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CN119685309A - 用于预防和治疗纤维化相关疾病和呼吸系统疾病的双调蛋白基因特异性双链寡核苷酸和包含其的组合物 - Google Patents

用于预防和治疗纤维化相关疾病和呼吸系统疾病的双调蛋白基因特异性双链寡核苷酸和包含其的组合物 Download PDF

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CN119685309A CN202411459338.3A CN202411459338A CN119685309A CN 119685309 A CN119685309 A CN 119685309A CN 202411459338 A CN202411459338 A CN 202411459338A CN 119685309 A CN119685309 A CN 119685309A
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高映浩
裵暶姝
朴翰浯
孙承燮
朴俊泓
尹成一
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Abstract

本发明涉及用于预防和治疗纤维化相关疾病和呼吸系统疾病的双调蛋白基因特异性双链寡核苷酸和包含其的组合物，具体涉及一种可以高度特异性且有效地抑制双调蛋白表达的双链寡核苷酸，并且优选是包含呈RNA/RNA、DNA/DNA或DNA/RNA杂合体形式的序列的双链寡核苷酸；一种包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构；一种包含所述双链寡核苷酸结构的纳米颗粒；以及其纤维化或呼吸系统疾病预防或治疗用途。

Description

用于预防和治疗纤维化相关疾病和呼吸系统疾病的双调蛋白 基因特异性双链寡核苷酸和包含其的组合物
本发明申请是基于申请日为2019年05月22日，申请号为201980042921.5(国际申请号为PCT/KR2019/006144)、名称为“用于预防和治疗纤维化相关疾病和呼吸系统疾病的双调蛋白基因特异性双链寡核苷酸和包含其的组合物”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种能够以高效率非常特异地抑制双调蛋白表达的双链寡核苷酸，优选包含RNA/RNA、DNA/DNA或DNA/RNA杂合序列的双链寡核苷酸；一种包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构；一种包含所述双链寡核苷酸结构的纳米颗粒；以及其在预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病中的用途。
背景技术
1995年，Guo和Kemphues报道了，不仅有义RNA，而且反义RNA也有效抑制秀丽隐杆线虫(C.elegans)中的基因表达，并且从那时起，进行了研究以鉴定其原因。1998年，Fire等人首先描述了一种现象，其中注射双链RNA(dsRNA)通过特异性降解与其对应的mRNA而抑制基因表达。这种现象称为RNA干扰(RNAi)。RNAi是一种用于抑制基因表达的过程，可以以简单的方式以低成本展现出独特的抑制基因表达的作用，并且因此这种技术的应用领域变得更加多样。
由于这种抑制基因表达的技术可以调节特定基因的表达，因此它可以在mRNA水平上去除与癌症、遗传疾病等相关的特定基因，并且可以用作开发用于疾病治疗的治疗剂和验证靶标的重要工具。作为用于抑制靶基因表达的常规技术，已经公开了针对靶基因引入转基因的技术。这些技术包括相对于启动子在反义方向上引入转基因的方法和相对于启动子在反义方向上引入转基因的方法。
这种靶向RNA的RNA疗法是针对靶RNA使用寡核苷酸去除感兴趣的基因的功能的方法，并且可以被认为与其中治疗剂(诸如抗体和小分子)主要靶向蛋白质的常规方法不同。用于靶向RNA的方法大致分为两种类型：双链RNA介导的RNAi和使用反义寡核苷酸(ASO)的方法。目前，正在通过靶向各种疾病中的RNA尝试临床试验。
反义寡核苷酸(在下文中称为“ASO”)是一种短的合成DNA，其被设计成根据Watson-Crick碱基配对与靶基因结合，并且可以特异性地抑制基因的特定核苷酸序列的表达。因此，反义寡核苷酸已被用于研究基因的作用以及开发能够在分子水平上治疗疾病(诸如癌症)的治疗剂。这些ASO具有能够通过设定各种抑制基因表达的靶标而容易地产生的优点，并且为了抑制癌基因表达和癌细胞生长，已经对ASO的使用进行了研究。通过将ASO结合到互补的mRNA序列以诱导RNase H活性并且去除所述mRNA，或者通过干扰用于蛋白质翻译的核糖体复合物的形成和进展来完成通过ASO抑制特定基因表达的过程。此外，据报道，ASO与基因组DNA结合以形成三螺旋结构，从而抑制基因转录。ASO具有如上所述的潜力，但为了在临床实践中使用ASO，需要提高ASO对核酸酶的稳定性，并且将ASO有效地递送到靶组织或细胞中，以便特异性地结合靶基因的核苷酸序列。此外，遗传mRNA的二级和三级结构是ASO特异性结合的重要因素，并且其中mRNA二级结构的形成减少的区域对于ASO的进入非常有利。因此，在合成ASO之前，已经作出努力通过系统地分析其中mRNA二级结构的形成减少的区域来不仅在体外而且在体内有效地实现基因特异性抑制。这些ASO比siRNA(一种RNA)更稳定，并且具有易溶于水和生理盐水的优点。迄今为止，联邦药品管理局(FDA)已批准了三种ASO(Jessica,C.,J Postdoc Res.,4:35-50,2016)。
由于发现了RNA干扰(在下文中称为“RNAi”)的作用，因此已经发现RNAi在各种类型的哺乳动物细胞中作用于序列特异性mRNA(Barik,S.,JMol.Med.(2005)83:764-773)。当双链RNA的长链被递送到细胞中时，所递送的双链RNA被Dicer核酸内切酶转化为加工成21至23个碱基对(bp)的小干扰RNA(在下文中称为“siRNA”)。siRNA与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合，并且通过其中引导(反义)链识别并且降解靶mRNA的过程以序列特异性方式抑制靶基因表达。使用SiRNA抑制基因表达的技术被用于抑制靶细胞中的靶基因表达并且观察由此产生的变化，并且有效地用于鉴定靶细胞中的靶基因的功能的研究。特别地，抑制传染性病毒或癌细胞中的靶基因的功能可以有效地用于开发针对感兴趣的疾病的治疗方法。作为使用实验动物进行体外研究和体内研究的结果，已经报道了通过siRNA抑制靶基因表达是可能的。
Bertrand等人报道，siRNA在体外和体内对mRNA表达的抑制作用好于针对相同靶基因的反义寡核苷酸(ASO)，并且这种作用持续更久。此外，关于作用机理，siRNA通过与靶mRNA互补结合以序列特异性方式调节靶基因表达。因此，siRNA优于常规的基于抗体的药物或化学药物(小分子药物)，因为siRNA适用的受试者的范围可以显著扩大(M.A.Behlke,MOLECULAR THERAPY.2006 13(4):664-670)。
siRNA具有优异的作用，并且可以用于各种应用中，但为了将siRNA开发为治疗剂，应改善siRNA的体内稳定性及其细胞递送效率，使得siRNA可以有效递送到细胞(F.Y.Xie,Drug Discov.Today.2006年1月；11(1-2):67-73)。为了提高体内稳定性并且解决与siRNA的非特异性先天免疫刺激相关的问题，已积极尝试通过修饰siRNA的一些核苷酸或其骨架以具有核酸酶抗性，或使用病毒载体、脂质体或纳米颗粒来对其进行研究。
包含病毒载体(诸如腺病毒或逆转录病毒)的递送系统具有高转染功效，但具有高免疫原性和致癌性。另一方面，含有纳米颗粒的非病毒递送系统具有比病毒递送系统更低的细胞递送效率，但具有优点，包括体内高安全性、靶标特异性递送、RNAi寡核苷酸向细胞或组织中的有效摄取和内化、以及低细胞毒性和免疫刺激。因此，非病毒递送系统目前被认为是比病毒递送系统更有前景的递送方法(Akhtar S,J Clin Invest.2007年12月3日；117(12):3623-3632)。
在非病毒递送系统中，使用纳米载体的方法是其中使用各种聚合物(诸如脂质体和阳离子聚合物复合物)形成纳米颗粒并且其中将siRNA装载到此类纳米颗粒(即，纳米载体)中并且递送到细胞的方法。在使用纳米载体的方法中，常用的方法包括使用聚合物纳米颗粒、聚合物胶束、脂质复合物(lipoplex)等的方法。其中，脂质复合物由阳离子脂质构成，并且功能是与细胞内体的阴离子脂质相互作用以诱导内体的不稳定，从而允许细胞外递送外来体。
此外，已知可以通过将化合物等缀合至到siRNA的随从(有义)链的末端区域以赋予其改善的药代动力学特征来提高体内siRNA的效率(J.Soutschek,Nature 11；432(7014):173-8,2004)。在这种情况下，siRNA的稳定性取决于与siRNA的有义(随从)链或反义(指导)链的末端缀合的化学化合物的特性而变化。例如，与聚合物化合物(诸如聚乙二醇(PEG))缀合的siRNA在阳离子化合物存在下与siRNA的阴离子磷酸基团相互作用以形成复合物，从而提供具有提高的siRNA稳定性的载体(S.H.Kim,J.Control.Release 129(2):107-16,2008)。特别地，与其他药物递送系统(诸如微球或纳米颗粒)相比，由聚合物复合物构成的胶束具有非常小的尺寸和非常均匀的尺寸分布，并且是自发形成的。因此，这些胶束的优点在于容易管理胶束配制品的质量并且容易确保其可再现性。
为了提高siRNA的细胞内递送效率，已经开发了使用siRNA缀合物来确保siRNA的稳定性和增加siRNA的细胞膜渗透性的技术，所述siRNA缀合物是通过经由简单的共价键或接头介导的共价键将作为生物相容性聚合物的亲水性化合物(例如，聚乙二醇(PEG))与siRNA缀合而获得的(韩国专利号883471)。然而，即使当siRNA被化学修饰并且缀合到聚乙二醇(PEG)(聚乙二醇化)时，其仍具有低的体内稳定性以及不容易将其递送到靶器官中的缺点。为了克服这些缺点，已经开发了双链寡RNA结构，其包含与寡核苷酸，特别是双链寡RNA(诸如siRNA)结合的亲水性和疏水性化合物。此结构通过疏水性化合物的疏水性相互作用而形成称为SAMiRNATM(自组装胶束抑制性RNA)的自组装纳米颗粒(韩国专利号1224828)。SAMiRNATM技术相对于常规递送技术具有的优点是可以获得具有非常小的尺寸的均匀纳米颗粒。
具体地，在SAMiRNATM技术中，将PEG(聚乙二醇)或HEG(六乙二醇)用作亲水性化合物。PEG是合成聚合物，通常用于增加医用药物(特别是蛋白质)的溶解度并且调节药物的药代动力学。PEG是多分散材料，并且单批聚合物由不同数量的单体构成，并且因此显示出具有高斯曲线的分子量。此外，材料的均匀性表示为多分散指数(Mw/Mn)。换句话说，当PEG具有低分子量(3至5kDa)时，其显示出约1.01的多分散指数，而当PEG具有高分子量(20kDa)时，其显示出约1.2的高多分散指数，从而表明PEG的均匀性随其分子量的增加而降低。因此，当PEG与医用药物结合时，存在的缺点在于，PEG的多分散特性反映在缀合物上，并且因此不容易验证单一材料。由于这种缺点，已经改进了用于合成和纯化PEG的方法，以便产生具有低多分散指数的材料。然而，当PEG与具有低分子量的化合物结合时，存在与所述化合物的多分散特性相关的问题，包括不容易确认是否容易地实现结合的问题(FrancescoM.VDRUG DISCOVERY TODAY(2005)10(21):1451-1458)。
因此，近年来，已经通过以下方式改进了SAMiRNATM技术(即自组装纳米颗粒)：将双链RNA结构的亲水性化合物(构成SAMiRNATM)形成为基本单元嵌段，每个嵌段包含1至15个具有均匀分子量的单体；以及(如果需要)接头，使得根据需要使用合适数量的嵌段。因此，已经开发了与常规SAMiRNATM相比具有小尺寸和显著改善的多分散特性的新型递送系统技术。已经知道，当注射siRNA时，siRNA被存在于血液中的各种酶快速降解，并且因此将其递送到靶细胞或组织的效率很差。因此，改进的SAMiRNATM中也出现稳定性和表达抑制率的变化，取决于靶基因。因此，为了使用由改进的自组装纳米颗粒构成的SAMiRNATM更稳定且有效地抑制靶基因的表达，本发明诸位发明人已试图通过应用双链寡核苷酸来增强对靶基因的表达抑制作用和SAMiRNATM的稳定性，所述双链寡核苷酸包含作为指导(有义)链的ASO的DNA序列和作为随从(反义有义)序列的RNA序列。
特发性肺纤维化(在下文中称为“IPF”)是纤维化的一种类型，是这样的疾病，其中慢性炎症细胞穿透小泡(肺泡)壁，引起使肺僵硬的各种变化，导致肺组织的各种严重结构变化并且逐渐降低肺功能，从而导致死亡。迄今为止，对于IPF尚无有效的治疗方法。一旦出现IPF症状并且患者被诊断出患有IPF，则患者的平均存活时间仅为约3至5年。因此，IPF是预后非常差的疾病。据报道，在外国IPF的发病率为每100,000人中约3至5人，并且已知的是，IPF的发病率在50岁以后通常更高，并且男性的发病率是女性的两倍。
尽管IPF的病因尚未明确鉴定，但据报道吸烟者中IPF的发病率高，并且抗抑郁药、胃食管反流引起的慢性肺吸入、胃食管反流引起的慢性肺吸入、金属粉尘、木粉、溶剂吸入等是与IPF发生相关的风险因素。然而，在大多数患者中，没有明确的病因因素被报道。至于最常提到的因素，已知当Th1/Th2反应、凝血级联等无论出于何种原因被激活时，从而分泌纤维化细胞因子，并且激活的细胞因子刺激成纤维细胞并且增加ECM(细胞外基质)，从而导致肺纤维化。当然，这个过程伴随着肺部炎症，这可能导致肺部纤维化，但近年来，认为这个过程可以直接导致肺部纤维化而不考虑肺部炎症的观点更占主导地位。最近的假设是，在伤口愈合期间由于上皮-间质相互作用中的异常信号传导系统，发生病理性肺纤维化。当上皮细胞受损时，上皮细胞的凋亡增加、上皮细胞的迁移受到限制、上皮细胞的迁移分化不受调节、增殖受到抑制，并且分泌可溶性因子(TGF、HGF、KGF、血管紧张素II、ROS等)。此外，在这种情况下，间充质细胞的凋亡与ECM一起受到抑制。间充质细胞的凋亡被抑制，从而导致成纤维细胞的分化增加，并且通过ECM沉积引起肺纤维化，或导致上皮细胞的再刺激。换句话说，不能认为肺部炎症直接导致肺纤维化，但这意味着在愈合恢复正常组织的过程中，由于IPF患者与正常人之间的差异，首先发生肺部炎症，并且然后发生肺纤维化。此外，IPF可能由Th1/Th2细胞因子的失衡引起。Th1细胞因子反应与细胞介导的免疫有关，所述细胞介导的免疫将受损的组织区域恢复到正常组织，而Th2细胞因子通过成纤维细胞的激活和增殖引起ECM沉积和纤维化。据报道，当将IFN-γ给予博莱霉素诱导的肺纤维化模型时，它可以通过减少TGF-β和前胶原的mRNA来预防肺纤维化。然而，由于肺纤维化的病因学不是确切已知的，因此必须鉴定引起纤维化的初始致病因素，并且开发可以抑制与IPF和TGF-β信号传导系统相关的基因的物质。
已知的是，当不治疗IPF时，IPF持续恶化，从而导致多于50％的患者在3至5年内死亡。此外，一旦随着疾病的进展，肺因纤维化而完全硬化，则无论进行哪种类型的治疗，患者都不会改善。因此，据预测，当在早期治疗IPF时，治疗有效的可能性将很高。使用类固醇与硫唑嘌呤或环磷酰胺的组合进行IPF治疗的方法是已知的，但似乎没有特别的特殊作用。此外，已经在动物实验和小组患者中尝试了各种纤维化抑制剂，但尚未清楚地证明其作用。特别地，对于晚期IPF的患者，除了肺移植之外，没有有效的治疗方法。因此，迫切需要开发用于治疗IPF的更有效的药剂。
纤维化是指其中由于某种原因结缔组织过度纤维化而使组织或器官变硬的疾病状态。其中发生纤维化的所有过程都遵循与其中疤痕愈合过程相同的路径，无论是在哪个区域。迄今为止，治愈纤维化症状的方法很少，并且已经开发和研究了治疗方法。有效的纤维化治疗剂可以应用于肝硬化、肝纤维化、骨髓纤维化、心肌纤维化、肾纤维化和肺纤维化，它们是纤维化的代表性类型，以及伴随纤维化的各种疾病，并且因此迫切需要有效的纤维化治疗剂。
同时，已知双调蛋白通过与表皮生长因子受体结合而激活上皮生长因子受体(EGFR)途径，并且参与细胞增殖。此外，已经公开了双调蛋白的表达可以被双调蛋白特异性siRNA抑制，所述双调蛋白特异性siRNA对某些类型的乳腺癌展现出治疗作用。此外，已经公开了使用针对双调蛋白的shRNA可以抑制炎性乳腺癌中的细胞渗透(Andrea Baillo,J.Cell Physiol.2011 226(10):2691-2701)，并且当使用双调蛋白特异性shRNA抑制双调蛋白表达时，暴露于烟草烟雾的小鼠的肺动脉重塑被抑制。已经公开了双调蛋白与气道平滑肌(ASM)增生和血管生成相关，并且过度分泌的表皮生长因子(EGF)和双调蛋白参与(尤其是)促进哮喘患者的气道重塑和急性哮喘后的组织重塑。
如上所解释，已经提出了将双调蛋白作为呼吸系统疾病和纤维化(特别是COPD和IPF)的治疗靶标的可能性，但用于双调蛋白的RNAi治疗剂及其递送技术的开发仍然不足，并且对于能够以高的效率和特异性抑制双调蛋白表达的双链寡核苷酸治疗剂及其递送技术的市场需求非常高。
因此，本发明诸位发明人选择双调蛋白作为与纤维化(包括IPF)相关的基因，选择靶向双调蛋白的双链寡核苷酸，并且还鉴定能够抑制双调蛋白表达的RNAi治疗剂和其递送载体，从而完成本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够以高效率非常特异性地抑制双调蛋白的双链寡核苷酸，优选包含RNA/RNA、DNA/DNA或DNA/RNA杂合序列的双链寡核苷酸；一种包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构；以及一种包含所述双链寡核苷酸结构的纳米颗粒。
本发明的另一个目的是提供一种用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的双链寡核苷酸；一种包含其的双链寡核苷酸结构；和/或一种包含所述双链寡核苷酸结构的纳米颗粒。
本发明的仍另一个目的是提供一种用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的方法，所述方法包括向需要预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的受试者给予用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的药物组合物的步骤。
本发明的又另一个目的是提供双链寡核苷酸、包含其的双链寡核苷酸结构、和/或包含所述双链寡核苷酸结构的纳米颗粒，用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的方法中。
本发明的仍又另一个目的是提供用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的方法的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供所述双链寡核苷酸、包含其的双链寡核苷酸结构、和/或包含所述双链寡核苷酸结构的纳米颗粒用于制造预防纤维化或呼吸系统疾病的药物的用途。
为了实现以上目的，本发明提供了一种双链寡核苷酸，其包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:1至14，更优选SEQ ID NO:10、11和12的任一种序列，所述反义链包含与其互补的序列。
本发明还提供了一种包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构，和一种包含所述双链寡核苷酸结构的纳米颗粒。
本发明还提供了一种用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的药物组合物，其包含：双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ IDNO:1至14，更优选SEQ ID NO:10、11和12的任一种序列，所述反义链包含与其互补的序列；或一种包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构；或一种包含所述双链寡核苷酸结构的纳米颗粒。
本发明还提供了一种用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的方法，所述方法包括向需要预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的受试者给予用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的药物组合物的步骤。
包含根据本发明的有义链和反义链的双链寡核苷酸(所述有义链包含选自SEQ IDNO:1至14，更优选SEQ ID NO:10、11和12的任一种序列，所述反义链包含与其互补的序列)、或包含所述双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构、或包含所述双链寡核苷酸结构的纳米颗粒可以非常有效地抑制双调蛋白表达，并且因此根据本发明的双链寡核苷酸、包含其的双链寡核苷酸结构、和包含所述双链寡核苷酸结构的纳米结构中的每一种均可以有效地用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病。
为实现以上目的而提供的优选双链寡核苷酸中包含的SEQ ID NO:10、11和12的序列如下：
5’-CACCTACTCTGGGAAGCGT-3’(SEQ ID NO:10)
5’-ACCTACTCTGGGAAGCGTG-3’(SEQ ID NO:11)
5’-CTGGGAAGCGTGAACCATT-3’(SEQ ID NO:12)
如本文所用，术语“双链寡核苷酸”旨在包括具有一般RNAi(RNA干扰)活性的所有材料，并且对于本领域技术人员将显而易见的是，编码双调蛋白的mRNA特异性双链寡核苷酸还包括双调蛋白特异性shRNA等。即，所述寡核苷酸可以是siRNA、shRNA或miRNA。
此外，对于本领域技术人员将显而易见的是，包含有义链和反义链的双调蛋白特异性siRNA或反义寡核苷酸(各自包含由有义链或与其互补的反义链中一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入产生的序列，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10、11和12的任一种序列)也包括在本发明的范围内，只要保持对双调蛋白的特异性。
在本发明中，有义或反义链可以独立地是DNA或RNA。此外，有义和反义链可以呈杂合体的形式，其中有义链是DNA并且反义链是RNA，或者有义链是RNA并且反义链是DNA。
在本发明中，SEQ ID NO:10、11和12以DNA的形式列出，但当使用RNA的形式时，SEQID NO:10、11和12的序列可以是与其对应的RNA序列，即其中T被U取代的序列。
此外，根据本发明的双链寡核苷酸不仅包括其中序列的有义链与双调蛋白基因的结合位点完全互补(完全匹配)的情况，而且还包括其中有义链与结合位点部分互补(错配)的情况，只要保持对双调蛋白的特异性。
根据本发明的双链寡核苷酸可以在一条或两条链的3’末端处包含突出物，所述突出物包含一个或多个未配对的核苷酸。
在本发明中，有义链或反义链可以优选地由19至31个核苷酸组成，但不限于此。
在本发明中，包含有义链和反义链的双链寡核苷酸可以对双调蛋白具有特异性，但不限于此，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10、11和12的任一种序列，所述反义链包含与其互补的序列。
在本发明中，双链寡核苷酸的有义链或反义链可以包含各种化学修饰，以便增加其体内稳定性或赋予核酸酶抗性并且减少非特异性免疫应答。化学修饰可以是选自但不限于以下的一种或多种化学修饰：其中一个或多个核苷酸中糖结构的2’碳位置处的OH基团被选自-CH3(甲基)、-OCH3(甲氧基)、胺(-NH2)、氟(-F)、-O-2-甲氧基乙基、-O-丙基、-O-2-甲基硫代乙基、-O-3-氨基丙基、-O-3-二甲基氨基丙基、-O-N-甲基乙酰胺基和-O-二甲基酰胺基氧乙基的任一种取代的修饰；其中核苷酸中糖结构中的氧被硫取代的修饰；将核苷酸之间的键修饰成选自硫代磷酸酯键、硼烷膦酸酯(boranophosphophate)键和甲基膦酸酯键的任一种键；修饰为PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)或UNA(解锁核酸)；以及修饰为DNA-RNA杂合体(Ann.Rev.Med.55,61-65 2004；US 5,660,985；US 5,958,691；US 6,531,584；US 5,808,023；US 6,326,358；US 6,175,001；Bioorg.Med.Chem.Lett.14:1139-1143,2003；RNA,9:1034-1048,2003；Nucleic Acid Res.31:589-595,2003；Nucleic Acids Research,38(17)5761-773,2010；Nucleic Acids Research,39(5):1823-1832,2011)。
在本发明中，可以将一个或多个磷酸酯基团，优选一至三个磷酸酯基团结合到双链寡核苷酸的反义链的5’末端。
在另一方面，本发明涉及一种包含由下式(1)表示的结构的双链寡核苷酸结构，其中A表示亲水性化合物，B表示疏水性化合物，X和Y各自独立地表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且R表示双链寡核苷酸。
在优选的实施方案中，包含根据本发明的双调蛋白特异性序列的双链寡核苷酸结构优选地具有由以下结构式(1)表示的结构：
A-X-R-Y-B结构式(1)
其中A表示亲水性化合物，B表示疏水性化合物，X和Y各自独立地表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且R表示双链寡核苷酸。
根据本发明的双链寡核苷酸优选地呈DNA-RNA杂合体、siRNA(短干扰RNA)、shRNA(短发夹RNA)或miRNA(微RNA)的形式，但不限于此，并且还可以包括可以充当miRNA拮抗剂的单链miRNA抑制剂。
在下文中，将以RNA为重点来描述根据本发明的双链寡核苷酸，但对于本领域技术人员将显而易见的是，本发明还可以应用于具有与本发明双链寡核苷酸相同特征的其他双链寡核苷酸。
更优选地，包含根据本发明的双调蛋白特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构具有由以下结构式(2)表示的结构：
其中A、B、X和Y如以上结构式(1)所定义，S表示双调蛋白特异性双链寡核苷酸的有义链，并且AS表示双调蛋白特异性双链寡核苷酸的反义链。
更优选地，包含双调蛋白特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构具有由以下结构式(3)或(4)表示的结构：
其中A、B、S、AS、X和Y如以上结构式(2)所定义，并且5’和3’分别表示双调蛋白特异性双链寡核苷酸的有义链的5’末端和3’末端。
亲水性化合物可以选自聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉，但不限于此。
对于本发明所属技术领域的技术人员将显而易见的是，可以将一至三个磷酸酯基团可以结合到包含如结构式(1)至结构式(4)所示的双调蛋白特异性siRNA的双链寡核苷酸RNA结构的反义链的5’末端，并且shRNA可以代替RNA使用。
以上结构式(1)至结构式(4)中的亲水性化合物优选地是分子量为200至10,000的聚合物化合物，更优选地是分子量为1,000至2,000的聚合物化合物。例如，作为亲水性聚合物化合物，优选使用非离子性亲水性聚合物化合物，诸如聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮或聚噁唑啉，但本公开文本不限于此。
特别地，结构式(1)至结构式(4)中的亲水性化合物(A)可以以如以下结构式(5)或(6)所示的亲水性嵌段的形式使用，并且可以根据需要使用合适数量(结构式(5)或(6)中的n)的此类亲水性嵌段，从而克服在使用一般合成聚合物化合物时可能发生的与多分散特性相关的问题：
(A’m-J)n结构式(5)
(J-A’m)n结构式(6)
其中A’表示亲水性单体，J表示将多个(m)亲水性单体连接在一起或将多个(m)亲水性单体与双链寡核苷酸连接的接头，m是范围从1至15的整数，n是范围从1至10的整数，并且由(A′m-J)或(J-Am′)表示的重复单元对应于亲水性嵌段的基本单元。
当使用如以上结构式(5)或(6)所示的亲水性嵌段时，包含根据本发明的双调蛋白特异性寡核苷酸的双链寡核苷酸结构可以具有由以下结构式(7)或(8)表示的结构：
(A’m-J)n-X-R-Y-B结构式(7)
(J-A’m)n-X-R-Y-B结构式(8)
其中X、R、Y和B如以上结构式(1)所定义，并且A’、J、m和n如以上结构式(5)和(6)所定义。
作为以上结构式(5)和(6)中的亲水性单体(A′)，可以使用但不限于选自非离子亲水性聚合物的一种，只要其与本发明的目的相容即可。优选地，可以使用选自下表1中所列出的化合物(1)至化合物(3)的单体。更优选地，可以使用化合物(1)的单体。在化合物(1)中，G可优选地选自O、S和NH。
特别地，在亲水性单体中，由化合物(1)表示的单体非常适合于生产根据本发明的结构，因为所述单体的优点在于可以将各种官能团引入到所述单体中，并且所述单体通过具有良好的体内亲和力和优异的生物相容性而诱导很少免疫反应，可以增加包含在由结构式(7)或(8)表示的结构中的双链寡核苷酸的体内稳定性，并且可以增加双链寡核苷酸的递送效率。
[表1]用于本发明的亲水性单体的结构
结构式(5)至结构式(8)中的亲水性化合物的总分子量优选地在1,000至2,000的范围内。因此，例如，当结构式(7)和结构式(8)中的化合物(1)是六乙二醇时，即，其中G是O并且m是6的化合物时，重复数量(n)优选地是3至5，因为六乙二醇空间的分子量为344。特别地，本发明的特征在于，可以根据需要使用合适数量(以n表示)的由结构式(5)和结构式(6)中的(A′m-J)或(J-A′m)n表示的亲水性基团(亲水性嵌段)的重复单元。每个亲水性嵌段中包含的亲水性单体J和接头J在亲水性嵌段之间可以是相同或不同的。换句话说，当使用3个亲水性嵌段(n＝3)时，可以分别在第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段中使用化合物(1)的亲水性单体、化合物(2)的亲水性单体和化合物(3)的亲水性单体，表明可以在所有亲水性嵌段中使用不同的单体。可替代地，选自化合物(1)至(3)的亲水性单体的任何一种亲水性单体也可用于所有亲水性嵌段中。类似地，作为介导亲水性单体键合的接头，可以在亲水性嵌段中使用相同的接头，或者还可以在亲水性嵌段中使用不同的接头。此外，亲水性单体的数量m在亲水性嵌段之间也可以是相同或不同的。换句话说，在第一亲水性嵌段中，连接三个亲水性单体(m＝3)，在第二亲水性嵌段中，连接五个亲水性单体(m＝5)，并且在第三亲水性嵌段中，连接四个亲水性单体(m＝4)，表明在亲水性嵌段中可以使用不同数量的亲水性单体。可替代地，也可以在所有亲水性嵌段中使用相同数量的亲水性单体。
此外，在本发明中，接头(J)优选地选自-PO3 --、-SO3-和-CO2-，但不限于此。对于本领域技术人员将显而易见的是，可以使用在考虑到所使用的亲水性单体的情况下而选择的任何接头，只要其与本发明的目的相容即可。
结构式(1)至结构式(4)、结构式(7)和结构式(8)中的疏水性化合物(B)的功能是通过疏水性相互作用形成由结构式(1)至结构式(4)、结构式(7)和结构式(8)所示的寡核苷酸结构构成的纳米颗粒。疏水性化合物优选地具有250至1,000的分子量，并且可以是选自类固醇衍生物、甘油酯衍生物、甘油醚、聚丙二醇、C12-C50不饱和或饱和烃、二酰基磷脂酰胆碱、脂肪酸、磷脂、脂多胺、脂质、生育酚和生育三烯酚的任一种，但不限于此。对于本领域技术人员将显而易见的是，可以使用任何疏水性化合物，只要其与本发明的目的相容即可。
类固醇衍生物可以选自胆固醇、胆甾烷醇、胆酸、胆甾醇基甲酸酯、胆甾烷基甲酸酯和胆甾烷基胺，并且甘油酯衍生物可以选自甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯等。在此，甘油酯的脂肪酸优选地为C12-C50不饱和或饱和脂肪酸。
特别地，在疏水性化合物中，优选地使用饱和或不饱和烃或胆固醇，因为其可以在根据本发明的双链寡核苷酸结构的合成步骤中容易地结合。最优选地，使用C24烃，特别是含有二硫键的疏水性烃。
疏水性化合物可以结合到亲水性化合物的远端，并且可以结合到双链寡核苷酸的有义链或反义链上的任何位置。
根据本发明的结构式(1)至(4)、(7)和(8)中的亲水性化合物或疏水性化合物通过单共价键或接头介导的共价键(X或Y)与双调蛋白特异性寡核苷酸结合。介导共价键的接头在双调蛋白特异性寡核苷酸的末端处共价键合到亲水性或疏水性化合物，并且没有特别的限制，只要如果需要，其在特定环境中提供可降解键即可。因此，本发明中使用的接头可以是在根据本发明的双链寡核苷酸结构的生产过程中，为了激活双调蛋白寡核苷酸和/或亲水性(或疏水性)化合物而结合的任何化合物。共价键可以是不可降解键和可降解键中的任一种。在此，不可降解键的例子包括但不限于酰胺键和磷酸键，并且可降解键的例子包括但不限于二硫键、酸可降解键、酯键、酸酐键、可生物降解的键和酶可降解键。
此外，作为结构式(1)至(4)、(7)和(8)中由R(或S和AS)表示的双调蛋白特异性双链寡核苷酸，可以使用但不限于具有特异性结合双调蛋白mRNA的特性的任何双链寡核苷酸。优选地，根据本发明的双调蛋白特异性双链寡核苷酸包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10、11和12的任一种序列，所述反义链包含与所述有义链的序列互补的序列。
此外，在包含根据本发明的双调蛋白特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构中，可以将胺或多组氨酸基团另外引入到与所述结构中的寡核苷酸结合的亲水性化合物的远端。
这促进了包含双链寡核苷酸结构的载体的细胞内摄取和内体逃逸，所述双链寡核苷酸结构包含根据本发明的双调蛋白特异性双链寡核苷酸，并且已经报道了引入胺基和多组氨酸基团可以用于促进载体(诸如量子点、树状聚合物或脂质体)的细胞内摄取和内体逃逸。
具体地，已知引入到载体末端或外部的伯胺基团在生物学pH下被质子化，同时通过与带负电荷的基因相互作用形成缀合物，并且由于细胞内摄取后在低pH下具有缓冲作用的内部叔胺，促进了内体逃逸，由此可以保护载体免受溶酶体降解(Gene Delivery andExpression Inhibition Using Polymer-Based Hybrid Material,PolymerSci.Technol.,第23卷,第3期,第254-259页)。
此外，已知组氨酸(非必需氨基酸)在其残基(-R)处具有咪唑环(pKa＝6.04)，并且因此具有增加在内体和溶酶体中的缓冲能力的作用，并且因此组氨酸修饰可以用于非病毒基因载体(包括脂质体)，以便增加内体逃逸效率(Novel histidine-conjugatedgalactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte selective genetransfer in human hepatoma HepG2 cells.J.Controlled Release 118,第262-270页)。
胺基或多组氨酸基团可以通过一个或多个接头与亲水性化合物或亲水性嵌段连接。
当将胺基或多组氨酸基团引入到由根据本发明的结构式(1)表示的双链寡核苷酸结构的亲水性化合物时，RNA结构可以具有以下结构式(9)所示的结构：
P-J1-J2-A-X-R-Y-B结构式(9)
其中A、B、R、X和Y如以上结构式(1)所定义，
P表示胺基或多组氨酸基团，并且J1和J2是接头，其各自可以独立地选自简单的共价键、PO3 -、SO3、CO2、C2-12烷基、烯基和炔基，但不限于此。对于本领域技术人员将显而易见的是，在考虑到本文所使用的亲水性化合物的情况下而选择的任何接头都可以用作J1和J2，只要它们与本发明的目的相容即可。
优选地，当引入胺基时，J2是简单的共价键或PO3 -，并且J1是C6烷基，但本发明不限于此。
此外，当引入多组氨酸基团时，优选的是结构式(9)中的J2是简单的共价键或PO3 -，并且J1是化合物(4)，但本发明不限于此。
此外，当结构式(9)所示的双链寡核苷酸结构的亲水性化合物是由结构式(5)或(6)表示的亲水性嵌段并且向其引入胺基或多组氨酸基团时，双链寡核苷酸结构可以具有由以下结构式(10)或(11)表示的结构：
P-J1-J2-(A’m-J)n-X-R-Y-B结构式(10)
P-J1-J2-(J-A’m)n-X-R-Y-B结构式(11)
其中X、R、Y、B、A’、J、m和n如以上结构式(5)或(6)所定义，并且P、J1和J2如结构式(9)所定义。
特别地，结构式(10)和结构式(11)中的亲水性化合物优选地结合到双调蛋白特异性双链寡核苷酸的有义链的3’末端。在这种情况下，结构式(9)至结构式(11)可以对应于以下结构式(12)至结构式(14)：
其中X、R、Y、B、A、A′、J、m、n、P、J1和J2如以上结构式(9)至结构式(11)所定义，并且5’和3’表示双调蛋白特异性双链寡核苷酸的有义链的5’末端和3’末端。
可以在本发明中引入的胺基可以是伯、仲或叔胺基团。特别地，优选地使用伯胺基团。引入的胺基可以作为胺盐的形式存在。例如，伯胺基团的盐可以作为NH3 +的形式存在。
此外，可以在本发明中引入的多组氨酸基团优选地包含3至10个组氨酸，更优选5至8个组氨酸，并且最优选6个组氨酸。除组氨酸之外，还可以包括一个或多个半胱氨酸。
同时，当在包含根据本发明的双调蛋白特异性寡核苷酸的双链寡核苷酸结构和由其形成的纳米颗粒中提供靶向部分时，它可以促进RNA结构向靶细胞的有效递送，使得RNA结构甚至可以以相对低的浓度递送到靶细胞，因此展现出调节靶基因表达的强作用。此外，靶向部分可以防止双调蛋白特异性双链寡核苷酸向其他器官和细胞的非特异性递送。
因此，本发明提供了一种双链寡RNA结构，其中配体(L)，特别是具有特异性结合到通过受体介导的内吞作用(RME)增强靶细胞内化的受体的特性的配体，进一步结合到由结构式(1)至(4)、(7)和(8)中任一个表示的结构。例如，其中配体与由结构式(1)表示的双链寡RNA结构结合的结构具有以下结构式(15)所示的结构：
(Li-Z)-A-X-R-Y-B结构式(15)
其中A、B、X和Y如以上结构式(1)所定义，L是具有特异性结合到通过受体介导的内吞作用(RME)增强靶细胞内化的受体的特性的配体，并且“i”是范围从1至5，优选从1至3的整数。
结构式(15)中的配体可以优选地选自：具有增强靶细胞内化的RME特性的靶受体特异性抗体、适体和肽；叶酸盐(术语“叶酸盐(folate)”通常与叶酸(folic acid)互换使用，并且如本文所用的术语“叶酸盐”意指呈天然形式或在人体中激活的叶酸)；和化学化合物，包括己糖胺，诸如N-乙酰基半乳糖胺(NAG)，以及糖或碳水化合物，诸如葡萄糖和甘露糖，但不限于此。
此外，以上结构式(15)中的亲水性化合物(A)可以以由结构式(5)或(6)表示的亲水性嵌段的形式使用。
在另一方面，本发明提供了一种用于生产包含双调蛋白特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构的方法。
例如，根据本发明的用于生产包含双调蛋白特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构的方法可以包括以下步骤：
(1)将亲水性化合物结合到固体支持物；
(2)在结合亲水性化合物的固体支持物上合成寡核苷酸单链；
(3)将疏水性化合物共价结合到寡核苷酸单链的5’末端；
(4)合成具有与步骤(2)的寡核苷酸单链的序列互补的序列的寡核苷酸单链；
(5)在合成完成后，从固体支持物分离并且纯化寡核苷酸-聚合物结构和寡核苷酸单链；以及
(6)用具有互补序列的寡核苷酸单链退火产生的寡核苷酸-聚合物结构，从而产生双链寡核苷酸结构。
本发明中使用的固体支持物优选地是控孔玻璃(CPG)，但不限于此，并且还可以使用聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、硅胶、纤维素纸等。当使用CPG时，其优选地具有40至180μm的直径和500至的孔径。在步骤(5)之后，可以使用MALDI-TOF质谱仪测量所产生和纯化的RNA-聚合物结构和寡核苷酸单链的分子量，以便确认获得了所希望的寡核苷酸-聚合物结构和寡核苷酸单链。在以上生产方法中，合成具有与步骤(2)中合成的寡核苷酸单链的序列互补的序列的寡核苷酸单链的步骤(4)可以在步骤(1)之前或在步骤(1)至(5)的任一个步骤期间进行。
此外，具有与步骤(2)中合成的寡核苷酸单链的序列互补的序列的寡核苷酸单链可以以磷酸酯基团结合到寡核苷酸单链的5’末端的状态使用。
同时，本发明提供了一种用于生产双链寡核苷酸结构的方法，其中配体进一步结合到包含双调蛋白特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构。
例如，所述用于生产包含双调蛋白特异性双链寡核苷酸的配体结合的双链寡核苷酸结构的方法可以包括以下步骤：
(1)将亲水性化合物结合到具有与其结合的官能团的固体支持物；
(2)在具有与其结合的官能团和亲水性化合物的固体支持物上合成寡核苷酸单链；
(3)将疏水性化合物共价结合到寡核苷酸单链的5’末端；
(4)合成具有与步骤(2)中合成的寡核苷酸单链的序列互补的序列的寡核苷酸单链；
(5)在合成完成后，从固体支持物分离官能团-寡核苷酸-聚合物结构和具有互补序列的寡核苷酸单链；
(6)通过官能团将配体与亲水性化合物的末端结合，以产生配体-寡核苷酸-聚合物结构单链；以及
(7)用具有互补序列的寡核苷酸单链退火产生的配体-寡核苷酸-聚合物结构，从而产生配体/双链寡核苷酸结构。
在步骤(6)之后，可以分离并且纯化产生的配体-寡核苷酸-聚合物结构和具有互补序列的寡核苷酸单链，并且然后可以使用MALDI-TOF质谱仪测量其分子量，以便确认产生了所希望的配体-RNA-聚合物结构和所希望的具有互补序列的RNA单链。通过用具有互补序列的寡核苷酸单链退火产生的配体/RNA-寡核苷酸结构，可以产生配体/双链-寡核苷酸结构。在以上生产方法中，合成具有与步骤(3)中合成的寡核苷酸单链的序列互补的序列的寡核苷酸单链的步骤(4)可以在步骤(1)之前或在步骤(1)至(6)的任一个步骤期间进行。
在仍另一方面，本发明涉及一种包含根据本发明的双链寡核苷酸结构的纳米颗粒。根据本发明的双链寡核苷酸通过疏水性化合物的疏水性相互作用形成自组装的纳米颗粒(韩国专利号1224828)。这些纳米颗粒具有优异的体内递送效率和体内稳定性。此外，纳米颗粒的高粒度均匀性使质量控制(QC)容易，并且因此将这些纳米颗粒制备为药物的方法是容易的。
在本发明中，纳米颗粒还可以由包含含有不同序列的双链结构的双链寡核苷酸结构的混合物构成。例如，纳米颗粒可以包含一种双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10至12的任一种序列，所述反义链包含与其互补的序列；然而，在另一个实施方案中，纳米颗粒可以包含不同种类的双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其各自包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10至12的任一种序列，所述反义链包含与其互补的序列，并且还可以包含未在本发明中公开的双调蛋白特异性双链寡核苷酸。
在仍另一个方面，本发明涉及一种用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的药物组合物，所述药物组合物含有作为活性成分的根据本发明的双链寡核苷酸、双链寡核苷酸结构、或包含双链寡核苷酸结构的纳米颗粒。
根据本发明的用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的药物组合物通过抑制结缔组织重塑，特别是肺动脉重塑和气道重塑而展现出预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的作用。
在本发明中，呼吸系统疾病可以是慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、急性和慢性支气管炎、过敏性鼻炎、咳嗽、痰、支气管炎、细支气管炎、咽喉痛、扁桃体炎或喉炎，并且纤维化可以选自特发性肺纤维化(IPF)、肝纤维化、肝硬化、骨髓纤维化、心肌纤维化、肾纤维化、肺纤维化、心脏纤维化和辐射诱导的纤维化，但本发明不限于此。在本发明中，辐射诱导的纤维化是经常由通常用于治疗癌症、肿瘤等的放射疗法引起的副作用，并且术语“辐射诱导的纤维化”可以与术语“辐射纤维化综合征(RFS)”互换使用。
对于给予，除上述活性成分之外，本发明的组合物还可以进一步含有一种或多种药学上可接受的载体。药学上可接受的载体应与所述活性成分相容，并且可以选自生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及其两种或更多种的混合物。如果需要，则所述组合物可以含有其他常规添加剂，诸如抗氧化剂、缓冲剂或细菌抑制剂。此外，可以将稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂另外添加到组合物中以制备可注射配制品(诸如水性溶液、悬浮液和乳液)。特别地，所述组合物优选地作为冻干配制品提供。为了制备冻干配制品，可以使用本发明所属技术领域中已知的常规方法，并且还可以添加用于冻干的稳定剂。此外，所述组合物可以优选地通过本领域已知的合适方法或通过Remington’sPharmaceutical Science,Mack Publishing Company,Easton PA中公开的方法根据各种疾病或组分来配制。
本发明的组合物的剂量可以由本领域技术人员基于患者的状况和疾病的严重程度来确定。此外，所述组合物可以被配制成各种剂型，包括粉剂、片剂、胶囊剂、液体剂、注射溶液、软膏剂和糖浆配制品，并且可以在单位剂量或多剂量容器(例如密封的安瓿或小瓶)中提供。
本发明的组合物可以口服或肠胃外给予。根据本发明的组合物可以例如通过口服、经由吸入、静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、透皮、皮下、腹膜内、直肠内、舌下或局部给予，但不限于此。特别地，还可以通过支气管内滴注将组合物给予肺中以治疗呼吸系统疾病。根据本发明的组合物的剂量可以根据患者的体重、年龄、性别、健康状况和饮食、给予持续时间、给予方式、排泄率、疾病严重程度等而变化，并且可以由本领域技术人员容易地确定。此外，对于临床给予，可以使用已知技术将本发明的组合物制备成合适的配制品。
在另一方面，本发明涉及一种包含根据本发明的药物组合物的冻干配制品。
在仍另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的方法，所述方法包括向需要预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的受试者给予根据本发明的用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的药物组合物的步骤。
在本发明中，呼吸系统疾病可以是慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、急性和慢性支气管炎、过敏性鼻炎、咳嗽、痰、支气管炎、细支气管炎、咽喉痛、扁桃体炎或喉炎，并且纤维化可以选自特发性肺纤维化(IPF)、肝纤维化、肝硬化、骨髓纤维化、心肌纤维化、肾纤维化、肺纤维化、心脏纤维化和辐射诱导的纤维化，但本发明不限于此。
在又另一方面，本发明涉及提供双链寡核苷酸、包含其的双链寡核苷酸结构和包含所述双链寡核苷酸结构的纳米颗粒，用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的方法中。
在仍又另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的方法中的药物组合物。
在另一方面，本发明涉及所述双链寡核苷酸、包含其的双链寡核苷酸结构和包含所述双链寡核苷酸结构的纳米颗粒用于制造预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的药物的用途。
具体地，本发明包括但不限于如下各项：
1.一种双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其包含有义链和反义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:10、11和12的任一种序列，所述反义链包含与其互补的序列。
2.根据项1所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其中所述有义链或所述反义链由19至31个核苷酸组成。
3.根据项1所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是siRNA、shRNA或miRNA。
4.根据项1所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其中所述有义或反义链独立地是DNA或RNA。
5.根据项1所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其中所述双链寡核苷酸的有义链或反义链包含化学修饰。
6.根据项5所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其中所述化学修饰是选自以下的任何一种或多种：
其中核苷酸中糖结构的2’碳位置处的羟基(OH)基团被选自-CH3(甲基)、-OCH3(甲氧基)、胺(-NH2)、氟(-F)、-O-2-甲氧基乙基、-O-丙基、-O-2-甲基硫代乙基、-O-3-氨基丙基、-O-3-二甲基氨基丙基、-O-N-甲基乙酰胺基和-O-二甲基酰胺基氧乙基的任一种取代的修饰；
其中核苷酸中糖结构中的氧被硫取代的修饰；
将核苷酸之间的键修饰成选自硫代磷酸酯键、硼烷膦酸酯键和甲基膦酸酯键的任一种键；以及
修饰为PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)或UNA(解锁核酸)。
7.根据项1所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸，其中一个或多个磷酸酯基团结合到所述双链寡核苷酸的反义链的5’末端。
8.一种双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其包含由以下结构式1表示的结构：
[结构式(1)]
A-X-R-Y-B
其中A表示亲水性化合物，B表示疏水性化合物，X和Y各自独立地表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且R表示根据项1至7中任一项所述的双链寡核苷酸。
9.根据项8所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其中所述寡核苷酸结构包含由以下结构式(2)表示的结构：
[结构式(2)]
其中S和AS分别表示根据项8所述的双链寡核苷酸的有义链和反义链。
10.根据项9所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其中寡核苷酸结构包含由以下结构式(3)或(4)表示的结构：
[结构式(3)]
[结构式(4)]
其中A、B、X、Y、S和AS如项9所定义，并且5’和3’分别表示所述双链寡核苷酸的有义链的5’末端和3’末端。
11.根据项8所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其中所述亲水性化合物选自聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉。
12.根据项8所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其中所述亲水性化合物具有由以下结构式(5)或(6)表示的结构：
[结构式(5)]
(A’m-J)n
[结构式(6)]
(J-A’m)n
其中A’表示亲水性单体，J表示将多个(m)亲水性单体连接在一起或将多个(m)亲水性单体与所述双链寡核苷酸连接的接头，m是范围从1至15的整数，n是范围从1至10的整数，所述亲水性单体(A’)是选自以下化合物(1)至化合物(3)的任一种化合物，并且所述接头(J)选自-PO3 --、-SO3-和-CO2-：
化合物(1)
其中G选自O、S和NH；
化合物(2)
化合物(3)
13.根据项12所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其中所述寡核苷酸结构具有由以下结构式(7)或(8)表示的结构：
[结构式(7)]
(A’m-J)n-X-R-Y-B
[结构式(8)]
(J-A’m)n-X-R-Y-B
14.根据项8所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其中所述亲水性化合物的分子量为200至10,000。
15.根据项8所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其中所述疏水性化合物的分子量为250至1,000。
16.根据项15所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其中所述疏水性化合物是选自类固醇衍生物、甘油酯衍生物、甘油醚、聚丙二醇、C12-C50不饱和或饱和烃、二酰基磷脂酰胆碱、脂肪酸、磷脂、脂多胺、脂质、生育酚和生育三烯酚的任一种。
17.根据项16所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其中所述类固醇衍生物是选自胆固醇、胆甾烷醇、胆酸、胆甾醇基甲酸酯、胆甾烷基甲酸酯和胆甾烷基胺的任一种。
18.根据项16所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其中所述甘油酯衍生物是选自甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的任一种。
19.根据项8所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其中由X和Y表示的所述共价键是不可降解键或可降解键。
20.根据项19所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其中所述不可降解键是酰胺键或磷酸酯键。
21.根据项19所述的双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构，其中所述可降解键是选自二硫键、酸可降解键、酯键、酸酐键、生物可降解键或酶可降解键的任一种。
22.一种纳米颗粒，其包含根据项8至21中任一项所述的双链寡核苷酸。
23.根据项22所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒由包含具有不同序列的双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构的混合物构成。
24一种用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的根据项1至7中任一项所述的双链寡核苷酸或根据项8至21中任一项所述的双链寡核苷酸结构。
25.一种用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的药物组合物，所述药物组合物包含根据项22所述的纳米颗粒作为活性成分。
26.根据项24所述的药物组合物，其中所述呼吸系统疾病是选自慢性阻塞性疾病(COPD)、哮喘、急性和慢性支气管炎、过敏性鼻炎、咳嗽、痰、支气管炎、细支气管炎、喉咙痛、扁桃体炎和喉炎的任一种。
27.根据项24所述的药物组合物，其中所述纤维化是选自特发性肺纤维化(IPF)、肝纤维化、肝硬化、骨髓纤维化、心肌纤维化、肾纤维化、肺纤维化、心脏纤维化、和辐射诱导的纤维化的任一种。
28.根据项25所述的药物组合物，其中所述呼吸系统疾病是选自慢性阻塞性疾病(COPD)、哮喘、急性和慢性支气管炎、过敏性鼻炎、咳嗽、痰、支气管炎、细支气管炎、喉咙痛、扁桃体炎和喉炎的任一种。
29.根据项25所述的药物组合物，其中所述纤维化是选自特发性肺纤维化(IPF)、肝纤维化、肝硬化、骨髓纤维化、心肌纤维化、肾纤维化、肺纤维化、心脏纤维化、和辐射诱导的纤维化的任一种。
30.一种冻干配制品，其包含根据项24所述的用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的药物组合物。
31.一种冻干配制品，其包含根据项25所述的用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的药物组合物。
附图说明
图1示出了筛选靶向人双调蛋白的1,257个SAMiRNA的结果。
图2示出了包含选择的双调蛋白特异性双链寡核苷酸的双链DNA/RNA杂合体的纳米颗粒尺寸分布。(a)：SAMi-AREG#10，(b)：SAMi-AREG#11，和(c)：SAMi-AREG#12。
图3示出了定量分析实施例4中双调蛋白的mRNA表达水平的结果，并且描绘了示出肺癌细胞系A549中双调蛋白的相对mRNA表达水平(％)的图，所述肺癌细胞系具有不同浓度(200和600nM)的具有本发明的SEQ ID NO:1至14中的每种序列作为有义链的SAMiRNA。
图4示出了定量分析实施例5中双调蛋白mRNA的表达水平的结果，并且描绘了示出分析肺癌细胞系A549中双调蛋白的相对mRNA表达水平(％)(图4(a))和确定所述肺癌细胞系中SAMiRNA的IC50值(图4(b))的图，所述肺癌细胞系用不同浓度(12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM、600nM和1,200nM)的具有本发明的SEQ ID NO:10的序列作为有义链的SAMiRNA处理。
图5示出了定量分析实施例5中双调蛋白mRNA的表达水平的结果，并且描绘了示出分析肺癌细胞系A549中双调蛋白mRNA的相对表达水平(％)(图5(a))和确定所述肺癌细胞系中SAMiRNA的IC50值(图5(b))的结果的图，所述肺癌细胞系用不同浓度(12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM、600nM和1,200nM)的具有本发明的SEQ ID NO:11的序列作为有义链的SAMiRNA处理。
图6示出了定量分析实施例5中双调蛋白mRNA的表达水平的结果，并且描绘了示出分析肺癌细胞系A549中双调蛋白mRNA的相对表达水平(％)(图6(a))和确定所述肺癌细胞系中SAMiRNA的IC50值(图6(b))的结果的图，所述肺癌细胞系用不同浓度(12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM、600nM和1,200nM)的具有本发明的SEQ ID NO:12的序列作为有义链的SAMiRNA处理。
图7示出了实施例6中针对双调蛋白候选序列的先天免疫应答测试的结果，并且描述了通过以下方式获得的结果：用2.5μM双调蛋白特异性SAMiRNA处理人外周血单核细胞(PBMC)，所述双调蛋白特异性SAMiRNA具有本发明的SEQ ID NO:10(AR-1)、11(AR-2)和12(AR-3)中的每种序列作为有义链，通过双调蛋白特异性SAMiRNA分析先天免疫相关细胞因子的mRNA表达水平的相对增加，并且使用人外周血单核细胞评估体外细胞毒性。(a)：DNA/RNA杂合SAMiRNA，和(b)：RNA/RNA杂合SAMiRNA。
图8示出了定量分析实施例7中的双调蛋白的mRNA表达水平的结果，并且是比较通过各自包含选择的双调蛋白特异性SAMiRNA的双链寡DNA/RNA杂合体和RNA/RNA杂合体而导致的双调蛋白的相对mRNA表达水平(％)的图。即，图8是比较肺癌细胞系A549中双调蛋白的mRNA表达水平的图，所述肺癌细胞系用不同浓度(200nM、600nM和1,200nM)的具有本发明的SEQ ID NO:10(AR-1)、11(AR-2)和12(AR-3)中的每种序列作为有义链的SAMiRNA处理。
图9示出了筛选237个靶向小鼠双调蛋白的SAMiRNA的结果(图9(a))，以及从其中选择的9个候选序列(图9(b))。
图10A示出了定量分析实施例8中小鼠双调蛋白的mRNA表达水平的结果，并且是示出小鼠肺成纤维细胞系MLg中双调蛋白的相对mRNA表达水平(％)的图，所述小鼠肺成纤维细胞系用不同浓度(200和500nM)的具有本发明的SEQ ID NO:19、20和21中的每种序列作为有义链的SAMiRNA处理。
图10B示出了定量分析实施例8中小鼠双调蛋白的mRNA表达水平的结果，并且是示出小鼠肺上皮细胞系LA-4中双调蛋白的相对mRNA表达水平(％)的图，所述小鼠肺上皮细胞系用不同浓度(200、500和1000nM)的具有本发明的SEQ ID NO:19、20和21中的每种序列作为有义链的SAMiRNA处理。
图11描绘了示出在实施例9中向患有二氧化硅诱导的肺纤维化的小鼠静脉内给予1mg/kg和5mg/kg的SAMiRNA-AREG#20后，肺组织染色的结果和靶基因和纤维化标记基因的相对mRNA表达水平(％)的图。
图12描绘了示出在实施例10中向患有博莱霉素诱导的肺纤维化的小鼠静脉内给予5mg/kg的SAMiRNA-AREG#20后，肺组织染色的结果和靶基因和纤维化标记基因的相对mRNA表达水平(％)的图。
图13描绘了示出在实施例11中向经受UUO手术的UUO模型小鼠静脉内给予1mg/kg和5mg/kg的SAMiRNA-AREG#20后，肾组织中的靶基因、纤维化标记基因和炎症标记基因的相对mRNA表达水平(％)的图。
具体实施方式
在下文中，将参考实施例更加详细地描述本发明。对于本领域技术人员将显而易见的是，这些实施例仅用于更详细地解释本发明，并且本发明的范围不受这些实施例的限制。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物来限定。
在本发明中，鉴定了能够抑制双调蛋白表达的三种特异性序列，并且证实这些序列可以与编码双调蛋白的mRNA互补地结合并且有效地抑制双调蛋白表达，从而有效地治疗纤维化和呼吸系统疾病。
实施例1.用于筛选靶向双调蛋白的SAMiRNA的算法和候选序列的选择
基于SAMiRNA的药物高通量筛选是这样的方法，其中通过对整个mRNA应用1碱基或2碱基滑动窗口算法产生所有可能的候选序列，通过进行同源性过滤去除不必要的候选序列，并且确定感兴趣的基因的表达被所有最终选择的SAMiRNA抑制的程度。
首先，进行针对双调蛋白的SAMiRNA候选序列的设计过程。具体地，通过对人双调蛋白mRNANM_001657.3(1,290bp)应用1碱基滑动窗口算法，选择各自由19个核苷酸组成的1,257个SAMiRNA候选序列，并且进行对双调蛋白的抑制程度的实验。
实施例2.双链寡RNA结构的合成
本发明中产生的双链寡RNA结构(SAMiRNA)由以下结构式表示：
C24-5’S3’-(六乙二醇-PO4 -)3-六乙二醇
AS 5’-PO4
为了合成monoSAMiRNA(n＝4)双链寡核苷酸结构的有义菌株，将3,4,6-三乙酰基-1-六(乙二醇)-N-乙酰基半乳糖胺-CPG用作支持物，并且通过反应将作为亲水性单体的三个去甲氧基三苯甲基(DMT)六乙二醇氨基磷酸酯连续结合到支持物。接下来，进行RNA或DNA的合成，并且然后将含有二硫键的疏水性C24(C6-S-S-C18)结合到5’末端区域，从而合成monoSAMiRNA(n＝4)的有义链，其中NAG-六乙二醇-(-PO3 -六乙二醇)3结合到3’末端，并且C24(C6-S-S-C18)结合到5’末端。
在合成完成后，通过在60℃水浴中用28％(v/v)氨处理，将合成的RNA单链和寡(DNA或RNA)-聚合物结构从CPG分离，并且然后通过去保护反应去除保护残基。在去除保护残基后，在70℃的烘箱中，用体积比为10:3:4的N-甲基吡咯烷酮、三甲胺和三乙胺三氢氟化物处理RNA单链和寡(DNA或RNA)-聚合物结构，以去除2′-TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)。通过高效液相色谱(HPLC)从反应产物分离RNA单链、寡(DNA或RNA)-聚合物结构和配体结合的寡(DNA或RNA)-聚合物结构，并且通过MALDI-TOF质谱分光光度计(MALDI TOF-MS，SHIMADZU，日本)测量其分子量，以确认它们是否与希望合成的核苷酸序列和聚合物结构匹配。此后，为了产生每个双链寡核苷酸结构，将有义链和反义链混合在一起，添加到1X退火缓冲液(30mM HEPES、100mM乙酸钾、2mM乙酸镁，pH 7.0至7.5)中，允许在90℃的水浴中反应3分钟，并且然后允许在37℃下反应，从而产生所希望的SAMiRNA。通过电泳确认产生的双链寡RNA结构的退火。
实施例3.靶向人双调蛋白并且诱导RNAi的SAMiRNA纳米颗粒的高通量筛选(HTS)
3-1SAMiRNA纳米颗粒的产生
将实施例2中合成的1,257个靶向双调蛋白序列的SAMiRNA溶解在1X杜尔贝科(Dulbecco)磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(WELGENE，KR)中，并且在冷冻干燥器(LGJ-100F，CN)中冷冻干燥5天。将冷冻干燥的纳米颗粒粉末溶解在1.429ml去离子蒸馏水(Bioneer，KR)中并且均质化，并且用于本发明的实验中。
3-2用SAMiRNA纳米颗粒处理细胞
为了鉴定抑制双调蛋白表达的SAMiRNA，使用人肺癌细胞系A549。将A549细胞系在含有10％胎牛血清(Hyclone，US)和1％青霉素-链霉素(Hyclone，US)的GibcoTMHam’s F-12K(Kaighn)培养基(Thermo，US)中于37℃在5％ CO2下培养。使用与以上相同的培养基，将A549细胞系以2X104个细胞/孔的密度分配到96孔板(Costar，US)中。第二天，将以上实施例3.1中用去离子蒸馏水均质化的SAMiRNA用1X DPBS稀释，并且将细胞用稀释液处理至SAMiRNA浓度为500nM或1,000nM。总共进行四次(每12小时一次)用SAMiRNA的处理，并且将细胞在37℃下在5％ CO2下培养。
3-3通过对人双调蛋白的mRNA表达的抑制分析来筛选SAMiRNA
从实施例3-2中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA，并且合成为cDNA，并且然后通过实时PCR定量双调蛋白基因的相对mRNA表达水平。
为了分析双调蛋白基因的mRNA表达水平，将300nM AREG正向引物、300nM AREG反向引物、300nM AREG探针、300nM RPL13A正向引物、300nM RPL13A反向引物、300nM RPL13A探针、400nM TBP正向引物、400nM TBP反向引物和300nM TBP探针添加到Dual-HotStart RT-qPCR试剂盒(Bioneer，韩国)的每个孔中，并且干燥(表2，在高通量筛选(HTS)实验中使用的引物和水解探针的序列)。为了评估所制备试剂盒的性能，使用A549细胞总RNA创建校准曲线，并且确定PCR扩增效率(表3)。在以下条件下执行RT-qPCR：95℃ 5分钟，并且然后45个循环，每个循环由95℃ 5秒和58℃ 15秒组成。使用在每个循环中检测荧光值的方案。
根据使用自动化系统韩国ExiStation HTTM的自动化程序和单独制备的包含用于分析双调蛋白的引物和探针的Dual-HotStart RT-qPCR试剂盒(Bioneer，韩国)，使经SAMiRNA处理的96孔板(Costar，US)经受总RNA提取和一步RT-qPCR。
基于qPCR阵列后获得的两个基因的Ct值，通过2(-ΔΔC(T))方法分析相比于对照组中的双调蛋白，测试组中的双调蛋白的相对mRNA表达水平[Livak KJ,SchmittgenTD.2001.Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method.Methods.12月；25(4):4 02-8]。
[表2]在高通量筛选(HTS)实验中使用的引物和水解探针的序列
[表3]3-plex RT-qPCR扩增功效
斜率 R2 效率
AREG Y＝-0.2778X+12.3894 0.9998 90％
RPL13A Y＝-0.2863X+10.5964 0.9999 93％
TBP Y＝-0.2892X+13.0351 0.9946 95％
为了选择高效的SAMiRNA，选择14个SAMiRNA，其具有SEQ ID NO:1至14中的每种序列作为有义链。在此，所选择的SAMiRNA显示出最高的效率，其中与对照相比，在500nM或1,000nM的最终浓度下双调蛋白的mRNA表达水平降低。
如图1所示，最终从1,257个靶向双调蛋白的SAMiRNA中选择最有效抑制双调蛋白基因表达的14个SAMiRNA。下表4中示出了关于所选择的SAMiRNA的序列的信息。
[表4]通过1-碱基滑动窗口筛选和高通量筛选(HTS)选择的双调蛋白特异性SAMiRNA候选序列
实施例4.靶向人双调蛋白并且诱导RNAi的SAMiRNA纳米颗粒的筛选
用具有SEQ ID NO:1至14中的每种序列作为有义链的SAMiRNA(在实施例3中选择)处理肺癌细胞系A549，并且分析所述细胞系中双调蛋白mRNA的表达模式。
4-1用SAMiRNA纳米颗粒处理细胞
为了鉴定抑制双调蛋白表达的SAMiRNA，使用人肺癌细胞系A549。将A549细胞系在含有10％胎牛血清(Hyclone，US)和1％青霉素-链霉素(Hyclone，US)的GibcoTMHam’s F-12K(Kaighn)培养基(Thermo，US)中于37℃在5％ CO2下培养。使用与以上相同的培养基，将A549细胞系以8X104个细胞/孔的密度分配到12孔板(Costar，US)中。第二天，将以上实施例3.1中用去离子蒸馏水均质化的SAMiRNA用1X DPBS稀释，并且将细胞用稀释液处理至SAMiRNA浓度为200nM或600nM。总共进行四次(每12小时一次)用SAMiRNA的处理，并且将细胞在37℃下在5％ CO2下培养。
4-2通过对人双调蛋白mRNA表达的抑制分析来筛选SAMiRNA
从实施例4-1中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA，并且合成为cDNA，并且然后通过实时PCR定量双调蛋白基因的相对mRNA表达水平。
4-2-1从经SAMiRNA处理的细胞分离RNA和cDNA合成
使用RNA提取试剂盒(AccuPrep细胞总RNA提取试剂盒，BIONEER，韩国)，从以上实施例4-1中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA。使用RNA逆转录酶(具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的RocketScriptTMCycle RT Premix)按照以下方式将提取的RNA合成为cDNA。具体地，将1μg提取的RNA添加到在每支0.25ml Eppendorf管中的具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的RocketScriptTMCycle RT Premix中，并且向其中添加用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的蒸馏水至总体积为20μl。在基因扩增系统(MyGenieTM96 Gradient Thermal Block，BIONEER，韩国)中，将RNA与引物在37℃下杂合30秒的过程和在48℃下合成cDNA4分钟的过程重复12次。然后，通过在95℃下使酶失活5分钟来终止扩增反应。
4-2-2人双调蛋白mRNA的相对mRNA表达水平的定量分析
使用实施例4-2-1中合成的cDNA作为模板，进行SYBR绿实时qPCR，并且按以下方式分析与SAMiRNA对照样品相比双调蛋白的相对mRNA表达水平。用蒸馏水将以上实施例4-2-1中合成的cDNA稀释5倍，并且为了分析双调蛋白的mRNA表达水平，将3μl稀释的cDNA、25μl2XGreenStarTMqPCR MasterMix(BIONEER，韩国)、19μl蒸馏水和3μl双调蛋白qPCR引物(SEQ ID NO:17和18(表5)；对于每种引物为10pmol/μl，BIONEER，韩国)添加到96孔板的每个孔中，以制备混合物。同时，将GAPDH(甘油醛3-磷酸酯脱氢酶)(管家基因(在下文中称为HK基因))用作归一化双调蛋白的mRNA表达水平的标准基因。使用ExicyclerTM实时定量热模块(BIONEER，韩国)，使含有混合物的96孔板经受以下反应。具体地，允许混合物在95℃下反应15分钟以活化酶并且去除cDNA的二级结构，并且然后使混合物经受42个循环，每个循环由在94℃下变性30秒、在58℃下退火30秒、在72℃下扩展30秒、以及SYBR绿色扫描、以及最后在72℃下扩展3分钟组成。接下来，将混合物在55℃的温度下保持1分钟，并且分析从55℃至95℃的熔融曲线。
在PCR完成后，通过GAPDH基因校正靶基因的Ct(阈值循环)值，并且然后使用经不诱导基因表达抑制的对照序列SAMiRNA(SAMiCONT)处理的对照计算ΔCt值。使用ΔCt值和等式2(-ΔCt)×100定量用双调蛋白特异性SAMiRNA处理的细胞中靶基因的相对表达水平。
为了选择高效的SAMiRNA，选择14个SAMiRNA，其具有SEQ ID NO:10、11和12中的每种序列作为有义链。在此，所选择的SAMiRNA显示出最高的效率，其中与对照相比，在200nM或600nM的最终浓度下双调蛋白的mRNA表达水平降低。
如图3所示，最终从14个靶向双调蛋白的SAMiRNA中选择最有效抑制双调蛋白基因表达的3个SAMiRNA。下表6中示出了关于所选择的SAMiRNA的序列的信息。
[表5]关于qPCR的引物序列的信息
引物 序列 SEQ ID NO
hGAPDH-F GGTGAAGGTCGGAGTCAACG 15
hGAPDH-R ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG 16
hAREG-F ACACCTACTCTGGGAAGCGT 17
hAREG-R GCCAGGTATTTGTGGTTCGT 18
(F表示正向引物，并且R表示反向引物)
[表6]有效抑制双调蛋白表达的SAMiRNA序列
SEQ ID NO 代码名称 位置 有义链序列
10 SAMi-AREG#10 341-359 CACCTACTCTGGGAAGCGT
11 SAMi-AREG#11 342-360 ACCTACTCTGGGAAGCGTG
12 SAMi-AREG#12 349-367 CTGGGAAGCGTGAACCATT
实施例5.通过所选择SAMiRNA抑制肺癌细胞系(A549)中的人双调蛋白表达
用具有SEQ ID NO:10、11和12中的每种序列作为有义链的SAMiRNA(在实施例4中选择)处理肺癌细胞系A549，并且分析所述细胞系中双调蛋白mRNA的表达模式，以确定SAMiRNA的IC50值。
5-1SAMiRNA纳米颗粒的生产和粒度分析
将实施例2中合成的3个靶向双调蛋白序列的SAMiRNA中的每个都溶解在1X杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(WELGENE，KR)中，并且在冷冻干燥器(LGJ-100F，CN)中冷冻干燥5天。将冷冻干燥的纳米颗粒粉末溶解在2ml去离子蒸馏水(Bioneer，KR)中并且均质化，并且用于本发明的实验中。为了分析产生的SAMiRNA纳米颗粒的粒度，使用Zetasizer Nano ZS(Malvern，UK)测量SAMiRNA的尺寸和多分散指数。SAMiRNA纳米颗粒的尺寸和多分散指数的测量结果在下表7中示出，并且以图形方式在图2中示出。
[表7]双调蛋白特异性SAMiRNA纳米颗粒的尺寸和多分散指数
代码名称 尺寸 PDI
SAMi-AREG#10 103.9±3.8 0.406±0.065
SAMi-AREG#11 99.9±4.0 0.501±0.005
SAMi-AREG#12 170.1±7.5 0.457±0.084
5-2用SAMiRNA纳米颗粒处理细胞
为了评估所选择的SAMiRNA抑制双调蛋白表达的作用，使用人肺癌细胞系A549。将A549细胞系在含有10％胎牛血清(Hyclone，US)和1％青霉素-链霉素(Hyclone，US)的GibcoTMHam’s F-12K(Kaighn)培养基(Thermo，US)中于37℃在5％ CO2下培养。使用与以上相同的培养基，将A549细胞系以(Costar，US)8X 104个细胞/孔的密度分配到12孔板(Costar，US)中。第二天，将以上实施例5.1中用去离子蒸馏水均质化的SAMiRNA用1X DPBS稀释，并且将细胞用稀释液处理至SAMiRNA浓度为12.5nM、25nM、50nM、100nM、200nM、600nM或1200nM。用SAMiRNA处理细胞，总共进行四次(每12小时一次)，并且将细胞在37℃在5％CO2下培养。
5-3通过对人双调蛋白的mRNA表达的抑制分析来确定SAMiRNA的IC50
从实施例5-2中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA，并且合成为cDNA，并且然后通过实时PCR定量双调蛋白基因的相对mRNA表达水平。
5-3-1从经SAMiRNA处理的细胞分离RNA和cDNA合成
使用RNA提取试剂盒(AccuPrep细胞总RNA提取试剂盒，BIONEER，韩国)，从以上实施例5-2中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA。使用RNA逆转录酶(具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的RocketScriptTMCycle RT Premix)按照以下方式将提取的RNA合成为cDNA。具体地，将1μg提取的RNA添加到在每支0.25ml Eppendorf管中的具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的RocketScriptTMCycle RT Premix中，并且向其中添加用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的蒸馏水至总体积为20μl。在基因扩增系统(MyGenieTM96Gradient Thermal Block，BIONEER，韩国)中，将RNA与引物在37℃下杂合30秒的过程和在48℃下合成cDNA4分钟的过程重复12次。然后，通过在95℃下使酶失活5分钟来终止扩增反应。
5-3-2人双调蛋白的相对mRNA表达水平的定量分析
使用实施例5-3-1中合成的cDNA作为模板，进行SYBR绿实时qPCR，并且按以下方式分析与SAMiRNA对照样品相比双调蛋白的相对mRNA表达水平。用蒸馏水将以上实施例5-3-1中合成的cDNA稀释5倍，并且为了分析双调蛋白的mRNA表达水平，将3μl稀释的cDNA、25μl2XGreenStarTMqPCR MasterMix(BIONEER，韩国)、19μl蒸馏水和3μl双调蛋白qPCR引物(SEQ ID NO:17和18(表5)；对于每种引物为10pmol/μl，BIONEER，韩国)添加到96孔板的每个孔中，以制备混合物。同时，将GAPDH(甘油醛3-磷酸酯脱氢酶)(管家基因(在下文中称为HK基因))用作归一化双调蛋白的mRNA表达水平的标准基因。使用ExicyclerTM实时定量热模块(BIONEER，韩国)，使含有混合物的96孔板经受以下反应。具体地，允许混合物在95℃下反应15分钟以活化酶并且去除cDNA的二级结构，并且然后使混合物经受42个循环，每个循环由在94℃下变性30秒、在58℃下退火30秒、在72℃下扩展30秒、以及SYBR绿色扫描、以及最后在72℃下扩展3分钟组成。接下来，将混合物在55℃的温度下保持1分钟，并且分析从55℃至95℃的熔融曲线。
在PCR完成后，确定通过GAPDH基因校正靶基因的Ct(阈值循环)值，并且然后使用经不诱导基因表达抑制的对照序列SAMiRNA(SAMiCONT)处理的对照计算ΔCt值。使用ΔCt值和等式2(-ΔCt)×100定量用双调蛋白特异性SAMiRNA处理的细胞中靶基因的相对表达水平。
结果是，证实了具有SEQ ID NO:10、11和12中的每种序列作为有义链的所有双调蛋白特异性SAMiRNA即使在100nM的浓度下也显示出双调蛋白的mRNA表达水平的50％或更多降低，表明双调蛋白特异性SAMiRNA展现出以高效率抑制双调蛋白表达的作用。证实了对于具有SEQ ID NO:10的序列作为有义链的双调蛋白特异性SAMiRNA的IC50值如图4所示为28.75nM，对于具有SEQ ID NO:11的序列作为有义链的双调蛋白特异性SAMiRNA如图5所示为26.04nM，以及对于具有SEQ ID NO:12的序列作为有义链的双调蛋白特异性SAMiRNA如图6所示为12.07nM。特别地，证实了如图6所示即使在25nM的低浓度下，具有SEQ ID NO:12的序列作为有义链的双调蛋白特异性SAMiRNA也显示出双调蛋白的mRNA表达水平的50％或更多降低，表明其在三种所选择序列中展现出最有效地抑制双调蛋白基因表达的作用。
实施例6.使用人外周血单核细胞(PBMC)评估体外细胞毒性
为了检查先天免疫相关细胞因子的mRNA表达水平是否因SAMi-hAREG而增加，将冷冻保存的人PBMC(人外周血单核细胞)，Cellular Technology Limited，美国)以每孔5x 105个细胞的密度分配到12孔板(美国)中，所述板具有含有10％ FBS(胎牛血清；HycloneTM)的RPMI1640(HycloneTM)培养基。将细胞在5％ CO2培养箱中于37℃下培养1小时以使其稳定，并且然后将分配的PBMC用2.5μM的SAMi-CON(DNA/RNA)、SAMi-hAREG#10(DNA/RNA)、SAMi-hAREG#11(DNA/RNA)、SAMi-hAREG#12(DNA/RNA)、SAMi-CON(RNA/RNA)、SAMi-hAREG#10(RNA/RNA)、SAMi-hAREG#11(RNA/RNA)和SAMi-hAREG#12(RNA/RNA)中的每一种处理，并且在5％ CO2培养箱中于37℃下培养6小时。作为阳性对照，使用20μg/ml伴刀豆球蛋白A(Sigma Aldrich，美国)。
此后，收获所有细胞，并且根据制造商的方案，使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，德国)和RNase-Free DNase Set(Qiagen，德国)从其中提取总RNA。
将200ng提取的RNA与去离子无菌DW(Bioneer，韩国)和RNA逆转录酶(具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的RocketScriptTMCycle RT Premix)混合，并且允许使用基因扩增系统(MyGenieTM96Gradient Thermal Block，BIONEER，韩国)使混合物在12个循环的条件下反应，每个循环由37℃ 30秒、48℃ 4min和55℃ 30秒以及然后95℃ 5min组成，从而合成总共20μl的cDNA。
将合成的cDNA与针对RPL13A、IL1B、IL6、IFNG、TNF和IL12B基因中的每一种的qPCR引物混合，并且然后使用ExicyclerTM96实时定量热模块(Bioneer，韩国)在以下条件下扩增：95℃ 5min，并且然后45个循环，每个循环由95℃ 5秒和58℃ 15秒组成。
基于qPCR阵列后获得的两个基因的Ct值，通过2(-ΔΔC(T))方法分析相比于对照组，测试组中的相对mRNA表达水平[Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis ofrelative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method.Methods.12月；25(4):4 02-8]。
结果是，如图7所示，证实了未观察到由双调蛋白特异性SAMiRNA#10、SAMiRNA#11和SAMiRNA #12中的每一种导致的在人外周血单核细胞(人PBMC)中先天免疫相关细胞因子的表达。
实施例7.包含SEQ ID NO:10、11和12中的每种所选择序列作为有义链的DNA/RNA杂合和RNA/RNA杂合SAMiRNA对人双调蛋白表达抑制的比较分析
用包含具有SEQ ID NO:10、11和12中的每种序列作为有义链的双调蛋白特异性SAMiRNA(在实施例4中选择)的每种双链DNA/RNA杂合体和RNA/RNA杂合体处理肺癌细胞系A549，并且分析所述细胞系中双调蛋白的相对mRNA表达水平(％)。
7-1用SAMiRNA纳米颗粒处理细胞
为了鉴定抑制双调蛋白表达的SAMiRNA，使用人肺癌细胞系A549。将A549细胞系在含有10％胎牛血清(Hyclone，US)和1％青霉素-链霉素(Hyclone，US)的GibcoTMHam’s F-12K(Kaighn)培养基(Thermo，US)中于37℃在5％ CO2下培养。使用与以上相同的培养基，将A549细胞系以8x104个细胞/孔的密度分配到12孔板(Costar，US)中。第二天，将以上实施例3.1中用去离子蒸馏水均质化的SAMiRNA用1X DPBS稀释，并且将细胞用稀释液处理至SAMiRNA浓度为200nM、600nM或1200nM。用SAMiRNA处理细胞，总共进行四次(每12小时一次)，并且将细胞在37℃在5％ CO2下培养。
7-2通过对人双调蛋白的mRNA表达的抑制分析来筛选SAMiRNA
从实施例7-1中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA，并且合成为cDNA，并且然后通过实时PCR定量双调蛋白基因的相对mRNA表达水平。
7-2-1从经SAMiRNA处理的细胞分离RNA和cDNA合成
使用RNA提取试剂盒(AccuPrep细胞总RNA提取试剂盒，BIONEER，韩国)，从以上实施例7-1中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA。使用RNA逆转录酶(具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的RocketScriptTMCycle RT Premix)按照以下方式将提取的RNA合成为cDNA。具体地，将1μg提取的RNA添加到在每支0.25ml Eppendorf管中的具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的RocketScriptTMCycle RT Premix中，并且向其中添加用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的蒸馏水至总体积为20μl。在基因扩增系统(MyGenieTM96 Gradient Thermal Block，BIONEER，韩国)中，将RNA与引物在37℃下杂合30秒的过程和在48℃下合成cDNA 4分钟的过程重复12次。然后，通过在95℃下使酶失活5分钟来终止扩增反应。
7-2-2人双调蛋白的相对mRNA表达水平的定量分析
使用实施例7-2-1中合成的cDNA作为模板，进行SYBR绿实时qPCR，并且按以下方式分析与SAMiRNA对照样品相比双调蛋白的相对mRNA表达水平。用蒸馏水将以上实施例7-2-1中合成的cDNA稀释5倍，并且为了分析双调蛋白的mRNA表达水平，并且将3μl稀释的cDNA、25μl2XGreenStarTMqPCR MasterMix(BIONEER，韩国)、19μl蒸馏水和3μl双调蛋白qPCR引物(SEQ ID NO:17和18(表5)；对于每种引物为10pmol/μl，BIONEER，韩国)添加到96孔板的每个孔中，以制备混合物。同时，将GAPDH(甘油醛3-磷酸酯脱氢酶)(管家基因(在下文中称为HK基因))用作归一化双调蛋白的mRNA表达水平的标准基因。使用ExicyclerTM实时定量热模块(BIONEER，韩国)，使含有混合物的96孔板经受以下反应。具体地，允许混合物在95℃下反应15分钟以活化酶并且去除cDNA的二级结构，并且然后使混合物经受42个循环，每个循环由在94℃下变性30秒、在58℃下退火30秒、在72℃下扩展30秒、以及SYBR绿色扫描、以及最后在72℃下扩展3分钟组成。接下来，将混合物在55℃的温度下保持1分钟，并且分析从55℃至95℃的熔融曲线。
在PCR完成后，通过GAPDH基因校正靶基因的Ct(阈值循环)值，并且然后使用经不诱导基因表达抑制的对照序列SAMiRNA(SAMiCONT)处理的对照计算ΔCt值。使用ΔCt值和等式2(-ΔCt)×100定量靶基因的相对表达水平。
为了从双链DNA/RNA杂合体和RNA/RNA杂合体选择高效的SAMiRNA，最终选择具有SEQ ID NO:12的序列作为有义链的DNA/RNA杂合SAMiRNA。在此，所选择的序列DNA/RNA杂合SAMiRNA(基因表达抑制为90％或更高)显示出最高的效率，其中与对照相比，在200nM、600nM或1200nM的最终浓度下双调蛋白的mRNA表达水平降低。
如图8所示，最有效地抑制双调蛋白基因表达的DNA/RNA杂合SAMiRNA 12最终选自分别包含三种所选择的双调蛋白特异性SAMiRNA的DNA/RNA和RNA/RNA杂合体。
实施例8.靶向小鼠双调蛋白并且诱导RNAi的SAMiRNA纳米颗粒的高通量筛选(HTS)
在siRNA治疗剂的情况下，难以鉴定可适用于不同菌株的最佳序列。在这种情况下，应用美国FDA指南，根据所述指南，设计对用于分析治疗作用(体内功效测试)的动物模型具有特异性的DNA序列(替代序列；小鼠基因特异性siRNA)，以便验证由抑制感兴趣的基因表达导致的药理学活性和由抑制感兴趣的基因表达导致的毒性(由FDA/CDER药理学博士/毒物学审查员Robert T.Dorsam呈现)。
先前发现的筛选已通过基于现有算法的siRNA程序(由申请人公司拥有的Turbo-si-designer)进行了修改，并且进行基于SAMiRNA的siRNA序列高通量筛选。针对整个靶基因进行19-mer siRNA的1碱基滑动窗口扫描(与上述人双调蛋白靶筛选相同的方法)，并且针对可能的小鼠双调蛋白基因(NM_009704.4)完整转录物序列产生总共1,190个候选siRNA序列。进行blast序列同源性过滤以去除影响其他基因表达的不必要的候选序列，并且合成237个最终选择的SAMiRNA。用在含有10％ FBS的细胞培养基中浓度为1μM的每种所选择SAMiRNA处理小鼠NIH3T3细胞系，并且首先使用表8(qPCR的引物序列信息)中所示的引物筛选SAMiRNA的体外表达抑制作用(图9)。
此后，以在含有10％ FBS的细胞培养基中200nM和500nM的处理浓度，用在NIH3T3细胞系中选择的两个序列(SEQ ID NO:19和20)中的每个和通过先前的里程碑式研究发现的SEQ ID NO:21的小鼠SAMiRNA-双调蛋白处理小鼠肺成纤维细胞系MLg，并且进行另外的筛选。结果是，证实了SEQ ID NO:20展现出最好的表达抑制作用(图10A)。
另外，以在含有10％ FBS的细胞培养基中200nM、500nM和1,000nM的处理浓度，用两个所选择序列(SEQ ID NO:19和20)中的每个和通过先前的里程碑式研究发现的SEQ IDNO:21的小鼠SAMiRNA-双调蛋白处理小鼠肺上皮细胞系LA-4，并且另外评估表达抑制作用。结果是，再次证实了SEQ ID NO:20展现出最好的表达抑制作用(图10B)。
如图10所示，最终从237个靶向小鼠双调蛋白的SAMiRNA中选择最有效抑制双调蛋白基因表达的两种SAMiRNA，并且所选择SAMiRNA的序列信息在下表9中示出。
[表8]qPCR的引物序列信息
引物 序列
mGAPDH-F AGGTCGGTGTGAACGGA TTTG(SEQ ID NO:22)
mGAPDH-R TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA SEQ ID NO:23)
mAREG-F GAGGCTTCGACAAGAAAACG(SEQ ID NO:24)
mAREG-R ACCAATGTCATTTCCGGTGT(SEQ ID NO:25)
(F表示正向引物，并且R表示反向引物)
[表9]有效抑制小鼠双调蛋白表达的SAMiRNA序列
SEQ ID NO 代码名称 位置 有义链序列
19 SAMi-mAREG#19 936-954 AACGGGACTGTGCATGCCA
20 SAMi-mAREG#20 937-955 ACGGGACTGTGCATGCCAT
21 SAMi-mAREG#21 1071-1089 CAGTTGTCACTTTTTATGA
实施例9.通过静脉给予的SAMiRNA-mAREG在二氧化硅诱导的肺纤维化模型中的功效的研究
为了分析SAMi-mAREG在由二氧化硅(二氧化硅，SIGMA，韩国)诱导的肺纤维化动物模型中的功效，并且进行实验。对于所述实验，获得7周龄小鼠，并且允许其适应1周。为了诱导所述模型，将二氧化硅(3mg)溶解并且气管内注射到小鼠体内。在诱导后3天，选择显示无异常症状的小鼠并且将其分为正常组、给予生理缓冲盐水(PBS)的测试组、给予SAMiRNA-对照的测试组、以及以2天的间隔分别给予三次1mg/kg和5mg/kg SAMi-mAREG#20的测试组(SAMi-mAREG#20)。此外，在模型诱导后14天，处死小鼠。
9-1.二氧化硅诱导的肺纤维化动物模型中SAMiRNA的基因表达分析
从处死的小鼠获得肺组织，并且使用匀浆器将其压碎。使用RNA提取试剂盒(AccuPrep细胞总RNA提取试剂盒，BIONEER，韩国)，从以上实施例7-1中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA。使用RNA逆转录酶(具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的RocketScriptTMCycle RT Premix)按照以下方式将提取的RNA合成为cDNA。使用合成的cDNA作为模板，进行SYBR绿实时qPCR，并且按以下方式分析所述组中总RNA的相对表达水平。用蒸馏水将合成的cDNA稀释5倍，并且为了分析双调蛋白的mRNA表达水平，将3μl稀释的cDNA、25μl2X GreenStarTMqPCR MasterMix(BIONEER，韩国)、19μl蒸馏水和3μl双调蛋白qPCR引物(SEQ ID NO:24和25(表8)；对于每种引物为10pmol/μl，BIONEER，韩国)添加到96孔板的每个孔中，以制备混合物。同时，将RPL13A(管家基因(在下文中称为HK基因))用作归一化双调蛋白、纤连蛋白、和胶原3α1的mRNA表达水平的标准基因。
在PCR完成后，通过RPL13A基因校正各靶基因的Ct(阈值循环)值，并且然后计算各组之间的ΔCt值。使用ΔCt值和等式2(-ΔCt)×100定量双调蛋白、纤连蛋白和胶原3α1基因的相对表达水平。
结果是，证实了与用生理缓冲盐水处理的二氧化硅诱导的肺纤维化模型组和用SAMiRNA-对照处理的二氧化硅诱导的肺纤维化模型组相比，在分别用1mg/kg SAMiRNA-AREG和5mg/kg SAMiRNA-AREG处理的组中，观察到双调蛋白的表达降低。此外，证实了与用生理缓冲盐水处理的二氧化硅诱导的肺纤维化模型组和用SAMiRNA-对照处理的二氧化硅诱导的肺纤维化模型组相比，在分别用1mg/kg SAMiRNA-AREG和5mg/kg SAMiRNA-AREG处理的组中，纤连蛋白和胶原3α1以浓度依赖性的方式减少。
9-2.二氧化硅诱导的肺纤维化动物模型中SAMiRNA的组织病理学分析
为了验证针对二氧化硅诱导的肺纤维化模型的SAMiRNA-AREG是否影响细胞外基质组分的表达，进行免疫组织化学染色。处死每个动物模型组，并且通过组织固定、洗涤、脱水、清除、浸润、包埋和切割过程制备石蜡切片。用切片机将石蜡切片切薄，并且将组织固定在玻片上。为了病理观察肺组织，进行造血和曙红(H&E)染色，并且为了检查胶原3α1的表达水平，进行Masson三色染色。此外，进行免疫组织化学染色以分析双调蛋白的表达水平。
通过苏木精和曙红染色，可以看出二氧化硅诱导的肺纤维化组织比正常组的肺组织受到更大损伤。然而，可以看出，与正常组的肺组织一样，给予SAMiRNA-AREG的小鼠的肺组织具有很少损伤。此外，进行Masson三色染色以检查纤维化程度。证实了与给予生理缓冲盐水(PBS)的二氧化硅诱导的肺纤维化模型组中的肺组织间质和给予SAMiRNA-对照的组中的那些相比，给予SAMiRNA-AREG的组中肺组织间质的纤维化程度降低。此外，通过免疫组织化学染色双调蛋白，可以看出在二氧化硅诱导的肺纤维化动物组中，双调蛋白在细胞之间的间质中大量表达。然而，可以证实在给予SAMiRNA-AREG的组中，肺组织间质中AREG的表达降低。
总之，向二氧化硅诱导的肺纤维化模型小鼠静脉内给予1mg/kg和5mg/kgSAMiRNA-AREG三次(第10、12和14天)，并且评估SAMiRNA-AREG对肺组织中靶基因双调蛋白和纤维化标记基因的表达的抑制作用，并且进行肺组织的H&E染色和Masson三色染色。作为分析靶基因双调蛋白和纤维化标记基因胶原3α1和纤连蛋白的表达的结果，证实了通过二氧化硅诱导的肺纤维化增加了表达，并且证实了通过用SAMiRNA-AREG的处理以浓度依赖性方式抑制表达的作用。此外，作为组织染色的结果，证实了在用PBS或SAMiRNA-对照处理的二氧化硅诱导的肺纤维化小鼠中，细胞向肺组织中的浸润和胶原的表达增加，但在用SAMiRNA-AREG处理的测试组中，细胞浸润和胶原显著降低至与用DPBS处理的对照组可比较的水平(图11)。
此外，在二氧化硅诱导的肺纤维化模型中，进行AREG的免疫组织化学染色。如图11所示，通过IHC染色分析给予1mg/kg和5mg/kg SAMiRNA-AREG的二氧化硅诱导的肺纤维化模型小鼠的组织中AREG的表达水平。证实了，在给予了二氧化硅+PBS或二氧化硅+SAMi-对照的模型小鼠的肺组织中，与正常肺组织中的AREG表达相比，间质部位中的AREG表达显著增加。然而，作为分析给予1mg/kg和5mg/kg SAMiRNA-AREG的组织中AREG的表达的结果，可以证实，与二氧化硅诱导的肺纤维化组织中的AREG的表达相比，所述组织中AREG的表达显著降低(图11)。
实施例10.通过静脉给予SAMiRNA-mAREG在博莱霉素诱导的肺纤维化模型中的功效的研究
向博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型静脉内给予5mg/kg SAMiRNA-AREG(SAMi-mAREG#20)三次(第8、10和12天)，并且进行Sircol测定。结果是，证实了与对照组SAMiRNA-对照中胶原蛋白的量相比，给予SAMiRNA-AREG的测试组中胶原蛋白的量减少了>40％。此外，从同一测试组的肺组织中提取RNA，并且分析抑制靶基因双调蛋白和纤维化标记基因胶原3α1的表达的作用。结果是，发现了与对照相比的表达抑制作用。证实了新鉴定的SEQ IDNO:20的测试物质的作用等于或高于现有序列的作用。进行肺组织的H&E染色和肺组织的胶原3α1特异性Masson三色染色。作为组织染色的结果，证实了在用PBS或SAMiRNA-对照处理的博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠组中，细胞向肺组织中的浸润增加，并且由于胶原积累，染色增加。证实了在用SAMiRNA-AREG处理的测试组中，细胞浸润和胶原积累显著降低(图12)。以与实施例8相同的方式，进行组织染色和靶基因表达的分析。
实施例11.评估SAMiRNA-AREG对由小鼠的UUO(单侧输尿管梗阻)诱导的肾纤维化的作用
在由UUO手术诱导的肾纤维化动物模型中，进行对SAMiRNA-AREG(SAMi-mAREG#20)的作用的分析。首先，用iFran溶液(Hana Pharmaceutical，韩国)对小鼠进行吸入麻醉以制备肾纤维化动物模型。切开皮肤和腹膜，并且在两个位置用4-0丝线绑扎左肾的输尿管。为了防止尿路感染，将两个位置之间的中间切开。此外，以相同的方式对右肾进行手术，但不绑扎输尿管。同样，正常组的腹部也是敞放的，并且检查左肾的输尿管，但不绑扎。此外，缝合腹膜和皮肤以防止感染。在模型诱导后6小时，进行第一次给予1mg/kg或5mg/kgSAMiRNA-AREG。在24小时后，进行第二次给予。进行两次给予，并且在最后一次给予后24小时处死动物。将动物模型组分为总共四组：正常组、给予生理缓冲盐水的UUO模型组、和分别给予1mg/kg和5mg/kg SAMiRNA-AREG的UUO组。
11-1.由UUO(单侧输尿管梗阻)诱导的肾纤维化中SAMiRNA的基因表达的分析
从处死的小鼠获得肺组织，并且使用匀浆器将其压碎。使用RNA提取试剂盒(AccuPrep细胞总RNA提取试剂盒，BIONEER，韩国)，从以上实施例7-1中用SAMiRNA处理的细胞系提取总RNA。使用RNA逆转录酶(具有oligo(dT)20(Bioneer，韩国)的RocketScriptTMCycle RT Premix)按照以下方式将提取的RNA合成为cDNA。使用合成的cDNA作为模板，进行SYBR绿实时qPCR，并且按以下方式分析所述组中总RNA的相对表达水平。用蒸馏水将合成的cDNA稀释5倍，并且为了分析双调蛋白和纤维化标记的mRNA表达水平，将3μl稀释的cDNA、25μl2X GreenStarTMqPCR MasterMix(BIONEER，韩国)、19μl蒸馏水和3μl针对双调蛋白和纤维化标记的qPCR引物(SEQ ID NO:24和25(表8)；对于每种引物为10pmol/μl，BIONEER，韩国)添加到96孔板的每个孔中，以制备混合物。同时，将RPL13A(管家基因(在下文中称为HK基因))用作归一化转化生长因子1、双调蛋白、纤连蛋白、胶原1、平滑肌肌动蛋白和胶原3α1的mRNA表达水平的标准基因。此外，还分析CCR2基因以验证其对炎症因子的功效。
在PCR完成后，通过RPL13A基因校正靶基因的Ct(阈值循环)值，并且然后计算各组之间的ΔCt值。使用ΔCt值和等式2(-ΔCt)×100定量转化生长因子-1、双调蛋白、纤连蛋白、胶原1、平滑肌肌动蛋白、胶原3α1和CCR2基因的相对表达水平。
结果是，在给予生理缓冲盐水的UUO模型组中双调蛋白的表达水平比正常组高60倍。证实了在分别给予1mg/kg SAMiRNA-AREG和5mg/kg SAMiRNA-AREG的组中，双调蛋白基因的表达降低。此外，证实了与UUO模型组相比，在分别给予1mg/kg SAMiRNA-AREG和5mg/kgSAMiRNA-AREG的组中，纤连蛋白和转化生长因子1以浓度依赖性的方式降低。此外，与UUO模型组相比，在给予1mg/kg SAMiRNA-AREG的组中，胶原3α1、胶原1和平滑肌肌动蛋白趋于减少。然而，证实了与给予1mg/kg SAMiRNA-AREG的组相比，在给予5mg/kg SAMiRNA-AREG的组中，降低基因表达的作用更好。此外，证实了CCR2在UUO模型组中增加了约6倍，但在给予SAMiRNA-AREG的组中减少。
尽管已经参考具体特征对本发明进行了详细描述，但是对于本领域技术人员而言将显而易见的是，本说明仅描述了本发明的优选实施方案，而非限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物来限定。
工业适用性
包含根据本发明的双调蛋白特异性双链寡核苷酸的双链寡核苷酸结构，以及包含其作为活性成分的药物组合物，可以以高的效率抑制双调蛋白而没有副作用，并且因此可以在预防和治疗由过度纤维化引起的疾病和呼吸系统疾病方面展现出优异的作用。
序列表文本文本
附有电子文件。

Claims (17)

1.一种化合物，其具有结构式(3)或结构式(4)的结构：
[结构式(3)]
[结构式(4)]
其中A表示六乙二醇-(PO3-六乙二醇)3，B表示C24(C6-S-S-C18)，X和Y各自表示简单的共价键或接头介导的共价键，并且S表示DNA有义链以及AS表示具有与之互补的序列的RNA反义链，并且其中S和AS形成DNA-RNA杂合体。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中S为双调蛋白特异性DNA有义链。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中S为具有选自SEQ ID NO:1-14的序列的DNA有义链，并且AS为具有与所述DNA有义链互补的序列的RNA反义链。
4.根据权利要求2所述的化合物，其中S为具有SEQ ID NO:10、11或12的序列的DNA有义链。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中S为具有SEQ ID NO:12的序列的DNA有义链。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中所述DNA有义链或所述RNA反义链包含化学修饰。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中所述化学修饰选自由如下组成的组：
其中核苷酸中糖结构的2’碳位置处的羟基(OH)基团被选自下组的任一种取代的修饰：-CH3(甲基)、-OCH3(甲氧基)、胺(-NH2)、氟(-F)、-O-2-甲氧基乙基、-O-丙基、-O-2-甲基硫代乙基、-O-3-氨基丙基、-O-3-二甲基氨基丙基、-O-N-甲基乙酰胺基和-O-二甲基酰胺基氧乙基；
其中核苷酸中糖结构中的氧被硫取代的修饰；
将核苷酸之间的键修饰成选自下组的任一种键：硫代磷酸酯键、硼烷膦酸酯键和甲基膦酸酯键；以及
修饰为PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)或UNA(解锁核酸)。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中X和Y表示的所述共价键为不可降解键或可降解键。
9.根据权利要求8所述的化合物，其包含不可降解键，其中所述不可降解键是酰胺键或磷酸酯键。
10.根据权利要求9所述的化合物，其包含可降解键，其中所述可降解键选自下组：二硫键、酸可降解键、酯键、酸酐键、生物可降解键或酶可降解键。
11.根据权利要求1所述的化合物，其还包含与A缀合的己糖胺、糖或碳水化合物。
12.根据权利要求1所述的化合物，其还包含与A缀合的N-乙酰半乳糖胺(NAG)。
13.根据权利要求1所述的化合物，其还包含与A缀合的葡萄糖或甘露糖。
14.一种纳米颗粒，其包含根据权利要求1所述的化合物。
15.根据权利要求14所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含双链寡核苷酸的混合物，其中每个双链寡核苷酸具有有着唯一序列的DNA有义链。
16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的化合物作为活性成分。
17.一种药物组合物，其包含根据权利要求14所述的纳米颗粒作为活性成分。
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