CN1281147C - 一种微生物饲料添加剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物饲料添加剂，具体地说是涉及一种由多种有益微生物和其代谢产物(如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等)组成的微生物饲料添加剂，及其制备方法和用途。该微生物饲料添加剂为将枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、乳酸杆菌和酿酒酵母菌分别进行液体深层高密度发酵培养的发酵液或干粉的混合物，并根据实际用途将其混合而成通用型、幼龄动物专用型、中大龄动物专用型、反刍动物(牛羊等)专用型、制粒饲料专用型的液剂或粉剂。该微生物饲料添加剂的活菌含量高、产品保存时间长、杂菌污染少、能提高饲料利用效率，促进动物生长，增加肉蛋奶等产量，改善肠道菌群或酶的平衡，提高免疫力和抗病力，替代抗生素等，改善动物产品品质。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物饲料添加剂，具体地说是涉及一种由多种有益微生物和其代谢产物(如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等)组成的微生物饲料添加剂及其制备方法和用途。
背景技术
饲料工业和养殖业中一些促生长保健剂的使用推动了畜牧业的迅猛发展，但同时又给人类健康和饲料业的发展带来了许多潜在的威胁。目前饲料和畜禽养殖中滥用抗生素、化学合成药物、激素、β-兴奋剂、重金属、镇静剂等促生长保健剂，导致一系列问题和后果：(1)导致畜禽产品中药物残留严重，直接危害人体健康，甚至产生“三致”，并使我国的畜禽产品和水产品在进入国际市场时，面临重重障碍，每年遭受巨大的经济损失。(2)导致畜禽产品品质下降，缺乏市场竞争力和信任感。目前在饲料中广泛使用的对氨基苯胂(砷)酸等砷制剂，被国际癌症研究机构(IARC，1980)列为致癌因子。另外，在养猪业中长期使用镇静剂等，引起药物残留。我国卫生部报道(1998)，中国每年新增200万癌症患者，其中100万人死去。这使消费者对畜禽产品产生“恐食症”。(3)导致细菌耐药性增强、耐药菌株增多，结果用药无效，威胁人类安全，科学界称之为“细菌复仇”。世界卫生组织专家认为，通过牲畜产生的各种抗药性病菌，可以通过食品传给人，并产生很难治愈的疾病，危害人类健康。同时，金霉素、土霉素、氯霉素、喹乙醇、磺胺药物、马杜霉素等易残留和毒性较大的抗生素及合成抗菌药物的大量使用，导致药物残留增加，耐药菌株扩散，动物菌群失调，动物的免疫力受到抑制，继发二次感染。(4)引起生态环境破坏。环境保护正日益成为世界各国人民越来越关心的问题。集约化畜禽生产造成的污染已成为制约畜禽生产的重要因素。据EEC报告，欧洲一氧化二氮(N2O)和甲烷排放量中分别有33％和34％来自畜禽饲养场。一氧化二氮在光化学作用下，可形成二氧化氮，又可与臭氧作用，可引起皮肤癌。集约化养殖中，畜禽排出大量的氨态氮和磷等，氨是一种污染性很强的物质，通过改变水和土壤酸碱性而影响植物的生长。此外，单胃动物由于无法利用植酸磷而将摄入体内的70％磷排泄掉，饲料中使用高铜制剂或砷制剂，也会经动物排泄物而污染水源和耕地，最终经食物链进入人体。目前一些并不安全的促生长保健剂在我国有1000多家兽药企业生产销售，达300亿元，这不仅导致畜禽产品残留增加，也污染了环境。
鉴于上述饲料和畜禽养殖中存在的诸多问题，抗生素等药物添加剂的使用已受到消费者的普遍反对，近些年，消费者特别注重食品的安全、卫生和健康，形成了“健康的动物→安全的食品→健康的人类”之共识，因而对食品质量的要求十分苛刻。为此，世界各国对抗生素各自采取了禁用或限制使用的坚决措施，如欧盟从2006年全部禁用抗生素，世界卫生组织(WHO)提出了“在食用动物中减少抗生素使用的全球原则”，中国已启动“饲料安全工程”，并禁用了一批毒性和残留较大的药物。面对世界各国的消费者对食品“安全、健康、营养”和回归自然的强烈要求，各个国家正在积极开发绿色饲料添加剂或绿色促生长保健剂。微生物饲料添加剂或称微生态活菌制剂、益生素，以其天然、无毒、无副作用、无耐药性、无环境污染，并可以促进动物生长和增重、增强机体免疫机能、降低动物死亡率、提高饲料转化率和动物饲养效益等优点，受到世界各国科学家和动物饲养者的广泛认同和亲睐。在饲料或动物饲养中应用微生物饲料添加剂，可替代抗生素或大幅度消减抗生素等药物的用量，提高畜禽产品的品质和风味以及增强畜禽产品的国际竞争力，有利于畜牧业的持续和健康发展，有利于动物和人类的健康，有利于环境保护。因此，开发和生产微生物绿色饲料添加剂，具有重要的现实、生态和经济意义。
微生物饲料添加剂，在国际上统称为益生素(Probiotics)，其通用的定义是指含活菌和(或)死菌，包括其组分和产物的细菌制品，经口或经由其它粘膜途径投入，旨在改善粘膜表面微生物或酶的平衡，或者刺激特异性或非特异性免疫机制(1994，德国国际会议上40多个国家参加的最新定义)。
乳酸杆菌、酵母菌和芽孢杆菌是具有各自的生物学特点和功能的益生菌类。其中，乳酸杆菌是一种喜欢在厌氧或少氧环境中生存的微生物，是动物消化道内正常微生物区系中的优势菌群，与动物“终生为伴，终生为益”，发挥着拮抗病原微生物(如大肠杆菌和沙门氏菌等)、启动特异和非特异性免疫系统(增强免疫力和抗病力)、降低胆固醇、中和肠毒素、合成营养物质、产生消化酶类并调节畜禽营养代谢等功能。酵母菌是耗氧微生物，它不仅能帮助动物消化，还能促进消化道内源有益微生物的活力，补充B族维生素，其细胞壁多糖还具有刺激动物免疫力，提高抗病力的功效。益生型芽孢杆菌，属于耗氧型微生物，它们进入消化道后能迅速发育、生长，产生很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶等活性物质，对蛋白质、脂肪、碳水化合物等营养物质的消化、吸收和利用发挥着重要的调控作用，还能产生维生素B和维生素K，通过降低消化道内氧化还原电位，以及产生少量抗菌物质，来对有害微生物起到抑制和杀灭作用，同时，其孢子对热、压、酸、碱、酶及某些药物、X射线等不良环境具有很强的耐受性，在饲料加工、贮存及消化道中稳定性好，无需特殊保护性处理，就能存活很长时间，因此，可广泛适用于猪、牛、鸡等家畜、禽以及水产动物。
目前，一些饲料企业都在积极寻找和研究新的绿色环保的微生物饲料添加剂。但市场上的此类微生物饲料添加剂一般多为使用乳酸杆菌、酵母菌和芽孢杆菌中的一种制得的单菌制剂，功能单一，产品中活菌含量低，生产工艺和设备较落后，活菌细胞存活时间短，品质较差，且杂菌污染严重，使用效果不理想、不稳定。
发明内容
本发明的目的在于利用包括乳酸杆菌、酵母菌和芽孢杆菌在内的三类4株有益功能微生物合理复合配伍、采用液体深层发酵技术和一系列后加工工艺技术，来克服现有的微生物饲料添加剂功能单一、产品中活菌含量低、活菌细胞存活时间短、产品杂菌污染严重、使用效果不理想、功效不稳定的缺陷，从而提供一种活菌含量高、产品保存时间长、杂菌污染少、能提高饲料营养成分和饲料利用率的微生物饲料添加剂。
本发明的另一目的在于提供所述微生物饲料添加剂的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述微生物饲料添加剂的用途。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：
本发明提供一种微生物饲料添加剂，其液剂型为将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)和酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)分别进行液体深层发酵培养，并将各单菌的发酵液混合而得，混合的发酵液中枯草芽孢杆菌+蜡状芽孢杆菌+乳酸杆菌+酿酒酵母菌的活菌数有三个规格，即≥1亿/ml，≥10亿/ml和≥100亿/ml。
所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的发酵液的液体深层发酵培养方法，包括如下的步骤：
1)平板培养复壮：将枯草芽孢杆菌和腊状芽孢杆菌菌种分别采用划线接种的方法在芽孢杆菌平板培养基上划线接种，于25～35℃培养12～24小时，分别使枯草芽孢杆菌和腊状芽孢杆菌复壮，并形成单菌落；所述的芽孢杆菌平板培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合物：蛋白胨0.5～1％、葡萄糖0.5～2％、牛肉膏0.5～1.5％、磷酸二氢钾0.3～0.6％、琼脂3～4％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，备用；
2)制作摇瓶种子：从步骤1)培养的枯草芽孢杆菌和腊状芽孢杆菌菌落中分别挑单菌落，接种到芽孢杆菌液体培养基中，于28～37℃培养20～30小时，得到枯草芽孢杆菌和腊状芽孢杆菌摇瓶种子液；所述的芽孢杆菌液体培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：蛋白胨0.5～1％、葡萄糖0.5～2％、牛肉膏0.5～1.5％、磷酸二氢钾0.3～0.6％、3.08％硫酸锰溶液0.5～1.5％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，备用；
3)生产一级种子液：将步骤2)得到的枯草芽孢杆菌摇瓶种子液和腊状芽孢杆菌摇瓶种子液以2～5v％的接种量，分别接种于生产所用的一级种子罐的一级种子液体培养基中，于32～37℃培养18～24h，搅拌速度150～200rpm，通气量为1～2vols/vol/min(简写为：vvm)，分别得到枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的一级种子液；所述的一级种子液体培养基配方为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：120目豆粕粉0.5～2.0％、120目鱼粉0.2～1.5％、120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖1.0～4.5％、NaCl 0.1～0.3％、NaOH 0.05～0.10％、Na2HPO40.1～0.5％、增效剂0.05～0.2％，消泡剂0.05～0.1％，pH＝7.5～7.6，经121℃灭菌30～45分钟，冷却到32～37℃；所述的增效剂在在先申请200410008993.3中公开，为由MgSO40.1～0.5g/L，CaCl21.0～4.0g/L，ZnSO40.2～1.5g/L，FeSO40.1～0.8g/L，CuSO40.01～0.05g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MnSO40.3～1.5g/L组成的水溶液；
4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的枯草芽孢杆菌和腊状芽孢杆菌一级种子，分别以5～10％的体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子液体培养基，发酵16～24小时后，通过显微镜观察，有大量芽孢形成时停止发酵。
在工业上生产时，当需要更大规模(20吨以上发酵罐)的生产量时，还包括步骤5)进行三级发酵：
5)三级发酵：将步骤4)得到的枯草芽孢杆菌和腊状芽孢杆菌二级种子，以5～10％体积的比例接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同步骤3)，发酵16～24小时后，通过显微镜观察，有大量芽孢形成时，停机。
所述的乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)的发酵液的培养方法，包括如下的步骤：
1)平板培养复壮：将乳酸杆菌斜面种子采用划线接种的方法在乳酸杆菌平板培养基上划线接种，于33～38℃培养24～48小时，使乳酸杆菌复壮，并形成单菌落；所述的乳酸杆菌平板培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合物：大豆蛋白胨0.5～1％、葡萄糖1～2％、酵母浸粉0.3～0.7％、磷酸二氢钾0.3～0.5％、牛肉膏0.5～1.5％、柠檬酸三铵1.5～2.3％、Tween-800.5～1.4％、乙酸钠0.2～0.6％、琼脂粉2～2.5％，pH＝5.5～5.8，121℃灭菌15分钟，备用；
2)制作摇瓶种子：将步骤1)培养的乳酸杆菌菌落中挑单菌落，接种到乳酸杆菌液体培养基中，采用常规方法在三角瓶液体培养基上于35～40℃培养24～48小时，得到乳酸杆菌摇瓶种子；所述的培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：大豆蛋白胨0.5～1％、葡萄糖1～2％、酵母浸粉0.3～0.7％、磷酸二氢钾0.3～0.5％、牛肉膏0.5～1.5％、柠檬酸三铵1.5～2.3％、Tween-800.5～1.4％、乙酸钠0.2～0.6％，pH＝5.5～5.8，121℃灭菌15分钟，备用；
3)生产一级种子液：将步骤2)得到的乳酸杆菌摇瓶种子以6～12v％的接种量，接种于生产所用的一级种子罐的一级种子液体培养基中，于35～38℃培养17～60h，搅拌速度150～200rpm，间隔1小时通气5～10分钟，通气量为1～2.5vols/vol/min(vvm)，直至乳酸杆菌数达到10亿，得到乳酸杆菌的一级种子液；所述的一级种子液体培养基配方为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：120目豆粕粉0.5～2.0％、120目鱼粉0.5～1.0％、鱼蛋白胨0.5～2％，乳糖0.2～1.5％，120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖1～2.5％、NaCl0.1～0.3％、Na2HPO40.15～0.3％、增效剂0.05～0.3％，消泡剂0.03～0.1％，pH＝5.5～5.8，经121℃灭菌30～45分钟，冷却到32～37℃；所述的增效剂在先申请200410008992.9中公开，为由CaCl22～4g/L，ZnSO40.5～1.5g/L，FeSO40.2～1.0g/L，CuSO40.01～0.08g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MgSO40.1～0.5g/L组成的水溶液；
4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的乳酸杆菌一级种子，以5～10％体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子液体培养基，发酵17～60小时后，检测pH值下降到5.0左右时(此时，多次试验的结果表明，乳酸杆菌量已达到大于109CFU/ml发酵液)停止发酵。
在工业上生产时，当需要更大规模(20吨以上发酵罐)的生产量时，还包括步骤5)进行三级发酵：
5)三级发酵：将步骤4)得到的乳酸杆菌二级种子，以5～10％体积的比例接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同步骤3)，发酵17～60小时后，检测直至乳酸杆菌数达到10亿/ml，停机。
所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的发酵液的培养方法，包括如下的步骤：
1)平板培养复壮：将酿酒酵母斜面种子采用划线接种的方法在酿酒酵母平板培养基上划线接种，于24～30℃培养20～24小时，使酿酒酵母复壮，并形成单菌落；所述的酿酒酵母平板培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合物：大豆蛋白胨0.2～0.7％、葡萄糖0.5～1.5％、酵母浸粉0.1～0.5％、麦芽膏0.2～1％、琼脂粉2～3％，pH＝5.8～6.0，121℃灭菌15分钟，备用；
2)制作摇瓶种子：从步骤1)培养的酿酒酵母培养平板中挑单菌落，接种到三角瓶液体培养液中，于28～32℃培养24～37小时，得到酿酒酵母摇瓶种子液；所述的培养液为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：大豆蛋白胨0.2～0.7％、葡萄糖0.5～1.5％、酵母浸粉0.1～0.5％、麦芽膏0.2～1％，pH＝5.8～6.0，121℃灭菌15分钟，备用；
3)生产一级种子液：将步骤2)得到的酿酒酵母摇瓶种子按2～12v％的接种量，接种于一级种子罐的一级种子培养液中，于28～32℃培养24～37小时，搅拌速度160～220rpm，通气量为1.0～3.0vols/vol/min(vvm)，得到酿酒酵母的一级种子液；所述的酿酒酵母一级种子培养液为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：120目豆粕粉0.5～1.5％、120目鱼粉0.2～0.8％、120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖0.3～1.0％、NaCl0.1～0.3％、Na2HPO40.2～0.5％、增效剂0.05～0.2％，消泡剂0.03～0.1％，pH＝5.8～6.0，经121℃灭菌30～45分钟，冷却到32～37℃；所述的增效剂在先申请200410008994.8中公开，为由MgSO40.05～0.3g/L，CaCl22.5～4g/L，ZnSO40.6～1.5g/L，FeSO40.1～1.0g/L，MnSO40.4～0.8g/L，CuSO40.02～0.08g/L组成的水溶液；
4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的酿酒酵母一级种子，以4～10％体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子培养液，发酵24～60小时后，检测酿酒酵母菌数达到10亿/ml时停止发酵。
在工业上生产时，当需要更大规模(20吨以上发酵罐)的生产量时，还包括步骤5)进行三级发酵：
5)三级发酵：将步骤4)得到的酿酒酵母二级种子，以5～10％体积的比例接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同步骤3)，发酵24～60小时后，检测直至酿酒酵母菌数达到10亿/ml，停机。
本发明提供的微生物添加剂液剂为将上述芽孢杆菌发酵液、乳酸杆菌发酵液、酵母发酵液按照各自的平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用灭菌水将活菌含量分别稀释到108CFU/ml、109CFU/ml或1010CFU/ml，然后根据实际用途按照下述体积比配制而成：
液剂型微生物添加剂通用型的配比为：
枯草芽孢杆菌发酵液 10～30v％；蜡状芽孢杆菌发酵液 10～30v％；
乳酸杆菌发酵液 30～50v％；酿酒酵母菌发酵液 10～30v％。
液剂型微生物添加剂幼龄动物专用型的配比为：
枯草芽孢杆菌发酵液 10～20v％；蜡状芽孢杆菌发酵液 10～20v％；
乳酸杆菌发酵液 40～60v％；酿酒酵母菌发酵液 15～25v％。
液剂型微生物添加剂中大龄动物专用型的配比为：
枯草芽孢杆菌发酵液 20～40v％；蜡状芽孢杆菌发酵液 15～30v％；
乳酸杆菌发酵液 20～40v％；酿酒酵母菌发酵液 10～25v％。
液剂型微生物添加剂反刍动物(牛羊等)专用型的配比为：
枯草芽孢杆菌发酵液 15～30v％；蜡状芽孢杆菌发酵液 10～30v％；
乳酸杆菌发酵液 30～40v％；酿酒酵母菌发酵液 15～35v％。
液剂型微生物添加剂制粒饲料专用型的配比为：
枯草芽孢杆菌发酵液 30～40v％；蜡状芽孢杆菌发酵液 20～30v％；
乳酸杆菌发酵液 20～30v％；酿酒酵母菌发酵液 10～20v％。
本发明提供的微生物饲料添加剂，其粉剂型为将上述枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、乳酸杆菌和酿酒酵母菌的发酵液经不同的后加工工艺制成干粉，按如下比例配制的混合物，干粉中枯草芽孢杆菌+蜡状芽孢杆菌+乳酸杆菌+酿酒酵母菌的活菌数有三个规格，即≥1亿/ml，≥10亿/ml和≥100亿/ml。
所述的枯草芽孢杆菌干粉和蜡状芽孢杆菌干粉的制备方法，包括如下的步骤：
将枯草芽孢杆菌的发酵液和蜡状芽孢杆菌的发酵液，分别按照发酵液与载体的重量比为0.5～0.8∶1的比例混合均匀，呈湿粉状，然后在流化干燥床上于80～100℃干燥后粉碎到80目以上，分别得到枯草芽孢杆菌干粉和蜡状芽孢杆菌干粉；所述的载体(吸附剂)配比为：轻质CaCO325～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％；
或是将枯草芽孢杆菌的发酵液和蜡状芽孢杆菌的发酵液分别按体积与重量比加入发酵液体积0.3～0.8％的糊精和3～10％的轻质碳酸钙，混合均匀后，在喷雾干燥机上按进风100～130℃，出风60～90℃，喷压2kg，流量1000～1500ml/min，进行喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌喷雾干粉和蜡状芽孢杆菌喷雾干粉。
所述的乳酸菌干粉的制备方法，包括如下的步骤：
1)将上述乳酸菌的发酵液经热低温(＜45℃)负压真空浓缩到原体积的40～60％；
2)加入占浓缩液的重量/体积百分比15～20％的保护剂，混合均匀后于-25～-45℃冷冻干燥，得到乳酸菌冻干粉；所述的保护剂为脱脂奶粉、白砂糖(蔗糖)、麦芽糊精、明胶按1∶2∶1∶1比例混合而成；
或是将乳酸菌的浓缩液加入预先混合好的载体中，浓缩液与载体的重量比为0.4～0.9∶1，然后经流化床45～60℃干燥，粉碎到80目以上，得到乳酸菌干粉；所述载体包括：轻质CaCO330～40wt％、次粉15～30wt％、玉米蛋白粉18～20wt％。
所述的酿酒酵母菌干粉的制备方法，包括如下的步骤：
1)将上述酿酒酵母菌的发酵液经热低温(＜45℃)负压真空浓缩到原体积的40～60％，得到酿酒酵母菌的浓缩液；
2)将酿酒酵母菌的浓缩液加入预先混合好的载体中，浓缩液与载体的重量比为0.6～0.9∶1，然后流化床干燥，干燥温度45～60℃，得到酿酒酵母菌干粉；所述载体包括：轻质CaCO330～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉18～20wt％。
本发明提供的微生物添加剂粉剂为将上述芽孢杆菌干粉、乳酸杆菌干粉按照各自的平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用载体将活菌含量分别稀释到108CFU/g、109CFU/g或1010CFU/g，所述的载体配比为：轻质CaCO325～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％，然后根据实际用途按照下述重量比配制而成：
粉剂型微生物添加剂通用型的配比：
枯草芽孢杆菌干粉 10～30wt％；蜡状芽孢杆菌干粉 10～30wt％；
乳酸杆菌干粉 30～50wt％；酿酒酵母菌干粉 10～30wt％。
粉剂型微生物添加剂幼龄动物专用型的配比为：
枯草芽孢杆菌干粉 10～20wt％；蜡状芽孢杆菌干粉 10～20wt％；
乳酸杆菌干粉 40～60wt％；酿酒酵母菌干粉 15～25wt％。
粉剂型微生物添加剂中大龄动物专用型的配比为：
枯草芽孢杆菌干粉 20～40wt％；蜡状芽孢杆菌干粉 15～30wt％；
乳酸杆菌干粉 20～40wt％；酿酒酵母菌干粉 10～25wt％。
粉剂型微生物添加剂反刍动物(牛羊等)专用型的配比为：
枯草芽孢杆菌干粉 15～30wt％；蜡状芽孢杆菌干粉 10～30wt％；
乳酸杆菌干粉 30～40wt％；酿酒酵母菌干粉 15～35wt％。
粉剂型微生物添加剂制粒饲料专用型的配比为：
枯草芽孢杆菌干粉 30～40wt％；蜡状芽孢杆菌干粉 20～30wt％；
乳酸杆菌干粉 20～30wt％；酿酒酵母菌干粉 10～20wt％。
本发明提供的上述微生物饲料添加剂的质量标准如下：
液剂：4种微生物的活菌总和≥108/毫升(1亿)，109/毫升(10亿)和1010/毫升(100亿)3种型号或规格，均棕黄色液体，较浓的酸香味；酸性液体，pH≤4.5。
粉剂：4种微生物的活菌总和≥1亿/克，10亿/克和100亿/克3种型号或规格，为淡黄白色粉沫，水份≤9％，灰份≤8％，砷≤0.5mg/kg，铅≤1.0mg/kg。
本发明提供一种所述的微生物饲料添加剂的用途。该添加剂用作抗生素替代品或产酶益生素(加酶益生素)，消除药物残留，提高肉蛋奶等产品品质，可用于防治各种动物拉稀腹泻，提高动物生产性能(增加肉、蛋、奶产量)、提高免疫力、抗病力和饲料转化效率、降低动物死淘率，还可用于制作青贮、黄贮饲料和生物饲料，棉粕(饼)和菜粕(饼)脱毒，净化厩舍环境(除臭降氨)和净化鱼虾池水质等。
本发明提供的微生物饲料添加剂(益生康)主要由安全高效有益的芽孢菌、乳酸菌、酵母菌等以及微生物产生的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素分解酶及抑菌活性物质组成，所选菌种属于美国食品药物管理局和美国饲料管理协会公布的微生物种类，符合GRAS标准，可广泛用于畜禽和水产生态养殖中，是无公害的绿色饲料添加剂。本发明提供的微生物饲料添加剂利用酵母菌和芽孢杆菌能消耗胃肠道食物中溶解氧的特点，为内源性厌氧有益微生物如乳酸菌类、双歧杆菌等提供厌氧环境，同时厌氧环境可抑制喜氧有害微生物如大肠杆菌和沙门氏菌等的生长繁殖，从而维护动物肠道菌群的平衡和动物的健康，同时发挥了三类有益菌和肠内源性有益菌的功能，最终起到促生长、提高生产效率和饲料利用率以及保健作用。与现有微生物添加剂的技术相比，在发酵工艺、后处理工艺、活菌含量和功效稳定性等方面，本发明提供的微生物饲料添加剂的优益之处在于：
1)该产品无毒副作用、无耐药性、无残留、成本低、效果显著；
2)采用液体深层高密度发酵法代替固体发酵法，活菌含量高，生产效率高，液剂3种规格产品中的活菌分别可达108/毫升、109/毫升或1010/毫升，粉剂3种规格产品中的活菌也可达108/g、109/g或1010/g，不同规格、不同的剂型可适用于不同的用户群，具有更强的实用性或市场适应性；
3)本发明产品的生产过程中，一是采用液体深层高密度发酵技术(灭菌彻底、条件可控性强)，避免了粗放的固体发酵过程中产生的杂菌污染，或灭菌不彻底而在发酵过程中杂菌繁殖，致使有害菌和目标菌(有益菌)一起混合生长，产品不纯等问题；二是本发明在后处理工艺中，对载体或吸附剂先经流化干燥床在105℃，1～2分钟的干燥灭菌处理，杀灭载体原料中的一些有害菌，使得产品的目标菌成分纯度高，功效明确、稳定，不会因杂菌的存在影响产品的功效；
4)本发明的微生物饲料添加剂为4种有益菌，科学组合，比例搭配得当合理，功能齐全、明确，功效强；
5)在发酵过程中加入了增效剂，使益生菌总数比现有产品提高几倍到几十倍，且延长了产品的储存期，提高了产品的功效稳定性；
6)本方法生产的产品成本低廉，适合于在饲料生产和畜牧、水产养殖中广泛使用，具有显著的经济效益、社会效益和生态效益。
具体实施方式
实施例1、培养枯草芽孢杆菌的发酵液(A)
1)平板培养复壮：将枯草芽孢杆菌的保藏菌种采用划线接种的方法在芽孢杆菌平板培养基上划线接种，于30℃培养18小时，使枯草芽孢杆菌复壮，并形成单菌落；所述的枯草芽孢杆菌培养基为按下述比例配制的混合物：蛋白胨0.5％(W/V，下同)、葡萄糖0.5％、牛肉膏0.5％、磷酸二氢钾0.3％、琼脂3％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，备用；
2)制作摇瓶(三角瓶)种子：从步骤1)培养的枯草芽孢杆菌菌落中挑选典型的单菌落，接种到芽孢杆菌液体培养基中，于32℃培养30小时，得到枯草芽孢杆菌摇瓶种子液；所述的芽孢杆菌液体培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨0.5％、葡萄糖2％、牛肉膏0.5％、磷酸二氢钾0.6％、3.08％硫酸锰溶液1.0％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，备用；
3)生产一级种子液：先按照后述的配方配制一级种子液体培养基，pH＝7.5～7.6，经121℃，灭菌45分钟，冷却到37℃，然后将步骤2)得到的枯草芽孢杆菌摇瓶种子液以2v％的接种量，分别接种于生产所用的一级种子罐中，于37℃培养24h，搅拌速度200rpm，通气量为2vvm，得到枯草芽孢杆菌的一级种子液；所述的一级种子液体培养基配方为按下述比例配制的混合液(W/V)，120目豆粕粉1.0％、120目鱼粉1.0％、120目玉米面0.5％、葡萄糖2.0％、NaCl 0.2％、NaOH 0.08％、Na2HPO40.3％、增效剂0.1％，消泡剂0.08％；所述的增效剂在先申请200410008993.3中公开，为由MgSO40.1～0.5g/L，CaCl21.0～4.0g/L，ZnSO40.2～1.5g/L，FeSO40.1～0.8g/L，CuSO40.01～0.05g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MnSO40.3～1.5g/L组成的水溶液；
4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的枯草芽孢杆菌一级种子，以10％体积的比例接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同步骤3)，发酵20小时后，通过显微镜观察，有大量芽孢形成时，停机，得到枯草芽孢杆菌的发酵液。最后按照枯草芽孢杆菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对枯草芽孢杆菌发酵液的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用灭菌自来水将活菌含量分别稀释到108CFU/ml、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到枯草芽孢杆菌发酵液的备用液(A)，待后处理。
实施例2、培养枯草芽孢杆菌的发酵液(A)
1)平板培养复壮：将枯草芽孢杆菌的保藏菌种采用划线接种的方法在芽孢杆菌平板培养基上划线接种，于30℃培养18小时，使枯草芽孢杆菌复壮，并形成单菌落；所述的枯草芽孢杆菌培养基为按下述比例配制的混合物：蛋白胨0.5％(％指重量体积百分比，下同)、葡萄糖0.5％、牛肉膏0.5％、磷酸二氢钾0.3％、琼脂3％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，备用；
2)制作摇瓶(三角瓶)种子：从步骤1)培养的枯草芽孢杆菌菌落中挑选典型的单菌落，接种到芽孢杆菌液体培养基中，于32℃培养30小时，得到枯草芽孢杆菌摇瓶种子液；所述的芽孢杆菌液体培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨0.5％、葡萄糖2％、牛肉膏0.5％、磷酸二氢钾0.6％、3.08％硫酸锰溶液1.0％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，备用；
3)生产一级种子液：先按照后述的配方配制一级种子液体培养基，pH＝7.5～7.6，经121℃，灭菌45分钟，冷却到37℃，然后将步骤2)得到的枯草芽孢杆菌摇瓶种子液以2v％的接种量，分别接种于生产所用的一级种子罐中，于37℃培养24h，搅拌速度200rpm，通气量为2vvm，得到枯草芽孢杆菌的一级种子液；所述的一级种子液体培养基配方为按下述比例配制的混合液(W/V)，120目豆粕粉1.0％、120目鱼粉1.0％、120目玉米面0.5％、葡萄糖2.0％、NaCl0.2％、NaOH0.08％、Na2HPO40.3％、增效剂0.1％，消泡剂0.08％；所述的增效剂在先申请200410008993.3中公开，为由MgSO40.1～0.5g/L，CaCl21.0～4.0g/L，ZnSO40.2～1.5g/L，FeSO40.1～0.8g/L，CuSO40.01～0.05g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MnSO40.3～1.5g/L组成的水溶液；
4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的枯草芽孢杆菌一级种子，以10％体积的比例接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同步骤3)，发酵16小时后，停机，得到枯草芽孢杆菌的二级种子。
5)三级发酵：将步骤4)得到的枯草芽孢杆菌二级种子，以5％体积的比例接种到装有生产发酵培养液的三级发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同步骤3)，发酵20小时后，通过显微镜观察，有大量芽孢形成时，停机，得到枯草芽孢杆菌发酵液。最后按照枯草芽孢杆菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对枯草芽孢杆菌发酵液的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用灭菌自来水将活菌含量分别稀释到108CFU/ml、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到枯草芽孢杆菌发酵液的备用液(A)，待后处理。
实施例3、培养蜡状芽孢杆菌的发酵液(B)
微生物种类为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，培养基、条件、制备方法同实施例1，得到蜡状芽孢杆菌发酵液，最后按照腊样芽孢杆菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对腊样芽孢杆菌发酵液的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用灭菌自来水将活菌含量分别稀释到108CFU/ml、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到蜡状芽孢杆菌发酵液的备用液(B)，待后处理。
实施例4、培养蜡状芽孢杆菌的发酵液(B)
1)微生物种类为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，培养基、条件、制备方法同实施例2，得到蜡状芽孢杆菌二级种子液。
2)三级发酵：将步骤1)得到的蜡状芽孢杆菌二级种子，以8％体积的比例接种到发酵培养液的三级发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同步骤2)，发酵22小时后，通过显微镜观察，有大量芽孢形成时，停机，得到蜡状芽孢杆菌发酵液，最后按照腊样芽孢杆菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对腊样芽孢杆菌发酵液的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用灭菌自来水将活菌含量分别稀释到108CFU/ml、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到蜡状芽孢杆菌发酵液的备用液(B)，待后处理。
实施例5、二级培养乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)发酵液(C)
1)平板培养复壮：将保藏的乳酸杆菌斜面种子采用划线接种的方法在乳酸杆菌平板培养基上划线接种，于33℃培养24小时，使乳酸杆菌复壮，并形成单菌落；所述的乳酸杆菌培养基为按下述比例配制的混合物：大豆蛋白胨1％、葡萄糖2％、酵母浸粉0.7wt％、磷酸二氢钾0.3％、牛肉膏0.5％、柠檬酸三铵2.3％、Tween-801.4％、乙酸钠0.2％、琼脂粉2％，pH＝5.5～5.8，121℃，灭菌15分钟，备用；
2)制作摇瓶种子：将步骤1)培养的乳酸杆菌菌落中挑选典型的单菌落，接种到乳酸杆菌液体培养基中，采用常规方法在三角瓶液体培养基上于35℃培养30小时，得到乳酸杆菌摇瓶种子；所述的培养基为按下述比例配制的混合液：大豆蛋白胨1％、葡萄糖1％、酵母浸粉0.7wt％、磷酸二氢钾0.5％、牛肉膏0.5％、柠檬酸三铵1.5％、Tween-800.5％、乙酸钠0.6％，pH＝5.5～5.8，115℃，灭菌15分钟，备用；
3)生产一级种子液：先按照后述的配方配制一级种子液体培养基，经121℃，灭菌45分钟，pH＝5.5～5.8，冷却到37℃，然后将步骤2)得到的乳酸杆菌摇瓶种子以8v％的接种量，接种于生产所用的一级种子罐中，于35℃培养30h，搅速150rpm，间隔1小时通气5分钟，通气量为1.0vvm，直至乳酸杆菌数达到10亿，得到乳酸杆菌生产所用的一级种子液；所述的一级种子发酵培养液为按下述比例配制的混合液(W/V)：120目豆粕粉0.5、120目鱼粉0.5％、鱼蛋白胨0.5％，乳糖0.2％，120目玉米面0.5％、葡萄糖1％、NaCl0.1％、Na2HPO40.15％、增效剂0.05％，消泡剂0.03％，pH＝5.5～5.8；所述的增效剂在先申请200410008992.9中公开，为由CaCl22～4g/L，ZnSO40.5～1.5g/L，FeSO40.2～1.0g/L，CuSO40.01～0.08g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MgSO40.1～0.5g/L组成的水溶液；所述的培养基同于步骤2)中的培养基；
4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的乳酸杆菌一级种子，以10％体积的比例接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同步骤3)，发酵24小时，得到乳酸杆菌发酵液，最后按照乳酸杆菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对乳酸杆菌发酵液的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用灭菌自来水将活菌含量分别稀释到108CFU/ml、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到乳酸杆菌发酵液的备用液(C)，待后处理。
实施例6、三级发酵乳酸杆菌液(C)
1)平板培养复壮：将保藏的乳酸杆菌斜面种子采用划线接种的方法在乳酸杆菌平板培养基上划线接种，于33℃培养24小时，使乳酸杆菌复壮，并形成单菌落；所述的乳酸杆菌培养基为按下述比例配制的混合物：大豆蛋白胨1％、葡萄糖2％、酵母浸粉0.7wt％、磷酸二氢钾0.3％、牛肉膏0.5％、柠檬酸三铵2.3％、Tween-801.4％、乙酸钠0.2％、琼脂粉2％，pH＝5.5～5.8，121℃，灭菌15分钟，备用；
2)制作摇瓶种子：将步骤1)培养的乳酸杆菌菌落中挑选典型的单菌落，接种到乳酸杆菌液体培养基中，采用常规方法在三角瓶液体培养基上于35℃培养30小时，得到乳酸杆菌摇瓶种子；所述的培养基为按下述比例配制的混合液：大豆蛋白胨1％、葡萄糖1％、酵母浸粉0.7wt％、磷酸二氢钾0.5％、牛肉膏0.5％、柠檬酸三铵1.5％、Tween-800.5％、乙酸钠0.6％，pH＝5.5～5.8，115℃，灭菌15分钟，备用；
3)生产一级种子液：先按照后述的配方配制一级种子液体培养基，经121℃，灭菌45分钟，pH＝5.5～5.8，冷却到37℃，然后将步骤2)得到的乳酸杆菌摇瓶种子以8v％的接种量，接种于生产所用的一级种子罐中，于35℃培养30h，搅速150rpm，间隔1小时通气5分钟，通气量为1.0vvm，直至乳酸杆菌数达到10亿，得到乳酸杆菌生产所用的一级种子液；所述的一级种子发酵培养液为按下述比例配制的混合液(W/V)：120目豆粕粉0.5、120目鱼粉0.5％、鱼蛋白胨0.5％，乳糖0.2％，120目玉米面0.5％、葡萄糖1％、NaCl 0.1％、Na2HPO40.15％、增效剂0.05％，消泡剂0.03％，pH＝5.5～5.8；所述的增效剂在先申请200410008992.9中公开，为由CaCl22～4g/L，ZnSO40.5～1.5g/L，FeSO40.2～1.0g/L，CuSO40.01～0.08g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MgSO40.1～0.5g/L组成的水溶液；所述的培养基同于步骤2)中的培养基；
4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的乳酸杆菌一级种子，以10％体积的比例接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同步骤3)，发酵30小时后，检测pH值下降到5.0左右时(此时，多次试验的结果表明，乳酸杆菌量已达到大于109CFU/ml发酵液)，停机，得到乳酸杆菌的发酵液，最后按照乳酸杆菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对乳酸杆菌发酵液的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用灭菌自来水将活菌含量分别稀释到108CFU/ml、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到乳酸杆菌发酵液的备用液(C)，待后处理。
实施例7、二级发酵培养酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵液(D)
1)平板培养复壮：将保藏的酿酒酵母斜面种子采用划线接种的方法在酿酒酵母平板培养基上划线接种，于24～30℃培养20～24小时，使酿酒酵母复壮，并形成单菌落；所述的培养基为按下述比例配制的混合物：大豆蛋白胨0.5％、葡萄糖0.8％、酵母浸粉0.3％、麦芽膏0.7％、琼脂粉3％，pH＝5.8～6.0，121℃，灭菌15分钟，备用；
2)制作摇瓶种子：从步骤1)培养的酿酒酵母培养平板中挑选典型的单菌落，接种到三角瓶液体培养液中，于28～32℃培养24～37小时，得到酿酒酵母摇瓶种子液；所述的摇瓶种子培养液为按下述比例配制的混合液：大豆蛋白胨0.5％、葡萄糖1.0％、酵母浸粉0.4％、麦芽膏0.8％，pH＝5.8～6.0，121℃，灭菌15分钟，备用；
3)生产一级种子液：先按照后述的酿酒酵母培养基配方配制一级种子液体培养基，经121℃，灭菌45分钟，pH＝5.8～6.0，冷却到35℃，然后将步骤2)得到的酿酒酵母摇瓶种子按10v％的比例接种于一级种子罐中，于35℃培养35小时，搅拌速度180rpm，通气量为1.5VVM，得到酿酒酵母生产所用的一级种子液；所述的酿酒酵母一级种培养液为按下述比例配制的混合液：120目豆粕粉0.9％、120目鱼粉0.8％、120目玉米面0.9％、葡萄糖0.8％、NaCl0.2％、Na2HPO40.5％、增效剂0.1％，消泡剂0.1％；所述的增效剂在先申请200410008994.8中公开，为由MgSO40.05～0.3g/L，CaCl22.5～4g/L，ZnSO40.6～1.5g/L，FeSO40.1～1.0g/L，MnSO40.4～0.Sg/L，CuSO40.02～0.08g/L组成的水溶液。
4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的酿酒酵母一级种子，以5％体积的比例接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同步骤3)，发酵36小时后，检测直至酿酒酵母菌数达到10亿/ml，停机，得到酿酒酵母菌的发酵液，最后按照酵母平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对酵母发酵液的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用灭菌自来水将活菌含量分别稀释到108CFU/ml、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到酵母发酵液的备用液(D)，待后处理。
实施例8、三级发酵培养酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵液(D)
1)平板培养复壮：将保藏的酿酒酵母斜面种子采用划线接种的方法在酿酒酵母平板培养基上划线接种，于24～30℃培养20～24小时，使酿酒酵母复壮，并形成单菌落；所述的培养基为按下述比例配制的混合物：大豆蛋白胨0.5％、葡萄糖0.8％、酵母浸粉0.3％、麦芽膏0.7％、琼脂粉3％，pH＝5.8～6.0，121℃，灭菌15分钟，备用；
2)制作摇瓶种子：从步骤1)培养的酿酒酵母培养平板中挑选典型的单菌落，接种到三角瓶液体培养液中，于28～32℃培养24～37小时，得到酿酒酵母摇瓶种子液；所述的摇瓶种子培养液为按下述比例配制的混合液：大豆蛋白胨0.5％、葡萄糖1.0％、酵母浸粉0.4％、麦芽膏0.8％，pH＝5.8～6.0，121℃，灭菌15分钟，备用；
3)生产一级种子液：先按照后述的酿酒酵母培养基配方配制一级种子液体培养基，经121℃，灭菌45分钟，pH＝5.8～6.0，冷却到32～37℃，然后将步骤2)得到的酿酒酵母摇瓶种子按8v％的接种量，接种于一级种子罐中，于32℃培养35小时，搅速220rpm，通气量为2.5VVM，得到酿酒酵母一级种子液；所述的酿酒酵母一级种培养液为按下述比例配制的混合液：120目豆粕粉0.9％、120目鱼粉0.8％、120目玉米面0.9％、葡萄糖0.8％、NaCl0.2％、Na2HPO40.5％、增效剂0.1％，消泡剂0.03％；所述的增效剂在先申请200410008994.8中公开，为由MgSO40.05～0.3g/L，CaCl22.5～4g/L，ZnSO40.6～1.5g/L，FeSO40.1～1.0g/L，MnSO40.4～0.8g/L，CuSO40.02～0.08g/L组成的水溶液。
4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的酿酒酵母一级种子，以7％体积的比例接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同步骤3)，发酵30小时后得到酿酒酵母菌的二级种子。
5)三级发酵：将步骤4)得到的酿酒酵母二级种子，以5％体积的比例接种到装有生产发酵培养液的三级发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同步骤3)，发酵36小时后，检测直至酿酒酵母菌数达到10亿/ml，停机，得到酿酒酵母发酵液，最后按照酵母平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对酵母发酵液的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用灭菌自来水将活菌含量分别稀释到108CFU/m1、109CFU/ml和1010CFU/ml，得到酵母发酵液的备用液(D)。
实施例9～30、制备本发明的微生物饲料添加剂的液剂益-1～益-22
将实施例1～2的枯草芽孢杆菌的发酵液(A)、实施例3～4的蜡状芽孢杆菌的发酵液(B)、实施例5～6的乳酸杆菌的发酵液(C)和实施例7～8的酿酒酵母菌的发酵液(D)按表1所列的比例配制混合液，得到本发明的微生物饲料添加剂的液剂(益生康)，即益-1～益-22。
表1、本发明的微生物饲料添加剂的液剂
| 分型 | 编号 | 实施例号 | 发酵液名称 | |||
| 枯草芽孢杆菌A(v％) | 腊状芽孢杆菌B(v％) | 乳酸杆菌C(v％) | 酿酒酵母D(v％) | |||
| 通用型 | 益-1益-2益-3益-4益-5益-6益-7益-8益-9益-10 | 9 | 10 | 30 | 30 | 30 |
| 10 | 30 | 20 | 35 | 15 | ||
| 11 | 20 | 10 | 50 | 20 | ||
| 12 | 30 | 10 | 40 | 20 | ||
| 13 | 25 | 25 | 30 | 20 | ||
| 14 | 10 | 30 | 35 | 25 | ||
| 15 | 25 | 25 | 40 | 10 | ||
| 16 | 30 | 20 | 30 | 20 | ||
| 17 | 15 | 15 | 50 | 20 | ||
| 18 | 30 | 20 | 40 | 10 | ||
| 幼龄动物专用型 | 益-11 | 19 | 10 | 10 | 60 | 20 |
| 益-12 | 20 | 15 | 20 | 50 | 15 | |
| 益-13 | 21 | 20 | 15 | 40 | 25 | |
| 中大龄动物专用型 | 益-14益-15益-16 | 22 | 20 | 15 | 40 | 25 |
| 23 | 30 | 25 | 30 | 15 | ||
| 24 | 40 | 30 | 20 | 10 | ||
| 反刍动物专用型 | 益-17益-18益-19 | 25 | 15 | 30 | 40 | 15 |
| 26 | 30 | 20 | 30 | 20 | ||
| 27 | 20 | 10 | 35 | 35 | ||
| 制粒饲料专用型 | 益-20益-21益-22 | 28 | 30 | 30 | 25 | 15 |
| 29 | 35 | 25 | 30 | 10 | ||
| 30 | 40 | 20 | 20 | 20 | ||
注：“益”是指本发明的微生物添加剂产品名称“益生康”的代号。
实施例31、制备枯草芽孢杆菌干粉(E)
将实施例1或2得到的枯草芽孢杆菌发酵液加到预先混合好的载体中混合均匀，所述载体为轻质CaCO350wt％、次粉20wt％、玉米蛋白粉18％组成，发酵液与载体的重量比为0.5∶1，然后在45℃干燥；
然后粉碎到80目以上，分别得到枯草芽孢杆菌干粉，最后按照芽孢杆菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对于粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用本实施例的载体将活菌含量分别稀释到108CFU/g、109CFU/g和1010CFU/g，得到枯草芽孢杆菌干粉(E)。
实施例32、制备枯草芽孢杆菌干粉(F)
将实施例1或2得到的枯草芽孢杆菌发酵液加入0.5％(W/V)糊精和7％(W/V)轻质碳酸钙，混合均匀后，在喷雾干燥机上按进风115℃，出风80℃，喷压2kg，流量1000ml/min，喷雾干燥，然后按照实施例31的载体和质控方法，将活菌含量分别稀释到108CFU/g、109CFU/g和1010CFU/g，得到枯草芽孢杆菌干粉(F)。
实施例33、制备蜡状芽孢杆菌干粉(G)
将实施例3或4得到的蜡状芽孢杆菌发酵液加到预先混合好的载体中，所述载体为轻质CaCO345wt％、次粉30wt％、玉米蛋白粉20％组成，发酵液与载体的重量比为0.8∶1，然后在45℃干燥；
然后粉碎到80目以上，分别得到蜡状芽孢杆菌干粉，最后按照芽孢杆菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用本实施例的载体将活菌含量分别稀释到108CFU/g、109CFU/g和1010CFU/g，得到的蜡状芽孢杆菌干粉(G)。
实施例34、制备蜡状芽孢杆菌干粉(H)
将实施例3或4得到的蜡状芽孢杆菌发酵液按重量体积比加入0.5％糊精和3％轻质碳酸钙，混合均匀后，在喷雾干燥机上按进风100℃，出风60℃，喷压2kg，流量1100ml/min，进行喷雾干燥，然后按照实施例33的载体和质控方法，将活菌含量分别稀释到108CFU/g、109CFU/g和1010CFU/g，得到蜡状芽孢杆菌干粉(H)。
实施例35、制备乳酸菌干粉(I)
将实施例5或6得到的乳酸杆菌发酵液经热低温(＜45℃)负压真空浓缩到原体积的40％，得到浓缩液。
然后加入由脱脂奶粉、白砂糖(蔗糖)、麦芽糊精、明胶按1∶2∶1∶1比例混合的保护剂15％(占浓缩液的重量/体积百分比)，与乳酸菌浓缩液混合均匀；
将加入保护剂的乳酸菌浓缩液于-45℃冷冻干燥，最后，按照乳酸杆菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用载体将活菌含量分别稀释到108CFU/g、109CFU/g和1010CFU/g，得到乳酸菌冻干粉(I)；所述载体包括：轻质CaCO330wt％、次粉15wt％、玉米蛋白粉18wt％。实施例36、制备乳酸菌干粉(J)
将实施例5或6得到的乳酸杆菌发酵液经热低温(＜45℃)负压真空浓缩到原体积的50％，得到浓缩液。
将此浓缩液加入预先混合好的载体中，所述载体包括为轻质CaCO335wt％、次粉15wt％、玉米蛋白粉20％，浓缩液与载体的重量比为0.5∶1，然后流化床干燥，干燥温度45℃，得到乳酸菌干粉，粉碎到80目以上，最后，按照乳酸杆菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用载体将活菌含量分别稀释到108CFU/g、109CFU/g和1010CFU/g，得到乳酸菌干粉(J)。
实施例37、制备酿酒酵母菌干粉(K)
将实施例7或8得到的酿酒酵母菌发酵液经热低温(＜45℃)负压真空浓缩到原体积的40％，得到浓缩液。
将此浓缩液加入预先混合好的载体中，所述载体为轻质CaCO340wt％、次粉20wt％、玉米蛋白粉20％，浓缩液与载体的重量比为0.7∶1，然后流化床干燥，干燥温度50℃，得到酿酒酵母菌干粉(K)。
实施例38～47、制备本发明的微生物饲料添加剂的粉剂益-23～益-33
将实施例31的枯草芽孢杆菌干粉(E)、实施例32的枯草芽孢杆菌干粉(F)、实施例33的蜡状芽孢杆菌干粉(G)、实施例34的蜡状芽孢杆菌干粉(H)、实施例35的乳酸菌干粉(I)、实施例36的乳酸菌干粉(J)和实施例37的酿酒酵母菌干粉(K)按表2所列的比例配制混合物，得到本发明的微生物饲料添加剂的粉剂(益生康)，即益-23～益-44。
表2、本发明的微生物饲料添加剂的粉剂
| 实施例号 | 分型 | 编号 | 各种干粉的组成wt％ | ||||||
| 枯草流干粉E(％) | 枯草喷干粉F(％) | 腊状流干粉G(％) | 腊状喷干粉H(％) | 乳杆菌冻干粉I(％) | 乳杆菌流干粉J(％) | 酵母流干粉K(％) | |||
| 38 | 通用型 | 益-23 | 20 | -- | 30 | -- | 30 | -- | 20 |
| 39 | 益-24 | 15 | -- | -- | 20 | 40 | -- | 25 | |
| 40 | 益-25 | -- | 30 | 10 | 15 | -- | 35 | 10 | |
| 41 | 益-26 | 10 | -- | 10 | -- | 50 | -- | 30 | |
| 42 | 益-27 | 20 | 10 | -- | 20 | -- | 35 | 15 | |
| 43 | 益-28 | -- | 30 | 10 | -- | 50 | -- | 10 | |
| 44 | 益-29 | 30 | -- | -- | 30 | -- | 30 | 10 | |
| 45 | 益-30 | 20 | 10 | 10 | -- | 40 | -- | 20 | |
| 46 | 益-31 | 15 | 10 | 10 | 10 | -- | 35 | 20 | |
| 47 | 益-32 | 10 | 10 | -- | 30 | 30 | -- | 20 | |
| 48 | 幼龄动物专用 | 益-33 | 10 | - | - | 10 | - | 60 | 20 |
| 49 | 益-34 | - | 15 | 20 | - | 50 | - | 15 | |
| 50 | 益-35 | 20 | - | - | 15 | 40 | - | 25 | |
| 48 | 中大龄动物专用 | 益-36 | 20 | - | - | 15 | 40 | - | 25 |
| 49 | 益-37 | - | 30 | 25 | - | - | 30 | 15 | |
| 50 | 益-38 | 40 | - | - | 30 | 20 | - | 10 | |
| 48 | 反刍动物专用 | 益-39 | - | 15 | - | 30 | 40 | - | 15 |
| 49 | 益-40 | - | 30 | 20 | - | - | 30 | 20 | |
| 50 | 益-41 | 20 | - | 10 | - | - | 35 | 35 | |
| 48 | 制粒专用 | 益-42 | 30 | - | 30 | - | 25 | - | 15 |
| 49 | 益-43 | - | 35 | 25 | - | - | 30 | 10 | |
| 50 | 益-44 | 40 | - | - | 20 | 20 | - | 20 | |
注：表中“流干粉”是指流化床干燥粉；“喷干粉”是指喷雾干燥粉。“益”是指本发明的微生物添加剂 产品名称“益生康”的代号。
实施例51、本发明的微生物饲料添加剂(益生康，活菌含量109/ml或g)对产奶量和乳房炎发生率的影响
将体重650公斤左右的180头3胎奶牛，分成5组，每组30头，每组分为3个重复，每个重复10头，分组情况如下：
A组，空白对照组，仅饲奶牛基础日粮；
B组，添加益生康组，除饲喂奶牛基础日粮外，每吨饲料添加1kg益-1微生物饲料添加剂；
C组，添加益生康组，除饲喂奶牛基础日粮外，每吨饲料添加1kg益-5微生物饲料添加剂；
D组，添加益生康组，除饲喂奶牛基础日粮外，每吨饲料添加1kg益-7微生物饲料添加剂；
E组，添加益生康组，除饲喂奶牛基础日粮外，每吨饲料添加1kg益-18微生物饲料添加剂；
F组，添加益生康组，除饲喂奶牛基础日粮外，每吨饲料添加1kg益-40微生物饲料添加剂；
连续30天，并按上述分组重复试验4次，记录各组每次检测其产奶量和乳房炎发生率，然后进行对比分析，列于表3。
奶牛基础日粮，配方(重量百分比)玉米45％，麦麸10％，菜籽饼9％，棉粕10.0％，干啤酒糟5.0％，大豆粕18.0％，石粉1.0％，食盐1.0％，预混料1％。
表3、试验前后奶牛产奶量和乳房炎发生率
| 组别/性能 | 试验前15天 | 试验后15天 | ||
| 日平均产奶量(kg) | 乳房炎发生率(％) | 平均产奶量(kg) | 乳房炎发生率(％) | |
| A组(空白对照) | 33.45 | 5.3 | 34.76 | 5.7 |
| B组(益-1) | 36.40 | 1.2 | 37.86 | 1.1 |
| C组(益-5) | 36.51 | 1.5 | 37.98 | 1.3 |
| D组(益-7) | 36.10 | 1.6 | 37.84 | 1.0 |
| E组(益-18) | 36.24 | 1.5 | 38.07 | 1.1 |
| F组(益-40) | 35.98 | 1.4 | 38.85 | 1.2 |
从表3可看出，益生康可显著提高奶牛的日平均产奶量，并明显降低奶牛的乳房炎发生率，且在加日产奶量上后期多与前期，在乳房率发育率上，后期小于前期，这说明随着益生康使用时间的延长，具有累积效应。综上试验表明，益生康可显著提高奶牛的日平均产奶量，并可降低奶牛的乳房炎发生率，主要原因是由于益生康微生物添加剂能提高奶牛的免疫力所致。
实施例52、本发明的微生物饲料添加剂(益生康，活菌含量108/ml或g)对蛋鸡生产性能、蛋品质、禽舍环境的影响
共用日龄相同的产蛋后期海赛褐壳蛋鸡15000只，分5组，每幢一组3000只，分3个重复，每个重复1000只。分组情况如下：
A组，空白对照组，饲喂蛋鸡基础日粮；
B组，添加益生康组，在蛋鸡基础日粮中加入1kg益-6微生物饲料添加剂；
C组，添加益生康组，在蛋鸡基础日粮中加入1kg益-23微生物饲料添加剂；
D组，添加益生康组，在蛋鸡基础日粮中加入1kg益-27微生物饲料添加剂；
E组，添加益生康组，在蛋鸡基础日粮中加入1kg益-38微生物饲料添加剂；
使用的蛋鸡基础日粮配方(重量百分比)为：玉米58.72％，豆粕26.0％，麦麸2.0％，石粉8.44％，氢钙1.5％，食盐0.34％，植物油2.0％，1％预混料1.0％。
前7天为预试期，后23天为试验期，并按上述分组重复试验3次，测定了舍内NH3、H2S浓度、鸡蛋破损率、蛋白质量(哈夫单位)、产蛋率、蛋重、死淘率、粪便状态、蛋壳色泽等指标。结果如表4所示。
表4、
从表4可以看出，饲喂本发明提供的益生康添加剂，鸡蛋的各项指标均明显好于对照组，说明这种活性肽添加剂在提高蛋鸡的生产性能和蛋品质中起了良好的促进作用。因益生康可调节肠道菌群平衡，促进微生物酶的分泌量，提高消化酶活性，进而提高饲料氮营养素吸收转化和利用效率，间接的降低禽舍中氨气和硫化氢的含量，有良好的经济和生态效益。
实施例53～56、本发明的微生物饲料添加剂(益生康)对仔猪、育肥猪、肉鸡和草鱼的影响
表5、
| 实施例号 | 益生康 | 试验方式 | 试验规模 | 试验结果 |
| 53 | 益-4益-11益-13益-33益-34益-35均含菌(1010/g，ml) | 同实施例52，A组加金霉素100g/t对照，B、C、D、E、F、G组添加益-4，11，13，33，34，35各0.1kg/t，每组30头猪，3个重复。 | 仔猪210头 | 与添加抗生组对比，添加益生康组的各项指标改善如下：日采食量提高9.3％～11.3％日增重提高10.6％～12.1％饲料转化效率改善12.8％～13.4％腹泻率降低53.3％～57.8％ |
| 54 | A：对照B：益-8C：益-10D：益-14E：益-15F：益-16(108/g，ml) | 同实施例52，A组加金霉素100g/t，磺胺100g/t对照，B、C、D、E、F组添加益-8，10，14，15，16各1.5kg/t，每组60头猪，6个重复。 | 育成育肥猪(30kg-上市)360头 | 肥育猪各生长阶段采食量、日增重；饲料转化效率提高，腹泻率和死淘率降低，各项生产性能不低于添加抗生素群体；猪舍臭味减少，屠宰率和瘦肉率与添加抗生素群体相似或更高，猪肉肉色红润，肉质鲜嫩。 |
| 55 | 小鸡添加：A：对照B：益-2C：益-3D：益-9E：益-12F：益-32(含菌108)中鸡添加：益-24 | 大鸡添加：益-28益-29益-30益-31益-38(含菌1010)对照加土霉素150g/t小鸡加1.5kg/t中鸡加150kg/t大鸡加20g/t | 肉鸡24000只 | 增加鸡体内蛋白质的沉积和降低腹脂率(P＜0.05)，明显降低十二指肠、空肠和回肠的pH值(p＜0.05，)，显著抑制(减少)空肠和直肠中的E.Coli繁殖，并能提高肠道中乳酸杆菌的含量(p＜0.05)，十分有利于鸡的健康和减少臭味。 |
| 益-25益-26益-36益-37(含菌109) | 饲料制粒，每组4000只肉鸡，4个重复，每个重复1000只，共24000只 | |||
| 56 | A：空白对照B：益-20C：益-21D：益-22E：益-42F：益-43G：益-44(含菌量109/g，ml) | 饲料制粒，每组3000条草鱼，3个重复，每个重复1000条，共21000条 | 育成期草鱼21000条 | 饲料系数比对照组提高6％，日增重比对照组提高12.3％，成活率提高20.7％，且试验组的整齐度好，抗病能力强。水质控制方面，水深2.8米、3亩投放益生康液体1kg。结果氨态氮(NH3-N)在24小时内由对照组的0.6mg/L降低到试验组的0.2mg/L，降低3倍，同时罗非鱼的白皮病减少61.3％。 |
从表5可以看出，饲喂本发明提供的益生康添加剂，仔猪、育成猪、肉仔鸡的不同饲养阶段以及草鱼的各项指标均明显好于对照组(添加抗生素)，说明这种绿色饲料添加剂能有效防治畜禽和水产动物疾病、显著提高生产性能(增重、饲料转化效率等)、改善畜舍环境和水产动物的水质、提高动物产品品质等功效，有良好的经济和生态效益。
Claims (11)
1、一种微生物饲料添加剂，其通用型液剂为将枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、乳酸杆菌和酿酒酵母菌分别发酵培养的发酵液按照各自的平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用灭菌水将活菌含量分别稀释到108CFU/ml、109CFU/ml或1010CFU/ml，然后按照下述体积比配制而成：
枯草芽孢杆菌发酵液 10～30v％；蜡状芽孢杆菌发酵液 10～30v％；
乳酸杆菌发酵液 30～50v％；酿酒酵母菌发酵液 10～30v％
所述的枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的发酵液是由液体深层发酵得到，包括如下的步骤：
1)平板培养复壮：将枯草芽孢杆菌和腊状芽孢杆菌菌种分别采用划线接种的方法在芽孢杆菌平板培养基上划线接种，于25～35℃培养12～24小时，分别使枯草芽孢杆菌和腊状芽孢杆菌复壮，并形成单菌落；所述的芽孢杆菌平板培养基为按下述重量体积比配制的混合物：蛋白胨0.5～1％、葡萄糖0.5～2％、牛肉膏0.5～1.5％、磷酸二氢钾0.3～0.6％、琼脂3～4％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，备用；
2)制作摇瓶种子：从步骤1)培养的枯草芽孢杆菌和腊状芽孢杆菌菌落中分别挑单菌落，接种到芽孢杆菌液体培养基中，于28～37℃培养20～30小时，得到枯草芽孢杆菌和腊状芽孢杆菌摇瓶种子液；所述的芽孢杆菌液体培养基为按下述重量体积比配制的混合液：蛋白胨0.5～1％、葡萄糖0.5～2％、牛肉膏0.5～1.5％、磷酸二氢钾0.3～0.6％、3.08％硫酸锰溶液0.5～1.5％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，备用；
3)生产一级种子液：将步骤2)得到的枯草芽孢杆菌摇瓶种子液和腊状芽孢杆菌摇瓶种子液以2～5v％的接种量，分别接种于生产所用的一级种子罐的一级种子液体培养基中，于32～37℃培养18～24h，搅拌速度150～200rpm，通气量为1～2vols/vol/min，分别得到枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的一级种子液；所述的一级种子液体培养基配方为按下述重量体积比配制的混合液：120目豆粕粉0.5～2.0％、120目鱼粉0.2～1.5％、120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖1.0～4.5％、NaCl 0.1～0.3％、NaOH 0.05～0.10％、Na2HPO40.1～0.5％、增效剂0.05～0.2％，消泡剂0.05～0.1％，pH＝7.5～7.6，经121℃灭菌30～45分钟，冷却到32～37℃；所述的增效剂为由MgSO40.1～0.5g/L，CaCl21.0～4.0g/L，ZnSO40.2～1.5g/L，FeSO40.1～0.8g/L，CuSO40.01～0.05g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MnSO40.3～1.5g/L组成的水溶液；
4)二级发酵：将步骤3)得到的枯草芽孢杆菌和腊状芽孢杆菌一级种子，分别以5～10％的体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子液体培养基，发酵16～24小时后，通过显微镜观察，有大量芽孢形成时停止发酵；
所述的乳酸杆菌的发酵液是由液体深层发酵得到，包括如下的步骤：
1)平板培养复壮：将乳酸杆菌斜面种子采用划线接种的方法在乳酸杆菌平板培养基上划线接种，于33～38℃培养24～48小时，使乳酸杆菌复壮，并形成单菌落；所述的乳酸杆菌平板培养基为按下述重量体积比配制的混合物：大豆蛋白胨0.5～1％、葡萄糖1～2％、酵母浸粉0.3～0.7％、磷酸二氢钾0.3～0.5％、牛肉膏0.5～1.5％、柠檬酸三铵1.5～2.3％、Tween-80 0.5～1.4％、乙酸钠0.2～0.6％、琼脂粉2～2.5％，pH＝5.5～5.8，121℃灭菌15分钟，备用；
2)制作摇瓶种子：将步骤1)培养的乳酸杆菌菌落中挑单菌落，接种到乳酸杆菌液体培养基中，采用常规方法在三角瓶液体培养基上于35～40℃培养24～48小时，得到乳酸杆菌摇瓶种子；所述的培养基为按下述重量体积比配制的混合液：大豆蛋白胨0.5～1％、葡萄糖1～2％、酵母浸粉0.3～0.7％、磷酸二氢钾0.3～0.5％、牛肉膏0.5～1.5％、柠檬酸三铵1.5～2.3％、Tween-80 0.5～1.4％、乙酸钠0.2～0.6％，pH＝5.5～5.8，121℃灭菌15分钟，备用；
3)生产一级种子液：将步骤2)得到的乳酸杆菌摇瓶种子以6～12v％的接种量，接种于生产所用的一级种子罐的一级种子液体培养基中，于35～38℃培养17～60h，搅拌速度150～200rpm，间隔1小时通气5～10分钟，通气量为1～2.5vols/vol/min，直至乳酸杆菌数达到10亿，得到乳酸杆菌的一级种子液；所述的一级种子液体培养基配方为按下述重量体积比配制的混合液：120目豆粕粉0.5～2.0％、120目鱼粉0.5～1.0％、鱼蛋白胨0.5～2％，乳糖0.2～1.5％，120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖1～2.5％、NaCl 0.1～0.3％、Na2HPO4 0.15～0.3％、增效剂0.05～0.3％，消泡剂0.03～0.1％，pH＝5.5～5.8，经121℃灭菌30～45分钟，冷却到32～37℃；所述的增效剂为由CaCl22～4g/L，ZnSO4 0.5～1.5g/L，FeSO4 0.2～1.0g/L，CuSO4 0.01～0.08g/L，Co(NO3)20.02～0.06g/L，MgSO4 0.1～0.5g/L组成的水溶液；
4)二级发酵：将步骤3)得到的乳酸杆菌一级种子，以5～10％体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子液体培养基，发酵17～60小时后，检测pH值下降到5.0时停止发酵；
所述的酿酒酵母的发酵液是由液体深层发酵得到，包括如下的步骤：
1)平板培养复壮：将酿酒酵母斜面种子采用划线接种的方法在酿酒酵母平板培养基上划线接种，于24～30℃培养20～24小时，使酿酒酵母复壮，并形成单菌落；所述的酿酒酵母平板培养基为按下述重量体积比配制的混合物：大豆蛋白胨0.2～0.7％、葡萄糖0.5～1.5％、酵母浸粉0.1～0.5％、麦芽膏0.2～1％、琼脂粉2～3％，pH＝5.8～6.0，121℃灭菌15分钟，备用；
2)制作摇瓶种子：从步骤1)培养的酿酒酵母培养平板中挑单菌落，接种到三角瓶液体培养液中，于28～32℃培养24～37小时，得到酿酒酵母摇瓶种子液；所述的培养液为按下述重量体积比配制的混合液：大豆蛋白胨0.2～0.7％、葡萄糖0.5～1.5％、酵母浸粉0.1～0.5％、麦芽膏0.2～1％，pH＝5.8～6.0，121℃灭菌15分钟，备用；
3)生产一级种子液：将步骤2)得到的酿酒酵母摇瓶种子按2～12v％的接种量，接种于一级种子罐的一级种子培养液中，于28～32℃培养24～37小时，搅拌速度160～220rpm，通气量为1.0～3.0vols/vol/min，得到酿酒酵母的一级种子液；所述的酿酒酵母一级种子培养液为按下述重量体积比配制的混合液：120目豆粕粉0.5～1.5％、120目鱼粉0.2～0.8％、120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖0.3～1.0％、NaCl 0.1～0.3％、Na2HPO4 0.2～0.5％、增效剂0.05～0.2％，消泡剂0.03～0.1％，pH＝5.8～6.0，经121℃灭菌30～45分钟，冷却到32～37℃；所述的增效剂为由MgSO40.05～0.3g/L，CaCl22.5～4g/L，ZnSO4 0.6～1.5g/L，FeSO4 0.1～1.0g/L，MnSO4 0.4～0.8g/L，CuSO4 0.02～0.08g/L组成的水溶液；
4)二级发酵：将步骤3)得到的酿酒酵母一级种子，以4～10％体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子培养液，发酵24～60小时后，检测酿酒酵母菌数达到10亿/ml时停止发酵。
2、一种微生物饲料添加剂，其幼龄动物专用型液剂为将权利要求1中所述的芽孢杆菌发酵液、乳酸杆菌发酵液、酵母发酵液按照各自的平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用灭菌水将活菌含量分别稀释到108CFU/ml、109CFU/ml或1010CFU/ml，然后按照下述体积比配制而成：
枯草芽孢杆菌发酵液 10～20v％；蜡状芽孢杆菌发酵液 10～20v％；
乳酸杆菌发酵液 40～60v％；酿酒酵母菌发酵液 15～25v％。
3、一种微生物饲料添加剂，其大龄动物专用型液剂为将权利要求1中所述的芽孢杆菌发酵液、乳酸杆菌发酵液、酵母发酵液按照各自的平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用灭菌水将活菌含量分别稀释到108CFU/ml、109CFU/ml或1010CFU/ml，然后按照下述体积比配制而成：
枯草芽孢杆菌发酵液 20～40v％；蜡状芽孢杆菌发酵液 15～30v％；
乳酸杆菌发酵液 20～40v％；酿酒酵母菌发酵液 10～25v％。
4、一种微生物饲料添加剂，其反刍动物专用型液剂为将权利要求1所述的芽孢杆菌发酵液、乳酸杆菌发酵液、酵母发酵液按照各自的平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用灭菌水将活菌含量分别稀释到108CFU/ml、109CFU/ml或1010CFU/ml，然后按照下述体积比配制而成：
枯草芽孢杆菌发酵液 15～30v％；蜡状芽孢杆菌发酵液 10～30v％；
乳酸杆菌发酵液 30～40v％；酿酒酵母菌发酵液 15～35v％。
5、一种微生物饲料添加剂，其制粒饲料专用型液剂为将权利要求1所述的芽孢杆菌发酵液、乳酸杆菌发酵液、酵母发酵液按照各自的平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用灭菌水将活菌含量分别稀释到108CFU/ml、109CFU/ml或1010CFU/ml，然后按照下述体积比配制而成：
枯草芽孢杆菌发酵液 30～40v％；蜡状芽孢杆菌发酵液 20～30v％；
乳酸杆菌发酵液 20～30v％；酿酒酵母菌发酵液 10～20v％。
6、一种微生物饲料添加剂，其通用型粉剂为将枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、乳酸杆菌和酿酒酵母菌分别发酵培养的发酵液制得的干粉按照各自的平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用载体将活菌含量分别稀释到108CFU/g、109CFU/g或1010CFU/g，所述的载体配比为：轻质CaCO325～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％，然后按照下述重量比配制而成：
枯草芽孢杆菌干粉 10～30wt％；蜡状芽孢杆菌干粉 10～30wt％；
乳酸杆菌干粉 30～50wt％；酿酒酵母菌干粉 10～30wt％；
所述的枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的干粉是由下述方法制得的，具体包括如下的步骤：
将权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌的发酵液和蜡状芽孢杆菌的发酵液，分别按照发酵液与载体的重量比为0.5～0.8∶1混合均匀，然后在流化干燥床上于80～100℃干燥后粉碎到80目以上，分别得到枯草芽孢杆菌干粉和蜡状芽孢杆菌干粉；所述的载体配比为：轻质CaCO325～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％；
或是将枯草芽孢杆菌的发酵液和蜡状芽孢杆菌的发酵液分别按体积与重量比加入发酵液体积0.3～0.8％的糊精和3～10％的轻质碳酸钙，混合均匀后，在喷雾干燥机上按进风100～130℃，出风60～90℃，喷压2kg，流量1000～1500ml/min，进行喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌喷雾干粉和蜡状芽孢杆菌喷雾干粉；
所述的乳酸菌干粉是由下述方法制得的，具体包括如下的步骤：
1)将权利要求1中所述的乳酸菌的发酵液在低于45℃、负压真空条件下浓缩到原体积的40～60％；
2)加入占浓缩液的重量/体积百分比15～20％的保护剂，混合均匀后于-25～-45℃冷冻干燥，得到乳酸菌冻干粉；所述的保护剂为脱脂奶粉、白砂糖、麦芽糊精、明胶按1∶2∶1∶1比例混合而成；
或是将乳酸菌的浓缩液加入预先混合好的载体中，浓缩液与载体的重量比为0.4～0.9∶1，然后经流化床45～60℃干燥，粉碎到80目以上，得到乳酸菌干粉；所述载体包括：轻质CaCO3 30～40wt％、次粉15～30wt％、玉米蛋白粉18～20wt％；
所述的酿酒酵母菌干粉是由下述方法制得的，具体包括如下的步骤：
1)将权利要求1中所述的酿酒酵母菌的发酵液在低于45℃、负压真空的条件下浓缩到原体积的40～60％，得到酿酒酵母菌的浓缩液；
2)将酿酒酵母菌的浓缩液加入预先混合好的载体中，浓缩液与载体的重量比为0.6～0.9∶1，然后流化床干燥，干燥温度45～60℃，得到酿酒酵母菌干粉；所述载体包括：轻质CaCO3 30～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉18～20wt％。
7、一种微生物饲料添加剂，其幼龄动物专用型粉剂为将权利要求6所述的芽孢杆菌干粉、乳酸杆菌干粉按照各自的平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用载体将活菌含量分别稀释到108CFU/g、109CFU/g或1010CFU/g，所述的载体配比为：轻质CaCO3 25～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％，然后按照下述重量比配制而成：
枯草芽孢杆菌干粉 10～20wt％；蜡状芽孢杆菌干粉 10～20wt％；
乳酸杆菌干粉 40～60wt％；酿酒酵母菌干粉 15～25wt％。
8、一种微生物饲料添加剂，其大龄动物专用型粉剂为将权利要求6所述的芽孢杆菌干粉、乳酸杆菌干粉按照各自的平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用载体将活菌含量分别稀释到108CFU/g、109CFU/g或1010CFU/g，所述的载体配比为：轻质CaCO3 25～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％，然后按照下述重量比配制而成：
枯草芽孢杆菌干粉 20～40wt％；蜡状芽孢杆菌干粉 15～30wt％；
乳酸杆菌干粉 20～40wt％；酿酒酵母菌干粉 10～25wt％。
9、一种微生物饲料添加剂，其反刍动物专用型粉剂为将权利要求6所述的芽孢杆菌干粉、乳酸杆菌干粉按照各自的平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用载体将活菌含量分别稀释到108CFU/g、109CFU/g或1010CFU/g，所述的载体配比为：轻质CaCO325～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％，然后按照下述重量比配制而成：
枯草芽孢杆菌干粉 15～30wt％；蜡状芽孢杆菌干粉 10～30wt％；
乳酸杆菌干粉 30～40wt％；酿酒酵母菌干粉 15～35wt％。
10、一种微生物饲料添加剂，其制粒饲料专用型粉剂为将权利要求6所述的芽孢杆菌干粉、乳酸杆菌干粉按照各自的平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用载体将活菌含量分别稀释到108CFU/g、109CFU/g或1010CFU/g，所述的载体配比为：轻质CaCO325～50wt％、次粉20～30wt％、玉米蛋白粉15～20wt％，然后按照下述重量比配制而成：
枯草芽孢杆菌干粉 30～40wt％；蜡状芽孢杆菌干粉 20～30wt％；
乳酸杆菌干粉 20～30wt％；酿酒酵母菌干粉 10～20wt％。
11、一种权利要求1至10之一所述的微生物饲料添加剂作为产酶益生素的用途。
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