CN1249779A - 细胞色素p450单加氧酶 - Google Patents

Abstract

提供了依赖细胞色素P450_Ⅱ的单加氧酶和编码这些单加氧酶的DNA分子,这些酶能催化醛肟向腈的生物合成转化以及该腈向相应的氰醇的转化,氰醇是含氰苷的前体。此外,本发明提供了获得根据本发明的DNA分子的方法,以及获得抵抗昆虫、蜱螨或线虫的转基因植物或者获得营养价值改善的植物的方法。

Description

细胞色素P450单加氧酶

本发明涉及通常使用重组DNA技术的植物中的遗传工程，并且涉及参与含氰苷的生物合成的酶，特别是编码这些酶的基因。根据本发明的蛋白质和基因能用来改善植物的营养价值或对害虫的抵抗力。

在超过2000种的植物中，含氰苷构成了次级植物代谢物。在一些实例中它们是HCN的来源，如果作为食物被摄取则其会赋予植物毒性。例如，生氰作物木薯(Manihot esculenta)的块茎构成了热带地区的一种重要的食物。这些块茎中存在的含氰苷可导致人的氰化物中毒，这是由于未充分处理的木薯产物引起的。其它植物种包括白三叶草(Trifoliumrepens)、高粱(双色高粱(Sorghum bicolor))、亚麻(Linumusitatissimum)、海韭菜苷(Triglochin maritima)、利马豆(棉豆(Phaseoluslunatus))、扁桃(扁桃属(Amygdalus))以及杏(李属(Prunns))、樱桃和苹果(Malus)的种子，其HCN的酶源产生说明了当作为食物被过量摄取或用作动物饲料时其潜在的毒性。在这些植物中毒性特性能通过阻断含氰苷的生物合成而降低。

天然发生的含氰苷的初级前体限于五种疏水性蛋白质氨基酸缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，以及一种单独的非蛋白质氨基酸，环戊烯甘氨酸。这些氨基酸在一系列反应中转化为氰醇，氰醇最终与糖残基连接。例如，苦杏仁苷构成O-β-龙胆二糖苷，野黑樱苷构成(R)-杏仁腈的O-β-葡糖苷。含有芳香族糖苷配基的含氰苷的另一个实例是含氰苷蜀黍苷和taxiphyllin的差向异构体对，其分别见于高粱属和紫杉属中。例如对羟基杏仁腈被UDPG-糖基转移酶转化为蜀黍苷(β-D-吡喃葡糖基氧-(S)-对羟基杏仁腈)。相似的糖基转移酶据认为存在于大多数植物中。巢菜苷和路枯马木苷是类似于苦杏仁苷的二糖衍生物的另外的例子。黑接骨木苷包含(S)-杏仁腈作为其糖苷配基，因此它是野黑樱苷的差向异构体。

含有脂族糖苷配基的含氰苷的实例是在三叶草、亚麻、木薯和豆类中发现的亚麻苦苷和百脉根苷。关于含氰苷及其生物合成的详细评述见Conn，Naturwissenschaften 66：28-34，1979，在此引入作为参考。

已广泛研究了来源于酪氨酸的含氰苷蜀黍苷的生物合成途径(Halkier等人，“含氰苷：生物合成途径与有关的酶系统”，在《生物学中的氰化物》(Cyanide compounds in biology)，Wiley Chichester(Ciba基金会140)，49-66页，1988；Halkier和Moller，植物生理学(Plant Physiol.)90：1552-1559，1989；Halkier等人，生物化学杂志(The J.of Biol.Chem.)264：19487-19494，1989；Halkier和Moller，植物生理学96：10-17，1990；Halkier和Moller，生物化学杂志265：21114-21121，1990；Halkier等人，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88：487-491，1991；Sibbesen等人，在《细胞色素P450的生物化学和生物物理学。结构和功能、生物工程学和生态学方面》，Archakov，A.I.(编)，1991；Koch等人，第8届国际细胞色素P450会议，摘要PII.053；以及Sibbesen等人，第8届国际细胞色素P450会议，摘要PII.016)。L-酪氨酸被转化为对羟基杏仁腈(蜀黍苷的前体)，N-羟基酪氨酸、N，N-二羟基酪氨酸、(E)-和(Z)-对羟苯基乙醛肟和对羟苯基乙腈是中间物。细胞色素P450型的两种单加氧酶参与了该途径。在木薯中，包括依赖细胞色素P450的单加氧酶的相似途径用于分别从缬氨酸和异亮氨酸合成亚麻苦苷和百脉根苷(Koch等人，生物化学与生物物理学档案(Archives of Biochemistry andBiophysics)，292：141-150，1992)。业已证明，在双色高粱中从L-酪氨酸到对羟基杏仁腈的复杂途径仅需要两种依赖细胞色素P450的多功能单加氧酶。第一种酶称为P450_TYR，将酪氨酸转化为对羟基苯乙醛肟。第二种酶称为P450_OX，将醛肟转化为对羟基杏仁腈。鉴于不同植物之间含氰苷生物合成途径的相似性，通常假定该途径包括两种依赖P450的多功能单加氧酶，P450_I和P450_II，它们分别将前体氨基酸转化为相应的醛肟，将醛肟转化为相应的氰醇。P450_I是一种特异酶，它决定底物特异性并因此决定产生的葡糖苷的类型，而预计P450_II在将一系列结构不同的醛肟转化为相应的氰醇方面特异性较低。

芥子油苷是亲水的、非挥发性的巯基糖苷，发现于双子叶被子植物的几个目中(Cronquist，《有花植物的进化和分类》(The Evolution andClassification of Flowering Plants)，New York Botanical Garden，Bronx，1988)。含氰芥子油苷和葡糖苷的存在是互相排斥的。芥子油苷的最大经济意义是其存在于十字花科(Capparales的目)的所有成员中，该科的许多品种几个世纪来为人类提供了佐料、调味品、色拉作物和蔬菜以及饲料作物的来源。最近，芸苔(特别是Brassica napus和油菜(Brassicacampestris))已作为主要的商业油料籽出现。已知大约100种不同的芥子油苷具有相同的通式结构，但其侧链的性质不同。芥子油苷是直接由蛋白质氨基酸形成的，或是在单个或多个链延伸后形成的(Underhill等人，生物化学学会评论集(Biochem.Soc.Symp.)38：303-326，1973)。已鉴定为含氰苷生物合成的中间物的N-羟基氨基酸和醛肟，也用作芥子油苷生物合成的有效前体(Kindl等人，植物化学(Phytochemistry)7：745-756，1968；Matsuo等人，植物化学11：697-701，1972；Underhill，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)2：61-63，1967)。参与含氰苷合成的细胞色素P450_I因此在功能上非常类似于芥子油苷合成中相应的生物合成酶，由此预计它是P450酶相同家族的一个成员。我们从白芥子(Sinapisalba)中分离了编码P450酶(SEQ ID NO：17)的cDNA克隆，该酶与P450_TYR(CYP79)有54％的同一性，催化芥子油苷生物合成的第一步，即由亲代氨基酸形成醛肟。该cDNA克隆显示与芥(Aribidopsis)EST序列(T42902)有大约90％的同一性，这有力地表明该细胞色素P450酶在含芥子油苷的物种中高度保守。

上述氰醇的复杂生物合成途径对仅仅两种酶细胞色素P450_I和P450_II的催化活性的降低，可用于对植物中含氰苷生物合成途径的操作。通过编码一种或两种单加氧酶的基因构建体的转染，能修改、重建或新建含氰苷的生物合成途径。

通过本领域已知的方法对植物中含氰苷生物合成途径的修改或引入该途径是非常有意义的，因为含氰苷对昆虫、蜱螨和线虫有毒。因此，植物中或某些植物组织中含氰苷生物合成途径的修改、引入或重建将使植物对于昆虫、蜱螨和线虫来说不好吃，于是有助于减少害虫对作物的损害。与其它杀虫剂成分如苏云金芽孢杆菌内毒素结合，甚至可进一步减少害虫对作物的损害。

另外，能使用编码根据本发明的单加氧酶的基因序列设计DNA质粒，该质粒一旦转染至含有含氰苷的植物如木薯、高粱或大麦中，即可消除在野生型植物中正常产生的含氰苷。这可通过反义或有义RNA或核酶的表达而实现，如EP-458367-A1、EP-240208-A2、US-5,231,020、WO 89/05852和WO 90/11682中所述，这抑制根据本发明的单加氧酶的表达。这是非常有意义的，因为尽管进行了许多努力，但仍不可能通过传统的植物培育从例如木薯或高粱中完全去除含氰苷。另一方面，已显示大麦品种的表皮细胞中含氰苷量的升高赋予对霉菌禾白粉菌(Erysiphegraminis)攻击的敏感性增强(Pourmohensi，博士论文，Gottingen，1989；Ibenthal等人，应用植物学(Angew.Bot.)67：97-106，1993)。在被真菌Microcyclus ulei攻击后的生氰橡胶树Hevea brasiliensis中(Lieberei等人，植物生理学90：3-36，1989)和被亚麻刺盘孢(Colletotrichum lini)攻击的亚麻中(Ludtke等人，Biochem.Z.324：433-442，1953)观察到相似的作用。在这些例子中，上述植物和其它植物的定量抗性能通过阻止含氰苷在这些植物中的产生而提高，其中含氰苷增强对微生物攻击的敏感性。在大麦中，含氰苷位于表皮细胞中。因此反义、有义或核酶构建体的表达优选地(但不是必须)由表皮特异的启动子所控制。

植物中甚至较少量含氰苷的存在也可引起营养问题，这是由于不希望的致癌物的产生引起的，如在大麦中所示。例如大麦麦芽包含少量的含氰苷epiheterodendrin，其在产生基于谷物的酒精过程中可转化为据认为是致癌物的氨基甲酸乙酯。正在进行尝试以提出氨基甲酸乙酯在发酵的食品、饮料和酒精中的强制最大允许浓度(食品化学新闻(Food ChemicalNews) 29：33.35，1988)。

WO 95/16041描述了一种编码细胞色素P450_I单加氧酶的DNA分子，该酶催化氨基酸向相应的N-羟基氨基酸、N，N-二羟基氨基酸的转化，以及N，N-二羟基氨基酸向相应的醛肟的转化。亲代氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和环戊烯甘氨酸。该DNA分子对应于天然发生的基因或其功能同源物，它们是突变、缺失、截短等的结果，但仍然编码一种细胞色素P450_I单加氧酶，该酶能催化含氰苷生物合成途径中一种以上的反应。单加氧酶优选地包含单一的催化中心。

另外，WO 95/16041描述了编码细胞色素P450_II单加氧酶如双色高粱的P450_OX的DNA分子。它们催化醛肟向腈的转化以及腈向相应的氰醇的转化。两种多功能P450酶对酪氨酸转化为对羟基苯乙腈的催化解释了为什么此转化中除(Z)-对羟基苯乙醛肟之外的所有中间物都是有沟的(channell)。

为了P450_OX的分离而提出的策略基于用于从高粱中分离P450_TYR(CYP79，Sibbesen等人，美国国家科学院学报91：9740-9744，1994)的策略。在此方法中，DEAE Sepharose离子交换柱用来结合P450酶，而样品中的黄色素不结合。色素的去除具有双重目的。这是P450酶与随后的柱结合的前提，并且使P450的含量能够通过光谱测定(一氧化碳和底物结合)估计。本发明证明P450_OX与P450_TYR相反，显示对DEAE柱的低结合亲和力，基本上回收于流过和洗涤级分中。为了从黄色素中分离P450_OX活性，应用基于Triton X-114的相分配法。择优使用0.6-1％的Triton X-114，发现P450_OX分配至全部两相中，这与P450_TYR相反，P450_TYR被回收于富含去污剂的上相中。通过将Triton X-114的浓度提高至6％，P450_OX的大多数从缺乏去污剂的下相中回收，而黄色素存在于上相中。使用6％Triton X-114的一个缺点是增强了P450_OX向其变性形式P420的转化。在本发明中使用此知识第一次纯化了P450_II单加氧酶如P450_OX，克隆编码该单加氧酶的基因，并用编码单加氧酶的基因稳定地转化植物。P450_OX的分离和部分氨基酸序列的测定可用于设计寡核苷酸探针和编码P450_OX的cDNA的分离。然而，在本案中，克隆是通过独立的方法完成。

本发明主要涉及编码细胞色素P450_II单加氧酶的DNA分子，该酶催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化。优选地醛肟是一种氨基酸的转化产物，所述氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和环戊烯甘氨酸，或者选自L-酪氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸，这种转化如WO 95/16041所述由P450_I单加氧酶催化。根据本发明的DNA分子对应于天然发生的基因或其同源物，它们是突变、缺失、截短等的结果，但仍编码一种细胞色素P450_II单加氧酶，该酶催化醛肟向腈的转化以及随后该腈向相应的氰醇的转化。根据本发明的单加氧酶催化含氰苷生物合成途径中一种以上的反应，优选地其包含单一的催化中心。

细胞色素P450_II酶可存在于大多数活生物体中。根据本发明的编码P450_II单加氧酶的DNA分子在结构上和功能上类似于可从产生含氰苷的多种植物中获得的DNA分子。在本发明的一种优选实施方案中，DNA分子可与具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA分子片段杂交。该片段超过10个核苷酸长，优选地超过15、20、25、30或50个核苷酸。影响杂交种稳定性的因素决定杂交条件的严格性，并能根据形成的杂交种的解链温度Tm来测定。在几种教科书中描述了Tm的计算。例如Keller等人在《DNA探针：背景、应用、方法》，Macmillan出版有限公司，1993，第8-10页中描述了对于在杂交反应Tm值计算中应考虑的因素。根据本发明的DNA分子与SEQ ID NO：1的片段在低于形成杂交种的计算值Tm30℃的温度下杂交。优选地它们在低于计算值Tm25、20、15、10或5℃的温度下杂交。

为了使用重组DNA技术进行基因操作，根据本发明的DNA分子除编码单加氧酶的基因外，可包含允许本发明的DNA在微生物例如大肠杆菌、芽胞杆菌(Bacillus)、农杆菌(Agrobacterium)、链霉菌(Streptomyces)或酵母中复制和选择的DNA。它也可包含允许单加氧酶基因在同种或异种植物中表达和选择的DNA。这样的序列包含但不限于如WO93/07278所述其密码子的使用适合于异种植物的密码子使用的基因；赋予对新霉素、卡那霉素、氨甲喋呤、潮霉素、博来霉素、链霉素或庆大霉素、氨乙基半胱氨酸、glyophosphate、磺酰脲或膦丝菌素的抗性的基因；可评价的标记基因如半乳糖苷酶；其天然启动子和转录终止信号；启动子元件如35S和19S CaMV启动子，或组织特异的植物启动子，如对根(如EP-452269-A2、WO91/13992、US-5,023,179所述)、对绿叶如玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)、对髓或花粉(如WO93/07278所述)特异的启动子，或者诱导型植物启动子(EP-332104)；以及异源转录终止信号。

本发明也涉及P450_II单加氧酶，它催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化。在本发明的一种优选实施方案中，纯化单加氧酶，并能用其建立与该单加氧酶特异结合的单克隆或多克隆抗体。尤其是从双色高粱中分离经SDS-PAGE测定分子量为55kD的细胞色素P450_OX。其氨基酸序列在SEQ ID NO：2中给出。

P450_OX的催化特性类似于报道的大鼠肝微粒体中细胞色素P450活性(DeMaster等人，有机化学杂志(J.Org.Chem.)5074-5075，1992)。细胞色素P450_OX和属于细胞色素P450_OX家族的其它成员的一个特征是，醛肟脱水为相应的腈依赖于NADPH的存在，但是在某些情况下这种依赖性可通过连二亚硫酸钠或其它还原剂的加入而克服。

在细胞色素P450酶的所有已知序列中，细胞色素P450_OX显示与鳄梨酶CYP71A1有最高的氨基酸序列同一性(44％)，与CYP71家族的所有其它成员有低于40％的同一性。鳄梨不产生含氰苷，CYP71A1不催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化。因此，根据本发明能定义细胞色素P450_II单加氧酶的家族，其成员催化醛肟向相应的氰醇的转化，并且与细胞色素P450_OX有40％或更高的氨基酸序列同一性。优选地与细胞色素P450_OX的氨基酸序列同一性高于50％或高于55％。

有人建议将P450_OX指派为新CYP71亚家族(CYP71E1)的第一种成员，因为它在系统树中与其它CYP71序列聚簇，系统树是多序列对比的图形输出结果。通常，根据命名委员会，对于将细胞色素P450分配于新的CYP家族需要在氨基酸水平上低于40％的序列同一性，且超过55％相同的序列则分配于相同的亚家族。当进行多序列比较时，不仅要考虑序列同一性，而且要考虑序列相似性，如单个氨基酸的相同净电荷或相似的疏水性/亲水性。在这种比较中，P450_OX与其它CYP71序列聚簇，因此应当属于CYP71家族，尽管事实表明除来源于鳄梨的CYP71A1外，它与CYP71家族的所有其它成员显示低于40％的同一性。由于它显示与其它成员的低序列同一性，所以应当被分配于一个新的亚家族。其它的CYP71家族成员全部来源于非生氰种，其功能还不清楚。以前鉴定的属于CYP71家族的P450的催化特性仍难以搞清。据认为它们参与了萜羟化。它们中没有一个被认为利用肟作为底物，也不能多功能地将醛肟转化为腈和氰醇。

本发明的另一种实施方案见于编码细胞色素P450_II单加氧酶的cDNA的制备方法，该酶催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化。它包括

(a)从产生含氰苷的植物组织中分离和溶解微粒体，

(b)纯化细胞色素P450单加氧酶，

(c)产生抗纯化的单加氧酶的抗体，

(d)用该抗体探查产生含氰苷的植物组织的cDNA表达文库，

(e)分离表达该单加氧酶的克隆。

微粒体能从植物组织中分离，这些植物组织显示担负含氰苷生物合成的酶系统的高活性。这些组织可随植物种而不同。微粒体的一种优选的来源是新分离的苗，这些苗在萌发后1-20天、优选地2-10天、最优选地2-4天收获。产生含氰苷的植物的黄化幼苗是优选的，但也可使用光生长的幼苗。分离后，将微粒体溶解于含一种或多种去污剂的缓冲液中。优选的去污剂是RENEX 690(J.Lorentzen A/S，Kvistgard，丹麦)、还原的Triton X-100(RTX-100)、Triton X-114和CHAPS。

可使用蛋白质纯化的标准技术纯化细胞色素P450单加氧酶，如超速离心、分级沉淀、透析、SDS-PAGE和柱层析。可能的柱包括但不限于离子交换柱如DEAE Sepharose、活性染料柱如Cibacron yellow 3琼脂糖、Cibacron blue琼脂糖和活性红120琼脂糖，以及凝胶过滤柱如Sephacryl S-1000。单个级分的细胞色素P450含量能从一氧化碳差示光谱中测定。P450_OX分离过程中一个特别的困难是，在最初的纯化步骤中它不是与离子交换柱相结合而是与黄色素共迁移，这也使P450_OX的定量变得困难，而离子交换柱通常用于P450酶如P450_TYR的纯化。黄色素的存在阻止P450_OX与许多不同柱材料的结合，于是构成了进一步纯化的主要障碍。然而，能通过温度诱导的Triton X-114相分配实现P450_OX从黄色素中的分离。就P450_OX的回收和色素的去除而言可通过提高Triton X-114的量优化该方法。在Triton X-114达6％时，大约80％的P450_OX活性分配至澄清的下相中，6％是用于其它P450的水平的六到十倍。在此纯化步骤中除了黄色素的去除还实现了小量纯化。然而，将含P450_OX的下相加于Cibacron blue染料柱时，盐梯度洗脱产生几乎均一的P450_OX，正如由主要考马斯染色带的存在所判断的，在通过重建显示P450_OX活性的级分中它具有55kDa的表观分子量。

分离的P450_OX产生一种一氧化碳光谱，在450nm处有一个吸收峰，但相对较大部分的分离酶以变性的P420形式存在。P450_OX向变性P420形式的连续转化妨碍了在分离方法的不同步骤中对P450_OX的总含量和比活性的定量测定。另外，P450_OX的比活性取决于所用的不同去污剂发挥的抑制作用。于是认为级分的总P450含量是半定量的。

能用纯化的蛋白质在例如小鼠、山羊、绵羊、兔或鸡中经注射后产生抗体。将5-50μg蛋白质以约14天的间隔注射数次。在本发明的一种优选实施方案中，12-20μg蛋白质以14天的间隔注射2-6次。可在有或无佐剂的情况下进行注射。免疫球蛋白从抗血清中纯化，脾能用于杂交瘤融合，如Harlow和Lane，《抗体：实验室手册》，Cold Spring HarborLaboratory Cold Spring Harbor，纽约，1988中所述，在此引入作为参考。与细胞，色素P450_II单加氧酶特异结合的抗体也能用于植物培育，以检测产生改变量的细胞色素P450单加氧酶从而得到产生改变量的含氰苷的植物。

植物组织cDNA文库的制备方法在Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约，1988中有广泛描述，其中关于cDNA文库制备的重要部分在此引入作为参考。从显示担负含氰苷生物合成的酶系统的高活性植物组织中分离polyA⁺RNA。这些组织可随植物种而不同。用于polyA⁺RNA分离的一种优选的组织是新分离的苗组织，这些苗在萌发后1-20天、优选地2-10天、最优选地2-4天收获。能用特异结合细胞色素P450_II单加氧酶的抗体探查获得的cDNA文库，并能分离表达该单加氧酶的克隆。

制备编码细胞色素P450_II单加氧酶的cDNA的一种备择方法包括

(a)从产生含氰苷的植物组织中分离和溶解微粒体，

(b)纯化细胞色素P450_II单加氧酶，

(c)获得该单加氧酶的完全或部分蛋白质序列，

(d)设计指定DNA的寡核苷酸，其中DNA编码所述单加氧酶蛋白质序列的4-15个氨基酸，

(e)用该寡核苷酸、或者用该寡核苷酸由cDNA进行PCR扩增所获得的DNA分子探查产生含氰苷的植物组织的cDNA文库，以及

(f)分离编码细胞色素P450_II单加氧酶的克隆。

内肽是蛋白酶消化的结果，其氨基酸序列能通过标准技术如Edman降解法获得。根据遗传密码通过蛋白质序列部分的反向翻译可获得指定DNA的寡核苷酸，其中DNA编码本发明的单加氧酶的部分蛋白质序列。对于反向翻译，低简并性的DNA序列所编码的蛋白质序列是优选的。其长度为4-15个、优选地5-10个氨基酸。如必要时，寡核苷酸中使用的密码子能适合植物来源的密码子习惯(Murray等人，核酸研究(Nucleic AcidsResearch)17：477-498，1989)。如Sambrook等人(《分子克隆：实验室手册》Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)所述，能用获得的寡核苷酸探查cDNA文库，以得到能与该寡核苷酸碱基配对的克隆。另外，寡核苷酸能用于聚合酶链反应，其方法学在本领域中已知，以植物cDNA作为扩增的模板。在本案中，获得的扩增产物被用来探查cDNA文库。分离编码细胞色素P450_II单加氧酶的克隆。

克隆基因的一种备择方法基于由表达载体构成的基因文库的构建。类似于以上已描述的方法，在此方法中，首先从能表达P450_II单加氧酶的细胞或组织中分离基因组DNA、但优选地是cDNA，然后剪接至合适的表达载体。然后使用适当的方法、优选地用抗体筛查如此产生的基因文库。筛选出含有所希望的基因或者至少此基因的一部分作为插入片段的克隆。

另外，能获得编码细胞色素P450单加氧酶的cDNA分子，该酶催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化，此方法包括

(a)设计覆盖A型细胞色素保守区3-10个氨基酸的简并寡核苷酸，

(b)使用简并寡核苷酸通过聚合酶链反应扩增一种或多种细胞色素特异的DNA片段，

(c)用细胞色素特异的片段筛查cDNA文库，获得全长的cDNA，

(d)在微生物宿主中表达全长的cDNA，

(e)鉴定表达细胞色素P450单加氧酶的宿主，该酶催化醛肟向腈的转化及该腈向相应的氰醇的转化，以及

(f)从该宿主中纯化克隆的DNA。

从DNA文库、优选地从cDNA文库中获得的总DNA可在PCR反应中用作模板，采用一种或多种代表A型细胞色素保守区的引物(Durst等人，药物代谢与药物相互作用(Drug Metabolism and Drug Interactions)12：189-206，1995)，A型细胞色素据信来源于共同的植物细胞色素P450祖先。根据A型细胞色素P450的多序列对比，能定义氨基酸水平上的三个高度保守区：1区(V/I)KEX(L/F)R，2区FXPERF和3区PFGXGRRXCXG。能设计含有简并肌苷(I)的引物，每条引物分别覆盖两个区的3-10个、优选地约5或6个氨基酸。PCR进行例如连续三轮。第1轮使用覆盖共有区FXPERF的引物和覆盖文库载体中T7启动子的标准T7引物，扩增来源于编码A型细胞色素P450的mRNA的cDNA。PCR的第2轮使用覆盖两个共有区的引物，以第1轮扩增的DNA作为模板，优先扩增一个100bp的片段，然后将其连接至pBluescript并测序。根据获得的DNA序列设计基因特异的引物。将其同与polyA尾互补的引物(引物dT+V)结合用于第3轮中，以PCR第1轮的DNA作为模板，扩增一个大约500bp的DNA片段，该片段能用作基因特异的探针分离全长的cDNA。该PCR方法不只用于P450_OX的分离，对于A型细胞色素P450的分离是通用的。所获得的A型细胞色素P450需要被异源表达以确定其功能。

如上所述制备的cDNA克隆或PCR产物或其片段可作为杂交探针，用于从同种或异种来源的生物如真菌或异种植物中进一步鉴定DNA序列的方法中，该DNA序列编码显示P450_II单加氧酶活性的蛋白质产物。一种合适的来源是含有含氰苷的植物的组织。

所述克隆或PCR产物也可作为RFLP标记，用来确定如细胞色素P450单加氧酶基因的位置或植物基因组中紧密相关的性状或用于标记辅助的培育(EP-A306139；WO 89/07647)。

使用上述方法，能分离编码P450_II单加氧酶的多种基因。所述基因能在产生纯化的重组细胞色素P450_II单加氧酶的方法中使用，该酶催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化；该方法包括

(a)人工改造编码该单加氧酶的基因，使其可在宿主生物如细菌、酵母或昆虫细胞中表达，

(b)用经改造的基因转化该宿主生物，以及

(c)从宿主生物或培养上清液中分离蛋白质。

在本发明的一种优选实施方案中，用该方法获得纯化的重组细胞色素P450_OX，或获得通过基因工程的已知技术修饰的细胞色素P450_OX。优选地，这种修饰导致重组蛋白质的表达增强或导致底物特异性改变。

能使用本发明的DNA分子获得抵抗昆虫或蜱螨的转基因植物。具体实施方案列于但不限于WO 95/16041的表B(45页)中，以及以下所述对于线虫的实施方案。只是为了方便，本说明书中不再重复该表，但有意在此引入以参考WO 95/16041的公开内容。优选地转基因植物可抵抗鞘翅目(Coleoptera)和鳞翅目(Lepidoptera)，如西方玉米根虫(Diabroticavirgifera virgifera)、北方玉米根虫(Diabrotica longicornis barberi)、南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata howardi)、棉花棉铃虫、欧洲玉米钻蛀虫、玉米根网虫(webworm)、棉红铃虫和烟草蚜虫。

线虫是植物的主要动物寄生虫，它每年导致全球农业估计大于十亿美元的损失。某些线虫诱导参与饲养部位的植物细胞修饰，并在一个部位饲养几个小时或更多。它们包括根结线虫(Meloidogyne)、球胞囊线虫(Globodera)、异皮线虫(Heterodera)、肾形线虫(Rotylenchulus)、麦线虫(Tylenchulus)、珍珠线虫(Nacobbus)、剑线虫属(Xiphinema)、长针线虫(Longidorus)、异长针线虫(Paralongidorus)、隐皮线虫(Cryphodera)、营养麦线虫(Trophotylenchulus)、鞘线虫(Hemicycliophora)、小环线虫(Criconemella)、标矛线虫(Verutus)和Heliocotylenchus等属的种。被认为在一个部位饲养更有限时间的属包括短体线虫(Pratylenchus)、穿孔线虫(Radopholus)、潜根线虫(Hirschmanniella)、毛刺线虫(Trichodorus)、类毛刺线虫(Paratrichodorus)、茎线虫(Ditylenchus)、滑刀线虫(Aphelenchoides)、Scutellonema和刺线虫(Belonolaimus)等属。

转基因植物包含编码新单加氧酶的DNA，该酶催化醛肟向腈的转化以及腈向相应的氰醇的转化。另外转基因植物可包含与除草剂抗性基因遗传连锁的单加氧酶基因。转基因植物优选地是单子叶或双子叶植物。WO 95/16041的表A(33-44页)中列出了具体实施方案。只是为了方便，本说明书中不再重复该表，但有意在此引入以参考WO 95/16041的公开内容。它们优选地选自玉米、稻、小麦、大麦、高粱、棉花、大豆、向日葵、草、油料籽油菜、甜菜、嫩茎花椰菜、花椰菜、卷心菜、黄瓜、甜玉米、日本萝卜、毕那棉(benas)、莴苣、甜瓜、胡椒、南瓜、番茄和西瓜。获得这些植物的方法包括

(a)将DNA引入能再生为完整植物的植物细胞或植物组织中，该DNA包含可在此植物中表达的、编码本发明的单加氧酶的基因，以及

(b)筛选转基因植物。

同样，能使用本发明的DNA分子获得转基因植物，该转基因植物表达针对内源P450_II单加氧酶基因的反义或有义RNA或核酶。转基因植物中这些分子的表达降低了细胞色素P450_II单加氧酶的表达。由于含氰苷表达的降低，这些植物显示改善的疾病抵抗力或营养价值。获得这些植物的方法包括

(a)将编码有义RNA、反义RNA或核酶的DNA引入能再生为完整植物的植物细胞或组织中，该DNA的表达降低了细胞色素P450_II单加氧酶的表达，以及

(b)筛选转基因植物。

许多非常有效的方法可用于将DNA引入植物细胞中，这些方法基于基因转移载体的应用或基于直接基因转移方法。

将基因构建体插入细胞的一种可能的方法是利用以该基因构建体转化的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和/或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物细胞。然后在本领域技术人员已知的适当培养条件下培养转基因植物细胞，以使其形成苗和根，最终形成整个植物。

使用农杆菌的所谓叶盘(leaf disk)转化属于本发明的范围之内(Horsch等人，科学(Science)227：1229-1231，1985)。将合适的靶植物的无菌叶盘与包含一种根据本发明的嵌合基因构建体的农杆菌细胞一起温育，然后转移至合适的营养培养基之中或之上。在本发明的范围之内特别合适的、因而优选的是LS培养基，它通过琼脂的加入而固化，并且富含一种或多种通常使用的植物生长调节剂，尤其是选自包括α-萘乙酸、落叶素、2，4，5-三氯苯氧乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-琥珀酸、吲哚-3-乙酸和对氯苯氧乙酸的生长素，以及选自包括细胞分裂素、6-苄基腺嘌呤、2-异戊烯基腺嘌呤和玉米素的细胞分裂素。生长素和细胞分裂素的优选浓度范围是0.1mg/l-10mg/l。

于20℃-40℃、优选地23℃-35℃、最优选地于25℃的温度下在漫射光中温育数天后，优选地温育2-3天后，将叶盘转移至合适的培养基中进行苗诱导。对于转化体的筛选LS培养基是特别优选的，它不含生长素但含有细胞分裂素，并且其中加入了选择性底物。将培养物置于光下，以适当的间隔、优选地以一周的间隔转移至新鲜培养基中。切下发育的绿苗，在诱导幼苗形成根的培养基中进一步培养。在本发明的范围内LS培养基是特别优选的，它不含生长素或细胞分裂素，但其中加入了选择性底物用于转化体的选择。

除农杆菌介导的转化外，在本发明的范围内能使用直接转化法用于将根据本发明的基因构建体插入植物材料中。

例如，能将载体中含有的遗传物质直接插入植物细胞中，例如使用纯粹的物理方法，如应用精细拉制成的微量加液器的显微注射(Neuhaus等人，理论与应用遗传学(Theoretical and Applied Genetics)74：363-373，1987)、电穿孔(D’Halluin等人，植物细胞(The Plant Cell)4：1495-1505，1992；WO92/09696)，或者优选地用转化DNA包被的微粒轰击细胞(“微粒轰击”；Wang等人，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)11：433-439，1988；Gordon-Kamm等人，植物细胞2：603-618，1990；McCabe等人，生物工程学(Bio/Technology)11：596-598，1993；Christou等人，植物生理学(Plant Physiol)87：671-674，1988；Koziel等人，生物工程学11：194-200，1993)。此外，待转化的植物材料可任选地用渗透活性底物如蔗糖、山梨糖醇、聚乙二醇、葡萄糖或甘露醇预处理。

用于遗传物质向植物细胞中直接转移的其它可能的方法包括用修饰质膜的方法处理原生质体，例如聚乙二醇处理、热休克处理或电穿孔，或这些方法的结合(Shillito等人，生物工程学3：1099-1103，1985)。

Negrutiu等人，植物分子生物学8：363-373，1987中描述了将遗传物质直接引入植物细胞的另一种方法，这种方法基于纯粹的化学方法，它使转化能非常有效和快速地进行。

应用共转化的直接基因转移(Schocher等人，生物工程学4：1093-1096，1986)也适用于植物材料的转化。

上述以举例方式给出的可能的转化方法的列表，不是要求专利保护的全部，也不是为了以任何方式限制本发明的主题。

人工改造进上述转基因种子和植物中的遗传特性通过有性繁殖或营养生长传递，因而能在子代植物中保持和繁殖。通常，这种保持和繁殖利用了为适应特定目的而开发的已知农业方法，如土壤耕作、播种或收获。也能使用特殊的方法如水培或温室技术。由于生长的作物对于昆虫或感染引起的攻击和损害以及对于杂草植物的竞争脆弱，所以采取措施控制杂草、植物疾病、昆虫、线虫或其它对提高产量不利的条件。这些措施包括机械措施，如土壤的耕作或杂草和染病植物的去除，以及农用化学品如除草剂、杀真菌剂、杀配子剂、杀线虫剂、生长调节剂、催熟剂和杀虫剂的应用。

根据本发明的转基因植物和种子的有利遗传特性能进一步在植物培育中使用，其目的是发展具有改善的特性的植物，这些特性如对害虫、除草剂或逆境的抵抗力，改良的营养价值，提高的产量，或使倒伏和散落损失较小的改进的结构。多种培育步骤均以明确的人为干预为特征，如选择要杂交的品系、引导亲代系的授粉或筛选合适的子代植物。根据希望的特性采取不同的培育方法。相关技术在本领域中众所周知，包括但不限于杂交、近交、回交、多系培育、品种融合、种间杂交、非整倍体技术等等。杂交技术也包括植物的不育化，以通过机械、化学或生物化学方法产生雄性或雌性不育植物。用不同系的花粉对雄性不育植物的异花授粉可确保雄性不育植物和雌性可育植物的基因组将一致获得两种亲代系的特性。因此，根据本发明的转基因种子和植物能用于改良的植物系的培育，例如它提高了常规方法如除草剂或杀虫剂处理的有效性，或者由于其改进的遗传特性省却了这些方法。另外，能获得具有改进的逆境抵抗力的新作物，由于其优化的遗传“装备”，能产生高品质的收获产物，其品质优于不能抵抗类似的不利发育条件的产物。

在种子生产中，种子的萌发质量和均匀性是重要的产品特征，而农民收获和出售的种子的萌发质量和均匀性是不重要的。由于难以使作物不含其它作物和杂草种子，为了控制种子携带的疾病及产生良好萌发的种子，种子生产者已发展了十分广泛和明确的种子生产方法，他们在纯种的生长、调节和营销领域中富有经验。因此，购买满足特定质量标准的合格种子而不是使用从自己的作物中收获的种子对于农民来说是普通的习惯。用作种子的繁殖材料通常用保护剂涂层处理，保护剂涂层包括除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或其混合物。通常使用的保护剂涂层包含如环己烯亚胺、萎锈灵、二硫四甲秋兰姆(TMTD^)、methalaxyl(Apron^)和pirimiphosmethyl(Actellic^)的化合物。如果希望，将这些化合物与另外通常应用于制剂领域的载体、表面活性剂或应用增强佐剂配制在一起，以提供对细菌、真菌或动物害虫引起的损伤的保护。可通过用液体制剂浸渗繁殖材料或通过用组合的湿或干制剂包被来应用保护剂涂层。其它应用方法如在芽或果实上进行处理也是可能的。

本发明的另一方面提供了新的农业方法，如以上举例说明的方法，其特征在于利用根据本发明的转基因植物、转基因植物材料或转基因种子。

下列实施例进一步描述了用于实施本发明的材料与方法，以及随后的结果。它们以举例方式给出，其叙述不应被认为是对要求保护的本发明的限制。

                          实施例实施例1：微粒体的制备

除非另外说明，涉及微粒体制备的所有步骤都在4℃下进行。所有缓冲液都通过在真空中搅拌除气，并用氩冲洗。

使双色高粱(杂交种SS1000，来源于AgriPro，Texas，美国)的种子在用纱布覆盖的金属筛上于28℃暗处萌发40小时。从大约3cm的黄化幼苗中制备微粒体。收获幼苗，使用研钵和研杵将其在2倍体积(v/w)的250mM蔗糖、100mM N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(pH7.9)、2mM EDTA和2mM DTT中匀浆化。在匀浆化前加入聚乙烯聚吡咯烷酮(0.1g/g鲜重)。匀浆通过22μM尼龙布过滤，以16500×g离心10分钟。上清液以165000×g离心1小时。重悬浮微粒体沉淀，用装备有聚四氟乙烯研杵的Potter-Elvehjem匀浆器在分离缓冲液中匀浆化。再次离心并再次匀浆化后，在液氮中冷冻匀浆，贮存于-80℃直到使用。实施例2：酶测定：总细胞色素P450的测定

总细胞色素P450的定量测定通过差光谱法进行，测定中对于还原的细胞色素P450与一氧化碳(A_450-490)间的加合物使用91mM^-1cm^-1的消光系数(Omura等人，生物化学杂志239：2370-2378，1964)。实施例3：细胞色素P450_OX的纯化

除非另外说明，涉及酶纯化的所有步骤都在4℃下进行。

缓冲液A：                        缓冲液C：

8.9％甘油                        8.9％甘油

10mM KH₂PO₄/K₂HPO₄(pH7.9)  40mM KH₂PO₄/K₂HPO₄(pH7.9)0.2mM EDTA                       5.0mM EDTA2.0mM DTT                        2.0mM DTT1.0％(v/v)Renex 690              1.0％(w/v)CHAPS0.05％RTX-100

在加入去污剂和DTT之前，通过在真空中搅拌将缓冲液除气三次。每次除气之间用氩冲洗缓冲液。在整个纯化过程中监测不同柱级分代谢放射性标记的对羟基苯乙醛肟的能力，以鉴定级分中P450_OX的存在。

用由8.9％甘油、10mM KH₂PO₄/K₂HPO₄(pH7.9)、0.2mM EDTA、2mM DTT组成的缓冲液将微粒体(20ml中400mg蛋白质)稀释至100ml，随后以恒定搅拌缓慢加入100ml的10mMKH₂PO₄/K₂HPO₄(pH7.9)、8.9％甘油、0.2mM EDTA、2mM DTT、0.1％RTX-100(v/v)、2％Renex。另外搅拌30分钟，随后以150000×g超速离心35分钟后，以100ml/小时的流速将大约190ml上清液加于用缓冲液A平衡的5×5cm DEAE Sepharose FF/S-100 Sepharose(20/80湿体积，Pharmacia)柱中。用S-100 Sepharose凝胶过滤材料以1∶4的比例稀释DEAE Sepharose离子交换树脂，以避免结合后太高的细胞色素P450酶浓度，这可导致不可逆的聚合。然后用150ml缓冲液A洗柱。P450_OX较弱地结合于柱上，基本上回收于含黄色素的流过和洗涤级分中。根据其在420nm的吸光度、CO结合光谱和在重建实验中(见实施例4)代谢肟的能力鉴定含P450_OX的级分，并合并(约200ml)。它们可用于进一步纯化或将其冻存。

在恒定搅拌中通过逐滴加入适量的甘油和Triton X-114的混合物，将合并的P450_OX级分调节至含30％(v/v)甘油和6％Triton X-114。继续搅拌20分钟，随后于25℃以24500×g离心25分钟，不开刹车(温度诱导的Triton X-114相分配)。形成两个相，黄色的上相和澄清的下相。合并含有细胞色素P450_OX活性主要部分的下相，用缓冲液C稀释2.5倍至约350ml，以70ml/小时的流速加于用缓冲液C平衡的1.9×5cm Cibacronblue 3GA-琼脂糖柱中。用50ml缓冲液C洗柱，用缓冲液C中的约60ml0-1.5M KCl线性梯度洗脱保留的细胞色素P450_OX。合并经SDS-PAGE显示在50-60kDa区存在单一的多肽带的级分，在氮下对1升8.9％甘油、10mM KH₂PO₄/K₂HPO₄(pH7.9)、5mM EDTA、2mM DTT(透析缓冲液)透析24小时，以降低盐和去污剂的含量。酶制剂在液氮中冷冻，贮存于-80℃。实施例4：从高粱微粒体中分离获得的细胞色素P450_OX的表征4.1.分子量和氨基酸序列资料

经SDS-PAGE测定P450_OX的分子量为55kD。从8-25％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上切下对应于从Cibacron blue 3GA-琼脂糖柱分离的P450_OX的蛋白带，电洗脱。根据生产厂商(Boehringer Mannheim)指示以约1∶100的蛋白酶与蛋白质的重量比用内切蛋白酶Glu-C(蛋白酶V8测序级，18小时，23℃)消化电洗脱的蛋白质。电洗脱的蛋白质和消化的蛋白质样品进行SDS-PAGE，将蛋白质和片段转移至ProBlott膜(AppliedBiosystems)上。切下膜的考马斯染色区，在装备有联机120A型乙内酰苯硫脲氨基酸分析仪的Applied Biosystems 470A型序列分析仪上进行N端氨基酸序列测定。

N端氨基酸序列测定产生两个序列，由于相对丰度的不同它们可被独立读出。数据库搜索(BLAST)显示，序列-GLVKEGVDMEEGTL与大麦(Hordeum vulgare)液泡ATP酶B亚基的N端序列MGLVKEGADMEEGTL(保藏号L11862)仅单一位点不同。大麦B亚基具有54kDa(20)的预测分子量。Western印迹法进一步证实了液泡ATP酶B亚基作为污染物在P450_OX制剂中的存在，当使用Heven Sze博士提供的燕麦根中产生的针对液泡ATP酶B亚基的单克隆抗体时，在55kDa处显示单一条带。通过在抗体包被的微量滴定孔中固定，能从P450_OX制剂中去除B亚基。该方法允许P450_OXN端氨基酸序列的明确测定，该序列为-ATTATPQLLGGSVPEQ，另外提供了一种内部P450_OX肽片段的序列，MDRLVADLDRAAA。去除残余量的液泡ATP酶B亚基的尝试导致一氧化碳差光谱的形成，其中代表P450_OX的无活性变性P420形式的420nm成分大大增多，并且失去或显著降低了在获得的级分中重建P450_OX活性的能力。这反映了P450_OX内在的不稳定性。预期液泡ATP酶B亚基不具有与P450_OX相关的任何催化特性。因此，B亚基作为污染物的存在在以下报告的P450_OX代谢研究中可以接受。

N端序列：

--ATTATPQLLGGSVPEQ--(SEQ ID NO：3)

内部序列：

--MDRLVADLDRAAA--(SEQ ID NO：4)4.2.NADPH-P450氧化还原酶的分离

NADPH-P450氧化还原酶与DEAE-Sepharose FF/S-100-Sepharose柱结合，用含0.5M KCl的增大缓冲液A洗脱。随后如以前所述(Halkier和Moller，植物生理学96：10-17，1990)在2’，5’-ADP-Sepharose 4B(Pharmacia)柱上将还原酶纯化为同质，并浓缩为约15单位/ml。4.3.可溶性UDPG葡糖基转移酶的制备

通过对微粒体制备中获得的离心上清液的硫酸铵分部分离，部分纯化葡糖基转移酶。葡糖基转移酶级分在40％-60％(NH₄)₂SO₄间沉淀，将其溶解于5ml 50mM N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(pH7.9)、2mM DTT中，并对2升相同缓冲液透析过夜。4.4.细胞色素P450_OX活性的重建

微粒体细胞色素P450酶活性重建的实现方法是，将细胞色素P450酶和相应的NADPH细胞色素P450氧化还原酶插入脂微胶粒中。能使用脂的混合物，但对于细胞色素P450_OX，双月桂基磷脂酰胆碱(DLPC)提供最佳酶活性。正确形成的细胞色素P450_OX与NADPH细胞色素P450氧化还原酶的复合体的数量是限速因素。使用过量的氧化还原酶和浓缩的酶溶液以确保足够量的活性复合体。

使用下列组分获得功能上重建的酶：

细胞色素P450OX：	20μg/ml于透析缓冲液中
		从双色高粱中纯化的NADPH细胞色素P450氧化还原酶：	100μg/ml于50mM磷酸钾缓冲液(pH7.9)中
脂：	在50mM N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(pH7.9)中超声处理的10mg/ml双月桂基磷脂酰胆碱
		NADPH：	25mg/ml于H2O中
14C-肟，使用重建的P450TYR从[U-14C]-L-酪氨酸中酶法制备，并经HPLC纯化	0.01μCi/μl，394mCi/mmol

在eppendorf管中将5μl脂悬液与5μl NADPH细胞色素P450氧化还原酶(0.075单位)、10μl细胞色素P450_OX(约0.4pmol)溶液和0.5μl¹⁴C-肟(0.014μCi/μl，394mCi/mmol)混合。用50mM N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(pH7.9)将终体积调节为30μl，通过加入1μl NADPH溶液起始酶反应。反应混合物中不加入NADPH细胞色素P450氧化还原酶或NADPH制备对照样品。将管在恒定和轻微振荡下于30℃温育1小时。温育后将反应混合物加至二氧化硅包被的TLC片(硅胶60F₂₅₄，Merck)上，用乙酸乙酯/甲苯(1∶5v/v)混合物作为流动相展开。将该片置于贮存磷筛上过夜，用Molecular Dynamics的STORM840磷成像仪使终产物对羟基苯乙腈和对羟基苯甲醛显色。

当重建入脂微胶粒中时，细胞色素P450_OX催化对羟基苯乙醛肟向对羟基杏仁腈的转化，后者分解为对羟基苯甲醛和HCN。这证明细胞色素P450_OX是一种多功能的蛋白质，它催化对羟基苯乙醛肟向对羟基苯乙腈的转化，以及对羟基苯乙腈向对羟基杏仁腈的转化。P450_OX的活性严格依赖于NADPH-P450氧化还原酶和NADPH的存在。连二亚硫酸钠(10mM)不支持对羟基苯乙醛肟的代谢。重建之前省略酶的透析导致与对羟基苯甲醛相比对羟基苯乙腈积累的相对增加。4.5.蜀黍苷从其亲代氨基酸酪氨酸合成的完整途径的体外重建

完全的反应混合物包含：3μl分离的重组P450_TYR(6pmol，在大肠杆菌中异源表达并分离，如Halkier等人，生物化学与生物物理学档案322：369-377，1995)、10μl分离并透析的P450_OX(约0.4pmol)、5μlNADPH-P450氧化还原酶(0.075U)、1μl部分纯化的来源于高粱的UDPG葡糖基转移酶、5μl DLPC(10mg/ml于50mM Kp_i(pH7)中)、0.25μl[U-¹⁴C]-酪氨酸(0.05μCi/mmol，433mCi/mmol，Amersham)、3μl UDPG(33mg/ml于50mM Kp_i(pH7)中)和3μl栗精素(castanospermin)(2mM于50mMKp_i(pH7)中)。经重复悬浮混合各组分，如果必要，用50mM Kp_i(pH7)将终体积调节为30μl。以1μl NADPH(25mg/ml)起始酶反应。

经P450_OX的重建用对羟基苯乙醛肟也合成蜀黍苷(反应混合物中不含P450_TYR和酪氨酸，其它任何组分不变)。这些试验包含0.5μl[U-¹⁴C]-对羟基苯乙醛肟(0.014μCi/μl，394mCi/mmol)或3μl未标记的对羟基苯乙醛肟(20mM)作为P450_OX的底物。在后一种情况中，放射性标记是1μl[U-¹⁴C]-UDPG(0.025μCi/μl，287mCi/mmol，Amersham)。所有反应混合物都制备双份。于30℃温育1小时后，将每组反应混合物加于TLC片上。如实施例4.5使用乙酸乙酯/甲苯溶剂分析第一组反应混合物。第二组反应混合物用由乙酸乙酯/丙酮/二氯甲烷/甲醇/水(20/15/6/5/4，v/v/v/v/v)组成的溶剂系统分析，以实现亲水产物蜀黍苷从酪氨酸和疏水中间物中的分离。放射性标记的底物和产物用STORM 840-磷成像仪显色。

在重建实验中，以放射性标记的酪氨酸为底物，分离的P450_TYR与P450_OX的结合使用导致对羟基苯乙腈和对羟基苯甲醛的产生。这证明P450_TYR和P450_OX能在体外共同作用。P450_TYR产生的对羟苯基乙醛肟于是被P450_OX有效地用作底物。在NADPH-P450氧化还原酶缺乏或NADPH缺乏下，观察不到活性。

使用对羟基苯乙醛肟作为底物，蜀黍苷体外产生的实现方法是，在NADPH和UDPG的存在下，将P450_OX与部分纯化的可溶性UDPG葡糖基转移酶一起重建。无法获得编码UDPG葡糖基转移酶的来源于高粱的cDNA克隆，该酶特异性利用对羟基杏仁腈作为底物。因此，在本研究中，用来自高粱的可溶性UDPG葡糖基转移酶粗提取物使对羟基杏仁腈葡糖基化，并证明完整蜀黍苷生物合成途径的体外重建。加入的放射性标记的对羟基苯乙醛肟被完全代谢。加入栗精素抑制UDPG葡糖基转移酶制剂中存在的葡糖苷酶活性。除了以上用于疏水化合物分离的TLC系统外，引入了另外一种TLC系统用于亲水化合物如蜀黍苷的分离。与真正的蜀黍苷共迁移的放射性标记化合物的形成证明，该重建试验中形成的对羟基杏仁腈部分转化为蜀黍苷。当用放射性标记的UDPG代替放射性标记的对羟基苯乙醛肟重复实验时，在不含栗精素时放射性标记化合物的分解以及共迁移的放射性标记产物的形成，进一步证实了该放射性标记化合物为蜀黍苷。放射性标记的UDPG非特异地标记一系列相对亲水的化合物。由于对羟基杏仁腈的不稳定性，它向蜀黍苷的转化在实验上以对羟基苯甲醛的消失来检测。当用放射性标记的对羟苯基乙醛肟作为底物时，除蜀黍苷之外产生许多未鉴定的、疏水的、放射性标记的化合物。这些化合物的形成在缺乏UDPG时发生，但需要可溶性提取物的存在，这表明UDPG葡糖基转移酶提取物包含其它的酶活性。对羟基杏仁腈酚基的葡糖基化导致吡喃葡糖基氧杏仁腈的形成。未观察到与对吡喃葡糖基氧杏仁腈的可靠标准共迁移的放射性标记产物。栗精素有效地抑制UDPG葡糖基转移酶提取物中存在的葡糖苷酶活性。

体外重建后，P450_TYR(CYP79)的转换数为230分钟^-1(Sibbesen等人，生物化学杂志270：3506-3511，1995)。P450_OX向其变性P420形式的部分转化妨碍了其转换数的测定。使用微粒体系统，从酪氨酸、对羟基苯乙醛肟和对羟基苯乙腈产生对羟基杏仁腈的Km和Vmax值分别为0.03、0.05和0.10mM，以及145、400和50nmole/mg蛋白质/小时(Moller等人，生物化学杂志254：8575-8583，1979)。

在体外重建了起始于亲代氨基酸酪氨酸的完整蜀黍苷生物合成途径，方法是在DLPC微胶粒中将P450_TYR、P450_OX、NADPH-P450氧化还原酶与UDPG葡糖基转移酶、酪氨酸、NADPH、UDPG和栗精素组合。P450_TYR使酪氨酸转化为对羟基苯乙醛肟，其被P450_OX进一步转化为对羟基苯乙腈和对羟基苯甲醛。一些对羟基苯乙腈积累，而形成的所有对羟基杏仁腈都转化为蜀黍苷和一些未鉴定的化合物。在这组实验中，P450_TYR和P450_OX的化学计量比约为15。因此在该重建试验中检测到对羟基苯乙醛肟的积累并不意外。观察到的对羟基苯乙腈的积累是不希望的，因为以前用高粱微粒体的实验显示，对羟基苯乙腈难以积累和捕获。分离的P450_OX的部分变性或失活可以解释在用分离的P450_OX进行的重建实验中为什么对羟基苯乙腈积累。4.6.底物结合

P450_OX是一种多功能的酶，可将对羟基苯乙醛肟转化为对羟基杏仁腈，对羟基苯乙腈是其中一种中间物，P450_OX的鉴定促使我们研究P450_OX的底物结合能力。用对羟基苯乙醛肟获得一种反向I型光谱，其吸光度最小值在381nm，吸光度最大值在418nm，这提示底物加入后从高自旋态到低自旋态的转变。温育后振幅在大小上增加，约45分钟后达到稳定的最大值。对羟基苯乙腈加入后未获得底物结合光谱。

发现与自高粱分离的其它P450酶相比P450_OX更不稳定。分离的P450_OX一经与对羟基苯乙醛肟温育后产生反向I型底物结合光谱。对应于从一个自旋态向另一个自旋态完全跃迁的消光系数E_420-390为130mM^{- 1}cm^-1。在获得的底物结合光谱中，最大振幅约两倍于理论计算值，甚至是假定从一个高自旋态到一个低自旋态完全跃迁时的计算值。这种差异表明，在一氧化碳结合光谱中从450nm峰定量时，低估了P450_OX的浓度。或者，P450_OX的P420形式能结合肟，因而对形成的底物结合光谱的大小有影响。后一种可能性可解释为什么只在延长的温育后获得最大振幅。

以前已报道了使用肝微粒体从醛肟向腈的P450介导的脱水化(DeMaster等人，有机化学杂志5074-5075，1992)。肝微粒体系统与P450_OX的主要不同在于，前者需要严格的厌氧条件，而后者需氧进行，催化随后的C-羟化反应，并代谢(E)-及(Z)-异构体。在厌氧条件下，用肝微粒体获得弱I型光谱。NADPH或连二亚硫酸盐加入后，在442-444nm处形成明显的Soret峰。推断其代表Fe(II)态的P450的主要活性种。厌氧条件下P450_OX的光谱研究未揭示442nm吸收复合体的形成，但催化活性需要NADPH的存在，这表明P450_OX也需要为Fe(II)态，以介导脱水反应。实施例5：A型细胞色素P450探针的产生

使用高度简并的含肌苷(I)的引物对从单向质粒cDNA文库(Invitrogen)分离的质粒DNA进行PCR，该文库从1-2cm高的双色高粱黄化幼苗中制备，其引物优先选择A型细胞色素P450(Nelson和Durst，药物代谢与药物相互作用12：189-206(1995))。引物1(有义链)具有序列5’-GCGGAATTCTTYIIICCNGARMGNTT-3’(SEQ ID NO：5)，覆盖共有氨基酸序列FXPERF(SEQ ID NO：6)，其中X是任意氨基酸。引物2(反义链)具有序列5’-GCGGATCCIIIRCAIIINCKNCKNCC-3’(SEQ ID NO：7)，覆盖共有氨基酸序列GRRXCXG(SEQ ID NO：8)。引物1和引物2尾部分别加上EcoRI和BamHI位点，以确保只有由这两条引物产生的PCR产物才被克隆至EcoRI/BamHI消化的pBluescriptII SK(Stratagene)中。PCR进行连续两轮。第1轮使用引物1和标准T7引物5’-AATACGACTCACTATAG-3’(SEQ ID NO：9)，富集编码A型细胞色素P450的cDNA库。第2轮包括引物1和引物2，主要产生对A型细胞色素P450特异的一条约100bp的带。第1轮的PCR反应在100μl的总体积中进行，包含5％DMSO、200μM dNTPs、200pmol引物1、100pmol标准T7引物、2.5单位PCR缓冲液中的Taq DNA聚合酶和1μl100倍稀释的自cDNA文库获得的质粒DNA。第2轮的PCR反应在100μl的总体积中进行，包括5％DMSO、200μM dNTPs、200pmol引物1和引物2、2.5单位于PCR缓冲液中的Taq DNA聚合酶和1μl从PCR第1轮获得的产物。对于两轮PCR，95℃5分钟的一个循环后是95℃30秒、50℃1分钟和72℃ 30秒的35个循环。从2％琼脂糖凝胶中切下PCR第2轮的约100bp的产物，在克隆至pBluescript之前再扩增。在19个测序的克隆中，有10个在氨基酸水平上与桂皮酸羟化酶(CYP74)具有很高的序列同一性，因此未进一步研究。剩余9个序列的序列比较将它们划分为8个和1个序列的两组，分别被表示为“12”和“7”。序列“12”基因特异引物位于引物1和引物2之间：5’-GCGGATCCGACTACTACGGCTCGC-3’(SEQ ID NO：10)和引物5’-GCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3’(SEQ ID NO：11)，两条引物尾部都含BamHI，用于从PCR第1轮中扩增约500bp的“12”基因特异片段，并克隆至pBluescript中。同样“7”基因特异片段的获得是使用“7”基因特异引物5’-GCGGATCCGACATCAAGGGCAGCG-3’(SEQ ID NO：12)和引物5’-GCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3’(SEQ ID NO：11)。根据厂商说明书用标准T7和T3引物通过PCR扩增，用洋地黄毒苷-11-dUTP(Boehringer Mannheim)标记插入片段，并用它来筛查cDNA文库。实施例6：文库筛查和DNA序列测定

过滤后使用DIG系统(Boehringer Mannheim)进行杂交。用尼龙膜(Boehringer Mannheim)制备集落重复样章，在5×SSC、0.1％N-月桂基肌氨酸、0.02％SDS、1％封闭剂(Boehringer Mannheim)中68℃杂交过夜。检测前将滤膜于65℃在0.1×SSC、0.1％SDS中洗两次各15分钟。序列分析证明，对于“12”和“7”两者都获得全长的克隆。使用热测序酶荧光标记的引物循环测序试剂盒(7-deaza dGTP)(Amersham)进行序列测定，并在ALF-Express(Pharmacia)上分析。使用GCG Wisconsin序列分析程序包中的程序进行序列计算机分析。从“12”的核苷酸序列测定中获得的P450_OX的全长cDNA序列和编码区的衍生氨基酸序列分别在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中列出。实施例7：在大肠杆菌中的表达

表达载体pSP19g10L(Barnes，酶学方法(Methods in Enzymology)272：3-14，1996)从Henry Barnes博士处(合成遗传学/免疫复合物公司，San Diego，CA)获得。该质粒包含lacZ启动子，lacZ启动子与来源于T7噬菌体g10L的基因10的短前导序列相融合，已证明它对于多种异源蛋白质的表达是一种很好的前导序列(Olin等人，1988)。通过使用Pwo-聚合酶(Boehringer Mannheim)经PCR修饰“7”和“12”，以在起始密码子处引入一个NdeI位点，将终止密码子改变为赭石终止密码子，其后紧接着一个HindIII位点。为了制备“7”的表达克隆，使用引物3(有义链)5’-CGCGGATCCATATGGACGCATCATTACTCCTCTCCGTCGCGCTC-3’(SEQ ID NO：13)和引物4(反义链)5’-CGCAAGCTTATTACATCTCAACGGGGACCCT-3’(SEQ ID NO：14)。引物3在密码子3、4和5中引入沉默突变，以降低翻译起始位点和NdeI位点上游紧接的BamHI位点周围的G/C含量。用BamHI和HindIII消化所得的PCR片段，连接至用BamHI和HindIII消化的pBluescript中，通过序列测定排除PCR错误。同样将“12”引入pBluescript中，使用引物5(有义链)5’-CGCGGATCCATATGGCAACAACAGCAACCCCGCAGCTCCTC-3’(SEQ ID NO：15)和引物6(反义链)5’-CGCAAGCTTATTATGCTGCGCGGCGGTTCTTGTATTTGG-3’(SEQ ID NO：16)。引物5在密码子2、3、4和5中引入沉默突变，引物6在最后2个密码子中引入沉默突变，以降低G/C含量。使用NdeI和HindIII切下插入片段，连接至用NdeI和HindIII消化的pSP19g10L中。将表达质粒转化至大肠杆菌JM109细胞中。单菌落于37℃在含100mg氨苄青霉素/ml的LB培养基中生长过夜，用5ml过夜培养物接种500ml含50mg/ml氨苄青霉素、1mM硫胺素、1mM异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷和1mMδ-氨基乙酰丙酸的TB培养基。细胞于28℃、125转/分生长48小时。用“7”、“12”的表达构建体转化1ml大肠杆菌，经离心(2000g，10分钟)沉淀pSP19g10L，在50mM N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸pH7.9中洗涤并浓缩10倍，与14nCi具有394mCi/mmol比活性的[U-¹⁴C]对羟基苯乙醛肟在30℃温育30分钟。用乙酸乙酯提取温育混合物，加于TLC板(硅胶60F₂₅₄，Merck)中，用乙酸乙酯/甲苯(1∶5v/v)混合物作为流动相展开，用Molecular Dynamics的STORM840显色。以表达“12”的构建体转化的大肠杆菌能将对羟基苯乙醛肟转化为对羟基苯乙腈。

表达P450_OX的大肠杆菌，其溶解的球芽(spheroblast)的CO差光谱包括一个417nm处的主要峰和一个457nm处的次要峰。通常，具有一个在420nm周围的吸光度峰的CO光谱表示一种非功能性构象的细胞色素P450(Imai等人，欧洲生物化学杂志1：419-426，1964)。417nm处主要峰的存在提示，表达的细胞色素P450大多数以非功能性构象存在。吸光度峰从450nm向457nm的明显转移可能是因为大量非构象态的细胞色素P450的存在。根据457nm处的峰，估计产量为每65小时每升大肠杆菌培养物50nmol P450_OX。

如Halkier等人，生物化学与生物物理学档案322：369-377，1995所述，从表达“12”的大肠杆菌中分离5μl膜，用100μl总体积的30mM N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(pH7.9)中的0.225单位NADPH-细胞色素P450还原酶、50μg NADPH、42nCi对羟基苯乙醛肟和100μg双月桂基磷脂酰胆碱将其重建。在30℃温育30分钟后，将反应混合物加于TLC板中，并如上所述分析。来源于表达“12”的大肠杆菌的膜的重建导致对羟基苯甲醛的积累，对羟基苯甲醛是对羟基杏仁腈的稳定的分解产物，对羟基杏仁腈是含氰苷蜀黍苷生物合成中最后的中间物。这显示“12”是催化对羟基苯乙醛肟向对羟基杏仁腈转化的细胞色素P450。其cDNA被称为P450_OX。包含所述P450_OX cDNA的一株克隆已于1997年1月10日保藏于德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，保藏号为DSM11367。

当对P450_OX转化的大肠杆菌细胞施用放射性标记的对羟基苯乙醛肟时，对羟基苯乙腈在表达P450_OX的大肠杆菌细胞中积累。不包含内源细胞色素P450或NADPH-细胞色素P450还原酶的大肠杆菌显示支持异源表达的细胞色素P450的催化活性。两种可溶性大肠杆菌黄素蛋白，黄素氧还蛋白和NADPH-黄素氧还蛋白还原酶，作为重组细胞色素P450的还原等效物。用高粱NADPH-细胞色素P450还原酶对分离的大肠杆菌膜或纯化的重组酶的重建导致对羟基苯乙醛肟向对羟基杏仁腈的转化，而表达P450_OX的大肠杆菌细胞将对羟基苯乙醛肟仅代谢为对羟基苯乙腈。大肠杆菌不能支持对羟基苯乙腈向对羟基杏仁腈的转化，是大肠杆菌黄素氧还蛋白/NADPH-黄素氧还蛋白还原酶系统不能支持微粒体细胞色素P450反应催化活性的第一个例子。用表达P450_OX的大肠杆菌细胞的膜和可溶性级分的初步重建实验显示，可溶性黄素氧还蛋白/NADPH-黄素氧还蛋白还原酶系统仅在对羟基苯乙醛肟向对羟基苯乙腈的转化中支持P450_OX，可溶性级分中不存在妨碍随后的羟化反应的抑制因素。大肠杆菌不能支持全部的P450_OX活性可能反映出P450_OX的非典型的催化反应性。在用P450_OX或表达载体转化的大肠杆菌细胞中，积累一种迁移率略低于对羟基苯乙醛肟的化合物。这显示大肠杆菌能不依赖于P450_OX的存在而代谢对羟基苯乙醛肟。实施例8：重组P450_OX(CYP71E1)的纯化

如以前所述(Halkier等人，生物化学与生物物理学档案322：369-377，1995)对表达P450_OX的2l大肠杆菌的球芽进行采用1％ Tritoh X-114的温度诱导的相分配。将含有P450_OX的上相用100mM KPi pH7.0、0.05％还原的Triton X-100、1mM DTT、0.5mM PMSF稀释100倍，用乙酸调节pH至7.0，加于用缓冲液D(10mM KPi pH7.0、0.2％ TritonX-114、0.05％还原的Triton X-100、10％甘油、1mM DTT、0.5％PMSF)平衡过的快流动CM-Sepharose柱(Pharmacia)上。以缓冲液D洗柱，用缓冲液D中的0-1M KCl线性梯度(350ml)洗脱P450_OX。合并含有P450_OX的级分(43ml)用于重建实验，电洗脱的重组P450_OX用于在鸡中产生抗体。

如实施例4 4.2节中对于植物酶的纯化所述，在DLPC中用NADPH-细胞色素P450还原酶重建的纯化重组P450_OX，在NADPH存在下催化对羟基苯乙醛肟向对羟基杏仁腈的转化。实施例9：蜀黍苷在转基因芥(Arabidopsis)和烟草中的表达9.1载体质粒的构建

产生三种用于根癌农杆菌介导的转化的双元载体，即pPZP111.79、pPZP221.71E1和pPZP111.79.71E1。

对于pPZP111.79的构建，首先用EcoRI切下P450_TYR的cDNA克隆(WO 95/16041；Koch等人，生物化学与生物物理学档案323：177-186，1995)，将其引入pRT101的EcoRI位点(Kopfer等人，核酸研究15：5890，1987)，以将该cDNA有功能地与35S启动子和CaMV聚腺苷酸化信号连接在一起，产生质粒pRT101.79。在P450_TYR cDNA引入之前去除一部分pRT101多接头，方法是用SacI和XbaI消化，随后再连接由Klenow处理获得的平末端，于是仅留下EcoRI和XhoI位点是可用的。用SphI从pRT101.79上切下包括35S启动子和CaMV聚腺苷酸化信号的P450_TYR。为产生质粒pPZP111.79，用Klenow聚合酶将末端处理成平端，将获得的片段连接至EcoRI酶切的质粒pPZP111上(Hajdukiewicz等人，植物分子生物学25：989-994，1994)，pPZP111的末端也用Klenow聚合酶处理成平端，并去磷酸化。

对于pPZP221.71E1的构建，首先用KpnI和XbaI切下P450_OX的cDNA克隆，将其连接至pRT101的KpnI和XbaI位点，产生pRT101.71E1。随后用HindIII从pRT101.71E1上切下包括35S启动子和CaMV聚腺苷酸化信号的P450_OX，将其连接至pPZP221(Hajdukiewicz等人，植物分子生物学25：989-994，1994)的HindIII位点，从而产生pPZP221.71E1。

对于pPZP111.79.71E1的构建，用HindIII从pPZP221.71E1上切下包括35S启动子和CaMV聚腺苷酸化信号的P450_OX的cDNA克隆，用Klenow聚合酶处理成平端，连接至pPZP111.79的SmaI位点。9.2拟南芥(Arabidopsis thaliana)的转化

如Wenjun和Forde，核酸研究17：8385，1989所述，通过电穿孔将双元载体pPZP111、pPZP221、pPZP111.79、pPZP221.71E1和pPZP111.79.71E1引入根癌农杆菌C58C1/pGV3850株。基本如Bechtold等人，分子生物学和遗传学316：1194-1199，1993的方法所述，经真空渗透转化拟南芥哥伦比亚(Colombia)生态型。在MS平板上筛选转化体，对于pPZP111载体系列平板含有50μg/ml卡那霉素，对于pPZP221载体系列含200μg/ml硫酸庆大霉素。萌发4-6周后将卡那霉素或庆大霉素抗性的植物转移至土壤中。9.3烟草(Nicotiana tabacum cv Xhanti)的转化

Nicotiana tabacum cv Xhanti的转化基本根据Svab等人(《植物分子生物学方法》，Cold Spring Harbor，55-60页，1995)的叶盘法，使用以pPZP111.79、pPZP221.71E1或pPZP111.79.71E1转化的根癌农杆菌C58C1/pGV3850。用100μg/ml卡那霉素筛选pPZP111.79载体的转化体，用100μg/ml硫酸庆大霉素筛选pPZP221.71E1载体的转化体，用50μg/mlG418筛选pPZP111.79.71E1载体的转化体。生根后将烟草植物转移至土壤中并在温室中生长。9.4蜀黍苷的测定

除了在加入0.1mgII型β-d-葡糖苷酶(Sigma)前将5-10mg叶组织冻融三次外，使用以前Halkier等人(植物生理学90：1552-1559，1989)描述的分光光度氰化物测定法定量蜀黍苷含量。9.5转基因拟南芥的分析

对离脱的拟南芥的叶饲喂2μl(U-¹⁴C)-酪氨酸(0.05μCi/μl，443mCi/mmol，Amersham)，置于封闭的eppendorf管内在100μl H₂O中过夜。用沸腾的90％甲醇提取代谢物5分钟，浓缩提取物，加于TLC片(硅胶60F₂₅₄)上。根据其疏水性/亲水性在三种不同的溶剂系统中分离代谢物。溶剂系统乙酸乙酯/丙酮/二氯甲烷/甲醇/水(20/15/6/5/4，v/v/v/v/v)优先分离不同的含氰苷。溶剂系统异丙醇/乙酸乙酯/水(7/1/2)分离不同的芥子油苷。溶剂系统甲苯/乙酸乙酯(5/1)分离疏水性中间物。放射性标记的底物和产物用STORM 840磷成像仪(MolecularDynamics，美国)显色。

使用根癌农杆菌C58C1/pGV3850/pPZP111.79.71E1以P450_TYR和P450_OX转化拟南芥，对其叶的甲醇提取物经TLC分析，显示与含氰苷蜀黍苷共迁移的新化合物的存在。对离脱的叶饲喂放射性标记的酪氨酸显示放射性标记物存在于与蜀黍苷共迁移的带中。通过比色氰化物测定法(Lambert等人，1975，分析化学(Analytic Chemistry)47，917-919)对转化植物的完整叶组织的分析显示，T1转化体包含1-6nmol氰化物/mg(鲜重)。与此相比，使用根癌农杆菌C58C1/pGV3850/pPZP111仅以nptII转化的对照植物显示1.2±0.35nmol氰化物/mg(鲜重)的氰化物含量。未见报道拟南芥的野生型植物含有含氰苷，对照植物中检测到的氰化物的表观水平最可能反映硫氰酸的存在。硫氰酸是芥子油苷的分解产物，已知其在比色氰化物测定中引起假反应(Epstein，1974，分析化学19：272-274)。

以拟南芥为例，作为P450_TYR和P450_OX两者引入的结果，观察到大量含氰苷蜀黍苷的产生，这证明存在适宜的UDP-葡糖基转移酶，该酶使形成的对羟基杏仁腈在正确位置葡糖基化。由于糖基转移酶的立体特异性还不清楚，所以存在这种可能性，即产生的含氰苷实际上是蜀黍苷的差向异构体(镜象异构体)taxiphyllin。

当通过根癌农杆菌C58C1/pGV3850/pPZP111.79将P450_TYR引入拟南芥时，一种化合物大量积累，该化合物与酪氨酸衍生的芥子油苷对羟基苯芥子油苷共迁移。这证明P450_TYR的引入导致由酪氨酸产生对羟基苯乙醛肟。然后芥子油苷途径中的酶将酪氨酸衍生的肟进一步代谢为对羟基苯芥子油苷。这有力地表明，芥子油苷途径中肟下游的酶对于侧链结构具有低底物特异性，芥子油苷曲线通常由该途径中第一种细胞色素P450的底物特异性所确定。

P450_OX的底物特异性不象P450_TYR那样窄。P450_OX能代谢其它氨基酸衍生的肟，一个例子是苯丙氨酸衍生的肟苯乙醛肟，而P450_TYR仅能代谢酪氨酸。将P450_OX引入产芥子油苷的植物，能因而预计，当在芥子油苷生物合成途径中由氨基酸衍生的肟产生时，含氰苷积累。

因为P450_TYR和P450_OX与芥子油苷生物合成途径中的酶和前体相互作用，所以预期芥子油苷分布图也被改变。9.6转基因Nicotiana tabacum cv Xhanti的分析

从用pPZP111.79转化、功能性表达CYP79的烟草植物中分离的微粒体催化酪氨酸形成对羟基苯乙醛肟。当使用溶剂系统异丙醇/乙酸乙酯/水(7/1/2)经TLC分析时，与野生型烟草植物相比，表达CYP79并用放射性标记的酪氨酸饲养的烟草离脱叶，其甲醇提取物包含三条另外的标记带。这三条另外的带在TLC上与在用放射性标记的对羟基苯乙醛肟饲养的野生型烟草植物中检测到的标记带共迁移。在溶剂系统甲苯/乙酸乙酯(5/1)中分析时，证实其中一条带为对羟基苯乙醛肟，其证据是与非标记的标准共迁移。另外两条带的同一性还不清楚，但从其在两种溶剂系统中的迁移率判断，其疏水性比对羟基基乙醛肟更低，它们最可能是对羟基苯乙醛肟的糖基化衍生物。CYP79植物的分析证实，CYP79能在烟草中功能性表达，并且产生一些游离的对羟基苯乙醛肟，但是产生的大多数对羟基苯乙醛肟被植物进一步代谢。

表达P450_TYR和P450_OX两者的植物能通过将表达P450_TYR的植物与表达P450_OX的植物杂交而获得。另外，表达P450_TYR或P450_OX的植物能用根癌农杆菌C58C1/pGV3850/pPZP221.71E1或根癌农杆菌C58C1/pGV3850/pPZP111.79再转化，这利用这样一个事实，即两种细胞色素P450构建体连接于两种不同的非排斥的抗性标记，nptII和aacCI。实施例10：蜀黍苷在转基因玉米中的表达10.1载体质粒的构建

产生下列两种载体pCIB9842和pCIB9833，用于以P450_TYR和P450_OX对玉米的biolistic转化。

pCIB9842：如WO 95/16041所述，将编码P450_TYR的cDNA克隆克隆至pBluescript II SK的EcoRI位点，用其通过PCR在起始ATG密码子处产生一个BamHI位点，在终止密码子处产生一个BglII位点。将含有P450_TYR基因的BamHI-BglII片段克隆至BamHI和BglII酶切的pCIB9805中，pCIB9805是基于pUC19的植物表达载体，在HindIII位点上游的256碱基对和BglII位点下游的778bp构建有AflII/NotI/AscI位点，并包含EP-A-452269中公开的金属硫素样启动子和35S终止子。

pCIB9833：克隆至pcDNAII(Invitrogen)NotI-BstXI位点的实施例的P450_OX cDNA克隆，被用来在起始ATG密码子处产生一个BamHI位点，在终止密码子处产生一个BglII位点。将含有P450_OX基因的BamHI-BglII片段克隆至也用BamHI和BglII酶切的pCIB9805。10.2玉米的转化方法

从1.5-2.5mm长的未成熟胚芽开始Lancaster型近交的I型生胚愈伤组织培养(Green等人，1983；Wan等人，1994)。授粉约14天后，从表面无菌的、温室生长的穗上无菌切下胚芽，置于含2％蔗糖和5mg/lchloramben的Duncan愈伤组织起始培养基中，在暗处培养。约14天后从外植体中去除胚发生反应，置于含2％蔗糖和0.5mg/l 2，4-d的Duncan维持培养基中。每周传代培养至新鲜的维持培养基中，4-8周后建立优质、致密的胚发生培养物。选择活跃生长的胚发生愈伤组织片作为基因送递的靶组织。基因送递前约4小时将愈伤组织片置于靶平板上，该平板含有含12％蔗糖的维持培养基。将愈伤组织片距靶平板中心8和10mm环形排列。如DuPont Biolistics手册中所述将质粒DNA沉淀于金微载体上。在每个6脉冲(shot)微载体制备中使用2-3μg每种质粒。用PDS-1000HeBiolistics装置将基因送递至靶组织细胞。Biolistics装置上的设置如下：破裂片与巨载体之间8mm，巨载体与终止筛之间10mm，终止筛与靶之间7cm。每个靶平板用650psi的破裂片射击两次。一个200×200的不锈钢网(McMaster-Carr，New Brunswick，NJ)置于终止筛与靶组织之间。基因送递7天后，将靶组织片从高渗培养基转移至含100-120mg/l草铵膦(Basta)的选择培养基中。从选择培养基中去除所有氨基酸。在高水平选择培养基上5-8周后，将任何生长的集落传代培养至含20mg/l Basta的培养基中。每2周传代培养生胚的愈伤组织，共4-8周，然后转移至改良的MS培养基中置于光下，该培养基含有3％蔗糖、0.25mg/l嘧啶醇、0.5mg/l细胞分裂素，并且不含选择剂。2周后去除嘧啶醇和细胞分裂素。将有根或无根的再生苗转移至Magenta盒中，该盒中含有含3％蔗糖的MS培养基，最后回收有根的小植物，并转移至温室的土壤中。实施例11：用PCR对含芥子油苷种中P450_TYR同源物的鉴定

根据芥(Arabidopsis)P450_TYR同源物EST(保藏号T42902)与芥子(Sinapis)P450_TYR同源物的计算机序列对比，设计两条简并引物寡核苷酸，它们能从含芥子油苷物种的基因组DNA中扩增P450_TYR同源物的PCR片段。有义链引物(5’-GCGGAATTCAARCCIGARMGICAYYT-3’)覆盖保守氨基酸序列KPERHL(SEQ ID NO：18)，包含一个EcoRI克隆位点。反义链引物2(5’-GCGGATCCRCAICCICKYTTICCNGT-3’)覆盖保守氨基酸序列TGKRGC(SEQ ID NO：19)，包含一个BamHI克隆位点。对用Amersham的Nucleon Phytopure植物DNA提取试剂盒制备的基因组DNA进行PCR。使用白芥子、拟南芥、Brassica napus、旱金莲(Tropaeolum majus)或N.Tabacum cv Xhanti的1μg基因组DNA，在100μl的总体积中进行PCR反应，其中含有5％DMSO、200μMdNTPs、200pmol每种引物、2.5单位于PCR缓冲液(50mM KCl、10mMTris-HCl(pH8.8)、1.5mM MgCl₂和0.1％Triton X-100)中的Taq聚合酶。用下列四个连续阶段进行PCR：

阶段1：95℃5分钟1个循环；

阶段2：95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒5个循环；

阶段3：95℃30秒、60℃30秒、72℃30秒30个循环；和

阶段4：72℃5分钟1个循环。

为从旱金莲中产生足量的约100bp的带，可将阶段2修改为95℃30秒、50℃30秒、71℃30秒5个循环。

使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，用EcoRI和BamHI限制性消化，在3％TAE琼脂糖凝胶上分离。切下约100bp的主要带，连接至EcoRI/amHI线性化的pBluescript II SK(Stratagene)中。使用热序列荧光标记引物循环测序试剂盒(7-deaza dGTP)(Amersham)对5个物种每种约10个克隆进行测序，并在ALF-Express(Pharmacia)上分析。

从四个含芥子油苷的物种白芥子、拟南芥、B.napus和旱金莲中，鉴定了编码保守氨基酸序列KPERH(L/F)NECSEVTLTENDLRFISFSTGKRGC(分别为SEQ ID NO：21和22)的PCR片段。此共有序列与以前鉴定的白芥子、拟南芥的P450_TYR同源物序列相同，并且非常类似于高粱P450_TYR氨基酸序列。从不含芥子油苷的植物N.tabacum cv Xhanti中，不能鉴定出编码该共有序列的PCR片段。该P450_TYR同源物共有氨基酸序列在例举的四种含芥子油苷植物种中的存在表明，P450_TYR家族的氨基酸N-羟化酶细胞色素P450在芥子油苷种中将亲代氨基酸或链延长的亲代氨基酸转化为相应的肟。对P450_TYR同源物特异的PCR片段的产生使同源cDNA或基因组克隆能被从相应的文库中分离。

尽管为了理解的清晰性已经以举例和实施例的方式相当详细地描述了前述的发明，但显然可实施某些改变和修改而仍落在附加的权利要求书的范围内。

                              序列表(1)一般信息(i)申请人：

(A)姓名：CIBA-GEIGY AG

(B)街道：Klybeckster.141

(C)城市：Basel

(E)国家：瑞士

(F)邮政编码(ZIP)：4002

(G)电话：41 61 69 11 11

(H)传真：41 61 696 79 76

(I)电传：962 991

(A)姓名：Royal Veterinary & Agricultural University

(B)街道：40，Thorvaldsensvej

(C)城市：Frederiksberg

(D)州：Copenhagen

(E)国家：丹麦

(F)邮政编码(ZIP)：1871(ii)发明名称：细胞色素P450单加氧酶(iii)序列数目：21(iv)计算机可读信息：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：

(A)长度：1929个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：cDNA(vii)直接来源：

(B)克隆：P450ox(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：81..1673(xi)SEQ ID NO：1的序列描述：CAGAGCTAGA AGCAGCTCAC ACTCCACACT CGTCTCGCCC GGCCATCCC CAAGGCAAGC    60AGGGGCACGG GCAATTAACA ATG GCC ACC ACC GCC ACC CCG CAG CTC CTC       110

                  Met Ala Thr Thr Ala Thr Pro Gln Leu Leu

                    1                5                 10GGC GGC AGC GTG CCG CAG CAG TGG CAG ACG TGC CTC CTG GTG CTC CTC     158Gly Gly Ser Val Pro Gln Gln Trp Gln Thr Cys Leu Leu Val Leu Leu

             15                  20                  25CCT GTG CTG CTG GTG TCC TAC TAC CTC CTC ACC AGC AGG AGC AGG AAC     206Pro Val Leu Leu Val Ser Tyr Tyr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Arg Asn

         30                  35          40AGG AGC AGG AGC GGC AAG CTG GGC GGG GCG CCG CGG CTG CCG CCG GGC     254Arg Ser Arg Ser Gly Lys Leu Gly Gly Ala Pro Arg Leu Pro Pro Gly

     45                  50                  55CCT GCG CAG CTG CCG ATC CTG GGC AAC CTG CAC CTG CTG GGC CCG CTG     302Pro Ala Gln Leu Pro Ile Leu Gly Asn Leu His Leu Leu Gly Pro Leu

 60                  65                  70CCG CAC AAG AAC CTC CGC GAG CTG GCG CGG CGG TAC GGC CCC GTG ATG     350Pro His Lys Asn Leu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Tyr Gly Pro Val Met75                  80                  85                  90CAG CTC CGT CTA GGC ACC GTG CCG ACG GTG GTG GTG TCC AGC GCG GAG     398Gln Leu Arg Leu Gly Thr Val Pro Thr Val Val Val Ser Ser Ala Glu

             95                 100                 105GCG GCG CGG GAG GTT CTC AAG GTG CAC GAC GTC GAC TGC TGC AGC CGG     446Ala Ala Arg Glu Val Leu Lys Val His Asp Val Asp Cys Cys Ser Arg

        110                 115                 120CCG GCG TCG CCC GGT CCC AAG CGC CTC TCC TAC GAC CTC AAG AAC GTC     494Pro Ala Ser Pro Gly Pro Lys Arg Leu Ser Tyr Asp Leu Lys Asn Val

    125                 130                 135GGC TTC GCG CCC TAC GGC GAG TAC TGG CGC GAG ATG CGC AAG CTC TTC     542Gly Phe Ala Pro Tyr Gly Glu Tyr Trp Arg Glu Met Arg Lys Leu Phe

140                 145                 150GCG CTC GAG CTC CTC AGC ATG CGC CGC GTC AAG GCC GCC TGC TAC GCG     590Ala Leu Glu Leu Leu Ser Met Arg Arg Val Lys Ala Ala Cys Tyr Ala155                 160                 165                 170CGC GAG CAG GAG ATG GAC AGG CTC GTC GCC GAC CTC GAC CGC GCC GCC     638Arg Glu Gln Glu Met Asp Arg Leu Val Ala Asp Leu Asp Arg Ala Ala

            175                 180                 185GCG TCC AAG GCC TCC ATC GTC CTC AAC GAC CAC GTC TTC GCC CTC ACC     686Ala Ser Lys Ala Ser Ile Val Leu Asn Asp His Val Phe Ala Leu Thr

        190                 195                 200GAC GGC ATC ATC GGC ACC GTC GCG TTC GGC AAC ATC TAC GCC TCC AAG     734Asp Gly Ile Ile Gly Thr Val Ala Phe Gly Asn Ile Tyr Ala Ser Lys

    205                 210                 215CAG TTC GCG CAC AAG GAG CGC TTC CAG CAC GTG CTG GAC GAC GCC ATG     782Gln Phe Ala His Lys Glu Arg Phe Gln His Val Leu Asp Asp Ala Met

220                 225                 230GAC ATG ATG GCC AGC TTC TCC GCC GAG GAC TTC TTC CCC AAC GCC GCC     830Asp Met Met Ala Ser Phe Ser Ala Glu Asp Phe Phe Pro Asn Ala Ala235                 240                 245                 250GGC CGC CTC GCC GAC CGC CTC TCG GGC TTC CTC GCC CGC CGC GAG CGC     878Gly Arg Leu Ala Asp Arg Leu Ser Gly Phe Leu Ala Arg Arg Glu Arg

            255                 260                 265ATC TTC AAC GAG CTC GAC GTC TTC TTC GAG AAG GTC ATC GAC CAG CAC     926Ile Phe Asn Glu Leu Asp Val Phe Phe Glu Lys Val Ile Asp Gln His

        270                 275                 280ATG GAC CCG GCG CGC CCC GTG CCG GAC AAC GGC GGC GAC CTC GTC GAC     974Met Asp Pro Ala Arg Pro Val Pro Asp Asn Gly Gly Asp Leu Val Asp

    285                 290                 295GTC CTC ATC AAC CTG TGC AAG GAG CAC GAC GGC ACG CTC CGC TTC ACC     1022Val Leu Ile Asn Leu Cys Lys Glu His Asp Gly Thr Leu Arg Phe Thr

300                 305                 310AGG GAC CAC GTC AAG GCC ATC GTC CTC GAC ACC TTC ATC GGC GCC ATC     1070Arg Asp His Val Lys Ala Ile Val Leu Asp Thr Phe Ile Gly Ala Ile315                 320                 325                 330GAC ACC AGC TCC GTC ACC ATC CTG TGG GCC ATG TCG GAG CTG ATG CGG     1118Asp Thr Ser Ser Val Thr Ile Leu Trp Ala Met Ser Glu Leu Met Arg

            335                 340                 345AAG CCG CAG GTG CTG AGG AAG GCG CAG GCC GAG GTG CGG GCC GCC GTG     1166Lys Pro Gln Val Leu Arg Lys Ala Gln Ala Glu Val Arg Ala Ala Val

        350                 355                 360GGC GAC GAC AAG CCG CGC GTC AAC TCG GAA GAC GCC GCC AAG ATC CCG     1214Gly Asp Asp Lys Pro Arg Val Asn Ser Glu Asp Ala Ala Lys Ile Pro

    365                 370                 375TAC CTG AAG ATG GTG GTC AAG GAG ACG CTG CGG CTG CAC CCG CCG GCG     1262Tyr Leu Lys Met Val Val Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Pro Ala

380                 385                 390ACG CTG CTG GTG CCC CGG GAG ACG ATG CGG GAC ACC ACC ATC TGC GGC     1310Thr Leu Leu Val Pro Arg Glu Thr Met Arg Asp Thr Thr Ile Cys Gly395                 400                 405                 410TAC GAC GTG CCG GCC AAC ACG CGC GTC TTC GTC AAC GCC TGG GCC ATC     1358Tyr Asp Val Pro Ala Asn Thr Arg Val Phe Val Asn Ala Trp Ala Ile

            415                 420                 425GGC AGG GAC CCG GCG AGC TGG CCG GCG CCC GAC GAG TTC AAC CCG GAC     1406Gly Arg Asp Pro Ala Ser Trp Pro Ala Pro Asp Glu Phe Asn Pro Asp

        430                 435                 440CGC TTC GTG GGG AGC GAC GTC GAC TAC TAC GGC TCG CAC TTC GAG CTC     1454Arg Phe Val Gly Ser Asp Val Asp Tyr Tyr Gly Ser His Phe Glu Leu

    445                 450                 455ATA CCG TTC GGG GCC GGC CGC CGG ATC TGC CCG GGA CTC ACC ATG GGC     1502Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly Leu Thr Met Gly

460                     465             470GAG ACC AAC GTC ACC TTC ACC CTC GCC AAC CTG CTC TAC TGC TAC GAC     1550Glu Thr Asn Val Thr Phe Thr Leu Ala Asn Leu Leu Tyr Cys Tyr Asp475                 480                 485                 490TGG GCG CTG CCG GGG GCC ATG AAG CCG GAG GAC GTC AGC ATG GAG GAG     1598Trp Ala Leu Pro Gly Ala Met Lys Pro Glu Asp Val Ser Met Glu Glu

            495                 500                 505ACC GGA GCG CTC ACG TTC CAC CGG AAG ACG CCG CTT GTG GTG GTG CCC     1646Thr Gly Ala Leu Thr Phe His Arg Lys Thr Pro Leu Val Val Val Pro

        510                 515             520ACC AAA TAC AAG AAC CGC CGC GCC GCC TAGTGAGCAG AGCCGAGCAG           1693Thr Lys Tyr Lys Asn Arg Arg Ala Ala

    525                 530AGCAATGGTC GACGACGACG ACGACGACGA CTGAATAAGC GTGCCAAAGT TTAGTACTAC   1753GTACGTACGT ACCTACTGCT ACTACGTACA GCTAGCCAAC AGTCAGAGTT GGACACTGTT   1813GGAGCTATCA TCCGGTCCTC TTCTTTTTGT GATACGTATT TGTTATGIGT TTTAGTGCCG   1873CAAAGCACAA AAGAAATAAA GCCCATCACA GTCGCGAGTC AAAAAAAAAA AAAAAA       1929(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：

(A)长度：531个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)SEQ ID NO：2的序列描述：Met Ala Thr Thr Ala Thr Pro Gln Leu Leu Gly Gly Ser Val Pro Gln1               5                  10                  15Gln Trp Gln Thr Cys Leu Leu Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Val Ser

        20                   25                  30Tyr Tyr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Arg Asn Arg Ser Arg Ser Gly Lys

    35                  40                   45Leu Gly Gly Ala Pro Arg Leu Pro Pro Gly Pro Ala Gln Leu Pro Ile

50                  55                   60Leu Gly Asn Leu His Leu Leu Gly Pro Leu Pro His Lys Asn Leu Arg65                  70                  75                  80Glu Leu Ala Arg Arg Tyr Gly Pro Val Met Gln Leu Arg Leu Gly Thr

             85                  90                  95Val Pro Thr Val Val Val Ser Ser Ala Glu Ala Ala Arg Glu Val Leu

        100                 105                 110Lys Val His Asp Val Asp Cys Cys Ser Arg Pro Ala Ser Pro Gly Pro

    115                 120                 125Lys Arg Leu Ser Tyr Asp Leu Lys Asn Val Gly Phe Ala Pro Tyr Gly

130                 135                 140Glu Tyr Trp Arg Glu Met Arg Lys Leu Phe Ala Leu Glu Leu Leu Ser145                 150                 155                 160Met Arg Arg Val Lys Ala Ala Cys Tyr Ala Arg Glu Gln Glu Met Asp

            165                 170                 175Arg Leu Val Ala Asp Leu Asp Arg Ala Ala Ala Ser Lys Ala Ser Ile

       180                  185                 190Val Leu Asn Asp His Val Phe Ala Leu Thr Asp Gly Ile Ile Gly Thr

    195                 200                 205Val Ala Phe Gly Asn Ile Tyr Ala Ser Lys Gln Phe Ala His Lys Glu

210                 215                 220Arg Phe Gln His Val Leu Asp Asp Ala Met Asp Met Met Ala Ser Phe225                 230                 235                 240Ser Ala Glu AsP Phe Phe Pro Asn Ala Ala Gly Arg Leu Ala Asp Arg

            245                 250                 255Leu Ser Gly Phe Leu Ala Arg Arg Glu Arg Ile Phe Asn Glu Leu Asp

        260                 265                 270Val Phe Phe Glu Lys Val Ile Asp Gln His Met Asp Pro Ala Arg Pro

    275                 280                 285Val Pro Asp Asn Gly Gly Asp Leu Val Asp Val Leu Leu Ile Asn Leu Cys

290                 295                 300Lys Glu His Asp Gly Thr Leu Arg Phe Thr Arg Asp His Val Lys Ala305                 310                 315                 320Ile Val Leu Asp Thr Phe Ile Gly Ala Ile Asp Thr Ser Ser Val Thr

            325                 330                 335Ile Leu Trp Ala Met Ser Glu Leu Met Arg Lys Pro Gln Val Leu Arg

        340                 345                 350Lys Ala Gln Ala Glu Val Arg Ala Ala Val Gly Asp Asp Lys Pro Arg

    355                 360                 365Val Asn Ser Glu Asp Ala Ala Lys Ile Pro Tyr Leu Lys Met Val Val

370                 375                 380Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Pro Ala Thr Leu Leu Val Pro Arg385                 390                 395                 400Glu Thr Met Arg Asp Thr Thr Ile Cys Gly Tyr Asp Val Pro Ala Asn

            405                 410                 415Thr Arg Val Phe Val Asn Ala Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Ala Ser

        420                 425                 430Trp Pro Ala Pro Asp Glu Phe Asn Pro Asp Arg Phe Val Gly Ser Asp

    435                 440                 445Val Asp Tyr Tyr Gly Ser His Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly

450                 455                 460Arg Arg Ile Cys Pro Gly Leu Thr Met Gly Glu Thr Asn Val Thr Phe465                 470                 475                 480Thr Leu Ala Asn Leu Leu Tyr Cys Tyr Asp Trp Ala Leu Pro Gly Ala

            485                 490                 495Met Lys Pro Glu Asp Val Ser Met Glu Glu Thr Gly Ala Leu Thr Phe

        500                 505                 510His Arg Lys Thr Pro Leu Val Val Val Pro Thr Lys Tyr Lys Asn Arg

    515             520                     525Arg Ala Ala

530(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：

(A)长度：16个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：蛋白质(v)片段类型：N-末端(vii)直接来源：

(B)克隆：N-末端肽(xi)SEQ ID NO：3的序列描述：Ala Thr Thr Ala Thr Pro Gln Leu Leu Gly Gly Ser Val Pro Glu Gln1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：

(A)长度：13个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：蛋白质(v)片段类型：内部(vii)直接来源：

(B)克隆：内部肽(xi)SEQ ID NO：4的序列描述：Met Asp Arg Leu Val Ala Asp Leu Asp Arg Ala Ala Ala1                5                  10(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(vii)直接来源：

(B)克隆：引物1(xi)SEQ ID NO：5的序列描述：GCGGAATTCT TYIIICCNGA RMGNTT                                              26(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：

(A)长度：6个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：肽  (v)片段类型：内部(vii)直接来源：

(B)克隆：由引物1编码的氨基酸(xi)SEQ ID NO：6的序列描述：Phe Xaa Pro Glu Arg Phe1               5(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(vii)直接来源：

(B)克隆：引物2(xi)SEQ ID NO：7的序列描述：GCGGATCCII IRCAIIINCK NCKNCC                                           26(2)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征：

(A)长度：7个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：肽(v)片段类型：内部(vii)直接来源：

(B)克隆：由引物2编码的氨基酸(xi)SEQ ID NO：8的序列描述：Gly Arg Arg Xaa Cys Xaa Gly1               5(2)SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(vii)直接来源：

(B)克隆：T7引物(xi)SEQ ID NO：9的序列描述：AATACGACTC ACTATAG                                                     17(2)SEQ ID NO：10的信息：(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(vii)直接来源：

(B)克隆：“12”基因特异性引物(xi)SEQ ID NO：10的序列描述：GCGGATCCGA CTACTACGGC TCGC                                             24(2)SEQ ID NO：11的信息：(i)序列特征：

(A)长度：25个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)SEQ ID NO：11的序列描述：GCGGATCCTT TTTTTTTTTT TTTTV                                              25(2)SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(vii)直接来源：

(B)克隆：“7”基因特异性引物(xi)SEQ ID NO：12的序列描述：GCGGATCCGA CATCAAGGGC AGCG                                               24(2)SEQ ID NO：13的信息：(i)序列特征：

(A)长度：44个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)(vii)直接来源：

(B)克隆：引物3(xi)SEQ ID NO：13的序列描述：CGCGGATCCA TATGGACGCA TCATTACTCC GCTC                                            44(2)SEQ ID NO：14的信息：(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(vii)直接来源：

(B)克隆：引物4(xi)SEQ ID NO：14的序列描述：CGCAAGCTTA TTACATCTCA ACGGGGACCC  T                                              31(2)SEQ ID NO：15的信息：(i)序列特征：

(A)长度：41个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(vii)直接来源：

(B)克隆：引物5(xi)SEQ ID NO：15的序列描述：CGCGGATCCA TATGGCAACA ACAGCAACCC CGCAGCTCCT C                         41(2)SEQ ID NO：16的信息：(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(vii)直接来源：

(B)克隆：引物6(xi)SEQ ID NO：16的序列描述：CGCAAGCTTA TTATGCTGCG CGGCGGTTCT TGTATTTGG                            39(2)SEQ ID NO：17的信息：(i)序列特征：

(A)长度：542个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：未知

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：蛋白质(iii)假设：非(iii)反义：非(v)片段类型：内部(vii)直接来源：(B)克隆：Sinapis alba(xi)SEQ ID NO：17的序列描述：Met Asn Thr Phe Thr Ser Asn Ser Ser Asp Leu Thr Ser Thr Thr Lys1               5                   10                  15Gln Thr Leu Ser Phe Ser Asn Met Tyr Leu Leu Thr Thr Leu Gln Ala

        20                   25                 30Phe Val Ala Ile Thr Leu Val Met Leu Leu Lys Lys Val Leu Val Asn

    35                  40                  45Asp Thr Asn Lys Lys Lys Leu Ser Leu Pro Pro Gly Pro Thr Gly Trp

50                  55                  60Pro Ile Ile Gly Met Val Pro Thr Met Leu Lys Ser Arg Pro Val Phe65                  70                  75                  80Arg Trp Leu His Ser Ile Met Lys Gln Leu Asn Thr Glu Ile Ala Cys

            85                  90                  95Val Arg Leu Gly Ser Thr His Val Ile Thr Val Thr Cys Pro Lys Ile

        100                 105                 110Ala Arg Glu Val Leu Lys Gln Gln Asp Ala Leu Phe Ala Ser Arg Pro

    115                 120                 125Met Thr Tyr Ala Gln Asn Val Leu Ser Asn Gly Tyr Lys Thr Cys Val

130                 135                 140Ile Thr Pro Phe Gly Glu Gln Phe Lys Lys Met Arg Lys Val Val Met145             150                     155                 160Thr Glu Leu Val Cys Pro Ala Arg His Arg Trp Leu His Gln Lys Arg

            165                 170                 175Ala Glu Glu Asn Asp His Leu Thr Ala Trp Val Tyr Asn Met Val Asn

        180                 185                 190Asn Ser Asp Ser Val Asp Phe Arg Phe Val Thr Arg His Tyr Cys Gly

    195                 200                 205Asn Ala Ile Lys Lys Leu Met Phe Gly Thr Arg Thr Phe Ser Gln Asn

210                 215         220Thr Ala Pro Asn Gly Gly Pro Thr Ala Glu Asp Ile Glu His Met Glu225                 230                 235                 240Ala Met Phe Glu Ala Leu Gly Phe Thr Phe Ser Phe Cys Ile Ser Asp

            245                 250                 255Tyr Leu Pro Ile Leu Thr Gly Leu Asp Leu Asn Gly His Glu Lys Ile

        260                 265                 270Met Arg Asp Ser Ser Ala Ile Met Asp Lys Tyr His Asp Pro Ile Ile

    275                 280                 285Asp Ala Arg Ile Lys Met Trp Arg Glu Gly Lys Lys Thr Gln Ile Glu

290                 295                 300Asp Phe Leu Asp Ile Phe Ile Ser Ile Lys Asp Glu Glu Gly Asn Pro305                 310                 315                 320Leu Leu Thr Ala Asp Glu Ile Lys Pro Thr Ile Lys Glu Leu Val Met

            325                 330                 335Ala Ala Pro Asp Asn Pro Ser Asn Ala Val Glu Trp Ala Met Ala Glu

        340                 345                 350Met Val Asn Lys Pro Glu Ile Leu Arg Lys Ala Met Glu Glu Ile Asp

    355                 360                 365Arg Val Val Gly Lys Glu Arg Leu Val Gln Glu Ser Asp Ile Pro Lys

370                 375                 380Leu Asn Tyr Val Lys Ala Ile Leu Arg Glu Ala Phe Arg Leu His Pro385                 390                 395                 400Val Ala Ala Phe Asn Leu Pro His Val Ala Leu Ser Asp Ala Thr Val

            405                 410                 415Ala Gly Tyr His Ile Pro Lys Gly Ser Gln Val Leu Leu Ser Arg Tyr

        420                 425                 430Gly Leu Gly Arg Asn Pro Lys Val Trp Ala Asp Pro Leu Ser Phe Lys

    435                 440                 445Pro Glu Arg His Leu Asn Glu Cys Ser Glu Val Thr Leu Thr Glu Asn

450                 455                 460Asp Leu Arg Phe Ile Ser Phe Ser Thr Gly Xaa Arg Gly Cys Ala Ala465                 470                 475             480Pro Ala Leu Gly Thr Ala Leu Thr Thr Met Leu Leu Ala Arg Leu Leu

            485                 490                 495Gln Gly Phe Thr Trp Lys Leu Pro Glu Asn Glu Tnr Arg Val Glu Leu

        500                 505                 510Met Glu Ser Ser His Asp Met Phe Leu Ala Lys Pro Leu Val Met Val

515                     520                 525Gly Glu Leu Arg Leu Pro Glu His Leu Tyr Pro Thr Val Lys

530                 535                 540(2)SEQ ID NO：18的信息：(i)序列特征：

(A)长度：6个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：非(iii)反义：非(v)片段类型：内部(xi)SEQ ID NO：18的序列描述：Lys Pro Glu Arg His Leu1               5(2)SEQ ID NO：19的信息：(i)序列特征：

(A)长度：6个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：非(iii)反义：非(v)片段类型：内部(xi)SEQ ID NO：19的序列描述：Thr Gly Lys Arg Gly Cys1               5(2)SEQ ID NO：20的信息：(i)序列特征：

(A)长度：31个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：非(iii)反义：非(v)片段类型：内部(xi)SEQ ID NO：20的序列描述：Lys Pro Glu Arg His Leu Asn Glu Cys Ser Glu Val Thr Leu Thr Glu1               5                   10                  15Asn Asp Leu Arg Phe Ile Ser Phe Ser Thr Gly Lys Arg Gly Cys

        20                  25                  30(2)SEQ ID NO：21的信息：(i)序列特征：

(A)长度：31个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑类型：线性(ii)分子类型：肽(iii)假设：非(iii)反义：非(v)片段类型：内部(xi)SEQ ID NO：21的序列描述：Lys Pro Glu Arg His Phe Asn Glu Cys Ser Glu Val Thr Leu Thr Glu1               5                   10                  15Asn Asp Leu Arg Phe Ile Ser Phe Ser Thr Gly Lys Arg Gly Cys

        20                  25                  30

Claims (28)

1.一种编码细胞色素P450单加氧酶的DNA分子，该酶催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化。

2.根据权利要求1的DNA分子，其中单加氧酶可从产生含氰苷的植物中获得。

3.根据权利要求2的DNA分子，其中单加氧酶可从选自高粱属、三叶草属、亚麻属、紫杉属、海韭菜属、木薯属、扁桃属、李属的植物和十字花科植物中获得。

4.根据权利要求1的DNA分子，其中醛肟是选自酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和环戊烯甘氨酸的氨基酸在单加氧酶存在下转化的结果，该单加氧酶催化该氨基酸向相应的N-羟基氨基酸的转化以及该N-羟基氨基酸向醛肟的转化。

5.根据权利要求1的DNA分子，其中单加氧酶催化含氰苷生物合成途径中一种以上的反应。

6.根据权利要求1的DNA分子，它包含应用重组DNA技术所必需的DNA。

7.根据权利要求1的DNA分子，它编码双色高粱的一种单加氧酶。

8.一种细胞色素P450单加氧酶，它催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化。

9.根据权利要求8的细胞色素P450单加氧酶，它将醛肟转化为腈的能力依赖于NADPH的存在，这种依赖性可通过还原剂的加入被克服。

10.根据权利要求9的细胞色素P450单加氧酶，如SDS-PAGE测定它具有55kD的分子量，并且具有如SEQ ID NO：3所述的N端序列。

11.一种分离编码细胞色素P450单加氧酶的cDNA分子的方法，所述单加氧酶催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化；该方法包括

(a)从产生含氰苷的植物组织中分离和溶解微粒体，

(b)纯化细胞色素P450单加氧酶，

(c)产生针对纯化的单加氧酶的抗体，

(d)用该抗体探查产生含氰苷的植物组织的cDNA表达文库，

(e)分离表达单加氧酶的克隆。

12.一种分离编码细胞色素P450单加氧酶的cDNA分子的方法，所述单加氧酶催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化；该方法包括

(a)从产生含氰苷的植物组织中分离和溶解微粒体，

(b)纯化细胞色素P450单加氧酶，

(c)获得该单加氧酶的完全或部分蛋白质序列，

(d)设计特定DNA的寡核苷酸，该DNA编码所述单加氧酶蛋白质序列的4-15个氨基酸，

(e)用该寡核苷酸、或者用通过该寡核苷酸由cDNA经PCR扩增所获得的DNA分子探查产生含氰苷的植物组织的cDNA文库，以及

(f)分离编码细胞色素P450单加氧酶的克隆。

13.一种分离编码细胞色素P450单加氧酶的cDNA分子的方法，所述单加氧酶催化醛肟向腈的转化以及该腈向相应的氰醇的转化；该方法包括

(a)设计覆盖A型细胞色素P450保守区3-10个氨基酸的简并寡核苷酸，

(b)使用该简并寡核苷酸通过聚合酶链反应扩增一种或多种细胞色素特异的DNA片段，

(c)用细胞色素特异的片段筛查cDNA文库，获得全长的cDNA，

(d)在微生物宿主中表达全长的cDNA，

(e)鉴定表达细胞色素P450单加氧酶的宿主，该酶催化醛肟向腈的转化及该腈向相应的氰醇的转化，以及

(f)从该宿主中纯化克隆的DNA。

14.一种产生纯化的重组细胞色素P450单加氧酶的方法，所述酶催化醛肟向腈的转化及该腈向相应的氰醇的转化；该方法包括

(a)人工改造编码该单加氧酶的基因，使其可在宿主生物中表达，

(b)用人工改造的基因转化该宿主生物，以及

(c)从宿主生物或其培养上清液中分离蛋白质。

15.根据权利要求14的方法，其中该宿主生物选自细菌、酵母和昆虫细胞。

16.根据权利要求14的方法，其中产生双色高粱的细胞色素P450单加氧酶。

17.根据权利要求14的方法，其中细胞色素P450单加氧酶被修饰。

18.一种转基因植物，它包含稳定整合入其基因组DNA、编码根据权利要求8的单加氧酶的DNA，或编码有义RNA、反义RNA或核酶的根据权利要求1的DNA，DNA的表达降低了细胞色素P450单加氧酶的表达。

19.根据权利要求18的转基因植物，它选自包括谷类、蛋白质作物、水果作物、蔬菜和块茎、坚果、油料作物、糖料作物、饲料和草皮草、饲料豆类、纤维植物和木本植物、药用作物以及香料和调料的植物类型。

20.根据权利要求18的转基因玉米植物。

21.根据权利要求18的转基因大麦植物。

22.一种获得根据权利要求18的转基因植物的方法，包括

(a)将DNA引入能再生为完整植物的植物细胞或组织中，该DNA包含可在此植物中表达的编码根据权利要求8的单加氧酶的基因，以及

(b)筛选转基因植物。

23.一种获得根据权利要求18的转基因植物的方法，包括

(a)将编码有义RNA、反义RNA或核酶的DNA引入能再生为完整植物的植物细胞或组织中，该DNA的表达降低了根据权利要求1的细胞色素P450单加氧酶的表达，以及

(b)筛选转基因植物。

24.根据权利要求1的DNA分子的用途，其用以获得根据权利要求18的转基因植物。

25.一种方法，它使用根据权利要求1的DNA分子获得抵抗昆虫、蜱螨或线虫的转基因植物，包括

(a)将DNA引入能再生为完整植物的植物细胞或组织中，该DNA包含可在此植物中表达的编码根据权利要求8的单加氧酶的基因，

(b)筛选转基因植物，以及

(c)鉴定可抵抗昆虫、蜱螨或线虫的植物。

26.根据权利要求22的方法，其中所述植物是单子叶或双子叶植物，选自包括谷类、蛋白质作物、水果作物、蔬菜和块茎、坚果、油料作物、糖料作物、饲料和草皮草、饲料豆类、纤维植物和木本植物、药用作物以及香料和调料的植物类型。

27.一种细胞色素P450酶，它催化芥子油苷生物合成的第一步。

28.权利要求27的酶，它具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。