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CN120699139B - 一种抗体或其抗原结合片段及其相关产品和应用 - Google Patents

一种抗体或其抗原结合片段及其相关产品和应用

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CN120699139B
CN120699139B CN202511150483.8A CN202511150483A CN120699139B CN 120699139 B CN120699139 B CN 120699139B CN 202511150483 A CN202511150483 A CN 202511150483A CN 120699139 B CN120699139 B CN 120699139B
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amino acid
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陈静
胡敏
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Chengdu Maikekang Biotechnology Co ltd
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Shanghai Maikekang Biotechnology Co ltd
Chengdu Maikekang Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种抗体或其抗原结合片段及其相关产品和应用，涉及免疫检测领域，该抗体包括氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3和氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区中的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其能够特异性结合HPV18型E6‑E7融合蛋白，具有检测灵敏度高、特异性好、准确度高和重复性好等优势，为HPV18型E6‑E7融合蛋白的有效检测提供了途径。

Description

一种抗体或其抗原结合片段及其相关产品和应用
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，具体而言，涉及一种抗体或其抗原结合片段及其相关产品和应用。
背景技术
人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一种主要感染人类表皮和粘膜鳞状上皮，而引起增生性病变的病原体，主要通过性生活或密切接触传播。目前已鉴定出200多种HPV亚型，根据其引起疾病严重程度分为低危型和高危型。高危型主要包括HPV16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68，可引起生殖器疣病，外生殖器癌、宫颈癌和高度宫颈上皮内瘤变，尤其HPV16、18型感染是宫颈癌发展最重要的致病因素。宫颈癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是影响全球女性健康的主要公共卫生问题之一，其发病率和死亡率位居全球女性癌症第四位，仅次于肺癌、乳腺癌和结直肠癌。根据世界卫生组织数据统计，全球每年宫颈癌新发病例接近60万，死亡约30万，而在社会经济较发达的国家，宫颈癌的发病率和死亡率较低。
人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是无包膜的双链闭环小DNA病毒，由病毒蛋白外壳和核心DNA构成。HPV基因组早期转录区含有E1~E8等多个蛋白，其中E1在病毒DNA起始复制中起关键作用，E2涉及病毒DNA转录的反式激活，E4可破坏角蛋白中间纤维网络，E6和E7为主要的致癌蛋白，在癌变发生的整个过程持续表达，参与细胞的恶性转化过程。E6和E7是导致宫颈癌发生的重要原因，因此，二者也被公认为是治疗性HPV疫苗的理想靶抗原。
目前已上市的预防性HPV疫苗都是基于病毒样颗粒（virus like particles,VLPs）的疫苗，VLPs由单一病毒蛋白形成，没有感染性和致癌性。但尚无研究表明VLP疫苗具有治疗作用，因此，对于在疫苗免疫前已感染HPV的受试者，它无法改变病毒的感染与发展。而感染HPV的患者目前仍然缺乏治疗选择。因此，开发治疗性HPV疫苗是控制现有HPV感染，治疗HPV感染引起的相关癌症及癌前病变的理想策略，也是紧扣临床需求，顺应市场趋势。
HPV疫苗研发生产过程中对疫苗主要有效成分的质量监控非常重要。目前，市场上缺乏性能优越的抗HPV18型E6-E7融合蛋白的融合蛋白的抗体，这限制了HPV18型E6-E7融合蛋白抗原检测的准确性和可靠性。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗体或其抗原结合片段及其相关产品和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种抗HPV18型E6-E7融合蛋白的抗体或其抗原结合片段，其包括：
氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3和氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
第二方面，本发明实施例提供了一种抗体偶联物，其包括：上述的抗体或其抗原结合片段。
第三方面，本发明实施例提供了一种试剂或试剂盒，其包括：上述的抗体或其抗原结合片段或上述的抗体偶联物。
第四方面，本发明实施例提供了如上述的抗体或其抗原结合片段或抗体偶联物在制备检测HPV18型E6-E7融合蛋白的产品中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合HPV18型E6-E7融合蛋白，具有检测灵敏度高、特异性好、准确度高和重复性好等优势，为HPV18型E6-E7融合蛋白的有效检测提供了途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为夹心ELISA实验流程图；
图2为6C9和14H8单抗检测HPV18 E6-E7抗原的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另外指明，否则实践本申请将采用细胞生物学、分子生物学（包含重组技术）、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
名词定义
本文中的术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，嵌合抗体，以及抗体片段，只要他们展示所需的生物学活性。
本文中的术语“抗原结合片段”是完整抗体的部分，所述部分与完整抗体所结合的抗原特异性结合。本领域技术人员根据本公开记载的内容容易理解到，抗原结合片段可以通过本领域已知方法制备获得，例如，酶消化的方法（包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶）和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得，还可以通过重组遗传学技术或通过自动肽合成仪（如Applied BioSystems的自动肽合成仪）合成获得。
本文中的术语“CDR”同“互补决定区”，是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。
本文中的术语“框架区”，同“骨架区”或“FR”区，是指抗体的重链可变区中除CDR区之外的区域；重链骨架区可以被进一步细分成被CDRs分隔开的毗邻区域（FR1、FR2、FR3和FR4），其中，重链骨架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4骨架区。重链可变区由以下编号的CDR与FR（从氨基末端排到羧基末端）排列连接获得：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4。
本文中的术语“同一性（identity）”百分比是指当两个序列最佳比对时，两个多肽的氨基酸在等效位置相同的程度。氨基酸序列同一性百分比的比对可以采用所属技术领域中各种方式进行，例如本领域熟知的BLAST、BLAST-2、ALIGN、MEGALIGN（DNASTAR）、CLUSTALW或CLUSTAL OMEGA等软件。本领域技术人员可确定比对序列的适当参数。
本发明实施例提供的抗体或其抗原结合片段可应用于HPV18型E6-E7融合蛋白生产过程中的质量控制，其能够高效精准地定量产品如疫苗中的HPV18型E6-E7融合蛋白含量，从而对疫苗的质量进行监控。
一方面，本发明实施例提供了一种抗HPV18型E6-E7融合蛋白的抗体或其抗原结合片段，其包括：
氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3和氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区中的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3和氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的轻链可变区中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明实施例提供的抗体或其抗原结合片段对于HPV18型E6-E7融合蛋白具有高亲和力和结合活性。
在一些实施例中，所述HPV18型E6-E7融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示。
在一些实施例中，所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3由Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact中的任意一种系统或多种系统组合定义。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括：
氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1~3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3和氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4、LVS和SEQ ID NO:5所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
氨基酸序列依次如SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3和氨基酸序列依次如SEQ ID NO:19、20和21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段还包括框架区HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，所述的HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4选自（a）或（b）：
（a）所述的HFR1、HFR2、HFR3和HFR4的氨基酸序列依次与如SEQ ID NO:6~9所示序列具有至少80%同一性；所述的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4的氨基酸序列依次与如SEQ ID NO:10~13所示序列具有至少80%同一性；
（b）所述的HFR1、HFR2、HFR3和HFR4的氨基酸序列依次与如SEQ ID NO:21、22、23和9所示序列具有至少80%同一性；所述的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4的氨基酸序列依次与如SEQID NO:24、25、26和27所示序列具有至少80%同一性。
在一些实施例中，至少80%可以为80%、82%、84%、86%、88%、90%、2%、94%、96%、98%和100%中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段还包括恒定区。
在一些实施例中，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、骆驼、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。
在一些实施例中，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在一些实施例中，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任意一种的重链恒定区或多种恒定区的组合。
在一些实施例中，所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。
在一些实施例中，所述抗原结合片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
上述抗体的抗原结合片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能片段可以通过比如酶消化的方法（包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶）和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。上述抗体的抗原结合片段还可以通过本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
另一方面，本发明实施例还提供了一种抗体偶联物，其包括：前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，所述抗体偶联物还包括与所述抗体或其抗原结合片段偶联的标记物、纯化标签和/或固相载体。
标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。
在一些实施例中，标记物包括荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂及纳米颗粒类标记物。
在一些实施例中，荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物（例如包括但不限于异硫氰酸荧光素（FITC）羟基光素（FAM）、四氯光素（TET）等或其类似物）、罗丹明类染料及其衍生物（例如包括但不限于红色罗丹明（RBITC）、四甲基罗丹明（TAMRA）、罗丹明B（TRITC）等或其类似物）、Cy系列染料及其衍生物（例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物）、Alexa系列染料及其衍生物（例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物）和蛋白类染料及其衍生物（例如包括但不限于藻红蛋白（PE）、藻蓝蛋白（PC）、别藻蓝蛋白（APC）、多甲藻黄素-叶绿素蛋白（preCP）等）。
在一些实施例中，酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在一些实施例中，放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在一些实施例中，化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在一些实施例中，纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体；纳米颗粒包括不限于：有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在一些实施例中，所述固相载体包括但不限于微球、板和膜。
在一些实施例中，所述固相载体包括磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、乳胶微球、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜中的任意一种或多种。
另一方面，本发明实施例还提供了一种试剂或试剂盒，其包括：前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段或前述任意实施例所述的抗体偶联物。
在一些实施例中，前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段可作为检测抗体和/或捕获抗体（包被抗体）。例如，含氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3和氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体或其抗原结合片段作为捕获抗体（或检测抗体），含氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3和氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的轻链可变区中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体或其抗原结合片段作为检测抗体（或捕获抗体）。再例如，含氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1~3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3和氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4、LVS和SEQ ID NO:5所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体或其抗原结合片段作为捕获抗体（或检测抗体），含氨基酸序列依次如SEQ ID NO:16、17和18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3和氨基酸序列依次如SEQ ID NO:19、QVS和SEQ ID NO:20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的抗体或其抗原结合片段作为检测抗体（或捕获抗体）。
在一些实施例中，所述试剂盒包括检测试剂盒。
在一些实施例中，所述检测包括免疫检测。
在一些实施例中，所述免疫检测包括酶联免疫吸附试验（ELISA），荧光免疫检测（IFA），化学发光免疫检测（CLIA）、放射免疫测定（RIA）、胶体金免疫层析以及其它非酶联抗体结合试验或方法。
在一些实施例中，所述试剂盒还包括免疫检测所需试剂，例如，ELISA检测试剂盒还可以包括：稀释液、洗脱液和显色液中的任意一种或多种。
此外，本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的抗体或其抗原结合片段或前述任意实施例所述的抗体偶联物在制备检测HPV18型E6-E7融合蛋白的产品中的应用。
在一些实施例中，所述产品包括：试剂、试剂盒、试纸条和芯片中的任意一种或多种。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了2种单克隆抗体，命名为6C9和14H8，经测序，6C9的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14和15所示，14H8的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28和29所示。需要说明的是，6C9和14H8均为IgG型抗体，Fc为鼠源Fc。
本实施例提供了单抗的制备方法，具体包括如下步骤：
小鼠免疫：选择雌性 BALB/c 小鼠以HPV18型 E6-E7融合蛋白（其氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示）乳化完全弗氏佐剂（CFA）进行皮下免疫，两周后使用同样的蛋白乳化不完全弗氏佐剂（IFA）进行免疫，间隔两周后继续免疫多次，直至血清效价合格；
（2）细胞融合：取免疫效价合格后的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞，按5:1比例用浓度为50%的PEG进行融合，悬于1%HAT选择培养基中培养，7-10天观察克隆细胞的生长情况；
（3）杂交瘤细胞株筛选：经间接ELISA法（采用HPV18型 E6-E7融合蛋白（SEQ IDNO:31）和HPV16型E6-E7融合蛋白（SEQ ID NO:30）包被）筛选出与HPV18型 E6-E7融合蛋白有反应，和HPV16型E6-E7融合蛋白不反应的细胞株，然后反复克隆，获得稳定的杂交瘤细胞；
（4）单抗制备：将能稳定分泌抗HPV18型 E6-E7融合蛋白的杂交瘤细胞注入经液体石蜡处理的BALB/c小鼠腹腔中，进行体内腹水生产，然后采取腹水进行纯化，便获得单克隆抗体（6C9、14H8）。
实施例2
本实施例提供了一种夹心ELISA试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括聚苯乙烯微孔板，TMB显色液、PBST洗脱液、包被抗体（6C9）以及检测抗体（14H8）。
夹心ELISA检测方法原理：将特异性抗体稀释至一定浓度后通过物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待检标本，与包被在固相载体上的抗体特异性结合，然后加入酶标二抗、显色液，最后加入终止液终止反应，通过测定特定波长吸光值进行定量分析，供试品吸光度值与其抗原浓度呈正相关，根据标准曲线计算供试品中抗原的浓度。夹心ELISA实验流程图见图1。
线性范围与抗体工作浓度的确定：
（1）按照常规包被条件，将鼠单抗6C9稀释至2 μg/ml进行包被（2-8℃包被16~24小时，包被液配方：NaHCO33.068 g，Na2CO31.435 g加纯化水到1L）；
（2）次日用1×PBST清洗掉未结合上的包被抗体，然后加入封闭液进行封闭（25℃封闭1小时），即制得包被了抗体的酶标板；
（3）使用时，依次加入系列稀释的标准品、供试品和稀释的辣根过氧化物酶标记的14H8单抗，25℃反应后加入辣根过氧化物酶显色体系的TMB显色液，最后用1 M磷酸终止后读取特异性吸光值。根过氧化物酶标记的14H8单抗的标记方法为：（a）称取4.2 mg HRP，溶于420 μl超纯水；（b）称取9.7 mg NaIO4，溶于755 μl超纯水；（c）取420 μl（b）溶液加入（a）中，4℃避光反应30 min；（d）反应结束后，加入3.78 μl乙二醇，室温避光反应30min；（e）取（d）反应所得溶液与待标记抗体按1：1质量比加入透析袋中，1×CBS缓冲液透析；（f）透析结束后，将透析袋中液体转入烧杯中；然后加入45 μl NaBH4（5 mg/ml），4℃避光反应3 h；（g）反应结束后，加入前6步反应总体积的饱和硫酸铵，4℃避光反应30 min；（h）反应结束后，取出液体，11000 rpm，4℃离心15 min；（i）将沉淀用PBS复溶，然后加入等体积甘油，混匀，保存；
（4）经过试验，结果显示，14H8酶标抗体最佳工作稀释比例为1：3200倍；在50ng/ml~0.39 ng/ml范围内，吸光值与检测浓度（ng/ml）呈高度线性相关（R2＞0.98）。
实施例3
对实施例2的夹心ELISA检测方法进行专属性验证。
实验设计：取715、717、718、721原液和716原液，均稀释10倍，然后将稀释后的715、717、718、721样品分别和716（参比品）进行混合，加样过程见表1。
表1. 样本稀释
备注：注：715蛋白为HPV16型E6-E7融合蛋白，氨基酸如SEQ ID NO：30所示；716蛋白为HPV18型 E6-E7融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示；717蛋白为HPV16型-18型E2融合蛋白，氨基酸如SEQ ID NO：32所示；718蛋白为HPV16型E1抗原，氨基酸如SEQ ID NO：33所示；721蛋白为HPV18型E1抗原，氨基酸如SEQ ID NO：34所示。
接受标准：各样品回收率80%~120%；其他抗原存在的情况下，不干扰供试品抗原的检测。
回收率（%）=716混合蛋白实测值/716蛋白实测值×100%。
结果见下表。
表2. 专属性验证结果
专属性验证结论：
在715蛋白、717蛋白、718蛋白和721蛋白分别存在的情况下，依然可以准确检测出716蛋白的含量（回收率在可接受范围80%-120%内），即本检测方法专属性/特异性良好。专属性验证合格。
实施例4
对实施例2提供的夹心ELISA检测方法进行精密度（重复性）验证。
实验设计：选取1批716蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示），用稀释液稀释至高、中和低三个浓度，分别为50 ng/ml、25 ng/ml和12.5 ng/ml，然后在板内2倍倍比稀释8个梯度进行检测。
检测时，每个浓度重复测定3次。计算三次复测检测值CV值。
接受标准：供试品必须有至少3个稀释度在标准曲线线性范围内；同一批次供试品的三次复测检测值CV≤20%。
精密度（重复性）验证结果如下表。
表3. 精密度验证结果
精密度（重复性）结论：各浓度三次复测检测值之间的CV小于20%（分别为1.6%、3.6%、3.4%）。重复性验证合格。
实施例5
对实施例2提供的夹心ELISA检测方法进行精密度（中间精密度）验证。
实验设计：另择一天三位实验员重复“重复性”实验，计算日间及人员差异。
接受标准：不同日期，不同人员，同一批次的供试品检测值CV≤20%。
精密度（中间精密度）验证结果如下表。
表4. 中间精密度验证结果
精密度（中间精密度）结论：不同日期、不同实验员对716抗原检测结果CV小于20%（分别为3.2%、2.7%、3.6%）。中间精密度验证合格。
实施例6
对实施例2提供的夹心ELISA检测方法进行准确度验证。
实验设计：选取1批716原液（氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示），用稀释液按表5~6进行稀释，然后进行加标，加标过程见表7，取C4、C5、C6、M4、M5、M6、c1、c2、c3进行测定，计算回收率。
回收率（%）=（加标样品实测值-样品实测值）/标品实测值×100%。
接受标准：回收率在80%~120%之间。
表5. 716原液稀释过程
表6. 716参比品稀释过程
表7. 准确度加标过程
准确度验证结果如下表所示。
表8. 准确度验证结果
备注：加标实测值=加标样品实测值-样品实测值。
准确度验证结论：各浓度加标回收率均在80%~120%之间（分别为108%、100%、92%），准确度验证合格。
实施例7
对实施例2提供的夹心ELISA检测方法进行标准曲线（线性和范围）验证。
实验设计：总结精密度、准确度、专属性验证中的标准曲线数据，以得到标准曲线的线性及最佳检测范围。
接受标准：标准曲线（四参数拟合曲线）的相关系数均不小于0.98，各标准曲线的R2的CV≤10%；标准曲线最佳检测范围一致。
标准曲线（线性和范围）验证结果如下表。
表9 标准曲线（线性和范围）验证结果
标准曲线（线性和范围）验证结论：综合前几个验证可知，标准曲线线性良好，R2均大于0.99，R2的CV%小于10%，符合验证标准；标曲的线性范围一致，为50~0.39ng/ml。标准曲线如图2。
实施例8
本实施例提供了一种试剂盒，其包括聚苯乙烯微孔板，在该板表面固定有14H8单克隆抗体（包被抗体），此外试剂盒还包括：酶标记的检测抗体（6C9）、TMB显色液和PBST洗脱液。
（1）按照常规包被条件，将14H8抗体以一定比例稀释进行包被（2-8℃包被16~24小时，包被液配方：NaHCO33.068 g，Na2CO31.435 g加纯化水定容至1L）。
（2）次日用1×PBST清洗掉未结合上的包被抗体，然后加入封闭液进行封闭（25℃封闭1小时），即制得包被了抗体的酶标板；
（3）使用时，依次加入系列稀释的标准品、供试品和稀释的辣根过氧化物酶标记的（6C9）单克隆抗体，25℃反应后加入辣根过氧化物酶显色体系的TMB显色液，最后用1 M磷酸终止后读取特异性吸光值。
本申请涉及的序列信息如下表所示。
表10 序列
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种抗HPV18型E6-E7融合蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其包括：
氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的重链可变区中的HCDR1、HCDR2和HCDR3和氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示的轻链可变区中的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
所述的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3同时由Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact中的任意一种系统定义。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括：
氨基酸序列依次如SEQ ID NO:1~3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3和氨基酸序列依次如SEQ ID NO:4、LVS和SEQ ID NO:5所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
3.根据权利要求1~2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还包括框架区HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，所述的HFR1、HFR2、HFR3和HFR4的氨基酸序列依次与如SEQ ID NO:6~9所示序列具有至少80%同一性；所述的LFR1、LFR2、LFR3和LFR4的氨基酸序列依次与如SEQ ID NO:10~13所示序列具有至少80%同一性。
4.根据权利要求1~2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还包括恒定区；所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、骆驼、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人；所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区；所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任意一种的重链恒定区或多种恒定区的组合；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。
5.根据权利要求1~2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
6.一种抗体偶联物，其特征在于，其由以下组分组成：权利要求1~5任一项所述的抗体或其抗原结合片段；与所述抗体或其抗原结合片段偶联的标记物、纯化标签和/或固相载体。
7.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其包括：权利要求1~5任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的抗体偶联物。
8.如权利要求1~5任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的抗体偶联物在制备检测氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示的HPV18型E6-E7融合蛋白的产品中的应用。
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