孔加入0.04M酸化异丙醇100μl，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。
(5)结果检测：用酶联免疫检测仪，在测定波长570nm，参考波长630nm处测定光密度值(OD值)，以OD值表示淋巴细胞的增殖活力。结果见表10。
表10、对鸡外周血T-淋巴细胞增殖活力的影响
| 指标 | 结果 | ||||||
| 活性肽浓度 | 0.00％ | 0.03％ | 0.05％ | 0.10％ | 0.20％ | 0.40％ | 0.80％ |
| T细胞活力(OD值) | 0.2078 | 0.4223 | 1.7575 | 2.0822 | 2.1562 | 2.1602 | 2.4192 |
由表10的数据可以看出，活性饲料添加剂具有刺激动物免疫功能，增强动物T细胞活力的功能，T细胞是畜禽动物体内参与非特异性免疫(如抗肿瘤、抗病毒)和细胞免疫的主力军，其活力的增强说明可提高动物的抗病力。
实施例89、本发明的活性肽饲料添加剂对鸡的牛血清白蛋白(BSA)抗体效价的影响
为检测本发明的活性肽饲料添加剂对肉鸡对牛血清白蛋白(BSA)特异性抗体效价的影响，将肉仔鸡分为5个组，每个组分成5个重复，每个重复20只鸡，试期7周。试验设计见表11，基础日粮配比及营养水平见表12。分别于35日龄、42日龄给肉鸡左右腿肌各注射牛血清白蛋白0.5ml(牛血清白蛋白浓度为2.5mg/kg)
表11、肉鸡饲养试验设计
| 组别 | 处理组 | 成品添加量(/吨饲料) | 有效成分(g/吨饲料) |
| A | 空白对照 | 0 | 0 |
| B | 抗生素对照(新霉素+金霉素) | 20+100g | 20+100 |
| C | 0.1％活性肽 | 1kg | 40.0 |
| D | 0.3％活性肽 | 3kg | 120.0 |
| E | 0.5％活性肽 | 5kg | 200.0 |
表12、肉仔鸡日粮配方及营养水平
| 饲料 | 配比(％) | 营养素 | 营养水平 | ||
| 0-3周 | 4-7周 | 0-3周 | 4-7周 | ||
| 玉米 | 55.8 | 59.8 | 代谢能(MJ/kg) | 2900.11 | 3000.55 |
| 豆粕 | 37.6 | 32.2 | 粗蛋白(％) | 21.03 | 19.00 |
| 豆油 | 2.3 | 3.36 | 钙(％) | 1.01 | 0.91 |
| 石粉 | 1.3 | 1.2 | 总磷(％) | 0.70 | 0.64 |
| 磷酸氢钙 | 1.92 | 1.7 | 有效磷(％) | 0.45 | 0.41 |
| 沸石粉 | 0.66 | 赖氨酸(％) | 1.10 | 0.96 | |
| 赖氨酸 | 0.02 | 蛋氨酸(％) | 0.45 | 0.36 | |
| 蛋氨酸 | 0.14 | 0.07 | 蛋+胱(％) | 0.79 | 0.67 |
| 食盐 | 0.3 | 0.3 | 食盐(％) | 0.3 | 0.3 |
| 预混料 | 1 | 1 | |||
注：预混料向每千克全价料提供：Cu 6mg，Fe 75mg，Zn 75mg，Mn 80mg，Se0.2mg，I 0.4mg，沸石粉1mg，胆碱3mg。维生素A 6000IU，维生素D3 2000IU，维生素E 12IU，维生素K3 2mg，生物素0.05mg，叶酸0.4mg，烟酸32mg，泛酸7mg，维生素B1 1mg，维生素B2 5mg，维生素B6 1mg，维生素B12 10ug。
于28日龄、49日龄每组组取12只鸡心脏采血，然后3000rpm离心10min分离血清，冻存于-20℃冰箱中，用酶联免疫方法(ELISA)检测BSA抗体效价，结果以OD值表示，见表13。
表13、28日龄添加活性肽对肉仔鸡BSA抗体效价的影响
| 组别 | BSA抗体效价(以OD值表示) |
| A(空白对照组，无药) | 0.453±0.019 |
| B(抗生素对照组，120克) | 0.451±0.022 |
| C(添加肽0.1％，含活性肽40g/t饲料) | 0.599±0.021 |
| D(添加肽0.3％，，含活性肽120g/t饲料) | 0.673±0.032 |
| E(添加肽0.5％，，含活性肽200g/t饲料) | 0.680±0.041 |
从表13可以看出，添加活性肽组的肉仔鸡的抗体效价明显高于空白对照组和抗生素组，特别是D组和E组更为显著。说明活性肽饲料添加剂可明显提高肉仔鸡的抗体效价，抗体效价是衡量机体抵抗病原能力的重要指标，抗体效价高即表明机体的抗病力强。
实施例90、本发明的活性肽饲料添加剂对肉仔鸡生产性能(增重速度和耗料)的影响
按实施例89饲养肉鸡，在1日龄入雏时和4周龄末(28日龄)、7周龄末(49日龄)分别以重复为单位称重，并统计耗料量，计算0～4周和4～7周龄的死亡只数、增重、采食量以及料肉比。结果见表14。
表14、49日龄添加活性肽对肉仔鸡生产性能的影响
| 组别 | 增重(kg) | 采食量(kg) | 料肉比 |
| A(空白对照组) | 2.333±0.076 | 5.190±0.004Aa | 2.227±0.073 |
| B(抗生素对照组) | 2.349±0.094 | 5.184±0.008Aa | 2.210±0.092 |
| C(添加肽0.1％) | 2.314±0.119 | 5.124±0.004Bb | 2.219±0.121 |
| D(添加肽0.3％) | 2.380±0.072 | 5.180±0.005Aa | 2.178±0.064 |
| E(添加肽0.5％) | 2.377±0.075 | 5.153±0.003Cc | 2.176±0.069 |
表14的数据表明，D组和E组鸡的体重比空白对照组分别提高47克和44克，比抗生素组分别提高31克和28克，同时，D组和E组鸡的耗料量也明显低于其他组。说明添加生物活性肽可明显提高肉鸡的增重，也能提高饲料转化效率，节约饲料开支，提高经济效益。
实施例91、本发明的活性肽饲料添加剂对肉仔鸡产品品质的影响
按实施例89饲养肉鸡，在28日龄和49日龄时，做禽肉品质测定.每个重复取两只鸡称重、屠宰，每个处理10只鸡，取胸肌、腿肌和腹脂(仅49天时取)，计算胸肌率、腿肌率和腹脂率。结果见表15。
表15、肉仔鸡出栏(7周龄)时的产品品质指数
| 组别 | 胸肌占胴体的％ | 腿肌占胴体的％ | 腹脂占胴体的％ |
| A(空白对照组) | 6.78±0.46 | 6.79±0.42 | 1.76±0.31a |
| B(抗生素对照组) | 6.79±0.53 | 6.81±0.72 | 1.74±0.27ab |
| C(添加肽0.1％) | 7.22±0.60 | 6.95±0.63 | 1.63±0.45c |
| D(添加肽0.3％) | 7.35±0.56 | 7.06±0.42 | 1.62±0.34cd |
| E(添加肽0.5％) | 7.49±0.97 | 7.26±0.73 | 1.62±0.46cd |
表15说明，添加活性肽饲料添加剂可明显提高肉仔鸡胸肌和腿肌的比率，同时能降低腹部脂肪的数量，即能明显改善肉鸡胴体(去毛去内脏的净堂鸡)的品质。
Claims (9)
1、一种活性肽饲料添加剂，其为由如下制备方法将发酵底物经发酵、水解且水解度控制在20～35％，并且经超高温瞬时灭菌得到的蛋白水解液，所述的制备方法包括如下步骤：
1)制备种子液：
将芽孢杆菌、曲霉菌、青霉、放线菌中的一种或几种，接入灭菌后的液体培养基中，于25～35℃培养24～48小时，得到种子液；
所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，马铃薯浸液50～100ml，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，豆粕1.5～2g，生长因子1～2ml，水1000ml；其中的生长因子为含有MgSO4.7H2O 20.00～30.00mg/ml，CaCl2.2H2O 2.20～3.50mg/ml，ZnSO4.7H2O0.81～1.10mg/ml，FeSO4.7H2O 0.44～0.60mg/ml，MnSO4.H2O 0.13～0.20mg/mg/ml，CuSO4.5H2O 0.02～0.04mg/ml的混合物；
2)发酵降解：
将发酵底物粉碎到60～120目后放入发酵罐中，依次加入水和碳源，所加入水的重量与发酵底物所含蛋白质的重量份配比为100∶5～18，所加入碳源的含碳量与发酵底物的含氮量的重量比为1∶2～35，将发酵液在0.1～0.13MPa，115～125℃灭菌10～30分钟，冷却到20～37℃，加入步骤1)得到的种子液，种子液和发酵液的体积比为0.3～1∶10，混合均匀后在25～42℃，以0.5～2.5vvm的速度通入无菌空气，以150～300rpm速度搅拌发酵，期间用常规的茚三酮法显色法测定水解度，24小时前每6小时检测一次水解度，24～48小时之间，每4小时检测一次水解度，48小时后每2小时检测一次水解度，直到水解度达到20～35％，然后于140～145℃灭菌2～8秒，得到活性肽饲料添加剂；
所述的发酵底物为选自植物蛋白或动物蛋白中的一种或几种的混合物；
所述的碳源包括玉米面、红糖、食用白糖、玉米糖浆、淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。
2、如权利要求1所述的活性肽饲料添加剂，其特征在于，所述的芽孢杆菌为腊样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或短小芽孢杆菌；所述的曲霉菌为黑曲霉菌、栖土曲霉菌、米曲霉菌、肉桂色曲霉菌或宇佐美曲霉菌；所述的放线菌为绿色糖单孢菌、灰绿链霉菌或费式链霉菌；所述的青霉菌为紫微青霉、产黄青霉、苹果青霉、淡黄青霉、台湾青霉、杜邦青霉或蓝棕青霉。
3、如权利要求1所述的活性肽饲料添加剂，其特征在于，所述的植物蛋白包括大豆蛋白、豆粕、豆饼、碗豆蛋白、玉米蛋白、红豆蛋白、小麦蛋白、大麦蛋白、棉籽粕和菜籽粕；所述的动物蛋白包括鱼粉、血粉、羽毛粉、乳蛋白、筋肉、酪蛋白、动物废弃脏器、蚯蚓蛋白粉、鱿鱼蛋白和鱼皮。
4、如权利要求1所述的活性肽饲料添加剂，其特征在于，其制备方法还包括步骤3)和步骤4)：
所述步骤3)为蛋白水解液的离心除渣、超滤、浓缩：
将步骤2)得到的经灭菌的蛋白水解液再经5000～7000rpm离心10～30分钟除去渣质，分出的上清液通过超滤膜过滤，得到分子量小于5000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到浓缩液；
所述步骤4)为加载体吸附干燥或喷雾干燥：
加载体吸附干燥是将步骤3)得到的浓缩液，加到预先混合好的载体中，浓缩液与载体的重量比为0.5～0.8∶1，然后在45～80℃干燥，得到活性肽饲料添加剂；所述的载体由2～5重量份有机载体和3～5重量份无机载体组成；所述有机载体包括糠麸类和饼粕类有机载体；所述糠麸类有机载体为麦麸、玉米芯粉、脱脂稻壳粉和脱脂米糠中的一种或几种的混合物；所述饼粕类有机载体为豆粕粉、豆饼粉和玉米蛋白粉中的一种或几种的混合物；所述无机载体为轻质碳酸钙、石粉、麦饭石和沸石粉中的一种或几种的混合物；
喷雾干燥是将步骤3)得到的浓缩液，喷雾干燥，得到活性肽饲料添加剂。
5、一种权利要求1所述的活性肽饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：
1)制备种子液：
将芽孢杆菌、曲霉菌、青霉、放线菌中的一种或几种，接入灭菌后的液体培养基中，于25～35℃培养24～48小时，得到种子液；
所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，马铃薯浸液50～100ml，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，豆粕1.5～2g，生长因子1～2ml，水1000ml；其中的生长因子为含有MgSO4.7H2O 20.00～30.00mg/ml，CaCl2.2H2O 2.20～3.50mg/ml，ZnSO4.7H2O0.81～1.10mg/ml，FeSO4.7H2O 0.44～0.60mg/ml，MnSO4.H2O 0.13～0.20mg/ml，CuSO4.5H2O 0.02～0.04mg/ml的混合物；
2)发酵降解：
将发酵底物粉碎到60～120目后放入发酵罐中，依次加入水和碳源，所加入水的重量与发酵底物所含蛋白质的重量份配比为100∶5～18，所加入碳源的含碳量与发酵底物的含氮量的重量比为1∶2～35，将发酵液在0.1～0.13MPa，115～125℃灭菌10～30分钟，冷却到20～37℃，加入步骤1)得到的种子液，种子液和发酵液的体积比为0.3～1∶10，混合均匀后在25～42℃，以0.5～2.5vvm的速度通入无菌空气，以150～300rpm速度搅拌发酵，期间用常规的茚三酮法显色法测定水解度，24小时前每6小时检测一次水解度，24～48小时之间，每4小时检测一次水解度，48小时后每2小时检测一次水解度，直到水解度达到20～35％，然后于140～145℃灭菌2～8秒，得到活性肽饲料添加剂；
所述的发酵底物为选自植物蛋白或动物蛋白中的一种或几种的混合物；
所述的碳源包括玉米面、红糖、食用白糖、玉米糖浆、淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。
6、如权利要求5所述的活性肽饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述的芽孢杆菌为腊样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或短小芽孢杆菌；所述的曲霉菌为黑曲霉菌、栖土曲霉菌、米曲霉菌、肉桂色曲霉菌或宇佐美曲霉菌；所述的放线菌为绿色糖单孢菌、灰绿链霉菌或费式链霉菌；所述的青霉菌为紫微青霉、产黄青霉、苹果青霉、淡黄青霉、台湾青霉、杜邦青霉或蓝棕青霉。
7、如权利要求5所述的活性肽饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述的植物蛋白包括大豆蛋白、豆粕、豆饼、碗豆蛋白、玉米蛋白、红豆蛋白、小麦蛋白、大麦蛋白、棉籽粕和菜籽粕；所述的动物蛋白包括鱼粉、血粉、羽毛粉、乳蛋白、筋肉、酪蛋白、动物废弃脏器、蚯蚓蛋白粉、鱿鱼蛋白和鱼皮。
8、如权利要求5所述的活性肽饲料添加剂的制备方法，其特征在于，还包括步骤3)和步骤4)：
所述步骤3)为蛋白水解液的离心除渣、超滤、浓缩：
将步骤2)得到的经灭菌的蛋白水解液再经5000～7000rpm离心10～30分钟除去渣质，分出的上清液通过超滤膜过滤，得到分子量小于5000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到浓缩液；
所述步骤4)为加载体吸附干燥或喷雾干燥：
加载体吸附干燥是将步骤3)得到的浓缩液，加到预先混合好的载体中，浓缩液与载体的重量比为0.5～0.8∶1，然后在45～80℃干燥，得到活性肽饲料添加剂；所述的载体由2～5重量份有机载体和3～5重量份无机载体组成；所述有机载体包括糠麸类和饼粕类有机载体；所述糠麸类有机载体为麦麸、玉米芯粉、脱脂稻壳粉和脱脂米糠中的一种或几种的混合物；所述饼粕类有机载体为豆粕粉、豆饼粉和玉米蛋白粉中的一种或几种的混合物；所述无机载体为轻质碳酸钙、石粉、麦饭石和沸石粉中的一种或几种的混合物；
喷雾干燥是将步骤3)得到的浓缩液，喷雾干燥，得到活性肽饲料添加剂。
9、一种权利要求1所述的活性肽饲料添加剂作为饲料添加剂的用途。
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