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CN1214020C - 从豆科植物制备异黄酮 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了制备异黄酮的方法，其中使来自豆科种类植物的植物材料与水、C1-C10有机溶剂和选择性地将异黄酮糖苷切割成糖苷配基形式的酶接触以形成混合物，将混合物温育足以使糖苷配基形式的异黄酮扩散进入有机溶剂的一段时间，继而从有机溶剂中回收异黄酮。

Description

从豆科植物制备异黄酮
异黄酮为植物化学物质，常见于豆科植物家族成员中。它们以例如由Carlson等(1980)Journal of Chromotography，198，193-197(此处引用作为参考)所述的单一双苯环结构为基础。
已有超过700种不同的异黄酮得到描述，它们在植物以及包括人类在内的进食含有异黄酮植物的动物体内表现一系列生物功能。
异黄酮的小亚群(7，4′-二羟基异黄酮、5，7，4′-三羟基异黄酮、biochanin、7-羟基-4′-甲氧异黄酮和黄豆黄素)根据与动物(包括人类)细胞上的雌激素受体结合的能力来区分。这是由于异黄酮的双苯环空间结构与雌激素如雌二醇、雌酮和雌三醇的类固醇环结构有紧密相似性。虽然与类固醇类雌激素相比，雌激素类异黄酮对受体的亲和力明显更低，但它们具有弱雌激素活性。此亚群在动物细胞中还表现一系列看来与雌激素受体无关的生物学活性包括抗氧化剂、利尿、抗解痉和抗癌效应。这些令人感兴趣的功能及其潜在治疗效益近年来已引起医学研究者对异黄酮此特别亚群的注意。
在植物中异黄酮可以各种形式存在-(i)基本糖苷配基形式，(ii)作为通过β-糖苷键与糖组分如葡萄糖结合的糖苷(糖苷形式)，(iii)糖苷形式+丙二酰组分，(iv)糖苷形式+乙酰组分，如由上文提及的Carlson等(1980)所述。
糖苷形式(单独或者以丙二酰或乙酰形式)是水溶性的并且是异黄酮在许多豆类植物中的主要形式，有助于运输和贮存。糖苷形式提供针对一些降解因素如热、氧化作用、紫外线照射的增强的稳定性。在异黄酮生化功能的细胞内位点，胞内β-糖苷酶切割所含的糖组分剩下生物学活性更高、基本上不溶于水的糖苷配基形式。
异黄酮虽然主要存在于豆科成员中，但它相当广泛地分布于植物界。按照这一总规律，雌激素类异黄酮(5，7，4′-三羟基异黄酮、biochanin、7-羟基-4′-甲氧异黄酮、7，4′-二羟基异黄酮和黄豆黄素)主要局限于豆科属。发现大多数研究的豆科植物含有至少可检测水平的一种或多种上述五种雌激素类异黄酮，但最丰富的来源是豆科植物-大豆、小扁豆、鹰嘴豆、胡芦巴、车轴草、紫苜蓿以及菜豆属的各种品种。这些化合物的最丰富的来源是车轴草(包括红车轴草、Trifolium sub-terranean)和大豆(完整的大豆或脱脂大豆或者作为大豆加工的产物随后出现的任何物质包括大豆粉、大豆胚轴和大豆糖蜜)。在车轴草和大豆中这些化合物的水平根据品种或栽培品种随着季节、环境和植物年龄因素的变化而变化。车轴草中水平在约0.5-3.5％之间变化，大豆中在约0.05-0.3％之间变化(干重)。
异黄酮可用作经前综合征、更年期综合征(美国专利5569459、5516528、5498631)、骨质疏松症(美国专利5424331)的治疗药物和食品添加剂(美国专利4366082、4390559)。由于这些重要用途，从植物分离或浓缩异黄酮十分有利。
已有多种实现异黄酮分离的技术，但主要有两类不同方法。第一类方法包括将水溶性糖苷形式转变成不溶于水的糖苷配基形式以有助于随后在适当有机溶剂如酒精中提取糖苷配基。此转化步骤已得到描述，以两种方法之一来完成：(a)通过于低pH进行强烈加热(通常80-100℃)水解(Wang K，Kuan SS，Francis OJ，Ware KM，Carman AS.，测定大豆及其加工产物中植物雌激素的简单HPLC方法，农业食品化学杂志38：185-190，1990)；或(b)通过暴露于特异切割连接糖组分的β-糖苷键的酶(葡萄糖水解酶，β-糖苷酶或β-葡糖醛酸酶)。将酶加入反应体系或者可以利用植物中天然存在的β-葡糖醛酸酶。关于后者，通过将豆粉加热至45-55℃数小时来利用大豆内天然酶活性(日本专利89-345164/47)的方法已得到描述，但市场上的豆粉样品中天然存在的酶活性差异甚大，并且即使在其最大值时也不足以得到超过约50-60％所含糖苷的水解。
不同的水解反应过程(酶促或加热/低pH)得到描述，应用于水中磨碎的植物材料的混合物。水解过程结束时，将水相与不溶于水的植物材料分开以进行下一步骤。一旦实现糖苷形式向糖苷配基形式的转变，就使水性混合物与有机溶剂(不与水混溶)接触。糖苷配基由于其基本不溶于水的特性被抽提到有机溶剂相中并且随后得到回收。
以前提出的方法涉及糖苷形式的异黄酮的起始水提取以使它们以这种形式保存或随后转化为糖苷配基形式。对这一过程所描述的技术包括将磨碎的植物材料加入水中，经过一段时间(几小时至几天)，天然存在的异黄酮的糖苷形式溶于水相。将不溶的植物材料与水分离后，水相中的异黄酮进一步通过上述任何方法转变为糖苷配基形式并且随后得到回收。这一过程的变换方法是通过在适当离子交换树脂上的吸附，从水性混合物选择性地除去糖苷配基形式。随后用水：有机溶剂混合物从树脂上洗脱异黄酮，通过旋转蒸发浓缩，然后通过酶消化或加热/酸处理水解成糖苷配基形式(日本专利95-272884/36)。
上述技术的缺陷包括(a)步骤繁多，(b)使用剧烈处理如加热和/或强酸和/或强碱，(c)异黄酮产量相对较低，(d)非常高的水解酶费用，(e)与异黄酮大规模多步骤商用数量提取相关的高资本投入和高运转费用。所有目前已知的异黄酮提取技术都受一种或多种上述缺点的影响并大大地降低商业生产能力。一旦雌激素类异黄酮的社会健康效益得到认可，它们必将产生对整个社会的经济效益。为此，应建立改良的、成本-效率更高的提取方法。
发明概述
本发明的广义方面提供了从豆科种类植物制备异黄酮的方法，包括使植物材料与水、C1-C10有机溶剂和选择性地将异黄酮糖苷切割成糖苷配基形式的酶接触以形成混合物，将混合物温育足以使糖苷配基形式的异黄酮扩散进入有机溶剂的一段时间，继而从有机溶剂中回收异黄酮。
上述成分的混合物可以包括含有酶和植物材料的水相和溶有异黄酮的有机溶剂相。混合物可选择性地包括由有机溶剂和水剧烈混合形成的乳浊液，或者如果使用可与水混溶的有机溶剂，混合物为水和有机溶剂的混合物。
当有机溶剂不能与水混溶时，可例如通过蒸发除去含有异黄酮的有机溶剂成分以得到含有异黄酮的剩余物。然后将剩余物与异黄酮基本不溶其中的C1-C10有机溶剂混合使异黄酮沉淀并得到回收。
当有机溶剂可与水混溶，可例如通过蒸发除去混合物中的有机溶剂以得到含有异黄酮的剩余物和水，然后可与不能与水混溶的、可溶解异黄酮的C1-C10有机溶剂混合以得到有机溶剂相和水相。可以收集含有溶解的异黄酮的有机溶剂相并且随后回收异黄酮。有机溶剂通过加水蒸发，继而异黄酮形成非水溶性絮结，随后得到回收。
如果使用酶水解异黄酮糖苷以形成糖苷配基形式异黄酮，优选地包括β-葡聚糖酶。更优选地，酶是β-葡聚糖酶和β-木聚糖酶的混合物(或组合)。
另一方面，提供按照本发明方法制备时含有异黄酮的组合物。
发明详述
本发明在其广义方面提供从豆科种类植物制备异黄酮的方法，包括使植物材料与水、C1-C10有机溶剂和选择性地将异黄酮糖苷切割成糖苷配基形式的酶接触以形成混合物，将混合物温育足以使糖苷配基形式的异黄酮扩散进入有机溶剂的一段时间，继而从有机溶剂中回收异黄酮。
由植物材料、水、C1-C10有机溶剂和选择性地将异黄酮糖苷水解成糖苷配基形式的酶混合在一起得到的混合物可呈分相混合形式，其中包含经酶解后温育含有酶和植物材料的水相和溶有异黄酮的有机溶剂相。混合物可包括由有机溶剂和水剧烈混合形成的乳浊液，或者如果有机溶剂可与水混溶，混合物可以是水和有机溶剂的混合物。当混合物包括乳浊液时，优选在足以使糖苷配基形式的异黄酮扩散进入有机溶剂的一段时间后，采用常规方法如过滤或离心从乳浊液中除去微粒物质。然后出现分相，从而可以随后从有机溶剂成分回收异黄酮。
当有机溶剂不能与水混溶时，可例如通过蒸发除去含有异黄酮的有机溶剂成分以得到含有异黄酮的剩余物。然后将剩余物与异黄酮基本不溶其中的C1-C10有机溶剂混合使异黄酮沉淀并得到回收。
当有机溶剂可与水混溶，可例如通过蒸发除去混合物中的有机溶剂以得到含有异黄酮的剩余物和水，然后可与不能与水混溶的、可溶解异黄酮的C1-C10有机溶剂混合以得到有机溶剂相和水相。可以收集含有溶解的异黄酮的有机溶剂相并且随后回收异黄酮。有机溶剂通过加水蒸发，继而异黄酮形成非水溶性絮结，随后得到回收。
需要选择性地用于将异黄酮糖苷水解成糖苷配基形式(此后称为异黄酮)的酶以特异地水解β-糖苷键，β-糖苷键描述为异黄酮与其碳水化合物(通常为葡萄糖)组分之间的主要连接方式。碳水化合物化学领域内技术人员可推断出实现此功能的最佳酶应为β-糖苷酶和可能地β-葡聚糖酶。如表1所示，在比较不同碳水化合物酶在水解大豆异黄酮糖苷键能力方面的相对效力的实验中发现β-糖苷酶高度有效；出乎意料地发现-葡糖醛酸酶也高度有效；而发现β-葡聚糖酶出乎意料地具有相对低的效力并需要相当长的反应时间。在一些含有异黄酮的植物如车轴草中，内源β-糖苷酶活性一般足以实现糖苷形式的水解，不需要其它水解酶。因此酶的添加在本发明的方法中可以是可选择的。
表1不同碳水化合物作用酶将糖苷形式大豆异黄酮(daidzin，genistin)转化为糖苷配基形式(7，4′-二羟基异黄酮，5，7，4′-三羟基异黄酮)的作用比较。
酶类型*                              相对活性(％转换)
β-糖苷酶                            90
β-葡糖醛酸酶                        98
β-葡聚糖酶                          40
1，4-bD-葡聚糖水解酶                 0
1，4-aD-葡聚糖水解酶                 0
β-木聚糖酶∶β-葡聚糖酶(10∶1)      85
β-木聚糖酶∶β-葡聚糖酶(1∶1)       87
*所有酶以相同浓度加入标准含量的异黄酮。
本发现人发现β-葡聚糖酶/β-木聚糖酶的酶混合物在将异黄酮糖苷水解为糖苷配基形式方面较有效。这一结果完全出乎意料，因为没有理由推测β-木聚糖酶会对前述异黄酮糖苷配基形式上的糖苷键有任何效应。有利的是这种真菌来源的酶混合物可以大量商用数量和有利价格得到。虽然仅比更特异的β-糖苷酶和β-葡糖醛酸酶效力略低，但后二种酶不能以大量商用数量或成本有效价格得到。同时商用β-葡聚糖酶/β-木聚糖酶的酶混合物的低价使得可以增加每单位异黄酮的剂量，这远远地补偿了稍低的效力。在涉及酶的本发明的一个实施方案中，有机溶剂不引起所用酶的明显失活。
植物材料来自豆科种类植物，可从诸如大豆、车轴草(包括地车轴草、红车轴草以及其它含有异黄酮的车轴草)、鹰嘴豆、小扁豆、菜豆属(如蚕豆、扁豆、芸豆、利马豆、菜豆)的植物得到，这些植物一般含有比其它豆科种类植物更高的异黄酮水平。优选的是来自大豆或车轴草的植物材料，但这并不意味着其它含有异黄酮的豆科种类植物不可以用于本发明的方法。从车轴草提取异黄酮时，不必需使用水解异黄酮糖苷的酶。
植物材料优选以细颗粒形式，例如通过研磨或另外加工如车轴草、大豆、其它菜豆、鹰嘴豆、小扁豆得到的粉末。优选的植物材料为大豆(Glycine max)或车轴草如红车轴草。不限制本发明，优选的是尽可能最大程度地除去植物不含异黄酮的部分以减少提取过程中作用的植物材料体积。例如收获的车轴草中所含的90％异黄酮存在于叶中，约10％存在于茎和叶柄中。因此将叶与茎分开是有利的，这可以通过先反复拍打干车轴草再通过差异筛滤将较小的叶与较大的茎分开。另一实施例中，大豆可以去皮和/或脱脂并去皮。脱脂的豆粉可容易地以商用数量得到。另一实施例中，在常规去皮步骤中常常与大豆子叶脱离的大豆胚轴可容易地通过常规方法如筛滤加以收集，与完整大豆(约0.05-0.3％)相比，胚轴一般含有更高的异黄酮水平(约0.5-1.5％)。
用于本发明的不同实施方案的有机溶剂含有从1到10个碳(C1-C10)，并且包括可与水混溶和不可与水混溶的有机溶剂。可与水混溶的有机溶剂包括C1-C10醇类如甲醇、乙醇、丙醇/异丙醇、乙酸、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、正丙醇、异丙醇、四氢呋喃以及任何上述溶剂的混合物。不可与水混溶的、可溶解异黄酮的有机溶剂包括C4-C10醇类(如丁醇、己醇、戊醇)，C1-C10烷氧基溶剂(如乙基甲基酮、甲基苯酮、己烷-2，4-二酮等)；C2-C10脂化酸(如乙酸乙酯、乙基甲基丙二酸酯、二甲基磷酸脂)；C1-C8醛类(包括丁酮、戊酮、己二醛、cyclohexanecarbaldehyde、丁烷-1，2，4-tricarbaldehyde)；C2-C10醚类，C2-C3烯烃类，C2-C4烷烃类或酚类及其衍生物(1，2，4-巯基苯)以及任何上述溶剂的混合物。异黄酮基本不溶于其中的有机溶剂包括C5-C10烷烃(如己烷、环己烷、庚烷、辛烷)和C4-C10烯烃及任何上述溶剂的液混合物。优选地选择具有挥发性的有机溶剂以保证通过蒸发(例如蒸馏、旋转蒸发)去除有机溶剂，这样溶于有机溶剂的异黄酮化合物可以随后得到回收。
用于此方法的水可以来自任何通常的水源、蒸馏水、去离子蒸馏水等。水可含有抑制微生物生长的防腐剂和/或本领域公知的其它添加剂。水和有机溶剂的相应比例不限定本发明。尽管水和有机溶剂的比例可以变化，例如从1∶10到10∶1，但通常使用等比例的水和有机溶剂。
由水和有机溶剂混合得到的混合物包括有机溶剂相和水相，分开的相可轻轻混匀或搅拌。这可容易地通过垂直搅拌器来实现，保证分开的相混匀而相与相之间不混合。
本发明的方法不需要升高的温度，可在环境温度条件下进行，例如5-35℃。因此环境温度条件可以是足够的，不需要现有技术方法所需的复杂的温度控制，其中现有技术方法中是需要升高的提取温度的方法。
在一个实施方案中，本发明提取方法是一个罐、一步反应，它赋予巨大利益如在资本设备费用和时间方面的成本降低。与现有技术基本相反，根据本发明的一个实施方案，酶促反应和有机溶剂提取在一步步骤中的效率是很有效的，并且得到高产量的异黄酮。
一般通过有机溶剂的蒸发如通过旋转蒸发、蒸馏从有机溶剂回收异黄酮化合物。发现有机相去除后留下少量含有糖苷配基异黄酮的油脂。虽然优选的是继续进行进一步浓缩异黄酮的提取步骤，但是这种富含异黄酮的油脂可认为是所需终产品并可以这样使用。然后含有异黄酮的油脂可以通过加入对油脂的高度溶解而对异黄酮的溶解性很低的适当有机溶剂如己烷、庚烷和辛烷除去；由于己烷相对的价格，优选地使用己烷。将有机溶剂(如己烷)以与油脂成分约1∶1-50∶1之间的比例、优选地10∶1的比例加入。发现油脂可容易地扩散进入有机溶剂，同时异黄酮从溶液析出并沉积容器底部。然后将己烷∶油脂相去除留下含异黄酮的剩余物。可以回收剩余物并且例如在烤箱中于50-120℃使之干燥以形成细小粉末，随后按此后所述的配制用于医药用途。然而优选地，己烷抽提步骤再重复1-3次以实现油脂的完全去除。选择性地，为富集和纯化异黄酮，可以对含异黄酮的油脂进行HPLC分级分离、离子交换、层析或使用本领域其它公知方法。
当用于提取植物材料的C1-C10有机溶剂使用与水混溶时(例如醇类如乙醇)，有机溶剂可通过蒸发(如旋转蒸发或蒸馏)去除以得到水中包含含有异黄酮油脂的浓缩物。浓缩物可与可溶解异黄酮的C1-C10有机溶剂如乙酰乙酯混合以形成含有异黄酮的有机液相和水相。可以收集有机相成分并从中回收异黄酮。例如，有机溶剂可以例如采用蒸馏加水蒸发，此后异黄酮形成非水溶性絮结，随后将其回收并配制成医药/保健工业。
到此阶段，所提取的物质具有高异黄酮含量，例如36-70％异黄酮，一与起始材料的异黄酮的比例相同。因此产量一般都很高。此阶段的产物可以例如经过干燥和随后的配制或者如本领域已知的进行进一步处理以进一步纯化异黄酮用作医药目的。进一步纯化可以包括HPLC分级分离、离子交换层析或其它本领域公知的技术。例如7，4’-二羟基异黄酮和5，7，4′-三羟基异黄酮可通过PLC分级分离去除。
当大豆作为起始材料时，所提取的异黄酮是7，4’-二羟基异黄酮、5，7，4′-三羟基异黄酮和黄豆黄素；其它物质含有一系列化合物包括植物固醇(phytosterols)和其它非水溶性化合物。当车轴草作为原始材料时所提取的异黄酮为7，4’-二羟基异黄酮、5，7，4′-三羟基异黄酮、7-羟基-4’-甲氧异黄酮和biochanin；各种黄酮类包括叶绿素及植物固醇构成分离物的其它物质的大部分。
根据本发明方法制备的异黄酮可单独纯化。例如7，4’-二羟基异黄酮和5，7，4′-三羟基异黄酮可使用HPLC、其它层析技术或本领域已知的标准方法纯化。
例如正如医药赋形剂手册[第二版，美国医药协会，1994(此处引用作为参考)]所述的，异黄酮可与本领域公知的适当赋形剂、载体等混合配制成药物组合物或保健组合物、饮料、食品等。药物组合物或保健组合物可包括片剂、胶囊、用于再配制的粉末、糖浆等。在这样的配方中常用的载体/赋形剂包括微晶体纤维素、磷酸氢钙、硬脂酸镁和胶体硅。含有异黄酮的食品包括食品条、饼干、快餐食品和本领域公知的其它常规食品形式。饮料包括调味剂、缓冲剂等。
在另一方面，提供按照本发明制备时含有异黄酮的组合物，选择性地与药学上可接受的载体和/或赋形剂结合。组合物可与食品成分结合，例如在食品条或早餐食品条、饼干、饮料等食品中。
看来，由于一系列原因，现有技术没有考虑使用一个发酵罐步骤将异黄酮从糖苷形式向糖苷配基形式转化同时回收有机溶剂中的糖苷配基异黄酮。可能一直认为水解糖苷形式后从步骤中除去残余豆类植物材料是必要的。也可能认为有机溶剂使影响糖苷配基形式形成的酶失活。因而在现有技术中，水溶性糖苷形式向非水溶性糖苷配基形式的转化在多步步骤中进行，接着是在适当有机溶剂提取糖苷配基的另一步骤。
本发明的实施方案参照下列非限制性实施例得到描述。
实施例1
如图1所示，将2000kg脱脂豆粉放入含有5000L去离子水和10kgβ-葡聚糖酶/β-木聚糖酶(Bio-Feed-Beta CT；Novo Nordisk，丹麦)的10,000L容器中。在水性悬浮液顶部铺加1000L乙酰乙酯以形成两相混合物。使用垂直推进搅拌器(图1)将水相和有机相通过连续搅拌轻柔混合。发现在水相和有机溶剂相之间接触的地方，糖苷配基异黄酮容易地从水相进入有机溶剂相。设计水相的持续搅拌以保证水解的异黄酮与乙酰乙酯最大程度的接触；乙酰乙酯的持续搅拌有助于确保在两液相间形成高的异黄酮浓度梯度，由此使非水溶性糖苷配基形式溶解于乙酰乙酯的比率最大化。通过使底部的水性悬浮液循环经过乙酰乙酯相提供另一可选择的两相接触。
约4至约48小时，优选地18小时左右后，停止搅拌和在循环过程，让两液相最大限度地分离。采用蒸馏去除蒸发乙酰乙酯。残留约20L的油脂未蒸发。向油脂层加入200L己烷并通过搅拌约5分钟剧烈混匀。让它不搅拌放置过夜(约18小时)，含有异黄酮的微粒物质沉积在反应容器底部。弃去己烷∶油脂相留下软泥状物质。再向软泥状物质中加入5L以实现残留油脂的去除。将混合物放置1小时，此时微粒物质再次析出。弃去己烷∶油脂相留下半固体软泥状物质，将其收集并在烤炉中于约80℃温度干燥。通过HPLC分析发现此物质含有约36-70％之间(通常约60％)的异黄酮。重要的是，提取物中异黄酮的比例与起始材料的异黄酮的比例相同，并且产量一般很高(表2)。此物质本身可投入使用或进行进一步加工以进一步纯化异黄酮。
表2采用实施例1中所述的方法从全豆粉回收异黄酮
异黄酮                            ％起始材料的回收率
7，4′-二羟基异黄酮                80.3
5，7，4′-三羟基异黄酮             76.3
黄豆黄素                           75.0
实施例2
起始材料200kg是含有大豆胚轴和大豆子叶碎片的混合物的大豆粗磨粉，并且代表异黄酮的更丰富的来源(与全豆粉约0.2％相比，为约10％)。将200kg大豆粗磨粉放入含有1000L去离子水和2.5kg葡聚糖水解酶(Bio-Feed-Beta CT；Novo Nordisk，丹麦)的1000L容器中。然后加入1000L乙酰乙酯。用功率约200L/每分的泵将水相和有机相剧烈地混合在一起以确保两液相的有效接触，即形成乳浊液。混合在室温下持续1-24小时时间，但优选4小时。然后通过常规方法如过滤或离心将混合物中微粒物质与液相分离。颗粒物质的去除破坏了乳浊液，将相体放置约30分钟后实现水相和乙酰乙酯相之间的分离。然后取出含有异黄酮的乙酰乙酯并进行蒸馏。然后按照上面实施例1中所述的步骤处理乙酰乙酯蒸馏后剩下的油脂以分离富含异黄酮的物质。
实施例3
将500kg车轴草加入counter-current提取系统，与5000L 50％的酒精混合6小时时间。然后将有机提取物泵至储存罐并弃去残留车轴草。然后于80℃、压力(80kPa)下通过旋转蒸发回收酒精得到500L提取浓缩物(含有异黄酮的油化水)和4000L酒精/水混合的回收。将浓缩物和乙酰乙酯按1∶4比例(即2000L乙酰乙酯)混匀，将混合物放置以形成水相和乙酰乙酯层。异黄酮溶解于乙酰乙酯层。将乙酰乙酯层泵至蒸馏器并在真空下加水同时蒸发有机溶剂。然后将湿絮状物(floc)(活性成分)泵至储存罐。然后将50％的湿絮状物与雾化干燥(spray dry)剂混匀、雾化干燥并回收活性异黄酮(25％)。剩余50％用己烷洗、脱水、于90℃干燥、研磨并与载体/赋形剂混匀制成片剂。
实施例4
上述实施例1-3的干燥终产物(样品1)可用作浓缩5，7，4′-三羟基异黄酮或7，4′-二羟基异黄酮(含有/不含有黄豆黄素)的起始材料。纯化通过常规技术包括HPLC、离子交换层析以及其它层析分离法进行。在一个系列实验中，对3kg实施例1-3的干燥终产物进行分级分离以使7，4′-二羟基异黄酮和5，7，4′-三羟基异黄酮分开。分离到纯度在约95-99％(通常98.5％)之间的7，4′-二羟基异黄酮，回收到相同纯度的5，7，4′-三羟基异黄酮。
实施例5
可以从按照上述实施例提取的产物制备药物组合物。
1.下面组合物以片剂形式制备：
采用按照实施例1制备的豆粉提取物，含有35％5，7，4′-三羟基异黄酮和28％7，4′-二羟基异黄酮(重量比)
60mg提取物
340mg标准片剂惰性载体
此组合物制成片剂，得到含有20mg 5，7，4′-三羟基异黄酮和17mg7，4′-二羟基异黄酮的400mg片剂。
2.下面组合物以胶囊形式制备
采用按照实施例2制备的大豆胚轴提取物，含有18％5，7，4′-三羟基异黄酮、35％7，4′-二羟基异黄酮和18％黄豆黄素(重量百分比)
60mg提取物
190mg标准药学惰性载体
所有物质包裹在无毒明胶胶囊中并得到含有11mg 5，7，4′-三羟基异黄酮、21mg 7，4′-二羟基异黄酮和11mg黄豆黄素的200mg胶囊。
3.下面组合物以片剂形式制备
采用按照实施例4制备的5，7，4′-三羟基异黄酮提取物，含有99.5％5，7，4′-三羟基异黄酮(重量百分比)
50mg提取物
150mg标准片剂惰性载体
4.下面组合物以片剂形式制备
500mg片剂中含有40mg按照实施例3制备的异黄酮和460mg惰性赋形剂/载体。
上述载体包括纤维素(微晶体)、磷酸氢钙、大豆多糖、硬脂酸镁和胶体硅(无水)。
在整说明书和后续的权利要求书中，除非文中有需要，单词“包括”；及其衍生词应理解为意味着包含着所述整体或步骤或者整体或步骤的群体，但不排除任何其它整体或步骤或者整体或步骤的群体。

Claims (17)

1.一种从豆料种类植物制备异黄酮的方法，包括使植物材料与水和选自丙酮、乙腈、乙醇、乙酸乙酯、甲醇、甲基乙基酮、丙醇、异丙醇和四氢呋喃的C1-C10有机溶剂及将异黄酮糖苷切割成糖苷配基形式的酶接触以形成混合物，将混合物温育足以使糖苷配基形式的异黄酮扩散进入有机溶剂的一段时间，继而从有机溶剂中回收异黄酮。
2.根据权利要求1所述的方法，其中回收有机溶剂，去除有机溶剂以得到异黄酮剩余物，并将剩余物与异黄酮基本不溶于其中的有机溶剂混匀以使异黄酮沉淀并随后得到回收。
3.根据权利要求1所述的方法，其中混合物中含有异黄酮的有机溶剂可与水混溶，并且去除有机溶剂以得到含有异黄酮的剩余物和水，继而将其与不可与水混溶的、可溶解异黄酮的有机溶剂混合以产生有机相和水相，收集含有溶解的异黄酮的有机相并从中回收异黄酮。
4.根据权利要求3所述的方法，其中有机相加水蒸发，继而异黄酮形成非水溶性絮结。
5.根据权利要求1所述的方法，其中混合物包含含有酶和植物材料的水相和异黄酮扩散进入其中的有机相。
6.根据权利要求1所述的方法，其中混合物包括剧烈混合有机溶剂和水形成的乳浊液。
7.根据权利要求5所述的方法，其中酶是β-葡聚糖酶和β-木聚糖酶混合物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中植物材料与水和酶混合，继而加入有机溶剂以形成水相和有机相或通过剧烈混合有机溶剂和水形成乳浊液。
9.根据权利要求1所述的方法，其中植物材料与水混溶，继而加入酶及有机溶剂。
10.根据权利要求1所述的方法，其中植物材料来自大豆和车轴草。
11.根据权利要求1所述的方法，在10-30℃之间进行。
12.根据权利要求1所述的方法，其中植物材料是颗粒形式。
13.根据权利要求12所述的方法，其中植物材料是豆粉。
14.根据权利要求12所述的方法，其中植物材料是大豆胚轴和大豆子叶的混合物。
15.根据权利要求1所述的方法，其中植物材料是车轴草。
16.根据权利要求1所述的方法，其中5，7，4′-三羟基异黄酮从回收的异黄酮中纯化得到。
17.根据权利要求1所述的方法，其中7，4′-二羟基异黄酮从回收的异黄酮得到纯化。
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