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CN119604314A - 抗gd2抗体、免疫偶联物及其治疗用途 - Google Patents

抗gd2抗体、免疫偶联物及其治疗用途 Download PDF

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CN119604314A
CN119604314A CN202380036218.XA CN202380036218A CN119604314A CN 119604314 A CN119604314 A CN 119604314A CN 202380036218 A CN202380036218 A CN 202380036218A CN 119604314 A CN119604314 A CN 119604314A
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CN
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antibody
antibodies
linker
amino acid
adc
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肖恩·D·麦肯纳
亚历克·格拉斯
马建国
朱莉雅·道特威
尼可拉斯·罗氏
单旻
克里斯蒂安·阿曼德
简·安德列
威廉姆·斯鲁特
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Original Assignee
Merck Patent GmbH
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Abstract

本发明提供了结合人GD2蛋白的抗体，以及分离的核酸和包含编码所述抗体的序列的宿主细胞。本发明还提供了包含与生长抑制剂连接的所述抗体的免疫偶联物，以及包含本发明的抗体或免疫偶联物的药物组合物。本发明还提供了本发明的抗体、免疫偶联物和药物组合物用于治疗癌症或用于诊断目的的用途。

Description

抗GD2抗体、免疫偶联物及其治疗用途
技术领域
本发明涉及结合人GD2(二唾液酸神经节苷脂GD2)的抗体，以及分离的核酸和包含编码所述抗体的序列的宿主细胞。本发明还涉及包含与生长抑制剂连接的所述抗体的免疫偶联物，以及包含本发明的免疫偶联物的药物组合物。本发明还涉及本发明的抗体、免疫偶联物和药物组合物用于治疗癌症和/或用于诊断目的的用途。
发明背景
抗体-药物偶联物(ADC)是将单克隆抗体(mAb)的特异性与细胞毒性分子的效力相结合的一类治疗剂。ADC的使用增强了偶联细胞毒性剂的抗体的癌症杀伤活性，而靶特异性递送减少了因暴露于游离毒性剂而引起的全身毒性。目前，FDA已批准了总共十二种ADC用于治疗人癌症，其中，大多数是在过去2-3年内批准的。最先批准的两种ADC是(贝伦妥单抗维多汀(Brentuximab vedotin)或SGN-35)和(T-DM1)，所述是与细胞毒性剂MMAE偶联的抗CD30抗体，旨在治疗CD30阳性复发性淋巴瘤，而所述是与细胞毒性剂DM1偶联的抗HER2抗体，旨在治疗HER2阳性转移性乳腺癌。在初步批准这些ADC后，又有至少八项批准。
接头技术对ADC的效力、特异性和安全性有重大影响。酶可切割接头利用细胞内外蛋白酶的不同活性来实现对药物释放的控制。药物可以通过多种不同的接头与抗体结合，并且只能通过细胞内存在的溶酶体蛋白酶的作用进行特异性切割，并且在某些肿瘤类型中溶酶体蛋白酶的水平较高(Koblinsk等，2000年)。这将确保接头在血流中的稳定性，以限制对健康组织的损害。然而，一些酶不稳定接头的相关疏水性增加可能导致ADC聚集，特别是对于强疏水性药物。因此，需要能够提供血清稳定性以及增加溶解度的接头，从而允许疏水性药物的有效结合和胞内递送。
文献提供了抗GD2单克隆抗体在治疗神经母细胞瘤和其他肿瘤适应症中的示例。如今，已有三种抗GD2裸抗体药物获批用于人类：在美国的纳西他单抗(naxitamab)和地诺昔单抗(dinutuximab)以及在欧洲的地诺昔单抗β。虽然地诺昔单抗和地诺昔单抗β是分别在名为SP2/0和CHO(中国仓鼠卵巢)细胞的小鼠骨髓瘤细胞系中产生的小鼠-人嵌合抗体(ch14.18)，但纳西他单抗是由CHO细胞产生的人源化抗体(hu3F8)。
所有儿童癌症患者中约12％死于神经母细胞瘤，神经母细胞瘤是儿童期最常见的颅外实体肿瘤。大多数患者被诊断患有高风险神经母细胞瘤，死亡率为50％。高风险神经母细胞瘤治疗包括与严重的短期和长期毒性有关多模态治疗。其复发率高，并且进一步的治疗选择有限。强化常规治疗并未改善结果，甚至与毒性增加相关联。
如上所述，针对神经节苷脂GD2的抗体地诺昔单抗已获得FDA批准用于神经母细胞瘤治疗，神经节苷脂GD2是含碳水化合物的鞘脂抗原，在神经母细胞瘤、神经外胚层来源的癌症类型和神经组织上均有表达。该抗体与细胞因子和分化因子联用改善了患者的预后并表明神经母细胞瘤对免疫疗法敏感(Yu等,2010；New Engl.J.Med,第363卷:第1324-34页；Suzuki和Cheung,2015；Expert Opin Ther Targets第19卷:第349-6页)。与以前的标准化疗相比，地诺昔单抗提高了无事件生存率。尽管如此，单独使用抗GD2抗体观察到的积极临床结果有时与严重的毒性有关。虽然已经记录了许多毒性(例如心动过速、高血压、低血压、发烧和荨麻疹)，但迄今为止最严重的毒性是神经性疼痛。事实上，尽管同时使用强效止痛药(包括阿片类药物)，这种神经性疼痛通常会限制抗GD2抗体的剂量，从而限制其功效。这种神经性疼痛可能通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)介导。
此外，在高风险神经母细胞瘤(12个月或以上)或难治性/复发性神经母细胞瘤患者中引入二唾液酸神经节苷脂(disialoganglioside，GD2)免疫疗法方面取得了进展(Ahmed等,2014，Nazha等,2020)。然而，神经性疼痛是一种常见且关键的剂量限制性不良事件，阻碍了目前上市的GD2抗体(地诺昔单抗、纳西他单抗)对患者的全部治疗潜力。抗GD2抗体与外周躯体感觉和内脏神经表达的GD2结合似乎会介导身体各个部位的剧烈、急性疼痛和/或异常性疼痛，并与患者(Yuki等,1997)和猴(EMA/263814/2017,2017)的外周神经损伤相关联。虽然GD2在周围神经的表达相对较低(Slart等,1997，Lammie等,1993，Yuki等,1997，Vriesendorp等,1997)，但是Ab的Fc部分效应功能，例如也应当杀伤肿瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)将引发体液和细胞介导物对周围神经的免疫攻击，表现为神经病变和急性神经性疼痛(Sorkin 2002,Dobrenkov和Cheung 2014；Mastrangelo等,2020，Nazha等,2020)。
ADC诱导周围神经病变的另一示例是单甲基澳瑞他汀(auristatin)E(MMAE)，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)是有效的抗癌微管靶向剂(MTA)，用作治疗不同类型癌症的三种已获批准的含MMAE的ADC(以及目前处于临床开发中的多种ADC)中的荷载。MMAE-ADC通常会诱发周围神经病变，这是一种常见的不良事件，导致治疗剂量减少或停止，以及后续使许多MMAE-ADC临床终止。
MMAE-ADC诱导的周围神经病变是因为ADC在周围神经中的非特异性摄取以及MMAE的释放，从而破坏微管(MT)并导致神经变性。
因此，需要抗GD2 ADC，其中与非神经毒性细胞毒性有效载荷(部分由于其化学结构和制剂)偶联的抗体(优选降低CDC和ADCC)可以更有选择性地将其细胞毒性荷载递送至恶性细胞，而不会引发毒性，特别是周围神经病变，否则会限制剂量和治疗功效。
发明内容
人源化抗GD2抗体hu14.18结合二唾液酸神经节苷脂GD2，该二唾液酸神经节苷脂GD2存在于肿瘤(包括神经母细胞瘤、黑色素瘤、肉瘤等)的细胞表面以及正常组织，主要局限于人的中枢和周围神经系统。正常组织中的二唾液酸神经节苷脂GD2表达主要限于中枢神经系统、周围感觉神经纤维、真皮黑素细胞、淋巴细胞和间充质干细胞。用抗GD2抗体治疗可诱发周围神经病变和疼痛，这被认为与抗体效应功能有关，例如补体结合(fixation)和补体依赖性细胞毒性(CDC)影响周围神经。之前，hu14.18抗体在名为“hu14.18-IgG1(K322A)”(在美国专利8,835,606B2中描述，本文通过引用纳入)的免疫球蛋白IgG1恒定结构域中通过点突变K322A(KabatEU索引编号)开发。hu14.18抗体中的K322A点突变旨在防止补体级联和CDC效应功能的激活，同时仍保持抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应功能的潜力。此外，hu14.18-IgG1(K322A)经低岩藻糖基化以增强ADCC活性(如美国专利8,835,606B2中所述，所有氨基酸和核酸序列，在此通过引用纳入)。ADCC增强的hu14.18-IgG1(K322A)可能诱导较少的补体结合/CDC介导的疼痛，同时通过ADCC作用机制杀死肿瘤细胞。ADCC增强的hu14.18-IgG1(K322A)处于临床开发(2期)，但尚未获得批准。具有野生型IgG1同种型的嵌合抗GD2抗体(地诺昔单抗)已获批用于治疗一组特定的儿科神经母细胞瘤患者，已知与这种治疗相关的神经性疼痛会发生并且可能需要与止痛药共同给药。
在一些实施方式中，本发明描述了抗GD2 hu14.18抗体作为ADC，其ADCC和CDC抗体效应功能均降低或缺失，从而提供更大的治疗窗口以治疗未满足的医疗需求。设计没有显著ADCC或CDC效应功能的hu14.18抗体可以降低给予抗GD2 hu14.18抗体所致神经性疼痛的风险，而药物与抗体的偶联为这种抗GD2-ADC提供了不同的作用机制以消除肿瘤细胞。缺乏显著ADCC和CDC效应功能的抗GD2hu14.18的组合提供了有效的偶联药物作为ADC，改善了现有治疗并且可能满足患者(迄今为止)未满足的医疗需求。在选定的实施方式中，选定的细胞毒性药物应当不具备神经毒性。
抗体与特定抗原靶标的结合是抗原结合片段(Fab)结构域(包括特定轻链和重链可变区互补决定区(CDR)氨基酸序列)的特性。抗体效应功能以及与Fcγ受体(FcγR)和新生儿Fc受体(FcRn)的结合是免疫球蛋白(Ig)恒定结构域的特性。免疫球蛋白恒定结构域基因各不相同，并且与Fab结构域序列融合的这些恒定结构域基因决定了抗体的同种型(IgM、IgG1、IgG2等)。在天然存在或重组抗体中，相同的抗原结合结构域氨基酸序列可以融合到不同的恒定结构域同种型中表达，以产生具有相同抗原靶标结合特异性但具有不同效应功能特性的抗体。抗体介导免疫系统成分激活的能力被称为抗体的“效应功能”，并且重要的效应功能通过与免疫细胞上的FcγR以及血液和胞外液中的补体蛋白(例如补体成分1q(C1q))结合来介导。取决于同种型，抗体将细胞上的特定抗原靶标与免疫系统连接，并可以诱导免疫功能(例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC))对靶细胞的靶向攻击。Ig恒定域与FcRn的结合在抗体的体内半衰期中起着重要作用，这是因为在抗体被细胞内化后，会增加循环回流。已经有大量研究测试抗体恒定域中特定氨基酸残基对抗体效应功能以及抗体与FcγR和补体蛋白结合的作用。人Ig恒定域氨基酸序列的一些变化能够用于产生抗体与FcγR和补体蛋白结合和抗体效应功能特性改变的重组抗体。在选定的实施方式中，本发明提供结合靶标GD2的ADC蛋白，以将ADC分子递送至细胞，且不具有显著的抗体效应功能。
在本发明的一些实施方式中，描述了与依沙替康(Exatecan)拓扑异构酶-I抑制剂类的小分子毒性荷载偶联的抗GD2 hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK抗体的产生和用途，用于治疗不同的肿瘤适应症，例如肉瘤、神经母细胞瘤和SCLC。该新型ADC与已在临床使用的其他GD2抗体疗法相比提供了优选的治疗窗口。
在本发明的优选实施方式中，Fc部分效应器功能工程改造自ADC，而是使用非神经毒性荷载依沙替康来杀伤肿瘤细胞，导致在重复输注分子1后的大鼠和猴中的PNS损伤和明显的临床疼痛信号消失。
具体实施方式
定义
“GD2”是一种二唾液酸神经节苷脂，其表达于神经外胚层来源的肿瘤，包括人神经母细胞瘤和黑色素瘤，其在正常组织中的表达受到严格限制，主要在人类的中枢和周围神经系统中。GD2由以下化学结构定义：
其对应如下IUPAC名称：
(2R,4R,5S,6S)-2-[3-[(2S,3S,4R,6S)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-5-[(2S,3R,4R,5R,6R)-3-乙酰氨基-4,5-二羟基-6-(羟甲基)噁烷-2-基]氧基-2-[(2R,3S,4R,5R,6R)-4,5-二羟基-2-(羟甲基)-6-[(E)-3-羟基-2-(十八烷酰氨基)十八烷基-4-烯氧基]噁烷-3-基]氧基-3-羟基-6-(羟甲基)噁烷-4-基]氧基-3-氨基-6-羧基-4-羟基噁烷-2-基]-2,3-二羟基丙氧基]-5-氨基-4-羟基-6-(1,2,3-三羟基丙基)噁烷-2-羧酸。
如本文所用，名称“M4344”是指具有以下化学结构的三磷酸腺苷(ATP)竞争性抑制剂：
1.
“结构域”或“区域”可以是蛋白质的任何区域，通常基于序列同源性进行定义，并且通常与特定结构或功能实体相关。已知GD2家族成员由Ig样结构域组成。本文中使用的术语“结构域”表示单个Ig样结构域，例如“N结构域”或连续结构域组，例如“A2-B2结构域”。
“编码序列”或“编码”表达产物(例如多肽、蛋白质或酶)的序列是核苷酸序列，当其表达时，导致产生该多肽、蛋白质或酶，即核苷酸序列编码该多肽、蛋白质或酶的氨基酸序列。蛋白质的编码序列可以包括起始密码子(通常为ATG)和终止密码子。
如本文所用，述及特定蛋白质(例如抗体)可以包括具有天然氨基酸序列的多肽，以及变体和修饰形式，无论其来源或制备方式如何。具有天然氨基酸序列的蛋白质是具有与从自然界获得的相同氨基酸序列的蛋白质。此类天然序列蛋白质可以从自然界中分离，或者可以使用标准重组和/或合成方法制备。具体地，天然序列蛋白质包括天然存在的截短或可溶形式、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)、天然存在的等位变体和包括翻译后修饰的形式。天然序列蛋白质包括携带翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)或一些氨基酸残基的其他修饰的蛋白质。
术语“基因”意指编码或对应于特定氨基酸序列(包括一种或多种蛋白质或酶的全部或部分)的DNA序列，并且可以包括或不包括调节DNA序列，例如启动子序列，其决定了例如基因表达的条件。一些基因不是结构基因，可以从DNA转录为RNA，但不会翻译成氨基酸序列。其他基因可以作为结构基因的调节子或DNA转录的调节子。具体而言，术语基因可以用于编码蛋白质的基因组序列，即包含调节子、启动子、内含子和外显子序列的序列。
在本文中，与参照序列“至少85％相同”的序列是指在其整个长度上与参照序列的整个长度具有85％或更多的序列同一性的序列，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。因此，可以通过使用Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.48:443(1970))通过全局成对比对来比较两个这样序列的整个长度来确定“序列同一性”的百分比，例如使用具有BLOSUM62矩阵和以下参数的Needle(EMBOSS)程序：缺口开启＝10、缺口延伸＝0.5、末端缺口罚分＝禁用、末端缺口开启＝10、末端缺口延伸＝0.5(这些是标准设置)。
“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有类似化学性质(例如电荷、大小或疏水性)侧链的另一个氨基酸残基取代。一般来说，保守氨基酸取代不会实质性地改变蛋白质的功能特性。具有类似化学性质侧链的氨基酸组的示例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和蛋氨酸。保守氨基酸取代组也可以根据氨基酸大小来定义。
例如，“抗体”(也称为“免疫球蛋白”)可以是天然或常规类型的抗体，其中，两个重链通过二硫键相互连接，并且各重链通过二硫键连接轻链。轻链有两种：lambda(λ)和kappa(k)。有五种主要的重链类别(或同种型)，它们决定了抗体分子的功能活性的各个方面：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。各抗体链包含不同的序列域(或区域)。典型的IgG抗体的轻链包括两个区域，可变区(VL)和恒定区(CL)。典型的IgG抗体的重链包括四个区域，即可变区(VH)和恒定区(CH)，后者由三个恒定域(CH1、CH2和CH3)组成。轻链和重链的可变区决定对抗原的结合和特异性。轻链和重链的恒定区可赋予重要的生物学特性，例如抗体链结合、分泌、跨胎盘移动性、补体结合以及与Fc受体(FcR)结合。Fv片段是抗体Fab片段的N端部分，由一条轻链和一条重链的可变部分组成。
抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点主要由来自所谓的高变或互补决定区(CDR)的残基组成。因此，互补决定区(CDR)是指共同定义抗体Fv区结合亲和力和特异性的氨基酸序列。抗体的轻链(L)和重链(H)各有三个CDR，分别指定为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。因此，常规抗体的抗原结合位点包括六个CDR，包括来自重链和轻链可变区各自的CDR组。
“框架区”(FR)是指介于CDR之间的氨基酸序列，即在单一物种不同免疫球蛋白之间相对保守的免疫球蛋白轻链和重链可变区中的部分。免疫球蛋白的轻链和重链各有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。如本文所用，“人框架区”是与天然存在的人抗体的框架区基本相同(约85％或更多，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的框架区。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指针对特定抗原的单一氨基酸序列的抗体分子，不应被理解为需要通过任何特定方法产生该抗体。例如，单克隆抗体可以通过单个B细胞克隆或杂交瘤产生，但也可以是重组的，例如通过涉及遗传或蛋白质工程改造的方法产生。
术语“嵌合抗体”是指工程改造的抗体，其最广泛的意义在于包含来自一个抗体的一个或多个区域和来自一个或多个其他抗体的一个或多个区域。在一个实施方式中，嵌合抗体包含来自非人动物的抗体的VH和VL，以及另一抗体的CH和CL，在一些实施方式中，所述另一抗体是人抗体。作为非人动物，可以使用任何动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔子等。嵌合抗体还可以表示对至少两种不同抗原具有特异性的多特异性抗体。
术语“人源化抗体”是指完全或部分非人类来源的抗体，其已经修饰以替换某些氨基酸，例如在VH和VL的框架区中，从而避免或使在人的免疫反应最小化。人源化抗体的恒定区通常是人CH和CL区。
抗体(例如常规抗体)的“片段”包括完整抗体(例如IgG)的部分，特别是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的示例包括Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、双抗体以及由抗体片段形成的双特异性和多特异性抗体。常规抗体的片段也可以是单域抗体，例如重链抗体或VHH。
术语“Fab”表示分子量约为50,000Da并具有抗原结合活性的抗体片段，其中约一半的重链N末端与整个轻链通过二硫键结合在一起。其通常是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶处理IgG而获得的片段。
术语“F(ab')2”是分子量约为100,000Da且具有抗原结合活性的抗体片段，其略微大于通过铰链区二硫键结合的两个相同的Fab片段。其通常是用蛋白酶胃蛋白酶处理IgG得到的片段。
术语“Fab'”是分子量约为50,000Da且具有抗原结合活性的抗体片段，其通过切割F(ab')2铰链区二硫键而获得。
单链Fv(“scFv”)是共价连接的VH::VL异二聚体，其通常由基因融合体表达，所述基因融合体包括通过肽编码接头连接的VH和VL编码基因。本发明的人scFv片段包括保持在适当构象的CDR，例如通过使用基因重组技术。二价和多价抗体片段可以通过单价scFv的结合自发形成，或者可以通过肽接头偶联单价scFv来产生，例如二价sc(Fv)2。“dsFv”是通过二硫键稳定的VH::VL异二聚体。“(dsFv)2”表示通过肽接头偶联的两个dsFv。
“抗体-药物偶联物”或“ADC”是各自通过接头与一个或多个细胞毒素偶联的抗体。该抗体通常是针对抗原的单克隆抗体。在本发明的某些优选实施例中，将ADC设计为治疗癌症的靶向疗法。与单独的化疗不同，这些优选实施例将单克隆抗体的靶向能力与细胞毒性药物的抗癌能力相结合，并且可以区分健康组织和恶性组织。
如本文所用，“分子1”(本文中也称为“M3554”)是指以下ADC：
其中：抗体与GD2结合，所述抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:4和氨基酸序列SEQID NO:1，所述接头为β-葡萄糖醛酸苷，所述生长抑制剂为依沙替康。
术语“杂交瘤”表示这样的细胞，其通过使用抗原免疫非人类哺乳动物制备的B细胞与源自小鼠等的骨髓瘤细胞进行细胞融合而获得，所述骨髓瘤细胞产生具有抗原特异性的所需单克隆抗体。在一些示例中，名称“M3554”与分子1同义。
当提及多肽(例如抗体)或核苷酸序列时，“纯化”或“分离”意指指定的分子在基本不存在其他相同类型的生物大分子的情况下存在。如本文所用，术语“纯化”是指存在至少75％、85％、95％、96％、97％或98％重量的相同类型的生物大分子。编码特定多肽的“分离”核酸分子是指基本不含不编码目标多肽的其他核酸分子的核酸分子；然而，该分子可能包括不会对组合物的基本特征产生有害影响的一些额外碱基或部分。
如本文所用，术语“对象”表示哺乳动物，例如啮齿动物、猫科动物、犬科动物、灵长类动物或人。在本发明的实施方式中，对象(或患者)是人。
如本文所用，术语“周围神经病变”表示脑和脊髓外的神经(周围神经)的损伤，临床表现为虚弱、麻木和/或疼痛。
如本文所用，“神经性疼痛”是指在皮肤、肌肉和身体其他部位的脊髓和大脑之间传递信息的神经受损或受伤所引起的疼痛，临床表现为患处通常对触摸敏感的灼热感。
产生本发明抗体的方法
本发明的抗体可以通过本领域已知的任何技术来生产，例如但不限于任何化学、生物、遗传或酶技术，单独或组合使用。
知晓所需抗体的氨基酸序列后，本领域技术人员可以使用生产多肽的标准技术容易地生产所述抗体或免疫球蛋白链。例如，可以使用众所周知的固相方法，使用市售可得的肽合成装置(例如由加利福尼亚州福斯特城的Applied Biosystems公司制造的装置)并按照制造商的说明来合成。或者，本发明的抗体和免疫球蛋白链可以通过重组DNA技术生产，这为本领域所众所周知。例如，这些多肽(例如抗体)可以在将编码所需多肽的DNA序列纳入表达载体并将此载体引入将表达所需多肽的合适真核或原核宿主中之后作为DNA表达产物获得，随后可以使用众所周知的技术从中分离它们。
用于产生抗GD2-ADC分子的蛋白质前体的抗体链的氨基酸序列。示出了成熟抗GD2hu14.18轻链和重链氨基酸序列。hu14.18重链的C末端可以G446(Kabat EU索引编号)或K447(Kabat EU索引编号)结束。与野生型人IgG1序列相比恒定域的变化以下划线标出。
hu14.18成熟轻链氨基酸序列：
DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:1)
hu14.18-IgG1-delK成熟重链氨基酸序列：
EVQLVQSGAEVEKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMHLKSLRSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ IDNO:2)
hu14.18-IgG1.4-delK成熟重链氨基酸序列：
EVQLVQSGAEVEKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMHLKSLRSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ IDNO:3)
hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK重链氨基酸序列
EVQLVQSGAEVEKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRATLTVDKSTSTAYMHLKSLRSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ IDNO:4)
提供用于测试抗GD2抗体蛋白前体蛋白的候选表征级联的流程图：
本发明还涉及生产本发明抗体的方法，其包括以下步骤：(i)培养根据本发明的转化的宿主细胞；(ii)表达抗体；和(iii)回收表达的抗体。
可以通过常规免疫球蛋白纯化程序(例如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法)将本发明的抗体适当地从培养基中分离。
在一些实施方式中，本发明的人源化嵌合抗体可以这样制备：获取编码前述人源化VL和VH区的核酸序列；构建人嵌合抗体表达载体，该人嵌合抗体表达载体通过将前述人源化VL和VH区的核酸序列插入到含有编码人抗体CH和人抗体CL的基因的动物细胞表达载体中构建；和通过将该表达载体引入动物细胞中表达该编码序列。
人嵌合抗体的CH结构域可以使用属于人免疫球蛋白重链的任何区域，例如IgG类的区域是合适的，并且可以使用属于IgG类的任意一个亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。同样，人嵌合抗体的CL结构域可以使用属于人免疫球蛋白轻链的任何区域，并且可以使用κ类或λ类的区域。
产生人源化或嵌合抗体的方法可以涉及本领域所熟知的常规重组DNA和基因转染技术(参见例如MorrisonSL.等(1984)和专利文件US5,202,238和US5,204,244)。
基于常规重组DNA和基因转染技术产生人源化抗体的方法为本领域所熟知(参见例如RiechmannL.等1988；NeubergerMS.等1985)。抗体可采用本领域已知的多种技术进行人源化，包括例如申请WO2009/032661中公开的技术，CDR移植(EP239,400；PCT公开号WO91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)，贴面或表面重塑(EP592,106；EP519,596；PadlanEA(1991)；StudnickaGM等(1994)；RoguskaMA等(1994))和链改组(美国专利号5,565,332)。用于制备此类抗体的通用重组DNA技术也是已知的(参见欧洲专利申请EP125023和国际专利申请WO96/02576)。
本发明的Fab可以通过用蛋白酶(例如木瓜蛋白酶)处理本发明的抗体(例如IgG)来获得。此外，可以通过将编码抗体Fab的两条链的DNA序列插入用于原核表达或用于真核表达的载体中，并将该载体引入原核或真核细胞(视情况而定)以表达Fab来产生Fab。
本发明的F(ab')2可以通过用蛋白酶胃蛋白酶处理本发明的抗体(例如IgG)来获得。此外，F(ab')2可以通过硫醚键或二硫键结合下述Fab'来产生。
本发明的Fab'可通过用还原剂(例如二硫苏糖醇)处理本发明的F(ab')2而获得。或者，可通过将编码抗体Fab'链的DNA序列插入原核表达载体或真核表达载体，并将载体导入原核或真核细胞(视情况而定)进行表达来产生Fab'。
本发明的scFv可以这样制备：获取先前描述的本发明抗体的CDR或VH和VL结构域的序列；然后构建编码scFv片段的DNA；将该DNA插入原核或真核表达载体；然后将表达载体引入原核或真核细胞(视情况而定)以表达scFv。为了生成人源化scFv片段，可以使用称为CDR移植的公知技术，其涉及选择根据本发明的互补决定区(CDR)，并将其移植到已知三维结构的人类scFv片段框架上(参见例如WO98/45322；WO87/02671；US5,859,205；US5,585,089；US4,816,567；EP0173494)。
经修饰的抗GD2抗体
考虑了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。
可以对本发明的抗体的结构以及编码它们的DNA序列进行修改和改变，并且仍产生具有所需特性的功能性抗体或多肽。
在改变多肽的氨基酸序列时，可以考虑氨基酸的亲水性指数。本领域通常理解亲水性氨基酸指数对于蛋白质的相互作用生物功能的重要性。据信氨基酸的相对亲水性特性有助于所得蛋白质的二级结构，而二级结构又决定了蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。根据各氨基酸的疏水性和电荷特性为其指定亲水性指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本发明的另一方面还包含本发明多肽的功能保守变体。
例如，可以通过其他氨基酸取代蛋白质结构中的某些氨基酸，而不会明显丧失活性。由于蛋白质的相互作用能力和性质决定了其生物功能活性，因此可以在蛋白质序列中进行某些氨基酸取代，当然也可以在其编码DNA序列中进行某些氨基酸取代，同时仍然获得具有类似特性的蛋白质。因此，设想了可以在本发明的抗体序列或编码所述多肽的相应DNA序列中进行各种改变，而不会明显丧失其生物活性。
本领域已知某些氨基酸可能会被具有相似亲水性指数或评分的其他氨基酸取代，但仍产生具有相似生物活性的蛋白质，即仍获得生物功能等效的蛋白质。还可以使用已建立的技术(例如丙氨酸扫描方法)在本发明的抗体或多肽中识别所有可以被取代而不会显著损失与抗原结合的氨基酸。这类残基可被认为是中性的，因为它们不参与抗原结合或维持抗体的结构。这些中性位置中的一个或多个可被丙氨酸或另一种氨基酸取代，而不会改变本发明的抗体或多肽的主要特征。
可以将中性位置视为可以纳入任何氨基酸取代的位置。事实上，在丙氨酸扫描原理中，选择丙氨酸是因为该残基不具有特定的结构或化学特征。普遍认为如果丙氨酸可以取代特定氨基酸而不改变蛋白质的性质，那么许多其他(如果不是所有)氨基酸取代也可能是中性的。在丙氨酸是野生型氨基酸的相反情况中，如果特定取代可以显示为中性的，则其他替换也可能是中性的。
如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到任何上述特征的示例性取代是本领域技术人员所熟知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
还可能希望在效应功能方面对本发明的抗体进行修饰，例如以增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，或例如改变与Fc受体的结合。这可以通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。或者或此外，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而允许在该区域形成链间二硫键。由此产生的同型二聚体抗体可以具有改进的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和/或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(CaronPC.等，1992；和ShopesB.，1992)。在一些实施方式中，本发明的抗体可以是具有修饰的氨基酸序列的抗体，其导致与大多数Fcγ受体的结合降低或消除，这可以减少表达此类受体的正常细胞和组织(例如巨噬细胞、肝窦细胞等)的吸收和毒性。
本发明的抗体的另一类氨基酸修饰可用于改变抗体的原始糖基化模式，即通过删除抗体中存在的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸的存在会产生潜在的糖基化位点，其中，X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。可以通过改变氨基酸序列以使其包含一个或多个上述三肽序列(用于N连接糖基化位点)来方便地添加或删除抗体的糖基化位点。
另一种类型的修饰涉及去除通过计算机或实验确定的可能导致降解产物或抗体制剂异质性的序列。例如，天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺作用可能取决于诸如pH和表面暴露等因素。天冬酰胺残基特别容易脱酰胺，主要存在于序列Asn-Gly中，而在其他二肽序列如Asn-Ala中程度较小。因此，当此类脱酰胺位点，特别是Asn-Gly存在于抗体或多肽中时，可以考虑去除该位点，通常通过保守置换去除其中一个相关残基。本发明也旨在涵盖序列中的此类置换以去除一个或多个相关残基。
另一类共价修饰涉及将糖苷化学或酶促偶联到抗体上。这些方法的优点在于它们不需要在具有N或O连接糖基化能力的宿主细胞中产生抗体。取决于所用的偶联模式，糖可以连接(a)精氨酸和组氨酸、(b)游离羧基、(c)游离巯基(如半胱氨酸的巯基)、(d)游离羟基(如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基)、(e)芳香族残基(如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香族残基)或(f)谷氨酰胺的酰胺基上。例如，此类方法在WO87/05330中有所描述。
去除抗体上存在的碳水化合物部分可以通过化学或酶促方法完成。化学脱糖需要将抗体暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。这种处理导致除连接糖(N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大多数或所有糖被裂解，同时保持抗体完好。SojahrH.等(1987)和Edge，AS.等(1981)描述了化学去糖基化。酶促裂解抗体上的碳水化合物部分可以通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，如Thotakura，NR.等(1987)所述。
抗体的另一类共价修饰包括连接抗体和多种非蛋白质聚合物中的一种，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，例如以美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192和4,179,337中所述的方式。
本领域已知的其他氨基酸序列修饰也可应用于本发明的抗体。
抗GD2 ADC
本发明提供免疫偶联物，本文中也称为ADC或更简单地称为偶联物。如本文所用，所有这些术语具有相同的含义并且可以互换。本发明的免疫偶联物可以根据本文所述的体外方法制备。
本发明提供了一种ADC，其包含通过接头与至少一种生长抑制剂共价连接的本发明的抗体(例如mAb1，或具有与mAb1类似CDR的抗体)。
术语“生长抑制剂”(也称为“抗增殖剂”)是指在体外和/或体内抑制细胞(例如肿瘤细胞)生长的分子或化合物或组合物。
在一些实施方式中，生长抑制剂是细胞毒性药物(也称为细胞毒性剂)。本发明还考虑使用放射性部分作为细胞毒性药物。
如本文所用，术语“细胞毒性药物”是指直接或间接抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。术语“细胞毒性药物”包括例如化疗剂，酶，抗生素，毒素，例如小分子毒素或酶活性毒素，类毒素，长春花，紫杉烷，美登木素生物碱或美登木素生物碱类似物，茅屋霉素或吡咯并苯并二氮杂卓衍生物，念珠藻素衍生物，轻肌蛋白衍生物，奥瑞他汀或多拉司他汀(dolastatin)类似物，前药，拓扑异构酶I抑制剂，拓扑异构酶II抑制剂，DNA烷化剂，抗微管蛋白剂，CC-1065和CC-1065类似物。
拓扑异构酶I抑制剂是抑制人类酶拓扑异构酶I的分子或化合物，其参与通过催化单链DNA的瞬时断裂和重新连接来改变DNA的拓扑结构。拓扑异构酶I抑制剂对分裂细胞(例如哺乳动物的细胞)具有高毒性。合适的拓扑异构酶I抑制剂的示例包括喜树碱(CPT)及其类似物，例如拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、西拉替康(silatecan)、可丝替康(cositecan)、依沙替康(Exatecan)、勒托替康(lurtotecan)、吉马替康(gimatecan)、贝洛替康(belotecan)和鲁比替康(rubitecan)。
在一些实施方式中，本发明的免疫偶联物包含细胞毒性药物依沙替康作为生长抑制剂。依沙替康具有下述IUPAC化学名称：
(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-1,2,3,9,12,15-六氢-10H,13H-苯并[de]吡喃并[3′,4′:6,7]吲哚并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮。
依沙替康的结构式(I)如下：
依沙替康是喜树碱的修饰衍生物，其中，A环和B环融合了额外的脂环，脂环上带有增溶的伯胺(相当于喜树碱上的7-CH2NH2取代基)。A环上的位置10和11还有亲脂性取代基，可增强膜通透性。
在本发明的进一步实施方式中，可以使用其他CPT类似物和其他细胞毒性药物，例如上文所列的那些。一些细胞毒性药物和偶联方法的示例在申请WO2008/010101中进一步给出，该申请通过引用纳入本文。
术语“放射性部分”是指包含或由适合治疗癌症的放射性同位素组成的化学实体(例如分子、化合物或组合物)，例如At211、Bi212、Er169、I131、I125、Y90、In111、P32、Re186、Re188、Sm153、Sr89或Lu的放射性同位素。此类放射性同位素通常主要发射β-辐射。在一些实施方式中，放射性同位素是α-发射体同位素，例如发射α-辐射的钍227。例如，免疫偶联物可以按照申请WO2004/091668中所述制备。
在本发明的免疫偶联物中，本发明的抗体通过接头共价连接至少一种生长抑制剂。如本文所用，“接头”是指包含共价键和/或任何原子链的化学部分，其将生长抑制剂与抗体共价连接。接头为本领域众所周知，包括例如二硫键、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。本发明的抗体与细胞毒性药物或其他生长抑制剂的偶联可以例如使用多种双功能蛋白质偶联剂进行，包括但不限于N-琥珀酰亚胺基吡啶基二硫代丁酸酯(SPDB)、丁酸4-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫代]-2,5-二氧代-1-吡咯烷基酯(硝基-SPDB)、4-(吡啶-2-基二硫烷基)-2-磺基丁酸(磺基-SPDB)、N-琥珀酰亚胺基(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、酰亚胺酯的双功能衍生物(例如二甲基己二酰亚胺HCL)、活性酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮苯甲酰)-己二胺)、双重氮衍生物(例如双-(对-重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可按照Vitetta等(1987)所述制备。碳标记的1-异硫氰酸苯甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的示例性螯合剂(WO94/11026)。
在本发明的实施方式中，接头可以是“可裂解接头”，其可促进细胞毒性药物或其他生长抑制剂在细胞(例如肿瘤细胞)内或附近的释放。在一些实施方式中，接头是在哺乳动物细胞的核内体中的可切割接头。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、酯酶不稳定接头、光不稳定接头或含二硫化物接头(参见例如美国专利号5,208,020)。
当述及代表免疫偶联物的结构式时，本文也使用以下命名法：生长抑制剂和接头合在一起也称为[(接头)-(生长抑制剂)]部分；例如，依沙替康分子和接头合在一起也称为[(接头)-(依沙替康)]部分。
在本发明的一些具体实施方式中，接头是可被人酶葡萄糖醛酸酶切割的接头。例如，本发明的免疫偶联物因此可具有下式(II)，其包括可被葡萄糖醛酸酶切割的接头：
其中抗体是本发明的抗体，其中，S是抗体的硫原子，并且其中n是与抗体共价连接的[(接头)-(生长抑制剂)]部分的数量。例如，数量n可以是1至10；在更具体的实施方式中，n是7至8；在甚至更具体的实施方式中，n是7.5至8.0(即约8)。在一些实施方式中，S是抗体的半胱氨酸的硫原子。在一些实施方式中，抗体是mAb1。
数字n也称为“药物与抗体比”(或“DAR”)；该数字n始终应理解为任何给定免疫偶联物(制剂)的平均数。
在本发明的其他具体实施方式中，接头是可被人酶豆荚蛋白(Legumain)切割的接头。例如，本发明的免疫偶联物因此可具有下式(III)，其包括可被豆荚蛋白切割的接头：
其中抗体是本发明的抗体，其中，S是抗体的硫原子，并且其中n是与抗体共价连接的[(接头)-(生长抑制剂)]部分的数量。数量n(也称为DAR)可以是例如1至10；在更具体的实施方式中，n是7至8；在甚至更具体的实施方式中，n是7.5至8.0(即约8)。在一些实施方式中，S是抗体的半胱氨酸的硫原子。在一些实施方式中，抗体是mAb1。
在上述式(II)和(III)中，抗体的硫原子与生长抑制剂之间的化学结构为接头。这些接头之一也包含在下文进一步描述的式(IV)至(IX)中。
在上述任何一个具有可以通过葡萄糖醛酸酶或豆荚蛋白切割的接头的实施方式中，生长抑制剂可以是例如依沙替康。
因此，在一些实施方式中，本发明提供了免疫偶联物，其包含通过接头共价连接依沙替康的根据本发明的抗体，其中，所述偶联物具有下式(IV)：
其中S是抗体的硫原子，并且其中n是共价连接到抗体的[(接头)-(依沙替康)]部分的数量。数量n(也称为DAR)可以是例如1至10；在更具体的实施方式中，n是7至8；在甚至更具体的实施方式中，n是7.5至8.0(即约8)。在一些实施方式中，抗体是mAb1。
在其他实施方式中，本发明提供了免疫偶联物，其包含通过接头共价连接依沙替康的根据本发明的抗体，其中，所述偶联物具有下式(V)：
其中S是抗体的硫原子，并且其中n是共价连接到抗体的[(接头)-(依沙替康)]部分的数量。数量n(也称为DAR)可以是例如1至10；在更具体的实施方式中，n是7至8；在甚至更具体的实施方式中，n是7.5至8.0(即约8)。在一些实施方式中，抗体是mAb1。
在一些实施方式中，在本发明的免疫偶联物(例如如上所述具有葡萄糖醛酸酶或豆荚蛋白可切割接头的依沙替康偶联物)中，接头在抗体的半胱氨酸残基的硫原子处与抗体共价连接。例如，抗体的该半胱氨酸残基可以是能够形成链间二硫键(本文中也称为链间二硫桥)的半胱氨酸残基之一。由于IgG1抗体中有四个链间二硫键，总共涉及八个半胱氨酸残基，因此接头在这些半胱氨酸残基的硫原子处连接抗体使得DAR可以高达8，并且在这种情况下，DAR通常在7和8之间，例如在7.5和8.0之间(即约8)，前提是该抗体是IgG1或具有与IgG1相同数量的链间二硫键。
因此，在一些实施方式中，本发明提供了免疫偶联物，其包含通过接头共价连接依沙替康的根据本发明的抗体，其中，偶联物具有下式(VI)：
其中S是抗体半胱氨酸的硫原子，并且其中n是共价连接抗体的[(接头)-(依沙替康)]部分的数量。数量n(也称为DAR)可以是例如1至10；在更具体的实施方式中，n是7至8；在甚至更具体的实施方式中，n是7.5至8.0(即约8)。
在其他实施方式中，本发明提供了免疫偶联物，其包含通过接头共价连接依沙替康的根据本发明的抗体，其中，所述偶联物具有下式(VII)：
其中S是抗体半胱氨酸的硫原子，并且其中n是共价连接抗体的[(接头)-(依沙替康)]部分的数量。数量n(也称为DAR)可以是例如1至10；在更具体的实施方式中，n是7至8；在甚至更具体的实施方式中，n是7.5至8.0(即约8)。
在上述任何免疫偶联物中，可使用本发明的任何抗体(如本文上文和下文所述)。在一些实施方式中，本发明的免疫偶联物包含mAb1作为抗体。
因此，在一些实施方式中，本发明提供了免疫偶联物，其包含通过接头共价连接依沙替康的mAb1，其中，该偶联物具有下式(VIII)：
其中S是抗体mAb1的半胱氨酸的硫原子，并且其中n是共价连接mAb1的[(接头)–(依沙替康)]部分的数量。数量n(也称为DAR)可以是例如1至10；在更具体的实施方式中，n是7至8；在甚至更具体的实施方式中，n是7.5至8.0(即约8)。在一些实施方式中，S是能够形成链间二硫桥的mAb1的半胱氨酸的硫原子，并且DAR约为8。此类免疫偶联物(即“ADC1”)的实例在实施例中进一步描述。
在其他实施方式中，本发明提供了免疫偶联物，其包含通过接头共价连接依沙替康的mAb1，其中，该偶联物具有下式(IX)：
其中S是抗体mAb1的半胱氨酸的硫原子，并且其中n是共价连接mAb1的[(接头)–(依沙替康)]部分的数量。数量n(也称为DAR)可以是例如1至10；在更具体的实施方式中，n是7至8；在甚至更具体的实施方式中，n是7.5至8.0(即约8)。在一些实施方式中，S是能够形成链间二硫桥的mAb1的半胱氨酸的硫原子，并且DAR约为8。连接抗huLRRC15 ADC的抗原结合部分的细胞毒性和/或细胞抑制剂的数量可以变化(称为“药物与抗体比”或“DAR”)，并且仅受抗原结合部分上可用的连接位点的数量以及与单个接头连接的药剂数量的限制。只要抗GD2ADC在使用和/或储存条件下不表现出不可接受的聚集水平，就可以考虑使用DAR为20甚至更高的抗GD2 ADC。
在本发明的其他实施方式中，接头可以是“不可切割接头”(例如SMCC接头)。生长抑制剂从抗体中释放出来可以在抗体的溶酶体降解时发生。
在本发明的其他实施方式中，免疫偶联物可以是包含本发明的抗体和细胞毒性或生长抑制多肽(作为生长抑制剂)的融合蛋白；此类融合蛋白可以通过重组技术或肽合成制备，即本领域众所周知的方法。编码DNA的分子可以包含编码偶联物的两个部分(分别为抗体和细胞毒性或生长抑制多肽)的各自区域，这些区域彼此相邻或由编码接头肽的区域隔开。
在本发明的一些实施方式中，在保持足够的ADCC活性以攻击肿瘤细胞的同时，通过hu14.18Ab中的Fc点突变(K322A)避免CDC来减轻疼痛，这由来自大鼠异常性疼痛模型的实验数据支持，表明机械异常性疼痛得到部分缓解(Slart等，1997，Sorkin等，2010)。
为此，设计了ADC(分子1)，其通过将人源化ch14.18衍生抗体与强效DNA拓扑异构酶I抑制剂的依沙替康偶联，以在ADC内化和溶酶体中荷载的细胞内酶促释放后诱导肿瘤细胞凋亡。此外，从Ab的Fc部分设计出ADCC和CDC活性，以减轻这些机制造成的神经损伤。与微管抑制剂(Stagg等，2016)不同，拓扑异构酶I抑制剂本身(Verschraegen等，2000,Rowinsky2005)或作为ADC的部分(Ogitani等，2016)不会诱发周围神经病变，因此，实现了荷载对相对高GD2表达的肿瘤的细胞杀伤，同时保护低GD2表达的周围神经系统(PNS)，从而减轻疼痛效应。
本发明的抗体还可用于定向酶前药疗法，例如通过将抗体与前药活化酶偶联的抗体定向酶前药疗法，其将前药(例如肽基化疗剂，参见WO81/01145)转化为活性细胞毒性药物(参见例如WO88/07378和美国专利号4,975,278)。可用于ADEPT的免疫偶联物的酶组分可以包括能够作用于前药以将其转化为更活性的细胞毒性形式的任何酶。在此情况下有用的酶包括但不限于碱性磷酸酶，其可用于将含磷酸盐的前药转化为游离药物；芳基硫酸酯酶，其可用于将含硫酸盐的前药转化为游离药物；胞嘧啶脱氨酶，其可用于将无毒的氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，例如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L)，其可用于将含肽的前体药物转化为游离药物；D-丙氨酰羧肽酶，其可用于将含有D-氨基酸取代基的前体药物转化为游离药物；碳水化合物裂解酶，例如O-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，其可用于将糖基化的前体药物转化为游离药物；P-内酰胺酶，其可用于将用P-内酰胺衍生的药物转化为游离药物；以及青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，其可用于将分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基在其胺氮上衍生的药物转化为游离药物。这些酶可以通过本领域众所周知的技术共价结合本发明的抗体，例如使用上述接头。
制备本发明免疫偶联物的合适方法是本领域众所周知的(参见例如HermansonG.T.,《生物偶联物技术》(Bioconjugate Techniques),第三版,2013,Academic Press)。例如，通过共价连接抗体链间二硫桥的半胱氨酸残基的接头来偶联细胞毒性药物与抗体的方法是众所周知的。
通常，本发明的免疫偶联物可例如通过包括以下步骤的方法获得：
(i)制备包含接头和生长抑制剂(例如细胞毒性药物)的化合物，本文也称为“药物-接头化合物”；
(ii)将本发明抗体的任选缓冲的水溶液与药物-接头化合物的溶液接触；
(iii)然后任选地，将在(ii)中形成的偶联物与未反应的抗体和/或药物-接头化合物分离。
抗体的水溶液可用缓冲液缓冲，例如组氨酸、磷酸钾、醋酸盐、柠檬酸盐或N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(Hepes缓冲液)。可根据抗体的性质选择缓冲液。例如，药物-接头化合物可溶解在有机极性溶剂中，例如二甲基亚砜(DMSO)或二甲基乙酰胺(DMA)。
为了与抗体的半胱氨酸残基偶联，在步骤(ii)之前对抗体进行还原(例如使用TCEP)。本领域已知仅还原链间二硫键的合适还原条件。
偶联反应温度通常在20至40℃之间。反应时间可以变化，通常为1至24小时。抗体和药物-接头化合物之间的反应可以通过具有的折射计和/或UV检测器的尺寸排阻色谱法(SEC)监测。如果偶联物产量太低，可以延长反应时间。
本领域技术人员可以使用多种不同的色谱法进行步骤(iii)的分离：纯化偶联物可以通过例如，SEC，吸附色谱法(例如离子交换色谱法，IEC)，疏水相互作用色谱法(HIC)，亲和色谱法，混合载体色谱法，例如羟基磷灰石色谱法，或高效液相色谱法(HPLC)，例如反相HPLC。也可以使用透析或过滤或渗滤纯化。
在步骤(ii)和/或(iii)之后，可对含有偶联物的溶液进行额外的步骤(iv)纯化，例如通过色谱法、超滤和/或渗滤。在偶联之前进行还原的情况下，这种额外的纯化步骤(例如通过色谱法、超滤和/或渗滤)也可在还原反应之后对含有抗体的溶液进行。
在该过程结束时，在水溶液中回收偶联物。药物与抗体比(DAR)是一个数字，该数字可以随所用抗体和药物-接头化合物的性质以及用于偶联的实验条件(例如比例(药物-接头化合物)/(抗体)、反应时间、溶剂和共溶剂(如果有)的性质)而变化。因此，抗体和药物-接头化合物之间的接触可以产生包含几种偶联物的混合物，这些偶联物彼此之间因药物与抗体比不同而不同。因此，确定的DAR是平均值。
使用具有四个链间二硫桥的抗体(例如，mAb1或任何IgG1抗体)在链间二硫桥的半胱氨酸残基处进行偶联(这是本领域中众所周知的方法)的优点在于，通过选择允许偶联进行至完成(或至少接近完成)的反应条件，可以实现约8的相对均匀的DAR。
可用于确定DAR的示例性方法由用分光光度法测量纯化偶联物溶液在λD和280nm处的吸光度比组成。280nm是通常用于测量蛋白质浓度(例如抗体浓度)的波长。选择波长λD以便能够区分药物和抗体，即如本领域技术人员所知，λD是药物具有高吸光度的波长，并且λD足够远离280nm以避免药物和抗体的吸光度峰出现实质性重叠。例如，对于依沙替康(或对于喜树碱或其他喜树碱类似物)，λD可以选择为370nm，或者对于美登木素生物碱分子，λD可以选择为252nm。
DAR计算的方法可以例如从Antony S.Dimitrov(编著),LLC,2009,
《治疗性抗体和方案》(Therapeutic Antibodies and Protocols),第525卷,445,Springer Science获得：偶联物在λD(AλD)和280nm(A280)处的吸光度可在尺寸排阻色谱(SEC)分析的单体峰上测量(能够计算“DAR(SEC)”参数)或使用经典分光光度计装置(能够计算“DAR(UV)”参数)。吸光度可表示如下：
AλD＝(CD XεDλD)+(CA XεAλD)
A280＝(CD XεD280)+(CA XεA280)
其中：
CD和CA分别是溶液中药物和抗体的浓度
εDλD和εD280分别为药物在λD和280nm处的摩尔消光系数
εAλD和εA280分别是抗体在λD和280nm处的摩尔消光系数。
求解这两个具有两个未知数的方程可得到以下方程：
CD＝[(εA280 X AλD)-(εAλD X A280)]/[(εDλD XεA280)-(εAλD XεD280)]
CA ＝[A280-(CD XεD280)]/εA280
然后根据药物浓度与抗体浓度的比例计算出平均DAR：DAR＝CD/CA。
实施例中描述了制备本发明的免疫偶联物的示例性方法。
药物-接头化合物
本发明还提供包含接头和生长抑制剂(例如细胞毒性药物)的化合物，本文也称为“药物-接头化合物”。例如，本发明提供下式(X)的化合物或其生理上可接受的盐：
该化合物在本文中也称为“药物-接头化合物1”、“化合物DL1”或“DL1”。
本发明还涉及如下的式(XI)化合物或其生理学上可接受的盐：
这种化合物在本文中也称为“药物-接头化合物2”、“化合物DL2”或“DL2”。
这些药物-接头化合物可用于制备如上文和下文所述的本发明的免疫偶联物。
本发明的药物-接头化合物(例如上述式(X)或(XI)的药物-接头化合物)可以通过化学合成来制备，例如下文实施例中所述。
药物组合物
本发明的抗体或免疫偶联物可以与药学上可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂组合以形成药物组合物，并且任选地与缓释基质组合，包括但不限于可生物降解的聚合物、不可生物降解的聚合物、脂质或糖类。
因此，本发明的另一个方面涉及包含本发明的抗体或免疫偶联物以及药学上可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。
“药学”或“药学上可接受的”是指在适当情况下施用于哺乳动物(尤其是人)时不会产生不良、过敏或其他不希望的反应的分子实体和组合物。药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。
如本文所用，“药学上可接受的运载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂等。合适的运载体、稀释剂和/或赋形剂的示例包括但不限于下述的中的一种或多种：水，氨基酸，盐水，磷酸盐缓冲盐水，缓冲磷酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸盐，氨基酸和衍生物，例如组氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、甘氨酰甘氨酸；无机盐，例如NaCl或氯化钙；糖或多元醇，例如葡萄糖、甘油、乙醇、蔗糖、海藻糖、甘露醇；表面活性剂，例如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆188等等，以及它们的组合。在许多情况下，在药物组合物中包含等渗剂(例如糖、多元醇或氯化钠)将是有用的，并且制剂还可以含有抗氧化剂(例如色胺)和/或稳定剂(例如吐温20)。
药物组合物的形式、给药途径、剂量和方案自然取决于所治疗的病症、疾病的严重程度、患者的年龄、体重和性别等。
本发明的药物组合物可配制用于局部、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下或眼内给药等。
在实施方式中，药物组合物含有对于注射用制剂药学上可接受的载剂。这些载剂可以是等渗、无菌、盐水溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的、尤其是冻干的组合物，根据情况，添加无菌水或生理盐水后，可以制成可注射溶液。
药物组合物可以通过药物组合装置给药。
给药所用的剂量可以根据各种参数进行调整，例如根据所用的给药方式、相关病理或者所需的治疗持续时间进行调整。
为了制备药物组合物，可以将有效量的本发明的抗体或免疫偶联物溶解或分散在药学上可接受的运载体或水性介质中。
适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末；在所有这些情况中，形式必须是无菌的并且可使用适当的装置或系统注射以进行递送而不会降解，并且其必须在制造和储存条件下保持稳定，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。
活性化合物作为游离碱或药理学上可接受的盐的溶液可在水中与表面活性剂适当混合制备。分散体还可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂以防止微生物的生长。
本发明的抗体或免疫偶联物可以中性或盐形式配制成药物组合物。药学上可接受的盐包括与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸或甘醇酸等)形成的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)。由游离羧基基团形成的盐还可以衍生自无机碱，例如，钠，钾，铵，钙或铁氢氧化物；和有机碱，例如异丙胺、三甲胺、甘氨酸、组氨酸、普鲁卡因等。
运载体也可以是溶剂或分散介质，含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适混合物，以及植物油。可以通过例如使用涂层(例如卵磷脂)、在分散的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在某些情况下，可能需要包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射组合物的吸收。
可通过将所需量的活性化合物与上述列举的任何其他成分(根据需要)纳入适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，可通过将各种灭菌活性成分纳入无菌载剂中来制备分散体，所述无菌载剂包含碱性分散介质和来自上述列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其可从经先前无菌过滤的溶液中产生活性成分粉末以及任何其他所需成分。
还考虑制备更浓缩或高度浓缩的溶液用于直接注射，其中，设想使用DMSO作为溶剂导致极其快速的渗透，将高浓度的活性剂递送至小的肿瘤区域。
配制后，溶液可以与剂量配方相容的方式施用，以及以治疗有效的量施用。制剂可以各种剂型容易地施用，例如上述注射溶液类型，但也可以采用药物释放胶囊等。
例如，对于在水溶液中进行肠外给药，如果需要，可以对溶液进行适当缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些水溶液特别适合静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给药。在这方面，本领域技术人员根据本公开内容将了解可以使用的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，然后将其添加到1000ml皮下注射液中或注射到预定的输液部位(参见例如《雷明顿制药科学》("Remington's PharmaceuticalSciences")第15版，第1035-1038和1570-1580页)。根据所治疗对象的状况，剂量必然会发生一些变化。无论如何，负责给药的人将确定适合个体对象的剂量。
本发明的抗体或免疫偶联物可以配制在治疗混合物中，以包含例如每剂量约0.01至100毫克左右。
除了配制用于肠胃外给药(例如静脉内或肌肉内注射)的抗体或免疫偶联物之外，其他药学上可接受的形式包括例如用于口服给药的片剂或其他固体、缓释胶囊和任何其他当前使用的形式。
在一些实施方式中，考虑使用脂质体和/或纳米颗粒将多肽引入宿主细胞。脂质体和/或纳米颗粒的形成和使用为本领域技术人员已知。
纳米胶囊通常可以稳定且可重复的方式包封化合物。为了避免由于细胞内聚合物超载而引起的副作用，这种超细颗粒(尺寸约为0.1μm)通常使用能够在体内降解的聚合物来设计。生物可降解聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒或满足这些要求的生物可降解聚乳酸或聚乳酸共乙醇酸纳米颗粒可用于本发明，并且本领域技术人员可以容易地制造此类颗粒。
脂质体可由分散在水性介质中的磷脂形成，并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))。MLV的直径通常为25nm至4μm。MLV的超声处理导致形成直径在200至500A范围内的小单层囊泡(SUV)，其核心中含有水溶液。脂质体的物理特性取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。
除了上述示例之外，还考虑了其他药物形式，例如纳米颗粒、微粒和胶囊、植入物(例如脂质植入物)或自固化或乳化系统。
治疗方法和用途
发明人发现，本发明的抗体(例如mAb1)在结合后能够作为GD2-抗体复合物的部分内化。此外，证明与细胞毒性药物(在优选实施方式中为依沙替康)偶联的此类抗体的靶介导摄取与相应的对照ADC或靶阴性细胞相比，在表达GD2的肿瘤细胞中转化为体外细胞毒性效力增加。发明人还证明，当以0.25mg/kg至10mg/kg的剂量范围以单次注射或多次注射使用时，本发明的这些免疫偶联物在体内诱导显著的抗肿瘤活性。事实上，本发明的免疫偶联物在来自不同肿瘤类型的大量体外和体内模型中表现出广泛的活性。此外，本发明的免疫偶联物在非人灵长类动物剂量范围探索研究中耐受性良好。这些临床前数据为以后的临床测试提供了良好的治疗窗口。因此，本发明的抗体、免疫偶联物和药物组合物可用于治疗表达GD2的癌症。
因此，本发明提供了本发明的抗体、免疫偶联物或药物组合物用于作为药物使用。例如，本发明提供了本发明的抗体、免疫偶联物或药物组合物用于治疗癌症。本发明还提供了治疗癌症的方法，包括向有需要的对象给予本发明的抗体、免疫偶联物或药物组合物。
待用本发明的抗体、免疫偶联物或药物组合物治疗的癌症优选是表达GD2的癌症，更优选是与相同组织来源的正常(即非肿瘤)细胞相比过表达GD2的癌症。例如，细胞的GD2表达可以通过使用本发明的抗体(或市售的抗GD2抗体)容易地测定，例如如下文“诊断用途”部分所述，以及例如通过免疫组织化学方法。
GD2通过增强细胞增殖、运动、迁移、粘附和侵袭(取决于肿瘤类型)与肿瘤发展和恶性表型相关联。这为在针对用于任何过度表达GD2的肿瘤类型的癌症治疗中靶向二唾液酸神经节苷脂GD2提供了理论基础。虽然本发明不旨在局限于任何特定的作用机制，但已知抗GD2单克隆抗体靶向表达GD2的肿瘤细胞，导致通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的吞噬和破坏，通过补体依赖性细胞毒性的裂解，和通过直接诱导细胞死亡的凋亡和坏死。此外，抗GD2单克隆抗体还可以防止循环恶性细胞归巢和粘附到胞外基质。
在一些实施方式中，用本发明的抗体、免疫偶联物或药物组合物治疗的癌症是神经母细胞瘤、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、骨肉瘤和软组织肉瘤。在选定的实施方式中，用本发明的抗体、免疫偶联物或药物组合物治疗的癌症是神经母细胞瘤和骨肉瘤。
本发明的抗体或免疫偶联物可以单独用于癌症治疗或者与任何合适的生长抑制剂联用。
如上所述，本发明的抗体可与生长抑制剂偶联(连接)。因此，本发明的抗体可用于将所述生长抑制剂靶向在其表面表达或过表达GD2的癌细胞。
同样众所周知的是，治疗性单克隆抗体可能导致携带该抗体特异性识别的抗原的细胞耗竭。这种耗竭可通过至少三种机制介导：抗体介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性裂解和通过抗体靶向的抗原介导的信号直接抑制肿瘤生长。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指这样的细胞毒性形式，其中，抗体与某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合，使这些细胞毒性效应细胞能够特异性地与携带抗原的靶细胞结合并随后杀死靶细胞。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的测定。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指补体存在下的靶细胞裂解。经典补体途径的激活通过补体系统的第一组分与结合其同源抗原的抗体结合而引发。为了评估补体激活，可以进行CDC测定，例如Gazzano-Santoro等(Journal of Immunological Methods.1997年3月；202(2):163-171)所述。
在一些实施方式中，本发明的抗体可以是具有修饰的氨基酸序列的抗体，其导致与大多数Fcγ受体的结合降低或消除，这可以减少表达此类受体的正常细胞和组织(例如巨噬细胞、肝窦细胞等)的吸收和毒性。
本发明的一个方面涉及治疗癌症的方法，包括向有需要的对象给予治疗有效量的本发明的抗体、免疫偶联物或药物组合物。
在本发明上下文中，本文所用的术语“治疗”或“处理”意指逆转、减轻、抑制该术语所适用的疾病或病症，或该疾病或病症的一种或多种症状的进展，或对其预防。本文所用的术语“治疗癌症”意指抑制肿瘤恶性细胞的生长和/或所述肿瘤转移的进展。这种治疗还可导致肿瘤生长的消退，即可测量肿瘤的大小减小。例如，这种治疗可导致肿瘤或转移的完全消退。
在本发明的治疗性应用的背景下，术语“对象”或“患者”或“有需要的对象”或“有需要的患者”是指受肿瘤影响或可能受肿瘤影响的对象(例如人或非人哺乳动物)。例如，所述患者可以是已确定对靶向GD2的治疗剂，特别是根据本发明的抗体或免疫偶联物易感的患者，例如根据如下文所述的方法。
述及“治疗有效量”意指足以以适用于任何医学治疗的合理效益/风险比治疗所述癌症疾病的量。然而，应理解，本发明的抗体、免疫偶联物和药物组合物(统称为“治疗剂”)的总日用量将由主治医生在合理的医学判断范围内决定。针对任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的疾病和疾病的严重程度；所采用的特定治疗剂的活性；患者的年龄、体重、常规健康状况、性别和饮食；所采用的特定治疗剂的给药时间、给药途径和排泄速率；治疗持续时间；与所采用的特定治疗剂联合使用或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素。例如，本领域技术人员熟知，化合物的起始剂量应低于达到所需治疗效果所需的剂量，然后逐渐增加剂量直至达到所需效果。
本发明的抗体、免疫偶联物或药物组合物还可用于抑制癌症转移的进展。
本发明的抗体、免疫偶联物或药物组合物还可与用于治疗癌症(例如辅助疗法)和/或用于减少转移性癌症生长的任何其他治疗干预措施组合使用。例如，用于这种组合的其他治疗干预措施可以是用于待治疗癌症的标准护理(SOC)治疗剂。
可以容易地在体内测定用本发明的抗体或免疫偶联物或药物组合物治疗的功效，例如在小鼠癌症模型中，通过测量例如治疗组和对照组之间肿瘤体积的变化、肿瘤消退％、部分消退或完全消退来测定。
诊断用途
据报道，GD2在癌细胞表面高度表达，例如神经母细胞瘤、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤或表达GD2的其他实体肿瘤。
因此，可将GD2视为癌症标志物，并有可能用于指示抗癌治疗的有效性或检测疾病的复发。
在一个实施方式中，本发明的抗体可用作靶向表达GD2的肿瘤的治疗中的测定的组分，以便确定患者对治疗剂的敏感性、监测抗癌治疗的有效性或检测治疗后疾病的复发。在一些实施方式中，本发明的相同抗体可用作治疗剂的组分和诊断测定的组分。
因此，本发明的另一方面涉及本发明的抗体在检测对象生物样品中的离体GD2表达中的用途。本发明的另一方面涉及本发明的抗体在检测对象体内GD2表达中的用途。当用于检测GD2时，可以用可检测分子(例如荧光团或酶)标记抗体。
检测GD2可能旨在通过检测肿瘤细胞上表面GD2的表达：
a)诊断对象中是否存在癌症，或
b)确定癌症患者对靶向GD2的治疗剂(特别是本发明的抗体或免疫偶联物)的敏感性，或
c)监测抗GD2癌症疗法的有效性或检测抗GD2癌症疗法后的癌症复发，特别是其中所述疗法是利用本发明的抗体或免疫偶联物进行的疗法。
在一些实施方式中，本发明的抗体旨在用于体外或离体诊断用途。例如，可以使用本发明的抗体在从对象获得的生物样品中体外或离体检测GD2。根据本发明的用途也可以是体内用途。例如，可以将本发明的抗体给予于对象并且可以检测和/或量化抗体-细胞复合物，由此所述复合物的检测指示癌症。
本发明还涉及检测对象中癌症存在的体外或离体方法，其包括以下步骤：
(a)将来自对象的生物样品与本发明的抗体接触，特别是在适合于抗体与所述生物样品形成复合物的条件下；
(b)测量与所述生物样品结合的抗体水平；和
(c)通过将测量的结合抗体水平与对照进行比较来检测癌症的存在，与对照相比结合抗体水平增加表明存在癌症。
本发明还涉及确定癌症患者对靶向GD2的治疗剂，特别是本发明的抗体或免疫偶联物的敏感性的体外或离体方法，该方法包括以下步骤：
(a)将来自癌症患者的生物样品与本发明的抗体接触，特别是在适合抗体与所述生物样品形成复合物的条件下；
(b)测量与所述生物样品结合的抗体水平；和
(c)将测量的所述生物样品的结合抗体的水平与对照的结合抗体的水平进行比较；
其中所述生物样品的结合抗体水平与对照相比增加表明患者对靶向GD2的治疗剂敏感。
在上述方法中，所述对照可以是相同类型的正常、非癌性生物样品，或者是确定为代表相同类型的正常生物样品中的抗体结合水平的参考值。
在实施方式中，本发明的抗体可用于诊断表达GD2的癌症，例如结直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、食道癌、前列腺癌或表达GD2的其他实体肿瘤。
本发明还涉及监测抗GD2癌症治疗效果的体外或离体方法，其包括以下步骤：
(a)将接受抗GD2癌症治疗的对象的生物样品与本发明的抗体接触，特别是在适合抗体与所述生物样品形成复合物的条件下；
(b)测量与所述生物样品结合的抗体水平；和
(c)将测量的结合抗体的水平与结合对照的抗体的水平进行比较；
其中，所述生物样品的结合抗体水平与对照相比降低表明所述抗GD2癌症疗法的有效性。在所述方法中，所述生物样品的结合抗体水平与对照相比升高表明所述抗GD2癌症疗法无效。在监测有效性的该方法的实施方式中，所述对照是与提交分析的生物样品类型相同的生物样品，但是其获自在抗GD2癌症疗法过程中的较早时间点的对象。
本发明还涉及检测抗GD2癌症治疗后癌症复发的体外或离体方法，其包括以下步骤：
(a)将来自对象的生物样品与根据本发明的抗体接触，所述对象已经完成抗GD2癌症治疗，特别是在适合于抗体与所述生物样品形成复合物的条件下；
(b)测量与所述生物样品结合的抗体水平；和
(c)将测量的结合抗体的水平与结合对照的抗体的水平进行比较；
其中，所述生物样品的结合抗体水平与对照相比增加表明抗GD2癌症治疗后癌症复发。具体地，所述对照可以是与提交分析的生物样品相同类型的生物样品，但该生物样品获自之前的对象，即在抗GD2癌症治疗完成时或之后。
所述抗GD2癌症疗法是使用根据本发明的抗体或免疫偶联物的疗法。所述抗GD2癌症疗法靶向表达GD2的癌症，例如神经母细胞瘤、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、骨肉瘤和软组织肉瘤或表达GD2的其他实体肿瘤。
在一些实施方式中，本发明的抗体可以用可检测分子或物质标记，例如荧光分子或荧光团、放射性分子、酶或本领域已知的提供(直接或间接)信号的任何其他标记。
如本文所用，对于本发明的抗体，术语“标记”旨在涵盖通过将可检测物质(例如放射性剂或荧光团(例如异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)或吲哚菁(Cy5)))与多肽偶联(即物理连接)而对抗体进行直接标记，以及通过与可检测物质反应而对多肽进行间接标记。
本发明的抗体可通过本领域已知的任何方法用放射性分子标记。例如，放射性分子包括但不限于用于闪烁显像研究的放射性原子，例如I123、I124、In111、Re186、Re188、Tc99。本发明的抗体还可用针对核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标签标记，例如碘-123、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
“生物样品”涵盖获自对象的可用于诊断或监测测定的各种样品类型。生物样品包括但不限于血液和生物来源的其他液体样品、固体组织样品(例如活检标本或组织培养物或由其衍生的细胞)及其后代。因此，生物样品涵盖临床样品、培养细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品(例如肿瘤样品)。
在一些实施方式中，生物样品可以是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)或冷冻组织样品。
本发明还涉及检测对象中癌症存在的体内方法，其包括以下步骤：
a)给予患者本发明的抗体，其中，该抗体经可检测分子标记；
b)通过成像检测患者体内所述抗体的定位，例如通过检测可检测分子。
在所述方法中，癌症可以是表达GD2的癌症，例如神经母细胞瘤、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、尤文氏肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、骨肉瘤和软组织肉瘤或表达GD2的其他实体肿瘤。
本发明的抗体也可用于癌症分期(例如，在放射成像中)。它们可以单独使用或与其他癌症标志物组合使用。
如本文所用，术语“检测(的)”或“测定(的)”包括参考或不参考对照的定性和/或定量检测(即测量水平)。
在本发明的上下文中，本文所用的术语“诊断”意指基于大量收集的数据来确定医学状况的性质，旨在识别影响对象的病理。
试剂盒
最后，本发明还提供了包含至少一种本发明的抗体或免疫偶联物的试剂盒。含有本发明抗体的试剂盒可用于检测表面蛋白GD2，或用于治疗或诊断测定。本发明的试剂盒可含有与固体支持物(例如组织培养板或珠(例如琼脂糖珠))偶联的抗体。可提供含有用于体外检测和定量表面蛋白GD2(例如在ELISA或Western印迹中)的抗体的试剂盒。可用于检测的此类抗体可带有标记，例如荧光标记或放射性标记。
序列简要说明
氨基酸序列：
hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK抗体的一级结构：
重链序列(SEQ ID NO:4)：
轻链序列(SEQ ID NO:1)：
抗GD2 ADC的优选实施方式
在优选实施方式中，本发明描述了新型ADC药物，其根据以下概要进行了充分优化：
选择具有合适亲和力、良好细胞结合能力和高效内化的抗体，确保抗体与癌细胞结合后有足够的荷载分布。所选的抗体hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK基于已知的地诺昔单抗(ch14.18)的CDR序列，但通过人源化经进一步优化以降低患者的免疫原性风险。
抗体部分含有HC K322A突变，可消除补体激活。如人源化抗GD2单克隆抗体(hu14.18K322A)与其他药物(包括化疗)联合使用的试验性试验所证实，该突变可减轻疼痛副作用。
抗体部分经过序列修饰(IgG1.4形式)，几乎消除了与大多数Fcγ受体的结合。非人灵长类动物的临床前耐受性研究(详见下文)表明，这种修饰与K322A突变一起几乎完全减轻了疼痛效应和神经组织损伤。因此，作为一种预期性治疗方法，ADC中的这种IgG1.4修饰可以减少表达Fcγ受体的其他正常细胞和组织(例如巨噬细胞和肝窦细胞)中的吸收和相关毒性。
在优选实施方式中，抗体部分与高效拓扑异构酶-I抑制剂依沙替康偶联，以相比裸露的抗GD2抗体疗法改善抗肿瘤活性。与其他ADC荷载(例如微管蛋白毒素(例如，澳瑞他汀和美登素))相比，这种优选的ADC具有较低的相关神经毒性风险。当ADC靶标呈现在外周神经表面上时，这尤其有利。
(5)连接药物和抗体的接头设计成使非肠道应用后的系统稳定性最大化。此外，基于葡萄糖醛酸连接系统的荷载-接头部分确保了良好的可偶联性、有利的PK特性以及在靶标阴性细胞和组织中较少的非特异性摄取。
(6)本发明所用的ADC的依沙替康荷载显示出与DNA损伤和反应抑制剂(例如ATR/ATM抑制剂)以及免疫检查点抑制剂的组合效应，这可能会在后期的临床研究中为患者带来额外的益处。
实施例
实施例1A：具有基于葡萄糖醛酸的接头的药物-接头化合物的合成：药物-接头化合物1(DL1)
化合物9(本文也称为药物-接头化合物1(DL1))的合成路线。
化学制备的方案
步骤1：化合物1
向(2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-三乙酰氧基-6-溴-四氢-吡喃-2-羧酸甲酯(8.30g；20.90mmol；1.00当量)和4-羟基-3-硝基-苯甲醛(5.24g；31.35mmol；1.50当量)的乙腈(83.00ml；10.00V)搅拌溶液中添加氧化银(I)(9.69g；41.80mmol；2.00当量)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。通过硅藻土过滤反应混合物。真空下浓缩滤液以得到固体。将固体溶解于EtOAc中，并用10％ NaHCO3水溶液洗涤，以除去过量的4-羟基-3-硝基苯甲醛。真空浓缩有机层以得到沙色固体的化合物1。
产量：9.0g
产率：89.1％
分析数据：
NMR:1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):9.98(s,1H),8.46(s,1H),8.25-8.21(m,1H),7.64(d,J＝11.60Hz,1H),5.94(d,J＝10.00Hz,1H),5.51-5.44(m,1H),5.20-5.09(m,2H),4.80(d,J＝13.20Hz,1H),3.64(s,3H),2.09(s,9H)。
步骤2：化合物2
向化合物1(9.00g；18.62mmol；1.00当量)的丙-2-醇(33.00ml；3.67V)和CHCl3(167.00ml；18.56V)搅拌溶液中添加硅胶60-120(3.60g；112.09mmol；6.02当量)，随后添加硼氢化钠(1.80g；46.55mmol；2.50当量)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。完成后，用冷H2O淬灭反应混合物并通过硅藻土过滤。用二氯甲烷萃取滤液并用Na2SO4干燥。浓缩溶剂以得到灰白色粉末的化合物2。
产量：8.70g
产率：92.4％
分析数据：
LCMS:柱：ATLANTIS dC18(50x4.6mm)5μm；流动相A:0.1％ HCOOH水溶液:ACN(95:5)；B:ACN
RT(分钟)：2.05；M+H:503.2，纯度：96.6％。
步骤3：化合物3
向化合物2(8.70g；17.21mmol；1.00当量)的乙酸乙酯(100.00ml；11.49V)和THF(100.00ml；11.49V)搅拌溶液中添加碳载钯(10％w/w)(2.50g；2.35mmol；0.14当量)。将反应混合物在氢气氛围下在室温下搅拌3小时。完成后，通过硅藻土过滤反应混合物。真空下浓缩溶剂，得到灰白色固体的化合物3。
产量：8.5g
产率：100％
分析数据：
LCMS:柱：ATLANTIS dC18(50x4.6mm)5μm；流动相A:0.1％HCOOH水溶液:ACN(95:5)；B:ACN
RT(分钟)：1.73；M+H:456.10，纯度：95.1％。
步骤4：化合物4
在0℃下，向化合物3(7.60g；25.06mmol；1.20当量)的DCM(250.00ml；25.00V)搅拌溶液中添加2-乙氧基-2H-喹啉-1-羧酸乙酯(15.65g；62.66mmol；3.00当量)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。完成后，减压除去溶剂以获得粗产物。通过柱色谱法(56％ EtOAc:石油醚)纯化粗产物以获得纯度为80％的化合物。通过用30％ EtOAc和石油醚洗涤进一步纯化化合物，以获得白色固体的化合物4。
产量：8.5g
产率：50.7％
分析数据：
LCMS:柱：ATLANTIS dC18(50x4.6mm)5μm；流动相A:0.1％HCOOH水溶液:ACN(95:5)；B:ACN
RT(分钟)：3.03；M+H:735.2，纯度：81.9％。
步骤5：化合物5
在0℃下，向化合物4(2.00g；2.49mmol；1.00当量)的THF(40.00ml；20.00V)搅拌溶液中添加碳酸双-(4-硝基-苯基)酯(3.06g；9.97mmol；4.00当量)和DIPEA(4.40ml；24.92mmol；10.00当量)。将反应混合物在室温下搅拌12小时。反应完成后，将反应混合物在真空下浓缩。使用硅胶(230-400)和石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂通过柱色谱法纯化粗产物，得到淡黄色固体的化合物5。
产量：2.0g
产率：84.6％
分析数据：
LCMS:柱：X-Bridge C8(50X4.6)mm,3.5μm；流动相:A:0.1％ TFA于MilliQ水中；B:ACN
RT(分钟)：3.24；M+H:900.20，纯度：94.9％。
步骤6：化合物6
将化合物5(1,369g；1,00当量)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(15,00ml)中，添加依沙替康甲磺酸(679,7mg；1,00当量)、用于合成的4-甲基吗啉(0,422ml；3,00当量)和1-羟基苯并三唑(172,8mg；1,00当量)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。搅拌时间后，反应悬浮液变为棕色溶液。通过LC-MS监测反应，结果显示起始材料完全转化。通过RP快速色谱纯化反应混合物。将含有产物的级分合并，真空浓缩并冻干过夜，得到黄色固体的化合物6。
产量：1.59g
产率：87.5％
分析数据：
LCMS:柱：Chromolith HR RP-18e(50-4,6mm)；流动相A:0.05％HCOOH水溶液；B:0.04％ HCOOH和1％ H2O于ACN中；T:40℃；流速:3,3ml/分钟；MS:100-2000,正原子质量单位(amu positive)；1％->100％ B:0->2,0分钟；100％ B:2,0->2,5分钟
RT(分钟)：1.95；M+H:1196.40，纯度：84.4％。
步骤7：化合物7
将化合物6(1,586g；1,00当量)溶解于四氢呋喃(50,00ml)中，并在0℃下滴加LiOH溶液(0.1M)(包含于水(67,100ml)中的氢氧化锂水合物(281,77mg；6,00当量))。在添加过程中检查pH值。pH不应超过10。1.5小时后，完成LiOH溶液的添加。通过LC-MS监测反应，结果显示起始材料完全转化。用柠檬酸溶液淬灭反应，将pH调节至5。减压浓缩反应混合物。粗品通过制备型HPLC纯化。将含有产物的级分合并并冻干，得到深黄色固体的化合物7。
产量：728mg
产率：54.8％
分析数据：
LCMS:柱：Chromolith HR RP-18e(50-4,6mm)；流动相A:0.05％HCOOH水溶液；B:0.04％ HCOOH和1％ H2O于ACN中；T:40℃；流速:3,3ml/分钟；MS:100-2000,正原子质量单位；1％->100％ B:0->2,0分钟；100％ B:2,0->2,5分钟
RT(分钟)：1.68；M+H:1056.30，纯度：98.5％。
步骤8：化合物8
将化合物7(728,000mg；1,00当量)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20,00ml)中。添加哌啶(136,513μl；2,00当量)，在室温下搅拌溶液共4小时。通过LC-MS监测反应，结果显示起始材料完全转化。减压浓缩反应混合物，并通过RP快速色谱纯化粗产物。合并含有产物的级分，部分除去溶剂，冻干过夜，得到黄色固体化合物8。
产量：706mg
产率：100％
分析数据：
LCMS:柱：Chromolith HR RP-18e(50-4,6mm)；流动相A:0.05％HCOOH水溶液；B:0.04％ HCOOH和1％ H2O于ACN中；T:40℃；流速:3,3ml/分钟；MS:100-2000,正原子质量单位；1％->100％ B:0->2,0分钟；100％ B:2,0->2,5分钟
RT(分钟)：1.22；M+H:834.30，纯度：97.6％。
步骤9：化合物9
向化合物8(854mg；1,00当量)的二甲基甲酰胺(30,00ml)溶液中添加N-乙基二异丙胺(149,234μl；1,00当量)和3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-吡咯-1-基)-丙酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(233,61mg；1,00当量)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。通过LC-MS监测反应，结果显示起始材料完全转化。将反应混合物减压浓缩，并通过RP快速色谱法分离粗产物。将含有产物的级分合并、浓缩并冻干，得到纯度为91％的所需产物。再次通过RP色谱法纯化该物质，得到黄色固的化合物9。
产量：580mg
产率：60.1％
分析数据：
LCMS:柱：Chromolith HR RP-18e(50-4,6mm)；流动相A:0.05％HCOOH水溶液；B:0.04％ HCOOH和1％ H2O于ACN中；T:40℃；流速:3,3ml/分钟；MS:100-2000,正原子质量单位；1％->100％ B:0->2,0分钟；100％ B:2,0->2,5分钟
RT(分钟)：1.38；M+H:985.30，纯度：90％(其余10％异构体可用HPLC除去)
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.10–12.44(m,1H),9.08(s,1H),8.32(t,J＝5.8Hz,1H),8.16(s,1H),8.02(d,J＝8.8Hz,1H),7.76(d,J＝10.9Hz,1H),7.31(s,1H),7.15–7.09(m,2H),6.98(s,2H),5.48–5.38(m,2H),5.32–5.22(m,3H),5.11–5.01(m,2H),4.87(d,J＝7.6Hz,1H),3.92–3.88(m,1H),3.89–3.84(m,2H),3.65–3.61(m,2H),3.46–3.41(m,1H),3.42–3.37(m,1H),3.38–3.31(m,1H),3.28–3.20(m,1H),3.15–3.07(m,1H),2.48–2.44(m,2H),2.38(s,3H),2.24–2.13(m,2H),1.94–1.80(m,2H),0.88(t,J＝7.3Hz,3H)。
实施例1B：具有豆荚蛋白可切割接头的药物-接头化合物的合成：药物-接头化合物2(DL2)
将{-3-氨基甲酰基-2-[(2S)-2-[(2S)-2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)丙酰胺基]丙酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基4-硝基苯基碳酸酯(400mg；0.52mmol；1.00当量)[可从美国的Levena Biopharma商购]溶解于N,N-二甲基甲酰胺(5.00ml)中。添加(10S,23S)-23-氨基-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.02°,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-5,9-二酮；甲磺酸(277,30mg；0,52mmol；1,00当量)，N-乙基二异丙胺(0,27ml；1,57mmol；3,00当量)和1-羟基苯并三唑(HOBT)(3,52mg；0,03mmol；0,05当量)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。LC/MS表示转换完成。
将粗反应混合物通过制备型HPLC纯化并冻干，得到365mg(0.343mmol)的{4-[(2S)-3-氨基甲酰基-2-[(2S)-2-[(2S)-2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)丙酰胺基]丙酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.02°,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸酯。
LC/MS:[M+H]＝1064.2
制备型HPLC：
柱：sunfire prep c18 obd-75.0g(250巴)
溶剂A：Wasser 0.1％TFA溶剂C：
溶剂B：乙腈0.1％TFA
步骤2
将{4-[(2S)-3-氨基甲酰基-2-[(2S)-2-[(2S)-2-({[(9H-芴-9-基)甲氧基]羰基}氨基)丙酰胺基]丙酰胺基]丙酰胺基]苯基}甲基N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.02°,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸酯(365mg；0.34mmol；1.00当量)溶于N,N-(4,00ml)。添加用于合成的哌啶(0,07ml；0,69mmol；2,00当量)并将反应溶液在室温下搅拌1小时。
将反应混合物通过制备型HPLC纯化，得到300mg(0.314mmol)的三氟乙酸；{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基丙酰胺基]丙酰胺基]-3-氨基甲酰基丙酰胺基]苯基}甲基N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.02°,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]
氨基甲酸酯。。
LC/MS:[M+H]:841.3
纯化用制备型HPLC：
RediSep C18 130g
SN:E0410A0D24BE1 Lot:262118923W
流速：75ml/min
步骤3
向三氟乙酸{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基丙酰胺基]丙酰胺基]-3-氨基甲酰基丙酰胺基]苯基}甲基N-[(10S,23S)-10-乙基-18-氟-10-羟基-19-甲基-5,9-二氧代-8-氧杂-4,15-二氮杂六环[14.7.1.02,14.04,13.06,11.02°,24]二十四碳-1,6(11),12,14,16,18,20(24)-庚烯-23-基]氨基甲酸酯(571mg；0.60mmol；1.00水)的N,N-二甲基甲酰胺(20ml)溶液添加N-乙基二异丙胺(203μl；1,20mmol；2,00当量)和N-琥珀酰亚胺基3-马来酰亚胺基丙酸酯(162mg；0,60mmol；1,00当量)。然后将反应混合物搅拌10分钟并通过LC/MS监测。
将反应混合物通过制备型HPLC纯化，得到378mg(0.35mmol)DL2。
LC/MS:[M+H]:992.4
纯化用制备型HPLC：
RediSep柱：C18 86g
SN:E0410A8B46130 Lot:281729189W
流速：60ml/min
状态-容量:264,0ml
洗脱液1:A1水0.1％TFA
洗脱液2:B1乙腈0.1％TFA
序列分析：
方法信息：A:H2O+0,05％ HCOOH|B:MeCN+0,04％ HCOOH+1％ H2O
T:40℃|流速:3,3ml/分钟|MS:100-2000正原子质量单位
柱：Chromolith HR RP-18e 50-4,6mm
0％->100％ B:0->2,0分钟|100％ B:2,0->2,5mi
实施例2：免疫偶联物的制备：基于葡萄糖醛酸的mAb1偶联物(简称ADC1)
抗体制备和偶联
在偶联前3天内将单克隆抗体(mAb)在2-8℃下解冻，并在2-8℃下储存直至使用。在偶联当天，将mAb在使用前在室温下平衡。通过添加4％v/v的0.5MTris、0.025EDTA、pH8.5来调节25mM醋酸钠pH5.5中的mAb溶液(25.3mg/ml)的pH。随后，将pH调节后的mAb溶液与5摩尔当量(相对于mAb)的TCEP在20℃下孵育2小时，以还原链间二硫键。之后，将溶液与10摩尔当量(相对于mAb)的药物-接头(DL)在20℃下孵育1小时，以将DL与抗体偶联。通过在20℃下添加10摩尔当量(相对于mAb)的20mM的N-乙酰基半胱氨酸(NAC)持续20分钟来终止反应。再次通过添加5％v/v的0.15M乙酸来调节pH值，并使用0.22μm PES过滤单元进行真空过滤。使用带有膜、C筛、0.1m2的胶囊通过TFF对反应混合物进行透析。使用10mM组氨酸、40mM NaCl(pH5.5)作为透析缓冲液，需要15个透析体积(DV)，流速为5L/分钟/m2。TFF之后，再次使用0.22μm PES过滤单元过滤样品并稀释至15mg/ml的浓度。ADC的最终配方为10mM组氨酸、40mM NaCl、6％海藻糖，pH为5.5，浓度为10mg/ml。
质量属性：
药物物质表征
尺寸排阻色谱法(SEC)
单体含量和纯度通过尺寸排阻色谱法在配有安全保护柱的TOSOH TSKgelG3000SWXL 7.8mm×30cm,5μm上评估，以0.5ml/分钟的速度在10％ IPA、0.2M磷酸钾、0.25M氯化钾、pH6.95中以等度运行30分钟。注射体积范围为1-10μl(最多20μg蛋白质)。
SEC方法参数
波长280nm
柱TOSOH TSKgel G3000SWXL 7.8mm×30cm,5μm
流动相10％ IPA、0.2M磷酸钾、0.25M钾
1.氯化物，pH6.95
注射量1-20μL(5-20μg的蛋白质)
柱温度25℃
梯度 等度洗脱
流速 0.5mL/分钟
运行时间30分钟
显示储料mAb和最终BDS纯度的典型SEC色谱：
对于上述BDS材料，已经报道了4.6％ HMWS和95.4％的单体纯度。
反相高效液相色谱(RP HPLC)法
在Polymer Labs PLRP-S2.1mm x 50mm,5μm、柱上进行反相分析，以1.0mL/分钟/80℃运行，在0.1％ TFA 25％ CH3CN(流动相B)和0.1％ TFA 50％ CH3CN(A)之间为25分钟线性梯度流动。通过非还原PLRP条件分析还原抗体和完全偶联的ADC。下表给出了用于样品制备的方法：
显示轻链和重链分离的典型RP-HPLC色谱图。下述色谱图显示了mAb和最终BDS的叠加：
对于上述BDS材料，据报道DAR为7.8。
疏水相互作用色谱
使用梯度洗脱和214nm吸光度检测的疏水相互作用色谱法(HIC)来评估ADC的平均DAR。通过降低流动相中的盐浓度ADC分子按DAR增加的顺序描述，流动相由1.5M硫酸铵/20mM磷酸钠/pH 6.95组成。柱使用Tosoh TSKgel丁基-NPR柱，4.6×35mm，2.5μm。抗体/偶联物样品(5-20μg蛋白质)的注射量范围为1–10μl。
显示mAb和ADC分离的典型HIC色谱图。下述色谱图显示了输入mAb和最终BDS的叠加：
无药物方法
反相HPLC在Phenomenex Kinetex Core Shell 2.6μm C8柱，
50x4.6mm柱上进行，以2mL/分钟运行，60℃下进行8分钟95％ A(0.05％ TFA/H2O)和95％ B(0.05％TFA/CH3CN)之间的线性梯度。毒素接头标准品以NAC淬灭运行。在214nm处收集数据，在252、360和280nm处进行光谱分析，以监测接头发色团和样品中的任何蛋白质残留物。在进行HPLC分析之前，通过冷甲醇/盐萃取去除样品中的蛋白质：将2μl 5M NaCl添加到50μl样品中，然后添加150μl冰冷甲醇。将样品旋涡并在-20℃下孵育30分钟。沉淀的蛋白质通过以15000x g在4℃下进行30分钟离心来沉淀。将125μl上清液用125μl Elga 18.2MΩ水稀释并混合。注入100μl样品，并在360nm处报告所有数据。相对于毒素标准曲线计算残留毒素相关物种的水平。观察到的毒素量以相对于样品总毒素含量的％mole/mole值报告。
粗制偶联反应(蓝色)、DV0(红色)、DV6(绿色)、DV10(粉色)和BDSPPB-13430(橄榄绿)的RP-HPLC色谱图叠加(360nm)。
内毒素
使用Endosafe PTS内毒素系统(Charles River)通过动态显色LAL测定法测定内毒素。缓冲液和抗体在LAL试剂水中稀释10倍。ADC在LAL试剂水中稀释10倍。所有样品均在0.01–1EU/mL试剂盒上进行分析。将EU/mL值除以ADC[P]mg/mL转换为EU/mg。
GD2-ADC：体外和体内实验结果
实验1抗GD2 ADC在神经母细胞瘤(CHP134)异种移植模型中的剂量反应功效研究
CHP134是表达高水平GD2的人类神经母细胞瘤异种移植肿瘤模型，在其中评估抗GD2 ADC分子1的剂量反应关系。
对具有已建立的CHP134肿瘤(约150mm3)的雌性无胸腺裸鼠(nu/nu)进行分子1静脉内(IV)注射治疗，剂量范围为0.25mg/kg至1.0mg/kg，每周(qw)一次，持续4周。
在该研究中，治疗耐受性良好，无毒性，体重增加正常(图1)。图2显示了治疗对CHP134肿瘤生长的影响，以及载剂对照治疗的肿瘤达到研究终点(>1,000mm3)当天个体肿瘤大小的影响。在D0(第0天)、D7、D14和D21以0.25、0.5和1.0mg/kg给予的分子1显示出剂量依赖性抗肿瘤活性。测试的最低剂量0.25显示出59％肿瘤生长抑制(TGI)的功效，这仍然很显著(p<0.01)(图2)。在0.5mg/kg和1.0mg/kg的分子1中观察到诱导肿瘤消退的强活性，对于两种剂量而言，这都是非常显著的(p<0.0001，第18天)(图2)。在研究结束时(第85天)，所有接受0.5mg/kg和1.0mg/kg剂量(16只中的16只)分子1治疗的动物均出现了完全缓解(图3)。
综上，本研究结果证明分子1具有强效抗肿瘤活性，在CHP134肿瘤中产生显著的功效和肿瘤消退。最低有效剂量(MED)定义为诱导肿瘤体积从基线减少>20％的最低剂量(治疗开始后的任何时间点)，在CHP134肿瘤模型中确定为约0.5mg/kg分子1。
图1
图2
图3.
实验2抗GD2 ADC在骨肉瘤PDX模型中的功效研究
在表达GD2的CTG-2735骨肉瘤PDX模型中评估抗GD2 ADC分子1的功效。
在第0天，对已建立CTG-2735肿瘤(约250mm3)的雌性无胸腺裸鼠(nu/nu)进行单次IV注射，剂量为10.0mg/kg的分子1。载剂组和治疗组的组大小为3。
在该研究中，治疗耐受性良好，无毒性，体重增加正常(图4)。用10mg/kg分子1治疗可引起强烈的肿瘤生长抑制，导致肿瘤消退持续很长时间，直到实验结束的第62天(参见图5和6)。
总之，本研究结果证明分子1在骨肉瘤PDX模型CTG-2735中具有强大的抗肿瘤活性。
图4.
图5.
图6.
实验3抗GD2 ADC在SCLC PDX模型中的功效研究
抗GD2 ADC分子1的功效在表达GD2的CTG-0199SCLC PDX模型中评估。
在第0天，对具有已建立的CTG-0199肿瘤(约250mm3)的雌性无胸腺裸鼠(nu/nu)进行单次IV注射，剂量为10.0mg/kg的分子1。载剂组和治疗组的组大小为5。
在该研究中，治疗耐受性良好，无毒性，体重增加正常(图7)。用10mg/kg分子1治疗可引起强烈的肿瘤生长抑制，导致肿瘤消退持续很长时间，直到实验结束的第53天(图8、9)。
总之，本研究结果证明分子1在SCLC PDX模型CTG-0199中具有强大的抗肿瘤活性。
图7.
图8.
图9.
实验4抗GD2 ADC与ATR抑制剂在骨肉瘤(CTG-2264)患者来源异种移植(PDX)模型中的联合疗效研究
在CTG-2264骨肉瘤PDX模型中测试本发明所选ADC的抗肿瘤活性。
已建立CTG-2264肿瘤(约50mm3)的雌性无胸腺裸鼠(nu/nu)接受以下治疗：在第0天单次静脉注射3.0mg/kg剂量的分子1，每日(qd)口服(po)10mg/kg剂量的ATR抑制剂；或两种治疗相结合。载剂对照为盐水，第0天给药(10mL/kg)。各治疗组的组大小为3。治疗开始后第23天计算肿瘤生长抑制(TGI)，此时对照组的平均肿瘤体积达到1000mm3(参见图11、12)。
治疗耐受性良好，未观察到毒性或临床症状，并且所有治疗组均未观察到与初始体重相比的平均体重减轻(图10)。单独和组合使用这些ADC时，在CTG-2264骨肉瘤PDX模型中导致65％、67％和-72％(消退)的肿瘤生长抑制(TGI)
总之，与两种单一疗法10mg/kg相比，上述组合显示出益处(p<0.0001)。
图10.
图11.
图12.
实验5.ADC对人癌细胞系的细胞杀伤试验
ADC hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK-βGluc依沙替康和利妥昔单抗(Rituximab)IgG1βGluc依沙替康、未偶联的抗体hu14.18-IgG1.4(K322A)-delk和游离荷载依沙替康的体外效力使用CellTiter 发光细胞活力测定(#G7573，Promega Corporation，美国威斯康星州麦迪逊)在抗原阳性人肿瘤细胞系CHP-134(神经母细胞瘤，#ACC653，DSMZ，德国不伦瑞克)、NCI-H446(小细胞肺癌(SCLC)，#HTB-171，ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯)以及M21(黑色素瘤，Scripps Research Institute，美国加利福尼亚州拉霍亚)和抗原阴性人肿瘤细胞系MDA-MB-468(乳腺癌，
#ACC738，DSMZ，德国不伦瑞克)中测量。
细胞系CHP-134、NCI-H446和MDA-MB-468按照供应商的说明进行培养，并在含有GlutaMAX TM补剂(#61870-010，GibcoTM，购自美国马塞诸塞州沃尔瑟姆Thermo FisherScientific)、1mM丙酮酸钠(#11360-070，GibcoTM，Thermo Fisher Scientific)和10％胎牛血清(FBS)(#S0615，美国密苏里州圣路易斯Sigma Aldrich)的RPMI1640培养基中培养。黑色素瘤细胞系M21在含有稳定L-谷氨酰胺(#41965-039，GibcoTM，Thermo FisherScientific)和10％FBS的DMEM中培养。
治疗前一天，将625个细胞/孔(90μl)(CHP-134、M21或MDA-MB-468)或1250个细胞/孔(90μl)(NCI-H446)接种于无菌FalconTM 96孔细胞培养处理的平底微孔板(#353219，美国纽约州Corning)中。在37℃和5％CO2或10％CO2下过夜孵育后，使用包含上述补剂的RPMI1640培养基或细胞培养基制备10倍起始浓度的化合物和连续稀释液(1:4)。各孔总共加入10μl化合物溶液(技术重复三次)。对照孔用相应量的二甲基亚砜(自由荷载的对照孔)或细胞培养基/RPMI 1640(ADC和未偶联抗体的对照孔以及不含细胞的背景孔)处理。孵育6天后，向各孔中添加100μl 试剂，将板孵育2分钟并伴有300rpm的摇动，然后在室温下再孵育20分钟(避光)。之后，在Varioskan Flash或Varioskan Lux平板读数器(Thermo Fisher Scientific)上测量发光信号以确定细胞活力。相对光单位(RLU)通过减去背景并转换为活力％(而未处理的对照细胞的RLU定义为100％)或效果％(通过从活力％中减去100％计算得出)处理。处理后的数据用于描述剂量反应，即效应％与浓度[M]，其方程式为log(抑制剂)与反应-可变斜率(四个参数)(适用于Windows的GraphPad Prism(版本8.2.0)，GraphPad软件，美国加利福尼亚州拉霍亚，www.graphpad.com)。数据显示为误差线，表示技术三重重复的标准偏差(SD)。进行多次实验并计算了确定的IC50的几何平均值(几何平均IC50[nM])。
抗GD2 hu14.18-IgG1.4(K322A)-delk-βGluc依沙替康ADC(分子1)的细胞毒活性在靶标阳性和靶标阴性人癌细胞系中测定。具有相同接头-荷载和可比DAR的利妥昔单抗IgG1βGluc依沙替康ADC(分子2)和未偶联抗体hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK(分子3)用作对照。为了确认人癌细胞系对游离荷载的普遍敏感性，依沙替康(分子4)也包括在测试中。
体外活性的结果总结在表1，代表性剂量反应曲线显示在图1-图。与非结合对照ADC(分子2)相比，抗GD2 hu14.18-IgG1.4(K322A)-delk-βGluc依沙替康ADC(分子1)表现有效抑制细胞活力并对表达GD2+的癌细胞系CHP-134(图1)、M21(图)和NCI-H446(图)表现出特定的亚纳摩尔或个位数纳摩尔效力。对于对游离荷载依沙替康(分子4)表现出相当高的敏感性的靶标阴性细胞系MDA-MB-468(图)，相较于非结合对照ADC(分子2)，未观察到分子1的特定细胞毒性作用。
用未偶联抗体hu14.18-IgG1.4(K322A)-delk(分子3)处理GD2阳性神经母细胞瘤细胞系CHP-134在最高测试浓度下显示出细胞杀伤活性(图)。该效果与Horwacik等(CancerLetters,第341卷，第2期，2013，第248-264页)发表的数据一致，该文献报道了用抗GD2小鼠mAb 14G2a处理后对CHP-134细胞活力产生的负面影响。用hu14.18-IgG1.4(K322A)-delk(分子3)处理后，对SCLC细胞系NCI-H446和黑色素瘤细胞系M21的细胞活力产生轻微影响，而对靶标阴性MDA-MB-468细胞系未发现影响。
NC：由于剂量反应曲线不完整，无法计算
N：实验次数
IC50：半数最大抑制浓度；观察到50％最大抑制时的浓度；表格包括根据所示实验次数的IC50值计算出的几何平均IC50[nM]
跨度(％)：最高测试浓度下的功效％*。非活细胞、总细胞与未处理对照细胞的百分比；表格包括根据所示实验次数的跨度(％)值计算出的几何平均跨度(％)
最高测试浓度：分子1、2、4为100nM；分子3为1μM
表1：hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK-βGluc依沙替康、利妥昔单抗IgG1βGluc依沙替康、hu14.18-IgG1.4(K322A)-delk和荷载依沙替康在人癌细胞系中的几何平均IC50值[nM]和几何平均跨度(％)
实验5的图例
图13：hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK-βGluc依沙替康(分子1)，对照ADC利妥昔单抗IgG1βGluc依沙替康(分子2)和荷载依沙替康(分子4)在CHP-134细胞中的体外剂量反应曲线。一条代表性剂量反应曲线显示为三次重复值的平均值±SD。
图14：hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK-βGluc依沙替康(分子1)，对照ADC利妥昔单抗IgG1βGluc依沙替康(分子2)和荷载依沙替康(分子4)治疗在M21细胞中的体外剂量反应曲线。一条代表性剂量反应曲线显示为三次重复值的平均值±SD。
图15：hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK-βGluc依沙替康(分子1)，对照ADC利妥昔单抗IgG1βGluc依沙替康(分子2)和荷载依沙替康(分子4)治疗在NCI-H446细胞中的体外剂量反应曲线。一条代表性剂量反应曲线显示为三次重复值的平均值±SD。
图16：hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK-βGluc依沙替康(分子1)，对照ADC利妥昔单抗IgG1βGluc依沙替康(分子2)和荷载依沙替康(分子4)在MDA-MB-468细胞中的体外剂量反应曲线。一条代表性剂量反应曲线显示为三次重复值的平均值±SD。
图17：hu14.18-IgG1.4(K322A)-delK-βGluc依沙替康(分子1)和hu14.18-IgG1.4(K322A)-delk(分子3)在CHP-134细胞中的体外剂量反应曲线。数据表示为三次重复值的平均值±SD。图中描绘的曲线来自两次独立实验。
图13
图14
图15
图16
图17
实验6：ADC1的安全性：在食蟹猴中进行的试验性静脉注射毒性TK研究
为了研究安全性，以4、8、16和32mg/kg的剂量通过30分钟静脉输注给予食蟹猴，三次，间隔一周(第1、8和15天)，然后将动物处死(第22天)以对包括周围神经组织在内的大量器官和组织进行大体和组织病理学检查。此外，研究还包括临床症状、体重、临床血液学和生物化学参数以及毒代动力学(TK)。ADC1主要在血液淋巴和胃肠道系统中引起类似于依沙替康毒性的剂量依赖性效应(De Jager 2000，Verschraegen 2000，Rowinsky 2005)。值得注意的是，在笼内观察期间或在处理猴进行剂量给药期间或采集血液样本时未观察到疼痛的临床症状。在检查几种周围神经组织(即腓骨、胫骨和坐骨神经)或中枢脑组织时未观察到组织病理学改变。结果表明，血浆偶联抗体的充分暴露水平与未偶联(释放的)依沙替康的极低血浆浓度有关。本研究中没有疼痛非常重要，因为疼痛或异常性疼痛是使用获批的GD2(IgG1)抗体(诸如地诺昔单抗(ch14.18/SP2/0，Unituxin)、地诺昔单抗β(ch14.18/CHO或APN311)和纳西他单抗(hu3F8))治疗肿瘤患者的剂量限制性毒性。在食蟹猴中测试的地诺昔单抗β表现出解释为急性疼痛的临床症状，这些临床症状通过观察到的周围神经系统或非神经元组织神经支配结构的组织病理学变化得到证实(EMA/263814/2017评估报告地诺昔单抗βApeiron)。地诺昔单抗β以及原始地诺昔单抗和纳西他单抗抗体的标签证实了有关急性疼痛(治疗)问题的安全性信息。即使使用仅通过K322A突变为CDC效应功能突变的GD2抗体，也只能部分缓解疼痛(Dobrenkov和Cheung2014；Navid等2014)并且仍然需要使用阿片类药物(Harman等2019)。
总之，采用新型ADC的猴安全性数据和小鼠肿瘤模型数据显示，肿瘤被靶向的依沙替康介导的细胞凋亡(而不是通过CDC和/或ADCC机制)杀伤，并且没有与单独给予裸抗GD2抗体相关的疼痛。
实验7：评估大鼠和食蟹猴中外周神经系统保护ADC(分子1)
为了研究分子1在表达相同GD2糖表位的猴和大鼠中的初始安全性特征，所述GD2糖表位可被用于偶联的hu14.18Ab变体(FDA BLA#125516,2014；EMA/263814/2017,2017)靶向，分子1显示出预期的依沙替康毒性特征，但在每周静脉重复给药后在猴和大鼠中未引起任何PNS损伤。此外，在笼中的动物正常行为(例如运动活动、直立和探索，或被处理时)中未观察到疼痛信号的迹象。
方法
一般毒理学计划包括使用分子1的试验性重复剂量毒性研究，其中，分子1每周一次通过静脉输注连续3次(第1、8和15天)给药于Wistar大鼠和食蟹猴，包括用于ADC暴露确认的毒代动力学评估(通过液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析偶联的荷载，通过免疫测定分析总抗体)和血浆中释放的荷载(通过超高效LC-MS/MS分析)。在第22天安排进行尸检以进行宏观和微观检查。
静脉内剂量配方：将分子1(抗体(Ab)由美国比勒里卡的EMD Serono公司制造，通过英国弗林特郡的Sterling Deeside有限公司偶联)配制在含有10mM组氨酸、40mM NaCl、6％海藻糖二水合物、0.05％聚山梨醇酯20(pH5.5)的载剂溶液(对照组)中，并深度冷冻储存(-60℃)待用。在给药前验证分子1的储液浓度(10mg/ml)和稀释液的稳定性和浓度(Merck KGaA，德国达姆施塔特)。测试物品或载剂通过静脉内(iv)缓慢推注输注给予大鼠(尾静脉)和30分钟输注给予食蟹猴(外周静脉)。毒性评估的一般参数。毒性指标由每日临床观察、体重、食物消耗、临床病理学、免疫表型分析、大体病理学、器官重量和组织病理学组成。尸检包括检查尸体、外部身体孔口、腹腔、胸腔和颅腔以及器官。尸检收集的组织保存在10％中性缓冲福尔马林、戴氏(Davidson’s)(眼睛和视神经)或改良戴氏(睾丸)固定剂中，并进行常规组织学检查(石蜡包埋组织和HE染色)。在固定前对选定的器官称重。此外，对垂死动物进行了计划外的尸检和组织学检查。
B.方法
3周龄大鼠试验毒性和毒代动力学研究
连续3周每周通过静脉输注将分子1给予四组Crl:WI(Han)大鼠(5只大鼠/性别/组；Charles River Laboratories，德国苏尔茨费尔德)，剂量为0(载剂对照)、10、30和60mg/kg分子1。3只大鼠/性别/组的卫星组用于三种分析物的毒代动力学评估。方法：将大鼠圈养在每笼2-3只的组。每天观察大鼠的外表、行为和临床症状。在开始治疗之前记录体重，此后每天记录体重直至研究结束。通过称量各笼子中未消耗的食物，每周记录各笼的食物消耗量直至研究结束。在最后一次给药期(第22天)后一周，对5只大鼠/性别/组进行血液学检查和临床化学测试。使用ADVIA2120i自动分析仪分析血液学参数，并使用ADVIA1800自动分析仪(均来自西门子医疗诊断有限公司)分析临床化学参数。在第1天和第15天直至下述时间点后1周从卫星组和主组(稀少采样)采集血液样品(0.15mL肝素锂管)进行生物分析和毒代动力学(TK)评估：0(给药前)，给药后0.5、4、24、48、96(仅第1天)和168小时(下次给药前)。作为对照，在第1天和第15天(第一次和最后一次给药后4小时)对经载剂处理的动物进行取样。
ii.3周试验性猴毒性和毒代动力学研究，包括心血管(CV)参数和呼吸频率的功能评估
专门饲养的幼年食蟹猴(Macaca fascicularis)购自Envigo公司(荷兰芬赖)。猴在越南出生、饲养并在Camarles(西班牙Camarney SLU)隔离，然后运往意大利伊夫雷亚的测试设施。将猴安置在空调房中(22±2℃)，每小时换气15-20次，相对湿度为55±15％，人工照明且昼夜节律为从早上7点到晚上7点的12小时。将动物分组饲养在固定在地板上的猴笼中。笼子的前壁和顶部由不锈钢条制成，而侧壁和后壁由彩色塑料制成。在该研究中，实验组由各组各性别一只动物组成，但存在额外的未给药的动物以确保两到三个对象的社会饲养组。非人灵长类动物饲养符合意大利对实验室动物福利的要求，包括环境丰富计划。在治疗开始时，雄性和雌性动物约3-4岁，体重在3.1-3.8公斤。分子1每周通过30分钟静脉输注以三种剂量水平(4、8和16mg/kg)的测试项目给予各组1只雄性和1只雌性食蟹猴，连续3周。另外一只雄性猴子以第四个更高的剂量水平(32mg/kg)输注以确定最大耐受性。
每天两次以及在输注结束时(直至给药后30分钟)记录死亡率和临床症状(体貌、行为和一般体征)，并且在整个研究期间从开始治疗前一周开始每周记录一次体重。每天(每笼)进行食物和水摄入。在治疗前期间以及第3天(即第1次给药后48小时)、第8天(第2次给药前168小时)、第15天(第3次给药前)、第17天(即第3次给药后48小时)和第22天(处死前)对所有猴子进行血液学检查(ADVIA2120i西门子分析仪)。在同一天进行免疫表型分析(FACLyric Becton Dickinson流式细胞仪、Becton Dickinson抗体)，以测量总B细胞(CD3-、CD20+)、总(CD3+)、辅助(CD3+、CD4+)和细胞毒性T细胞(CD3+、CD8+)以及自然杀伤细胞(CD3-、CD16+)的绝对和相对计数。在给药前、第15天和第22天进行临床化学分析(AU480Beckman Coulter分析仪)。
在第1天和第15天直至此后一周在下述时间点从各动物采集血液样本(0.6mL肝素锂管中)用于生物分析和TK评估：0小时(给药前)，给药后0.5(＝输注结束)、2、6、24、48、72、120和168小时(下次给药前)。
iii.综合心电图和动脉血压评估
作为试验性猴DRF毒性研究的组成部分，在基线(给药前)和输注最后一剂(第15天)结束时30分钟内测量所有猴的心率(HR)、心电图(ECG)和动脉血压(收缩压和舒张压)。训练动物在清醒、暂时受约束的条件下坐在椅子上进行记录。在呼吸频率和ECG测量会话之前连续测量收缩压和舒张压三次。对至少10个代表性ECG复合体进行评估。在动脉血压测量后立即通过对1分钟内的呼吸运动进行计数来测量呼吸频率。记录所有动物的直肠温度，给药前进行两次，以及第1天、第8天和第15天，输注结束时(给药后30分钟内)和给药后24小时(±30分钟)。
方法：根据标准II导联(Standard II Leads)将ECG电极(一次性泡沫电极)置于各动物。使用软件包(Ponemah Physiology Platform 5.20，来自DSI供应商)将信号数字化(A/D转换器ACQ-7700，DSI，美国明尼苏达州圣保罗)并在心率达到稳定状态后连续记录。将用于动脉血压(BP)测量的袖带连接到血压监测仪(监测生命体征单元CARESCAPETMV100，GEHealthcare，美国威斯康星州密尔沃基)并置于前臂之一。由于各组动物数量较少，因此未进行统计分析。
实验结果：
Wistar大鼠的3周试验性毒理学研
连续三次每周静脉注射三种剂量水平的分子1后，导致16只接受60mg/kg剂量的大鼠中3只因出现临床症状(腰部凹陷、毛发竖立、眼睑下垂)而提前处死，研究结束时(第21天)与对照组相比，雄性大鼠体重下降-25％，雌性大鼠体重下降-12％(图13)。每周给药后，60mg/kg剂量组出现短暂性体重损失，注射后3至4天体重下降最低，与给药前各周体重值相比，雄性大鼠体重下降-7％(与对照组相比下降多达-27％)，雌性大鼠体重下降-10％(与对照组相比下降多达-15％)。剂量为30mg/kg时，两种性别的大鼠在第21天体重下降-10％至-11％(与对照组相比)。在21天的观察期内，与对照组相比，在两种性别中，60mg/kg剂量组体重几乎未增加，30mg/kg剂量组体重几乎减少50％。60mg/kg剂量组食物消耗量剂量依赖性减少33-37％，30mg/kg剂量组食物消耗量剂量依赖性减少16-19％。
在第22天，即最后一次给药(第15天)后一周，临床病理学测量显示红细胞、血红蛋白和血细胞比容(hematocrit)中度下降(所有参数在60mg/kg时下降多达-29％，在30mg/kg时下降多达-9％)，网织红细胞在表明再生的中等剂量下增加(高达90％)，在高剂量下网织红细胞无变化。在60mg/kg时，白细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞似乎下降，并且在30mg/kg时也部分下降(雄性嗜酸性粒细胞，雌性淋巴细胞)。在中等和高剂量下，血小板增加(高达60％)，而中性粒细胞计数显示减少趋势(无统计学意义)。选定的第22天进行血液学分析可能不是大鼠造血再生能力的最佳时间。依沙替康在啮齿动物中表现出的血液毒性作用，诸如中性粒细胞、淋巴细胞和血小板减少(Verschraegen等,2000)可能在最后一剂分子1给予后7天部分恢复。关于临床血液化学，总蛋白(-14％)和白蛋白(-12％)仅在60mg/kg时下降。后者的影响很可能与3周内体重没有任何增长的一般分解代谢有关。
对第22天收集的器官进行显微镜检查揭示血液淋巴系统(胸腺、骨髓(BM)和脾脏周围淋巴鞘(PALS)以及淋巴结中细胞性坏死减少和/或单细胞坏死增加)、胃肠道(隐窝区域中单细胞坏死增加)和生殖器官(卵母细胞、颗粒细胞和生精小管变性)中存在不良发现，这反映了抗有丝分裂细胞毒性剂的模式。在胸腺中，在受感染最严重的大鼠中观察到中度至显著的皮髓质区别丧失。此外，在单只大鼠，尤其是在60mg/kg剂量组中出现了次要发现，由减少的原发性小梁、骨/骨髓中编织骨形成或纤维化以及皮肤溃疡组成。编织骨形成和纤维化可视为对骨形成紊乱的补偿。在60mg/kg组的四只雄性大鼠中，皮肤伤口出现溃疡可能是由于免疫抑制情况下常见的皮肤变化(抓伤或咬伤)的机会性感染(显微镜载玻片中存在球菌菌落)所引起。在10mg/kg及以上低剂量下，大多数大鼠淋巴结中生发中心丢失，表明这种特定的B细胞区室对大鼠体内分子1的抗有丝分裂活性具有很高的敏感性。60mg/kg下的其他观察结果是肝脏和肾上腺中髓外造血最少，这被认为是由于骨髓抑制而产生的适应性现象。主要60mg/kg组(2次给药后第14天)中过早处死的雌性大鼠的盲肠出现多灶性中度糜烂，这可能是其临床状况不佳的原因。该大鼠中的其他发现与该组中的剩余大鼠相当。卫星TK组的两只过早处死的大鼠(第5天为雌性，第18天为雄性)未进行组织病理学检查。
对大鼠背根神经节(颈、胸、腰)和周围神经(包括视神经、胫神经、腓神经和坐骨神经)的显微镜评估没有显示任何异常。
毒代动力学评估
全部抗体、偶联(依沙替康)和未偶联(释放的依沙替康)的总血浆暴露在测试剂量范围内与剂量增加成比例增加，其中ADC在10和30mg/kg治疗组中积累，但在60mg/kg组中没有积累。在0.5至4小时之间观察到非常低血浆水平的未偶联的依沙替康的最大血浆浓度，其半衰期与ADC相似(约2-3天)，表明ADC的形成限速过程。血浆暴露量没有明显的相关性别差异。
vi.在食蟹猴中进行试验性3周毒性试验研究以及CV功能评估
食蟹猴耐受连续三次以三种剂量水平每周静脉注射分子1。在两次给药(第1天和第8天)后，单个雄性猴并不耐受输注第四较高剂量32mg/kg分子1，并需要在第14天处死。因此，在本研究中，认为32mg/kg的剂量超过了MTD。
达到MTD时，猴表现出与体重下降相关的剂量依赖性胃肠道临床症状(即软便和/或腹泻发作)。在MTD为16mg/kg时，在两种动物和8mg/kg的雌性动物中均观察到轻微的软便和/或腹泻发作。这与16mg/kg雌性动物体重随时间逐渐减少-11％(第14天)至-16％(第21天)有关，但雄性动物没有。两种性别的猴在8mg/kg时以及雄性猴在4mg/kg时均出现轻微的体重下降。随时间对猴进行血液学研究(图14)表明，在所有剂量水平下，红细胞、血红蛋白和血细胞比容的下降最小到轻微(对于两种性别在16mg/kg时，与基线值相比下降高达-27％)，剂量关系有限。在4和8mg/kg剂量下观察到再生反应(即网织红细胞计数增加高达5倍)，而在16mg/kg剂量下，对于同一参数出现中度至重度下降(第8天下降高达约-95％)。在16mg/kg时，雄性猴在第8天和第15天的中性粒细胞计数暂时减少(<2.0 103/μL)，但仍高于正常参考值的下限(＝1.10x103/μL，平均值5.77±3.57x103/μL，如Park等,2016报告)。
在16mg/kg时，组织病理学仅限于淋巴系统的变化(淋巴结和胸腺中的细胞减少)。以8和4mg/kg治疗的所有猴子中，胸腺的轻微影响可能与继发性应激相关影响混淆。胃肠道中未观察到组织病理学变化。
对包括视神经、胫神经、腓神经和坐骨神经等的周围神经进行显微镜评估后，在任何测试剂量下均未显示任何与测试项目相关的发现，包括在超过MTD的雄性猴中(第14天尸检)。
心血管功能
对于心率(HR)、ECG(QT/HR校正的QT)、收缩压、舒张压和平均血压，以及呼吸频率和体温，未测量到MTD的相关变化。
毒代动力学评估
全部抗体、偶联(依沙替康)和未偶联(释放的依沙替康)的总血浆暴露量在测试剂量范围内与剂量增加成比例增加，且未积累任何分析物。仅在单个猴(雄性)中观察到重复给予4mg/kg后出现暴露量下降，表明该对象可能形成ADA。通常在6小时后观察到非常低水平的未偶联的依沙替康的最大血浆浓度，其半衰期与ADC相似(约2-3天)，表明ADC的形成限速过程。血浆暴露量没有明显的相关性别差异。
实验结果讨论
在目前上市的抗GD2抗体(地诺昔单抗、纳西他单抗)的GD2免疫疗法治疗患有神经母细胞瘤和骨肉瘤的患者时观察到尽管存活率有所提高，但急性神经性疼痛是与周围神经病变相关的常见且关键的剂量限制性不良事件(AE)。在对大鼠和食蟹猴进行的试验性毒性/TK研究中，每周静脉注射(3次)基于依沙替康的ADC分子1，在第22天未观察到PNS损伤，并且在其行为中未观察到疼痛迹象。分子1在表达GD2的异种移植小鼠模型中产生强大的抗肿瘤活性，即使在单剂量应用后也是如此。这些非临床数据共同显示了积极的效益风险比，可能改善与目前的GD2免疫疗法相比治疗儿童和成人患者中表达GD2的肿瘤的临床前景。总体而言，在处理过程中没有发现任何异常防御行为迹象，例如过度反应、焦虑或激动，这些异常防御行为迹象可能表明存在机械性异常性疼痛。而且，在它们的笼中行为中，没有观察到任何表明疼痛的迹象，例如运动活动减少、后退和探索。此外，坐在椅子上的经过训练的猴子在接受30分钟的静脉输液时没有出现问题，随后在1小时后测量可能对疼痛刺激做出反应的CV功能，例如心动过速或血压升高，尽管是非特异性的，但似乎在猴子中保持正常。
与之相对，在连续10天每天4小时(30和100mg/m2/天)输注地诺昔单抗β的食蟹猴的毒性研究中，在第15天在器官的周围神经和内脏神经支配中观察到组织病理学变化(EMA/263814/2017,2017)。这些观察结果以及这些猴的临床症状(例如活动减退)被解释为最可能与急性疼痛诱导有关的症状，因为测试项目靶向周围神经系统内的GD2。在用抗GD2mAb(14G2a；ch14.18源自该鼠IgG2a同种型)治疗黑色素瘤后，一些患者出现了感觉运动脱髓鞘性多发性神经病(Yuki等,1997)。尚未对猴子或其他非啮齿动物进行过纳昔单抗(FDABLA#761171，2020)或地诺昔单抗的毒理学研究(FDABLA#125516，2014)。
在DRF毒性研究中，在重复施用分子1后，在猴和大鼠的多种受检外周神经中未观察到微观变化(大鼠的坐骨神经、胫骨神经、腓骨神经和视神经，以及不同水平的DRG)，同时确认了血浆中ADC充分暴露。猴的临床症状仅限于MTD为16mg/kg时偶尔出现的轻度软便和腹泻，以及雌性(-16％)的体重减少，但雄性没有。主要在大鼠中观察到剂量依赖性体重增加减少和轻微的食物摄入量减少。由于16只大鼠中有3只在60mg/kg下体重未增加所示的情况不佳，因此该DRF大鼠研究中的高剂量被认为超过了MTD。从临床和组织病理学检查来看，猴和大鼠表现出类似于依沙替康毒性的血液淋巴和胃肠道效应(Verschraegen等,2000，Rowinsky 2005)，这是因为ADC在一周内释放的未偶联的依沙替康血浆水平相对较低。如在肿瘤患者和动物中观察到的结果所示，认为中性粒细胞减少症是依沙替康甲磺酸盐的主要剂量限制性毒性，同时还伴有其他血液毒性作用(如贫血、淋巴细胞减少和血小板减少)和胃肠道效应。
如实验7中详述，通过显示正常剂量比例和规则的TK曲线的TK概况以及不存在异常毒性判断得出在三周内重复给予分子1后，未在大鼠和猴子中观察到免疫原性的迹象(除了1只低剂量猴)。有可能通过分子1诱导的强免疫抑制作用(例如，没有生发中心，即主要B细胞区室)来解释免疫原性的缺失。用分子1观察到的其他非血液毒性作用(例如雌性和雄性大鼠生殖器官/组织的抗增殖变化)可归因于依沙替康的抗有丝分裂作用(Verschraegen等,2000，Rowinsky 2005)。
通过将肿瘤杀灭概念替换为非神经毒性荷载的靶向递送，并消除任何Ab Fc-效应器功能，防止了两种受试动物物种的PNS损伤。这种一致结果的最大优势在于分子1至少可以消除或减少对患者PNS的潜在伤害。
在本发明的一些实施方式中，治疗方法描述了分子1的PNS保护活性，从而可以预防眼部神经疾病(例如，瞳孔散大、视力模糊、瞳孔不等或畏光)。

Claims (22)

1.一种抗体药物偶联物(“ADC”)，包含通过接头与抗体连接的生长抑制剂和/或抗增殖剂，其中所述抗体包含SEQ ID NO:1的抗GD2抗体轻链可变区、SEQ ID NO:2的抗GD2抗体重链可变区和具有一个突变的Fc区，所述突变相对于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性降低补体结合，其中所述一个突变导致补体结合的绝对降低。
2.如权利要求1所述的抗体，其中，所述一个突变消除补体结合。
3.如权利要求1所述的抗体，其中，所述Fc区源自IgG。
4.如权利要求3所述的抗体，其中，所述IgG是IgG1。
5.如权利要求1所述的抗体，其还包含CH1结构域。
6.如权利要求5所述的抗体，其中，所述Fc区源自IgG。
7.如权利要求5所述的抗体，其中，所述IgG是IgG1。
8.如权利要求1所述的抗体，其还包含CL结构域。
9.如权利要求8所述的抗体，其还包含CH1结构域。
10.如权利要求1所述的接头，其中，所述接头能够通过葡萄糖醛酸酶切割。
11.如权利要求1所述的接头，其中，所述接头能够通过豆荚蛋白切割。
12.如权利要求1所述的生长抑制剂，其中，所述生长抑制剂是依沙替康。
13.如权利要求1所述的ADC，其平均药物与抗体比在1-10的范围内。
14.如权利要求1所述的ADC，其平均药物与抗体比在2-4的范围内。
15.如权利要求1所述的ADC，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:2中所示的重链可变区氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:1中所示的轻链可变区氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列。
16.一种药物组合物，包含权利要求1所述ADC和药学上可接受的赋形剂。
17.一种治疗对象的癌症的方法，包括向所述对象给予治疗有效量的权利要求16所述药物组合物。
18.一种抗体药物偶联物(“ADC”)，包含通过接头与抗GD2抗体连接的生长抑制剂和/或抗增殖剂，其中所述抗GD2抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:4和氨基酸序列SEQ ID NO:1，所述接头为β-葡萄糖醛酸苷，所述生长抑制剂为依沙替康。
19.如权利要求18所述的ADC，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:4中所示的重链可变区氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:1中所示的轻链可变区氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列。
20.一种药物组合物，包含权利要求18所述ADC和药学上可接受的赋形剂。
21.一种治疗对象的癌症的方法，包括向所述对象给予治疗有效量的权利要求20所述药物组合物。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述药物组合物的给予与批准用于人的其它ADC的给予相关的周围神经病变的减少相关。
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