CN1195774C - 新的hev抗原肽及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高度免疫反应性的病毒肽pE2，其来自戊型肝炎病毒(HEV)基因组ORF2区羧基末端的区域。新pE2肽的独特特征在于其具有构象型抗原决定簇。所述抗原决定簇仅在该肽单体与另一单体通过非共价相互作用结合，天然形成同型二聚体时才暴露。已证明新pE2肽与来自患有或过往感染HEV的患者血清有高反应性，提示该同型二聚体可模拟HEV衣壳蛋白的某些结构特征。此外，pE2肽的抗原活性本质上是严格构象限制性的，因此仅当肽以二聚形式存在时才显示免疫化学活性。因此，一旦二聚体解离则抗原活性丧失，但当单体重新结合成二聚体后活性恢复。此外，还公开了用于检测和诊断HEV感染的诊断方法，以及有效防止戊型肝炎病毒感染的疫苗组合物，其中利用了该新型pE2肽。
Description
本发明涉及克隆自戊型肝炎病毒(HEV)中国株基因组的、具高度免疫反应性的病毒肽pE2，以及它在为HEV的检测和诊断而研制的可靠诊断方法方面的应用，以及在预防人类HEV的疫苗组合物中的应用。
发明背景
戊型肝炎病毒(HEV)首次发现于1983年，它引起肠道传播的肝炎(Balayan等人，1983)。1991年，病毒的全长基因组首次获得克隆及测序，发现它是一条单股正链有义无包膜的RNA(Tam等人，1991)。虽然HEV在形态上与杯状病毒科的成员相似(Bradley等人，1988；Huang等人，1992；Panda等人，1989)，但其具有独特的基因组组成(Berke等人，1997)。基于序列分析，推测7.2kb的病毒基因组包含三个开放读码框架(ORF)(图1)(Tam等人，1991；Aye等人，1992；Aye等人，1993；Huang等人，1992；Reyes等人，1993)。非结构病毒蛋白由位于病毒基因组5’端的ORF1编码成多聚蛋白质。ORF2位于基因组的3’端，编码一个主要结构蛋白质。ORF3的5’端有一个碱基与ORF1的3’端重叠，3’端有339个碱基与ORF2的5’端重叠。ORF3被认为编码另一功能尚未知的结构蛋白质。通过表位作图和重组肽研究，表明线性抗原表位位于ORF2和ORF3(Coursaget等人，1993；Khudyakov等人，1993；Khudyakov等人，1994)。
最近的研究表明，来自ORF2区域的主要HEV结构蛋白的氨基端和羧基端的截短的重组多肽能自组装成病毒样颗粒(Li等人，1997)。虽然体积较小，这些病毒样颗粒在形态和抗原性方面与感染病毒的衣壳蛋白相似(Li等人，1997；Xing等人，1999)。基于这些发现，表明重组肽装配成病毒样颗粒与全长HEV结构蛋白装配成感染病毒颗粒的大衣壳具有相似的必要条件。很显然，这些发现提示仅仅是ORF2编码的结构蛋白可能已经足够自组装成病毒衣壳。而且显示涉及衣壳蛋白自身形成的相互作用可能发生在全长ORF2蛋白的112至608氨基酸残基区域内(Xing等人，1999)。位于主要结构蛋白氨基端的111个氨基酸序列，等电点高达12.35，被认为涉及病毒基因组的包装(Briton和Heinz，1990)，但是这一区域显然不直接参与病毒衣壳自身的组装。主要结构蛋白的羧基端同样不直接参与病毒衣壳的组装，但是Li等人(1997)已显示这一区域的蛋白切割是病毒样颗粒组装的关键。
戊型肝炎主要发生于发展中国家，有流行和散布发生两种形式。几次大的戊型肝炎暴发发生于1950年代到1980年代，由粪便污染的饮用水而引起(Visvanathan，1957；Wong等人，1980；Myint等人，1985；Belabbes等人，1985；Hau等人，1999)。感染通常是自我限制的，但是也有在怀孕期间发生感染而产生严重并发症的报道(Tsega等人，1992；Dilawari等人，1994；Hussaini等人，1997)。用于防止病毒感染的一个重要的预防策略就是环境样品的监控和检测，以保证公共卫生安全和环境保护。但是目前用于采集和浓缩病毒颗粒的传统方法具有几个众所周知的缺点，限制了潜在来源的HEV的调查和发现。目前最通用的两种方法是吸附法和离心法。
在吸附法中，首先将测试样品吸附于微孔滤膜而浓缩病毒，然后用大体积的洗脱液进行洗脱。但是这种技术同时也有效地浓缩了一些别的溶解物，如腐殖酸和蛋白质，它们可能干扰病毒的检测。特别是，很多天然产生的无机和有机溶质抑制用于扩增靶基因组的核酸聚合酶(如反转录酶和Taq聚合酶)(Tsai等人，1992；1993)。存在于测试样品中的核酸酶和蛋白酶可能在扩增病毒基因组之前而使之降解，因此而产生模棱两可的结果。此外，多种蛋白质、糖类和其它有机化合物可能结合镁离子和核苷酸，而这些是核酸聚合酸发挥适当功能所必须的，而且其它溶质可能存在毒性影响，可能彻底破坏这些聚合酶的活性(Demeke和Adams，1992；Lmai等人，1992；Kolk等人，1992)。
在离心法中，将测试样品匀浆，然后重复离心。在处理过程中，将聚乙二醇(PEG)加入到上清液中然后再离心。最后的沉淀重悬于缓冲液中，但是最终的浓缩物仍然含有有毒物质，这些有毒物质可能干扰诊断方法的后续步骤，如细胞培养、反转录和聚合酶链式反应(Beril等人，1996)。因此，必须通过葡聚糖凝胶过滤对来源于测试样品的浓缩物进行脱毒。
用于防止病毒感染的另外一种重要策略就是应用疫苗产生抗HEV的免疫，以保证公共卫生安全和保护。但是迄今不可能用活的减毒的或杀死了的病毒颗粒来制备疫苗，防止HEV感染，因为在培养细胞中繁殖病毒有很大的困难。作为另一种解决的方法，已证明一些重组HEV多肽，特别是那些来源于病毒基因组结构基因的重组HEV多肽，更有希望提供保护而防止感染HEV(Tsarev等人，1994a；Tsarev等人，1997)。与减毒病毒相比，用重组多肽制备疫苗的优点在于，多肽可以更为有效地生产而且易于纯化。而且，产生的疫苗不可能带有任何活的完整病毒颗粒，因此避免了潜在的感染危险。
综上所述，始终需要一种检测和诊断HEV的可靠方法，其不仅避免前面所述的缺点，又能为生物和环境样品的HEV检测提供一种更为灵敏的分析测定。根据本发明，提供了一种诊断方法，该方法使用一种具有高度抗原反应性的重组病毒肽pE2，该肽来源于戊型肝炎病毒(HEV)基因组的ORF2的羧基末端区域，已证明该多肽与正在感染或感染过HEV的病人的血清有很高的反应性。另外，pE2肽的部分氨基酸序列在其它HEV分离株中高度保守，从而与戊型肝炎病毒具有抗原相关性。正如本发明所描述及进一步说明的，pE2肽的抗原特性使它成为HEV感染的免疫和预防疫苗的极佳候选者。相应地，本发明提供应用新的pE2肽检测HEV感染的诊断方法，以及包含pE2肽的有效预防HEV感染的疫苗组合物。
发明概述
本发明的一个目的是提供一种戊型肝炎病毒(HEV)肽pE2，由于其存在的构象型抗原决定簇只有当pE2单体二聚化形成同型二聚体的时候才暴露出来，因此与感染了戊型肝炎病毒的个体的血清有高度的免疫反应性。
本发明的另一个目的是提供一种改进的、更为可靠的诊断方法，通过检测临床或生物测试样品中的IgM和IgG抗体来测定现在的以及过去的HEV感染。因为pE2二聚体结合HEV抗体的高度特异性和敏感性，其中掺入了pE2二聚体为一种免疫试剂。
本发明的另一个目的是提供一种监测和检测公共卫生和环境研究的、改进的以及更可靠的诊断方法，该方法用针对pE2二聚体的高度特异性的抗体，能有效地捕获、分离和浓缩测试样品中的HEV颗粒，避免了其它传统方法的缺点。
本发明的另一个目的是提供一种疫苗组合物，其中包含pE2二聚体，其用途在于HEV感染的免疫和预防。
如表1所示，虽然不同HEV分离株之间的核苷酸同源性在77％至100％之间，这些突变在自然界中通常是保守的，其氨基酸序列具有高度同源性。HEV不同分离株之间显示的HEV基因组保守性提示(1)pE2肽可能是HEV结构蛋白的一个重要的功能域；(2)掺入pE2肽的诊断测试在检测HEV不同分离株时可能具有优越性；(3)由pE2肽制备的疫苗可能对不同的HEV分离株都具有保护性。
表1 HEV主要结构蛋白的一个保守区域
序列同源性(％)
毒株 区域 核苷酸 氨基酸 参考文献
D11092 中国 100 100 Aye等人，1992
D10330 中国 92.6 98.6 Aye等人，1993
L25547 中国 94.1 99.5 Yin等人，1994
M73218 缅甸 92.9 100 Tam等人，1991
M74506 墨西哥 78.2 94.3 Purdy等
人，1999
M80581 巴基斯坦 98.3 100 Tsarev等
人，1992
M94177 中国 98.6 99.5 Bi等人，1994
X98292 印度 89.7 99 Donati等
人，1997
M74506 墨西哥 78.2 94.3 Huang等
人，1992
AF035437 美国 76.7 92.9 Schlauder等
人，1998
根据本发明，提供了一种具高度免疫反应性的病毒肽pE2，其来源于戊型肝炎病毒(HEV)基因组的ORF2的羧基末端区域，包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。pE2肽的一个特殊特征是它拥有的构象型抗原决定簇，只有在肽的单体间非共价相互作用而自然形成同源二聚体后才暴露出来。而且，本发明提供这个高度免疫反应性的结构性pE2肽的克隆和表达，以及其纯化和特性的描述。
本发明涉及的HEV肽，pE2，来源于上述HEV主要结构蛋白的区域，该主要结构蛋白直接参与病毒衣壳的组装。从ORF2核苷酸序列的羧基区域翻译出来，pE2肽最初有267个氨基酸残基，在长度上与全长蛋白的羧基端区域一致。基于相似的多肽图谱研究(Khudyakov等人，1993；Khudyakov等人，1994)，认为在多肽的氨基和羧基端都有线性表位。但是，在克隆序列中的移码突变导致在原来cDNA序列的上游出现一个新的终止密码，而使翻译提前终止，产生一个只有213个氨基酸残基长度的小肽(图2)。
pE2肽的性质研究表明，在其羧基端的截短有效地去除了抑制病毒样颗粒自组装的羧基区域。其结果是pE2肽单体之间通过二聚体化而相互作用，因而天然产生了同型二聚体。pE2肽的二聚体形式被HEV反应性人血清强烈识别，提示同型二聚体可能模拟了HEV衣壳蛋白的某种结构特征。因此，pE2肽的二聚体化而带来的构象型抗原决定簇使其与其他研究者报导的细菌表达的HEV多肽区别开来(Yarbough等人，1991；Purdy等人，1992；Li等人，1994；Li等人，1997)。以前报道的HEV多肽的抗原活性主要在于它们各自的一级结构的线性表位，而本发明的pE2肽的抗原活性主要与同型二聚体的四级结构相关。相应地，pE2肽的抗原区域明显不同于上述存在于ORF2区域的氨基端的线性表位，因为以前从未有过类似的构象型抗原决定簇的描述或多肽图谱推测。
如本文证明及描述，在新的pE2肽中存在两种不同类型的抗原活性。第一种类型的抗原活性与pE2肽的单体形式相关，它与迄今为止描述的其它细菌表达的HEV抗原多肽具有相似的活性类型(Yarbough等人，1991；Purdy等人，1992；Li等人1994)。这种类型的抗原活性主要来自于位于各种多肽一级结构的线性表位，其活性可能受到各种多肽在水溶液中不同构象如二级和三级结构的影响(Li等人，1997)。但是pE2肽的第二种也是更突出的抗原活性是与多肽的二聚体形式相关，而且发现它比其单体形式具有更高的免疫反应性。实验研究表明，pE2二聚体与HEV人的血清的抗体反应水平通常比pE2单体的反应水平高很多。这种新型的抗原活性，到目前为止未见报道，其抗原活性主要在于pE2同型二聚体的新的构象型抗原决定簇。而且，当二聚体解聚时其抗原活性下降，一旦单体重新形成二聚体，其活性亦得到恢复。这种行为表明与构象型抗原决定簇相关的抗原活性，与pE2二聚体的形式或四级结构相关，而pE2二聚体或四级结构是来自pE2单体之间的非共价相互作用形成的同型二聚体。
E2的DNA序列
根据本发明的一个方面，提供一种纯化的核酸分子E2，编码构象型肽pE2，包括其cDNA序列(见SEQ ID NO：1)，以及其它任何同源的序列或片段。
E2核苷酸序列最初分离自戊型肝炎病毒(HEV)中国株D1 1092的HEV基因组的ORF2区域的羧基末端(图2)。最初克隆的序列包含811个碱基对长度，分布于6326至7136位核苷酸之间，在7127-7129位带有一个终止密码，在6957位包含一个单碱基对的无意删除，推测是由PCR扩增错配引起(图2)。结果导致移码突变使得核苷酸序列的翻译在一个新的终止密码(位于6966-6968)处提前终止。核苷酸序列的翻译导致产生和发现了新的pE2肽和新的E2核苷酸序列(即SEQ ID NO：1)，编码区包括642个碱基对。相应地，参照图2，新的E2核苷酸序列位于6326-6968位碱基，其中位于新的终止密码下游即6968位之后的序列片段被去除，在6957位发生了一个单碱基对删除。
本领域技术人员知晓由于遗传密码的简并性，不只一个密码可编码序列SEQ ID NO：2(即E2)的任何一个氨基酸残基，因此除了序列SEQ ID NO：1(即E2)之外，还可以产生很多种不同的核酸序列，它们同样编码pE2肽。相应地，本发明包括任何一种核苷酸序列的突变型，这些突变型可以基于可能的密码子选择而合成，还包括SEQID NO：1的互补核苷酸序列。这些化合物根据标准的三联体遗传密码制备，如同pE2肽核苷酸序列所用的标准的三联体遗传密码，所有这些突变型都认为被特别公开。
而且，可被制备的多种pE2肽衍生物或抗原性等同物，包括例如各种替换、插入、删除或延长，其最终结果不改变pE2肽的免疫反应性。因此，编码具pE2肽免疫学活性衍生物的核苷酸序列也是本发明的一部分。制备这些衍生物的方法可能很容易地通过任何本领域的普通技术而实现(Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室印刷，Plainview，NY，1989)。根据本发明，编码pE2肽或抗原性等同物质的氨基酸序列的任何核苷酸序列，能够用于产生表达pE2的重组分子。
pE2氨基酸序列
根据本发明的另一方面，提供一种构象型的HEV多肽抗原pE2，包括一种SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者其同源序列、片段、或其类似物。
已知确定一种多肽三维结构的信息完全存在于其氨基酸序列。而且，包含决定特异构象性表位氨基酸的序列各部分可能广泛地分散在整个分子中，之间为间隔序列。基于推测的多肽的三级(和四级)结构，构象型表位的三维坐标因为多肽一级结构的三维折叠而最终形成其正确结构。相应地，预计氨基酸序列可以进行一定程度的、基于多肽结构组织高水平的改造，这种改造基本上不会改变多肽的构象型结构和免疫化学反应性。因此，位于决定不同表位的残基基团之间的多肽片段即这些间隔序列，其内部的延伸、删除、插入、残基替换，可能不会显著改变表位的形成。
此外，根据一种序列包含的氨基酸残基的化学特性决定一个特殊的表位，用具有相似功能基团的残基替换可能不会改变多肽的免疫化学反应性。考虑到这点，预计只要pE2肽的免疫化学反应性保留，仍然能被抗pE2抗体识别，氨基酸序列中的多种氨基酸可以被删除、插入或用其它氨基酸残基替换，而得到衍生物。当然这是假设组合的特殊改变在其应用上提供了优越性，如涉及不同的HEV分离株(表1)之间的株与株之间差异。此外，本发明范围预期的氨基酸替换指那些替换残基的化学性质与原来的氨基酸相似。基于其功能基团，一般认为氨基酸有相似的化学特征，因此包括组合如：Gly/Ala；Asp/Glu；Asn/Gln；Val/Ile/Leu；Ser/Thr；Lys/Ary；和Phe/Tyr。这些pE2肽衍生物可能还包括SEQ ID NO：2决定的氨基酸序列的延伸、替换、插入和/或删除，只要它们对HEV抗体的免疫化学反应性保留。当多肽能被抗pE2肽的相同抗体所识别，亦可认为二者有相同的免疫化学反应性且在本发明的范围内。
pE2肽的制备
本发明的pE2肽通过本领域已知的方法产生，并提供目的蛋白的构象型表位，这些方法包括化学合成法和重组DNA技术。制备pE2肽的优选方法是在一种宿主细胞中表达重组DNA，然后分离纯化多肽。根据本发明，编码pE2肽、多肽片段、融合蛋白或其它功能等同物的核苷酸序列，可能用于重组DNA分子，并在合适的宿主细胞中指导pE2肽的表达。为了表达一种具免疫学活性的pE2肽，编码pE2的核苷酸序列(即SEQ ID NO：1)，或编码其功能等同物的核苷酸序列，被插入到一种合适的表达载体，此载体带有插入编码序列转录和翻译所必需的元件。根据所选择的宿主细胞，表达载体一般含有影响DNA序列表达的DNA调控元件，通常包括一种启动子、核糖体结合位点、翻译起始和终止位点，以及转录终止位点。
因此根据本发明的另一方面，提供一种本发明制备pE2肽的方法，包括从HEV基因组中分离cDNA序列，将此cDNA序列插入到一种能在合适的宿主细胞中进行表达的表达载体，然后用表达载体转化宿主细胞，培养转化了的宿主细胞，以及分离和纯化pE2肽。
对本领域技术人员而言众所周知的方法，可用于构建含有pE2编码序列的表达载体，以及合适的转录或翻译调控元件。上述获得的目的cDNA序列可以用已知及标准的技术插入到一种表达载体(Sambrook等人，1989 and Ausubel等人，1989)。表达载体通常用限制性内切酶切割，cDNA序列用平端或粘端连接插入。通常是在表达载体的方便位置的限制性位点进行切割，一旦插入，该cDNA序列即位于影响其表达的cDNA功能元件的控制之下。宿主细胞的转化和培养以及多肽的分离也可以用标准的技术进行。
在细菌系统中，可以根据要表达的目的多肽或蛋白来选择多种表达载体。例如，当需要表达大量的多肽或蛋白用以产生抗体时，需选择能达到高的融合蛋白表达水平且易于纯化的载体。根据本发明的相关方面，提供一种带有E2核酸序列(如SEQ ID NO：1所示)表达载体，该核酸序列编码pE2肽，该载体能表达E2核酸序列。该表达载体适于在一种细菌系统中表达，以大肠杆菌为佳，包括但不限于多功能的大肠杆菌克隆和表达载体pGEX(Promega，Madison，威斯康星州)。在这个特殊的载体中，pE2编码序列在其5’端被符合读框地连接到载体中谷胱甘肽S转移酶(GST)异源序列的3’端，得到的杂合多聚核苷酸序列表达为融合蛋白。通常，这种融合蛋白是可溶性的，而且通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠，然后用自由谷胱甘肽洗脱而从裂解细胞中纯化出来。这种系统制备的蛋白被设计成包含了剪切位点，因此克隆的目的多肽可能通过加入合适的蛋白酶如凝血酶而从GST部分释放出来。
因此，根据本发明的优选实施方案，提供一种表达融合蛋白GE2的质粒，GE2包括HEV肽pE2(序列为SEQ ID NO：2)，其融合于谷胱甘肽S转移酶(GST)多肽。将E2核酸序列(SEQ ID NO：1所示)插入一种pGEX20表达载体，使E2核苷酸序列的开放读码框架与GST的开放读码框架相符合。本发明的质粒包括位于6326-7136位的811个碱基对的序列(图2)，终止密码位于7127-7129位。但是，推测由于PCR扩增错误引起的在6957位的单一碱基对的删除，导致移码突变，引起核苷酸序列的翻译在一新的终止密码子(6966-6968位)处提前终止，结果产生新的pE2肽。相应地，这一新的E2序列分布于6326-6968位，在6957位有一单碱基对删除，在6968位之后、新终止密码下游的片段被去除(图2)。克隆的E2序列编码新的pE2肽，有642个碱基对，其序列确定为SEQ ID NO：1。
GE2蛋白
分离的GE2融合蛋白质，含有完整的、融合于全长GST多肽的pE2肽，共约92kD。但是，本发明的GE2融合蛋白质可以含有pE2肽的较小部分，该部分仍具有免疫原性，因此GE2融合蛋白质预计可以小于92kD。本文描述的融合蛋白质GE2，在pE2氨基酸序列和GST或异源物、蛋白序列之间含有一个剪切位点，将融合蛋白结合于谷胱甘肽葡聚糖4B柱，再用凝血酶剪切，使得pE2肽从异源物中纯化出来。而且，除了纯化和表征目的，GE2多肽也用于在合适的宿主细胞中指导和确证pE2肽的表达，以及制备针对pE2肽表位的特异多克隆抗血清或单克隆抗体。反过来，用分离的GE2多肽免疫哺乳动物制备的多克隆抗血清或单克隆抗体，有利于测定生物学测试样品中HEV颗粒的存在。
pE2作为一种诊断试剂
此处提供的构象型pE2肽可以在诊断测定中用作免疫试剂，用于筛选生物学测试样品中的HEV抗体的存在，帮助从业者或临床医生检测或诊断HEV感染。相应地，本发明提供用pE2肽检测生物学测试样品中抗HEV抗体的免疫化学方法。本质上，可以应用任何一种免疫检测形式，其设计都是用pE2作为一种捕获抗原来检测抗HEV抗体。进行免疫检测的方法在本领域是众所周知的，本发明不限于任何一种特定的免疫测定。可以用于均相和非均相免疫测定。
通常而言，怀疑带有HEV抗体的生物学测试样品与pE2肽接触，并在允许反应发生的条件下孵育一段时间。pE2肽最好连在一种合适的固相支持物上。如果HEV抗体存在于测试样品中，它们将与pE2肽形成一种免疫学复合物(抗原-抗体复合物)，并连在固相支持物上。可以选择用缓冲洗涤液洗涤固相支持物，去除任何未结合的成分，这样在一定程度上可以帮助提高检测的敏感度。洗涤之后，免疫学复合物与一种指示试剂反应，并在第二种复合物形成的条件下孵育一定时间。免疫学复合物可以用任何一种已知的技术检测，依测定形式的不同而异。例如，一种抗哺乳动物免疫球蛋白与一种标记或产生信号的成分(如一种酶)的偶联物通常用作指示剂。免疫学复合物的存在证明了测试样品中抗HEV抗体的存在，并通过检测产生的信号而确定。对很多种指示剂而言，抗体存在的量通常与产生的信号成比例。测试样品中免疫复合物的存在可以直观地或机械地检测，如用自动化扫描和解释装置。
合适的固相支持物将依赖于所采用的免疫检测形式的类型，但是期望选择的支持物类型有合理的强度而且不会干扰免疫学复合物的免疫反应性，也不会从产生信号的成分中产生出可检测的信号。固相支持的例子包括微孔反应板的壁、试管、薄片(sheets)、平板、载玻片、珠子(如聚苯乙烯或玻璃)、硝酸纤维条或膜、小颗粒如乳胶颗粒、玻璃或塑料芯片，以及其它。
用于检测一种免疫复合物形成的标记或产生信号的成分，将允许通过沉淀的产生或颜色变化而进行直观检测，也可以通过显微镜直观检测，或者通过光谱测定、放射测定而自动检测，或者类似的检测方法。产生信号的成分的例子包括胶体金、荧光化合物、发光化合物、一种染料、放射性元素、酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β半乳糖苷酶)以及增强化合物(如生物素、抗生物素和亲和素)。
相应地，本发明的另一方面提供一种生物测试样品中HEV抗体的诊断或检测方法，包括以下步骤：
●提供一种pE2肽，其包括由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或同源序列、片段或其类似物，其特征在于pE2肽被优选地固定于一种固相支持物上；
●在允许pE2肽和抗HEV抗体之间形成免疫复合物(抗原-抗体)的条件下，使pE2肽与生物学测试样品接触并孵育；
●可能地从得到的混合物中去除未结合的成分；
●将得到的混合物与一种指示剂孵育；
●检测混合物以确定免疫学复合物的存在，由免疫学复合物的形成表明测试样品中抗戊型肝炎病毒(HEV)抗体的存在。
抗pE2肽抗体的产生
本文所描述的方法和实例进一步证明，因为pE2肽呈现出的高度免疫化学反应性，与pE2肽特异反应的抗体可以通过本领域公知的技术产生。因为本发明的pE2肽的构象型抗原决定簇模拟了HEV衣壳蛋白的相似结构特征，pE2肽可用于产生多克隆和单克隆抗体。而且，这些针对pE2肽的抗体或其它片段，作为有价值的免疫试剂，可通过分离和筛选病毒颗粒和/或抗原而证明HEV感染，在诊断测试的研究中有重要用途。因此，抗pE2抗体可用于很多临床诊断程序，包括传统的在生物学样品中检测HEV抗原存在的免疫检测方法，以及小样品中HEV病毒颗粒可被分离和浓缩的免疫捕获法。(Harlowand Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，1988，Cold SpringsHarbor Laboratory Press)。
如果期望得到针对本发明pE2肽的多克隆抗体，则将肽注射到一种选择的非人的哺乳动物宿主(如小鼠、大鼠、绵羊、兔、山羊，等)中，肽最好与一种载体偶联以提高免疫反应，将产生的抗体进行回收和纯化。根据本发明的优选实施方案，哺乳动物用上述带有HEV构象表位的GE2多肽免疫。GE2多肽是以一种可注射的制剂形式施用，因此GE2是与一种生理学上可接受的稀释液混合。佐剂，如福氏完全或不完全佐剂，可以包括在制剂中。制剂注射到宿主后，经过一段合适的时间，在合适的间隔期采集血浆样品以检测HEV病毒的抗体。当获得合适水平的活性时，采集宿主的全血。然后用标准程序如免疫亲和层析，从血浆中回收及纯化抗体。
虽然优选本发明的多克隆抗体，带有多种单克隆抗体的系统，其功能与多克隆抗体系统相同，也在本发明的范围内。针对HEV构象型表位的单克隆抗体也能够由本领域的技术人员容易地用本发明的GE2多肽产生。用永生的产生抗体的细胞系一通常叫作杂交瘤，产生单克隆抗体的一般方法是从所周知的。杂交瘤可以通过融合产生抗pE2抗体的细胞与一种永生的细胞而产生，永生的细胞赋予杂交细胞以长期组织培养的能力。在杂交细胞的形成中，第一融合伴侣--产生抗体的细胞，可以是一种接种了GE2多肽的非人的哺乳动物宿主(如大鼠或小鼠)的脾细胞。 经过足够的时间，当宿主达到高水平的抗体反应时，摘除产生抗体的细胞。一种永生化的细胞系(如大鼠或小鼠的骨髓瘤细胞系)的细胞，与产生抗体的细胞融合，接下来进行融合筛选以识别一种细胞系如杂交瘤，能分泌期望的单克隆抗体。产生抗体的细胞与永生细胞的融合可以用标准的程序完成(Kohler and Milstein，(1975)Nature(London)256，495-497；Kennet，R.，(1980)in Monoclonal Antibodies(Kennet等人，Eds.pp.365-367，Plenum Press，NY)。融合细胞系可以进行培养，从培养液中筛选和纯化抗pE2的单克隆抗体与回收多克隆抗体具有相似的方法。
此外，根据本发明的另一方面，提供一种产生抗HEV抗原的纯化抗体的方法，其中具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的构象型HEV肽pE2，或者同源序列、片段或其类似物以有效剂量被注射到一种非人的哺乳动物宿主中，收集产生的抗体。在本发明的优选实施方案中，包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的重组融合蛋白GE2，被注射到非人的哺乳动物宿主中以产生期望的抗体。
抗pE2抗体用作捕获试剂
用本发明的pE2肽产生的单克隆或多克隆抗体，可以作为捕获试剂用于免疫测定中，以检测生物学测试样品中HEV衣壳蛋白或病毒颗粒的存在。本质上，可以使用任何一种免疫测定方式，其设计中都运用了抗pE2抗体作为捕获试剂。进行免疫测定的方法在本领域从所周知，本发明不限于任何一种特殊的免疫测定。
通常，因为本发明的pE2肽的构象型抗原决定簇模拟了HEV衣壳蛋白的结构特征，抗pE2抗体可以用于免疫捕获方法来分离和浓缩HEV病毒颗粒，然后可以通过提取病毒的RNA及运用反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)而检测到病毒的存在。根据本发明的优选实施方案，免疫捕获方法是用于分离和浓缩HEV病毒颗粒，因此抗pE2肽的抗血清被包被在聚苯乙烯片或者其它合适的固相吸附材料上。在检测测试样品中的小量病毒时这一方法效果很好，通过提取病毒RNA，之后立即进行RT-PCR，最好是巢式聚合酶链反应以确定病毒的有无。
合适的固相支持物或吸附材料将依赖于所采用的免疫测定形式的类型，但是期望选择的支持物类型有合理的强度而且不会干扰免疫学复合物的免疫反应性。固相支持的例子包括微孔反应板的孔壁、试管、薄片、平板、载玻片、珠子(如聚苯乙烯或玻璃)、硝酸纤维条或膜、小颗粒如乳胶颗粒、玻璃或塑料芯片，以及其它。相应地，本发明的另一方面提供一种在生物学测试样品中检测HEV病毒颗粒(即分析物)的方法，包括以下步骤：
●提供一种抗pE2肽(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)或同源序列、片段或其类似物的纯化抗体，其特征在于抗pE2抗体被优选地固定于一种固相支持物上；
●在允许抗pE2抗体和任一HEV分析物(可能存在于测试样品中)之间形成免疫复合物的条件下，使抗pE2抗体与生物学测试样品接触并孵育；
●可能地从得到的混合物中去除未结合的成分；
●测定混合物以确定HEV分析物的存在与否。
诊断检测试剂盒
本文描述的新的HEV肽pE2或抗pE2抗体一般以诊断试剂盒的形式包装，用于HEV感染的检测和诊断。试剂盒通常包括作为免疫试剂的pE2肽或抗pE2抗体，分装在分开的容器中。而且，根据使用的免疫试剂和被检测的HEV分析的类型，试剂盒可能附带阳性和阴性对照样品、一种指示剂如标记的抗人抗体，如果标记不直接产生一种信号则附带产生信号的试剂(如以酶标记则为酶的底物)。如本文所述，术语”分开的容器”是指任何材料，能够在其中装固定量的本发明的pE2肽或抗pE2抗体，以及其它诊断试剂盒中提供的成分。试剂盒中通常还包括进行测定的说明书。这些说明书一般描述免疫试剂的浓度，或者至少一种测定方法参数，如需混合的免疫试剂和样品的相关量、免疫试剂和样品混合的时间长度、温度、缓冲液条件及类似内容。
如果需要，本发明的pE2肽或抗pE2抗体一般可以通过被动吸附或共价偶联而固定到一种固相支持材料上，其中可采用的很多技术对本领域的技术人员而言是公知的。一种合适的支持物依赖于所进行的免疫测定形式的类型，但是期望选择的支持物类型有合理的强度而且不会干扰免疫学复合物的免疫反应性，也不会从产生信号的成分中产生出可检测的信号。固相支持的例子包括微孔反应板的孔壁、试管、薄片、平板、载玻片、珠子(如聚苯乙烯或玻璃)、硝酸纤维条或膜、小颗粒如乳胶颗粒、玻璃或塑料芯片，以及其它。
指示剂应该包括一种标记或产生信号的成分，能够通过本发明的免疫试剂和捕获的HEV分析物指示免疫复合物的形成。诊断试剂盒中的指示剂可以以液体分散的溶液形式提供，或者是干粉，例如以一种冻干的形式。当指示剂是用一种酶作为产生信号的成分，在诊断试剂盒的分开的容器中可以提供酶的底物。而且，用于检测一种通过抗原抗体结合引起的免疫复合物形成的标记或产生信号的成分，将允许通过沉定的产生或颜色变化而进行直观检测，也可以通过显微镜直观检测，或者通过光谱测定、放射测定而自动检测，或者类似的检测方法。产生信号的成分的例子包括胶体金、荧光化合物(如荧光素和罗丹明)、发光化合物、一种染料、放射性元素、酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β半乳糖苷酶)以及增强化合物(如生物素、抗生物素和亲和素)。
作为一检测HEV抗体的试剂盒的例子，本发明的预先测定的一定量的pE2可以固定到反应条的微孔中，从而能够通过免疫反应结合将要加入的HEV抗体。指示剂可以是标记的哺乳动物抗人抗体，它将识别并结合到任何一种可能存在于测试样品中的HEV抗体。标记的哺乳动物抗人抗体可以用一种酶作为产生信号的成分，如酶不直接产生信号则附带提供酶的底物。
疫苗
目前因为HEV病毒不能成功地在培养中增殖，也就不可能产生减毒的HEV疫苗。现在发展的候选疫苗是由真核表达产生的主要结构蛋白的重组多肽(Tsarev等人，1993a；Tsarev等人，1994a)。与减毒病毒相比，在疫苗组合物中使用重组多肽的优点在于，多肽的生产更为有效而纯化更为方便。此外，得到的疫苗不可能带有任何完整的病毒颗粒，因此避免了感染的危险。
已发现pE2肽的二聚体形式比它的单体形式具有更强的免疫原性。在一个实验研究中，抗血清由pE2肽免疫后得到，针对二聚体的抗体反应水平基本上高于针对单体的抗体反应水平。而且不象HEV反应的人血清存在HEV抗体特异性的广谱性，pE2抗血清具有HEV抗体特异性的限定谱。但是值得注意的是，pE2抗血清能够识别和结合HEV颗粒，已证明它们能够影响病毒免疫捕获的有效性。建立在pE2肽的二聚体形式和病毒之间的抗原相互关系在于，pE2二聚体模拟了病毒衣壳的某种结构特征，使它在形态上和抗原性上与HEV衣壳蛋白相关。相应地，很有可能戊型肝炎病毒衣壳和pE2肽共享某种共同的抗原决定簇，特别是与pE2肽二聚体形式相关的新的构象型抗原决定簇。这一论点与多肽的二聚体形式通常被HEV反应的人血清强烈识别的发现相吻合。
根据pE2同型二聚体在结构上和抗原性上与HEV衣壳蛋白相关，使得细菌表达的多肽可作为抗HEV感染的潜在疫苗。而且，不同HEV分离株(表1)的HEV基因组之间保守性进一步提示虽然pE2肽是来自于一中国分离株，也同样可能针对其它HEV分离株提供保护，包括最近从墨西哥和美国分离的遗传变化最大的分离株。
此外，根据本发明的另一方面，提供一种疫苗组合物，其包括pE2肽，序列如SEQ ID NO：2所示，或者同源序列、片段，或其类似物，以及药学上可接受的载体，其在免疫接种后保护哺乳动物抵抗HEV的攻击。
而且，也提供疫苗的应用，其用来免疫个体以抵抗戊肝病毒的感染，其中疫苗包括pE2肽的免疫学有效剂量，以及药理学上可接受的载体。药理学上可接受的载体对本领域的一般技术而言是众所周知的(Amon，R.(Ed.)合成疫苗1：83-92，CPC Press，Inc.，BocaRaton，Fl.，1987)，包括适于作为载体的液体媒介来介导肽进入病人体内，但其本身不应引起对接受此成分的个体有害的抗体的产生。盐溶液是这类液体媒介的一个例子。此外，疫苗组合物可能还含有一种佐剂，用于刺激免疫反应而增强疫苗的效果。
“免疫学有效剂量”是指以单剂量或者是一系列中的一部分的形式，向受试者施用，如上定义，这一施用对治疗而言是有效的。这个量依不同情况而异，如需治疗的个体的健康和身体条件，个体的不同种类(如非人哺乳动物、灵长类动物等)，个体的免疫系统合成抗体的能力，需达到的保护程度，疫苗的组成，感染的HEV的株系，以及其它相关因素。可以预计这一剂量将位于一个相当广泛的范围，可以通过日常试验而确定。
通过任何一种方便的疫苗给药方法，包括口服和非肠道(如静脉内、皮下或肌肉内)注射，本发明的疫苗都可以施用。治疗由单剂量的疫苗或在一段时间内的多剂量组成。
这些以及其它赋予本发明新颖特征的优点和特点，在后面的权利要求中特别指出，并形成了关于此点的一部分。为了更好地理解本发明、其优点以及应用达到的目的，可以参考随后的图和描述性的材料，其中有阐明和描述本发明的优选实施方案。
虽然任何与本文描述相似或等同的方法和材料可以用于实践或测试本发明，下面描述优选的方法、设计以及材料。
附图简述
关于下面的描述，发明将借助伴随阐明本发明优选实施方案的数据进行详细解释。
图1说明HEV基因组内部的开放读码框架ORF1、ORF2、ORF3的基因组结构，以及pE2和pE3肽的编码区的大约位置。
图2A-2D提供中国HEV株(DDBJ Accession No.D11092)的核苷酸序列以及来源于此的E2片段；方框处示单碱基对删除。
图3提供中国HEV株(DDBJ Accession No.D11092)ORF3的核苷酸序列和来源于此的E3片段。
图4提供由E2编码的pE2肽的氨基酸序列。
图5提供由E3编码的pE3蛋白的氨基酸序列。
图6显示带有HEV基因组序列的重组质粒的特征。用BamHI和EcoRI消化重组质粒pGEX20分别得到一个821bp的插入片段，其包含HEV基因组ORF2序列的810bp(泳道2)，和一个124bp的插入片段，其包含HEV基因组ORF3的114bp的序列(泳道3)。分子标记用以比较这些产物的分子量(泳道3)。
图7显示表达自ORF2的纯化HEV重组多肽的特征。(A)SDS-PAGE和(B)用GST特异的抗血清进行Western印迹和(C)混合人HEV反应的人血清，用于分析纯化的pE2融合蛋白GE2(泳道1和2)、pE2肽(泳道3和4)和谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白(泳道5)。另外，GE2和pE2肽样品先加热到100℃3分钟，再用SDS PAGE(A)和Western blotting(B和C)进行分析(泳道2和4)。分子标记用以比较这些产物的分子量(泳道6)。
图8显示表达自HEV基因组ORF3的GST融合多肽GE3的特征。(A)PAGE和(B)用GST特异抗血清的Western印迹和(C)混合人血清，用于分析GE3多肽(泳道1)和经100℃加热3分钟的GE3多肽(泳道2)以及GST(泳道3)。分子标记用以比较这些产物的分子量(泳道4)。
图9显示pE2二聚体的抗原活性强度大约是pE2单体抗原活性的80倍。如下面图10所描述的，加热和未加热的纯化pE2的等体积样品中，蛋白梯度含量从1.3ng到1360ng，用混合HEV反应性人血清以1∶200稀释进行Western印迹分析。通过混合血清检测pE2单体的最小量是1360ng，比相同条件下检测到的pE2二聚体的最小量(86ng)高了16倍。在限定浓度对二聚体的反应性估计至少比单体限定浓度的反应强5倍。因此，综合而言，pE2二聚体的抗原反应性估计比pE2单体强80倍。
图10显示在其二聚体和单体形式中重组pE2肽的不同抗原性。含有1300ng纯化的pE2样品被加热到100℃3分钟以分解多肽的二聚体形式为单体形式。加热的样品以等比例与纯化的未加热的pE2混匀。多肽的23kDa单体和42kDa二聚体形式用SDS PAGE分离并转移至膜上。将膜剪成条状进行Western印迹分析。以1∶50稀释的血清进行测试，有8份血清同时与pE2单体和二聚体反应，而其余10份血清只与pE2二聚体反应。
图11显示在4℃(泳道1)、20℃(泳道2)、37℃(泳道3)、45℃(泳道4)用8M尿素处理纯化的pE2 1小时。同样的纯化pE2样品用8M尿素在45℃处理1小时后，对1×PBS透析过夜(泳道5)。5个样品进行(A)PAGE和(B)用混合HEV反应人血清进行Western印迹分析。
图12显示在纯化的pE2或GE3反应的3种人血清类型中，用ELISA法测定比较其中IgG抗体的水平。在微孔板中以预先测定的理想浓度包被纯化的pE2或GE3，然定检测这些血清中含有的IgG抗体的滴度水平。多肽的制备物用SDS PAGE(左泳道)分析，用1∶100的稀释血清进行Western印迹测定。对相应的重组多肽，人血清出现强反应(实心圆)、弱反应(阴影圆)或不反应(空心圆)。抗体水平确定为血清稀释度的倒数，血清稀释度的OD值需高于阈值OD0.37。
图13显示由ELISA测定的96份非甲、非乙、非丙型肝炎病人血清中IgG抗体的分布水平，对纯化的pE2或GE3分别表现为强反应(实心条)、弱反应(阴影条)和不反应(空心条)。每一份血清样品用1∶100稀释血清进行Western印迹测定，以及用包被了纯化的pE2的微孔板进行ELISA分析。抗体的水平由OD证明，而血清对多肽的反应性根据反应的强度评估。
图14显示从疾病开始HEV抗体的时间分布。用各自的HEV多肽进行ELISA，测定96份96份非甲、非乙、非丙型肝炎病人血清中，pE2特异的IgG(A)和IgM(B)以及pE3特异的IgG(C)和IgM(D)抗体。得到的结果与疾病开始以后取得这些血清的时间长度进行比较。pE2 IgG、IgM的阈OD值(虚线)分别为0.52、0.57，GE3 IgG、GE3 IgM的阈OD值(虚线)分别为1.05、0.74。
图15显示通过不同HEV特异性的三种ELISA确定抗体的反应。使用商用试剂(GeneLabs Diagnostics Pte Ltd.，Singapore)，对96份非甲、非乙、非丙型肝炎病人血清中的74份进一步进行HEV特异抗体的测定。将得到结果与GE3特异(A、B和C)或pE2特异(A和D)测定得到的结果相比较。前面进行的Western印迹显示，这些血清中的32份对pE2和GE3有反应(A和D)，14份只与pE2有反应(B和E)，还有40份不与二者反应(C和F)。商用试剂测定的阈OD值是0.6，pE2特异的IgG阈OD值是0.52，GE3特异的阈OD值IgG是1.05(虚线)。
图16显示用包被了针对纯化pE2的抗血清的聚苯乙烯片来特异性地免疫捕获HEV。抗血清是来自图19描述的动物M1，以1∶100稀释，包被聚苯乙烯片。片分别在带有HEV(泳道2)、HAV(泳道3)、杯状病毒(泳道4和5)或肠道病毒(泳道6)的溶液中浸泡过液。然后去掉溶液，用缓冲液彻底洗涤4次。提取结合于片的RNA，进行反转录，将cDNA用相应病毒的引物进行PCR扩增。分子标记用以比较这些产物的分子量(泳道1)。
图17显示从图18描述的动物M1取得一种pE2特异的抗血清(A)或免疫前的血清(B)，分别用二者包被聚苯乙烯片，用于免疫捕获HEV，然后与4.5ml带有HEV、经系列稀释的胆汁样品反应。经过洗涤后，结合于片上的HEV颗粒用RT-PCR进行检测。分子标记用以比较这些产物的分子量(左泳道)。
图18显示短尾猴(Macaque monkeys)对纯化pE2免疫的反应而产生的pE2抗体。3只猴子(M1、M2和M3)每星期分别用100ug纯化的pE2进行免疫，共4次。3只对照的猴子(M5、M7和M8)用安慰剂进行同样操作。免疫完成后的两个星期，两组猴子都用等剂量的105基因组当量的HEV进行静脉内注射，继续观察动物7个星期。每星期采集血清样品，用ELISA测定分析抗pE2抗体的存在。
图19显示在短尾猴未感染HEV之前，用制备的pE2肽进行免疫，然后收集血清分析HEV的抗体谱。每星期分别用带100ug纯化pE2的制备物注射3只成年猴(M1、M2和M3)，共4次。在最后一次注射后的2星期收集血清，进行4倍递增的系列稀释，用纯化的pE2的单体(100℃加热3分钟)和二聚体(未加热)的等量混和物进行Western印迹测定。来自M1的免疫血清在1∶4,000至1∶256,000之间的4倍系列稀释后进行测定(泳道1-4)；来自M2的免疫血清在1∶100至1∶6,400之间的稀释后进行测定；来自M3的免疫血清在1∶250至1∶16,000之间进行测定。免疫前的血清用为阴性对照以1∶100测定(泳道5)(A)。来自这些动物的免疫前和免疫后的血清以及阳性对照血清P，进一步以1∶100稀释，进行Western印迹测定，抗原为GE3即30kDa的带pE3多肽的GST融合蛋白，同时用商用试剂盒(北京医科大学，北京)进行ELISA测定。生产者建议ELISA的阈OD值由虚线所示。
图20显示戊肝病毒的攻击基因组剂量。用1ml 1∶100稀释的贮存HEV接种动物。接种病毒的基因组剂量由病毒制备物的系列稀释的等份样品，经RT-PCR确定。这里所说的病毒制备物在”材料和方法”部分描述。
图21显示HEV攻击的抗体反应。在HEV攻击之前及之后的指定时间，立即从免疫了的(M1、M2、M3)和未免疫的对照动物(M5、M7、M8)获得血浆样品。血清样品以及阳性P、阴性N对照人血清样品，用纯化的pE2和pE3进行Western印迹测定，同时用商用试剂盒(Genelabs Diagnostics Pte Ltd.，新加坡)进行ELISA测定。
发明详述
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所共同理解的相同意义。通常，在下面描述的细胞培养、分子遗传和核酸化学中所用的术语和实验方法，在本领域中是众所周知且普遍应用的。标准技术用于重组核酸方法、细胞培养和转化。通常，酶反应和纯化步骤根据生产者的说明进行。一般进行的技术和方法是根据本领域传统的方法和各种一般文献(Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室印刷，Plainview，NY，1989)进行。如本文通篇所用，下列术语：除非另外说明，应该理解为以下含义：
生物学测试样品：指个体身体的一个部分，这个部分是目的分析物的来源。测试样品的例子包括但不限定于，人和动物身体的流体如全血、血清、血浆、脑脊髓液、白血细胞、肠道分泌物、尿液和淋巴液。
E2是克隆的cDNA片段，如图2描述，它位于中国HEV株(DDBJAccession No.D11092)基因组的6326-6968位，在6957位含有一个单碱基对的删除。
pE2是由E2编码的肽(即SEQ ID NO：2)
E3是克隆的cDNA片段，如图3描述，它位于中国HEV株(DDBJAccession No.D11092)基因组的5364-5477位。
pE3是如图4描述的由E3编码的多肽。GE2是一种融合蛋白，其中pE2的氨基端与谷胱甘肽S转移酶的羧基端相连。
GE3是一种融合蛋白，其中pE3的氨基端与谷胱甘肽S转移酶的羧基端相连。
戊型肝炎病毒(HEV)是一单股正链RNA病毒，形态上与杯状病毒的成员相似。能引起肝炎的散发发病或地方暴发，在血清学上不同于甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)和丁肝病毒(HDV)。
同型二聚体是由两个相同的单体形成的分子。
同型序列是一种核酸或氨基酸序列，分别与E2核苷酸序列或pE2氨基酸序列(确定为SEQ ID NL：1或2)有至少80％，甚至90％的序列等同。
I HEY基因组序列
图2A-2D和图3中阐明的HEV基因组序列分别对应于ORF2和ORF3区域。类似地，图4和5中所示的多肽序列分别对应于来自ORF2和ORF3区域的基因产物。相应地，所列出来的基因组序列如下：
SEQ ID NO.1是来自于ORF2的、克隆的DNA片段E2的核苷酸序列。
SEQ ID NO.2是多肽pE2的氨基酸序列。
SEQ ID NO.3是下游引物ORF2Rb(参见表9)的核苷酸序列。
II HEV多肽pE2和pE3
从HEV基因组中表达pE2和pE3多肽
用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，从HEV中国株D11092基因组内ORF3序列的3’端克隆及扩增出114bp片段，从ORF2序列的3’端克隆及扩增出811bp片段。将这些序列连到pGEX载体的BamHI和EcoRI克隆位点。用EcoRI和BamHI分别消化质粒并回收克隆的病毒基因(图6，泳道2和3)，并进行序列分析。结果发现114bp序列位于病毒基因组内部的5364-5477位，编码37个氨基酸的多肽pE3，分子量为3.9kD。811bp序列位于6326-7136位，但是发现在6957位有一个单碱基对删除(图2D)，推测是由于PCR扩增错误引起。结果由移码突变导致核苷酸序列的翻译在6968位的新终止密码子处提前终止，因而产生一个长度上比预计小的213个氨基酸残基多肽pE2，分子量为23kD，而不是开始预计的267个氨基酸残基。pE2羧基端的3个氨基酸残基是由移码突变产生，不是HEV序列(SEQ ID NO：2)。
图2A-2D和图3所示的核苷酸序列分别对应于HEV中国株(DDBJAccession No.D11092)的ORF2和ORF3。
图4和5所示的氨基酸序列对应于多肽pE2和pE3，分别来自于HEV中国株(DDBJ Accession No.D11092)的ORF2和ORF3。HEV ORF2和ORF3特异蛋白的表征
克隆自HEV基因组的ORF2和ORF3区域的序列被分别表达成谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白GE2和GE3。这个表达系统可产生高水平的病毒多肽，而且用谷胱甘肽葡聚糖4B系统可以进行有效的纯化。这一方法从1升的细菌培养物中可产生约2mg纯化的GE2和7mg纯化的GE3。而且，可以用凝血酶将结合于葡聚糖4B的GE2洗脱下来，凝血酶在GST的羧基端剪切融合蛋白从而释放出病毒多肽pE2。这个方法从1升细菌培养物中产生约1mg纯化的pE2肽。
纯化的GE2和pE2制备物用SDS PAGE和Wewtern印迹技术进行性质研究(图7)。纯化的pE2融合蛋白GE2(泳道1和2)、pE2肽(泳道3和4)和谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白(泳道5)，用SDS PAGE(A)进行分析，以及用GST特异的抗血清(B)和合并的人HEV反应的人血清(C)进行Western印迹分析。另外，GE2和pE2肽样品先加热到100℃3分钟，再用SDS PAGE(A)和Western印迹(B和C)进行分析(泳道2和4)。纯化的pE2呈现出一条分子量为92kD的二聚体形式的主带(图7A，泳道1)，但是多肽样品经100℃加热3分钟后分解成一条49kD的条带(图7A，泳道2)。在对应的Western印迹检测中，GE2的二聚体和单体形式都可以被抗GST血清所识别(图7B，泳道1和2)。值得注意的是这一制备物中的少量成分-49kD的GE2单体，只与抗GST血清反应，不与人HEV反应性血清反应(图7C，泳道2)。相应地，当GE2经100℃加热3分钟后，49kD的单体变成主带，但是它对人HEV血清的抗原性显著下降(图7C，泳道2)。用凝血酶消化结合的融合多肽而纯化出的pE2肽，天然形成42kD的二聚体，也在100℃加热3分钟后解聚成23kD的单体(图7A，泳道3和4)。pE2的单体或二聚体都不被抗GST血清识别(图7B，泳道3和4)。而且只有pE2的二聚体形式与人HEV血清反应(图7C，泳道1和3)。
表达自ORF3的纯化GST融合蛋白(GE3)同样用SDS PAGE和Western印迹进行性质分析(图8)。GE3蛋白作为单体产生一条预计的30kD的条带。Western印迹显示GE3与抗GST抗血清和混合人血清都发生反应。但是与pE2和GE2相比较，GE3的反应性只与其单体形式有关系，因此它的抗原活性不受加热的影响。因此，通过以前的多肽图谱研究，认为很可能这种活性至少部分是由于其表位位于ORF3特异的全长蛋白的羧基端引起。
III Pe2和其抗原反应性
pE2肽天然以同型二聚体出现
以前的研究已描述过HEV基因组ORF2编码的HEV结构蛋白的重组多肽，可以被HEV反应性人血清所识别(Yarbough等人，1991；Li等人，1994)。利用分布于全长结构蛋白的重叠短肽和多肽图谱技术，发现这些具抗原性多肽的活性是来自于，位于全长多肽不同区域的抗体结合位点的数量和性质。作为线性表位，这些抗体结合位点与蛋白的一级结构相关，而一级结构是由其氨基酸序列决定的。在溶液中重组蛋白的构象由它们的二级和三级结构决定，可能影响表位与抗体的接触，因而减低它们的抗原活性。
本发明的重组pE2肽具有被HEV反应性人血清识别的两种类型的抗原活性。抗原活性的一种类型与pE2肽的一级结构有关，而第二种类型的活性与它的二聚体形式多肽的四级结构相关。第一种抗原活性来自于pE2肽的氨基酸序列中的线性表位，而且由下面的Western印迹实验证明是与其单体形式有关。但是第二种类型的抗原活性具有严格的天然构象，只有当pE2肽的单体之间相互结合成二聚体时才会出现。因此，pE2肽的一个使其区分于其它HEV重组多肽的显著特征是，在生理学条件下它会自然且主要形成二聚体(如更多的聚体)，其抗原活性就来自于仅由二聚体形式的四级结构构成的构象型抗原决定簇。此外，当二聚体降解时，这种抗原活性即消失，但是当单体重新变成二聚体时活性又可以恢复。对于HEV基因组ORF2区域来源的重组多肽而言，这种类型的抗原活性是首次报告。
图7显示合并的人HEV反应性血清与pE2谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白(即GE2)和纯化的pE2的二聚体形式具有强烈的反应。如本文描述的制备纯化的GE2(泳道1和2)和纯化的pE2(泳道3和4)，再用SDS PAGE(A)进行分析，以及用GST特异的抗血清(B)和合并人HEV反应的人血清(C)进行Western印迹分析。泳道2和4的样品先加热到100℃3分钟，然后立即用于分析。纯化的GST样品和分子量标记混和物分别上到泳道5和6。在未加热的样品中(7A，泳道1和3)，融合蛋白GE2主要以分子量约为92kD的二聚体形式迁移(7A，泳道1)，pE2主要以分子量约为42kD的二聚体形式迁移(7A，泳道3)。但是，如图7A泳道2和4所示，加热引起两种蛋白的二聚体形式解聚，GE2融合蛋白解聚为为49kD单体，pE2肽解聚为23kD单体。接下来的Western印迹发现，融合蛋白GE2，不管是以二聚体或单体形式，都被抗GST抗血清识别(7B，泳道1和2)，其结果与GST相同(7B，泳道5)。HEV反应性人血清强烈识别GE2融合蛋白(7C，泳道1)和pE2肽(7C，泳道3)的二聚体形式。样品经100℃加热3分钟后引起GE2融合蛋白和pE2肽的二聚体解聚成相应的单体形式。但是，这种解聚伴随着抗原活性的消失，HEV反应性人血清不能识别和结合于GE2蛋白和pE2肽的单体形式(7C，泳道2和4)。
用Western印迹来评估pE2单体的抗原性并与pE2二聚体相比较(图9)。混合等量未加热和加热了的纯化pE2肽样品。混合物进行4倍系列稀释，上到泳道1-6。经过电泳，用图7中所用的混合HEV反应性人血清以1∶200稀释，来测定pE2两种形式的抗原性。图9显示，pE2单体与混合人HEV反应性血清发生阳性反应的最少量为1360ng，比在相同条件下pE2二聚体的最小阳性反应量(86ng)高16倍。此外，对pE2二聚体的反应强度估计大约是对pE2单体反应强度的5倍。因此，综合证明，pE2二聚体的抗原活性显著不同于单体，pE2二聚体的总体反应性估计比pE2单体强约80倍。pE2单体的抗原活性是来自于pE2氨基酸一级结构中的几个线性表位。
此外，18份用商用HEV ELISA试剂盒(Genelabs Diagnostics PteLtd.，新加坡)测定为阳性的人血清，以1∶50稀释进行Western印迹测定(图10)，抗原为纯化pE2的经加热和未经加热的两种形式的等量(每个反应每种形式的量为1360ng)混匀物，未加热则保留了pE2二聚体形式，100℃加热3分钟则分解pE2二聚体成单体形式。根据图10所示结果，18份血清中只有8份同时与pE2二聚体和单体反应，而其余10份血清只与pE2二聚体反应。与pE2单体比较，pE2二聚体的抗体反应性的高比例，进一步说明二聚体比单体具有更好的抗原反应性。
图11显示pE2二聚体的第二种类型的抗原反应性是与pE2肽的二聚体或寡聚体形式的四级结构相关。作为构象型抗原决定簇，抗原反应性的这种类型迄今未知，它与重组多肽而不只是pE2相关，这些重组多肽来自于HEV基因组的ORF2区域。在进行SDS PAGE(A)和Western印迹(B)分析之前，纯化的pE2样品分成5份，分别用M尿素在不同温度条件下处理1小时：4℃(泳道1)、20℃(泳道2)、37℃(泳道3)、45℃(泳道4)。而且，一份样品用8M尿素在45℃处理1小时后，对1×PBS透析过夜去除尿素(泳道5)，再进行SDSPAGE和Western印迹分析。用混合HEV反应性人血清以1∶250稀释进行Western印迹分析。SDS PAGE得到的结果(图11A)表明，pE2二聚体解离成单体的程度随加热处理的温度的升高而提高，温度达到45℃时pE2二聚体完全解离(泳道4)。与这些结果相一致的是，相应的Western印迹分析(图11B)显示，只有存在pE2二聚体的样品(即泳道1-3和泳道5)，HEV反应性血清都存在一定程度的反应。另外，HEV反应性人血清与只含有pE2肽单体的加热样品不发生反应(即泳道4)。
这些结果提示，在生理学条件下，pE2单体自然地相互作用而形成同型二聚体，被HEV反应性人血清识别的构象型抗原决定簇很可能是产生于这种二聚体的相互作用，因为检测不到针对pE2单体形式的抗体。相应地，由pE2二聚体的四级结构决定的、抗原反应性的第二种类型，显示出严格的天然构象，只有当pE2肽呈二聚体时才有功能。因此，pE2肽二聚体形式的解离呈现出与构象型抗原活的消失相关(即图11B泳道4)。但是，将尿素处理的样品对PBS进行过夜透析后，pE2单体重新结合形成二聚体，构象型抗原活性得以恢复(图11B泳道5)。
pE2的构象型抗原决定簇在HEV感染中的重要性
如上所述及证明，被HEV反应性人血清识别的pE2抗原活性的两种类型中，二聚体形式的构象型抗原决定簇显然在天然HEV感染中的作用比单体的线性表位更为重要。Western印迹分析的结果(图10)显示，总共18份HEV反应性人血清都能与pE2肽的二聚体形式反应，而只有8份血清另外与pE2肽的单体形式反应。这个实验结果同样得出上述结论。而且，基于图9的结果，pE2构象型抗原决定簇的总体反应性估计大约是单体的线性表位反应性的80倍。
能过测定21份健康献血者的血清和96份非甲、非乙、非丙型急性肝炎病人从肝炎发病时的不同时间采集的血清(表2)，进一步评价pE2构象型抗原决定簇在天然HEV感染中的角色。研究中所用的血清是经过香港皇后玛珈丽医院允许，取自正在发病的或得过病的非甲、非乙、非丙型急性肝炎病人。结果显示，pE2特异的IgG抗体在非甲、非乙、非丙型急性肝炎病人中比健康献血者中明显普遍得多。这个差异与流行病学研究相一致，提示这些病人的一部分可能正在感染而其他人可能以前感染过这个病毒。大约10％的健康献血者在过去感染过病毒，与这些血清样品来源的社区中HEV的感染水平相一致。
表2 用Western印迹检测人血清中的HEV抗体
抗体(IgG) 血清数量
| pE2 | 非甲、非乙、非丙型肝炎病人 | 健康献血者 |
| + | 56 | 3 |
| - | 40 | 18 |
| 总计 | 96 | 21 |
IV 确定pE2和pE3的HEV特异性
为了确定pE2二聚体和pE3的抗原活性是HEV特异的，96份来自急性或曾经急性的非甲、非乙、非丙型急性肝炎病人的血清样品中的74份，通过商用的HEV特异的ELISA进一步进行测定(表3)。商用测定与pE2或pE3测定的高符合率证明了pE2和pE3的HEV抗原特异性。
表3 用商用ELISA测定抗pE2、pE3的IgG抗体以及HEV IgG抗体
Wewtern印迹 EIA 合计 总一致率*
+ -
pE2 + 37 7 44 89.2％
- 1 29 30
pE3 + 30 0 32 89.2％
- 8 36 54
合计 38 36 74
*整体一致性＝结果一致的样品数/总样品数×100％
V 检测抗HEV IgG和IgM的ELISA的建立
分别用pE2或谷胱甘肽S转移酶融合蛋白GE3的纯化样品包被微孔板，进行两个分开的ELISA实验。这些HEV多肽的产生和纯化已在上文描述。这些样品的纯度由42kD的pE2二聚体和30.4kD的GE3融合多肽的相对强度决定，它们占各自样品的总蛋白中的89％和95％(图12左泳道)。Western印迹显示，这些多肽是这些样品中的主要抗原，因为它们与HEV阳性的人血清发生反应(图12实心和阴影)，而不与阴性对照的人血清发生反应(图12空心)。用这些纯化的HEV多肽样品滴定这些血清而得到的一般结果与用Western印迹测定的相应多肽与这些血清的反应相一致。
在进一步的研究中，用pE2和pE3特异测定，检测了90份健康献血者和96份正在得病或曾经得病的非甲、非乙、非丙型急性肝炎病人血清中的HEV IgG抗体水平。个体病人血清的抗体水平通常与它们和相应病毒多肽的反应性相关，这一反应性已用Western印迹测定(图13)。由Western印迹确定有反应的血清(图13实心条)得到的OD值要高于弱反应(图13阴影条)或无反应血清(图13，空心条)。
设定超过由Western印迹证明无反应血清的平均OD值的5SD为阈值。通过pE2特异性测定，85.7％的pE2反应或弱反应性血清给出阳性结果。通过GE3特异性测定，66.6％的GE3反应性血清给出阳性结果。Western印迹和pE2、GE3特异性测定的总相符率分别为91.7％和88.5％。基于Western印迹结果，两者的ELISA测定都有100％的特异性，由这些测定和Western印迹得到的不同结果只限于弱反应性血清。这些结果证实了pE2测定是特异于42kD的pE2二聚体，而GE3测定是特异于30.4kD的pE3多肽。由ELISA测定pE2 IgG抗体的血清流行，在HEV病人中为50％，在献血者中为5.5％，而GE3 IgG抗体的血清流行性况为，在HEV病人中为22.9％，在献血者中为1.1％。测试样品中两个群体的pE2特异抗体的血清流行均高于GE3特异抗体。这个结果提示，pE2是两个抗原的主要成分，这些抗体的高度流行与急性肝炎有关。
用抗体反应来区分HEV衣壳蛋白的抗原区域
为了进一步比较，从96份血清中取出74份，进一步用商用检测试剂盒(Genelabs Diagnostics Pte Ltd.，新加坡)测定其IgG抗体。商用测定试剂盒是由42个氨基酸的多肽和33个氨基酸的多肽混合组成，这两个多肽分别编码自HEV的Burmese和Mexican株的ORF2和ORF3的3’端(Yarbough等人，1991)。如上所述，pE3是一38个氨基酸的多肽，也表达自ORF3的3’端，所以发现用于商用测定的ORF3的33个氨基酸多肽是pE3中的一部分(即GE3)。因此可以预计在商用测定中ORF3特异的多肽的抗原特异性应该与GE3密切相关。另一方面，用于商用测定的ORF2特异的多肽位于213个氨基酸的pE2肽的羧基端的更下游。因此，商用测定试剂盒的抗原特异性部分由其含有的ORF2多肽决定，预计不同于体发明的pE2肽。不同于以前报道的来自于ORF2区的HEV多肽，pE2的抗原活性的唯一性在于，它主要来源于其构象型抗原决定簇，这种构象型抗原决定簇只有当pE2单体之间相连成二聚体时才会暴露出来。
如Western印迹所证明的，30份血清同时与pE2 IgG和pE3 IgG反应(pE2+/pE3+，图15A和15E)，14份只与pE2 IgG反应(pE2+/pE3-，图15B和15E)，30份与两者都不反应(pE2-/pE3-，图15C和15F)。因此，由商用测定的pE2和GE3反应性血清的抗体水平随GE3特异抗体的水平的变化(图15A)，但是与pE2特异抗体的水平无关(图15D)。这些血清中的11份与pE3呈弱反应性，OD值在GE3特异的ELISA阈值以下(图15A)。发现只与pE2反应的14份血清中的10份带有不同水平的相应抗体。14份血清中的7份在商用测定中有反应(图15E)。但是，它们在GE3特异的ELISA中都呈阴性(图15B)。其余血清不与任何一种多肽反应，在pE2和pE3特异的ELISA中，它们都呈阴性，在商用测定中，除了一份外其余也都呈阴性。
用三种方法测定的HEV抗体谱总结于表4。尽管它们的抗原特异性不同，33份血清在pE2特异测定和商用测定中为阳性，30份在两种测定中为阴性，两种测定的总一致率为87.8％。类似的，GE3特异性测定和商用测定的总一致率为74.3％。三种测定的总一致率为66.2％。用商用测定检测的HEV抗体的频率(47％)稍低于pE2特异性测定(50％)，高于GE3特异性测定(29％)。基于个体血清中存在的抗体谱，在40份血清中由商用测定检测出15份血清的抗体，可能是因为与这种试剂盒中的ORF2特异性多肽特异作用的抗体的存在，因为这些血清在GE3特异性测定中不发生反应。其余的23份血清在商用测定和GE3特异测定中都是阳性，但是如果这些血清仍含有针对商用试剂盒中的ORF2特异多肽的抗体，则结果仍不能确定。
表4 病毒性肝炎病人血清与HEV多肽和商用
ELISA试剂盒的反应方式
| pE2 ELISA | GE3 ELISA | Genelabs试剂盒 | 血清数量(n＝74) |
| + | + | + | 17 |
| + | - | + | 16 |
| + | - | - | 4 |
| - | + | + | 2 |
| - | - | + | 3 |
| - | - | - | 32 |
| 37(50％) | 19(25.7％) | 38(51.3％) | 流行(％) |
| 87.8％ | 74.3％ | - | 总一致率1 |
1商用ELISA试剂盒的总一致率＝用pE2或GE3特异检测和同时用商用测定得到阳性或阴性结果一致的血清数/检测的总血清数×100％。三种测定方法之间的总一致率为66.2％。
VI 正在和曾经的HEV感染中的抗体反应
同样检测了HEV病人和健康献血者血清中的pE2和GE3特异的IgM抗体的水平。开始的研究显示，测定不受存在的IgG抗体的影响，因此在有和无抗人IgG存在时都得到一样的结果。因此做了一些无抗人IgG存在时的检测，设定阈值为90份献血者血清的平均OD值的3SD。图14比较了戊型肝炎刚发病的病人血清中的pE2和GE3抗体的产生。pE2和GE3特异的IgM抗体和GE3特异的IgG抗体主要存在于戊型肝炎刚发病的早期血清样品中，而pE2特异的IgG抗体的产生不与疾病的发病相关。
如图14，基于pE3和GE3特异测定检测的HEV抗体水平，测定的个体血清样品存在9个不同的HEV血清型。发现总共有53份病人血清与1种或多种抗体发生的反应(表5)。18份血清存在5种血清型，与正在感染的情况一致(表5曲线1-5)。其中包括3份只有pE2IgM反应的血清(表5曲线1)，11份另外有pE2和GE3特异的IgG抗体反应的血清(表5曲线2)，另外3份有以上抗体反应以及GE3特异的IgM抗体反应的血清(表5曲线4)。其余血清存在pE2特异IgM和不同的其它抗体的反应。值得注意的是这些血清中的16份血清是在戊型肝炎发病之后的30天内采集的。其余2份病人血清是在病程开始后的60天以后采集的。推测这些以及其它来自献血者的血清是属于无征兆的HEV感染，与以前的戊型肝炎病史无关。另外35个病人的血清存在血清谱，与那些IgG阳性而IgM阴性的过往HEV感染一致(表5曲线6-8)。这些血清中的27份有pE2特异的I gG反应(表5曲线6)，7份有GE3特异IgG反应(表5曲线7)，但是没有一份有IgG抗体反应(表5曲线6-8)。1个血清谱显示血清不存在任何一种抗体的反应(表5曲线9)。但是，这些血清谱的产生不与戊型肝炎的开始发病时间相关。很多显示正在感染的血清谱样品是在戊型肝炎开始之后的27天内(平均＝13天)采集的，其它样品是在括号内所示天采集的。过往感染的血清谱与疾病开始不相关，这些样品是在疾病开始以后与非反应的血清以相似的速率累积(平均＝50和40天)。
表5 HEV感染的血清谱
确定的 IgM IgG 献血者 病人
血清谱 pE2 GE3 pE2 GE3 血清数 血清数 发病后的天数
(n＝90) (n＝96)
1 + - - - 0 3 9-15
2 + - + + 0 11 5-27(190，240)
3 + + - - 1 1 8
4 + + + + 0 3 7-14
5 - + + + 0 1 18
合计(正在感染) 1 18 平均＝13
6 - - + - 5 27 5-430
7 - - + + 0 7 9-40
8 - - - + 0 1 18
合计(过往感染) 5 35 平均＝50
9 - - - - 84 42 平均＝40
ELISA测定低亲和力IgG抗pE2抗体
ELISA的进一步应用是用pE2二聚体检测血清中的低亲和力IgG抗体。在4M尿素或无4M尿素中滴定血清样品而完成此检测。当尿素处理引起明显的抗体水平显著下降4倍以上，即表明低亲和力IgG抗体的存在。表6显示，在戊肝发病2周内采集的病人血清中检测到的主要是低亲和力的抗体，后来这一抗体逐渐被亲和力IgG抗体所代替。因此，低亲和力抗体转移的产生使其在急性戊型肝炎的诊断中有潜在的用途。
表6 用ELISA检测开始发病后的不同时间的非甲、乙、丙型肝炎
病人血清样品中的低亲和力pE2 IgG抗体
pE2 IgG亲和力测定(例子)
| 发病后的天数 | 低亲和力 | 高亲和力 | 合计 |
| 0-7 | 3 | 0 | 3 |
| 8-14 | 3 | 3 | 6 |
| 15-21 | 3 | 0 | 3 |
| 22-84 | 0 | 12 | 12 |
| ＞84 | 0 | 7 | 7 |
| 合计 | 9 | 22 | 31 |
VII 建立免疫捕获RT-PCR来检测HEV RNA
如果pE2二聚体模拟了HEV衣壳的某种结构特征，则以上描述的人血清的反应性是可以解释的。为了测定这种可能性，进行了实验以确定针对pE2的抗血清是否影响HEV颗粒的免疫捕获。
RT-PCR引物的特异性
在本研究中，选择了两对引物A5R/A3F和B5R/B3F(表9)进行RT-PCR。分别用含有HEV、HAV、肠道病毒和杯状病毒的样品直接进行RT-PCR以评估这些引物的特异性。图16显示，只有含HEV的样品经RT-PCR扩增出一条特异的203bp HEV序列的条带。
pE2二聚体模拟了HEV的结构特征
用包被了抗pE2肽的抗血清的聚苯乙烯板(paddle)进行免疫捕获实验，以研究pE2双全和HEV病毒颗粒的抗原关系。使用的抗血清是采用一只用4次100ug剂量的纯化pE2肽免疫的猴子，它与pE2二聚体有强烈的反应。抗血清与pE2单体存在弱反应，不与其它的HEV抗原反应。发现包被了抗血清的板影响HEV颗粒的特异免疫捕获，结合的病毒用于后面的反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测(泳道2)，在”材料和方法”部分对本方法有所描述。板相似地允许与HAV1(泳道3)、杯状病毒(泳道4和5)和肠道病毒(泳道6)反应，但不能捕获病毒(图16)。
这些结果进一步支持pE2二聚体可能模拟了HEV病毒颗粒某种结构特征的论点，使得抗血清能够与二聚体强烈反应，影响了HEV颗粒免疫捕获的有效性和特异性。下面讨论这一发现应用于发展一种检测临床、食品和环境样品中的HEV的免疫捕获测定法。
免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)
测定兔子pE2抗血清的免疫捕获HEV的能力。聚苯乙烯板分别用抗血清和血疫前的血清包被，用于捕获病毒。进行捕获病毒的RT-PCR。发现抗血清能捕获贮存病毒的55稀释液中的HEV颗粒(图17A)，而免疫前的血清不能捕获即使是未稀释的贮存液中的病毒(图17B)。
用商用病毒RNA检测试剂盒进行IC-RT-PCR的比较。
上面描述的免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)方法可以用于日常公共健康和环境监测的HEV检测，因为稳定来源的抗血清是源自HEV特异的蛋白pE2的表达。
在上面描述的方法中，免疫捕获的HEV颗粒用一种商用试剂盒(QIAamp Viral RNA Kit，QIAGEN)提取其RNA，这种试剂盒为分子生物学家常用。如果假设用商用试剂盒的RNA提取的有效性为100％，不受任何干扰，则理论上，IC-RT-PCR应该比直接的RT-PCR敏感32倍，因为前者能够容纳32倍体积的样品。在本研究中，接种的病毒进行了5倍系列稀释，因此预计IC-RT-PCR的结果比RT-PCR敏感25倍。
在本研究中，准备了三种类型的HEV接种样品，包括水、人粪便样品的上清和匀浆的贝类样品的上清。水样品、一份贝类样品(如牡砺)和一份粪便样品用相同量的HEV穿刺。穿刺样品进行5倍递增的系列稀释，各稀释样品用商用(传统的)方法和免疫捕获法进行HEV的测定。对这些样品的HEV捕获有效性进行了比较，结果如表7。根据这些结果，证明免疫捕获法比传统的RT-PCR法增加了HEV的检测灵敏度，在水样品中提高25倍，在粪便样品中提高125倍，在贝类样品中则大于125倍。因此，结果显示IC-RT-PCR至少比商用病毒RNA试剂盒敏感25。在水样品中观察到敏感性增加的原因，是由于免疫捕获法中的测定样品体积是传统RT-PCR测定中样品体积的32倍。而且，结果也提示，在粪便和贝类上清中存在未知因子抑制RNA的提取。这是为什么水样品的结果显著高于贝类和粪便上清样品的结果，因为水样品预计不含有抑制检测的物质。但是，与传统的RT-PCR法相比，用IC-RT-PCR法使粪便和贝类样品中的干扰降低到最小。与传统的RT-PCR相比，IC-RT-PCR法的敏感度提高了25倍，是因为用免疫捕获法去除了抑制物质。
表7 比较免疫捕获-RT-PCR和传统的RT-PCR法的HEV检测效率
| 方法 | 水 | 粪便上清 | 贝类上清 |
| IC-RT-PCR | 1∶3125 | 1∶125 | 1∶125 |
| 传统的RT-PCR | 1∶125 | 1(未稀释) | 未检测到 |
检测敏感度由病毒检测要求的有限样品稀释度表示。
总之，与水样品相比，商用RT-PCR法和IC-RT-PCR法对粪便和贝类样品都具有低的敏感度。但是，这种现象可能是因为粪便和贝样品中的一些未知因子引起，这些因子可能加速病毒的降解。另一方面，IC-RT-PCR结果比直接的RT-PCR敏感125倍，暗示免疫捕获法成功地克服了粪便和贝类样品中未知因素的干扰，进一步表明IC-RT-PCR可用于临床和环境监测。
VIII pE2在针对HEV的保护中的作用
前面对非甲、乙、丙型肝炎病人的研究结果提示，重组肽pE2的二聚体形式通过暴露构象型抗原决定簇可能在天然HEV感染中起着重要作用，其构象型抗原决定簇是由肽单体形式的二聚体化而产生。
如在前面非甲、乙、丙型肝炎病人的研究中所示，发现pE2的二聚体形式在天然HEV感染中起着更突出的作用。在急性HEV感染中，通常产生pE2特异的IgM抗体。相应的IgG抗体同样产生并持续一段时间，并伴随着亲和力的上升。而且在恢复期血清和以前感染过该病毒的个体血清中，它们是最普遍的抗体。这些结果提示，pE2可能对HEV提供保护，在实验感染的短尾猴(Macaque monkeys)中的保护性研究进一步支持这一观点。而且，结果也提示，保护性作用主要是由于pE2肽的二聚体化呈现出来的构象型抗原决定簇，而不是呈现的线性表位，这一论点为疫苗的发展提供了合理的理论基础。
用短尾猴作为模型进行实验感染的保护性研究中显示，用纯化的pE2肽制备物免疫能够保护动物免受HEV攻击，因此使它成为一种很好的疫苗候选者。发现感染剂量接近基因组剂量，与实验感染相关的病理学用以与人体的天然感染相关的病理学相比较(Tsarev等人，1993b；Tsarev等人，1994b)。为了获得一种清晰的指征即是否细菌表达的肽提供针对HEV的保护，本研究中的动物用相当大剂量的、含有至少105基因组当量的HEV病毒进行感染。对照动物出现的粪便中的病毒分泌和病毒血症在免疫动物中基本消除。没有动物产生另外的除抗pE2抗体以外的HEV抗体，抗pE2抗体是在攻击之前就已经存在的。因为在攻击之前存在的抗pE2抗体中，特异性识别pE2二聚体的抗体与识别其单体的抗体相比占了优势，得出的结论是，在很大程度上保护效果是由于这一病毒多肽的二聚化产生的构象型抗原决定簇。与这一结论相一致，pE2肽的研究和特性提示，它可能包含了HEV主要结构蛋白中的一个区域，这一区域之间相互作用而形成HEV衣壳。因此，与那些通过pE2二聚体化产生的构象型抗原决定簇相比，病毒衣壳是产生于相同或相似的构象型抗原决定簇。因此，pE2二聚体特异的抗体是与天然HEV感染反应的主要抗体。
将编码210个氨基酸HEV多肽pE2的核苷酸序列与已报道的HEV原型株相应区域的核苷酸序列和编码的氨基酸序列相比较。210个氨基酸多肽是由HEV基因组的ORF2的高度保守的区域编码(表1)。用于免疫的病毒多肽的纯度用SDS PAGE评估(图7A泳道3)，其抗原性用人HEV反应的血清的免疫印迹法评估(图7C泳道3)。用于免疫的纯化制备物中pE2占了超过90％的量。HEV反应的人血清特异识别二聚体形式(图7C泳道3)，而不是23kD的单体形式(图7C泳道4)。这些结果提示人血清中存在的抗HEV抗体主要针对由病毒多肽的二聚体化产生的构象型抗原决定簇。
免疫接种
3只猴子(M1、M2和M3)每星期分别用100ug纯化的pE2二聚体进行肌肉内免疫，共4次。3只对照的猴子(M5、M7和M8)用安慰剂进行同样操作。第四次免疫完成后的两个星期，给所有动物采血，血清用纯化的pE2、GE3作为抗原进行Western印迹检测，以及商用ELISA测定。在最的一次免疫后的两个星期，两组猴子都用105基因组当量的同种HEV株进行攻击。
用纯化的pE2肽进行ELISA监测免疫接种后的抗体反应(图18)。结果显示，在三只动物中(M1-M3)，免疫接种都导致了活跃的抗病毒多肽的抗体反应。首次后的一个星期进行第一次抗体检测，发现抗体即达到了接受第三次剂量一周后的最高水平。对照动物没有检测到pE2特异的抗体。在所有动物中观察到的活跃反应显示pE2具有很强的免疫原性。
在病毒攻击前立即采集HEV特异的血清，进一步进行Western印迹分析，抗原为天然(即pE2二聚体)和加热变性的纯化pE2(即pE2单体)(图19A泳道1-4)、纯化的GE3融合蛋白(图19B)，同时用商用ELISA试剂检测HEV(图19C)。后者的ELISA试剂是由两种合成的HEV多肽混和而成，多肽对应于ORF2和ORF3特异蛋白的羧基端区域的氨基酸序列。根据生产者的操作说明，检测使用了两个HEV多肽，一个类似于pE3(即GE3)，另一个对应于HEV主要结构蛋白的羧基端区域，位置与pE2相邻但不重叠。
图19A显示，将血清进行4倍递增的系列稀释，等份稀释血清用于Western印迹，检测抗pE2二聚体和单体的抗体水平。来自M1的免疫血清在1∶4,000(泳道1)和1∶256,000(泳道4)稀释度之间进行测定；来自M2的免疫血清在1∶100(泳道1)和1∶6,400(泳道4)之间进行测定；来自M3的免疫血清在1∶250(泳道1)和1∶16,000(泳道4)之间进行测定。纯化pE2肽的二聚体和单体形式的等量制备物用于Western印迹。抗任何一种形式的抗体水平由血清的最大稀释度(有限稀释)确定，在这一稀释度时仍能与多肽的各自形式发生反应。结果显示，来自M1的血清中抗二聚体的抗体水平是1∶64,000，比抗单体的抗体水平(有限稀释度为1∶4,000)高16倍。M2和M3的血清抗二聚体的抗体水平分别为1∶1,600和1∶4,000，比相同血清中相应的抗单体的抗体水平高16倍和4倍。这些动物免疫前的血清在1∶100稀释度没有检测到活性(图19A泳道5)。
图19B显示，在1∶100稀释度时，没有血清与纯化的GE3发生反应。相同血清在相同的稀释度用商用ELISA测定，商用ELISA是产生于一种合成多肽，对应于HEV主要结构蛋白的羧基端，蛋白由HEV基因组的ORF3编码。图19C显示，没有血清含有抗这些HEV多肽的可检测的抗体。来自对照动物的血清同样用上述方法检测，任何一种方法都没有检测到任一种血清中的HEV抗体。
因此，这些结果显示，pE2肽具有高度免疫原性，能够在猴子中引起活跃的抗体反应，同样能在其它动物如小鼠、大鼠、羊或兔中激发免疫反应。针对免疫反应产生的抗体主要是与pE2二聚体反应。通过有限稀释法测定，这些抗体的水平比相应抗单体的抗体水平高4至6倍。pE2二聚体比单体引起更高抗体水平的产生，说明pE2二聚体是主要的免疫原。而且，用纯化的pE2免疫不会引起用其它商用方法检测得到的、其它HEV抗体的产生。因此，从这些结果可以得出结论，抗纯化pE2的抗血清是pE2特异性的，对多肽的二聚体形式更为特异。
而且，对于单体，在有限稀释度范围内稀释的抗血清只能与二聚体发生反应，而不与单体发生反应。根据免疫学中的正常应用，此处描述的合适稀释度时产生对二聚体的”单特异性”的抗血清，可以用于区分单体和由单体形成二聚体而暴露的构象型抗原决定簇和其中含有的线性表位。
HEV攻击
用HEV同源株进行肌肉内注射免疫后的2个星期，对3个测试动物(M1，M2，M3)和3个对照动物(M5，M6，M7)进行攻击。攻击病毒最初分离于1986年中国的一场爆发(表1 D11092株)，注射的病毒量用PCR评估为每剂量为105HEV基因组当量(图20)。攻击病毒的首次感染剂量未测定。其他研究者的最近报道显示，HEV的首次感染滴度与基因组滴度相同。
实验感染之后，每天观察动物戊型肝炎病毒的发展。在感染前和后的每2天，监测粪便样品中病毒的分泌。每周采集2次外周血样品，用于检测血浆和外周血中单核细胞(PBMC)的病毒。收集血清样品用于检测ALT水平。两组猴子的ALT水平正常，无戊型肝炎发展的征兆。推测是因为在灵长类中，病毒在前面的传代中被削弱了(Zhuang等人，1992)。不过，表8显示，1只对照动物M5在感染后的第5至17天的每个粪便样品中分泌病毒。在其它两只对照动物M7和M8中，从第7至17天持续10天分泌病毒。感染后的第9和第13天的M7和M8的PBMC样品也进行了HEV基因组检测。从这些动物的任何血浆样品中都没有检测到HEV基因组。在两只测试动物M1和M2中，用pE2肽进行免疫完全消除了病毒分泌，在第3只测试动物M3中，将病毒分泌减少到1天，从这些动物的血浆或PBL样品中没有检测到病毒基因组。
表8 病毒攻击后粪便中的HEV分泌和病毒血症
群 猴子 攻击后的天数
体 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21
测 No.1 - - - - - - - - - -
试 No.2 - - - - - - - - - -
No.3 - + - - - - - - - -
对 No.5 - + + + + +1 + + - -
照 No.7 - - + +1 + + + + - -
No.8 - - + + + + + + - -
1用RT-PCR检测外周血单核细胞中的HEV基因组。没有血浆样品带有可检测的HEV基因组。
病毒攻击后的HEV血清转换
根据图19描述的实验方法和条件，分析了病毒攻击前和攻击后4个星期的血清样品中的HEV抗体谱。图21显示，从病毒攻击前的3只对照动物(M5，M7，M8)获得的血清，开始时在所有3种HEV抗体测定中都为阴性。1只对照动物M5的HEV血清转化发生于感染后的7天，在这天以及所有后来采集的血清中都检测到了pE2同源二聚体特异的抗体(图21)。所有这些血清样品用商用ELISA测定也给出了HEV抗体的可能的测定结果，在第7天和14天连续采集的样品同样与纯化的GE3发生反应。针对感染产生的广泛特异性抗体谱与以前描述的用pE2肽免疫而产生的严格的特异抗体谱形成对照(图21)。感染后的第14和21天，从另一对照动物M7获得的血清样品，与pE2二聚体有弱反应性，用商用测定得到的是阳性结果。，但是无样品与ORF3特异的多肽GE3发生反应。剩余的对照M8对感染不产生足够可检测的抗体量。相反，除了pE2抗体，免疫动物在感染后没有获得其它的HEV抗体(图21)。
从免疫动物(M1，M2，M3)采集的血清在病毒攻击之前的0天已经与pE2二聚体发生反应。病毒攻击后的7、14、28天从这些动物中采集的样品中，抗体持续存在。但是与对照动物相比较，免疫过的动物在病毒攻击后都没有获得另外的HEV抗体(图21A)。
讨论
前面的研究已将恒河猴(Rhesus monkey)建立为HEV的合适动物模型。发现感染剂量接近基因组剂量(Tsarev等人，1994b)，与实验感染相关的病理学用以与人体天然感染相关的病理学相比较(Tsarev等人，1993b)。为了获得一种清楚的指征，即是否细菌表达的多肽对HEV提供保护，本研究中所用的动物用相当大剂量的、含有至少105基因组当量的HEV病毒进行感染。我们的结果显示，感染导致3个对照动物的粪便样品中延长了至少10天的病毒分泌，在PBMC样品中用病毒基因组检测证明两只动物有短暂的病毒血症。而且，在两只动物中感染伴随着HEV血清转化。推测因为攻击的病毒在以前的灵长类动物中的传代中被消弱，但是所有对照动物仍然保持健康，ALT水平正常。
发现用纯化的pE2免疫引起了活跃的针对其单体和二聚体形式多肽的抗体反应。二聚体反应性抗体的水平基本上高于相应单体特异性抗体的水平。除了这些抗体，血清中不存在其它的HEV反应。pE2反应性抗体显然在免疫动物中阻止了实验感染。在两只免疫动物中粪便的病毒分泌消失，在第3只动物中，分泌时间已从对照动物的10或更多天而减少到1天。进一步显示免疫过的动物在其PBMC或血浆样品中没有发现可检测的病毒，在病毒攻击后，这些动物也没有获得另外的HEV抗体。
综合以上结果显示，用重组表达的pE2肽免疫已阻止了HEV同种株对灵长类的实验感染，保护很大程度上是得益于抗pE2肽二聚体形式的抗体。因为在不同的HEV分离株之间是高度保守的，包括分离自墨西哥(Huang等人，1992)和美国(Schlauder等人，1998)的遗传变异最大的分离株，可能pE2肽能够同样阻止HEV其它株的感染。
下面提供的实施例用于阐明发明的概念，而不限制权利与要求确定本发明的范围。
实施例
病毒株—中国HEV株的DDBJ登录号为D11092，由中国北京医科大学Zhuang H教授提供(Aye等人，1992)。根据Zhuang描述的方法(Zhuang等人，1992)，用戊肝病人的粪便样品实验感染恒河猴，再从其胆汁中获得病毒。
血清—本发明所述的96份血清是经过香港皇后玛珈丽医院允许，取自正在发病的或得过病的非甲、非乙、非丙型急性肝炎病人。样品采集自正在住院的病人或出院后的不同时期。
实施例1 HEV衣壳基因的克隆
HEV RNA的提取
根据生产者的说明，用QIAamp Virus RNA试剂盒(QIAGEN GbmH，Hilden，Germany)，从实验感染了HEV的恒河猴(Zhuang等人，1992)的肝汁中提取RNA。纯化的RNA与两倍体积的异丙醇(BDH LaboratorySupplies，England)、1/10体积的3M醋酸钠(pH6.4)(Sigma，美国)混匀，置于-20℃1小时。之后，混合物以15,000转/分钟离心15分钟。沉淀用70％乙醇(BDH Laboratory Supplies，英国)洗一次，然后重悬于反转录缓冲液中。
目的序列的RT-PCR
为了进行反转录，RNA沉淀加到20ul RT混合物中(4ul 5×RT缓冲液[Boeringer Mannheim]；1.6ul 2.5mM dNTP；0.2ul禽成髓细胞血症病毒(AMV)[Boeringer Mannheim]；0.625ul RNAsin[BoeringerMannheim]；1ul下游引物E5R或E3R(150ug/ul)；12.6ul无RNAse的水)，在42℃温育1个小时。
所用的引物列于表9。E3R和E5R是用于合成病毒的cDNA片段。分别用引物对ORF2F/ORF2Rb和ORF3F/ORF3R扩增ORF2和ORF3的3’端区域的相应cDNA序列。这些引物已设计成带有BamHI和EcoRI限制性内切酶位点，易于克隆扩增的cDNA片段。所有的引物由美国LifeTechnologies合成。
最初的cDNA序列位于6326-7136位，在6957位带有一个单碱基删除，这段序列由引物对ORF2F/ORF2Ra克隆自ORF2区域。但是，新的E2 cDNA序列(即SE ID NO：1)可以用同样的上游引物ORF2F和新的下游引物ORF2Rb从同一区域克隆出来，ORF2Rb位于6932-6956位核苷酸处。新克隆的序列编码相同的pE2肽(即SEQ IDNO：2)，但新的终止密码下游的序列被去除。
表9 RT和PCR引物
| 引物* | 目的 | 位置 | 序列 | 酶切位点 |
| E3R | RT | 5508-5529 | 5′-CGGGGAGTCAACATCAGGCACT-3′ | |
| E5R | RT | 7117-7140 | 5′-AAGCAAATAAACTATAACTCCCGA-3′ | |
| ORF2F | 克隆 | 6326-6350 | 5′- GCTGGATCCCAGCTGTTCTACTCTCGTCCCGTCG-3′ | BamHI |
| ORF2Ra | 克隆 | 7117-7136 | 5′- GGCGAATTCCAAATAAACTATAACTCCCGA-3′ | EcoRI |
| ORF2Rb | 克隆 | 6932-6956 | 5′-GGCGAATTCGGGGGGCTAAAACAGCAACCGCGGA3′ | EcoRI |
| ORF3F | 克隆 | 5364-5384 | 5′- CCGGGATCCGACCTCGTGTTCGCCAACCCG-3′ | BamHI |
| ORF3R | 克隆 | 5457-5477 | 5′ -CAGGAATTCCTTAGCGGCGCGGCCCCAGCTG-3′ | EcoRI |
| A3R | RT-PCR | 4566-4586 | 5′-GGCTCACCGGAGTGTTTCTTC-3′ | |
| A5F | RT-PCR | 4341-4362 | 5′-CTTTGATGACACCGTCTTCTCG-3′ | |
| B3R | RT-PCR | 4554-4575 | 5′-GTGTTTCTTCCAAAACCCTCGC-3′ | |
| B5F | RT-PCR | 4372-4392 | 5′-GCCGCAGCAAAGGCATCCATG-3′ |
*引物是参照中国HEV分离株(DDBJ登录号D11092)的序列而设计。
非HEV序列用下划线表示。
目的cDNA序列的PCR扩增是将5ul cDNA加入45ul PCR混合物中(5ul 10×Taq缓冲液)[Boeringer Mannheim]；4ul 2.5mM dNTP混合物；1.0ul的每种引物(150ng/ul)；1ul Taq DNA聚合酶(1U/ul)[Boeringer Mannheim])和33ul超纯水。加入50ul矿物油于PCR混合物表面。热循环条件为：94℃变性40秒；57℃复性40秒；72℃延伸1分钟。从ORF2和ORF3得到的PCR产物分别命名为E2和E3。克隆至pGEX载体
PCR产物用酚-录仿抽提，然后用乙醇沉淀。产物E2和E3以及用BamHI和EcoRI(Boeringer Mannheim)消化。pGEX20载体由香港大学微生物系Liang Cao博士馈赠。它来源于pGEX表达载体(Smith等人，1988)，其多克隆位点为5’-CCGCGTGGATCCGAAATTCCTCGAGATCGATTAG-3’，含有BamHI、EcoRI、XhoI和ClaI限制性剪切识别序列。消化的片段用琼脂糖凝胶电泳分离，切出目的条带，电洗脱后用乙醇沉淀。之后，用T4连接酶(Boeinger Mannheim)将E2和E3连至pGEX20。用基因脉冲器[BIO-RAD]电转，将重组质粒pGEX20-E2和pGEX20-E3转化到DH5α大肠杆菌中，涂布在带有青酶素(100ug/ml)的LB琼脂板上(Sambrook等人，1989)。挑选20个转化克隆提取质粒，质粒进行BamHI和EcoRI消化，选择预计插入片段的重组子(图6)。本研究中所用的所有质粒都用QIAgenminiplasmid试剂盒制备(QIAgen，Hilden，德国)。
测序
用ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit[PERKIN ELMER]进行DNA测序。结果显示，811bp的E2序列位于6326-7136位，在6957位带有一个单碱基删除，推测是由PCR扩增错误引起。产生的移码突变引起翻译在6968位的一个新终止密码处提前终止，产生一个比预计小的213氨基酸、分子量为23kD的多肽，而不是最初期望的267个氨基酸。E2的位置及相关片段如图1所示。
实施例2 HEV多肽的产生和纯化
GST融合蛋白的表达
重组质粒转化到BL21大肠杆菌中。挑选单克隆于2×YTA培养基(蛋白胨16g/L；酵母膏10g/L；NaCl 5g/L；青霉素100ug/L)。4ml过夜培养物接种到400ml 2×YTA培养基中，在28℃培养至OD600大于等于0.5。加入IPTG[Pharmacia Biotech，美国](400ul 100mM溶液)，继续培养5-6小时。在Beckman J2-MC转子JA-14以7000转/分钟离心10分钟，收获细胞。
纯化
沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS：0.8％ NaCl；0.02％KCl；0.144％Na2HPO4；0.024％KH2PO4，pH7.0)洗涤一次，重悬于20ml PBS，用SONIPREP 150[MSE]超声破碎(30秒超声；30秒停；35个循环；power18-22)。超声后，加入Triton-X100(Sigma，美国)至终浓度为1％，温和振荡混合物30分钟。细菌裂解物在4℃离心，收集上清。融合蛋白的批次纯化根据”GST Fusion Protein System Manual”用谷胱甘肽凝胶-4B[Phamacia Biotech，美国]进行。结合融合多肽用洗脱缓冲液(10mM还原谷胱甘肽溶于50mM Tris-HCl，pH8.0)洗脱两次，相应于ORF2和ORF3 cDNA序列分别命名为GE2和GE3。
凝血酶剪切结合于Bulk基质的融合蛋白
凝血酶[Pharmacia Biotech，美国](5ul的1U/ul溶液)和95ulPBS加入到的100ul结合于谷胱甘肽凝胶-4B的GE2，于22℃温育16小时。离心收集上清，将第2次基质洗涤的上清汇集在一起。这种由凝血酶剪切出的蛋白命名为pE2。
实施例3 HEV多肽的鉴定
SDS PAGE(SDS聚丙烯酰铵凝胶电泳)分析
根据标准方法(Sambtook等人，1989)制备10％SDS聚丙烯酰铵凝胶。4ug多肽样品上到凝胶上，用Minigel TwinG42[Biometra，德国]电泳槽于100伏电泳3个小时。凝胶用考马斯亮兰R250混合物(45ml甲醇，45ml水和10ml冰乙酸)染色。
Western印迹
SDS-PAGE结束后，用Mini-PROTEIN II Cell电转仪[BIO-RAD]在100伏条件下进行一小时，将凝胶中的蛋白被转移到0.45um的硝酸纤维膜上[BIO-RAD，美国]。在1×PBS配制的5％脱脂奶[Carnation，Nestle]中4℃封闭过夜后，将膜与来自戊肝病人的血清(1∶500)或来自几内亚猪的抗GST血清(1∶1000)在室温反应1.5小时。洗涤三次，每次用含0.05％Tween20的PBS洗5分钟，将膜与偶连于辣根过氧化物酶(HRP)的Protein-A[BIO-RAD，美国]在室温反应1.5小时。再洗三次，将膜与3-氨基-9-乙烷基咔唑[AEC SinggleSolution，ZYMED，美国]在室温反应5-10分钟，产生阳性带。将膜转移到水里而终止颜色反应。以上所说的血清和偶联物都是在封闭缓冲液(用1×PBS配制的5％脱脂奶[Carnation，Nestle]中稀释)。
实施例4 检测抗HEV IgG和IgM的ELISA法的建立
血清来源
研究了96份采集于香港皇后玛珈丽医院的非甲、非乙、非丙型肝炎病人血清。其中的74份进一步用商用HEV试剂盒[Genelabs，新加坡]测定。90份健康献血者的血清采集自王后玛丽医院。
用HEV多肽抗原进行ELISA检测
用0.063ug/ml的纯化pE2肽(在0.05M pH9.5的碳酸钠溶液中的浓度为6.3ng/100ul)或0.23ug/ml的纯化GE3多肽(在0.05MpH9.5的碳酸钠溶液中的浓度为23.0ng/100ul)包被聚苯乙烯微孔滴度板[Nunc，丹麦]，用于进行pE2或GE3的特异性测定。使用的多肽浓度预先调整到最佳。在4℃孵育过夜后，用350ul洗涤缓冲液(含有0.05％Tween20的PBS)洗一次，然后用含2％小牛血清白蛋白(BSA)[Sigma，美国]的PBS在4℃封闭24小时。板用洗涤缓冲液洗两次。加入以1∶100稀释的0.1ml的血清样品到双孔(稀释液：含1％BSA和0.2％Bronodox的PBS)，检测HEV抗体水平。在37℃温育30分钟后，微孔用洗涤缓冲液洗5次。与1∶25,000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的人IgM特异的抗血清[BIOSOURC]反应以检测IgM抗体，与1∶16,000稀释的HRP偶联的蛋白A[BIO-RAD]反应以检测IgG抗体(稀释液：含1％BSA、0.2％bronidox、10％蔗糖的PBS)。37℃温育30分钟后，再洗涤5次，加入100ul TMB底物(3，3’，5，5’-四甲基对二氨基联苯)[Diesse，意大利]。在37℃温育15分钟后，用0.3M硫酸终止反应。用Anthos 2001微孔板读数仪[ANTHOS LAB]在450nm波长读板。为了能够比较不同测定批次获得的结果，每次测定都包括一份参考血清，每一次测定获得的测试血清的OD值都针对当次获得的参考血清的OD值进行标准化处理。抗pE2 IgG的阈值设定为由Western印迹测定无反应的血清的平均OD值的3SD。抗pE2IgM的阈值设定为健康献血者的血清的平均OD值的3SD。
pE2 IgG亲和力测定
血清进行系列稀释，以双孔方式与包被了pE2的微孔板反应。37℃温育30分钟后，洗板，再用PBS(对照)或含有4M尿素的PBS在室温下处理10分钟。再洗板，然后如上与HRP-蛋白A偶联物反应。
实施例5 用Western印迹检测抗pE2 IgG
血清来源
实施例4中所用的所有血清用于Western印迹技术重新测试Western印迹
将34ug纯化的pE2上样到SDS聚丙烯酰铵凝胶的70mm宽的单一泳道上，以100伏电泳3小时。电泳后，在一个MINI-PROTEIN IICell[BIO-RAD]电转仪中，以100伏电转1个小时，将多肽转移到一张0.45um的干净硝酸纤维素膜[BIO-RAD]。在封闭缓冲液中于4℃振荡过夜，将膜剪成2mm的条。将条与每份以1∶250稀释的血清分别孵育1.5小时。然后用洗涤缓冲液将条洗3次，每次5分钟，再与以1∶30,000稀释的碱性磷酸酶偶联的羊抗人IgG[Sigma，美国]在室温孵育1.5小时。洗涤3次，加入BCIP/NBT混合物[Gibico BRL，美国]以进行颜色反应，将条放入水中以终止反应。结果证实，由ELISA检测的大多数抗体是那些能结合于pE2的二聚体形式而不是其单体形式的抗体。
实施例6 免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)
特异兔多克隆抗体的产生
用于产生HEV抗体的抗原是谷胱甘肽S转移酶融合蛋白GE2形式的pE2肽。重2.5-3.0公斤重的雌白兔用100ug抗原免疫。第一剂量中含有等体积的完全福氏佐剂。以后的剂量以10-14天为间隔，其中加入了不完全福氏佐剂。当用ELISA检测到1∶10,000稀释的兔血清中的特异抗体时，通过静脉给予兔子100ug溶于PBS的抗原进行刺激。刺激后的第4天，通过心脏穿刺采血。用Western印迹和ELISA评估特异抗体。
粪便悬浮液的制备
在广州第一人民医院收集了13份急性戊肝病人的粪便。在接种HEV后的0-30天收集3只实验感染HEV猴子的粪便。
5克粪便样品与20ml 1×PBS混匀，在4℃孵育1小时。混合物以1500转/分钟离心10分钟，收集上清用于免疫捕获。
贝类匀浆上清液的制备
64份贝类样品收集于香港市场，17份收集于环境保护系。
将20克贝肉彻底混匀，匀浆与100ml 0.2M甘氨酸-0.15M NaCl缓冲液(pH9.5)和2ml Cat-Floc贮存液(1％W/V)混匀。得到的混合物经涡旋混匀，在4℃孵育10分钟。然后以1000转/分钟离心5分钟。收集上清用于免疫捕获。
HEV颗粒接种
含有HEV颗粒的胆汁由Zhuang Hui教授(北京医科大学)慷慨馈赠，肝汁是采自确证实验感染了HEV的恒河猴。胆汁用含1％的PBS稀释200倍，即为贮存液。贮存液从50至56进行5倍系列稀释后，即为工作液。10ul的每一种工作液与5ml水、粪便上清液或贝类上清混匀，产生接种了HEV的样品，用于IC-RT-PCR和直接RT-PCR比较。
免疫捕获
用50mM碳酸钠/重碳酸钠缓冲液(pH9.6)以1∶200倍稀释抗血清，用作包被溶液。Nunc-Immuno片[Nunc，Denmark]用1ml包被溶液在37℃包被4小时。去掉抗血清，加入1ml含2％小牛血清白蛋白(BSA)的PBS，在37℃温育1小时。然后用含0.05％Tween20的PBS洗涤，转移至一个管子中用于免疫捕获。在管中加入4.5ml贝类悬浮液或20％粪便悬浮液，管子在4℃温和振荡过夜。免疫片，用含0.05％Tween20的PBS洗涤3次，转移到小离心管中用于提取RNA，进行巢式RT-PCR以检测HEV RNA。
病毒RNA提取
140ul无RNAse水和560ul AVL缓冲液加入到装有免疫片的管中。然后根据”QIAgen Vital RNA Handbook”的说明提取病毒RNA。之后，1/10体积2M醋酸钠(pH4.6)和1倍体积的异丙醇加入到纯化的RNA中。混匀混合物，在-20℃放置1个小时，然后在4℃以14,000转/分钟离心15分钟。沉淀用预冷的70％乙醇洗涤1次。离心后，小心去掉乙醇，沉淀在室温空气干燥15分钟，然后反转录成特异的cDNA。
反转录(RT)和巢式PCR
用于RT和PCR的引物列于表9。外部的引物对为A5F和A3R，内部的引物对为B5F和B3R。
RT-PCR：每一份RNA沉淀与20ul RT混合物混匀，20ulRT混合物包括4ul 5×RT缓冲液[Boeringer Mannheim]；1.6ul 2.5mM dNTP；0.2ul 25/ul的禽成髓细胞血症病毒(AMV)[Boeringer Mannheim]；0.625ul 40U/ul的RNAsin[Boeringer Mannheim]；1ul 150ng/ul的反向引物(A3)；12.6ul无RNAse的水。在42℃温育1个小时后，将5ul cDNA加入45ul PCR混合物中，45ul PCR混合物包括5ul 10×Taq缓冲液[Boeringer Mannheim]；4ul 2.5mM dNTP混合物；1.0ul正向和反向引物A3和A5(150ng/ul)；1ul 1U/ul的Taq DNA聚合酶[Boeringer Mannheim])和33ul超纯水。将50ul矿物油加在PCR混合物表面。扩增在DNA Thermal cycler 480[Perkin-ElmerCetus]PCR仪上进行，热循环条件为：94℃变性40秒；57℃复性40秒；72℃延伸1分钟20秒。总共运行35个循环，最后在70℃自动延伸。
巢式PCR和amplicon检测：2ul第一次PCR产物加入到48ul PCR混合物中，其成份除了引物为B3和B5外与第一次PCR相同.5ul PCR产物和50bp的DNA ladder[GibcoGRL]上样于2％琼脂糖凝胶(TBE缓冲液配制)，以100伏电泳30分钟。凝胶用0.5ug/ml的溴化乙锭染色15分钟，然后在紫外灯下观察。
实施例7 pE2在针对HEV的保护中的作用
动物
野生恒河猴经一个月隔离后，采血检测ALT和HEV抗体。排除ALT/AST超过60或抗HEV IgG阳性的猴子。将猴子分成两组，一个为试验组，一个对照组。每组由3只动物组成。
免疫接种
实验组每星期进行1次血管内免疫，共4次，每一剂量含100ug纯化的pE2.第一剂量含有等体积的完全福氏佐剂。后来的剂量中含有不完全福氏佐剂。对照动物注射含相应佐剂的安慰剂。每周采集血清样品用于检测HEV抗体。当特异抗体达到一个满意水平后，给予动物一个I/V刺激。两组动物在最后一次免疫两周后，用105基因组当量的HEV同源株进行静脉内注射。感染后，每两天收集一次病毒样品，每周收集一次外周血样品，持续5个星期。用ficoll-hypaque梯度离心分离血浆和外周单核血细胞(PMBC)(Kanof等人，1998)。在一台自动分析仪上(Model 7170，HITACHI，日本)检测新鲜采集的血清样品中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。贮存血浆样品用于HEV抗体和HEV基因组的检测。
HEV颗粒攻击
两组动物在最后一次免疫两周后用105基因组当量的HEV同源株进行静脉内注射。
灵长类监测
感染后，每两天收集一次病毒样品，每周收集一次外周血样品，持续5个星期。用ficoll-hypaque梯度离心分离血浆和外周单核血细胞(PMBC)(Kanof等人，1998)。在一台自动分析仪上(Model7170，HITACHI，日本)检测新鲜采集的血清样品中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。贮存血浆样品用于HEV抗体和HEV基因组的检测。
用北京医科大学生产的商用HEV ELISA试剂盒检测HEV抗体水平，也用包被了纯化的pE2肽的微孔滴定板进行测定。用Western印迹检测抗纯化的病毒多肽的抗体，其中约有0.5ug的pE2或100ug的GE3被上样到70mm宽的10％SDS聚丙烯酰铵凝胶上。电泳后，病毒多肽经电转印迹到硝酸纤维膜上。膜在5％脱脂奶中经4℃振荡过夜，再剪成2mm的条备用。1∶2000稀释的辣根过氧化物酶偶联的蛋白A(BIO-RAD，美国)用作第二抗体。
根据生产者的说明，分别用QIAmp RNA blood mini-kit和QIAgenViral RNA kit(QIAGEN，德国)提取PMBC和血浆中的病毒RNA。纯化的病毒RNA进行反转录，然后用巢式PCR扩增。用于反转录的引物为A3R。外侧引物对为A5F和A3R，内侧引物对为B5F和B3R(表9)。
免疫捕获法用于检测粪便样品中的HEV。聚乙烯片[Nunc，Denmark]用1ml 1∶100稀释的超免疫兔抗pE2血清在37℃包被4小时。包被的片用1ml含2％小牛血清白蛋白(BSA)的PBS在37℃温育1小时进行封闭。然后用含0.05％Tween20的PBS洗涤，片转移至一个含4.5ml 20％粪便上清的管子中。管子在4℃温和振荡过夜。然后将片用含0.05％Tween20的PBS洗涤3次，转移到一个干净的管中，用QIAgen Viral RNA kit(QIAGEN，德国)提取RNA。纯化的病毒RNA进行如上所述的反转录和扩增。
工业应用
克隆自戊型肝炎病毒(HEV)中国株基因组的、具有高度免疫原性的病毒多肽pE2，在研制用于HEV检测的可靠诊断方法和诊断测定中，以及在研制人类针对HEV的保护的疫苗组成和疫苗方法中都有很大用途。
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Claims (23)
1.一种纯化和分离的肽pE2，具有由SEQ ID NO：2确定的氨基酸序列。
2.一种重组融合蛋白，包括融合于权利要求1所述的氨基酸序列的谷胱甘肽S-转移酶。
3.一种产生如权利要求1所述的pE2肽的方法，其可通过化学合成或重组DNA表达。
4.一种纯化和分离的核酸分子E2，包括由SEQ ID NO：1确定的DNA序列，或其简并性序列。
5.一种纯化和分离的核酸分子，具有编码权利要求1所述的pE2肽的DNA序列。
6.一种纯化和分离的核酸分子，具有由SEQ ID NO：3确定的序列。
7.一种含有权利要求4或5的核酸分子的载体，其特征在于一旦将载体导入一种合适的宿主细胞，其能够表达核酸分子。
8.根据权利要求7的载体，其特征在于载体是一种质粒。
9.根据权利要求8的载体，其特征在于宿主细胞是真核细胞。
10.根据权利要求7的载体，其特征在于宿主细胞是大肠杆菌。
11.一种用权利要求8-10所述的任何一种载体转化的宿主细胞。
12.一种用于产生如权利要求1-2所述的任何一种肽或蛋白的方法，包括将编码这种肽或蛋白的核酸分子插入一种载体构建体，使它能够在一种合适的宿主细胞中表达，用此载体构建体转化宿主细胞，培养转化的宿主细胞，并且分离和纯化得到的肽或蛋白产物。
13.一种产生针对权利要求1所述的任何一种pE2肽之纯化的抗体的方法，包括将pE2肽以免疫学有效剂量注射到一种非人的哺乳动物宿主中，分离和纯化产生的抗体。
14.一种纯化的抗体，其由如权利要求1所述的任何一种pE2肽刺激产生。
15.一种用于针对戊型肝炎病毒感染的免疫个体的疫苗组合物，包括如权利要求1所述的任何一种pE2肽，以及一种药理学上可接受的载体。
16.一种用于检测抗戊型肝炎病毒(HEV)抗体的诊断检测试剂盒，包括：
●权利要求1所述的肽pE2；
●一种指示剂，其能够检测一种带有pE2肽的免疫复合物(抗原-抗体)。
17.根据权利要求16的诊断检测试剂盒，进一步包括：
●对照标准；
●样品稀释液和/或洗涤缓冲液。
18.根据权利要求16或17的诊断检测试剂盒，其特征在于pE2肽固定于一种固相支持物上。
19.根据权利要求18的诊断检测试剂盒，其特征在于固相支持物是滴定微孔板的壁。
20.一种检测生物学测试样品中戊型肝炎病毒分析物的诊断试剂，包括权利要求14所述的纯化的抗pE2抗体。
21.如权利要求14所述的纯化的抗pE2抗体的应用，作为检测生物学测试样品中戊型肝炎病毒分析物的诊断试剂。
22.一种用于检测生物学测试样品中戊型肝炎病毒分析物的诊断检测试剂盒，包括权利要求20中所述的诊断试剂。
23.根据权利要求22的诊断检测试剂盒，其特征在于纯化的抗pE2抗体固定于一种固相支持物上。
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