CN1259106C - 一种抗癌靶向基因病毒药物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域。本发明提供了一种抗癌靶向基因病毒药物的制备方法。本发明构建缺失55Kda基因的腺病毒并携带有外源抗癌基因，命名为Ad5-ZD55-基因，克服ONYX-015病毒不能携带外源抗癌基因的缺点，提高了抗癌效果。本发明构建的腺病毒突变体，可以开发出有效的治疗肿瘤的抗癌新药。

Description

一种抗癌靶向基因病毒药物的制备方法

技术领域：

本发明属生物技术领域。具体涉及一种抗癌靶向基因病毒药物的制备方法。

背景技术：

恶性肿瘤严重危害人类的生命健康。我国每年癌症新发病人数超过160万(癌症患者总人数超过1000万)。癌症可能要超过心脑血管病而成为人类致死的第一位原因。

基因治疗是近10年兴起的一种生物高技术方案，在整个基因治疗方案中肿瘤基因治疗方案占60％以上，可能是治疗恶性肿瘤最有希望方案之一。目前作为基因治疗的载体分为病毒和非病毒型两种类型。非病毒载体包括：裸露DNA脂质体和其它物质包裹的DNA；病毒载体包括：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒等。病毒介导的DNA转移法在近年得到迅速发展，其中在肿瘤的基因治疗中较为常用的还是腺病毒载体。

腺病毒是一种双链DNA病毒，基因组长度为36kb，分早期和晚期转录区。将其E1区删除(或E1与E3同时删除)，得到传统的腺病毒载体，这种载体可插入并表达长度为8kb以内的外源基因。腺病毒载体可感染多种类型的细胞，包括静息期细胞，它可以被大规模的培养并获得高滴度的病毒纯品，这些特点使得腺病毒成为肿瘤基因治疗的常用载体。传统的腺病毒载体本身不能复制产生子代病毒，尽管传统的腺病毒载体用于肿瘤基因治疗取得了某些较好的动物实验结果，但迄今还没有明确的临床疗效。腺病毒载体不能靶向性转染肿瘤细胞，这被认为是它临床疗效有限的主要原因。

早在一百年前，有人发现极少数肿瘤病人感染病毒后，出现肿瘤暂时消退的现象，从而开始了肿瘤病毒治疗的尝试。应用基因工程技术，改变病毒的基因组，使之特异性地在肿瘤细胞中复制和传播，并随之杀死肿瘤细胞，释放出来的子代病毒扩散到临近的肿瘤细胞，在肿瘤组织内引起一种链式反应，最终蔓延到整个肿瘤而全部消灭之，但对正常组织没有损害，在肿瘤内特异增殖病毒的应用给肿瘤治疗带来了新的曙光。

肿瘤的基因治疗在临床上没有重大进展，而肿瘤的病毒治疗却取得重大进展。美国ONXY医药公司研制出的突变腺病毒(d11520，也叫ONYX-015)，乃将腺病毒基因组的E1b55K蛋白基因缺失，使得该突变的腺病毒能在p53缺失的肿瘤细胞内进行大量复制，而在正常细胞内不能复制。应用ONYX-015，联合常规的化学疗法治疗30例化疗复发的头颈癌患者，其中8例完全缓解，其中1例直径达10厘米以上的肿瘤也完全消退，11例肿瘤缩小一半以上，总有效率达63％(Nature Medicine 2000)。目前已进入III期临床，治疗病例超过200名患者，这是目前疗效最为显著的肿瘤生物治疗的方法。ONYX-015与化疗合用，在临床上治疗头颈癌取得了63％的疗效，但单独使用ONYX-015(不与化疗结合)，则疗效很差，只有15-20％。为了克服单独使用ONYX-015疗效不理想的缺点，刘新垣院士2000年就提出(中国肿瘤生物治疗杂志，8(1)，2001，P1-)，一种新策略：肿瘤的基因病毒治疗策略。在肿瘤特异性增殖病毒中加入抗癌基因，将肿瘤的基因治疗与病毒治疗结合起来。这种新型的肿瘤治疗策略一方面保留了病毒治疗的有效特异性，另一方面利用病毒的大量复制而使得它所携带的抗癌基因也大量扩增，得到高效表达，两者协同作用，进一步提高抗癌疗效。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于克服肿瘤基因治疗中病毒载体不能有效地在肿瘤中特异性扩增的缺点，改善ONYX-015不能携带外源基因而缺乏杀伤力的现状，将肿瘤的基因治疗与病毒治疗二者的优势结合起来，提供一类能靶向性在肿瘤细胞内复制和增殖，而在正常细胞内不增殖，同时能够在肿瘤细胞内高效表达抗癌基因的重组腺病毒。

本发明提供了一种抗癌靶向基因病毒药物的制备方法。该方法为表达抗癌基因的肿瘤特异性增殖的腺病毒的构建方法，其特征在于：(1)用定点PCR方法，使腺病毒的2269-3327bp缺失。在E1B 19Kda基因后加上了SV40 polyA尾巴。在SV40 polyA尾巴加入的单酶切位点Bgl II；(2)将抗癌基因克隆进质粒pCA13的多克隆位点，用BglII酶切出治疗基因的表达框(它包含HCMV启动子、抗癌基因、SV40poly A尾巴)，插入改造好的腺病毒载体中；(3)将改造好的抗癌基因的腺病毒载体与含腺病毒大质粒pBHGE₃或pBHG₁₀转染HEK-293细胞建成治疗用重组腺病毒；(4)分离治疗用的重组腺病毒。

本发明根据插入的基因的不同，将这一类病毒命名为Ad5-ZD55-gene，如Ad5-ZD55-sFLT-1，Ad5-ZD55-IL-12等。

本发明构建缺失55Kda基因的腺病毒并携带有外源抗癌基因的ZD55-gene，克服ONYX-015腺病毒不能携带外源抗癌基因的缺点，提高了抗癌效果。本发明应用定点突变PCR技术，缺失了野生型腺病毒的55Kda蛋白，同时加入一个酶切位点，可以方便的插入抗癌基因的表达框，后面又接上SV40 PolyA尾巴的终止信号。本发明缺失了腺病毒的bp2269-3327，是突变腺病毒中缺失55Kda蛋白基因碱基最多的一种，为pZD55插入外源抗癌基因提供了更多的空间，这是我们载体的又一优点，而ONYX-015根本就不含外源基因插入位点，故无法插入外源抗癌基因。

本发明构建的重组病毒不仅可以选择性的在肿瘤细胞内特异性复制增殖，还带有杀死肿瘤细胞的抗癌基因，特异性病毒在癌细胞的大量复制，又使抗癌基因拷贝数大量增加。实现了肿瘤的基因治疗与病毒治疗紧密协同作用。

本发明所构建的腺病毒突变体，可以开发出有效的治疗肿瘤的抗癌新药，用于治疗p53基因或者p53途径缺陷的肿瘤。可以开发出一种药物组合物，这种药物组合含有本发明描述的任意一种重组腺病毒，如携带A抗癌基因与携带B抗癌基因的相互结合，还可与下列化合物之一组成复合治疗：化学治疗药物；生物毒素；免疫抑制化合物，单克隆抗体等。

本发明构建的pZD55载体将它与含腺病毒大部份基因的大质粒pBHGE3或pBHG10同源重组得到ZD55腺病毒，它能在p53缺乏的肿瘤中特异增殖扩增，而在正常细胞中不增殖。同时，pZD55能够很方便的将抗癌基因的表达框插(装)入进出，并且包装出能够表达抗癌基因的增殖腺病毒(Ad5-ZD55-gene)。这个表达抗癌基因的腺病毒能够特异性的裂解肿瘤细胞，同时能够高效表达抗癌基因。与非增殖性的腺病毒载体相比，能够特异性地在肿瘤细胞中大大提高抗癌基因的表达量。本发明以Ad5-ZD55-sFLT-1为例加以说明。

本发明具有如下有益效果：

1.本发明提供一种E1b 55Kda基因缺失的突变型腺病毒，经细胞实验证明，可以选择性的在肿瘤细胞中增殖，而不杀死正常细胞，经动物试验，可以用于治疗多种肿瘤。

2.本发明提供了一种E1b 55Kda基因缺失的腺病毒的构建方法。该方法可用于构建新型突变腺病毒，易于掌握，并且加入了便于插入外源抗癌基因的克隆位点。

3.本发明构建的突变腺病毒载体，能够非常方便的装入外源抗癌基因，能够在肿瘤细胞中大量增殖，我们称之为基因—病毒。这个载体能够构建表达不同抗癌基因的多种基因—病毒，为肿瘤的基因—病毒治疗提供良好的基础。

4.本发明构建的基因—病毒，是一种肿瘤特异性增殖腺病毒，能选择性的在肿瘤细胞内大量复制增殖。同时该重组病毒所携带的抗癌基因也随着病毒在肿瘤细胞的大量复制而大量扩增，故该基因—病毒具有很高的抗癌作用。实现了肿瘤的基因治疗与病毒治疗的紧密协同作用。

5.本发明构建的多种基因病毒经动物试验证明能选择性的杀死瘤细胞，而不影响正常细胞。基因—病毒表达的抗癌基因能加强病毒的抗肿瘤效果。这种新型的基因病毒为今后用于人类肿瘤治疗打下了良好基础。

6、本发明构建的基因病毒可以与下列化合物之一组成复合物：其它的基因—病毒，化疗药物；生物毒素；免疫抑制化合物，单克隆抗体等。

具体实施方式：

实施例I.55Kda基因缺失的质粒载体pZD55的构建

除非另外说明，本发明所采用的技术，均是本领域常规技术，如分子克隆技术，微生物学技术，细胞生物学技术，这些技术在文献中均有充分解释，如Sambrook的《分子克隆实验指南》等。

PXC1载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，PXC1质粒含有5型腺病毒序列bp22-5790。

利用定位突变双次PCR技术，构建E1b 55Kda基因缺失的新型腺病毒载体。PCR反应的引物：

引物1：5’gcc cga cat cac ctg tgt cta gag aat g 3’(含Xba I位点，和pXC1中bp1321-1348配对)

引物2：5’tca gat ggg ttt ctt cac tcc att tat cct 3’(和pXC1中bp 2040-2011配对)

引物3：5’ata aag gat aaa tgg agt gaa gaa acc cat ctg ag 3’(和pXC1中bp 2007-2041配对，55Kda基因第三个密码子突变成终止密码子，突变C2024T)

引物4：5’gaa gat cta tac agt taa gcc acc tat aca aca 3’(含Bgl II位点，和pXC1中bp 2269-2245，E1B 55Kda基因读码框突变，C2252T，G2261T加入了两个终止密码子)

以PXC1质粒为PCR反应的模板，引物1与引物2进行第一次PCR反应，跑电泳回收719bp片段。以PXC1质粒为PCR反应的模板，引物3与引物4进行第二次PCR反应，跑电泳回收270bp片段。两次PCR反应的产物有34bp的配对序列，以两次PCR产物混合作为模板，以引物1与引物4进行第三次PCR反应，跑电泳回收955bp片段。以Xba I+Bgl II酶切955bp的PCR产物，克隆进Xba I+BglII酶切过的pXC1质粒，命名为pXC1-D55。PXC1-D55与PXC1相比，缺失了PXC1载体的bp2269-bp3327，将E1b 55Kda基因的第3个密码子突变成了终止密码子，并且在E1b 19Kda蛋白终止密码子后面，又为E1b 55Kda基因读码框添加了两个终止密码子。

pCA13质粒购于加拿大Microbix Biosystem Inc(Toronto)，PCA13含有5型腺病毒序列bp22-5790，并缺失E1区342至3523bp片段，在E1缺失区插入了人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299-+72)及SV40 polyA加尾信号。以BamH I+Bgl II酶切PCA13载体，跑电泳回收160bp片段，即回收SV40 polyA尾巴，将片段克隆进Bgl II酶切过的pXC1-D55，酶切鉴定，将正向克隆命名为pZD55。在E1b19Kda蛋白基因后面加上了SV40 polyA尾巴。pZD55中只有一个BglII位点。BglII位点前面是SV40 polyA尾巴，BglII位点不在腺病毒基因的读码框内，也不在腺病毒启动子内，可以用来插入基因表达框而不影响腺病毒中其他基因的表达，不影响腺病毒的复制。但pZD55中含有与腺病毒进行同源重组的左臂序列。

对PZD55质粒进行测序，测序结果和预期结果一致，表明载体构建成功。

……GATTTTCTGGCCATGCATCTGTGGAGAGCGGTTGTGAGACA

CAAGAATCGCCTGCTACTGTTGTCTTCCGTCCGCCCGGCGATAA

TACCGACGGAGGAGCAGCAGCAGCAGCAGGAGGAAGCCAGGC

GGCGGCGGCAGGAGCAGAGCCCATGGAACCCGAGAGCCGGCC

TGGACCCTCGGGAATGAATGTTGTA TAGGTGGCT TAACTGTA

T

AGATCTGGAAGGTGCTGAGGTACGAT

GAGACCCGCACCAGGTGCAGACCCTGCGAGTGTGGCG……

方框中为SV4O poly A尾巴序列。

AGATCT是Bgl II位点。

TAG、 TAA是E1b 55K Da基因读码框的终止密码子。

实施例II.将抗癌基因的表达框插入pZD55，构建基因病毒质粒

pZD55-gene(这里的基因可以是自杀基因CD、TK产物；抗癌作用很强的基因Trail、Blys、Smae产物；细胞因子1L-12、1L-2、IFN、GM-CSF；细胞凋亡基因ICF、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax产物；血管生在抑制基因、sflt-1、Angicstatin、Endcstatin、TIMP-4、PAI产物。的任何一种基因，现仅仅以sFLT-1基因为例子加以说明)。

pCA13载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，PCA13含有5型腺病毒序列bp22-5790，并缺失E1区342至3523bp片段(但其中含有腺病毒左臂重组序列)，在E1缺失区插入了人巨细胞病毒(HCMV)IE启动子(-299-+72)及SV40 polyA加尾信号，在IE与加尾信号之间含有多个多克隆位点，Sal I、Hind III、EcoRI、EcoR V、Xba I、Xho I、BamH I。将上述任何一种基因，通过基因操作的方法顺向插入到pCA13的多克隆位点，构建成质粒pCA13-gene。将质粒pCA13-gene用Bgl II酶切，可以切出该gene的表达框。这个表达框包含hCMV启动子、抗癌基因及SV40 polyA尾巴。而后将此表达框克隆进Bgl II单酶切并去磷的pZD55质粒，构建成质粒pZD55-gene。

现仅仅以sFLT-1基因为例加以说明。FLT-1是人血管内皮细胞生长因子VEGF的受体，sFLT-1是受体的胞外区，它可与VEGF结合，从而抑制VEGF活性，故sFLT-1的高表达能够抑制VEGF的促进血管生长作用，从而抑制肿瘤的营养供应，达到杀灭肿瘤的目的。

应用多聚酶链反应(PCR)技术，自人心肌细胞cDNA文库中扩增出1014bp的FLT-1基因的胞外区cDNA(sFLT-1)，并在基因末端引入EcoR I和BamH I两个酶切位点

引物5：5’tag aat tca tgg tca gct act ggg ac 3’

(含EcoRI位点，和FLT-1 bp1-18配对)

引物6：5’tga gga tcc tta atg ttt cac agt gat gaa tgc 3’

(含BamHI位点，和FLT-1 bp1014-994配对)

PCR反应后，回收1029bp片段，应用EcoR I+BamH I双酶切，将得到的该基因片段插入pCA13的质粒，命名pCA13-sFLT-1。测定其中sFLT-1序列，结果如下(与理论数据一致)：

Gaattcatggtcagctactgggacaccggggtcctgctgtgcgcgctgctcagctgtctgcttctcacag

gatctagttcaggttcaaaattaaaagatcctgaactgagtttaaaaggcacccagcacatcatgcaagca

ggccagacactgcatctccaatgcaggggggaagccagcccataaatggtctttgcctgaaatggtgagt

aaggaaagcgaaaggctgagcataactaaatctgcctgtggaagaaatggcaaacaattctgcagtact

ttaaccttgaacacagctcaagcaaaccacactggcttctacagctgcaaatatctagctgtacctacttca

aagaagaaggaaacagaatctgcaatctatatatttattagtgatacaggtagacctttcgtagagatgtac

agtgaaatccccgaaattatacacatgactgaaggaagggagctcgtcattccctgccgggttacgtcac

ctaacatcactgttactttaaaaaagtttccacttgacactttgatccctgatggaaaacgcataatctggga

cagtagaaagggcttcatcatatcaaatgcaacgtacaaagaaatagggcttctgacctgtgaagcaaca

gtcaatgggcatttgtataagacaaactatctcacacatcgacaaaccaatacaatcatagatgtccaaata

agcacaccacgcccagtcaaattacttagaggccatactcttgtcctcaattgtactgctaccactcccttg

aacacgagagttcaaatgacctggagttaccctgatgaaaaaaataagagagcttccgtaaggcgacga

attgaccaaagcaattcccatgccaacatattctacagtgttcttactattgacaaaatgcagaacaaagac

aaaggactttatacttgtcgtgtaaggagtggaccatcattcaaatctgttaacacctcagtgcatatatatg

ataaagcattcatcactgtgaaacattaaggattc

用Bgl II酶切质粒pCA13-sFLT-1，回收1583bp的片段，此片段包含包含hCMV启动子、human sFLT-1基因及SV40 polyA尾巴。而后将此表达框克隆进Bgl II单酶切并去磷的pZD55质粒，构建成质粒pZD55-sFLT-1。

用类似方法构建的质粒还有pZD55-Trail，pZD55-TK，pZD55-CD，pZD55-IL12，pZD55-Smac，pZD55-IFNβ，pZD55-Endostatin，pZD55-Angiostatin及其衍生物等等。

实施例III.E1b 55Kda基因缺失的腺病毒的重组基因病毒构建：

293细胞株购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成。它含有及表达5型腺病毒的E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。我们将任何一种pZD55-gene(它含有与腺病毒同源重组的左臂序列)与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3，通过Effectene将二者共转染至293细胞株，其具体方法参见Qigen公司的操作说明。PBHG-E3质粒购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，含有5型腺病毒的右臂，并含有E3区及含腺病毒的绝大部份其它基因。将pZD55-gene与pBHGE3共转染293细胞后，10-14天出现病毒空斑，经过2次病毒空斑纯化，进行扩增，提取重组腺病毒的DNA，进行DNA酶切分析，PCR分析，确定重组正确的腺病毒株，即得到55Kda基因缺失并插入目的基因表达框的腺病毒，命名为Ad5-ZD55-gene(有时简称为ZD55-gene)。

以sFLT-1基因为例，将质粒pZD55-sFLT1与pBHGE3共转染293细胞，10-14天后挑出病毒空斑，经过2次病毒空斑纯化，小量扩增，提取病毒DNA。PCR鉴定重组腺病毒株，鉴定所用的引物：

引物7：5’Aga gcc cat gga acc cga ga 3’(和Ad5 bp 2200-2219配对)

引物8：5’Cat cgt acc tca gca cct tcca 3’(和Ad5 bp 3353-3332配对)

引物9：5’Tcc gac tgt ggt tgc ttc atg 3’(和Ad5 bp 2999-3019配对)

以病毒DNA为模板，引物7与引物8进行PCR反应，扩增出1840bp的片段，而以野生型病毒DNA为模板，能扩增出1153bp的片段。以病毒DNA为模板，引物9与引物8进行PCR反应，不能扩增出DNA片段，而以野生型病毒DNA为模板，能扩增出354bp的片段。PCR反应证明所挑的腺病毒克隆是正确的，去除了E1b 55Kda基因，并且加入了sFLT-1基因的表达框。将此E1b 55Kda基因缺失并插入sFLT-1基因表达框的腺病毒，命名为Ad5-ZD55-sFLT-1。Ad5-ZD55-sFLT-1为5型腺病毒，腺病毒的E1b 55Kda基因已缺失(bp2269-bp3327缺失)，在E1b 19Kda蛋白基因后面加上了SV40polyA尾巴，SV40polyA尾巴后面加上了一个Bgl II位点，并且在该酶切位点中插入了含有CMV启动子、含有人sFLT-1基因及SV40polyA尾巴的基因表达框。病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。

腺病毒Ad5-ZD55-sFLT-1在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心纯化腺病毒。具体操作方法见Microbix Biosystem Inc.(Toronto)的操作说明。

用类似方法构建的重组腺病毒还有Ad5-ZD55-Trail，Ad5-ZD55-TK，Ad5-ZD55-CD，Ad5-ZD55-IL 12，Ad5-ZD55-Smac，Ad5-ZD55-Endostatin，Ad5-ZD55-Angiostatin及其衍生物等。

实施例IV.检测重组腺病毒在体外对肿瘤细胞的杀伤能力

以Ad5-ZD55-sFLT-1为例。将Ad5-ZD55-sFLT-1、ONYX-015、野生型5型腺病毒Ad5分别病毒感染293细胞，肝癌细胞株Hep3B细胞，大肠癌细胞株SW620及正常人胚肺细胞。细胞按2×10⁵/孔接种6孔板，分别感染Ad5-ZD55-sFLT-1、ONYX-015、Ad5各1×10⁵pfu，48小时后收集整个细胞培养液，3次冻融后用293细胞株测定其病毒滴度。具体方法参见Microbix Biosystem Inc.(Toronto)的操作说明。结果为：

	293	Hep3B	SW620	正常胚肺细胞
					Ad5ONYX-015Ad5-ZD55-sFLT-1	1×1051×1051×105	1×1058×1048×104	2×1056×1047×104	5×104＜1×101＜1×101

证明Ad5-ZD55-sFLT-1能够特异性的在肿瘤细胞中复制(达8×10⁴)，而在正常细胞中不复制(只1×10¹)。构建的表达抗癌基因的E1b 55Kda基因缺失的腺病毒能特异性的在肿瘤细胞中复制和增殖，并杀死肿瘤细胞。

实施例V.检测重组基因病毒在体外表达抗癌基因的能力

为鉴定E1b55Kda基因缺失的腺病毒表达抗癌基因的能力及表达水平，用上述类似的方法，构建了荧光素酶基因病毒Ad5-ZD55-Luciferase，并且构建了E1区缺失的不能在肿瘤中复制的腺病毒Ad5-CA13-Luciferase。Luciferase基因是荧光素酶报告基因，购于Promega公司。荧光素酶基因的定量测量参照Promega公司的产品说明书。

将Ad5-ZD55-Luciferase、Ad5-CA13-Luciferase分别感染肝癌细胞株Hep3B细胞，大肠癌细胞株SW620，乳腺癌细胞株Bcap-37及正常人胚肺细胞。在24板中，按每孔接种2×10⁴pfu病毒，分别感染Ad5-ZD55-Luciferase、Ad5-CA13-Luciferase 1×10²pfu，24小时、48小时、72小时、96小时后收集细胞，裂解细胞后，测荧光素酶的强度。结果显示24小时后，Ad5-ZD55-Luciferase与Ad5-CA13-Luciferase相同，48小时、72小时、96小时后在Hep3B、SW620、Bcap-37细胞中，Ad5-ZD55-Luciferase大大高于Ad5-CA13-Luciferase，而在正常人胚肺细胞Ad5-ZD55-Luciferase与Ad5-CA13-Luciferase无明显差别。感染癌细胞，Ad5-ZD55-Luciferase的峰值在96小时，随时间延长而成倍增长。而Ad5-CA13-Luciferase的峰值在48小时，48小时后表达量开始下降。

实验表明Ad5-ZD55载体能够表达外源基因，并且随着载体的复制、增殖，基因表达量提高。与不能增殖的腺病毒载体Ad5-CA13相比，Ad5-ZD55载体能够成千倍的提高基因在肿瘤细胞中的表达量。

实施例VI.重组腺病毒在裸鼠体内治疗肿瘤细胞移植瘤

将4-5周龄的裸鼠皮下接种乳腺癌细胞株Bcap-37，12天后进行动物分组。治疗组给予1×10⁹pfu的基因病毒Ad5-Zd55-sFLT-1进行治疗，对照分3组：1组是PBS处理组，2组用相同剂量的ONYX-015病毒，3组用相同剂量的非增殖的病毒Ad5-CA13-sFLT-1，试验结果表明Ad5-ZD55-sFLT-1能有效的杀死肿瘤细胞，治疗效果比ONYX-015好，比Ad5-CA13-sFLT-1更好。

以上结果充分证明由pZD55质粒构建的携带抗癌基因的肿瘤特异性增殖腺病毒Ad5-ZD55-gene能够实现基因治疗效果与病毒治疗的协同作用，其治疗效果比单纯应用基因治疗或者病毒治疗效果都好。用Ad5-pZD55-Trail治疗肿瘤，初步观察，效果更明显。

Claims (9)

1、一种抗癌靶向基因病毒药物的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

I：表达肿瘤治疗基因的肿瘤特异性增殖的腺病毒的构建方法，其特征在于：(1)用定点PCR方法，使腺病毒的2269-3327bp缺失，在E1B 19Kda基因后加上了SV40 polyA尾巴，在SV40 polyA尾巴加入的单酶切位点Bgl II；(2)将抗癌基因克隆进质粒pCA13的多克隆位点，用Bgl II酶切出治疗基因的表达框，它包含HCMV启动子、抗癌基因、SV40 poly A尾巴，插入改造好的腺病毒载体中；(3)将改造好的抗癌基因的腺病毒载体与含腺病毒大质粒pBHGE3或pBHG10转染HEK-293细胞建成治疗用重组腺病毒；(4)分离治疗用的重组腺病毒；

II：将步骤I制得的重组腺病毒按常规方法制备药物。

2、根据权利要求1所述的一种抗癌靶向基因病毒药物的制备方法，其特征在于其中所述的肿瘤特异性增殖的腺病毒插入的抗癌基因为报告基因GFP、EGFP、Luciferase产物。

3、根据权利要求1所述的一种抗癌靶向基因病毒药物的制备方法，其特征在于其中所述的肿瘤特异性增殖的腺病毒插入的抗癌基因为抑癌基因p53、p21、RB、NF1、VHL、APC产物。

4、根据权利要求1所述的一种抗癌靶向基因病毒药物的制备方法，其特征在于其中所述的肿瘤特异性增殖的腺病毒插入的抗癌基因为自杀基因CD、TK产物。

5、根据权利要求1所述的一种抗癌靶向基因病毒药物的制备方法，其特征在于其中所述的肿瘤特异性增殖的腺病毒插入的抗癌基因为抗癌作用很强的基因Trail、Blys、Smac产物。

6、根据权利要求1所述的一种抗癌靶向基因病毒药物的制备方法，其特征在于其中所述的肿瘤特异性增殖的腺病毒插入的抗癌基因为细胞因子IL-12、IL-2、IFN、GM-CSF。

7、根据权利要求1所述的一种抗癌靶向基因病毒药物的制备方法，其特征在于其中所述的肿瘤特异性增殖的腺病毒插入的抗癌基因为细胞凋亡基因ICE、caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax产物。

8、根据权利要求1所述的一种抗癌靶向基因病毒药物的制备方法，其特征在于其中所述的肿瘤特异性增殖的腺病毒插入的抗癌基因为血管生成抑制基因sflt-1，Angiostatin、Endostatin、TIMP-4、PAI产物。

9、一种药物组合物，含有根据权利要求1方法构建的重组腺病毒。