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CN119630791A - 用于抑制snca表达的组合物和方法 - Google Patents

用于抑制snca表达的组合物和方法 Download PDF

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CN119630791A
CN119630791A CN202380053018.5A CN202380053018A CN119630791A CN 119630791 A CN119630791 A CN 119630791A CN 202380053018 A CN202380053018 A CN 202380053018A CN 119630791 A CN119630791 A CN 119630791A
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oligonucleotide
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H·T·杜德克
S·郑
S·王
T·格里姆
M·G·科斯塔莱斯
M·荣格
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Dicerna Pharmaceuticals Inc
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Abstract

本文提供了抑制SNCA基因表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸，包括缀合至靶向配体(例如，GalNAC部分或脂质部分)的寡核苷酸。还提供了包含所述寡核苷酸的组合物及其用途，尤其涉及治疗与SNCA基因表达相关的疾病、病症和/或疾患的用途。

Description

用于抑制SNCA表达的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2022年5月13日提交的美国临时申请号63/364,639的优先权，所述临时申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开大体上涉及生物学和医学，并且更具体地涉及用于抑制或降低(即，调节)α-突触核蛋白(SNCA)基因表达的寡核苷酸和包含所述寡核苷酸的组合物，以及其用于治疗与SNCA基因表达相关的疾病和病症的用途。
背景技术
突触是细胞之间的功能区室，其中信息从脑中的一个细胞传送至另一个细胞SNCA是主要在脑中发现的蛋白质，所述蛋白质调控突触囊泡运输和神经递质的释放。除了其他功能之外，SNCA还充当分子伴侣以帮助折叠突触融合组分(例如，SNAREs)。SNCA中改变SNCA功能和表达或SNCA的一般异常表达的突变(例如，插入和错配)是影响CNS的若干疾病(例如，帕金森氏病(Parkinson's disease)和多系统萎缩)的已知原因。需要靶向SNCA基因以预防此类疾病的策略。
哺乳动物CNS是协同相互作用以实现多种功能的组织(包括细胞)、流体和化学物质的复杂系统，所述功能包括运动、导航、认知、语言、视觉和情感。不幸地，已知有多种CNS疾病和病症(例如，神经病症)并且影响或破坏这些功能中的一些或全部。通常，对CNS疾病和病症的治疗限于小分子药物、抗体和/或适应疗法或行为疗法。持续需要开发与不当基因表达相关的CNS疾病和病症的治疗。
发明内容
为了满足这种需要，本公开描述了用于治疗与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的组合物和方法。本公开至少部分基于发现有效靶向并降低CNS组织中的SNCA基因表达的RNAi寡核苷酸。具体地，鉴定SNCA mRNA内的靶序列，并且产生结合至这些靶序列并抑制SNCA mRNA表达的寡核苷酸。如本文所证明，寡核苷酸抑制CNS组织中的人类和非人类灵长类动物(NHP)SNCA基因表达。此外，在与帕金森氏病或多系统萎缩相关的CNS组织中，使用脂质缀合的SNCA靶向寡核苷酸，SNCA mRNA表达降低。不受理论约束，本文所描述的寡核苷酸可用于治疗与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患。
因此，在一些方面，本公开提供了一种用于降低SNCA基因表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中所述反义链包含SEQ ID NO:1683-2066中的任一者的SNCA mRNA靶序列的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为至少约15个连续核苷酸。
在前述或相关方面中的任一者中，有义链的长度为约15至约50个核苷酸。在一些方面，有义链的长度为约18至约36个核苷酸。在一些方面，反义链的长度为约15至约30个核苷酸。在一些方面，反义链的长度为22个核苷酸，并且反义链和有义链形成双链体区域，所述双链体区域的长度为至少19个核苷酸，任选地长度为至少20个核苷酸。在一些方面，互补区域的长度为至少19个连续核苷酸。在一些方面，互补区域的长度为至少20个连续核苷酸。
在其它方面，本公开提供了一种用于降低SNCA基因表达的双链(ds)RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含：
(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域选自SEQ ID NO:2067-2450，以及
(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含所述反义链的互补区域，其中所述反义链和所述有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些方面，有义链的3'端包含如S1-L-S2所示的茎环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3-5个核苷酸的环。在一些方面，L是三环或四环。在一些方面，L是四环。在一些方面，四环包含序列5'-GAAA-3'。在一些方面，S1和S2的长度为1-10个核苷酸并且具有相同长度。在一些方面，S1和S2的长度为1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸或10个核苷酸。在一些方面，S1和S2的长度为6个核苷酸。在一些方面，茎环包含序列5'-GCAGCCGAAAGGCUGC-3'(SEQID NO:1680)。
在其它方面，寡核苷酸包含平端。在一些方面，平端包含有义链的3′端。在一些方面，有义链为20至22个核苷酸。在一些方面，有义链为20个核苷酸。
在前述或相关方面中的任一者中，反义链包含长度为一个或多个核苷酸的3'悬垂序列。在一些方面，悬垂包含嘌呤核苷酸。在一些方面，3′悬垂序列的长度为2个核苷酸。在一些方面，3′悬垂选自AA、GG、AG和GA。在一些方面，悬垂是GG或AA。在一些方面，悬垂是GG。
在前述或相关方面中的任一者中，寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些方面，经修饰的核苷酸包含2'-修饰。在一些方面，2′-修饰是选自2'-氨基乙基、2'-氟(2'-F)、2′-O-甲基(2'-OMe)、2′-O-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸的修饰。在一些方面，修饰是选自2'-F和2'-OMe的2'-修饰。在一些方面，有义链的约18％至约23％或18％、19％、20％、21％、22％或23％的核苷酸包含2'-F修饰。在一些方面，有义链的约38-43％、38％、39％、40％、41％、42％或43％的核苷酸包含2'-F修饰。在一些方面，反义链的约25％至约35％或25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的核苷酸包含2'-F修饰。在一些方面，寡核苷酸的约25％至约35％或25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的核苷酸包含2'-F修饰。在一些方面，寡核苷酸的约35％至约45％、或35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％或45％的核苷酸包含2′-F修饰。在一些方面，有义链从5'至3'在位置1-36处包含36个核苷酸，其中位置3、5、8、10、12、13、15和17中的每一者包含2'-F修饰。在一些方面，有义链从5'至3'在位置1-20处包含20个核苷酸，其中位置3、5、8、10、12、13、15和17中的每一者包含2'-F修饰。在一些方面，反义链从5'至3'在位置1-22处包含22个核苷酸，并且其中位置2、3、4、5、7、10、14、16和19中的每一者包含2'-F修饰。在一些方面，其余核苷酸包含2′-OMe修饰。
在前述或相关方面中的任一者中，寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键。在一些方面，至少一个经修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些方面，反义链在以下位置包含硫代磷酸酯键：(i)在位置1与2之间和位置2与3之间；或(ii)在位置1与2之间、位置2与3之间和位置3与4之间，其中位置从5'至3'编号为1-4。在一些方面，反义链的长度为22个核苷酸，并且反义链在位置20与21之间和位置21与22之间包含硫代磷酸酯键，其中位置从5'至3'编号为1-22。在一些方面，有义链在位置1与2之间包含硫代磷酸酯键，其中位置从5'至3'编号为1-2。在一些方面，有义链的长度为20个核苷酸，并且有义链在位置1与2之间、位置18与19之间和位置19与20之间包含硫代磷酸酯键，其中位置从5'至3'编号为1-20。
在前述或相关方面中的任一者中，反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。在一些方面，磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯，任选地其中所述磷酸酯类似物是包含4′-氧甲基膦酸酯的4'-磷酸酯类似物。
在前述或相关方面中的任一者中，寡核苷酸的至少一个核苷酸缀合至一个或多个靶向配体。在一些方面，每个靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、脂质、胆固醇或多肽。在一些方面，茎环包含缀合至茎环的一个或多个核苷酸的一个或多个靶向配体。在一些方面，一个或多个靶向配体缀合至环的一个或多个核苷酸。在一些方面，环包含从5′至3'编号为1-4的4个核苷酸，其中位置2、3和4处的核苷酸各自包含一个或多个靶向配体，其中所述靶向配体相同或不同。在一些方面，每个靶向配体包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。在一些方面，GalNAc部分是单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分。在一些方面，茎环的L的至多4个核苷酸各自缀合至单价GalNAc部分。
在其它方面，一个或多个靶向配体是脂质部分。在一些方面，脂质部分缀合至有义链的5'末端核苷酸。在一些方面，脂质部分是烃链。在一些方面，烃链是C8-C30烃链。在一些方面，烃链是C16烃链。在一些方面，C16烃链由以下表示：在一些方面，脂质部分缀合至5'末端核苷酸的核糖环的2'碳。
在前述或相关方面中的任一者中，互补区域在反义链的核苷酸位置2-8处与SNCAmRNA靶序列完全互补，其中核苷酸位置从5'至3′编号。在一些方面，互补区域在反义链的核苷酸位置2-11处与SNCA mRNA靶序列完全互补，其中核苷酸位置从5'至3'编号。
在前述或相关方面中的任一者中，有义链包含SEQ ID NO:1537-1571和1681中的任一者的核苷酸序列。在一些方面，反义链包含SEQ ID NO:1572-1606中的任一者的核苷酸序列。在一些方面，有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1537和1572；
b)分别是SEQ ID NO:1538和1573；
c)分别是SEQ ID NO:1539和1574；
d)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
e)分别是SEQ ID NO:1541和1576；
f)分别是SEQ ID NO:1542和1577；
g)分别是SEQ ID NO:1543和1578；
h)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
i)分别是SEQ ID NO:1545和1580；
j)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
k)分别是SEQ ID NO:1547和1582；
l)分别是SEQ ID NO:1548和1583；
m)分别是SEQ ID NO:1549和1584；
n)分别是SEQ ID NO:1550和1585；
o)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
p)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
q)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
r)分别是SEQ ID NO:1554和1589；
s)分别是SEQ ID NO:1555和1590；
t)分别是SEQ ID NO:1556和1591；
u)分别是SEQ ID NO:1557和1592；
v)分别是SEQ ID NO:1558和1593；
w)分别是SEQ ID NO:1559和1594；
x)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
y)分别是SEQ ID NO:1561和1596；
z)分别是SEQ ID NO:1562和1597；
aa)分别是SEQ ID NO:1563和1598；
bb)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
cc)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
dd)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
ee)分别是SEQ ID NO:1567和1602；
ff)分别是SEQ ID NO:1568和1603；
gg)分别是SEQ ID NO:1569和1604；
hh)分别是SEQ ID NO:1570和1605；
ii)分别是SEQ ID NO:1571和1606；以及
jj)分别是SEQ ID NO:1681和1586。
在一些方面，有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
b)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
c)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
f)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
g)分别是SEQ ID NO:1558和1594；
h)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
i)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
j)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
k)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
l)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
m)分别是SEQ ID NO:1681和1586。
在一些方面，有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
b)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
c)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及，
f)分别是SEQ ID NO:1681和1586。
在一些方面，有义链包含如SEQ ID NO:1553所示的核苷酸序列，并且反义链包含如SEQ ID NO:1588所示的核苷酸序列。在一些方面，有义链包含如SEQ ID NO:1560所示的核苷酸序列，并且反义链包含如SEQ ID NO:1595所示的核苷酸序列。在一些方面，有义链包含如SEQ ID NO:1564所示的核苷酸序列，并且反义链包含如SEQ ID NO:1599所示的核苷酸序列。在一些方面，有义链包含如SEQ ID NO:1551所示的核苷酸序列，并且反义链包含如SEQ ID NO:1586所示的核苷酸序列。在一些方面，有义链包含如SEQ ID NO:1570所示的核苷酸序列，并且反义链包含如SEQ ID NO:1605所示的核苷酸序列。在一些方面，有义链包含如SEQ ID NO:1681所示的核苷酸序列，并且反义链包含如SEQ ID NO:1586所示的核苷酸序列。
在前述或相关方面中的任一者中，反义链的长度为22个核苷酸。在一些方面，反义链包含含有选自SEQ ID NO:1588、1595、1599、1586和1605的核苷酸序列的核苷酸序列。在一些方面，有义链的长度为36个核苷酸。在一些方面，有义链包含含有选自SEQ ID NO:1865、1721、1847、1846和1955的核苷酸序列的核苷酸序列。在一些方面，有义链包含选自SEQ ID NO:1553、1560、1564、1551和1570的核苷酸序列。
在前述或相关方面中的任一者中，有义链包含SEQ ID NO:1607-1641和1682中的任一者的核苷酸序列。在一些方面，反义链包含SEQ ID NO:1642-1676中的任一者的核苷酸序列。
在一些方面，有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1607和1642；
b)分别是SEQ ID NO:1608和1643；
c)分别是SEQ ID NO:1609和1644；
d)分别是SEQ ID NO:1610和1645；
e)分别是SEQ ID NO:1611和1646；
f)分别是SEQ ID NO:1612和1647；
g)分别是SEQ ID NO:1613和1648；
h)分别是SEQ ID NO:1614和1649；
i)分别是SEQ ID NO:1615和1650；
j)分别是SEQ ID NO:1616和1651；
k)分别是SEQ ID NO:1617和1652；
l)分别是SEQ ID NO:1618和1653；
m)分别是SEQ ID NO:1619和1654；
n)分别是SEQ ID NO:1620和1655；
o)分别是SEQ ID NO:1621和1656；
p)分别是SEQ ID NO:1622和1657；
q)分别是SEQ ID NO:1623和1658；
r)分别是SEQ ID NO:1624和1659；
s)分别是SEQ ID NO:1625和1660；
t)分别是SEQ ID NO:1626和1661；
u)分别是SEQ ID NO:1627和1662；
v)分别是SEQ ID NO:1628和1663；
w)分别是SEQ ID NO:1629和1664；
x)分别是SEQ ID NO:1630和1665；
y)分别是SEQ ID NO:1631和1666；
z)分别是SEQ ID NO:1632和1667；
aa)分别是SEQ ID NO:1633和1668；
bb)分别是SEQ ID NO:1634和1669；
cc)分别是SEQ ID NO:1635和1670；
dd)分别是SEQ ID NO:1636和1671；
ee)分别是SEQ ID NO:1637和1672；
ff)分别是SEQ ID NO:1638和1673；
gg)分别是SEQ ID NO:1639和1674；
hh)分别是SEQ ID NO:1640和1675；
ii)分别是SEQ ID NO:1641和1676；以及，
jj)分别是SEQ ID NO:1682和1656。
在一些方面，有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1610和1645；
b)分别是SEQ ID NO:1614和1649；
c)分别是SEQ ID NO:1616和1651；
d)分别是SEQ ID NO:1621和1656；
e)分别是SEQ ID NO:1622和1657；
f)分别是SEQ ID NO:1623和1658；
g)分别是SEQ ID NO:1629和1664；
h)分别是SEQ ID NO:1630和1665；
i)分别是SEQ ID NO:1634和1669；
j)分别是SEQ ID NO:1635和1670；
k)分别是SEQ ID NO:1636和1671；
l)分别是SEQ ID NO:1640和1675；以及，
m)分别是SEQ ID NO:1682和1656。
在一些方面，有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1623和1658；
b)分别是SEQ ID NO:1630和1665；
c)分别是SEQ ID NO:1634和1669；
d)分别是SEQ ID NO:1621和1656；
e)分别是SEQ ID NO:1640和1675；以及，
f)分别是SEQ ID NO:1682和1656。
在一些方面，有义链包含如SEQ ID NO:1623所示的核苷酸序列，并且反义链包含如SEQ ID NO:1658所示的核苷酸序列。在一些方面，有义链包含如SEQ ID NO:1630所示的核苷酸序列，并且反义链包含如SEQ ID NO:1665所示的核苷酸序列。在一些方面，有义链包含如SEQ ID NO:1634所示的核苷酸序列，并且反义链包含如SEQ ID NO:1669所示的核苷酸序列。在一些方面，有义链包含如SEQ ID NO:1621所示的核苷酸序列，并且反义链包含如SEQ ID NO:1656所示的核苷酸序列。在一些方面，有义链包含如SEQ ID NO:1640所示的核苷酸序列，并且反义链包含如SEQ ID NO:1676所示的核苷酸序列。在一些方面，有义链包含如SEQ ID NO:1682所示的核苷酸序列，并且反义链包含如SEQ ID NO:1656所示的核苷酸序列。
在一些方面，有义链包含5'-[mCs][mA][fG][mC][fA][mG][mU][fG][mA][fU][mU][fG][fA][mA][fG][mU][fA][mU][mC][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3'(SEQ ID NO:1623)的序列和所有修饰，并且其中反义链包含5'-[Me膦酸酯-4O-mUs][fGs][fA][fU][fA][mC][fU][mU][mC][fA][mA][mU][mC][fA][mC][fU][mG][mC][fU][mGs][mGs][mG]-3'(SEQID NO:1658)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG、mU＝2′-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU＝2′-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中ademA-GalNAc＝
在一些方面，有义链包含5'-[mAs][mG][fA][mG][fC][mA][mA][fG][mU][fG][mA][fC][fA][mA][fA][mU][fG][mU][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3'(SEQ ID NO:1630)的序列和所有修饰，并且其中反义链包含5'-[Me膦酸酯-4O-mUs][fAs][fA][fC][fA][mU][fU][mU][mG][fU][mC][mA][mC][fU][mU][fG][mC][mU][fC][mUs][mGs][mG]-3'(SEQID NO:1665)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG、mU＝2′-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU＝2′-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中ademA-GalNAc＝
在一些方面，有义链包含5'-[mAs][mG][fU][mC][fA][mU][mG][fA][mC][fA][mU][fU][fU][mC][fU][mC][fA][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3'(SEQ ID NO:1634)的序列和所有修饰，并且其中反义链包含5'-[Me膦酸酯-4O-mUs][fUs][fU][fU][fG][mA][fG][mA][mA][fA][mU][mG][mU][fC][mA][fU][mG][mA][fC][mUs][mGs][mG]-3'(SEQID NO:1669)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG、mU＝2′-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU＝2′-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中ademA-GalNAc＝
在一些方面，有义链包含5'-[mCs][mA][fG][mU][fC][mA][mU][fG][mA][fC][mA][fU][fU][mU][fC][mU][fC][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3'(SEQ ID NO:1621)的序列和所有修饰，并且其中反义链包含5'-[Me膦酸酯-4O-mUs][fUs][fU][fG][fA][mG][fA][mA][mA][fU][mG][mU][mC][fA][mU][fG][mA][mC][fU][mGs][mGs][mG]-3'(SEQID NO:1656)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG、mU＝2′-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU＝2′-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中ademA-GalNAc＝
在一些方面，有义链包含5'-[mAs][mG][fU][mU][fG][mU][mU][fA][mG][fU][mG][fA][fU][mU][fU][mG][fC][mU][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3'(SEQ ID NO:1640)的序列和所有修饰，并且其中反义链包含5'-[Me膦酸酯-4O-mUs][fUs][fA][fG][fC][mA][fA][mA][mU][fC][mA][mC][mU][fA][mA][fC][mA][mA][fC][mUs][mGs][mG]-3'(SEQID NO:1675)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG、mU＝2′-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU＝2′-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中ademA-GalNAc＝
在一些方面，有义链包含5'-[ademCs-C16][mA][fG][mU][fC][mA][mU][fG][mA][fC][mA][fU][fU][mU][fC][mU][fC][mAs][mAs][mA]-3'(SEQ ID NO:1682)的序列和所有修饰，并且其中反义链包含5'-[Me膦酸酯-4O-mUs][fUs][fU][fG][fA][mG][fA][mA][mA][fU][mG][mU][mC][fA][mU][fG][mA][mC][fU][mGs][mGs][mG]-3'(SEQ ID NO:1656)的序列和所有修饰，其中mC、mA、mG、mU＝2′-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU＝2′-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且[ademC s-C16]＝
在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所描述的RNAi寡核苷酸和药学上可接受的载体、递送剂或赋形剂。
在其它方面，本公开提供了一种用于治疗患有与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的RNAi寡核苷酸或其药物组合物，从而治疗所述受试者。
在其它方面，本公开提供了一种将寡核苷酸递送至受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所描述的药物组合物。
在其它方面，本公开提供了一种用于降低细胞、细胞群体或受试者中的SNCA基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：
i.使所述细胞或所述细胞群体与本文所描述的RNAi寡核苷酸或药物组合物接触；或
ii.向所述受试者施用本文所描述的RNAi寡核苷酸或药物组合物。
在一些方面，降低SNCA基因表达包括降低SNCA mRNA的量或水平、SNCA蛋白的量或水平或两者。在一些方面，受试者患有与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患。在一些方面，与SNCA表达相关的疾病、病症或疾患是多系统萎缩、路易体痴呆(dementia with Lewybodies)或帕金森病(Parkinson disease)。
在前述或相关方面中的任一者中，使用本文所描述的RNAi寡核苷酸或药物组合物，SNCA基因表达在CNS的一个或多个区域的组织中降低，其中所述组织与帕金森病相关。在一些方面，与帕金森病相关的组织选自：壳核、中脑被盖、黑质、脑桥和髓质。在一些方面，SNCA基因表达在CNS的一个或多个区域的组织中降低，其中所述组织与多系统萎缩相关。在一些方面，与多系统萎缩相关的组织选自：尾状核、壳核、中脑被盖、黑质、脑桥、小脑皮层、小脑白质、髓质、颈脊髓、胸脊髓和腰脊髓。在一些方面，SNCA基因表达在CNS的一个或多个区域中降低，所述一个或多个区域选自：颈脊髓、胸脊髓、腰脊髓、额叶皮层、颞叶皮层、小脑、中脑、枕叶皮层、顶叶皮层、海马体、尾状核、丘脑、脑干、运动皮层、苍白球、中脑被盖、黑质、脑桥、小脑白质和小脑齿状核。在一些方面，SNCA基因表达在CNS的一个或多个区域中降低，所述一个或多个区域选自：颈脊髓、胸脊髓、腰脊髓、额叶皮层、颞叶皮层、小脑、中脑、枕叶皮层、顶叶皮层、海马体、尾状核、丘脑、脑干、运动皮层、苍白球、中脑被盖、黑质、脑桥、小脑白质、小脑齿状核、L1背根神经节(DRG)、L2 DRG、L3 DRG、L4 DRG、L5 DRG、L6 DRG、壳核、中脑被盖、黑质、脑桥、髓质、小脑皮层和小脑白质。
在前述或相关方面中的任一者中，RNAi寡核苷酸或药物组合物与第二组合物或治疗剂组合施用。
在其它方面，本公开提供了本文所描述的RNAi寡核苷酸或药物组合物的用途，所述用途是用于制造用以治疗与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的药剂。
在其它方面，本公开提供了本文所描述的RNAi寡核苷酸或药物组合物，所述RNAi寡核苷酸或药物组合物用于或适用于治疗与SNCA表达相关的疾病、病症或疾患。
在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本文所描述的RNAi寡核苷酸、任选的药学上可接受的载体和包装插页，所述包装插页包含用于向患有与SNCA表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用的说明书。
在前述或相关方面中的任一者中，与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患是多系统萎缩、路易体痴呆和帕金森病。
附图说明
图1A和图1B提供了描绘在用GalNAc缀合的SNCA靶向寡核苷酸处理后外源性表达人类SNCA的小鼠(流体动力学注射模型)的肝脏中残留的人类SNCA mRNA的百分比(％)的图。向CD-1小鼠皮下给予3mg/kg在PBS中配制的指定GalNAc缀合的SNCA靶向寡核苷酸。给药后三天，向小鼠流体动力学注射(HDI)编码人类SNCA的DNA质粒。24小时后从收集的肝脏中确定人类SNCA mRNA的水平。Hs-Mf＝构建体是人类和猴SNCA特异性的。Hs-Mf-Mm＝构建体是人类、猴和小鼠SNCA特异性的。SNCA-291用作基准对照。
图2A和图2B提供了描绘基于图1A-1B中所示的抑制功效选择的GalNAc缀合的SNCA寡核苷酸的剂量反应的图。如图1A-1B中所描述在CD-1HDI小鼠中测量肝脏组织中残留的SNCA mRNA的百分比(％)。在注射0.3mg/kg、1.0mg/kg或3mg/kg指定GalNAc缀合的SNCA寡核苷酸后，在两个群组中确定残留的mRNA百分比(％)，图2A和图2B。Hs-Mf＝构建体是人类和猴SNCA特异性的。Hs-Mf-Mm＝构建体是人类、猴和小鼠SNCA特异性的。
图3A-3S提供了描绘在用GalNAc缀合的SNCA靶向寡核苷酸处理后在NHP的CNS中残留的非人类灵长类动物(NHP；Mf)SNCA mRNA的百分比(％)的图。在研究第0天和第7天，通过大池内(i.c.m)注射50mg在人工脑脊髓液(aCSF)中配制的指定GalNAc缀合的SNCA靶向寡核苷酸向NHP给药。相对于aCSF处理的动物中残留的SNCA mRNA的百分比(％)确定SNCAmRNA的水平。测量的中枢神经组织包括额叶皮层(图3A)、尾状核(图3B)、海马体(图3C)、中脑(图3D)、顶叶皮层(图3E)、枕叶皮层(图3F)、丘脑(图3G)、颞叶皮层(图3H)、小脑(图3I)、脑干(图3J)、颈脊髓(图3K)、胸脊髓(图3L)、腰脊髓(图3M)、L1背根神经节(DRG)(图3N)、L2 DRG(图3O)、L3 DRG(图3P)、L4 DRG(图3Q)、L5 DRG(图3R)和L6 DRG(图3S)。GaLXC＝GalNAc缀合的SNCA靶向寡核苷酸。
图4A-4B提供了描绘与帕金森氏病相关的NHP CNS组织中残留的非人类灵长类动物(NHP；Mf)SNCAmRNA的百分比(％)(图4A)和寡核苷酸的浓度(图4B)的图。向NHP鞘内施用缀合至C16脂质的aCSF或SNCA-B15。在施用寡核苷酸后28天收集并分析组织。
图5A-5B提供了描绘与多系统萎缩相关的NHP CNS组织中残留的非人类灵长类动物(NHP；Mf)SNCA mRNA的百分比(％)(图5A)和寡核苷酸的浓度(图5B)的图。向NHP鞘内施用缀合至C16脂质的aCSF或SNCA-B15。在施用寡核苷酸后28天收集并分析组织。
具体实施方式
根据一些方面，本公开提供了降低CNS中的SNCA基因表达的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文所提供的寡核苷酸被设计为治疗与CNS中的SNCA表达相关的疾病。在其它实施方案中，本公开提供了通过降低细胞(例如，CNS的细胞)中的SNCA基因表达来治疗与SNCA表达相关的疾病的方法。
SNCA表达的寡核苷酸抑制剂
本公开尤其提供了抑制SNCA基因表达的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)。在一些实施方案中，抑制SNCA基因表达的寡核苷酸靶向SNCA mRNA。
SNCA靶序列
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)靶向包含SNCA mRNA的靶序列。在一些实施方案中，本文所描述的寡核苷酸靶向SNCA mRNA序列内的靶序列。
在一些实施方案中，本文所描述的寡核苷酸对应于SNCA mRNA序列内的靶序列。在一些实施方案中，寡核苷酸或其部分、片段或链(例如，ds RNAi寡核苷酸的反义链或引导链)结合或粘接至包含SNCA mRNA的靶序列，从而抑制SNCA基因表达。
在一些实施方案中，寡核苷酸靶向SNCA靶序列以用于体内抑制SNCA基因表达的目的。在一些实施方案中，靶向SNCA靶序列的寡核苷酸抑制SNCA基因表达的量或程度与寡核苷酸的效力相关联。在一些实施方案中，靶向SNCA靶序列的寡核苷酸抑制SNCA基因表达的量或程度与患有用寡核苷酸治疗的与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的受试者或患者中的治疗效益的量或程度相关联。
通过检查编码SNCA的mRNA的核苷酸序列，包括多个不同物种(例如，人类、食蟹猴和小鼠；参见例如实施例1)的mRNA，并且作为体外和体内测试的结果(参见例如实施例2-5)，已发现SNCA mRNA的某些核苷酸序列比其它更易发生基于寡核苷酸的抑制并且因此可用作本文的寡核苷酸的靶序列。在一些实施方案中，本文所描述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的有义链包含SNCA靶序列。在一些实施方案中，本文所描述的ds寡核苷酸的有义链的一部分或区域包含SNCA靶序列。在一些实施方案中，SNCA靶序列包含SEQ ID NO:1683-2066中的任一者的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方案中，SNCA靶序列包含SEQ IDNo:1781、1782、1796、1798、1802、1808、1814、1817、1713、1718、1726、1830、1839、1742、1846、1852、1865、1784、1804、1721、1822、1840、1735、1847、1855、1864、1901、1902、1938、1947、1955、1964、1973和1978中的任一者的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方案中，SNCA靶序列包含SEQ ID No:1798、1817、1718、1846、1852、1865、1804、1721、1847、1855、1864和1955中的任一者的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方案中，SNCA靶序列包含SEQID NO:1865、1721、1847、1846和1955中的任一者的核苷酸序列或由其组成。在一些实施方案中，SNCA靶序列包含SEQ ID NO:1865所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，SNCA靶序列包含SEQ ID NO:1721所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，SNCA靶序列包含SEQ ID NO:1847所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，SNCA靶序列包含SEQ ID NO:1846所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，SNCA靶序列包含SEQ ID NO:1955所示的核苷酸序列。
SNCA靶向序列
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸具有SNCA mRNA(例如，在SNCA mRNA的靶序列内)的互补区域以用于靶向细胞中的mRNA并抑制其表达的目的。在一些实施方案中，寡核苷酸包含具有互补区域的SNCA靶向序列(例如，ds寡核苷酸的反义链或引导链)，所述互补区域通过互补(沃森-克里克(Watson-Crick))碱基配对结合或粘接至SNCA靶序列。靶向序列或互补区域一般具有适合的长度和碱基含量，以使寡核苷酸(或其链)能够结合或粘接至SNCA mRNA以用于抑制其表达的目的。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约26个、至少约27个、至少约28个、至少约29个或至少约30个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域为至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为约12至约30个(例如，12至30个、12至22个、15至25个、17至21个、18至27个、19至27个或15至30个)核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为23个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域的长度为24个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ IDNO:1683-2066中的任一者的序列互补的靶向序列或互补区域，并且靶向序列或互补区域的长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1683-2066中的任一者的序列互补的靶向序列或互补区域，并且靶向序列或互补区域的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1-384中的任一者的序列互补的靶向序列或互补区域，并且靶向序列或互补区域的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1-384中的任一者的序列互补的靶向序列或互补区域，并且靶向序列或互补区域的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1-384中的任一者的序列互补的靶向序列或互补区域，并且靶向序列或互补区域的长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1-384中的任一者的序列互补的靶向序列或互补区域，并且靶向序列或互补区域的长度为23个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1-384中的任一者的序列互补的靶向序列或互补区域，并且靶向序列或互补区域的长度为24个核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SNCA靶序列完全互补的靶向序列或互补区域(例如，ds寡核苷酸的反义链或引导链)。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域与SNCA靶序列部分互补。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1683-2066中的任一者的序列完全互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1683-2066中的任一者的序列部分互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1781、1782、1796、1798、1802、1808、1814、1817、1713、1718、1726、1830、1839、1742、1846、1852、1865、1784、1804、1721、1822、1840、1735、1847、1855、1864、1901、1902、1938、1947、1955、1964、1973和1978中的任一者的序列完全互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1781、1782、1796、1798、1802、1808、1814、1817、1713、1718、1726、1830、1839、1742、1846、1852、1865、1784、1804、1721、1822、1840、1735、1847、1855、1864、1901、1902、1938、1947、1955、1964、1973和1978中的任一者的序列部分互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1798、1817、1718、1846、1852、1865、1804、1721、1847、1855、1864和1955中的任一者的序列完全互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1798、1817、1718、1846、1852、1865、1804、1721、1847、1855、1864和1955中的任一者的序列部分互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1865、1721、1847、1846和1955中的任一者的序列完全互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1865、1721、1847、1846和1955中的任一者的序列部分互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1865所示的序列完全互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1721所示的序列完全互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1847所示的序列完全互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQID NO:1846所示的序列完全互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1955所示的序列完全互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1865中的任一者的序列部分互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1721的序列部分互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1847的序列部分互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1846的序列部分互补的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1955的序列部分互补的靶向序列或互补区域。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含与包含SNCA mRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中所述连续核苷酸序列的长度为约12至约30个核苷酸(例如，长度为12至30个、12至28个、12至26个、12至24个、12至20个、12至18个、12至16个、14至22个、16至20个、18至20个或18至19个核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与包含SNCAmRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中所述连续核苷酸序列的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与包含SNCA mRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中所述连续核苷酸序列的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与包含SNCA mRNA的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中所述连续核苷酸序列的长度为20个核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1683-2066中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，任选地其中所述连续核苷酸序列的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1781、1782、1796、1798、1802、1808、1814、1817、1713、1718、1726、1830、1839、1742、1846、1852、1865、1784、1804、1721、1822、1840、1735、1847、1855、1864、1901、1902、1938、1947、1955、1964、1973和1978中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，任选地其中所述连续核苷酸序列的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1798、1817、1718、1846、1852、1865、1804、1721、1847、1855、1864和1955中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，任选地其中所述连续核苷酸序列的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1865、1721、1847、1846和1955的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，任选地其中所述连续核苷酸序列的长度为19个核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的靶向序列或互补区域与如SEQ ID NO:1683-2066中的任一者所示的连续核苷酸序列互补并且跨越反义链的整个长度。在一些实施方案中，寡核苷酸的靶向序列或互补区域与如SEQ ID NO:1683-2066中的任一者所示的连续核苷酸序列互补并且跨越反义链的整个长度的一部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与跨越如SEQ ID NO:1683-2066中的任一者所示的序列的核苷酸1-20的连续核苷酸段至少部分(例如，完全)互补的互补区域(例如，在ds寡核苷酸的反义链上)。在一些实施方案中，寡核苷酸的靶向序列或互补区域与如SEQ ID NO:1-384中的任一者所示的连续核苷酸序列互补并且跨越反义链的整个长度。在一些实施方案中，寡核苷酸的互补区域与如SEQ ID NO:1-384中的任一者所示的连续核苷酸序列互补并且跨越反义链的整个长度的一部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与跨越如SEQ ID NO:1-384中的任一者所示的序列的核苷酸1至19的连续核苷酸段至少部分(例如，完全)互补的互补区域(例如，在ds寡核苷酸的反义链上)。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含与相应SNCA靶序列具有一个或多个碱基对(bp)错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有至多约1个、至多约2个、至多约3个、至多约4个、至多约5个等错配，前提条件为靶向序列或互补区域在适当杂交条件下结合或粘接至SNCA mRNA的能力和/或寡核苷酸抑制SNCA基因表达的能力得以维持。或者，在一些实施方案中，靶向序列或互补区域包含不多于1个、不多于2个、不多于3个、不多于4个或不多于5个与相应SNCA靶序列的错配，前提条件为靶向序列或互补区域在适当杂交条件下结合或粘接至SNCA mRNA的能力和/或寡核苷酸抑制SNCA基因表达的能力得以维持。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与相应靶序列具有1个错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与相应靶序列具有2个错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与相应靶序列具有3个错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与相应靶序列具有4个错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与相应靶序列具有5个错配的靶向序列或互补区域。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与相应靶序列具有多于一个错配(例如，2、3、4、5个或更多个错配)的靶向序列或互补区域，其中至少2个(例如，所有)错配连续定位(例如，连续2、3、4、5个或更多个错配)，或其中错配散布于整个靶向序列或互补区域的任何位置。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与相应靶序列具有多于一个错配(例如，2、3、4、5个或更多个错配)的靶向序列或互补区域，其中至少2个(例如，所有)错配连续定位(例如，连续2、3、4、5个或更多个错配)，或其中至少一个或多个非错配碱基对位于错配之间，或它们的组合。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1683-2066中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有至多约1个、至多约2个、至多约3个、至多约4个、至多约5个等错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1683-2066中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有不多于1个、不多于2个、不多于3个、不多于4个或不多于5个错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1781、1782、1796、1798、1802、1808、1814、1817、1713、1718、1726、1830、1839、1742、1846、1852、1865、1784、1804、1721、1822、1840、1735、1847、1855、1864、1901、1902、1938、1947、1955、1964、1973和1978中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有至多约1个、至多约2个、至多约3个、至多约4个、至多约5个等错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1781、1782、1796、1798、1802、1808、1814、1817、1713、1718、1726、1830、1839、1742、1846、1852、1865、1784、1804、1721、1822、1840、1735、1847、1855、1864、1901、1902、1938、1947、1955、1964、1973和1978中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有不多于1个、不多于2个、不多于3个、不多于4个或不多于5个错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1798、1817、1718、1846、1852、1865、1804、1721、1847、1855、1864和1955中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有至多约1个、至多约2个、至多约3个、至多约4个、至多约5个等错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1798、1817、1718、1846、1852、1865、1804、1721、1847、1855、1864和1955中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有不多于1个、不多于2个、不多于3个、不多于4个或不多于5个错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQID NO:1865、1721、1847、1846和1955中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有至多约1个、至多约2个、至多约3个、至多约4个、至多约5个等错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1865、1721、1847、1846和1955中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有不多于1个、不多于2个、不多于3个、不多于4个或不多于5个错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1865的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有至多约1个、至多约2个、至多约3个、至多约4个、至多约5个等错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1865的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有不多于1个、不多于2个、不多于3个、不多于4个或不多于5个错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1721的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有至多约1个、至多约2个、至多约3个、至多约4个、至多约5个等错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQID NO:1721的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有不多于1个、不多于2个、不多于3个、不多于4个或不多于5个错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1847的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有至多约1个、至多约2个、至多约3个、至多约4个、至多约5个等错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1847的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有不多于1个、不多于2个、不多于3个、不多于4个或不多于5个错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1846的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有至多约1个、至多约2个、至多约3个、至多约4个、至多约5个等错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1846的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有不多于1个、不多于2个、不多于3个、不多于4个或不多于5个错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1955的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有至多约1个、至多约2个、至多约3个、至多约4个、至多约5个等错配。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1955的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中靶向序列或互补区域可以与相应SNCA靶序列具有不多于1个、不多于2个、不多于3个、不多于4个或不多于5个错配。
寡核苷酸的类型
多种寡核苷酸类型和/或结构可用于在本文的方法中靶向SNCA mRNA，包括但不限于RNAi寡核苷酸、反义寡核苷酸、miRNA等。本文或别处描述的任何寡核苷酸类型都预期用作框架以并入本文的SNCA mRNA靶向序列以用于抑制SNCA基因表达的目的。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸通过参与切丁酶(Dicer)涉入的上游或下游的RNA干扰(RNAi)通路(例如，RNAi寡核苷酸)来抑制SNCA基因表达。举例来说，已开发了RNAi寡核苷酸，其中每个链具有约19至约25个核苷酸的大小与至少一个具有约1至约5个核苷酸的3'悬垂(参见例如美国专利号8,372,968)。还已开发了更长的寡核苷酸，其由切丁酶加工以产生活性RNAi产物(参见例如美国专利号8,883,996)。进一步工作产生延伸的ds寡核苷酸，其中至少一个链的至少一端延伸超出双链体靶向区域，包括其中一个链包括热力学稳定的四环结构的结构(参见例如美国专利号8,513,207和8,927,705，以及国际专利申请公布号WO 2010/033225)。此类结构可以包括单链(ss)延伸(在分子的一侧或两侧)以及ds延伸。
在一些实施方案中，寡核苷酸参与切丁酶涉入(例如，切丁酶裂解)的下游的RNAi通路。在一些实施方案中，寡核苷酸在有义链的3'端具有悬垂(例如，长度为1、2或3个核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸(例如，siRNA)包含与靶mRNA(例如，SNCA mRNA)反义的21个核苷酸的反义链和互补的过客有义链，其中两个链粘接形成19-bp双链体以及在任一个或两个3'端的2个核苷酸的悬垂。还预期更长的寡核苷酸设计，包括具有23个核苷酸的反义链和21个核苷酸的过客链的寡核苷酸，其中在分子的右侧(有义链的3'端/反义链的5'端)存在平端并且在分子的左侧(有义链的5'端/反义链的3'端)存在两个核苷酸的3′反义链悬垂。在此类分子中，存在21-bp双链体区域。参见例如美国专利号9,012,138、9,012,621和9,193,753。
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含长度均在约17至约36个(例如，17至26个、20至25个或21-23个)核苷酸范围内的有义链和反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为19-30个核苷酸的反义链和长度为19-50个核苷酸的有义链，其中所述反义链和所述有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3′末端具有1-4个核苷酸的悬垂。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度均在约19至约22个核苷酸范围内的有义链和反义链。在一些实施方案中，有义链和反义链的长度相等。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，使得在有义链或反义链任一者上或有义链和反义链两者上存在3'悬垂。在一些实施方案中，对于具有长度均在约21-23个核苷酸范围内的有义链和反义链的寡核苷酸，有义链、反义链或两个链上的3'悬垂的长度为1或2个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸具有22个核苷酸的有义链和20个核苷酸的反义链，其中在分子的右侧(有义链的3'端/反义链的5'端)存在平端并且在分子的左侧(有义链的5'端/反义链的3'端)存在2个核苷酸的3'反义链悬垂。在此类分子中，存在20-bp双链体区域。
用于本文的组合物和方法的其它寡核苷酸设计包括：16-mer siRNA(参见例如NUCLEIC ACIDS IN CHEMISTRY AND BIOLOGY,Blackburn(编),Royal Society ofChemistry,2006)、shRNA(例如，具有19bp或更短的茎；参见例如Moore等人(2010)METHODSMOL.BIOL.629:141-58)、钝性siRNA(例如，长度为19bp；参见例如Kraynack和Baker(2006)RNA 12:163-76)、不对称siRNA(aiRNA；参见例如Sun等人(2008)Nat.Biotechnol.26:1379-82)、不对称较短双链体siRNA(参见例如Chang等人(2009)mol.Ther.17:725-732)、叉形siRNA(参见例如Hohjoh(2004)FEBS Lett.557:193-98)、单链siRNA(Elsner(2012)Nat.Biotechnol.30:1063)、哑铃形环状siRNA(参见例如Abe等人(2007)j.Am.Chem.Soc.129:15108-09)，和小内部分段干扰RNA(siRNA；参见例如Bramsen等人(2007)Nucleic Acids Res.35:5886-97)。在一些实施方案中可以用于降低或抑制SNCA基因表达的寡核苷酸设计的其它非限制性实例是微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和短siRNA(参见例如Hamilton等人(2002)EMBO J.21:4671-79；还参见美国专利申请公布号2009/0099115)。
此外，在一些实施方案中，本文中用于降低或抑制SNCA基因表达的寡核苷酸是ss。此类结构可以包括但不限于ss RNAi分子。最近的努力已证明了ss RNAi分子的活性(参见例如Matsui等人(2016)Mol.Ther.24:946-955)。然而，在一些实施方案中，寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)。反义寡核苷酸是具有核碱基序列的ss寡核苷酸，并且当按5′至3'方向书写或描绘时，所述核碱基序列包含特定核酸的靶向区段的反向补体并且经适当修饰(例如，作为间聚体(gapmer))以诱导细胞中RNaseH介导的其靶RNA的裂解或(例如，作为混聚体(mixmer))以抑制细胞中靶mRNA的翻译。用于本文中的ASO可以按本领域中已知的任何适合的方式进行修饰，包括例如美国专利号9,567,587中所示(包括例如长度、核碱基(嘧啶、嘌呤)的糖部分和核碱基的杂环部分的改变)。此外，ASO数十年来已用于降低特定靶基因的表达(参见例如Bennett等人(2017)Annu.Rev.Pharmacol.57:81-105)。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸(ASO)与SNCA mRNA共享互补区域。在一些实施方案中，ASO靶向鉴定为NM_000345.3的人类SNCA的各个区域。在一些实施方案中，ASO的长度为约15至约50个核苷酸。在一些实施方案中，ASO的长度为15-25个核苷酸。在一些实施方案中，ASO的长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，ASO与SEQ ID NO:1683-2066中的任一者互补。在一些实施方案中，ASO的长度为至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，ASO的长度为至少19个连续核苷酸。在一些实施方案中，ASO的长度为至少20个连续核苷酸。在一些实施方案中，ASO与靶序列相差1、2或3个核苷酸。
双链RNAi寡核苷酸
在一些方面，本公开提供了用于靶向SNCA mRNA并且抑制SNCA基因表达(例如，经由RNAi通路)的ds RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含有义链(在本文中也称作过客链)和反义链(在本文中也称作引导链)。在一些实施方案中，有义链和反义链是独立链并且不共价连接。在一些实施方案中，有义链与反义链共价连接。在一些实施方案中，有义链和反义链形成双链体区域，其中有义链和反义链或其一部分以互补方式(例如，通过沃森-克里克碱基配对)彼此结合。
在一些实施方案中，有义链具有第一区域(R1)和第二区域(R2)，其中R2包含第一亚区域(S1)、环(L)(诸如四环(tetraL)或三环(triL))和第二亚区域(S2)，其中L位于S1与S2之间，并且其中S1和S2形成第二双链体(D2)。D2可以具有各种长度。在一些实施方案中，D2的长度为约1至约6bp。在一些实施方案中，D2的长度为2-6、3-6、4-6、5-6、1-5、2-5、3-5或4-5bp。在一些实施方案中，D2的长度为1、2、3、4、5或6bp。在一些实施方案中，D2的长度为6bp。
在一些实施方案中，有义链的R1和反义链形成第一双链体(D1)。在一些实施方案中，D1的长度为至少约15个(例如，至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个)核苷酸。在一些实施方案中，D1的长度在约12至约30个核苷酸范围内(例如，长度为12至30个、12至27个、15至22个、18至22个、18至25个、18至27个、18至30个或21至30个核苷酸)。在一些实施方案中，D1的长度为至少12个核苷酸(例如，长度为至少12个、至少15个、至少20个、至少25个或至少30个核苷酸)。在一些实施方案中，D1的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，D1的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，D1的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，包含有义链和反义链的D1不跨越有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施方案中，包含有义链和反义链的D1跨越有义链或反义链任一者或两者的整个长度。在某些实施方案中，包含有义链和反义链的D1跨越有义链或反义链两者的整个长度。
在一些实施方案中，有义链的长度为36个核苷酸并且位置从5'至3′编号为1-36。在一些实施方案中，反义链的长度为22个核苷酸并且位置从5'至3'编号为1-22。在一些实施方案中，本文所描述的位置编号遵循这种编号格式。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含具有SEQ ID NO:1-384中的任一者的序列的有义链和包含SEQ ID NO:385-768中的任一者的互补序列的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含具有SEQ ID NO:1683-2066的序列的有义链和包含SEQ ID NO:2067-2450中的任一者的互补序列的反义链。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含具有SEQ ID NO:1537-1571中的任一者的序列的有义链和包含SEQ ID NO:1572-1606中的任一者的互补序列的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含具有SEQ ID NO:1537-1571和1681中的任一者的序列的有义链和包含SEQID NO:1572-1606中的任一者的互补序列的反义链。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，所述有义链和所述反义链包含选自以下的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1537和1572；
b)分别是SEQ ID NO:1538和1573；
c)分别是SEQ ID NO:1539和1574；
d)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
e)分别是SEQ ID NO:1541和1576；
f)分别是SEQ ID NO:1542和1577；
g)分别是SEQ ID NO:1543和1578；
h)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
i)分别是SEQ ID NO:1545和1580；
j)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
k)分别是SEQ ID NO:1547和1582；
l)分别是SEQ ID NO:1548和1583；
m)分别是SEQ ID NO:1549和1584；
n)分别是SEQ ID NO:1550和1585；
o)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
p)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
q)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
r)分别是SEQ ID NO:1554和1589；
s)分别是SEQ ID NO:1555和1590；
t)分别是SEQ ID NO:1556和1591；
u)分别是SEQ ID NO:1557和1592；
v)分别是SEQ ID NO:1558和1593；
w)分别是SEQ ID NO:1559和1594；
x)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
y)分别是SEQ ID NO:1561和1596；
z)分别是SEQ ID NO:1562和1597；
aa)分别是SEQ ID NO:1563和1598；
bb)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
cc)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
dd)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
ee)分别是SEQ ID NO:1567和1602；
ff)分别是SEQ ID NO:1568和1603；
gg)分别是SEQ ID NO:1569和1604；
hh)分别是SEQ ID NO:1570和1605；
ii)分别是SEQ ID NO:1571和1606；以及
jj)分别是SEQ ID NO:1681和1586。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，所述有义链和所述反义链包含选自以下的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
b)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
c)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
f)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
g)分别是SEQ ID NO:1558和1594；
h)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
i)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
j)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
k)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
l)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
m)分别是SEQ ID NO:1681和1586。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，所述有义链和所述反义链包含选自以下的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
b)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
c)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
f)分别是SEQ ID NO:1681和1586。
在一些实施方案中，有义链包含SEQ ID NO:1553的序列，并且反义链包含SEQ IDNO:1588的序列。在一些实施方案中，有义链包含SEQ ID NO:1560的序列，并且反义链包含SEQ ID NO:1595的序列。在一些实施方案中，有义链包含SEQ ID NO:1564的序列，并且反义链包含SEQ ID NO:1599的序列。在一些实施方案中，有义链包含SEQ ID NO:1551的序列，并且反义链包含SEQ ID NO:1586的序列。在一些实施方案中，有义链包含SEQ ID NO:1570的序列，并且反义链包含SEQ ID NO:1605的序列。在一些实施方案中，有义链包含SEQ ID NO:1681的序列，并且反义链包含SEQ ID NO:1586的序列。
应了解，在一些实施方案中，在描述寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)或其它核酸的结构时可以参考序列表中呈现的序列。在此类实施方案中，实际寡核苷酸或其它核酸当与指定序列相比时可以具有一个或多个替代性核苷酸(例如，DNA核苷酸的RNA对应物或RNA核苷酸的DNA对应物)和/或一个或多个经修饰的核苷酸和/或一个或多个经修饰的核苷酸间键和/或一个或多个其它修饰，同时保留与指定序列基本上相同或相似的互补特性。
在一些实施方案中，本文的RNAi寡核苷酸包含25个核苷酸的有义链和27个核苷酸的反义链，所述反义链当由切丁酶作用时产生并入成熟RNA诱导型沉默复合体(RISC)中的反义链。在一些实施方案中，25个核苷酸的有义链包含选自SEQ ID NO:1-384的序列。在一些实施方案中，27个核苷酸的反义链包含选自SEQ ID NO:385-768的序列。在一些实施方案中，有义链长于27个核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)。在一些实施方案中，有义链长于25个核苷酸(例如，26、27、28、29或30个核苷酸)。在一些实施方案中，有义链包含选自SEQ ID NO:1683-2066的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列长于27个核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)。在一些实施方案中，有义链包含选自SEQ ID NO:1683-2066的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列长于25个核苷酸(例如，26、27、28、29或30个核苷酸)。
在一些实施方案中，寡核苷酸具有一个5'端，所述5'端当与另一个5′端相比时在热力学上较不稳定。在一些实施方案中，提供了不对称RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸在有义链的3'端包含平端并且在反义链的3'端包含3'悬垂。在一些实施方案中，反义链上的3'悬垂的长度为约1至约8个核苷酸(例如，长度为1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸)。通常，寡核苷酸在反义链的3'端具有两个核苷酸的悬垂。然而，可能有其它悬垂。在一些实施方案中，悬垂是3'悬垂，其包括介于1个与6个核苷酸之间的长度，任选地为1至5个、1至4个、1至3个、1至2个、2至6个、2至5个、2至4个、2至3个、3至6个、3至5个、3至4个、4至6个、4至5个、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸。在其它实施方案中，悬垂是5'悬垂，其长度介于1个与6个核苷酸之间，任选地为1至5个、1至4个、1至3个、1至2个、2至6个、2至5个、2至4个、2至3个、3至6个、3至5个、3至4个、4至6个、4至5个、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸。
在一些实施方案中，反义链的3'端上的两个末端核苷酸经修饰。在一些实施方案中，反义链的3'端上的两个末端核苷酸与靶mRNA(例如，SNCA mRNA)互补。在一些实施方案中，反义链的3'端上的两个末端核苷酸与靶mRNA不互补。在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链的3'端上的两个末端核苷酸未配对。在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链的3'端上的两个末端核苷酸包含未配对的GG。在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链的3'端上的两个末端核苷酸与靶mRNA不互补。在一些实施方案中，寡核苷酸的每个3'端上的两个末端核苷酸是GG。通常，ds寡核苷酸的每个3'端上的两个末端GG核苷酸中的一者或两者与靶mRNA不互补。在一些实施方案中，寡核苷酸的每个3'端上的两个末端核苷酸是GG。在一些实施方案中，寡核苷酸的每个3'端上的两个末端GG核苷酸中的一者或两者与靶mRNA不互补。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:2067-2045中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，其中寡核苷酸的反义链的3'端上的两个末端核苷酸包含未配对的GG。在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链包含选自SEQ ID NO:2067-2450的核苷酸序列，其中寡核苷酸的反义链的3'端上的两个末端核苷酸包含未配对的GG。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，所述有义链包含选自SEQ ID NO:1683-2066的核苷酸序列；以及反义链，所述反义链包含选自SEQ ID NO:2067-2450的核苷酸序列，其中寡核苷酸的反义链的3'端上的两个末端核苷酸包含未配对的GG。
在一些实施方案中，在构成本文的寡核苷酸的有义链与反义链之间存在一个或多个(例如1、2、3、4或5个)错配。如果在有义链与反义链之间存在多于一个错配，则其可以连续定位(例如，连续2个、3个或更多个)或可以散布于整个互补区域中。在一些实施方案中，有义链的3'端含有一个或多个错配。在一个实施方案中，在有义链的3'端并入两个错配。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链的3'端的区段的碱基错配或去稳定化改善或增加寡核苷酸的效力。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，所述有义链和所述反义链包含选自以下的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1537和1572；
b)分别是SEQ ID NO:1538和1573；
c)分别是SEQ ID NO:1539和1574；
d)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
e)分别是SEQ ID NO:1541和1576；
f)分别是SEQ ID NO:1542和1577；
g)分别是SEQ ID NO:1543和1578；
h)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
i)分别是SEQ ID NO:1545和1580；
j)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
k)分别是SEQ ID NO:1547和1582；
l)分别是SEQ ID NO:1548和1583；
m)分别是SEQ ID NO:1549和1584；
n)分别是SEQ ID NO:1550和1585；
o)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
p)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
q)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
r)分别是SEQ ID NO:1554和1589；
s)分别是SEQ ID NO:1555和1590；
t)分别是SEQ ID NO:1556和1591；
u)分别是SEQ ID NO:1557和1592；
v)分别是SEQ ID NO:1558和1593；
w)分别是SEQ ID NO:1559和1594；
x)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
y)分别是SEQ ID NO:1561和1596；
z)分别是SEQ ID NO:1562和1597；
aa)分别是SEQ ID NO:1563和1598；
bb)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
cc)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
dd)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
ee)分别是SEQ ID NO:1567和1602；
ff)分别是SEQ ID NO:1568和1603；
gg)分别是SEQ ID NO:1569和1604；
hh)分别是SEQ ID NO:1570和1605；
ii)分别是SEQ ID NO:1571和1606；以及
jj)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中在有义链与反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)错配。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，所述有义链和所述反义链包含选自以下的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
b)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
c)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
f)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
g)分别是SEQ ID NO:1558和1594；
h)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
i)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
j)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
k)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
l)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
m)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中在有义链与反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)错配。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，所述有义链和所述反义链包含选自以下的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
b)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
c)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及，
f)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中在有义链与反义链之间存在一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)错配。
反义链
在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链称作“引导链”，所述反义链与RISC啮合并且结合至Argonaute蛋白，诸如Ago2，或者啮合或结合至一个或多个类似因子，并且指导靶基因的沉默。在一些实施方案中，与反义链互补的有义链称作“过客链”。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为至多约50个核苷酸(例如，长度为至多50个、至多40个、至多35个、至多30个、至多27个、至多25个、至多21个、至多19个、至多17个、至多15个或至多12个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为至少约12个核苷酸(例如，长度为至少12个、至少15个、至少19个、至少21个、至少22个、至少25个、至少27个、至少30个、至少35个或至少38个核苷酸)的反义链。在一些实施方案中，反义链的长度在约12至约40个(例如，12至40个、12至36个、12至32个、12至28个、15至40个、15至36个、15至32个、15至30个、15至28个、17至22个、17至25个、19至27个、19至30个、20至40个、22至40个、25至40个或32至40个)核苷酸范围内。在一些实施方案中，寡核苷酸包含长度为15至30个核苷酸的反义。在一些实施方案中，本文所公开的寡核苷酸中的任一者的反义链的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施方案中，反义链的长度为22个核苷酸。
在一些实施方案中，反义链包含如SEQ ID NO:1683-2066中的任一者所示的序列或由其组成。在一些实施方案中，反义链包含如SEQ ID NO:2067-2450中的任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，反义链包含如SEQ ID NO:385-768中的任一者所示的序列或由其组成。在一些实施方案中，反义链包含如SEQ ID NO:385-768中的任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，反义链包含如SEQ IDNO:1572-1606中的任一者所示的序列或由其组成。在一些实施方案中，反义链包含如SEQID NO:1572-1606中的任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，反义链包含如SEQ ID NO:2067-2450中的任一者所示的序列或由其组成。在一些实施方案中，反义链包含如SEQ ID NO:2067-2450中的任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，反义链包含如SEQ ID NO:1575、1579、1581、1586、1587、1588、1594、1595、1599、1600、1601、1605和1586中的任一者所示的序列或由其组成。在一些实施方案中，反义链包含如SEQ ID NO:1575、1579、1581、1586、1587、1588、1594、1595、1599、1600、1601、1605和1586中的任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，反义链包含如SEQ ID NO:1588、1595、1599、1586和1605中的任一者所示的序列或由其组成。在一些实施方案中，反义链包含如SEQ ID NO:1588、1595、1599、1586和1605中的任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。
有义链
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如SEQ ID NO:1683-2066中的任一者所示的有义链序列。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:1683-2066中的任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:1-384中的任一者所示的序列。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ IDNO:1-384中的任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:1537-1571中的任一者所示的序列。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:1537-1571和1681中的任一者所示的序列。在一些实施方案中，有义链是SEQ ID NO:1681。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:1537-1571中的任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:1781、1782、1796、1798、1802、1808、1814、1817、1713、1718、1726、1830、1839、1742、1846、1852、1865、1784、1804、1721、1822、1840、1735、1847、1855、1864、1901、1902、1938、1947、1955、1964、1973和1978中的任一者所示的序列。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:1781、1782、1796、1798、1802、1808、1814、1817、1713、1718、1726、1830、1839、1742、1846、1852、1865、1784、1804、1721、1822、1840、1735、1847、1855、1864、1901、1902、1938、1947、1955、1964、1973和1978中的任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:1540、1544、1546、1551、1552、1553、1558、1560、1564、1565、1566和1570中的任一者所示的序列。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:1540、1544、1546、1551、1552、1553、1558、1560、1564、1565、1566和1570中的任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:1553、1560、1564、1551和1570中的任一者所示的序列。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:1553、1560、1564、1551和1570中的任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含如SEQ ID NO:1540、1544、1546、1551、1552、1553、1558、1560、1564、1565、1566、1570和1681中的任一者所示的有义链序列。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:1540、1544、1546、1551、1552、1553、1558、1560、1564、1565、1566、1570和1681中的任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:1553、1560、1564、1551、1570和1681中的任一者所示的序列。在一些实施方案中，有义链包含如SEQ ID NO:1553、1560、1564、1551、1570和1681中的任一者所示的序列的至少约12个(例如，至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个)连续核苷酸。
在一些实施方案中，有义链的长度包含至多约50个核苷酸(例如，长度为至多50个、至多40个、至多36个、至多30个、至多27个、至多25个、至多21个、至多19个、至多17个或至多12个核苷酸)。在一些实施方案中，有义链的长度包含至少约12个核苷酸(例如，长度为至少12个、至少15个、至少19个、至少21个、至少25个、至少27个、至少30个、至少36个或至少38个核苷酸)。在一些实施方案中，有义链的长度在约12至约50个(例如，12至50个、12至40个、12至36个、12至32个、12至28个、15至40个、15至36个、15至32个、15至28个、17至21个、17至25个、19至27个、19至30个、20至40个、22至40个、25至40个或32至40个)核苷酸范围内。在一些实施方案中，有义链的长度包含15至50个核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度包含18至36个核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度包含12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为36个核苷酸。
在一些实施方案中，有义链在其3'端包含茎环结构。在一些实施方案中，茎环由链内碱基配对形成。在一些实施方案中，有义链在其5′端包含茎环结构。在一些实施方案中，茎环的茎包含长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，茎环的茎包含长度为2个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，茎环的茎包含长度为3个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，茎环的茎包含长度为4个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，茎环的茎包含长度为5个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，茎环的茎包含长度为6个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，茎环的茎包含长度为7个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，茎环的茎包含长度为8个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，茎环的茎包含长度为9个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，茎环的茎包含长度为10个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，茎环的茎包含长度为11个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，茎环的茎包含长度为12个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，茎环的茎包含长度为13个核苷酸的双链体。在一些实施方案中，茎环的茎包含长度为14个核苷酸的双链体。
在一些实施方案中，茎环提供针对降解(例如，酶促降解)的寡核苷酸保护，促进或改善靶向和/或递送至靶细胞、组织或器官(例如，肝脏或脑)，或两者。举例来说，在一些实施方案中，茎环的环提供包含一个或多个修饰的核苷酸，所述一个或多个修饰促进、改善或增加靶向靶mRNA(例如，SNCA mRNA)、对靶基因表达(例如，SNCA基因表达)的抑制和/或递送至靶细胞、组织或器官(例如，CNS)，或它们的组合。在一些实施方案中，茎环本身或对茎环的修饰大体上不影响寡核苷酸的固有基因表达抑制活性，但促进、改善或增加稳定性(例如，提供针对降解的保护)和/或寡核苷酸向靶细胞、组织或器官(例如，CNS)的递送。在某些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，所述有义链包含(例如，在其3'端)如下所示的茎环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为至多约10个核苷酸(例如，长度为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的单链环。在一些实施方案中，环(L)的长度为3个核苷酸(例如，三环或triL)。在一些实施方案中，环(L)的长度为4个核苷酸(例如，四环或tetraL)。在一些实施方案中，环(L)的长度为5个核苷酸(例如，五环或pentaL)。在一些实施方案中，环(L)的长度为6个核苷酸(例如，六环或hexaL)。在一些实施方案中，环(L)的长度为7个核苷酸(例如，七环或heptaL)。在一些实施方案中，环(L)的长度为8个核苷酸(例如，八环或octaL)。在一些实施方案中，环(L)的长度为9个核苷酸(例如，九环或nonaL)。在一些实施方案中，环(L)的长度为10个核苷酸(例如，十环或decaL)。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1683-2066中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，并且寡核苷酸包含有义链，所述有义链包含(例如，在其3'端)如下所示的茎环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为至多约10个核苷酸(例如，长度为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的ss环。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1683-2066中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域，并且寡核苷酸包含有义链，所述有义链包含(例如，在其3'端)如下所示的茎环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为4个核苷酸的ss环。在一些实施方案中，具有如上文所描述的结构S1-L-S2的茎环的环(L)是如美国专利号10,131,912中所描述的tetraL(例如，在带切口的tetraL结构内)，所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1683-2066中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域和tetraL。在一些实施方案中，四环包含序列5'-GAAA-3'。在一些实施方案中，茎环包含序列5'-GCAGCCGAAAGGCUGC-3'(SEQ ID NO:1680)。
在其它实施方案中，环(L)是triL。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ IDNO:1683-2066中的任一者的连续核苷酸序列互补的靶向序列或互补区域和triL。在一些实施方案中，triL包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸、递送配体和它们的组合。
双链体长度
在一些实施方案中，在有义链与反义链之间形成的双链体的长度为至少约12个(例如，至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个或至少21个)核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度在约12至约30个核苷酸范围内(例如，长度为12至30个、12至27个、12至22个、15至25个、18至30个、18至22个、18至25个、18至27个、18至30个、19至30个或21至30个核苷酸)。在一些实施方案中，双链体的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为12个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为13个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为14个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为15个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为16个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为17个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为23个核苷酸。在一些实施方案中，所形成的双链体的长度为24个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为25个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为26个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为27个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为28个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为29个核苷酸。在一些实施方案中，双链体的长度为30个核苷酸。在一些实施方案中，双链体不跨越有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施方案中，双链体跨越跨越有义链或反义链任一者的整个长度。在一些实施方案中，双链体跨越有义链和反义链两者的整个长度。
在一些实施方案中，有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1537和1572；
b)分别是SEQ ID NO:1538和1573；
c)分别是SEQ ID NO:1539和1574；
d)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
e)分别是SEQ ID NO:1541和1576；
f)分别是SEQ ID NO:1542和1577；
g)分别是SEQ ID NO:1543和1578；
h)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
i)分别是SEQ ID NO:1545和1580；
j)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
k)分别是SEQ ID NO:1547和1582；
l)分别是SEQ ID NO:1548和1583；
m)分别是SEQ ID NO:1549和1584；
n)分别是SEQ ID NO:1550和1585；
o)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
p)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
q)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
r)分别是SEQ ID NO:1554和1589；
s)分别是SEQ ID NO:1555和1590；
t)分别是SEQ ID NO:1556和1591；
u)分别是SEQ ID NO:1557和1592；
v)分别是SEQ ID NO:1558和1593；
w)分别是SEQ ID NO:1559和1594；
x)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
y)分别是SEQ ID NO:1561和1596；
z)分别是SEQ ID NO:1562和1597；
aa)分别是SEQ ID NO:1563和1598；
bb)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
cc)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
dd)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
ee)分别是SEQ ID NO:1567和1602；
ff)分别是SEQ ID NO:1568和1603；
gg)分别是SEQ ID NO:1569和1604；
hh)分别是SEQ ID NO:1570和1605；
ii)分别是SEQ ID NO:1571和1606；以及
jj)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中在有义链与反义链之间形成的双链体的长度在约12至约30个核苷酸范围内(例如，长度为12至30个、12至27个、12至22个、15至25个、18至30个、18至22个、18至25个、18至27个、18至30个、19至30个或21至30个核苷酸)。
在一些实施方案中，有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
b)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
c)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
f)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
g)分别是SEQ ID NO:1558和1594；
h)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
i)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
j)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
k)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
l)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
m)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中在有义链与反义链之间形成的双链体的长度在约12至约30个核苷酸范围内(例如，长度为12至30个、12至27个、12至22个、15至25个、18至30个、18至22个、18至25个、18至27个、18至30个、19至30个或21至30个核苷酸)。
在一些实施方案中，有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
b)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
c)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及，
f)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中在有义链与反义链之间形成的双链体的长度在约12至约30个核苷酸范围内(例如，长度为12至30个、12至27个、12至22个、15至25个、18至30个、18至22个、18至25个、18至27个、18至30个、19至30个或21至30个核苷酸)。
寡核苷酸末端
在一些实施方案中，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，其中任一个或两个链的末端包含平端。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，所述有义链和所述反义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有悬垂。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中任一个或两个链的末端包含含有一个或多个核苷酸的悬垂。在一些实施方案中，构成悬垂的一个或多个核苷酸是未配对的核苷酸。在一些实施方案中，本文的寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链的3'末端和所述反义链的5'末端包含平端。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链的5'末端和所述反义链的3'末端包含平端。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中任一个或两个链的3'末端包含含有一个或多个核苷酸的3'悬垂。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链包含含有一个或多个核苷酸的3'悬垂。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述反义链包含含有一个或多个核苷酸的3'悬垂。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链两者均包含含有一个或多个核苷酸的3'悬垂。
在一些实施方案中，3'悬垂的长度为约1至约20个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)。在一些实施方案中，3′悬垂的长度为约1至19个、1至18个、1至17个、1至16个、1至15个、1至14个、1至13个、1至12个、1至11个、1至10个、1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个或1至2个核苷酸。在一些实施方案中，3'悬垂的长度为1个核苷酸。在一些实施方案中，3'悬垂的长度为2个核苷酸。在一些实施方案中，3'悬垂的长度为3个核苷酸。在一些实施方案中，3′悬垂的长度为4个核苷酸。在一些实施方案中，3′悬垂的长度为5个核苷酸。在一些实施方案中，3′悬垂的长度为6个核苷酸。在一些实施方案中，3'悬垂的长度为7个核苷酸。在一些实施方案中，3′悬垂的长度为8个核苷酸。在一些实施方案中，3′悬垂的长度为9个核苷酸。在一些实施方案中，3′悬垂的长度为10个核苷酸。在一些实施方案中，3′悬垂的长度为11个核苷酸。在一些实施方案中，3'悬垂的长度为12个核苷酸。在一些实施方案中，3′悬垂的长度为13个核苷酸。在一些实施方案中，3′悬垂的长度为14个核苷酸。在一些实施方案中，3′悬垂的长度为15个核苷酸。在一些实施方案中，3′悬垂的长度为16个核苷酸。在一些实施方案中，3′悬垂的长度为17个核苷酸。在一些实施方案中，3′悬垂的长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，3′悬垂的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，3'悬垂的长度为20个核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1537和1572；
b)分别是SEQ ID NO:1538和1573；
c)分别是SEQ ID NO:1539和1574；
d)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
e)分别是SEQ ID NO:1541和1576；
f)分别是SEQ ID NO:1542和1577；
g)分别是SEQ ID NO:1543和1578；
h)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
i)分别是SEQ ID NO:1545和1580；
j)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
k)分别是SEQ ID NO:1547和1582；
l)分别是SEQ ID NO:1548和1583；
m)分别是SEQ ID NO:1549和1584；
n)分别是SEQ ID NO:1550和1585；
o)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
p)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
q)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
r)分别是SEQ ID NO:1554和1589；
s)分别是SEQ ID NO:1555和1590；
t)分别是SEQ ID NO:1556和1591；
u)分别是SEQ ID NO:1557和1592；
v)分别是SEQ ID NO:1558和1593；
w)分别是SEQ ID NO:1559和1594；
x)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
y)分别是SEQ ID NO:1561和1596；
z)分别是SEQ ID NO:1562和1597；
aa)分别是SEQ ID NO:1563和1598；
bb)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
cc)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
dd)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
ee)分别是SEQ ID NO:1567和1602；
ff)分别是SEQ ID NO:1568和1603；
gg)分别是SEQ ID NO:1569和1604；
hh)分别是SEQ ID NO:1570和1605；
ii)分别是SEQ ID NO:1571和1606；以及
jj)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中反义链包含长度为约1至约20个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)的3'悬垂，任选地其中所述3'悬垂的长度为2个核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
b)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
c)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
f)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
g)分别是SEQ ID NO:1558和1594；
h)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
i)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
j)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
k)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
l)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
m)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
并且其中其中反义链包含长度为约1至约20个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)的3'悬垂，任选地其中所述3'悬垂的长度为2个核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
b)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
c)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
f)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中反义链包含长度为约1至约20个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)的3'悬垂，任选地其中所述3'悬垂的长度为2个核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链包含含有一个或多个核苷酸的5'悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
b)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
c)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
f)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
g)分别是SEQ ID NO:1558和1594；
h)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
i)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
j)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
k)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
l)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
m)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中反义链包含长度为约1至约20个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)的5'悬垂，任选地其中所述5'悬垂的长度为2个核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
b)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
c)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
f)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中反义链包含长度为约1至约20个核苷酸(例如，长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸)的5'悬垂，任选地其中所述5'悬垂的长度为2个核苷酸。
在一些实施方案中，构成有义链和/或反义链的3'末端或5'末端的一个或多个(例如，2、3、4、5个或更多个)核苷酸经修饰。举例来说，在一些实施方案中，反义链的3'末端的一或两个末端核苷酸经修饰。在一些实施方案中，反义链的3'末端的最后一个核苷酸经修饰(例如，包含2'修饰，例如2′-O-甲氧基乙基)。在一些实施方案中，反义链的3′末端的最后一或两个末端核苷酸与标靶互补。在一些实施方案中，反义链的3'末端的最后一或两个核苷酸与标靶不互补。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链的3'末端包含本文所描述的茎环并且所述反义链的3'末端包含3'悬垂。在一些实施方案中，寡核苷酸包含形成带切口的tetraL结构的有义链和反义链，其中所述有义链的3'末端包含茎环，其中环(L)是本文所描述的tetraL，并且其中所述反义链的3'末端包含本文所描述的3′悬垂。在一些实施方案中，3'悬垂的长度为2个核苷酸。在一些实施方案中，构成3'悬垂的2个核苷酸均包含鸟嘌呤(G)核碱基。通常，构成反义链的3'悬垂的核苷酸中的一者或两者与靶mRNA不互补。
寡核苷酸修饰
在一些实施方案中，寡核苷酸包含修饰。寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)可以按各种方式进行修饰，以改善或控制特异性、稳定性、递送、生物利用度、对核酸酶降解的抗性、免疫原性、碱基配对特性、RNA分布和细胞摄取以及与治疗研究用途相关的其它特征。
在一些实施方案中，修饰是经修饰的糖。在一些实施方案中，修饰是5'末端磷酸酯基团。在一些实施方案中，修饰是经修饰的核苷间键。在一些实施方案中，修饰是经修饰的碱基。在一些实施方案中，修饰是可逆修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸可以包含本文所描述的修饰中的任一者或它们的任何组合。举例来说，在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个经修饰的糖、5'末端磷酸酯基团、至少一个经修饰的核苷间键、至少一个经修饰的碱基和至少一个可逆修饰。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个经修饰的糖、5'末端磷酸酯基团、至少一个经修饰的核苷酸间键和至少一个经修饰的碱基。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1537和1572；
b)分别是SEQ ID NO:1538和1573；
c)分别是SEQ ID NO:1539和1574；
d)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
e)分别是SEQ ID NO:1541和1576；
f)分别是SEQ ID NO:1542和1577；
g)分别是SEQ ID NO:1543和1578；
h)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
i)分别是SEQ ID NO:1545和1580；
j)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
k)分别是SEQ ID NO:1547和1582；
l)分别是SEQ ID NO:1548和1583；
m)分别是SEQ ID NO:1549和1584；
n)分别是SEQ ID NO:1550和1585；
o)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
p)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
q)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
r)分别是SEQ ID NO:1554和1589；
s)分别是SEQ ID NO:1555和1590；
t)分别是SEQ ID NO:1556和1591；
u)分别是SEQ ID NO:1557和1592；
v)分别是SEQ ID NO:1558和1593；
w)分别是SEQ ID NO:1559和1594；
x)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
y)分别是SEQ ID NO:1561和1596；
z)分别是SEQ ID NO:1562和1597；
aa)分别是SEQ ID NO:1563和1598；
bb)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
cc)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
dd)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
ee)分别是SEQ ID NO:1567和1602；
ff)分别是SEQ ID NO:1568和1603；
gg)分别是SEQ ID NO:1569和1604；
hh)分别是SEQ ID NO:1570和1605；
ii)分别是SEQ ID NO:1571和1606；以及
jj)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含至少一个经修饰的糖、5'末端磷酸酯基团、至少一个经修饰的核苷酸间键和至少一个经修饰的碱基。
在一些实施方案中，有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
b)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
c)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
f)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
g)分别是SEQ ID NO:1558和1594；
h)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
i)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
j)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
k)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
l)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
m)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含至少一个经修饰的糖、5'末端磷酸酯基团、至少一个经修饰的核苷酸间键和至少一个经修饰的碱基。
在一些实施方案中，有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
b)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
c)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
f)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含至少一个经修饰的糖、5′末端磷酸酯基团、至少一个经修饰的核苷酸间键和至少一个经修饰的碱基。
寡核苷酸上的修饰数目和那些核苷酸修饰的位置可能影响寡核苷酸的特性。举例来说，寡核苷酸可以通过将其包含于脂质纳米粒子(LNP)或类似载体中而在体内递送。然而，当寡核苷酸不受LNP或类似载体保护时，至少一些核苷酸经修饰可能是有利的。因此，在一些实施方案中，寡核苷酸的所有或大体上所有核苷酸经修饰。在一些实施方案中，多于一半的核苷酸经修饰。在一些实施方案中，少于一半的核苷酸经修饰。在一些实施方案中，构成寡核苷酸的所有核苷酸的糖部分在2'位置处经修饰。修饰可以是可逆的或不可逆的。在一些实施方案中，寡核苷酸具有足以促成所需特征(例如，防止酶促降解、在体内施用后靶向所需细胞的能力和/或热力学稳定性)的数目和类型的经修饰核苷酸。
糖修饰
在一些实施方案中，寡核苷酸包含经修饰的糖。在一些实施方案中，经修饰的糖(本文中也称作糖类似物)包括经修饰的脱氧核糖或核糖部分，例如，其中一个或多个修饰在糖的2'、3'、4'和/或5'碳位置处发生。在一些实施方案中，经修饰的糖还可以包括非天然替代性碳结构，诸如存在于以下中的那些结构：锁核酸(“LNA”；参见例如Koshkin等人(1998)Tetrahedon 54:3607-30)、非锁核酸(“UNA”；参见例如Snead等人(2013)Mol.Ther-Nucl.Acids 2:e103)和桥联核酸(“BNA”；参见例如Imanishi和Obika(2002)Chem Commun.(Camb)21:1653-59)。
在一些实施方案中，糖中的核苷酸修饰包括2'-修饰。在一些实施方案中，2'-修饰可以是2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、2'-F、2'-氨基乙基(EA)、2'-OMe、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)、2'-O-[2-(甲基氨基)-2-氧代乙基](2'-O-NMA)或2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸(2'-FANA)。在一些实施方案中，修饰是2'-F、2'-OMe或2'-MOE。在一些实施方案中，经修饰的糖包含糖环的修饰，其可以包括糖环的一个或多个碳的修饰。举例来说，核苷酸的糖的修饰可以包括糖的2'-氧连接至糖的1'-碳或4'-碳，或2'-氧经由亚乙基或亚甲基桥连接至1'-碳或4'-碳。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有缺乏2'-碳至3'-碳键的无环糖。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有硫醇基(例如，在糖的4'-位置处)。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个或更多个)。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链包含至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个或更多个)。在一些实施方案中，寡核苷酸的反义链包含至少约1个经修饰的核苷酸(例如，至少1个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个)。
在一些实施方案中，有义链的所有核苷酸经修饰。在一些实施方案中，反义链的所有核苷酸经修饰。在一些实施方案中，所有核苷酸(即，有义链和反义链两者)经修饰。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含2'-修饰(例如，2'-F或2'-OMe、2'-MOE和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸)。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含2'-修饰(例如，2'-F或2'-OMe)。
在一些实施方案中，本公开提供了具有不同修饰模式的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含具有如实例和序列表中所列的修饰模式的有义链序列和具有如实例和序列表中所列的修饰模式的反义链。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含具有2'-F修饰的核苷酸的反义链。在其它实施方案中，寡核苷酸包含具有2'-F和2'-OMe修饰的核苷酸的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含具有2'-F修饰的核苷酸的有义链。在其它实施方案中，寡核苷酸包含具有2'-F和2'-OMe修饰的核苷酸的有义链。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，其中有义链的约10％至约15％、或10％、11％、12％、13％、14％或15％的核苷酸包含2'-F修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，其中约18％至约23％、或18％、19％、20％、21％、22％或23％的核苷酸包含2'-F修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，其中约38％至约43％、或38％、39％、40％、41％、42％或43％的核苷酸包含2'-F修饰。在一些实施方案中，有义链的约11％的核苷酸包含2'-F修饰。在一些实施方案中，有义链的约22％的核苷酸包含2'-F修饰。在一些实施方案中，有义链的约40％的核苷酸包含2'-F修饰。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，其中约25％至约35％、或25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的核苷酸包含2'-F修饰。在一些实施方案中，反义链的约32％的核苷酸包含2'-F修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸具有约15％至约25％、或15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％的包含2'-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸具有约35％至约45％、或35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％或45％的包含2'-F修饰的核苷酸。在一些实施方案中，约19％的核苷酸包含2'-F修饰。在一些实施方案中，约29％的核苷酸包含2'-F修饰。在一些实施方案中，约40％的核苷酸包含2'-F修饰。
在一些实施方案中，36个核苷酸的有义链的位置8、9、10或11中的一者或多者经2'-F基团修饰。在一些实施方案中，包含茎环的有义链的位置8、9、10或11中的一者或多者经2'-F基团修饰。在一些实施方案中，36个核苷酸的有义链的位置1-7和12-20的每个核苷酸处的糖部分经2'-OMe修饰。在一些实施方案中，包含茎环的有义链的位置1-7和12-20的每个核苷酸处的糖部分经2'-OMe修饰。在一些实施方案中，有义链中的位置1-7和12-36的每个核苷酸处的糖部分经2'-OMe修饰。
在一些实施方案中，有义链的位置3、5、8、10、12、13、15和17中的一者或多者经2'-F基团修饰。
在一些实施方案中，反义链具有在糖部分的2'-位置处经2'-F修饰的3个核苷酸。在一些实施方案中，反义链的位置2、5和14处的糖部分和任选地位置1、3、7和10处的至多3个核苷酸经2'-F修饰。在一些实施方案中，反义链的位置2、5和14处的糖部分和任选地位置3、4、7和10处的至多3个核苷酸经2'-F修饰。在其它实施方案中，反义链的位置2、5和14中的每个位置处的糖部分经2'-F修饰。在其它实施方案中，反义链的位置1、2、5和14中的每个位置处的糖部分经2'-F修饰。在其它实施方案中，反义链的位置2、4、5和14中的每个位置处的糖部分经2'-F修饰。在其它实施方案中，反义链的位置1、2、3、5、7和14中的每个位置处的糖部分经2'-F修饰。在其它实施方案中，反义链的位置2、3、4、5、7和14中的每个位置处的糖部分经2'-F修饰。在另一个实施方案中，反义链的位置1、2、3、5、10和14中的每个位置处的糖部分经2'-F修饰。在其它实施方案中，反义链的位置2、3、4、5、10和14中的每个位置处的糖部分经2'-F修饰。在另一个实施方案中，反义链的位置2、3、5、7、10和14中的每个位置处的糖部分经2'-F修饰。在其它实施方案中，与36个核苷酸的有义链形成双链体的反义链的位置2、3、4、5、7、10和14中的每个位置处的糖部分经2'-F修饰。在一些实施方案中，与包含茎环的有义链形成双链体的反义链的位置2、3、4、5、7、10和14中的每个位置处的糖部分经2'-F修饰。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置2和14处经2'-F修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置2、5和14处经2'-F修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置1、2、5和14处经2'-F修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置2、4、5和14处经2'-F修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置1、2、3、5、7和14处经2'-F修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置2、3、4、5、7和14处经2'-F修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置1、2、3、5、10和14处经2'-F修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置2、3、4、5、10和14处经2'-F修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含36个核苷酸的有义链和反义链，其中所述反义链包含在位置2、3、4、5、7、10和14处经2'-F修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含含有茎环的有义链和反义链，其中所述反义链包含在位置2、3、4、5、7、10和14处经2'-F修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置2、3、4、5、7、10、14、16和19处经2'-F修饰的糖部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置2、5和14处的每个核苷酸经2'-F修饰的糖部分和反义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置1、2、5和14处的每个核苷酸经2'-F修饰的糖部分和反义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置2、4、5和14处的每个核苷酸经2'-F修饰的糖部分和反义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置1、2、3、5、7和14处的每个核苷酸经2'-F修饰的糖部分和反义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置2、3、4、5、7和14处的每个核苷酸经2'-F修饰的糖部分和反义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置1、2、3、5、10和14处的每个核苷酸经2'-F修饰的糖部分和反义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置2、3、4、5、10和14处的每个核苷酸经2'-F修饰的糖部分和反义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置2、3、5、7、10和14处的每个核苷酸经2'-F修饰的糖部分和反义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含36个核苷酸的有义链和反义链，其中所述反义链包含在位置2、3、4、5、7、10和14处经2'-F修饰的糖部分和反义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。在一些实施方案中，寡核苷酸包含含有茎环的有义链和反义链，其中所述反义链包含在位置2、3、4、5、7、10和14处经2'-F修饰的糖部分和反义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置2、3、4、5、7、10、14、16和19处的每个核苷酸经2'-F修饰的糖部分和反义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2′-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22处经2'-F修饰的糖部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22处经2'-OMe修饰的糖部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21或位置22处经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含36个核苷酸的有义链，所述有义链具有在位置8-11处经2'-F修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，所述有义链包含茎环和在位置8-11处经2'-F修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含36个核苷酸的有义链，所述有义链具有在位置1-7和12-17或12-20处经2'-OMe修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，所述有义链包含茎环和在位置1-7和12-17或12-20处经2'-OMe修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含36个核苷酸的有义链，所述有义链具有在位置1-7和12-17、12-20或12-22处经2'-OMe修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，所述有义链包含茎环和在位置1-7和12-17、12-20或12-22处经2'-OMe修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含36个核苷酸的有义链，所述有义链具有在有义链的位置1-7和12-17或12-20处的每个核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，所述有义链包含茎环并且具有在有义链的位置1-7和12-17或12-20处的每个核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。在一些实施方案中，寡核苷酸包含36个核苷酸的有义链，所述有义链具有在有义链的位置1-7和12-17、12-20或12-22处的每个核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，所述有义链包含茎环和在有义链的位置1-7和12-17、12-20或12-22处的每个核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，所述有义链具有在位置3、5、8、10、12、13、15和17处经2'-F修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，所述有义链具有在位置1、2、4、6、7、9、11、14、16和18-20处经2'-OMe修饰的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，所述有义链具有在有义链的位置1、2、4、6、7、9、11、14、16和18-20处的每个核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，所述有义链具有在有义链的位置1-7和12-17、12-20或12-22处的每个核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，所述有义链具有在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36处经2'-F修饰的糖部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，所述有义链具有在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36处经2'-OMe修饰的糖部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含有义链，所述有义链具有在位置1、位置2、位置3、位置4、位置5、位置6、位置7、位置8、位置9、位置10、位置11、位置12、位置13、位置14、位置15、位置16、位置17、位置18、位置19、位置20、位置21、位置22、位置23、位置24、位置25、位置26、位置27、位置28、位置29、位置30、位置31、位置32、位置33、位置34、位置35或位置36处经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-氨基、2′-乙基、EA、2′-OMe、2′-MOE、2′-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在反义链的位置2、3、4、5、7、10和14处的每个核苷酸经2'-F修饰的糖部分和反义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-氨基、2′-乙基、EA、2′-OMe、2'-MOE、2′-O-NMA和2'-FANA；以及有义链，所述有义链具有在有义链的位置8-11处的每个核苷酸经2'-F修饰的糖部分和有义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2′-O-NMA和2'-FANA。在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在反义链的位置2、3、4、5、7、10和14处的每个核苷酸经2'-F修饰的糖部分和反义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2'-氨基、2′-乙基、EA、2′-OMe、2′-MOE、2′-O-NMA和2'-FANA；以及有义链，所述有义链具有茎环和在有义链的位置8-11处的每个核苷酸经2'-F修饰的糖部分以及有义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2′-氨基、2'-乙基、2′-EA、2′-OMe、2′-MOE、2′-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含反义链，所述反义链具有在反义链的位置2、3、4、5、7、10、14、16和19处的每个核苷酸经2'-F修饰的糖部分和反义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2′-O-丙胺、2′-氨基、2′-乙基、EA、2′-OMe、2′-MOE、2′-O-NMA和2'-FANA；以及有义链，所述有义链具有在有义链的位置3、5、8、10、12、13、15和17处的每个核苷酸经2'-F修饰的糖部分和有义链的每个其余核苷酸经选自由以下组成的组的修饰进行修饰的糖部分：2'-O-炔丙基、2'-O-丙胺、2'-氨基、2'-乙基、EA、2'-OMe、2'-MOE、2'-O-NMA和2'-FANA。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1537和1572；
b)分别是SEQ ID NO:1538和1573；
c)分别是SEQ ID NO:1539和1574；
d)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
e)分别是SEQ ID NO:1541和1576；
f)分别是SEQ ID NO:1542和1577；
g)分别是SEQ ID NO:1543和1578；
h)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
i)分别是SEQ ID NO:1545和1580；
j)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
k)分别是SEQ ID NO:1547和1582；
l)分别是SEQ ID NO:1548和1583；
m)分别是SEQ ID NO:1549和1584；
n)分别是SEQ ID NO:1550和1585；
o)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
p)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
q)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
r)分别是SEQ ID NO:1554和1589；
s)分别是SEQ ID NO:1555和1590；
t)分别是SEQ ID NO:1556和1591；
u)分别是SEQ ID NO:1557和1592；
v)分别是SEQ ID NO:1558和1593；
w)分别是SEQ ID NO:1559和1594；
x)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
y)分别是SEQ ID NO:1561和1596；
z)分别是SEQ ID NO:1562和1597；
aa)分别是SEQ ID NO:1563和1598；
bb)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
cc)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
dd)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
ee)分别是SEQ ID NO:1567和1602；
ff)分别是SEQ ID NO:1568和1603；
gg)分别是SEQ ID NO:1569和1604；
hh)分别是SEQ ID NO:1570和1605；
ii)分别是SEQ ID NO:1571和1606；以及
jj)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中有义链的位置3、5、8、10、12、13、15或17中的一者或多者经2'-F基团修饰。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
b)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
c)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
f)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
g)分别是SEQ ID NO:1558和1594；
h)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
i)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
j)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
k)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
l)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
m)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中有义链的位置3、5、8、10、12、13、15或17中的一者或多者经2'-F基团修饰。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
b)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
c)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
f)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中有义链的位置3、5、8、10、12、13、15或17中的一者或多者经2'-F基团修饰。
5'末端磷酸酯
在一些实施方案中，本文所描述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含有义链和反义链，其中所述反义链包含5'末端磷酸酯。在一些实施方案中，5'末端磷酸酯基团增强与Ago2的相互作用。然而，包含5'-磷酸酯基团的寡核苷酸可能易于经由磷酸酯酶或其它酶降解，这可能限制其体内生物利用度。在一些实施方案中，寡核苷酸包括对此种降解具有抗性的5'-磷酸酯类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯或它们的组合。在某些实施方案中，寡核苷酸链的5'端附接至模拟天然5'-磷酸酯基团(“磷酸酯模拟物”)的静电和空间特性的化学部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸在糖的4'-碳位置处具有磷酸酯类似物(称作“4'-磷酸酯类似物”)。参见例如国际专利申请公布号WO 2018/045317。在一些实施方案中，寡核苷酸在5'末端核苷酸处包含4'-磷酸酯类似物。在一些实施方案中，磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子结合至糖部分(例如，在其4'-碳处)或其类似物。在其它实施方案中，4'-磷酸酯类似物是硫甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中硫甲基的硫原子或氨基甲基的氮原子结合至糖部分或其类似物的4'-碳。在某些实施方案中，4'-磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯。在一些实施方案中，氧甲基膦酸酯由式-O-CH2-PO(OH)2、-O-CH2-PO(OR)2或-O-CH2-POOH(R)表示，其中R独立地选自H、CH3、烷基、CH2CH2CN、CH2OCOC(CH3)3、CH2OCH2CH2Si(CH3)3或保护基。在某些实施方案中，烷基是CH2CH3。更通常，R独立地选自H、CH3或CH2CH3。在一些实施方案中，R是CH3。在一些实施方案中，4'-磷酸酯类似物是4'-氧甲基膦酸酯。在一些实施方案中，具有4'-膦酸酯类似物的经修饰核苷酸是尿苷。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸是4'-O-单甲基膦酸酯-2'-O-甲基尿苷。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1537和1572；
b)分别是SEQ ID NO:1538和1573；
c)分别是SEQ ID NO:1539和1574；
d)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
e)分别是SEQ ID NO:1541和1576；
f)分别是SEQ ID NO:1542和1577；
g)分别是SEQ ID NO:1543和1578；
h)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
i)分别是SEQ ID NO:1545和1580；
j)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
k)分别是SEQ ID NO:1547和1582；
l)分别是SEQ ID NO:1548和1583；
m)分别是SEQ ID NO:1549和1584；
n)分别是SEQ ID NO:1550和1585；
o)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
p)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
q)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
r)分别是SEQ ID NO:1554和1589；
s)分别是SEQ ID NO:1555和1590；
t)分别是SEQ ID NO:1556和1591；
u)分别是SEQ ID NO:1557和1592；
v)分别是SEQ ID NO:1558和1593；
w)分别是SEQ ID NO:1559和1594；
x)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
y)分别是SEQ ID NO:1561和1596；
z)分别是SEQ ID NO:1562和1597；
aa)分别是SEQ ID NO:1563和1598；
bb)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
cc)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
dd)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
ee)分别是SEQ ID NO:1567和1602；
ff)分别是SEQ ID NO:1568和1603；
gg)分别是SEQ ID NO:1569和1604；
hh)分别是SEQ ID NO:1570和1605；
ii)分别是SEQ ID NO:1571和1606；以及
jj)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含5'末端磷酸酯，任选地是5'末端磷酸酯类似物。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
b)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
c)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
f)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
g)分别是SEQ ID NO:1558和1594；
h)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
i)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
j)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
k)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
l)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
m)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含5'末端磷酸酯，任选地是5'末端磷酸酯类似物。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
b)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
c)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
f)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含5'末端磷酸酯，任选地是5'末端磷酸酯类似物。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含在5'末端核苷酸处包含4'-磷酸酯类似物的反义链，其中5'末端核苷酸包含以下结构：
4'-O-单甲基膦酸酯-2'-O-甲基尿苷硫代磷酸酯[Me膦酸酯-4O-mUs]。
经修饰的核苷酸间键
在一些实施方案中，寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)包含经修饰的核苷酸间键。在一些实施方案中，磷酸酯修饰或取代会产生包含至少约1个(例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个)经修饰的核苷酸间键的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含约1至约10个(例如，1至10个、2至8个、4至6个、3至10个、5至10个、1至5个、1至3个或1至2个)经修饰的核苷酸间键。在一些实施方案中，寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个经修饰的核苷酸间键。
经修饰的核苷酸间键可以是二硫代磷酸酯键、硫代磷酸酯键、磷酸三酯键、硫羰基烷基膦酸酯键、硫羰基烷基磷酸三酯键、亚磷酰胺键、膦酸酯键或硼烷磷酸酯键。在一些实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，寡核苷酸在有义链的位置1与2、反义链的位置1与2、反义链的位置2与3、反义链的位置3与4、反义链的位置20与21以及反义链的位置21与22中的一者或多者之间具有硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，寡核苷酸在有义链的位置1与2、反义链的位置1与2、反义链的位置2与3、反义链的位置20与21以及反义链的位置21与22中的每一者之间具有硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，寡核苷酸在以下中的每一者之间具有硫代磷酸酯键：(i)有义链的位置1与2；以及(ii)反义链的位置1与2、位置2与3、位置3与4、位置20与21和位置21与22。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1537和1572；
b)分别是SEQ ID NO:1538和1573；
c)分别是SEQ ID NO:1539和1574；
d)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
e)分别是SEQ ID NO:1541和1576；
f)分别是SEQ ID NO:1542和1577；
g)分别是SEQ ID NO:1543和1578；
h)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
i)分别是SEQ ID NO:1545和1580；
j)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
k)分别是SEQ ID NO:1547和1582；
l)分别是SEQ ID NO:1548和1583；
m)分别是SEQ ID NO:1549和1584；
n)分别是SEQ ID NO:1550和1585；
o)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
p)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
q)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
r)分别是SEQ ID NO:1554和1589；
s)分别是SEQ ID NO:1555和1590；
t)分别是SEQ ID NO:1556和1591；
u)分别是SEQ ID NO:1557和1592；
v)分别是SEQ ID NO:1558和1593；
w)分别是SEQ ID NO:1559和1594；
x)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
y)分别是SEQ ID NO:1561和1596；
z)分别是SEQ ID NO:1562和1597；
aa)分别是SEQ ID NO:1563和1598；
bb)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
cc)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
dd)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
ee)分别是SEQ ID NO:1567和1602；
ff)分别是SEQ ID NO:1568和1603；
gg)分别是SEQ ID NO:1569和1604；
hh)分别是SEQ ID NO:1570和1605；
ii)分别是SEQ ID NO:1571和1606；以及
jj)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含经修饰的核苷酸间键。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
b)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
c)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
f)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
g)分别是SEQ ID NO:1558和1594；
h)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
i)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
j)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
k)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
l)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
m)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含经修饰的核苷酸间键。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
b)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
c)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
f)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含经修饰的核苷酸间键。
碱基修饰
在一些实施方案中，本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)具有一个或多个经修饰的核碱基。在一些实施方案中，经修饰的核碱基(本文中也称作碱基类似物)在核苷酸糖部分的1'位置处连接。在某些实施方案中，经修饰的核碱基是含氮碱基。在某些实施方案中，经修饰的核碱基不含氮原子。参见例如美国专利申请公布号2008/0274462。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包含通用碱基。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸不含核碱基(无碱基)。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1537和1572；
b)分别是SEQ ID NO:1538和1573；
c)分别是SEQ ID NO:1539和1574；
d)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
e)分别是SEQ ID NO:1541和1576；
f)分别是SEQ ID NO:1542和1577；
g)分别是SEQ ID NO:1543和1578；
h)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
i)分别是SEQ ID NO:1545和1580；
j)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
k)分别是SEQ ID NO:1547和1582；
l)分别是SEQ ID NO:1548和1583；
m)分别是SEQ ID NO:1549和1584；
n)分别是SEQ ID NO:1550和1585；
o)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
p)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
q)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
r)分别是SEQ ID NO:1554和1589；
s)分别是SEQ ID NO:1555和1590；
t)分别是SEQ ID NO:1556和1591；
u)分别是SEQ ID NO:1557和1592；
v)分别是SEQ ID NO:1558和1593；
w)分别是SEQ ID NO:1559和1594；
x)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
y)分别是SEQ ID NO:1561和1596；
z)分别是SEQ ID NO:1562和1597；
aa)分别是SEQ ID NO:1563和1598；
bb)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
cc)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
dd)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
ee)分别是SEQ ID NO:1567和1602；
ff)分别是SEQ ID NO:1568和1603；
gg)分别是SEQ ID NO:1569和1604；
hh)分别是SEQ ID NO:1570和1605；
ii)分别是SEQ ID NO:1571和1606；以及
jj)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核碱基。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
b)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
c)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
f)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
g)分别是SEQ ID NO:1558和1594；
h)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
i)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
j)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
k)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
l)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
m)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核碱基。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
b)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
c)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
f)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核碱基。
在一些实施方案中，通用碱基是位于经修饰的核苷酸中的核苷酸糖部分的1'位置或核苷酸糖部分取代中的等效位置处的杂环部分，当存在于双链体中时，其可以与多于一种类型的碱基相对定位而不会大体上改变双链体的结构。在一些实施方案中，相较于与靶核酸完全互补的参考ss核酸(例如，寡核苷酸)，含有通用碱基的ss核酸与靶核酸形成双链体，所述双链体的Tm低于与互补核酸形成的双链体。在一些实施方案中，当与其中通用碱基已被某个碱基置换以产生单个错配的参考ss核酸相比时，含有通用碱基的ss核酸与靶核酸形成双链体，所述双链体的Tm高于与包含错配碱基的核酸形成的双链体。
通用结合核苷酸的非限制性实例包括但不限于肌苷、1-β-D-核糖呋喃糖基-5-硝基吲哚和/或1-β-D-核糖呋喃糖基-3-硝基吡咯(参见美国专利申请公布号2007/0254362；Van Aerschot等人(1995)Nucleic Acids Res.23:4363-4370；Loakes等人(1995)NucleicAcids Res.23:2361-66；以及Loakes和Brown(1994)Nucleic Acids Res.22:4039-43)。
靶向配体
在一些实施方案中，希望将寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)靶向一个或多个细胞或一个或多个器官。此种策略可以帮助避免在其它器官中不合需要的作用，或避免寡核苷酸对不会得益于寡核苷酸的细胞、组织或器官的过度损失。因此，在一些实施方案中，寡核苷酸经修饰以促进靶向和/或递送至特定组织、细胞或器官(例如，以促进寡核苷酸向CNS的递送)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含缀合至一个或多个靶向配体的至少一个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6个或更多个核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1537和1572；
b)分别是SEQ ID NO:1538和1573；
c)分别是SEQ ID NO:1539和1574；
d)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
e)分别是SEQ ID NO:1541和1576；
f)分别是SEQ ID NO:1542和1577；
g)分别是SEQ ID NO:1543和1578；
h)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
i)分别是SEQ ID NO:1545和1580；
j)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
k)分别是SEQ ID NO:1547和1582；
l)分别是SEQ ID NO:1548和1583；
m)分别是SEQ ID NO:1549和1584；
n)分别是SEQ ID NO:1550和1585；
o)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
p)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
q)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
r)分别是SEQ ID NO:1554和1589；
s)分别是SEQ ID NO:1555和1590；
t)分别是SEQ ID NO:1556和1591；
u)分别是SEQ ID NO:1557和1592；
v)分别是SEQ ID NO:1558和1593；
w)分别是SEQ ID NO:1559和1594；
x)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
y)分别是SEQ ID NO:1561和1596；
z)分别是SEQ ID NO:1562和1597；
aa)分别是SEQ ID NO:1563和1598；
bb)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
cc)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
dd)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
ee)分别是SEQ ID NO:1567和1602；
ff)分别是SEQ ID NO:1568和1603；
gg)分别是SEQ ID NO:1569和1604；
hh)分别是SEQ ID NO:1570和1605；
ii)分别是SEQ ID NO:1571和1606；以及
jj)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含缀合至至少一个核苷酸的靶向配体。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含缀合至一个或多个靶向配体的至少一个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6个或更多个核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
b)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
c)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
f)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
g)分别是SEQ ID NO:1558和1594；
h)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
i)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
j)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
k)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
l)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
m)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含缀合至至少一个核苷酸的靶向配体。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含缀合至一个或多个靶向配体的至少一个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6个或更多个核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
b)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
c)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及，
f)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含缀合至至少一个核苷酸的靶向配体。
在一些实施方案中，靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、肽、多肽，或蛋白质或蛋白质的一部分(例如，抗体或抗体片段)。在一些实施方案中，靶向配体是适体。举例来说，靶向配体可以是用于靶向肿瘤脉管系统或神经胶质瘤细胞的RGD肽、靶向肿瘤脉管系统或造口的CREKA肽、转铁蛋白、乳铁蛋白，或靶向CNS脉管系统上表达的转铁蛋白受体的适体，或靶向神经胶质瘤细胞上的EGFR的抗EGFR抗体。在某些实施方案中，靶向配体是一个或多个GalNAc部分。在一些实施方案中，靶向配体是一个或多个脂质部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸的1个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自缀合至独立的靶向配体。在一些实施方案中，寡核苷酸的2至4个核苷酸各自缀合至独立的靶向配体。在一些实施方案中，靶向配体缀合至有义链或反义链的任一端的2至4个核苷酸(例如，靶向配体缀合至有义链或反义链的5'或3'端的2至4个核苷酸悬垂或延伸)，使得靶向配体类似于牙刷的刷毛并且寡核苷酸类似于牙刷。举例来说，寡核苷酸可以在有义链的5'或3'端任一端包含茎环，并且茎环的1、2、3或4个核苷酸可以个别地缀合至靶向配体。在一些实施方案中，寡核苷酸在有义链的3'端包含茎环，其中茎环的环包含triL或tetraL，并且其中构成triL或tetraL的3或4个核苷酸分别个别地缀合至靶向配体。在一些实施方案中，寡核苷酸包含在其3′端的平端和缀合至至少一个核苷酸的一个或多个靶向配体。在一些实施方案中，寡核苷酸包含在其3'端的平端和缀合至有义链的5'末端核苷酸的一个或多个靶向配体。
GalNAc缀合
GalNAc是ASGPR的高亲和力配体，ASGPR主要在肝细胞的血窦表面上表达，并且在结合、内化和后续清除含有末端半乳糖或GalNAc残基的循环糖蛋白(脱唾液酸糖蛋白)中起主要作用。GalNAc部分与本文的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的缀合(间接或直接)可以用于将寡核苷酸靶向细胞上表达的ASGPR。在一些实施方案中，寡核苷酸缀合至至少一个或多个GalNAc部分，其中所述GalNAc部分将寡核苷酸靶向人类肝脏细胞(例如，人类肝细胞)上表达的ASGPR。在一些实施方案中，GalNAc部分将寡核苷酸靶向肝脏。
在一些实施方案中，寡核苷酸直接或间接缀合至单价GalNAc。在一些实施方案中，寡核苷酸直接或间接缀合至多于一个单价GalNAc(即，缀合至2、3或4个单价GalNAc部分，并且通常缀合至3或4个单价GalNAc部分)。在一些实施方案中，寡核苷酸缀合至一个或多个二价GalNAc、三价GalNAc或四价GalNAc部分。在一些实施方案中，二价、三价或四价GalNAc部分经由分支接头缀合至寡核苷酸。在一些实施方案中，单价GalNAc部分缀合至第一个核苷酸，并且二价、三价或四价GalNAc部分经由分支接头缀合至第二个核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸的1个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自缀合至GalNAc部分。在一些实施方案中，tetraL的2至4个核苷酸各自缀合至独立的GalNAc。在一些实施方案中，triL的1至3个核苷酸各自缀合至独立的GalNAc。在一些实施方案中，靶向配体缀合至有义链或反义链的任一端的2至4个核苷酸(例如，配体缀合至有义链或反义链的5'或3'端的2至4个核苷酸悬垂或延伸)，使得GalNAc部分类似于牙刷的刷毛并且寡核苷酸类似于牙刷。在一些实施方案中，GalNAc部分缀合至有义链的核苷酸。举例来说，4个GalNAc部分可以缀合至有义链的tetraL中的核苷酸，其中每个GalNAc部分缀合至1个核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含tetraL，其中tetraL是腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)核苷酸的任何组合。在一些实施方案中，tetraL包含经由本文所描述的任何接头附接至四环的任何一个或多个鸟嘌呤(G)核苷酸的单价GalNAc部分，如下文所描绘(X＝杂原子)：
在一些实施方案中，tetraL具有经由本文所描述的任何接头附接至tetraL的任何一个或多个腺嘌呤核苷酸的单价GalNAc，如下文所描绘(X＝杂原子)：
在一些实施方案中，寡核苷酸包含附接至鸟嘌呤(G)核苷酸的单价GalNAc，称作[ademG-GalNAc]或2'-氨基二乙氧基甲醇-鸟嘌呤-GalNAc，如下文所描绘：
在一些实施方案中，寡核苷酸包含附接至腺嘌呤(A)核苷酸的单价GalNAc，称作[ademA-GalNAc]或2'-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下文所描绘：在一些实施方案中，寡核苷酸包含：
对于从5'至3'包含核苷酸序列GAAA的环(L＝接头，X＝杂原子)，下文展示此种缀合的一个实例，其中示出茎附接点。此种环可以存在于例如表4和表5中列出的有义链中任一者的有义链的位置27-30处。在化学式中，用于描述与寡核苷酸链的附接点：
可以使用适当方法或化学(例如，点击化学)将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施方案中，使用点击接头将靶向配体缀合至核苷酸。在一些实施方案中，基于缩醛的接头用于将靶向配体缀合至本文所描述的寡核苷酸中的任一者的核苷酸。基于缩醛的接头公开于例如国际专利申请公布号WO 2016/100401中。在一些实施方案中，接头是不稳定接头。然而，在其它实施方案中，接头是稳定的。下文展示从5'至3'包含核苷酸GAAA的环的实例，其中使用缩醛接头将GalNAc部分附接至环的3或4个核苷酸。此种环可以存在于例如表4和表5中列出的有义链中的任一者的位置27-30处。在化学式中，是与寡核苷酸链的附接点：
如所提及，可以使用各种适当方法或化学合成技术(例如，点击化学)将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施方案中，使用点击接头将靶向配体缀合至核苷酸。在一些实施方案中，基于缩醛的接头用于将靶向配体缀合至本文所描述的寡核苷酸中的任一者的核苷酸。基于缩醛的接头公开于例如国际专利申请公布号WO 2016/100401中。在一些实施方案中，接头是不稳定接头。然而，在其它实施方案中，接头是稳定接头。
在一些实施方案中，在靶向配体(例如，GalNAc部分)与寡核苷酸之间提供双链体延伸(例如，长度为至多3、4、5或6bp)。在一些实施方案中，寡核苷酸不具有与其缀合的GalNAc。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1537和1572；
b)分别是SEQ ID NO:1538和1573；
c)分别是SEQ ID NO:1539和1574；
d)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
e)分别是SEQ ID NO:1541和1576；
f)分别是SEQ ID NO:1542和1577；
g)分别是SEQ ID NO:1543和1578；
h)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
i)分别是SEQ ID NO:1545和1580；
j)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
k)分别是SEQ ID NO:1547和1582；
l)分别是SEQ ID NO:1548和1583；
m)分别是SEQ ID NO:1549和1584；
n)分别是SEQ ID NO:1550和1585；
o)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
p)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
q)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
r)分别是SEQ ID NO:1554和1589；
s)分别是SEQ ID NO:1555和1590；
t)分别是SEQ ID NO:1556和1591；
u)分别是SEQ ID NO:1557和1592；
v)分别是SEQ ID NO:1558和1593；
w)分别是SEQ ID NO:1559和1594；
x)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
y)分别是SEQ ID NO:1561和1596；
z)分别是SEQ ID NO:1562和1597；
aa)分别是SEQ ID NO:1563和1598；
bb)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
cc)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
dd)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
ee)分别是SEQ ID NO:1567和1602；
ff)分别是SEQ ID NO:1568和1603；
gg)分别是SEQ ID NO:1569和1604；
hh)分别是SEQ ID NO:1570和1605；
ii)分别是SEQ ID NO:1571和1606；以及
jj)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含至少一个缀合至核苷酸的GalNAc部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
b)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
c)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
f)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
g)分别是SEQ ID NO:1558和1594；
h)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
i)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
j)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
k)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
l)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
m)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含至少一个缀合至核苷酸的GalNAc部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸的有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
b)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
c)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
f)分别是SEQ ID NO:1681和1586，
其中寡核苷酸包含至少一个缀合至核苷酸的GalNAc部分。
脂质缀合
在一些实施方案中，一个或多个脂质部分缀合至有义链的5'末端核苷酸。在一些实施方案中，一个或多个脂质部分缀合至腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，一个或多个脂质部分缀合至鸟嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，一个或多个脂质部分缀合至胞嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，一个或多个脂质部分缀合至胸腺嘧啶(T)核苷酸。在一些实施方案中，一个或多个脂质部分缀合至尿嘧啶(U)核苷酸。
在一些实施方案中，脂质部分是烃链。在一些实施方案中，烃链是饱和的。在其它实施方案中，烃链是不饱和的。在一些实施方案中，烃链是分支链。在其它实施方案中，烃链是直链。在一些实施方案中，脂质部分是C8-C30烃链。在某些实施方案中，脂质部分是C8:0、C10:0、C11:0、C12:0、C14:0、C16:0、C17:0、C18:0、C18:1、C18:2、C22:5、C22:0、C24:0、C26:0、C22:6、C24:1、二酰基C16:0或二酰基C18:1。在一些实施方案中，脂质部分是C16烃链。在一些实施方案中，C16烃链表示为：
在一些实施方案中，有义链的长度为20-22个核苷酸，并且脂质部分缀合至有义链的5'末端核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为20-22个核苷酸，并且烃链缀合至有义链的5'末端核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为20-22个核苷酸，并且C14-C22烃链缀合至有义链的5'末端核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为20-22个核苷酸，并且C16烃链缀合至有义链的5'末端核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为20个核苷酸，并且脂质部分缀合至有义链的5'末端核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为20个核苷酸，并且烃链缀合至有义链的5'末端核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为20个核苷酸，并且C14-C22烃链缀合至有义链的5'末端核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为20个核苷酸，并且C16烃链缀合至有义链的5'末端核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)长度为20-22个核苷酸的有义链；(ii)包含长度为一个或多个核苷酸的3'悬垂序列的反义链；(iii)包含有义链的3'端的平端；以及(iv)缀合至有义链的5'末端核苷酸的脂质部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)长度为20-22个核苷酸的有义链；(ii)包含长度为一个或多个核苷酸的3'悬垂序列的反义链；(iii)包含有义链的3'端的平端；以及(iv)缀合至有义链的5'末端核苷酸的烃链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)长度为20-22个核苷酸的有义链；(ii)包含长度为一个或多个核苷酸的3'悬垂序列的反义链；(iii)包含有义链的3'端的平端；以及(iv)缀合至有义链的5'末端核苷酸的C14-C22烃链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)长度为20-22个核苷酸的有义链；(ii)包含长度为一个或多个核苷酸的3'悬垂序列的反义链；(iii)包含有义链的3'端的平端；以及(iv)缀合至有义链的5′末端核苷酸的C16烃链。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)长度为20个核苷酸的有义链；(ii)长度为22个核苷酸并且包含长度为两个核苷酸的3'悬垂序列的反义链；(iii)包含有义链的3'端的平端；以及(iv)缀合至有义链的5'末端核苷酸的脂质部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)长度为20个核苷酸的有义链；(ii)长度为22个核苷酸并且包含长度为两个核苷酸的3'悬垂序列的反义链；(iii)包含有义链的3'端的平端；以及(iv)缀合至有义链的5'末端核苷酸的烃链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)长度为20个核苷酸的有义链；(ii)长度为22个核苷酸并且包含长度为两个核苷酸的3'悬垂序列的反义链；(iii)包含有义链的3'端的平端；以及(iv)缀合至有义链的5'末端核苷酸的C14-C22烃链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)长度为20个核苷酸的有义链；(ii)长度为22个核苷酸并且包含长度为两个核苷酸的3'悬垂序列的反义链；(iii)包含有义链的3'端的平端；以及(iv)缀合至有义链的5'末端核苷酸的C16烃链。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)19-30个核苷酸的反义链，所述反义链包含SNCA mRNA靶序列的互补区域，所述靶序列选自SEQ ID NO:1781、1782、1796、1798、1802、1808、1814、1817、1713、1718、1726、1830、1839、1742、1846、1852、1865、1784、1804、1721、1822、1840、1735、1847、1855、1864、1901、1902、1938、1947、1955、1964、1973和1978；(ii)19-25个核苷酸的有义链，所述有义链与反义链形成双链体区域；以及(iii)缀合至有义链的5′末端核苷酸的脂质部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)19-30个核苷酸的反义链，所述反义链包含SNCA mRNA靶序列的互补区域，所述靶序列选自SEQ ID NO:1798、1817、1718、1846、1852、1865、1804、1721、1847、1855、1864和1955；(ii)19-25个核苷酸的有义链，所述有义链与反义链形成双链体区域；以及(iii)缀合至有义链的5'末端核苷酸的脂质部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)19-30个核苷酸的反义链，所述反义链包含SNCAmRNA靶序列的互补区域，所述靶序列选自SEQ ID NO:1865、1721、1847、1846和1955；(ii)19-25个核苷酸的有义链，所述有义链与反义链形成双链体区域；以及(iii)缀合至有义链的5'末端核苷酸的脂质部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)19-30个核苷酸的反义链，所述反义链包含SNCA mRNA靶序列的互补区域，所述靶序列选自SEQ ID NO:1781、1782、1796、1798、1802、1808、1814、1817、1713、1718、1726、1830、1839、1742、1846、1852、1865、1784、1804、1721、1822、1840、1735、1847、1855、1864、1901、1902、1938、1947、1955、1964、1973和1978；(ii)19-25个核苷酸的有义链，所述有义链与反义链形成双链体区域；以及(iii)缀合至有义链的5'末端核苷酸的烃链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)19-30个核苷酸的反义链，所述反义链包含SNCA mRNA靶序列的互补区域，所述靶序列选自SEQ ID NO:1798、1817、1718、1846、1852、1865、1804、1721、1847、1855、1864和1955；(ii)19-25个核苷酸的有义链，所述有义链与反义链形成双链体区域；以及(iii)缀合至有义链的5′末端核苷酸的烃链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)19-30个核苷酸的反义链，所述反义链包含SNCA mRNA靶序列的互补区域，所述靶序列选自SEQ ID NO:1865、1721、1847、1846和1955；(ii)19-25个核苷酸的有义链，所述有义链与反义链形成双链体区域；以及(iii)缀合至有义链的5'末端核苷酸的烃链。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)19-30个核苷酸的反义链，所述反义链包含SNCA mRNA靶序列的互补区域，所述靶序列选自SEQ ID NO:1781、1782、1796、1798、1802、1808、1814、1817、1713、1718、1726、1830、1839、1742、1846、1852、1865、1784、1804、1721、1822、1840、1735、1847、1855、1864、1901、1902、1938、1947、1955、1964、1973和1978；(ii)19-25个核苷酸的有义链，所述有义链与反义链形成双链体区域；以及(iii)缀合至有义链的5'末端核苷酸的C14-C22烃链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)19-30个核苷酸的反义链，所述反义链包含SNCA mRNA靶序列的互补区域，所述靶序列选自SEQ ID NO:1798、1817、1718、1846、1852、1865、1804、1721、1847、1855、1864和1955；(ii)19-25个核苷酸的有义链，所述有义链与反义链形成双链体区域；以及(iii)缀合至有义链的5'末端核苷酸的C14-C22烃链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)19-30个核苷酸的反义链，所述反义链包含SNCA mRNA靶序列的互补区域，所述靶序列选自SEQ ID NO:1865、1721、1847、1846和1955；(ii)19-25个核苷酸的有义链，所述有义链与反义链形成双链体区域；以及(iii)缀合至有义链的5'末端核苷酸的C14-C22烃链。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)19-30个核苷酸的反义链，所述反义链包含SNCA mRNA靶序列的互补区域，所述靶序列选自SEQ ID NO:1781、1782、1796、1798、1802、1808、1814、1817、1713、1718、1726、1830、1839、1742、1846、1852、1865、1784、1804、1721、1822、1840、1735、1847、1855、1864、1901、1902、1938、1947、1955、1964、1973和1978；(ii)19-25个核苷酸的有义链，所述有义链与反义链形成双链体区域；以及(iii)缀合至有义链的5'末端核苷酸的C16烃链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)19-30个核苷酸的反义链，所述反义链包含SNCA mRNA靶序列的互补区域，所述靶序列选自SEQ ID NO:1798、1817、1718、1846、1852、1865、1804、1721、1847、1855、1864和1955；(ii)19-25个核苷酸的有义链，所述有义链与反义链形成双链体区域；以及(iii)缀合至有义链的5'末端核苷酸的C16烃链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含(i)19-30个核苷酸的反义链，所述反义链包含SNCAmRNA靶序列的互补区域，所述靶序列选自SEQ ID NO:1865、1721、1847、1846和1955；(ii)19-25个核苷酸的有义链，所述有义链与反义链形成双链体区域；以及(iii)缀合至有义链的5'末端核苷酸的C16烃链。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含含有SEQ ID NO:1681的核苷酸序列的有义链和含有SEQ ID NO:1586的核苷酸序列的反义链，其中所述有义链包含缀合至有义链的5'末端核苷酸的脂质部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包含含有SEQ ID NO:1681的核苷酸序列的有义链和含有SEQ ID NO:1586的核苷酸序列的反义链，其中所述有义链包含缀合至有义链的5'末端核苷酸的烃链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含含有SEQ ID NO:1681的核苷酸序列的有义链和含有SEQ ID NO:1586的核苷酸序列的反义链，其中所述有义链包含缀合至有义链的5'末端核苷酸的C14-C22烃链。在一些实施方案中，寡核苷酸包含含有SEQ IDNO:1681的核苷酸序列的有义链和含有SEQ ID NO:1586的核苷酸序列的反义链，其中所述有义链包含缀合至有义链的5'末端核苷酸的C16烃链。
示例性SNCA靶向RNAi寡核苷酸
在一些实施方案中，用于降低SNCA基因表达的SNCA靶向RNAi寡核苷酸包含有义链和反义链，其中构成有义链和反义链的所有核苷酸经修饰，其中所述反义链包含SEQ IDNO:1683-2066中的任一者的SNCA mRNA靶序列的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸。在一些实施方案中，反义链的5'末端核苷酸包含4'-O-单甲基膦酸酯-2'-O-甲基尿苷[Me膦酸酯-4O-mU]，如本文所描述。在一些实施方案中，反义链的5'末端核苷酸包含硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，反义链和有义链包含一个或多个2'-F修饰和2'-OMe修饰的核苷酸和至少一个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，反义链包含4个硫代磷酸酯键并且有义链包含1个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，反义链包含5个硫代磷酸酯键并且有义链包含1个硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含具有SEQ ID NO:1683-2066中的任一者的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO:2067-2450中的任一者的互补序列的反义链。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含具有SEQ ID NO:1-384中的任一者的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO:385-768中的任一者的互补序列的反义链。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含具有SEQ ID NO:1537-1571中的任一者的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO:1572-1606中的任一者的互补序列的反义链。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含具有SEQ ID NO:1537-1571和1681中的任一者的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO:1572-1606中的任一者的互补序列的反义链。
在一些实施方案中，寡核苷酸由具有SEQ ID NO:1537-1571中的任一者的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO:1572-1606中的任一者的互补序列的反义链组成。
在一些实施方案中，寡核苷酸由具有SEQ ID NO:1537-1571和1681中的任一者的序列的有义链和包含选自SEQ ID NO:1572-1606中的任一者的互补序列的反义链组成。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含：
36个核苷酸的有义链，所述有义链包含在位置3、5、8、10、12、13、15和17处经2'-F修饰的核苷酸；在位置1、2、4、6、7、9、11、14、16、18-27和31-36处经2'-OMe修饰的核苷酸；在位置28、29和30处经GalNAc缀合的核苷酸；以及在位置1与2之间的硫代磷酸酯键；以及
22个核苷酸的反义链，所述反义链包含在位置2、3、4、5、7、10、14、16和19处经2'-F修饰的核苷酸；在位置1、6、8、9、11、12、13、15、17、18和20-22处的2'-OMe；在位置1与2、位置2与3、位置20与21和位置21与22之间的硫代磷酸酯键；以及在位置1处的5'末端核苷酸，其包含4'-磷酸酯类似物，任选地其中所述5'末端核苷酸包含4'-O-单甲基膦酸酯-2'-O-甲基尿苷[Me膦酸酯-4O-mU]；其中反义链的位置1-20与有义链的位置1-20形成双链体区域，其中有义链的位置21-36形成茎环，其中位置27-30形成茎环的环，任选地其中位置27-30包含四环，其中反义链的位置21和22包含悬垂，并且其中有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1537和1572；
b)分别是SEQ ID NO:1538和1573；
c)分别是SEQ ID NO:1539和1574；
d)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
e)分别是SEQ ID NO:1541和1576；
f)分别是SEQ ID NO:1542和1577；
g)分别是SEQ ID NO:1543和1578；
h)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
i)分别是SEQ ID NO:1545和1580；
j)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
k)分别是SEQ ID NO:1547和1582；
l)分别是SEQ ID NO:1548和1583；
m)分别是SEQ ID NO:1549和1584；
n)分别是SEQ ID NO:1550和1585；
o)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
p)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
q)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
r)分别是SEQ ID NO:1554和1589；
s)分别是SEQ ID NO:1555和1590；
t)分别是SEQ ID NO:1556和1591；
u)分别是SEQ ID NO:1557和1592；
v)分别是SEQ ID NO:1558和1593；
w)分别是SEQ ID NO:1559和1594；
x)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
y)分别是SEQ ID NO:1561和1596；
z)分别是SEQ ID NO:1562和1597；
aa)分别是SEQ ID NO:1563和1598；
bb)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
cc)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
dd)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
ee)分别是SEQ ID NO:1567和1602；
ff)分别是SEQ ID NO:1568和1603；
gg)分别是SEQ ID NO:1569和1604；
hh)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
ii)分别是SEQ ID NO:1571和1606。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含：
36个核苷酸的有义链，所述有义链包含在位置3、5、8、10、12、13、15和17处经2'-F修饰的核苷酸；在位置1、2、4、6、7、9、11、14、16、18-27和31-36处经2'-OMe修饰的核苷酸；在位置28、29和30处经GalNAc缀合的核苷酸；以及在位置1与2之间的硫代磷酸酯键；以及
22个核苷酸的反义链，所述反义链包含在位置2、3、4、5、7、10、14、16和19处经2'-F修饰的核苷酸；在位置1、6、8、9、11、12、13、15、17、18和20-22处的2'-OMe；在位置1与2、位置2与3、位置20与21和位置21与22之间的硫代磷酸酯键；以及在位置1处的5'末端核苷酸，其包含4'-磷酸酯类似物，任选地其中所述5'末端核苷酸包含4'-O-单甲基膦酸酯-2'-O-甲基尿苷[Me膦酸酯-4O-mU]；其中反义链的位置1-20与有义链的位置1-20形成双链体区域，其中有义链的位置21-36形成茎环，其中位置27-30形成茎环的环，任选地其中位置27-30包含tetraL，其中反义链的位置21和22包含悬垂，并且其中有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
b)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
c)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
f)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
g)分别是SEQ ID NO:1558和1594；
h)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
i)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
j)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
k)分别是SEQ ID NO:1566和1601；以及
l)分别是SEQ ID NO:1570和1605。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含：
36个核苷酸的有义链，所述有义链包含在位置3、5、8、10、12、13、15和17处经2'-F修饰的核苷酸；在位置1、2、4、6、7、9、11、14、16、18-27和31-36处经2'-OMe修饰的核苷酸；在位置28、29和30处经GalNAc缀合的核苷酸；以及在位置1与2之间的硫代磷酸酯键；以及
22个核苷酸的反义链，所述反义链包含在位置2、3、4、5、7、10、14、16和19处经2'-F修饰的核苷酸；在位置1、6、8、9、11、12、13、15、17、18和20-22处的2'-OMe；在位置1与2、位置2与3、位置20与21和位置21与22之间的硫代磷酸酯键；以及在位置1处的5'末端核苷酸，其包含4'-磷酸酯类似物，任选地其中所述5'末端核苷酸包含4'-O-单甲基膦酸酯-2'-O-甲基尿苷[Me膦酸酯-4O-mU]；其中反义链的位置1-20与有义链的位置1-20形成双链体区域，其中有义链的位置21-36形成茎环，其中位置27-30形成茎环的环，任选地其中位置27-30包含tetraL，其中反义链的位置21和22包含悬垂，并且其中有义链和反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
b)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
c)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；以及
e)分别是SEQ ID NO:1570和1605。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含：
20个核苷酸的有义链，所述有义链包含在位置3、5、8、10、12、13、15和17处经2'-F修饰的核苷酸；在位置2、4、6、7、9、11、14、16和18-20处经2'-OMe修饰的核苷酸；缀合至位置1处的核苷酸的C16烃链；以及在位置1与2之间、位置18与19之间和位置19与20之间的硫代磷酸酯键；以及
22个核苷酸的反义链，所述反义链包含在位置2、3、4、5、7、10、14、16和19处经2'-F修饰的核苷酸；在位置1、6、8、9、11、12、13、15、17、18和20-22处的2'-OMe；在位置1与2、位置2与3、位置20与21和位置21与22之间的硫代磷酸酯键；以及在位置1处的5'末端核苷酸，其包含4'-磷酸酯类似物，任选地其中所述5'末端核苷酸包含4'-O-单甲基膦酸酯-2'-O-甲基尿苷[Me膦酸酯-4O-mU]；其中反义链的位置1-20与有义链的位置1-20形成双链体区域，其中反义链的位置21和22包含悬垂，并且其中有义链和反义链分别包含SEQ ID NO:1681和1586的核苷酸序列。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含含有如SEQ ID NO:1553所示的核苷酸序列的有义链和含有如SEQ ID NO:1588所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含含有如SEQ ID NO:1560所示的核苷酸序列的有义链和含有如SEQ ID NO:1595所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含含有如SEQ ID NO:1564所示的核苷酸序列的有义链和含有如SEQ ID NO:1599所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含含有如SEQ ID NO:1551所示的核苷酸序列的有义链和含有如SEQ ID NO:1586所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含含有如SEQ ID NO:1570所示的核苷酸序列的有义链和含有如SEQ ID NO:1605所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含含有如SEQ ID NO:1681所示的核苷酸序列的有义链和含有如SEQ IDNO:1586所示的核苷酸序列的反义链。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1865所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域，其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1721所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域，其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1847所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域，其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1846所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域，其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1955所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域，其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1865所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域和3'末端的茎环，其中所述茎环如S1-L-S2所示，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1721所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域和3'末端的茎环，其中所述茎环如S1-L-S2所示，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1847所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域和3'末端的茎环，其中所述茎环如S1-L-S2所示，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1846所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域和3'末端的茎环，其中所述茎环如S1-L-S2所示，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1955所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域和3'末端的茎环，其中所述茎环如S1-L-S2所示，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1846所示；以及(ii)长度为19-25个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域，其中寡核苷酸包含含有有义链的3'端的平端，并且其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1865所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域，其中反义链的互补区域如SEQ ID NO:2249所示，并且其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1721所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域，其中反义链的互补区域如SEQ ID NO:2105所示，并且其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1847所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域，其中反义链的互补区域如SEQ ID NO:2231所示，并且其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1846所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域，其中反义链的互补区域如SEQ ID NO:2230所示，并且其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1955所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域，其中反义链的互补区域如SEQ ID NO:2339所示，并且其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1865所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域和3'末端的茎环，其中反义链的互补区域如SEQ ID NO:2249所示，其中所述茎环如S1-L-S2所示，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1721所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域和3'末端的茎环，其中反义链的互补区域如SEQ ID NO:2105所示，其中所述茎环如S1-L-S2所示，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1847所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域和3'末端的茎环，其中反义链的互补区域如SEQ ID NO:2231所示，其中所述茎环如S1-L-S2所示，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1846所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域和3'末端的茎环，其中反义链的互补区域如SEQ ID NO:2230所示，其中所述茎环如S1-L-S2所示，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1955所示；以及(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域和3'末端的茎环，其中反义链的互补区域如SEQ ID NO:2339所示，其中所述茎环如S1-L-S2所示，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3至5个核苷酸的环，其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域如SEQ ID NO:1846所示；以及(ii)长度为19-25个核苷酸的有义链，所述有义链包含反义链的互补区域，其中反义链的互补区域如SEQ ID NO:2230所示，其中寡核苷酸包含含有有义链的3'端的平端，并且其中反义链和有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含根据以下的有义链和反义链：
有义链：5'-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-[ademX-GalNAc]-[ademX-GalNAc]-[ademX-GalNAc]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3'；杂交至：
反义链：5'-[Me膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3'；
其中mX＝2'-OMe修饰的核苷酸，fX＝2'-F修饰的核苷酸，-S-＝硫代磷酸酯键，-＝磷酸二酯键，[Me膦酸酯-4O-mX]＝4'-O-单甲基膦酸酯-2'-O-甲基修饰的核苷酸，并且ademX-GalNAc＝附接至核苷酸的GalNAc。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含根据以下的有义链和反义链：
有义链：5'-[AdemX-L]-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3'；杂交至：
反义链：5'-[Me膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3'；
其中mX＝2'-OMe修饰的核苷酸，fX＝2'-F修饰的核苷酸，-S-＝硫代磷酸酯键，-＝磷酸二酯键，[Me膦酸酯-4O-mX]＝4'-O-单甲基膦酸酯-2'-O-甲基修饰的核苷酸，并且ademX-L＝附接至核苷酸的脂质部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含根据以下的有义链和反义链：
有义链：5'-[AdemX-C16]-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3'；杂交至：
反义链：5′-[Me膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3'；
其中mX＝2'-OMe修饰的核苷酸，fX＝2'-F修饰的核苷酸，-S-＝硫代磷酸酯键，-＝磷酸二酯键，[Me膦酸酯-4O-mX]＝4'-O-单甲基膦酸酯-2'-O-甲基修饰的核苷酸，并且ademX-C16＝附接至核苷酸的C16烃链。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含有义链和反义链，所述有义链和所述反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1607和1642；
b)分别是SEQ ID NO:1608和1643；
c)分别是SEQ ID NO:1609和1644；
d)分别是SEQ ID NO:1610和1645；
e)分别是SEQ ID NO:1611和1646；
f)分别是SEQ ID NO:1612和1647；
g)分别是SEQ ID NO:1613和1648；
h)分别是SEQ ID NO:1614和1649；
i)分别是SEQ ID NO:1615和1650；
j)分别是SEQ ID NO:1616和1651；
k)分别是SEQ ID NO:1617和1652；
l)分别是SEQ ID NO:1618和1653；
m)分别是SEQ ID NO:1619和1654；
n)分别是SEQ ID NO:1620和1655；
o)分别是SEQ ID NO:1621和1656；
p)分别是SEQ ID NO:1622和1657；
q)分别是SEQ ID NO:1623和1658；
r)分别是SEQ ID NO:1624和1659；
s)分别是SEQ ID NO:1625和1660；
t)分别是SEQ ID NO:1626和1661；
u)分别是SEQ ID NO:1627和1662；
v)分别是SEQ ID NO:1628和1663；
w)分别是SEQ ID NO:1629和1664；
x)分别是SEQ ID NO:1630和1665；
y)分别是SEQ ID NO:1631和1666；
z)分别是SEQ ID NO:1632和1667；
aa)分别是SEQ ID NO:1633和1668；
bb)分别是SEQ ID NO:1634和1669；
cc)分别是SEQ ID NO:1635和1670；
dd)分别是SEQ ID NO:1636和1671；
ee)分别是SEQ ID NO:1637和1672；
ff)分别是SEQ ID NO:1638和1673；
gg)分别是SEQ ID NO:1639和1674；
hh)分别是SEQ ID NO:1640和1675；
ii)分别是SEQ ID NO:1641和1676；以及
jj)分别是SEQ ID NO:1682和1656。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含有义链和反义链，所述有义链和所述反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1610和1645；
b)分别是SEQ ID NO:1614和1649；
c)分别是SEQ ID NO:1616和1651；
d)分别是SEQ ID NO:1621和1656；
e)分别是SEQ ID NO:1622和1657；
f)分别是SEQ ID NO:1623和1658；
g)分别是SEQ ID NO:1629和1664；
h)分别是SEQ ID NO:1630和1665；
i)分别是SEQ ID NO:1634和1669；
j)分别是SEQ ID NO:1635和1670；
k)分别是SEQ ID NO:1636和1671；
l)分别是SEQ ID NO:1640和1675；以及
m)分别是SEQ ID NO:1682和1656。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含有义链和反义链，所述有义链和所述反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1623和1658；
b)分别是SEQ ID NO:1630和1665；
c)分别是SEQ ID NO:1634和1669；
d)分别是SEQ ID NO:1621和1656；
e)分别是SEQ ID NO:1640和1675；以及，
f)分别是SEQ ID NO:1682和1656。
在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含含有如SEQ ID NO:1623所示的核苷酸序列的有义链和含有如SEQ ID NO:1658所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含含有如SEQ ID NO:1630所示的核苷酸序列的有义链和含有如SEQ ID NO:1665所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含含有如SEQ ID NO:1634所示的核苷酸序列的有义链和含有如SEQ ID NO:1669所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含含有如SEQ ID NO:1621所示的核苷酸序列的有义链和含有如SEQ ID NO:1656所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含含有如SEQ ID NO:1640所示的核苷酸序列的有义链和含有如SEQ ID NO:1675所示的核苷酸序列的反义链。在一些实施方案中，寡核苷酸用于降低SNCA基因表达并且包含含有如SEQ ID NO:1682所示的核苷酸序列的有义链和含有如SEQ IDNO:1656所示的核苷酸序列的反义链。
制剂
已开发了多种制剂以促进寡核苷酸的使用。举例来说，可以使用使降解最小化、促进递送和/或摄取或为制剂中的寡核苷酸提供另一种有益特性的制剂将寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)递送至受试者或细胞环境。在一些实施方案中，制剂是包含降低SNCA基因表达的寡核苷酸的组合物。可以适当配制此种组合物，使得当向靶细胞的直接环境中或全身施用至受试者时，足够部分的寡核苷酸进入细胞以降低SNCA基因表达。任何种类的适合寡核苷酸制剂都可以用来递送用于降低SNCA基因表达的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸于缓冲溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、脂质体、胶束结构和衣壳中配制。在其它实施方案中，寡核苷酸于缓冲溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液中配制。
寡核苷酸与阳离子脂质的制剂可以用于促进寡核苷酸转染至细胞中。举例来说，可以使用阳离子脂质，诸如脂质转染蛋白(lipofectin)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(例如，聚赖氨酸)。适合的脂质包括寡染胺(Oligofectamine)、脂染胺(Lipofectamine)(Life Technologies)、NC388(Ribozyme Pharmaceuticals,Inc.；Boulder,CO)或FuGene 6(Roche)，所有这些脂质都可以根据制造商的说明书使用。在一些实施方案中，寡核苷酸不与促进转染至细胞中的组分一起配制。
因此，在一些实施方案中，制剂包含脂质纳米粒子。在一些实施方案中，脂质纳米粒子包含脂质体、脂质、脂质复合物、微球、微粒、纳米球或纳米粒子，或可以按其它方式配制以用于向有需要的受试者的细胞、组织、器官或身体施用(参见例如Remington:THESCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY,第22版,Pharmaceutical Press,2013)。
在一些实施方案中，制剂包含赋形剂，所述赋形剂赋予组合物改善的稳定性、改善的吸收、改善的溶解度和/或活性成分的治疗增强。在一些实施方案中，赋形剂是缓冲剂(例如，柠檬酸钠、磷酸钠、tris碱或氢氧化钠)或媒剂(例如，缓冲溶液、石蜡脂、二甲亚砜或矿物油)。在一些实施方案中，将寡核苷酸冻干以延长其保质期，然后在使用(例如，向受试者施用)前制成溶液。因此，赋形剂可以是冻干保护剂(例如，甘露糖醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)或崩解温度调节剂(例如，葡聚糖、FicollTM或明胶)。
在一些实施方案中，制剂是与其预期施用途径相容的药物组合物。施用途径的实例包括但不限于肠道外(例如，静脉内、肌内、腹膜内、皮内、皮下)、经口(例如，吸入)、经皮(例如，局部)、经粘膜和直肠施用。
在一些实施方案中，制剂被配制为用于施用至CNS中。在一些实施方案中，制剂被配制为用于施用至脑脊髓液中。在一些实施方案中，制剂被配制为用于施用至脊髓。在一些实施方案中，制剂被配制为用于鞘内施用。在一些实施方案中，制剂被配制为用于施用至脑。在一些实施方案中，制剂被配制为用于脑室内施用。在一些实施方案中，制剂被配制为用于脑干。在一些实施方案中，制剂被配制为用于大池内施用。
适用于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF；Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和它们的适合混合物。在许多情况下，优选地，组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。可以通过将所需量的寡核苷酸与上文所列举的一种成分或成分的组合一起并入所选溶剂中，视需要继之以过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。
在一些实施方案中，制剂可以含有至少约0.1％的寡核苷酸或更多，但活性成分的百分比可以介于总组合物重量或体积的约1％至约80％之间或更多。诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其它药理学考虑因素的因素将由制备此类药物制剂的技术人员所预期，并且因此可能需要多种剂量和治疗方案。
使用方法
降低SNCA表达
在一些实施方案中，使细胞或细胞群体接触或向细胞或细胞群体递送的方法包括施用有效量的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)以降低SNCA基因表达。在一些实施方案中，通过测量细胞中SNCA mRNA、SNCA蛋白、SNCA活性的量或水平的降低或它们的组合来确定SNCA基因表达的降低。所述方法包括本文所描述和本领域普通技术人员已知的那些方法。
在一些实施方案中，降低CNS中的SNCA基因表达的方法包括施用有效量的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)以降低SNCA基因表达。在一些实施方式中，CNS包括脑和脊髓。在一些实施方案中，SNCA基因表达在至少一个脑区域中降低，所述脑区域包括但不限于颈脊髓、胸脊髓、腰脊髓、额叶皮层、颞叶皮层、小脑、中脑、枕叶皮层、顶叶皮层、海马体、尾状核、丘脑和脑干。在一些实施方案中，SNCA基因表达在至少一个脊髓区域中降低，所述脊髓区域包括但不限于颈脊髓、胸脊髓和腰脊髓。在一些实施方案中，SNCA基因表达在至少一个脑区域和至少一个脊髓区域中降低。在一些实施方案中，SNCA基因表达在以下至少一者中降低：颈脊髓、胸脊髓、腰脊髓、额叶皮层、颞叶皮层、小脑、中脑、枕叶皮层、顶叶皮层、海马体、尾状核、丘脑、脑干、运动皮层、苍白球、中脑被盖、黑质、脑桥、小脑白质和小脑齿状核。在一些实施方案中，SNCA基因表达在腰脊髓、胸脊髓和颈脊髓中的至少一者中降低。在一些实施方案中，SNCA基因表达在与帕金森氏病相关的脑和/或脊髓组织中降低。在一些实施方案中，与帕金森氏病相关的组织包括但不限于壳核、中脑被盖、黑质、脑桥和髓质。在一些实施方案中，SNCA基因表达在与多系统萎缩相关的脑和/或脊髓组织中降低。在一些实施方案中，与帕金森氏病相关的组织包括但不限于尾状核、壳核、中脑被盖、黑质、脑桥、小脑皮层、小脑白质、髓质、颈脊髓、胸脊髓和腰脊髓。
在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或包含所述寡核苷酸的制剂后，SNCA基因表达降低持续约1周至约12周。在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或制剂后，SNCA基因表达降低持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周。在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或制剂后，SNCA基因表达降低持续约1个月至约4个月。在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或制剂后，SNCA基因表达降低持续约1个月至约6个月。在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或制剂后，SNCA基因表达降低持续1、2、3或4个月。在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或制剂后，SNCA基因表达降低持续1、2、3、4、5或6个月。在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或制剂后，SNCA基因表达降低持续约7天至约91天。在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或制剂后，SNCA基因表达降低持续7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84或91天。
在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或制剂后，SNCA基因表达在至少一个脑区域和/或至少一个脊髓区域中降低持续约1至约12周。在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或制剂后，SNCA基因表达在至少一个脑区域和/或至少一个脊髓区域中降低持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周。在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或制剂后，SNCA基因表达在至少一个脑区域和/或至少一个脊髓区域中降低持续约1个月至约4个月。在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或制剂后，SNCA基因表达在至少一个脑区域和/或至少一个脊髓区域中降低持续约1个月至约6个月。在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或制剂后，SNCA基因表达在至少一个脑区域和/或至少一个脊髓区域中降低持续1、2、3或4个月。在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或制剂后，SNCA基因表达在至少一个脑区域和/或至少一个脊髓区域中降低持续1、2、3、4、5或6个月。在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或制剂后，SNCA基因表达在至少一个脑区域和/或至少一个脊髓区域中降低持续约7天至约91天。在一些实施方案中，在施用寡核苷酸或制剂后，SNCA基因表达在至少一个脑区域和/或至少一个脊髓区域中降低持续7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84或91天。
本文的方法可用于任何适当细胞类型。在一些实施方案中，细胞类型是表达SNCAmRNA的任何细胞(例如，寡树突细胞)。在一些实施方案中，细胞类型是从受试者获得的原代细胞。在一些实施方案中，原代细胞已经历有限次数的传代，使得细胞大体上维持天然表型特性。在一些实施方案中，寡核苷酸所递送的细胞是离体或体外的(即，可以递送至培养中的细胞或细胞所处的生物体)。
在一些实施方案中，使用本领域中已知的核酸递送方法将寡核苷酸递送至细胞或细胞群体，所述方法包括但不限于注射含有寡核苷酸的溶液或药物组合物(即，制剂)，由寡核苷酸覆盖的粒子进行轰击，将细胞或细胞群体暴露于含有寡核苷酸的溶液，或在寡核苷酸存在下对细胞膜进行电穿孔。可以使用本领域中已知的用于将寡核苷酸递送至细胞的其它方法，诸如脂质介导的载体转运、化学介导的转运和阳离子脂质体转染，诸如磷酸钙等等。
在一些实施方案中，通过评价与SNCA基因表达相关的细胞或细胞群体的一种或多种分子、特性或特征的测定或技术，或通过评价直接指示细胞或细胞群体中的SNCA基因表达的分子(例如，SNCA mRNA或SNCA蛋白)的测定或技术来确定SNCA基因表达的降低。在一些实施方案中，通过将与寡核苷酸接触的细胞或细胞群体中的SNCA基因表达与对照细胞或细胞群体(例如，未接触寡核苷酸或接触对照寡核苷酸的细胞或细胞群体)相比较来评价寡核苷酸降低SNCA基因表达的程度。在一些实施方案中，对照细胞或细胞群体中SNCA基因表达的对照量或水平是预定的，使得对照量或水平不需要在进行测定或技术的每个实例中测量。预定水平或值可以采用多种形式。在一些实施方案中，预定水平或值可以是单个截止值，诸如中值或平均值。
在一些实施方案中，使寡核苷酸与细胞或细胞群体接触或将寡核苷酸递送至细胞或细胞群体促使SNCA基因表达降低。在一些实施方案中，SNCA基因表达的降低是相对于未接触寡核苷酸或接触对照寡核苷酸的细胞或细胞群体中SNCA基因表达的对照量或水平。在一些实施方案中，相对于SNCA基因表达的对照量或水平，SNCA基因表达的降低为约1％或更低、约5％或更低、约10％或更低、约15％或更低、约20％或更低、约25％或更低、约30％或更低、约35％或更低、约40％或更低、约45％或更低、约50％或更低、约55％或更低、约60％或更低、约70％或更低、约80％或更低或约90％或更低。在一些实施方案中，SNCA基因表达的对照量或水平是尚未接触寡核苷酸的细胞或细胞群体中SNCA mRNA和/或SNCA蛋白和/或SNCA活性/功能的量或水平。在一些实施方案中，在任何有限的时间段或时间量(例如，分钟、小时、天、周、月)之后评估根据本文的方法将寡核苷酸递送至细胞或细胞群体的效果。举例来说，在一些实施方案中，在使寡核苷酸与细胞或细胞群体接触或将寡核苷酸递送至细胞或细胞群体之后至少约4小时、约8小时、约12小时、约18小时、约24小时；或至少约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约21天、约28天、约35天、约42天、约49天、约56天、约63天、约70天、约77天或约84天或更长时间，在细胞或细胞群体中确定SNCA基因表达。在一些实施方案中，在使寡核苷酸与细胞或细胞群体接触或将寡核苷酸递送至细胞或细胞群体之后至少约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月或约6个月或更长时间，在细胞或细胞群体中确定SNCA基因表达。
在一些实施方案中，寡核苷酸以转基因的形式递送，所述转基因被工程改造为在细胞中表达寡核苷酸或包含寡核苷酸的链(例如，其有义链和反义链)。在一些实施方案中，使用被工程改造为表达任何寡核苷酸的转基因来递送寡核苷酸。可以使用病毒载体(例如，腺病毒、反转录病毒、牛痘病毒、痘病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒)或非病毒载体(例如，质粒或合成mRNA)来递送转基因。在一些实施方案中，可以将转基因直接注射至受试者。
治疗方法
还提供了用于或适用于治疗将受益于降低SNCA基因表达的受试者(例如，患有与SNCA表达相关的疾病、病症或疾患的人)的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)。在一些方面，本公开提供了用于或适用于治疗患有与SNCA表达相关的疾病、病症或疾患的受试者的寡核苷酸。还提供了用于或适用于制造用以治疗与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的药剂或制剂/药物组合物的寡核苷酸。在一些实施方案中，使用或适于使用的寡核苷酸靶向SNCAmRNA并且降低SNCA基因表达(例如，经由RNAi通路)。在一些实施方案中，使用或适于使用的寡核苷酸靶向SNCA mRNA并且降低SNCA mRNA、SNCA蛋白和/或SNCA活性/功能的量或水平。
另外，在本文的方法的一些实施方案中，选择患有与SNCA表达相关的疾病、病症或疾患或易患所述疾病、病症或疾患的受试者以用寡核苷酸或制剂治疗。在一些实施方案中，所述方法包括选择具有与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的标志物(例如，生物标志物)或易患所述疾病、病症或疾患的受试者，所述标志物诸如但不限于SNCA mRNA、SNCA蛋白、SNCA活性/功能或它们的组合。同样地并且如下文详述，方法的一些实施方案包括诸如以下的步骤：测量或获得SNCA基因表达的标志物的基线值，然后将此种所获得的值与一个或多个其它基线值或在向受试者施用寡核苷酸后获得的值相比较以评估治疗的有效性。
本文提供了用寡核苷酸或制剂治疗患有、疑似患有或有风险患上与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的受试者的方法。在一些方面，本文提供了使用寡核苷酸或制剂治疗或减轻与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的发作或进展的方法。在其它方面，本文提供了使用寡核苷酸或制剂在患有与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的受试者中达成一种或多种治疗效益的方法。在一些实施方案中，通过施用治疗有效量的任何一种或多种本文所提供的寡核苷酸来治疗受试者。在一些实施方案中，治疗包括降低SNCA基因表达。在一些实施方案中，以治疗方式治疗受试者。在其它实施方案中，以预防方式治疗受试者。
在本文的方法的一些实施方案中，向患有与SNCA表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用寡核苷酸或包含所述寡核苷酸的药物组合物，使得受试者中的SNCA基因表达降低，从而治疗所述受试者。在一些实施方案中，受试者中SNCA mRNA的量或水平降低。在一些实施方案中，受试者中SNCA蛋白的量或水平降低。在其它实施方案中，受试者中SNCA活性/功能的量或水平降低。
在一些实施方案中，向患有与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用寡核苷酸或包含所述寡核苷酸的药物组合物/制剂，使得当与施用寡核苷酸或药物组合物之前的SNCA表达相比时，受试者中的SNCA表达降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在本文的方法的一些实施方案中，向患有与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用寡核苷酸或药物组合物，使得当与施用寡核苷酸或药物组合物之前的SNCA表达相比时，受试者中的SNCA表达降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％，持续约1周至约12周、约1个月至约6个月或约7天至约91天。在一些实施方案中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中的SNCA表达相比时，受试者中的SNCA表达降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施方案中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中的SNCA表达相比时，受试者中的SNCA表达降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％，持续约1周至约12周、约1个月至约6个月或约7天至约91天。
在本文的方法的一些实施方案中，向患有与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用寡核苷酸或药物组合物，使得当与施用寡核苷酸或药物组合物之前的SNCAmRNA的量或水平相比时，受试者中SNCA mRNA的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在本文的方法的一些实施方案中，向患有与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用寡核苷酸或药物组合物，使得当与施用寡核苷酸或药物组合物之前的SNCA mRNA的量或水平相比时，受试者中SNCA mRNA的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％，持续约1周至约12周、约1个月至约6个月或约7天至约91天。在一些实施方案中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中SNCA mRNA的量或水平相比时，受试者中SNCA mRNA的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施方案中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中SNCA mRNA的量或水平相比时，受试者中SNCA mRNA的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％，持续约1周至约12周、约1个月至约6个月或约7天至约91天。
在本文的方法的一些实施方案中，向患有与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用寡核苷酸或药物组合物，使得当与施用寡核苷酸或药物组合物之前的SNCA蛋白的量或水平相比时，受试者中SNCA蛋白的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在本文的方法的一些实施方案中，向患有与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用寡核苷酸或药物组合物，使得当与施用寡核苷酸或药物组合物之前的SNCA蛋白的量或水平相比时，受试者中SNCA蛋白的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％，持续约1周至约12周、约1个月至约6个月或约7天至约91天。在一些实施方案中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中SNCA蛋白的量或水平相比时，受试者中SNCA蛋白的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施方案中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中SNCA蛋白的量或水平相比时，受试者中SNCA蛋白的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％，持续约1周至约12周、约1个月至约6个月或约7天至约91天。
在本文的方法的一些实施方案中，向患有与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用寡核苷酸或药物组合物，使得当与施用寡核苷酸或药物组合物之前的SNCA活性/功能的量或水平相比时，受试者中SNCA活性/功能的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在本文的方法的一些实施方案中，向患有与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用寡核苷酸或药物组合物，使得当与施用寡核苷酸或药物组合物之前的SNCA活性/功能的量或水平相比时，受试者中SNCA活性/功能的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％，持续约1周至约12周、约1个月至约6个月或约7天至约91天。在一些实施方案中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中SNCA活性/功能的量或水平相比时，受试者中SNCA活性/功能的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％。在一些实施方案中，当与未接受寡核苷酸或药物组合物或接受对照寡核苷酸、药物组合物或治疗的受试者(例如，参考或对照受试者)中SNCA活性/功能的量或水平相比时，受试者中SNCA活性/功能的量或水平降低至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或大于99％，持续约1周至约12周、约1个月至约6个月或约7天至约91天。
用于确定受试者中或来自受试者的样品中的SNCA基因表达(诸如SNCA表达)、SNCAmRNA的量或水平、SNCA蛋白的量或水平和/或SNCA活性/功能的量或水平的适合方法在本领域中是已知的。此外，本文所阐述的实施例说明了用于确定SNCA基因表达的示例性方法。
在一些实施方案中，从受试者获得或分离的细胞(例如，寡树突细胞)、细胞群体或一组细胞(例如，类器官)、器官(例如，额叶皮层)、血液或其部分(例如，血浆)、组织(例如，脑组织)、样品(例如，脑活检样品)或任何其它生物材料中的SNCA基因表达(诸如SNCA表达)、SNCA mRNA的量或水平、SNCA蛋白的量或水平、SNCA活性/功能的量或水平或它们的任何组合降低。在一些实施方案中，从受试者获得或分离的多于一种类型的细胞(例如，寡树突细胞和一种或多种其它类型的细胞)、多于一组细胞、多于一种器官(例如，脑和一种或多种其它器官)、多于一种血液部分(例如，血浆和一种或多种其它血液部分)、多于一种类型的组织(例如，脑组织和一种或多种其它类型的组织)、多于一种类型的样品(例如，脑活检样品和一种或多种其它类型的活检样品)中的SNCA表达、SNCA mRNA的量或水平、SNCA蛋白的量或水平、SNCA活性/功能的量或水平或它们的任何组合降低。在一些实施方案中，颈脊髓、胸脊髓、腰脊髓、额叶皮层、颞叶皮层、小脑、中脑、枕叶皮层、顶叶皮层、海马体、尾状核、丘脑、脑干、运动皮层、苍白球、中脑被盖、黑质、脑桥、小脑白质和小脑齿状核中的一者或多者中的SNCA表达、SNCA mRNA的量或水平、SNCA蛋白的量或水平、SNCA活性/功能的量或水平或它们的任何组合降低。在一些实施方案中，与帕金森氏病相关的脑和/或脊髓组织中的SNCA表达、SNCA mRNA的量或水平、SNCA蛋白的量或水平、SNCA活性/功能的量或水平或它们的任何组合降低。在一些实施方案中，与帕金森氏病相关的组织包括但不限于壳核、中脑被盖、黑质、脑桥和髓质。在一些实施方案中，与多系统萎缩相关的脑和/或脊髓组织中的SNCA表达、SNCA mRNA的量或水平、SNCA蛋白的量或水平、SNCA活性/功能的量或水平或它们的任何组合降低。在一些实施方案中，与多系统萎缩相关的组织包括但不限于尾状核、壳核、中脑被盖、黑质、脑桥、小脑皮层、小脑白质、髓质、颈脊髓、胸脊髓和腰脊髓。
与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的实例包括多系统萎缩、路易体痴呆和帕金森病。
由于其高度特异性，本文的寡核苷酸特异性靶向细胞、组织或器官(例如，脑)的靶基因的SNCA mRNA。在预防疾病中，靶基因可以是引发或维持疾病所需或已鉴定为与感染疾病的较高风险相关的基因。在治疗疾病中，可以使寡核苷酸与展现或负责介导疾病的细胞、组织或器官(例如，脑)接触。举例来说，可以使与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患相关的野生型(即，原生)或突变基因的全部或部分大体上相同的寡核苷酸接触所关注的细胞或组织类型(诸如寡树突细胞或其它脑细胞)或引入其中。
在一些实施方案中，SNCA可以来自任何哺乳动物(诸如人类)并且可以根据本文所描述的方法而沉默。
本文的方法通常涉及向受试者施用治疗有效量的寡核苷酸，即，能够产生期望治疗结果的量。治疗上可接受的量可以是可按治疗方式治疗疾病、病症或疾患的量。针对任何一名受试者的适当量/剂量将取决于某些因素，包括受试者的体型、体表面积、年龄、待施用的特定组合物、组合物中的活性成分、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其它药物。
在一些实施方案中，经肠(例如，经口、通过胃饲管、通过十二指肠饲管、经由胃造口术或经直肠)、肠道外(例如，皮下注射、静脉内注射或输注、动脉内注射或输注、骨内输注、肌内注射、脑内注射、脑室内注射、鞘内)、局部(例如，表皮、吸入、经由滴眼剂或经粘膜)或通过直接注射至靶器官(例如，受试者的脑)中，向受试者施用本文的寡核苷酸或组合物中的任一者。通常，静脉内或皮下施用寡核苷酸或组合物。在一些实施方案中，向脑脊髓液施用寡核苷酸或组合物。在一些实施方案中，鞘内施用寡核苷酸或组合物。在一些实施方案中，脑室内施用寡核苷酸或组合物。在一些实施方案中，通过大池内注射施用寡核苷酸或组合物。
作为一组非限制性实例，将通常每季度(每三个月一次)、每两月(每两个月一次)、每月或每周施用寡核苷酸。举例来说，可以每周或以两周或三周的时间间隔施用寡核苷酸。或者，可以每天施用寡核苷酸。在一些实施方案中，向受试者施用一个或多个负荷剂量的寡核苷酸，继而施用一个或多个维持剂量的寡核苷酸。
在一些实施方案中，待治疗的受试者是人类或非人类灵长类动物或其它哺乳动物受试者。其它示例性受试者包括家养动物，诸如犬和猫；牲畜，诸如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及动物，诸如小鼠、大鼠、天竺鼠和仓鼠。
试剂盒
在一些实施方案中，提供了一种包含本文所描述的寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)及其使用说明书的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含寡核苷酸以及含有试剂盒和/或其任何组分的使用说明书的包装插页。在一些实施方案中，试剂盒在适合的容器中包含寡核苷酸、一种或多种对照和本领域中众所周知的各种缓冲液、试剂、酶和其它标准成分。在一些实施方案中，容器包括至少一个小瓶、孔、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器工具，寡核苷酸置于其中并且在一些情况下被适当等分。在提供额外组分的一些实施方案中，试剂盒含有此种组分置于其中的额外容器。试剂盒还可以包括用于在密闭空间中容纳寡核苷酸和任何其它试剂以用于商业销售的工具。此类容器可以包括注塑成型或吹塑成型的塑料容器，其中保留所需小瓶。容器和/或试剂盒可以包括带有使用说明书和/或警告的标签。
在一些实施方案中，试剂盒包含寡核苷酸和药学上可接受的载体或药物组合物，以及用于在有需要的受试者中治疗与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患或延缓其进展的说明书。
在一些实施方案中，试剂盒包含寡核苷酸和药学上可接受的载体或药物组合物，以及用于向脑脊髓液施用寡核苷酸或药物组合物以降低有需要的受试者的至少一个脑区域和/或至少一个脊髓区域中的SNCA基因表达的说明书。
定义
如本文所用，“近似”或“约”当应用于一个或多个所关注的值时，是指类似于所叙述的参考值的值。在某些实施方案中，除非另有规定或从上下文另外显而易见(除非此种数值将超过可能值的100％)，否则“约”是指处于在任一方向上(大于或小于)所叙述的参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小值以内的值的范围。
如本文所用，“施用(administer)”、“施用(administering)”、“施用(administration)”等是指以药理学上有用(例如，以治疗受试者的疾病、病症或疾患)的方式向受试者提供物质(例如，寡核苷酸)。
如本文所用，“脱唾液酸糖蛋白受体”或“ASGPR”是指由主要48kDa亚基(ASGPR-1)和次要40kDa亚基(ASGPR-2)形成的对分C型凝集素。ASGPR主要在肝细胞的血窦表面上表达，并且在含有末端半乳糖或GalNAc残基的循环糖蛋白(脱唾液酸糖蛋白)的结合、内化和后续清除中起主要作用。
如本文所用，“减轻(attenuate)”、“减轻(attenuating)”、“减轻(attenuatio n)”等是指减少或有效阻止。作为一个非限制性实例，本文的一种或多种治疗可以减少或有效阻止受试者中与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的发作或进展。此种减弱可以由以下例示：例如，与SNC A基因表达相关的疾病的一个或多个方面(例如，症状、组织特征以及细胞、炎性或免疫反应等)减少，未检测到疾病、病症或疾患的一个或多个方面的进展(恶化)，或在受试者中未检测到可能以其它方式预期的疾病的方面。
如本文所用，“互补”是指两个核苷酸之间(例如，在两个相对核酸上或在单链核酸的相对区域上)的结构关系，这允许两个核苷酸彼此形成碱基对。举例来说，与相对核酸的嘧啶核苷酸互补的一个核酸的嘌呤核苷酸可以通过彼此形成氢键而一起碱基配对。在一些实施方案中，互补核苷酸可以按沃森-克里克方式或按允许形成稳定双链体的任何其它方式碱基配对。在一些实施方案中，两个核酸可以具有多个核苷酸的区域，所述区域彼此互补以形成互补区域，如本文所描述。
如本文所用，“脱氧核糖核苷酸”是指当与核糖核苷酸相比时，在其戊糖的2'位置处具有替代羟基的氢的核苷酸。经修饰的脱氧核糖核苷酸是除2'位置以外具有一个或多个原子修饰或取代的脱氧核糖核苷酸，包括糖、磷酸酯基团或碱基内部或本身的修饰或取代。
如本文所用，“双链寡核苷酸”或“ds寡核苷酸”是指大体上呈双链体形式的寡核苷酸。在一些实施方案中，在共价分离的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成ds寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对。在一些实施方案中，在共价连接的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成ds寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对。在一些实施方案中，由折叠(例如，经由发夹)的单链核酸形成ds寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对，以提供一起碱基配对的核苷酸的互补反平行序列。在一些实施方案中，ds寡核苷酸包含彼此完全呈双链体的两个共价分离的核酸链。然而，在其它实施方案中，ds寡核苷酸包含部分呈双链体(例如，在一端或两端具有悬垂)的两个共价分离的核酸链。在一些实施方案中，ds寡核苷酸包含部分互补的核苷酸的反平行序列，并且因此可以具有一个或多个错配，其可以包括内部错配或末端错配。
如本文所用，关于核酸(例如，寡核苷酸)的“双链体”是指经由核苷酸的两个反平行序列的互补碱基配对形成的结构。
如本文所用，“赋形剂”是指可以包含于组合物中的非治疗剂，例如，以提供或有助于所需稠度或稳定作用。
如本文所用，“不稳定接头”是指可以裂解(例如，通过酸性pH)的接头。“相当稳定的接头”是指不可裂解的接头。
如本文所用，“环”是指核酸(例如，寡核苷酸)的未配对区域，其两侧是核酸的两个反平行区域，所述两个反平行区域彼此充分互补，使得在适当杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲液中、在细胞中)，位于未配对区域两侧的两个反平行区域杂交形成双链体(称作“茎”)。
如本文所用，“经修饰的核苷酸间键”是指当与包含磷酸二酯键的参考核苷酸间键相比时具有一个或多个化学修饰的核苷酸间键。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸是非天然存在的键。通常，经修饰的核苷酸间键赋予其中存在经修饰的核苷酸间键的核酸一种或多种期望特性。举例来说，经修饰的核苷酸可以改善热稳定性、抗降解性、核酸酶抗性、溶解度、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
如本文所用，“经修饰的核苷酸”是指与选自以下的相应参考核苷酸相比具有一个或多个化学修饰的核苷酸：腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和胸苷脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸在其糖、核碱基和/或磷酸酯基团中具有一个或多个化学修饰。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸具有一个或多个缀合至相应参考核苷酸的化学部分。通常，经修饰的核苷酸赋予其中存在经修饰的核苷酸的核酸一种或多种期望特性。举例来说，经修饰的核苷酸可以改善热稳定性、抗降解性、核酸酶抗性、溶解度、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
如本文所用，“带切口的四环结构”或“带切口的tetraL结构”是指寡核苷酸(例如，RNAi寡核苷酸)的结构，其特征为独立的有义(过客)链和反义(引导)链，其中有义链具有反义链的互补区域，并且其中至少一个链，一般是有义链，具有被配置为稳定在至少一个链内形成的相邻茎区的tetraL。
如本文所用，“寡核苷酸”是指短核酸(例如，长度小于约100个核苷酸)。寡核苷酸可以是ss或ds。寡核苷酸可能具有或可能不具有双链体区域。作为一组非限制性实例，寡核苷酸可以是但不限于小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、切丁酶受质干扰RNA(dsiRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、短siRNA或ss siRNA。在一些实施方案中，寡核苷酸是ds寡核苷酸并且是RNAi寡核苷酸。
如本文所用，“悬垂”是指由一个链或区域延伸超过互补链的末端产生的末端非碱基配对核苷酸，所述一个链或区域与所述互补链形成双链体。在一些实施方案中，悬垂包含在ds寡核苷酸的5'末端或3'末端处从双链体区域延伸的一个或多个未配对核苷酸。在某些实施方案中，悬垂是ds寡核苷酸的反义链或有义链上的3'或5'悬垂。
如本文所用，“磷酸酯类似物”是指模拟磷酸酯基团的静电和/或空间特性的化学部分。在一些实施方案中，磷酸酯类似物位于寡核苷酸的5′末端核苷酸处以替代常常易于酶促移除的5'-磷酸酯。在一些实施方案中，5′-磷酸酯类似物含有磷酸酯酶抗性键。磷酸酯类似物的实例包括但不限于5'膦酸酯，诸如5'亚甲基膦酸酯(5'-MP)和5'-(E)-乙烯基膦酸酯(5'-VP)。在一些实施方案中，寡核苷酸在5'末端核苷酸处具有在糖的4'-碳位置处的磷酸酯类似物(称作“4'-磷酸酯类似物”)。4′-磷酸酯类似物的实例是氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子结合至糖部分(例如，在其4'-碳处)或其类似物。参见例如美国临时专利申请号62/383,207(2016年9月2日提交)和62/393,401(2016年9月12日提交)。已针对寡核苷酸的5'端开发其它修饰(参见例如国际专利申请号WO 2011/133871；美国专利号8,927,513；以及Prakash等人(2015)Nucleic Acids Res.43:2993-3011)。
如本文所用，“SNCA”是指突触核蛋白α。SNCA在脑中大量发现，并且抑制磷脂酶D2。它在突触信号传导和膜运输中发挥功能。编码野生型人类SNCA的mRNA如SEQ ID NO:1677所示。编码小鼠SNCA的mRNA如SEQ ID NO:1678所示。编码猴SNCA的mRNA如SEQ ID NO:1679所示。
如本文所用，基因(例如，SNCA)的“表达降低”是指当与适当参考(例如，参考细胞、细胞群体、样品或受试者)相比时，细胞、细胞群体、样品或受试者中由基因编码的RNA转录物(例如，SNCA mRNA)或蛋白质的量或水平减少和/或基因和/或蛋白质的活性/功能的量或水平减少。举例来说，使细胞与寡核苷酸(例如，包含具有与包含SNCA mRNA的核苷酸序列互补的核苷酸序列的反义链的寡核苷酸，诸如RNAi寡核苷酸)接触的行为可以使得当与未用寡核苷酸处理的细胞相比时，SNCA mRNA、SNCA蛋白和/或SNCA活性/功能的量或水平减少(例如，经由RNAi通路使SNCA mRNA失活和/或降解)。类似地并且如本文所用，“降低表达”是指使基因(例如，SNCA)的表达降低的行为。
如本文所用，“SNCA基因表达降低”是指当与适当参考(例如，参考细胞、细胞群体、样品或受试者)相比时，细胞、细胞群体、样品或受试者中SNCA mRNA、SNCA蛋白和/或SNCA活性/功能的量或水平减少。
如本文所用，“互补区域”是指核酸(例如，ds寡核苷酸)的核苷酸的序列，其与核苷酸的反平行序列充分互补，以允许在适当杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲液中、在细胞中等等)，核苷酸的两个序列之间进行杂交。在一些实施方案中，寡核苷酸包含具有mRNA靶序列的互补区域的靶向序列。
如本文所用，“核糖核苷酸”是指具有呈戊糖形式的核糖的核苷酸，在其2'位置处含有羟基。“经修饰的核糖核苷酸”是指除2'位置以外具有一个或多个原子修饰或取代的核糖核苷酸，包括核糖、磷酸酯基团或碱基内部或本身的修饰或取代。
如本文所用，“RNAi寡核苷酸”是指(a)具有有义链和反义链的ds寡核苷酸，其中反义链或反义链的一部分由Argonaute 2(Ago2)核酸内切酶用于靶mRNA(例如，SNCA mRNA)的裂解中，或(b)具有单个反义链的ss寡核苷酸，其中那个反义链(或那个反义链的一部分)由Ago2核酸内切酶用于靶mRNA(例如，SNCA mRNA)的裂解中。
如本文所用，“链”是指经由核苷酸间键(例如，磷酸二酯键或硫代磷酸酯键)连接在一起的单个连续核苷酸序列。在一些实施方案中，链具有两个自由端(例如，5'端和3'端)。
如本文所用，“受试者”意指任何哺乳动物，包括小鼠、兔和人类。在一个实施方案中，受试者是人类或NHP。此外，“个体”或“患者”可以与“受试者”互换使用。
如本文所用，“合成”是指人工合成(例如，使用机器(诸如固态核酸合成器))或以其它方式不来源于通常产生分子的天然来源(例如，细胞或生物体)的核酸或其它分子。
如本文所用，“靶向配体”是指选择性结合至所关注的组织或细胞的同源分子(例如，受体)，并且可缀合至另一种物质以达成将另一种物质靶向所关注的组织或细胞的目的的分子(例如，碳水化合物、氨基糖、胆固醇或多肽)。举例来说，在一些实施方案中，靶向配体可以缀合至寡核苷酸以达成将寡核苷酸靶向所关注的特定组织或细胞的目的。在一些实施方案中，靶向配体选择性结合至细胞表面受体。因此，在一些实施方案中，靶向配体当缀合至寡核苷酸时，经由选择性结合至细胞表面上表达的受体以及包含寡核苷酸、靶向配体和受体的复合物的细胞的核内体内化来促进寡核苷酸递送至特定细胞中。在一些实施方案中，靶向配体经由接头缀合至寡核苷酸，所述接头在细胞内化之后或期间裂解，使得寡核苷酸从细胞中的靶向配体释放。
如本文所用，“四环”或“tetraL”是指增加由核苷酸的侧翼序列杂交形成的相邻双链体的稳定性的环。稳定性的增加是可检测的，这是因为相邻茎双链体的解链温度(Tm)的增加高于平均来说从一组具有可比长度并且由随机选择的核苷酸序列组成的环预期的相邻茎双链体的Tm。举例来说，tetraL可以在10mM NaHPO4中向包含长度为至少2个碱基对(bp)的双链体的发夹赋予至少约50℃、至少约55℃、至少约56℃、至少约58℃、至少约60℃、至少约65℃或至少约75℃的Tm。在一些实施方案中，tetraL可以通过堆积相互作用稳定相邻茎双链体中的bp。另外，tetraL中核苷酸之间的相互作用包括但不限于非沃森-克里克碱基配对、堆积相互作用、氢键结和接触相互作用(Cheong等人(1990)Nature 346:680-682；以及Heus和Pardi(1991)Science 253:191-94)。在一些实施方案中，tetraL包含3至6个核苷酸或由其组成并且通常为4至5个核苷酸。在某些实施方案中，tetraL包含3、4、5或6个核苷酸或由其组成，所述核苷酸可能经修饰或可能未经修饰(例如，其可能缀合或可能不缀合至靶向部分)。在某些实施方案中，tetraL包含3、4、5或6个核苷酸或由其组成，所述核苷酸可能经修饰或可能未经修饰(例如，其可能缀合或可能不缀合至靶向配体)。在一个实施方案中，tetraL由4个核苷酸组成。任何核苷酸都可以用于tetraL中，并且可以使用此类核苷酸的标准IUPAC-IUB符号，如Cornish-Bowden(1985)Nucleic Acids Res.13:3021-30中所描述。举例来说，字母“N”可以用于意谓任何碱基都可以在那个位置处，字母“R”可以用于显示A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)可以在那个位置处，并且“B”可以用于显示C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)、T(胸腺嘧啶)或U(尿嘧啶)可以在那个位置处。四环的实例包括四环的UNCG家族(例如，UUCG)、四环的GNRA家族(例如，GAAA)和CUUG四环(Woese等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8467-71；以及Antao等人(1991)Nucleic Acids Res.19:5901-05)。DNA四环的实例包括四环的d(GNNA)家族(例如，d(GTTA))、四环的d(GNRA)家族、四环的d(GNAB)家族、四环的d(CNNG)家族和四环的d(TNCG)家族(例如，d(TTCG))。参见例如Nakano等人(2002)Biochem.41:4281-92；Shinji等人(2000)Nippon Kagakkai Koen Yokoshu 78:731。在一些实施方案中，tetraL含于带缺口的tetraL结构内。
如本文所用，“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指例如通过向有需要的受试者施用治疗剂(例如，本文的寡核苷酸，诸如RNAi寡核苷酸)而向所述受试者提供照护的行为，以达成关于现有疾患(例如，疾病、病症)改善受试者的健康和/或福祉的目的或者预防或降低疾患发生的可能性。在一些实施方案中，治疗涉及降低受试者经历的疾患(例如，疾病、病症)的至少一种征象、症状或促成因素的频率或严重性。
实施例
实施例1：制备RNAi寡核苷酸
寡核苷酸合成和纯化
使用本文所描述的方法化学合成前述实施例中所描述的寡核苷酸(即，RNAi寡核苷酸)。一般来说，除了使用已知亚磷酰胺合成(参见例如Hughes和Ellington(2017)ColdSpring Harb Perspect Biol.9(1):a023812；Beaucage和Caruthers(1981)TetrahedronLett.22:1859-62)以外，使用如针对19-23mer siRNA所描述的固相寡核苷酸合成方法(参见例如Scaringe等人(1990)Nucleic Acids Res.18:5433-5441以及Usman等人(1987)J.Am.Chem.Soc.109:7845-45；还参见美国专利号5,804,683、5,831,071、5,998,203、6,008,400、6,111,086、6,117,657、6,353,098、6,362,323、6,437,117和6,469,158)合成RNAi寡核苷酸。将具有19mer核心序列的dsRNAi寡核苷酸格式化为具有25mer有义链和27mer反义链的构建体，以允许由RNAi机器进行加工。19mer核心序列与SNCA mRNA中的区域互补。
根据标准方法(Integrated DNA Technologies；Coralville,IA)合成个别的RNA链并且进行HPLC纯化。举例来说，使用固相亚磷酰胺化学合成RNA寡核苷酸，进行脱保护，并且使用标准技术(Damha和Olgivie(1993)Methods Mol.Biol.20:81-114；Wincott等人(1995)Nucleic Acids Res.23:2677-84)在NAP-5柱(Amersham Pharmacia Biotech；Piscataway,NJ)上脱盐。使用离子交换高效液相色谱法(IE-HPLC)在Amersham Source 15Q柱(1.0cm×25cm；Amersham Pharmacia Biotech)上使用15分钟阶梯线性梯度纯化寡聚物。梯度从90:10缓冲液A:B至52:48缓冲液A:B变化，其中缓冲液A是100mM Tris pH8.5并且缓冲液B是100mM Tris pH 8.5、1M NaCl。在260nm处监测样品，并且收集对应于全长寡核苷酸种类的峰，汇集，在NAP-5柱上脱盐并冻干。
通过毛细管电泳(CE)在Beckman PACE 5000(Beckman Coulter,Inc.；Fullerton,CA)上确定每种寡聚物的纯度。CE毛细管具有100μm内径并且含有ssDNA 100R凝胶(Beckman-Coulter)。通常，将约0.6nmol寡核苷酸注入毛细管中，在444V/cm的电场中运行，并且由260nm处的UV吸亮度进行检测。变性Tris-硼酸盐-7M-脲电泳缓冲液从Beckman-Coulter购得。获得如由CE评估为至少90％纯以用于下文所描述的实验的寡核糖核苷酸。遵循制造商的推荐方案，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法在VoyagerDETM生物光谱工作站(Applied Biosystems；Foster City,CA)上验证化合物身份。获得所有寡聚物的相对分子质量，通常在预期分子质量的0.2％以内。
制备双链体
将ss RNA寡聚物再悬浮(例如，以100μM浓度)于由100mM乙酸钾、30mM HEPES(pH7.5)组成的双链体缓冲液中。将互补的有义链和反义链以等摩尔量混合以得到例如50μM双链体的最终溶液。将样品在RNA缓冲液(IDT)中加热至100℃持续5分钟，并且在使用前冷却至室温。将RNAi寡核苷酸储存于-20℃下。将ss RNA寡聚物在-80℃下冻干或于无核酸酶的水中储存。
实施例2：产生SNCA靶向RNAi寡核苷酸
SNCA编码SNCA，一种抑制磷脂酶D2的神经元蛋白。SNCA参与调控突触囊泡运输和神经递质释放。SNCA的异常表达可能导致各种脑部疾病，包括但不限于帕金森病和多系统萎缩。鉴定并产生能够抑制SNCA mRNA表达的寡核苷酸。
鉴定SNCA mRNA靶序列
为了产生SNCA靶向RNAi寡核苷酸，使用基于计算机的算法以计算方式鉴定适合于测定RNAi通路对SNCA表达的抑制的SNCA mRNA靶序列。所述算法提供RNAi寡核苷酸反义链序列，每个序列具有人类(Hs)或鼠类(Mm)mRNA(例如，分别是SEQ ID NO:1677和1678；表1)的适合SNCA mRNA靶序列的互补区域。归因于跨物种的序列保守性，针对人类SNCAmRNA鉴定的一些SNCAmRNA靶序列与鼠类(mM)SNCAmRNA (SEQ ID NO:1678；表1；即，双重通用)和/或猴(Mf)SNCA mRNA (SEQ ID NO:1679；表1；即，三重通用)的相应SNCA mRNA靶序列同源。预测包含具有核苷酸序列相似性的同源SNCA mRNA靶序列的互补区域的SNCA靶向RNAi寡核苷酸具有靶向同源SNCAmRNA (例如，人类SNCA和猴SNCA mRNA)的能力。
表1：示例性人类SNCA、猴SNCA和小鼠SNCA mRNA序列。
物种 GenBank参考序列号 SEQ ID NO
人类(Hs) NM_00345.3 1677
小鼠(Mm) NM_001042451.2 1678
食蟹猴(Mf) XM_005555420.2 1679
如实施例1中所描述产生RNAi寡核苷酸(格式化为DsiRNA寡核苷酸)用于体外评价。以相同修饰模式产生每种DsiRNA，并且各自具有独特的引导链，所述引导链具有由算法鉴定的SNCA靶序列的互补区域。有义和反义DsiRNA的修饰包括以下(X-任何核苷酸；m-2'-OMe修饰的核苷酸；r-核糖基修饰的核苷酸)：
有义链：
5'rXmXrXmXrXrXrXrXrXrXrXrXrXmXrXmXrXrXrXrXrXrXrX XX 3'
反义链：
3'mXmXmXrXmXrXrXrXrXrXrXrXrXrXmXrXmXrXrXrXrXrXr XmXmXmXmX 5′
基于体外细胞的测定
使用基于体外细胞的测定来测量表2中每种经修饰的DsiRNA减少SNCA mRNA的能力。简单来说，在多孔细胞培养板的独立孔中用表2中所列的每种DsiRNA以0.5nM(第1阶段)或用所选DsiRN A以0.5nM、0.1nM和0.02nM(第2阶段)转染表达内源性人类SNCA的人类Huh7细胞(肝细胞系)。在用经修饰的DsiRNA转染后将细胞维持24小时，然后使用基于的qPCR测定确定来自经转染细胞的剩余SNCA mRNA的量，所述测定使用以下引物：正向：AGG GTG TTC TCT ATG TAG GCT(SEQ ID NO:2451)；反向：ACT GCT CCT CCAACATTT GTC(SEQ ID NO:2452)；探针：TGCTCTTTG/ZEN/GTCTTCTCAGCCACTG(SEQ ID NO:2453)。如表2中所示，测定引物对的剩余mRNA％。当与模拟转染的细胞相比时，DsiRNA使得小于或等于13％的SNCA mRNA残留于DsiRN A转染的细胞中，应视为DsiRNA“命中”。评价表2中所列的DsiRN A抑制SNCA基因表达的能力的基于Huh7细胞的测定鉴定若干候选DsiRNA。
总之，这些结果显示，被设计为靶向人类SNCA mRNA的DsiRNA抑制细胞中的SNCA基因表达，如由DsiRNA转染的细胞中SNCA mRNA的量相对于对照细胞减少所确定。这些结果证明了包含DsiRNA的核苷酸序列可用于产生RNAi寡核苷酸以抑制SNCA基因表达。此外，这些结果证明了多个SNCA mRNA靶序列适用于RNAi介导的SNCA基因表达的抑制。
表2：体外筛选结果。
实施例3：GalNAc缀合的SNCA靶向RNAi寡核苷酸体内抑制人类SNCA mRNA表达
实施例2中的体外筛选测定验证了SNCA靶向RNAi寡核苷酸敲低靶SNCA mRNA的能力。为了进一步评价SNCA靶向RNAi寡核苷酸抑制SNCA mRNA表达的能力，产生GalNAc缀合的SNCA靶向RNAi寡核苷酸以确认体内敲低。
具体地，实施例2中鉴定的DsiRNA的子组用于产生相应的ds RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含具有36-mer过客链和22-mer引导链(表4和表5)的带切口的tetraL GalNAc缀合结构(本文中称作“GalNAc缀合的SNCA寡核苷酸”或“GalNAc-SNCA寡核苷酸”)。此外，包含有义链和反义链的核苷酸序列具有不同模式的经修饰核苷酸和硫代磷酸酯键。将三个包含tetraL的核苷酸各自缀合至GalNAc部分(CAS#14131-60-3)。修饰模式如下说明：
有义链：5'-mX-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-mX-[ademX-Gal NAc][ademX-GalNAc][ademX-GalNAc]-mX-mX-mX-mX-mX-mX-3′
杂交至：
反义链：5'-Me膦酸酯-4O-mX-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3'(修饰关键符：表3)。
或者，表示为：
有义链：5'-[mXs][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][mX][ademX-GalNAc][ademX-GalNAc][ademX-GalNAc][mX][mX][mX][mX][mX][mX]-3′
杂交至：
反义链：5′-[Me膦酸酯-4O-mXs][fXs][fX][fX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mX][mX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mXs][mX]-3′(修饰关键符：表3)。
表3：修饰模式的关键符。
GalNAc缀合的SNCA靶向寡核苷酸用于流体动力学注射(HDI)小鼠模型中以确认RNAi寡核苷酸体内敲低SNCA基因表达的能力。在被工程改造为在小鼠肝脏的肝细胞中瞬时表达人类SNCA mRNA的小鼠中评价表4和表5中所列的GalNAc缀合的SNCA靶向寡核苷酸。简单来说，向6-8周龄的雌性CD-1小鼠皮下施用在PBS中配制的3mg/kg剂量的指定GalNAc缀合的SNCA靶向寡核苷酸。向对照组的小鼠(n＝5)仅施用PBS。三天(72小时)后，在普遍存在的巨细胞病毒(CMV)启动子序列控制下，用编码完整人类SNCA(SEQ ID NO:1677)(10μg)的DNA质粒对小鼠进行HDI。引入DNA质粒后一天，收集来自HDI小鼠的肝脏样品。对来源于这些HDI小鼠的总RNA进行qRT-PCR分析以确定人类SNCA mRNA水平，如实施例2中所描述。使用DNA质粒上包括的NeoR基因对所述值进行转染效率归一化。基准对照SNCA-291用于确认成功敲低。
表4：用于HDI筛选的GalNAc缀合的人类SNCA RNAi寡核苷酸。
表5：用于HDI筛选的GalNAc缀合的人类SNCA RNAi寡核苷酸。
图1A和图1B中的结果证明了被设计为靶向人类SNCA mRNA的GalNAc缀合的SNCA寡核苷酸(分别如表4和表5中所示)成功抑制HDI小鼠中的人类SNCA mRNA表达，如由用GalNAc缀合的SNCA寡核苷酸处理的HDI小鼠的肝脏样品中的人类SNCA mRNA表达量相对于仅用PBS处理的对照HDI小鼠减少所确定。
实施例4：GalNAc缀合的SNCA RNAi寡核苷酸以剂量依赖性方式抑制人类SNCA基因表达
为了进一步评价GalNAc缀合的SNCA RNAi寡核苷酸抑制SNCA表达的能力，进行剂量反应研究。具体地，在独立处理组中，将所选GalNAc缀合的SNCARNAi寡核苷酸(表6和表7)在PBS中配制，并且以0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg的剂量向CD-1小鼠皮下施用。如实施例3中所描述，在寡核苷酸给药后3天向小鼠施用人类SNCA DNA表达质粒，并且在24小时后收集肝脏以用于qRT-PCR分析。如图2A和图2B中所示，所有经测试的GalNAc缀合的SNCA RNAi寡核苷酸都以剂量依赖性方式抑制人类SNCA基因表达。强效GalNAc缀合的SNCA寡核苷酸(即，SNCA-244、SNCA-429、SNCA-751、SNCA-752、SNCA-800、SNCA-801和SNCA1003)在1mg/kg下使SNCA mRNA减少约50％或更多并且在3mg/kg下甚至进一步减少。选择所选构建体以用于非人类灵长类动物中的进一步研究。
表6：用于剂量筛选的GalNAc缀合的人类SNCA RNAi寡核苷酸。
表7：用于剂量筛选的GalNAc缀合的人类SNCA RNAi寡核苷酸。
实施例5：RNAi寡核苷酸对NHP CNS中的SNCA基因表达的抑制
测定了在HDI小鼠研究中鉴定的有效GalNAc缀合的SNCA靶向寡核苷酸在NHP中的抑制作用。具体地，在非原初食蟹猴(Macaca fascicularis)中评价表8中所列的GalNAc缀合的SNCA靶向寡核苷酸。每个群组容纳2名雄性和2名雌性受试者。在研究第0天和第7天，经由大池内(i.c.m.)注射以50mg的剂量于1.6mL人工脑脊髓液(aCSF)中施用GalNAc缀合的SNCA靶向寡核苷酸。
表8.用于NHP研究的GalNAc缀合的SNCA RNAi寡核苷酸。
在研究第14天，收集CNS组织并且进行qRT-PCR分析，以测量寡核苷酸处理的猴相对于用可比体积的aCSF处理的那些猴中的S NCA mRNA。为了使数据归一化，相对于2个参考基因RPL23和GAPDH进行测量(两者之间的几何平均值用作靶上KD的设定点)。以下从Integrated DNA Technologies购得的SYBR测定用于评价基因表达：正向：ACAGTGGCTGAGAAGACCAA (SEQ ID NO:2454)，反向：CTCCCTCCACTGTCTTCTGG(SEQ ID NO:2455)；以及探针：ACCCGTCACCACCGCTCCTCC(SEQ ID NO:2456)。
如图3A-3S中所示(第14天)，用GalNAc缀合的SNCA靶向寡核苷酸处理NHP会抑制若干CNS区域中的SNCA基因表达，如由来自寡核苷酸处理的NHP的脑样品中的SNCA mRNA的量相对于用aC SF处理的NHP减少所确定。若干GalNAc缀合的SNCA靶向寡核苷酸降低整个CNS中的SNCA基因表达。SNCA-801和SNCA-751在额叶皮层、海马体、顶叶皮层、枕叶皮层、颞叶皮层、脑干、颈脊髓、胸脊髓和腰脊髓中特别强效并且使SNCA mRNA减少至少50％。这些结果证明了用GalNAc缀合的SNCA靶向寡核苷酸处理NHP减少CNS中的SNCA mRNA的量。
实施例6：脂质缀合的靶向SNCA的RNAi寡核苷酸降低NHP CNS中的基因表达
为了进一步研究靶向SNCA的寡核苷酸的功效，在NHP中评估脂质缀合的寡核苷酸。具体地，基于上述研究选择SNCA-0751，并且将有义链配制为具有与5'末端核苷酸缀合的脂质的20mer有义链。这种构建体被称作SNCA-B15，其具有20mer有义链和22mer反义链(分别是SEQ ID NO:1682和1656)。脂质缀合的寡核苷酸的化学修饰模式如下提供：
有义链：5'-[ademX-C16]-S-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-fX-fX-mX-fX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX-3'
杂交至：
反义链：5'-[Me膦酸酯-4O-mX]-S-fX-S-fX-fX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-mX-mX-fX-mX-fX-mX-mX-fX-mX-S-mX-S-mX 3′(修饰关键符：表3)。
或者，表示为：
有义链：5'-[ademXs-C16][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mX][fX][mX][fX][fX][mX][fX][mX][fX][mXs][mXs][mX]-3'
杂交至：
反义链：5'-[Me膦酸酯-4O-mXs][fXs][fX][fX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mX][mX][mX][fX][mX][fX][mX][mX][fX][mXs][mXs][mX]-3'(修饰关键符：表3)。
脂质缀合
使用文献中已知的用于寡核苷酸合成的标准程序在合成器上使用亚磷酰胺化学来合成脂质缀合的平端寡核苷酸(参见Matteucci和Caruthers(1981)TetrahedronLett.21:719-221；Beaucage和Caruthers(1981)Tetrahedron Lett.22:1859-622)。
1Matteucci MD,Caruthers MH.The synthesis of oligodeoxypyrimidines ona polymer support.Tetrahedron Lett.1980；21(8):719-722.
2Beaucage SL,Caruthers MH.Deoxynucleoside phosphoramidites-A newclass of key intermediates for deoxypolynucleotides.Tetrahedron Lett.1981；22(20)：1859-1862
使用如下所示的亚磷酰胺合成进行脂质部分与SNCA靶向寡核苷酸的缀合：
合成甲酸2-(2-((((6aR,8R,9R,9aR)-8-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2,2,4, 4-四异丙基四氢-6H-呋喃并[3,2-f][1,3,5,2,4]三氧杂二硅环辛-9-基)氧基)甲氧基)乙 氧基)乙-1-铵(1-6)
在10℃下用吡啶(11 mL，134.67 mmol)和四异丙基二硅氧烷二氯化物(22.63 mL，70.75 mmol)处理化合物1-1(25.00 g，67.38 mmol)于20 mL DMF中的溶液。在25℃下搅拌所得混合物3小时，并且用20％柠檬酸(50 mL)淬灭。用EtOAc(3×50 mL)萃取水层，并且在真空中浓缩合并的有机层。使粗残余物从MTBE与正庚烷(1:15，320 mL)的混合物中再结晶，得到呈白色油性固体状的化合物1-2(37.20 g，90％)。
用AcOH(20 mL，317.20 mmol)和Ac2O(15 mL，156.68 mmol)处理化合物1-2(37.00g，60.33mmol)于20mL DMSO中的溶液。在25℃下搅拌混合物15小时。用EtOAc(100mL)稀释反应物，并且用饱和K2CO3(50mL)淬灭。用EtOAc(3×50mL)萃取水层。浓缩合并的有机层并且用ACN(30mL)再结晶，得到呈白色固体状的化合物1-3(15.65g，38.4％)。
在25℃下用Fmoc-氨基-乙氧基乙醇(11.67g，35.66mmol)处理化合物1-3(20.00g，29.72mmol)于120mL DCM中的溶液。搅拌混合物，得到澄清溶液，然后用分子筛(20.0g)、N-碘丁二酰亚胺(8.02g，35.66mmol)和TfOH(5.25mL，59.44mmol)处理。在30℃下搅拌混合物，直至HPLC分析指示化合物1-3消耗量>95％。用TEA(6mL)淬灭反应物并过滤。用EtOAc稀释滤液，用饱和NaHCO3(2×100mL)、饱和Na2SO3(2×100mL)和水(2×100mL)洗涤并且在真空中浓缩，得到呈黄色固体状的粗化合物1-4(26.34g，93.9％)，其未经进一步纯化即直接用于下一步骤。
在5℃下用DBU(7.00mL，45.08mmol)处理化合物1-4(26.34g，27.62mmol)于DCM/水(10:7，170mL)的混合物中的溶液。在5-25℃下搅拌混合物1小时。然后分离有机层，用水(100mL)洗涤，并且用DCM(130mL)稀释。用富马酸(7.05g，60.76mmol)和分子筛(26.34g)分4份处理溶液。搅拌混合物1小时，浓缩，并且从MTBE与DCM(5:1)的混合物中再结晶，得到呈白色固体状的化合物1-6(14.74g，62.9％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)8.73(s,1H),8.58(s,1H),8.15-8.02(m,2H),7.65-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),6.52(s,2H),6.15(s,1H),5.08-4.90(m,3H),4.83-4.78(m,1H),4.15-3.90(m,3H),3.79-3.65(m,2H),2.98-2.85(m,6H),1.20-0.95(m,28H)。
合成(2R,3R,4R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基-9H-嘌呤-9-基)-2-((双(4-甲氧基苯基) (苯基)甲氧基)甲基)-4-((2-(2-[脂质]-酰胺基乙氧基)乙氧基)甲氧基)四氢呋喃-3-基 (2-氰基乙基)二异丙基亚磷酰胺(2-4a至2-4e)
用冰冷的K2HPO4水溶液(6％，100mL)和盐水(20％，2×100mL)洗涤化合物1-6(50.00g，59.01mmol)于150mL 2-甲基四氢呋喃中的溶液。分离有机层，并且在0℃下用己酸(10.33mL，82.61mmol)、HATU(33.66g，88.52mmol)和DMAP(10.81g，147.52mmol)处理。将所得混合物升温至25℃并且搅拌1小时。用水(2×100mL)、盐水(100mL)洗涤溶液，并且在真空中浓缩，得到粗残余物。硅胶快速色谱法(1:1己烷/丙酮)得到呈白色固体状的化合物2-1a(34.95g，71.5％)。
在10℃下用三乙胺三氢氟酸盐(20.61mL，126.58mmol)逐滴处理化合物2-1a(34.95g，42.19mmol)和TEA(9.28mL，126.58mmol)于80mL THF中的混合物。将混合物升温至25℃并且搅拌2小时。浓缩反应物，溶解于DCM(100mL)中，并且用饱和NaHCO3(5×20mL)和盐水(50mL)洗涤。在真空中浓缩有机层，得到粗化合物2-2a(24.72g，99％)，其未经进一步纯化即直接用于下一步骤。
用N-甲基吗啉(18.54mL，168.67mmol)和DMTr-Cl(15.69g，46.38mmol)处理化合物2-2a(24.72g，42.18mmol)于50mL DCM中的溶液。在25℃下搅拌混合物2小时，并且用饱和NaHCO3(50mL)淬灭。分离有机层，用水洗涤并浓缩，得到浆状粗物质。硅胶快速色谱法(1:1己烷/丙酮)得到呈白色固体状的化合物2-3a(30.05g，33.8mmol，79.9％)。
在氮气气氛下用N-甲基吗啉(3.10mL，28.17mmol)和四唑(0.67mL，14.09mmol)处理化合物2-3a(25.00g，28.17mmol)于50mL DCM中的溶液。将双(二异丙基氨基)氯膦(9.02g，33.80mmol)逐滴添加至溶液中，并且在25℃下搅拌所得混合物4小时。用水(15mL)淬灭反应物，并且用DCM(3×50mL)萃取水层。用饱和NaHCO3(50mL)洗涤合并的有机层，浓缩得到粗固体，使其从DCM/MTBE/正己烷(1:4:40)的混合物中再结晶，得到呈白色固体状的化合物2-4a(25.52g，83.4％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)11.25(s,1H),8.65-8.60(m,2H),8.09-8.02(m,2H),7.71(s,1H),7.67-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.38-7.34(m,2H),7.30-7.25(m,7H),6.85-6.79(m,4H),6.23-6.20(m,1H),5.23-5.14(m,1H),4.80-4.69(m,3H),4.33-4.23(m,2H),3.90-3.78(m,1H),3.75(s,6H),3.74-3.52(m,3H),3.50-3.20(m,6H),3.14-3.09(m,2H),3.09(s,1H),2.82-2.80(m,1H),2.65-2.60(m,1H),2.05-1.96(m,2H),1.50-1.39(m,2H),1.31-1.10(m,14H),1.08-1.05(m,2H),0.85-0.79(m,3H)；31P NMR(162MHz,d6-DMSO)149.43,149.18。
使用上文针对化合物2-4a所描述的类似程序制备化合物2-4b、2-4c、2-4d和2-4e。获得呈白色固体状的化合物2-4b(25.50g，85.4％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)11.23(s,1H),8.65-8.60(m,2H),8.05-8.02(m,2H),7.73-7.70(m,1H),7.67-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.38-7.34(m,2H),7.30-7.25(m,7H),6.89-6.80(m,4H),6.21-6.15(m,1H),5.23-5.17(m,1H),4.80-4.69(m,3H),4.40-4.21(m,2H),3.91-3.80(m,1H),3.74(s,6H),3.74-3.52(m,3H),3.50-3.20(m,6H),3.14-3.09(m,2H),3.09(s,1H),2.83-2.79(m,1H),2.68-2.62(m,1H),2.05-1.97(m,2H),1.50-1.38(m,2H),1.31-1.10(m,18H),1.08-1.05(m,2H),0.85-0.78(m,3H)；31P NMR(162MHz,d6-DMSO)149.43,149.19。
获得呈灰白色固体状的化合物2-4c(36.60g，66.3％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)11.22(s,1H),8.64-8.59(m,2H),8.05-8.00(m,2H),7.73-7.70(m,1H),7.67-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.38-7.34(m,2H),7.30-7.25(m,7H),6.89-6.80(m,4H),6.21-6.15(m,1H),5.25-5.17(m,1H),4.80-4.69(m,3H),4.40-4.21(m,2H),3.91-3.80(m,1H),3.74(s,6H),3.74-3.50(m,3H),3.50-3.20(m,6H),3.14-3.09(m,2H),3.09(s,1H),2.83-2.79(m,1H),2.68-2.62(m,1H),2.05-1.99(m,2H),1.50-1.38(m,2H),1.33-1.12(m,38H),1.08-1.05(m,2H),0.86-0.80(m,3H)；31P NMR(162MHz,d6-DMSO)149.42,149.17。
获得呈灰白色固体状的化合物2-4d(26.60g，72.9％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)11.22(s,1H),8.64-8.59(m,2H),8.05-8.00(m,2H),7.73-7.70(m,1H),7.67-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.38-7.33(m,2H),7.30-7.25(m,7H),6.89-6.80(m,4H),6.21-6.15(m,1H),5.22-5.17(m,1H),4.80-4.69(m,3H),4.40-4.21(m,2H),3.91-3.80(m,1H),3.74(s,6H),3.74-3.52(m,3H),3.50-3.20(m,6H),3.14-3.09(m,2H),3.09(s,1H),2.83-2.79(m,1H),2.68-2.62(m,1H),2.05-1.99(m,2H),1.50-1.38(m,2H),1.35-1.08(m,38H),1.08-1.05(m,2H),0.85-0.79(m,3H)；31P NMR(162MHz,d6-DMSO)149.47,149.22。
获得呈白色固体状的化合物2-4e(38.10g，54.0％)：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)11.21(s,1H),8.64-8.59(m,2H),8.05-8.00(m,2H),7.73-7.70(m,1H),7.67-7.60(m,1H),7.59-7.51(m,2H),7.38-7.34(m,2H),7.30-7.25(m,7H),6.89-6.80(m,4H),6.21-6.15(m,1H),5.23-5.17(m,1H),4.80-4.69(m,3H),4.40-4.21(m,2H),3.91-3.80(m,1H),3.73(s,6H),3.74-3.52(m,3H),3.47-3.22(m,6H),3.14-3.09(m,2H),3.09(s,1H),2.83-2.79(m,1H),2.68-2.62(m,1H),2.05-1.99(m,2H),1.50-1.38(m,2H),1.35-1.06(m,46H),1.08-1.06(m,2H),0.85-0.77(m,3H)；31P NMR(162MHz,d6-DMSO)149.41,149.15。
NHP研究
经由L1腰椎输注向NHP(n＝4)鞘内施用37.5mg脂质缀合的SNCA-B15(见表9)。aCSF用作对照。
表9.用于NHP研究的脂质缀合的SNCA靶向RNAi寡核苷酸
施用后28天，收集CNS组织以确定寡核苷酸的浓度和SCNA基因表达的水平。帕金森氏病(PD)是以震颤、运动缓慢、肌肉僵硬、步态不稳和/或失去平衡为特征的运动障碍，而多系统萎缩(MSA)是影响自主神经功能，诸如血压、呼吸和膀胱控制以及运动功能的罕见病症。因此，独立地分析与PD或MSA相关的CNS组织。
如图4A中所示，使用脂质缀合的SNCA-B15，SNCA基因表达在与AD相关的组织中降低，所述组织包括壳核、中脑被盖、黑质、脑桥和髓质。如上述实施例中所描述确定SNCA基因表达。图4B显示了在28天后组织中脂质缀合的SNCA-B15的浓度。这些结果指示，脂质缀合的SNCA靶向寡核苷酸在与PD相关的组织中具有增强的效力。
同样地，并且如图5A中所示，使用脂质缀合的SNCA-B15，SNCA基因表达在与MSA相关的组织中降低，所述组织包括壳核、中脑被盖、黑质、脑桥、小脑白质、髓质、颈脊髓、胸脊髓和腰脊髓。如上述实施例中所描述确定SNCA基因表达。图5B显示了在28天后组织中脂质缀合的SNCA-B15的浓度。这些结果指示，脂质缀合的SNCA靶向寡核苷酸在与MSA相关的组织中具有增强的效力。
序列表
以下核酸和/或氨基酸序列在本公开中提及并且在下文提供以供参考。

Claims (114)

1.一种用于降低SNCA基因表达的RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链形成双链体区域，其中所述反义链包含SEQ ID NO:1683-2066中的任一者的SNCA mRNA靶序列的互补区域，并且其中所述互补区域的长度为至少15个连续核苷酸。
2.如权利要求1所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链的长度为15至50个核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链的长度为18至36个核苷酸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链的长度为15至30个核苷酸。
5.如权利要求1至4中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链的长度为22个核苷酸，并且其中反义链和所述有义链形成双链体区域，所述双链体区域的长度为至少19个核苷酸，任选地长度为至少20个核苷酸。
6.如权利要求1至5中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述互补区域的长度为至少19个连续核苷酸。
7.如权利要求1至6中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述互补区域的长度为至少20个连续核苷酸。
8.一种用于降低SNCA基因表达的双链RNAi寡核苷酸，所述寡核苷酸包含：
(i)长度为19-30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含含有SNCA mRNA靶序列的互补区域的核苷酸序列，其中所述互补区域选自SEQ ID NO:2067-2450，以及
(ii)长度为19-50个核苷酸的有义链，所述有义链包含所述反义链的互补区域，其中所述反义链和所述有义链是形成不对称双链体区域的独立链，所述双链体区域在所述反义链的3'末端具有1-4个核苷酸的悬垂。
9.如权利要求1-8中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链的3'端包含如S1-L-S2所示的茎环，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为3-5个核苷酸的环。
10.如权利要求9所述的RNAi寡核苷酸，其中L是三环或四环。
11.如权利要求10所述的RNAi寡核苷酸，其中L是四环。
12.如权利要求11所述的RNAi寡核苷酸，其中所述四环包含序列5′-GAAA-3'。
13.如权利要求9-12中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述S1和所述S2的长度为1-10个核苷酸并且具有相同长度。
14.如权利要求13所述的RNAi寡核苷酸，其中S1和S2的长度为1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸或10个核苷酸。
15.如权利要求14所述的RNAi寡核苷酸，其中S1和S2的长度为6个核苷酸。
16.如权利要求9-15中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述茎环包含序列5'-GCAGCCGAAAGGCUGC-3'(SEQ ID NO:1680)。
17.如权利要求1-8中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含平端。
18.如权利要求17所述的RNAi寡核苷酸，其中所述平端包含所述有义链的3'端。
19.如权利要求17-18中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链为20-22个核苷酸。
20.如权利要求19所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链为20个核苷酸。
21.如权利要求1至20中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链包含长度为一个或多个核苷酸的3'悬垂序列。
22.如权利要求21所述的RNAi寡核苷酸，其中所述悬垂包含嘌呤核苷酸。
23.如权利要求21或22所述的RNAi寡核苷酸，其中所述3'悬垂序列的长度为2个核苷酸。
24.如权利要求23所述的RNAi寡核苷酸，其中所述3'悬垂选自AA、GG、AG和GA。
25.如权利要求24所述的RNAi寡核苷酸，其中所述悬垂是GG或AA。
26.如权利要求25所述的RNAi寡核苷酸，其中所述悬垂是GG。
27.如前述权利要求中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。
28.如权利要求27所述的RNAi寡核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸包含2'-修饰。
29.如权利要求28所述的RNAi寡核苷酸，其中所述2'-修饰是选自2'-氨基乙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸的修饰。
30.如权利要求28-29中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述修饰是选自2'-氟和2'-O-甲基的2'-修饰。
31.如权利要求29-30中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链的约18％至约23％、或18％、19％、20％、21％、22％或23％的核苷酸包含所述2'-氟修饰。
32.如权利要求29-30中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链的约38％至约43％、或38％、39％、40％、41％、42％或43％的核苷酸包含所述2'-氟修饰。
33.如权利要求29-32中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链的约25％至约35％、或25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的核苷酸包含所述2'-氟修饰。
34.如权利要求29-33中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的约25％至约35％、或25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的核苷酸包含所述2'-氟修饰。
35.如权利要求29-33中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的约35-45％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％或45％的核苷酸包含所述2'-氟修饰。
36.如权利要求29-35中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链从5'至3'在位置1-36处包含36个核苷酸，其中位置3、5、8、10、12、13、15和17中的每一者包含所述2'-氟修饰。
37.如权利要求29-35中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链从5'至3'在位置1-20处包含20个核苷酸，其中位置3、5、8、10、12、13、15和17中的每一者包含所述2'-氟修饰。
38.如权利要求29-37中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链从5'至3'在位置1-22处包含22个核苷酸，并且其中位置2、3、4、5、7、10、14、16和19中的每一者包含所述2′-氟修饰。
39.如权利要求31-38中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中其余核苷酸包含所述2'-O-甲基修饰。
40.如前述权利要求中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸间键。
41.如权利要求40所述的RNAi寡核苷酸，其中所述至少一个经修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
42.如权利要求41所述的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链在以下位置包含所述硫代磷酸酯键：(i)在位置1与2之间和位置2与3之间；或(ii)在位置1与2之间、位置2与3之间和位置3与4之间，并且其中位置从5'至3'编号为1-4。
43.如权利要求41或42所述的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链的长度为22个核苷酸，并且其中所述反义链在位置20与21之间和位置21与22之间包含所述硫代磷酸酯键，并且其中位置从5'至3'编号为1-22。
44.如权利要求41-43中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链在位置1与2之间包含所述硫代磷酸酯键，并且其中位置从5′至3'编号为1-2。
45.如权利要求41-43中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链的长度为20个核苷酸，其中所述有义链在位置1与2之间、位置18与19之间和位置19与20之间包含所述硫代磷酸酯键，并且其中位置从5'至3'编号为1-20。
46.如前述权利要求中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。
47.如权利要求46所述的RNAi寡核苷酸，其中所述磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯，任选地其中所述磷酸酯类似物是包含4′-氧甲基膦酸酯的4'-磷酸酯类似物。
48.如前述权利要求中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一个核苷酸缀合至一个或多个靶向配体。
49.如权利要求48所述的RNAi寡核苷酸，其中每个靶向配体包含碳水化合物、氨基糖、脂质、胆固醇或多肽。
50.如权利要求9-16和21-49中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述茎环包含缀合至所述茎环的一个或多个核苷酸的一个或多个靶向配体。
51.如权利要求50所述的RNAi寡核苷酸，其中所述一个或多个靶向配体缀合至所述环(L)的一个或多个核苷酸。
52.如权利要求51所述的RNAi寡核苷酸，其中所述环(L)包含从5′至3'编号为1-4的4个核苷酸，其中位置2、3和4处的核苷酸各自包含一个或多个靶向配体，并且其中所述靶向配体相同或不同。
53.如权利要求52所述的RNAi寡核苷酸，其中每个靶向配体包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
54.如权利要求53所述的RNAi寡核苷酸，其中所述GalNac部分是单价GalNAc部分、二价GalNAc部分、三价GalNAc部分或四价GalNAc部分。
55.如权利要求9-16和21-54中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述茎环的环(L)的至多4个核苷酸各自缀合至单价GalNAc部分。
56.如权利要求17-48中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述一个或多个靶向配体是脂质部分。
57.如权利要求56所述的RNAi寡核苷酸，其中所述脂质部分缀合至所述有义链的5'末端核苷酸。
58.如权利要求56或57所述的RNAi寡核苷酸，其中所述脂质部分是烃链。
59.如权利要求58所述的RNAi寡核苷酸，其中所述烃链是C8-C30烃链。
60.如权利要求58或59所述的RNAi寡核苷酸，其中所述烃链是C16烃链。
61.如权利要求60所述的RNAi寡核苷酸，其中所述C16烃链表示为：
62.如权利要求56-61中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述脂质部分缀合至所述5'末端核苷酸的核糖环的2'碳。
63.如权利要求中任一项所述的RNAi寡核苷酸1-62，其中所述互补区域在所述反义链的核苷酸位置2-8处与所述SNCA mRNA靶序列完全互补，并且其中核苷酸位置从5'至3'编号。
64.如权利要求1-62中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述互补区域在所述反义链的核苷酸位置2-11处与所述SNCA mRNA靶序列完全互补，并且其中核苷酸位置从5'至3'编号。
65.如权利要求1至64中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含SEQ ID NO:1537-1571和1681中的任一者的核苷酸序列。
66.如权利要求1至65中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链包含SEQ ID NO:1572-1606中的任一者的核苷酸序列。
67.如权利要求1至66中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和所述反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1537和1572；
b)分别是SEQ ID NO:1538和1573；
c)分别是SEQ ID NO:1539和1574；
d)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
e)分别是SEQ ID NO:1541和1576；
f)分别是SEQ ID NO:1542和1577；
g)分别是SEQ ID NO:1543和1578；
h)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
i)分别是SEQ ID NO:1545和1580；
j)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
k)分别是SEQ ID NO:1547和1582；
l)分别是SEQ ID NO:1548和1583；
m)分别是SEQ ID NO:1549和1584；
n)分别是SEQ ID NO:1550和1585；
o)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
p)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
q)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
r)分别是SEQ ID NO:1554和1589；
s)分别是SEQ ID NO:1555和1590；
t)分别是SEQ ID NO:1556和1591；
u)分别是SEQ ID NO:1557和1592；
v)分别是SEQ ID NO:1558和1593；
w)分别是SEQ ID NO:1559和1594；
x)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
y)分别是SEQ ID NO:1561和1596；
z)分别是SEQ ID NO:1562和1597；
aa)分别是SEQ ID NO:1563和1598；
bb)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
cc)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
dd)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
ee)分别是SEQ ID NO:1567和1602；
ff)分别是SEQ ID NO:1568和1603；
gg)分别是SEQ ID NO:1569和1604；
hh)分别是SEQ ID NO:1570和1605；
ii)分别是SEQ ID NO:1571和1606；以及jj)分别是SEQ ID NO:1681和1586。
68.如权利要求1至66中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和所述反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1540和1575；
b)分别是SEQ ID NO:1544和1579；
c)分别是SEQ ID NO:1546和1581；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1552和1587；
f)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
g)分别是SEQ ID NO:1558和1594；
h)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
i)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
j)分别是SEQ ID NO:1565和1600；
k)分别是SEQ ID NO:1566和1601；
l)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及
m)分别是SEQ ID NO:1681和1586。
69.如权利要求1至66中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和所述反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1553和1588；
b)分别是SEQ ID NO:1560和1595；
c)分别是SEQ ID NO:1564和1599；
d)分别是SEQ ID NO:1551和1586；
e)分别是SEQ ID NO:1570和1605；以及，
f)分别是SEQ ID NO:1681和1586。
70.如权利要求1至66中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ IDNO:1553所示的核苷酸序列，并且其中所述反义链包含如SEQ ID NO:1588所示的核苷酸序列。
71.如权利要求1至66中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ IDNO:1560所示的核苷酸序列，并且其中所述反义链包含如SEQ ID NO:1595所示的核苷酸序列。
72.如权利要求1至66中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ IDNO:1564所示的核苷酸序列，并且其中所述反义链包含如SEQ ID NO:1599所示的核苷酸序列。
73.如权利要求1至66中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ IDNO:1551所示的核苷酸序列，并且其中所述反义链包含如SEQ ID NO:1586所示的核苷酸序列。
74.如权利要求1至66中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ IDNO:1570所示的核苷酸序列，并且其中所述反义链包含如SEQ ID NO:1605所示的核苷酸序列。
75.如权利要求1至66中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ IDNO:1681所示的核苷酸序列，并且其中所述反义链包含如SEQ ID NO:1586所示的核苷酸序列。
76.如权利要求1-64中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链的长度为22个核苷酸。
77.如权利要求76所述的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链包含选自SEQ ID NO:1588、1595、1599、1586和1605的核苷酸序列。
78.如权利要求1-64和76-77中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含选自SEQ ID NO:1865、1721、1847、1846和1955的核苷酸序列。
79.如权利要求1-64和76-78中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链的长度为36个核苷酸。
80.如权利要求79所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含选自SEQ ID NO:1553、1560、1564、1551和1570的核苷酸序列。
81.如权利要求1-64中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含SEQ ID NO:1607-1641和1682中的任一者的核苷酸序列。
82.如权利要求1至64和81中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述反义链包含SEQ IDNO:1642-1676中的任一者的核苷酸序列。
83.如权利要求1-64中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和所述反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1607和1642；
b)分别是SEQ ID NO:1608和1643；
c)分别是SEQ ID NO:1609和1644；
d)分别是SEQ ID NO:1610和1645；
e)分别是SEQ ID NO:1611和1646；
f)分别是SEQ ID NO:1612和1647；
g)分别是SEQ ID NO:1613和1648；
h)分别是SEQ ID NO:1614和1649；i)分别是SEQ ID NO:1615和1650；j)分别是SEQ IDNO:1616和1651；k)分别是SEQ ID NO:1617和1652；
l)分别是SEQ ID NO:1618和1653；
m)分别是SEQ ID NO:1619和1654；
n)分别是SEQ ID NO:1620和1655；
o)分别是SEQ ID NO:1621和1656；
p)分别是SEQ ID NO:1622和1657；
q)分别是SEQ ID NO:1623和1658；
r)分别是SEQ ID NO:1624和1659；
s)分别是SEQ ID NO:1625和1660；
t)分别是SEQ ID NO:1626和1661；
u)分别是SEQ ID NO:1627和1662；
v)分别是SEQ ID NO:1628和1663；
w)分别是SEQ ID NO:1629和1664；
x)分别是SEQ ID NO:1630和1665；
y)分别是SEQ ID NO:1631和1666；
z)分别是SEQ ID NO:1632和1667；
aa)分别是SEQ ID NO:1633和1668；
bb)分别是SEQ ID NO:1634和1669；
cc)分别是SEQ ID NO:1635和1670；
dd)分别是SEQ ID NO:1636和1671；
ee)分别是SEQ ID NO:1637和1672；
ff)分别是SEQ ID NO:1638和1673；
gg)分别是SEQ ID NO:1639和1674；
hh)分别是SEQ ID NO:1640和1675；
ii)分别是SEQ ID NO:1641和1676；以及
jj)分别是SEQ ID NO:1682和1656。
84.如权利要求1-64中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和所述反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1610和1645；
b)分别是SEQ ID NO:1614和1649；
c)分别是SEQ ID NO:1616和1651；
d)分别是SEQ ID NO:1621和1656；
e)分别是SEQ ID NO:1622和1657；
f)分别是SEQ ID NO:1623和1658；
g)分别是SEQ ID NO:1629和1664；
h)分别是SEQ ID NO:1630和1665；
i)分别是SEQ ID NO:1634和1669；
j)分别是SEQ ID NO:1635和1670；
k)分别是SEQ ID NO:1636和1671；
l)分别是SEQ ID NO:1640和1675；以及
m)分别是SEQ ID NO:1682和1656。
85.如权利要求1-64中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链和所述反义链包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a)分别是SEQ ID NO:1623和1658；
b)分别是SEQ ID NO:1630和1665；
c)分别是SEQ ID NO:1634和1669；
d)分别是SEQ ID NO:1621和1656；
e)分别是SEQ ID NO:1640和1675；以及
f)分别是SEQ ID NO:1682和1656。
86.如权利要求1至64中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ IDNO:1623所示的核苷酸序列，并且其中所述反义链包含如SEQ ID NO:1658所示的核苷酸序列。
87.如权利要求1至64中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ IDNO:1630所示的核苷酸序列，并且其中所述反义链包含如SEQ ID NO:1665所示的核苷酸序列。
88.如权利要求1至64中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ IDNO:1634所示的核苷酸序列，并且其中所述反义链包含如SEQ ID NO:1669所示的核苷酸序列。
89.如权利要求1至64中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ IDNO:1621所示的核苷酸序列，并且其中所述反义链包含如SEQ ID NO:1656所示的核苷酸序列。
90.如权利要求1至64中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ IDNO:1640所示的核苷酸序列，并且其中所述反义链包含如SEQ ID NO:1676所示的核苷酸序列。
91.如权利要求1至64中任一项所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含如SEQ IDNO:1682所示的核苷酸序列，并且其中所述反义链包含如SEQ ID NO:1656所示的核苷酸序列。
92.如权利要求1所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含序列5'-[mCs][mA][fG][mC][fA][mG][mU][fG][mA][fU][mU][fG][fA][mA][fG][mU][fA][mU][mC][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3'(SEQ ID NO:1623)，其中所述反义链包含序列5'-[M e膦酸酯-4O-mUs][fGs][fA][fU][fA][mC][fU][mU][mC][fA][mA][mU][mC][fA][mC][fU][mG][mC][fU][mGs][mGs][mG]-3'(SEQ ID NO:1658)，并且其中mC、mA、mG、mU＝2′-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU＝2'-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中ademA-GalNAc
93.如权利要求1所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含序列5'-[mAs][mG][fA][mG][fC][mA][mA][fG][mU][fG][mA][fC][fA][mA][fA][mU][fG][mU][mU][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3'(SEQ ID NO:1630)，其中所述反义链包含序列5'-[M e膦酸酯-4O-mUs][fAs][fA][fC][fA][mU][fU][mU][mG][fU][mC][mA][mC][fU][mU][fG][mC][mU][fC][mUs][mGs][mG]-3'(SEQ ID NO:1665)，并且其中mC、mA、mG、mU＝2′-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU＝2′-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中
94.如权利要求1所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含序列5'-[mAs][mG][fU][mC][fA][mU][mG][fA][mC][fA][mU][fU][fU][mC][fU][mC][fA][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3'(SEQ ID NO:1634)，其中所述反义链包含序列5'-[M e膦酸酯-4O-mUs][fUs][fU][fU][fG][mA][fG][mA][mA][fA][mU][mG][mU][fC][mA][fU][mG][mA][fC][mUs][mGs][mG]-3'(SEQ ID NO:1669)，并且其中mC、mA、mG、mU＝2′-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU＝2'-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中
95.如权利要求1所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含序列5'-[mCs][mA][fG][mU][fC][mA][mU][fG][mA][fC][mA][fU][fU][mU][fC][mU][fC][mA][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3'(SEQ ID NO:1621)，其中所述反义链包含序列5′-[Me膦酸酯-4O-mUs][fUs][fU][fG][fA][mG][fA][mA][mA][fU][mG][m U][mC][fA][mU][fG][mA][mC][fU][mGs][mGs][mG]-3'(SEQ ID NO:1656)，并且其中mC、mA、mG、mU＝2′-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU＝2′-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中
96.如权利要求1所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含序列5'-[mAs][mG][fU][mU][fG][mU][mU][fA][mG][fU][mG][fA][fU][mU][fU][mG][fC][mU][mA][mA][mG][mC][mA][mG][mC][mC][mG][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][ademA-GalNAc][mG][mG][mC][mU][mG][mC]-3'(SEQ ID NO:1640)，其中所述反义链包含序列5'-[M e膦酸酯-4O-mUs][fUs][fA][fG][fC][mA][fA][mA][mU][fC][mA][mC][mU][fA][mA][fC][mA][mA][fC][mUs][mGs][mG]-3'(SEQ ID NO:1675)，并且其中mC、mA、mG、mU＝2′-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU＝2′-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且其中
97.如权利要求1所述的RNAi寡核苷酸，其中所述有义链包含序列5'-[ademCs-C16][mA][fG][mU][fC][mA][mU][fG][mA][fC][mA][f U][fU][mU][fC][mU][fC][mAs][mAs][mA]-3'(SEQ ID NO:1682)，其中所述反义链包含序列5'-[Me膦酸酯-4O-mUs][fUs][fU][fG][fA][m G][fA][mA][mA][fU][mG][mU][mC][fA][mU][fG][mA][mC][fU][mGs][mGs][mG]-3'(SEQ ID NO:1656)，并且其中mC、mA、mG、mU＝2′-OMe核糖核苷；fA、fC、fG、fU＝2'-F核糖核苷；s＝硫代磷酸酯，并且
98.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至97中任一项所述的RNAi寡核苷酸和药学上可接受的载体、递送剂或赋形剂。
99.一种用于治疗患有与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-97中任一项所述的RNAi寡核苷酸或权利要求98所述的药物组合物，从而治疗所述受试者。
100.一种将寡核苷酸递送至受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求98所述的药物组合物。
101.一种用于降低细胞、细胞群体或受试者中的SNCA基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：
i.使所述细胞或所述细胞群体与权利要求1至97中任一项所述的RNAi寡核苷酸或权利要求98所述的药物组合物接触；或
ii.向所述受试者施用权利要求1至97中任一项所述的RNAi寡核苷酸或权利要求98所述的药物组合物。
102.如权利要求101所述的方法，其中降低SNCA基因表达包括降低SNCAmRNA的量或水平、SNCA蛋白的量或水平、SNCA活性/功能或它们的组合。
103.如权利要求101或102所述的方法，其中所述受试者患有与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患。
104.如权利要求99或103所述的方法，其中所述与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患是多系统萎缩、路易体痴呆或帕金森病。
105.如权利要求99-104中任一项所述的方法，其中SNCA基因表达在中枢神经系统(CNS)的一个或多个区域的组织中降低，并且其中所述组织与帕金森病相关。
106.如权利要求105所述的方法，其中与帕金森病相关的组织选自：壳核、中脑被盖、黑质、脑桥和髓质。
107.如权利要求99-104中任一项所述的方法，其中SNCA基因表达在中枢神经系统(CNS)的一个或多个区域的组织中降低，并且其中所述组织与多系统萎缩相关。
108.如权利要求107所述的方法，其中与多系统萎缩相关的组织选自：尾状核、壳核、中脑被盖、黑质、脑桥、小脑皮层、小脑白质、髓质、颈脊髓、胸脊髓和腰脊髓。
109.如权利要求99-104中任一项所述的方法，其中SNCA基因表达在中枢神经系统(CNS)的一个或多个区域中降低，所述一个或多个区域选自：颈脊髓、胸脊髓、腰脊髓、额叶皮层、颞叶皮层、小脑、中脑、枕叶皮层、顶叶皮层、海马体、尾状核、丘脑、脑干、运动皮层、苍白球、中脑被盖、黑质、脑桥、小脑白质和小脑齿状核。
110.如权利要求99-109中任一项所述的方法，其中所述RNAi寡核苷酸或药物组合物与第二组合物或治疗剂组合施用。
111.一种权利要求1至97中任一项所述的RNAi寡核苷酸或权利要求98所述的药物组合物的用途，所述用途是用于制造用以治疗与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的药剂。
112.如权利要求1至97中任一项所述的RNAi寡核苷酸或如权利要求98所述的药物组合物，所述RNAi寡核苷酸或药物组合物是用于或适用于治疗与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患。
113.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1至97中任一项所述的RNAi寡核苷酸、任选的药学上可接受的载体和包装插页，所述包装插页包含用于向患有与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患的受试者施用的说明书。
114.如权利要求111所述的用途、如权利要求112所述的供使用或适于使用的RNAi寡核苷酸或药物组合物或如权利要求113所述的试剂盒，其中所述与SNCA基因表达相关的疾病、病症或疾患是多系统萎缩、路易体痴呆和帕金森病。
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