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CN1056382C - 改进的丙型肝炎诊断试剂 - Google Patents

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CN1056382C CN94191954A CN94191954A CN1056382C CN 1056382 C CN1056382 C CN 1056382C CN 94191954 A CN94191954 A CN 94191954A CN 94191954 A CN94191954 A CN 94191954A CN 1056382 C CN1056382 C CN 1056382C
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Abstract

本发明涉及丙型肝炎病毒核心蛋白和非结构3蛋白(NS3)的抗原表位，包膜蛋白的抗原表位，非结构4蛋白的抗原表位，HCV非结构5蛋白的抗原表位以及含有这些表位的重组蛋白；生产重组蛋白的方法；一种包含重组蛋白的用于诊断待测血清样品中抗丙型肝炎病毒抗体的试剂；利用该试剂诊断丙型肝炎的方法。

Description

改进的丙型肝炎诊断试剂
发明领域
本发明涉及丙型肝炎病毒(HCV)特异性表位，包含一或多个HCV表位的重组蛋白以及用所述重组蛋白检测待测血清样品中丙型肝炎病毒抗体的方法。更具体地，涉及HCV核心蛋白和非结构3蛋白(NS3)的表位及包含这些表位的重组蛋白，HCV包膜蛋白和非结构4蛋白的表位及包含这些表位的重组蛋白，HCV非结构5蛋白表位及包含这些表位的重组蛋白；生产这些重组蛋白的方法；在待测血清样品中诊断丙型肝炎病毒的试剂，该试剂包含所述的重组蛋白；以及用所述试剂诊断丙型肝炎的方法。
发明背景
丙型肝炎病毒是渐进性肝硬变或肝细胞癌的主要原因，据报道大约70～80％由输血引起的肝炎由此病毒引起(Alter，H.J.等，Lancet，2，838-841(1975)；和Dienstag，J.L.等，Seminar Liver Dis.，6，67-81(1986))。所述病毒为其为单链正股RNA病毒，从所述链的开放读框(ORF)编码一多蛋白前体(Choo，Q.L.等，Science 244，359-362(1989)；及Choo，Q.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，2451-2455(1991))。
丙型肝炎病毒基因结构与黄病毒、瘟病毒相似(Miller，R.H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2057-2061(1990)；及Muraiso，K.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.172，511-516(1991))，依所述的相关性推测丙型肝炎病毒多蛋白从N-端至C-端为：核心-包膜蛋白1(E1)-包膜蛋白2/非结构1蛋白(E2/NS1)-非结构2蛋白(NS2)-非结构3蛋白(NS3)-非结构4蛋白(NS4)-非结构5蛋白(NS5)(Choo，Q.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，2451-2455(1991)；Takamizawa，A.等，J.Virol.，65，1105-1113(1991)；及Kato，N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，6524-6528(1990))。
丙型肝炎病毒的感染可以通过用聚合酶链反应(PCR)直接从血样中检测丙型肝炎病毒RNA而进行诊断(Hosoda，k.等，Hepatology，15，777-781(1992)；Abe，K.等，Hepatology，15，777-781(1992)；Abe，K.等，Hepatology，15，690-695(1992)；Alter，H.J.，Annals of Internal Medicine 115，644-649(1991))，通过这种方法可以很早地检测到病毒RNA，即在感染后1到2星期内即可检测，然而由于需分析大量的样品，因此这种方法费用高，时间长。另一种诊断方法是例如通过使用C100-3蛋白的酶联免疫测定检测存在于血清样品中的抗丙型肝炎病毒抗体(见Houghtonet al.，PCT WO 89/04669；WO90/11089)。Kuo，G.等在Science，244，362-384(1989)中披露了。70％以上输血后患肝炎病人具有抗C100-3蛋白抗体。
然而，C100-3抗原作为诊断试剂的活性组分只能与慢性丙型肝炎病人体内抗体反应，不能和早期急性丙型肝炎患者体内抗体反应，因为抗体通常在HCV感染后4至6个月上升。所以，在疾病早期常出现假阴性(Alber，H.J.，et al.，N.Engl.J.Med.，321，1494-1500(1989)； Myamura，T.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，983-987(1990))，而且在由于自身免疫疾病而不是HCV造成的肝炎情况下，通常有相当一部分呈假阳性结果(McFarlane，I.G.，et alLancet，335，754-757(1990))。
Okamoto等人公开了日本丙型肝炎患者血清中的HCV的cDNA克隆的核苷酸序列，该序列包括5′末端区和编码核心蛋白及包膜蛋白的结构基因，并与美国Chiron公司从黑猩猩血清中分离的HCV序列进行了比较，Okamoto等发现料从日本型HCV衍生的一种亚特异性的HCV及抗原的特异性，以制备疫苗和诊断试剂用于抗日本型HCV(Jpn.J.Exp.Med.，60，167-177(1990))。Harad等人还在《病毒学杂志》(65卷，3015页，1991年)报道，当结构基因的5′末端编码的核心蛋白用作抗原诊断可能存在于HCV患者样品中的抗体时，此法比C100-3蛋白早6至8周检查出抗体。
另外，Choo等公开了一种利用核心结构基因表达的核心蛋白和NS3基因表达的C33C蛋白的改进的诊断方法(英国医学通报46卷，423-441页，1990)；Okamoto等采用部分核心结构基因核苷酸序列的合成多肽诊断丙型肝炎。美国UBI公司开发了另一种诊断方法，其采用由核心结构基因编码的15至16个氨基酸组成的合成多肽为抗原检测抗HCV抗体(WANG，C.Y.，EP442394(1991)；Hosein，B等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，3647-3651(1991))；另外，美国Ortho Diagnostic Systems Inc报道了第二代更为敏感的HCV抗体诊断试剂，它是将C22-3核心抗原、NS3部分蛋白C33C和NS4部分蛋白C200加入已有的第一代诊断试剂中而制备的(Mc Hutchison等，《肝脏病学)》，15卷，19～25页，1992年)；Alter描述了有可能从HCV感染15至20周的患者血清中检测出抗HCV抗体(Annals of Internal Medicine，115，644-649(1991年))。
本发明人也披露一株与美国型或日本型HCV不同的韩国型丙型肝炎病毒(KHCV)内部基因结构；由重组酵母或大肠杆菌表达KHCV CORE基因的产物KHCV UBCORE14蛋白，KHCV NS3基因的产物KHCV UB897，KHCV NS5基因的产物KHCV403蛋白和KHCV包膜基因产物包膜蛋白；证实了所述表达蛋白质的免疫特异性；报道了纯化所述蛋白质的方法；开发了以KHCV抗原蛋白质的酯联免疫吸附试验(ELISA)检测丙型肝炎患者血清中HCV抗体的改进的诊断方法(见韩国专利文献93-683)。
本发明人致力于开发较所述试剂更为精确、快速的HCV诊断试剂，结果意外地发现几个与HCV抗体反应更灵敏、精确的HCV抗原表位。
发明概述
因此，本发明的主要目的在于提供具有改进的与HCV抗体反应性的所述抗原表位；以及包含一或多个HCV抗原表位的重组蛋白质。
本发明的另一目的是提供编码所述抗原表位或所述重组蛋白质的核苷酸序列；含有编码所述重组蛋白质的核苷改序列的重组表达载体，该载体在表达时可以生产含一或多个HCV抗原表位的重组蛋白质；以及用重组表达载体转化的宿主细胞。
本发明的又一目的是提供生产包含一个或多个HCV抗原表位的重组蛋白的方法，该方法包括培养用含编码所述重组蛋白的核苷酸序列的重组表达载体转化的所述宿主细胞。
本发明的再一目的是提供包含一或多种重组蛋白的诊断试剂，所述的重组蛋白含有一或多个HCV抗原表位作为活性组分来检测待测样品中的HCV抗体；以及包含所述试剂的诊断盒。
本发明的另一目的是提供采用所述诊断试剂或试剂盒的更为快速、准确的HCV早期感染诊断方法。
根据本发明的一个方面，提供了HCV抗原表位，包含：KHCV NS4E-HCV非结构4蛋白的抗原表位；KHCV EIG、KHCV E2A和KHCV E2E蛋白-HCV包膜蛋白的抗原表位；KHCV COREEPI蛋白-HCV核心蛋白的抗原表位；KHCV518蛋白-HCV非结构3蛋白的抗原表位；以及，包含非结构5蛋白抗原表位的KHCVNS5-1，2蛋白质；以及包含一个或多个所述抗原表位的重组蛋白。
附图简要说明
本发明的上述或其它目的可由结合以下附图的较佳实施方案的描述而更加清楚，其中：
图1分别显示编码核心蛋白(COREEPI)和非结构3蛋白表位的核苷酸序列及其编码的多肽的氨基酸序列。
图2分别显示编码NS4蛋白表位(NS4E)和非结构3蛋白(EIG，E2A和E2E)表位的核苷酸序列及其编码的多肽氨基酸序列。
图3描述KHCV NS5-1.2蛋白质的核苷酸序列及其编码的多肽的氨基酸序列。
图4代表以聚合酶链式反应(PCR)扩增KHCV897DNA片段所用的每一引物的位置。
图5示出用于在大肠杆菌中表达KHCV897DNA片段的表达载体的构建。
图6A代表KHCV897 DNA片段在大肠杆菌细胞中表达后的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果；图6B显示以丙型肝炎病人血清对图6A的凝胶进行蛋白质印迹分析的结果。
图7代表以PCR扩增包膜蛋白基因不同DNA片段所用的每一引物的位置。
图8示出用于在大肠杆菌中表达部分包膜蛋白的DNA片段的表达载体的构建。
图9A显示编码部分包膜蛋白的不同大小DNA片段在大肠杆菌中表达后的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果；图9B显示以丙型肝炎病人血清对图9A的凝胶进行蛋白质印迹分析的结果。
图10示意性示出表达UBCORE518蛋白的表达载体构建过程。
图11A显示UBCORE518 DNA片段在大肠杆菌中表达后的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果；图11B显示以丙型肝炎病人血清对图11A的凝胶进行蛋白质印迹分析的结果。
图12示意性示出用于表达包含遍在蛋白基因和编码非结构4蛋白(NS4E蛋白)的一个抗原表位的DNA片段的重组DNA的表达载体的构建。
图13示意性示出用于表达编码包含遍在蛋白和含包膜蛋白E1G，E2A，E2E的表位的融合蛋白的UBE1E2蛋白的重组DNA的表达载体的构建。
图14A显示重组UBE1E2蛋白在大肠杆菌细胞中表达后的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果。
图14B显示以丙型肝炎病人血清对图14A的凝胶进行蛋白质印迹分析的结果。
图15示意性示出用于表达编码包含遍在蛋白，NS4E蛋白，E1E2蛋白的UBNS4E1E2蛋白的重组DNA的表达载体的构建。
图16A显示编码UBNS4E1E2蛋白的重组DNA在大肠杆菌细胞中表达后的聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)结果。
图16B显示以丙型肝炎患者血清对图16A的凝胶进行蛋白质印迹分析的结果。
图17示意性示出用于表达编码包含遍在蛋白和NS5-1.2蛋白的USNS5-1.2蛋白的重组DNA的表达载体的构建。
图18A显示UBNS5-1.2蛋白在大肠杆菌细胞中表达后的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果；图18B显示以丙型肝炎病人血清对图18A的凝胶进行蛋白质印迹分析的结果。
图19A显示KHCV403蛋白和重组UBNS5-1.2蛋白在大肠杆菌细胞中表达后的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果；图19B显示以丙型肝炎患者血清对图19A的凝胶进行蛋白质印迹分析的结果。
发明详述
本文引用的参考文献皆以其全文作为本发明的参考文献。
以下术语将具如下定义：
术语“丙型肝炎病毒”是指引起非甲非乙型肝炎或丙型肝炎的病毒。本文中术语HCV与丙型肝炎病毒交替使用。
术语“韩国型丙型肝炎病毒”或“KHCV”指一株新型HCV，从韩国丙型肝炎患者体内分离得到；其cDNA具有一开放读框，编码的氨基酸序列在第842，849和853位分别是苯丙氨酸，亮氨酸和苏氨酸，或是亮氨酸，苯丙氨酸和丙氨酸。
术语“抗原表位”是指一种多肽的抗原决定簇，其能够在免疫活性宿主体内引起免疫反应和/或能够自身特异性的与一种互补抗体结合。本发明的抗原表位通常至少由6个氨基酸组成，优选由7或8个氨基酸组成。
本文中所用的其它术语具有与现有技术所用的相同的和传统的含义。
下文中HCV cDNA的核苷酸序号或HCV蛋白的氨基酸序号是基于韩国专利公开出版物93-683号公开的全KHCV核苷酸序列或氨基酸序列。
以下将更详细地描述本发明。1.抗原表位的确定
HCV，例如KHCV(KHCV-LBC1，于1991年5月14日保藏在ATCC，保藏号为ATCC 75008，见韩国专利公开出版物93-683号)的cDNA核苷酸序列的信息被用于合成聚合酶链反应的引物，其相应于编码KHCV897蛋白、包膜蛋白或非结构5蛋白的cDNA片段的5’和3’末端。
用所述的引物以KHCV897基因(其在1991年6月27日被保藏于ATCC，保藏号为ATCC68640)、KHCV包膜1基因(其在1991年12月11日被保藏于ATCC，保藏号为ATCC 68878)、KHCV包膜2基因(其在1991年12月11日被保藏于ATCC，保藏号为ATCC 69866和74117)以及KHCV NS5基因(见韩国专利公开出版物93-683)为模板进行聚合酶链反应，以获得KHCV897基因、KHCV包膜1和包膜2基因以及KHCV NS5基因的cDNA片段。将每一cDNA片段插入一个载体，用所述的表达载体转化合适的宿主如大肠杆菌。将由转化的宿主细胞生产的多肽进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后使用丙型肝炎患者的血清进行蛋白质印迹分析，以确定那些特异性地与KHCV抗体反应的多肽为KHCV抗原的表位。也检测了被确定的抗原表位在KHCV cDNA全序列中的位置。
其结果是，发现KHCV 897蛋白的抗原表位存在于KHCV 897蛋白的羧基末端，其是从对应于KHCV cDNA的第4348到4713核苷酸的366个碱基对表达的(见图4所示的KHCV897蛋白的抗原表位的氨基酸和核苷酸的序列)。
对于包膜蛋白，发现表位存在于KHCV包膜1蛋白(E1G蛋白)的羧基末端，其是从对应于KHCVcDNA的第1201到1509核苷酸的309个碱基对表达的；以及存在于KHCV包膜2蛋白(E2A蛋白)的氨基末端，其是从对应于KHCV cDNA的第1510到1749核苷酸的240个碱基对表达的；以及存在于KHCV包膜2蛋白(E2E蛋白)的羧基末端，其是从对应于KHCV cDNA的第2281到2529核苷酸的249个碱基对表达的(见图2示出的E1G、E2A和E2E蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列)。
另外，NS5蛋白的抗原表位存在于NS5蛋白的氨基末端，其是由对应于包括KHCV 403 cDNA片段的第6649到7284核苷酸的1200个碱基对编码的，并以比KHCV403更高的灵敏度特异性地与KHCV患者的血清反应。
2、包括一或多个HCV抗原表位的重组蛋白
HCV抗原的表位对于开发有效和经济的诊断试剂是非常重要的。具体说来，考虑到经济、效果及精确度更优选的是包含一或多个抗原表位的融合蛋白；包含多于一个抗原表位的融合蛋白是最优选的。
作为包含多于一个HCV表位的HCV重组蛋白，优选的是可以包括含有KHCV核心蛋白和NS3蛋白的表位的重组CORE518融合蛋白，以及含有KHCV E1、E2和NS4蛋白的表位的重组NS4E1E2融合蛋白。
这些重组蛋白可以通过含有编码所述的融合蛋白的核苷酸序列的各种表达载体系统进行制备；并且该载体可调控包含所述的融合蛋白和其它可增加蛋白稳定性或促进纯化步骤的特异性蛋白，优选为遍在蛋白的重组融合蛋白的生产。
例如，可通过在细菌如大肠杆菌中表达HCV cDNA片段和遍在蛋白基因的融合多核苷酸，然后体外用遍在蛋白酶UBP1切下遍在蛋白而获得所需的HCV蛋白(Tobias，J.W.et al.，J.Biol.Chem.，266，12021-12028(1991))。包含遍在蛋白和KHCV融合蛋白的重组融合蛋白可以用于本发明的用途，只要其含有KHCV蛋白的必要特征例如HCV抗原性即可。
上述的表达体系可以有效地用于所需的蛋白不稳定以及可被宿主细胞的蛋白酶很容易地消化的场合，因为遍在蛋白可保护所需的蛋白不被蛋白酶攻击或稳定所需的蛋白。另外，与遍在蛋白融合的所需重组蛋白的表达可以用抗遍在蛋白抗体确定，并利用遍在蛋白的特性而很容易地被纯化。
为了获得所希望的包含HCV表位的HCV蛋白，用含有编码HCV表位的HCV cDNA片段的表达载体转化一相容宿主细胞；在允许表达的条件下培养转化后的细胞。
合适宿主的选择受一系列公知因素的影响，这些因素包括，例如与所选择载体的相容性、由重组质粒编码的蛋白的毒性，回收所希望蛋白的容易程度、蛋白质特性、生物安全性及费用。必须均衡考虑这些因素，应该理解的是不是所有的宿主都同等有效地表达特定的重组DNA分子。
本发明中可使用的合适的宿主包括，但不限于，细菌如大肠杆菌和酵母如酿酒酵母。
在宿主细胞中生产的多肽可以通过结合使用传统方法，例如，细胞破碎，离心、透析、盐析、层析、凝胶过滤、电泳和电洗脱来分离和纯化。
本发明的多肽也可以通过合适的方法化学合成，如纯粹固相合成，部分固相方法，片段缩合或经典溶液合成。优选的是由Merrifield(J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1963))公开的固相合成。
另一方面，已知会发生基本上不会改变生物学和免疫学活性的在蛋白质中的氨基酸取代并由Neurath等人描述于The Proteins，Academic Press，New York(1979)，特别是该书的第14页的图5所示。只要由其产生的蛋白质保持相同的抗原特性，则这种功能上等价的氨基酸取代也包括在本发明范围内。
在本说明书中采用标准的单字母或三字母缩写表示核苷酸和氨基酸。这些缩写的含义可在标准的生物化学教科书如Lehninger，Principlesof Biochemistry，Worth Publishers Inc.New York，pp.96，798(1984)中找到。
1)CORE518蛋白的制备
利用KHCV的cDNA核苷酸序列(见韩国专利公开93-683)合成聚合酶链式反应的引物，该引物对应于编码包含KHCV NS3蛋白表位的KHCV518蛋白的KHCV 518 cDNA片段的5′端和3′端，其中一对应于cDNA5′端的引物在其5′端设计有内切酶位点，用以连接到编码核心蛋白表位的COREEPI基因的3′端，另一对应于cDNA3′端的引物设计有终止密码子和内切酶位点。因此，所述引物使得表达融合蛋白从遍在蛋白起始密码子开始，结束于插入的终止密码子，使得融合基因插入表达载体简化。
而且，可以适当使用引物序列将所述编码两个表位的基因相反排列，也可以在两个表位之间插入其它氨基酸序列，只要蛋白质保持同样的抗原特性。
用所述引物和KHCV897基因(于1991年6月27日保藏于ATCC，保藏号ATCC 68640)模板以聚合酶链式反应扩增KHCV518基因，然后内切酶消化KHCV518基因，将其插入ptrp-UB-CORE14质粒，代替除去COREEPI基因的部分KHCV Core14基因，以此构建成表达载体。表达载体转化象大肠杆菌等合适的宿主，转化宿主细胞产生的多肽由15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再以丙型肝炎患者血清进行蛋白质印迹分析，证实CORE518蛋白与KHCV抗体特异性反应。
2)NS4E1E2蛋白的制备
利用KHCV的cDNA核苷酸序列(见韩国专利公开93-683)将编码NS4蛋白表位(NS4E)和包膜蛋白表位(E1G，E2A，E2E)的核苷酸连接在一起，例如，以适当引物进行聚合酶链式反应而连接。首先，PCR引物在E1E2蛋白核苷酸序列的5′端和3′端，编码的包膜蛋白表位如E1G，E2A，E2E，其中一引物在所述核苷酸序列的5′端，引物的5’端设计有21个核苷酸，与NS4基因3′端核苷酸相同，用以连接在NS4基因的3′端；另一引物位于cDNA的3′端，设计有终止密码子和内切酶识别位点。因此，所述引物使得融合蛋白合成开始于遍在蛋白的起始密码子，结束于插入终止密码子，简化了融合基因插入表达载体的过程。
而且，通过适当利用引物，能够将所述四个基因任意排列，也可以将其它氨基酸序列插入任意两个表位之间，只要蛋白质保持原来的抗原特性。
利用所述引物和ptrpH-UB-E1E2质粒(见图16)模板进行聚合酶链式反应扩增E1E2基因。第二聚合酶链式反应以E1E2和NS4基因为模板。得到的NS4E1E2基因以内切酶消化，插入ptrp-UB-CORE14质粒，替代KHCV Core14基因，构建成表达载体。然后表达载体转化合适的宿主如大肠杆菌W3110(ATCC37339)，转化的宿主细胞在适于表达的条件下培养。转化的宿主细胞产生的多肽经15％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以丙型肝炎患者血清对凝胶进行蛋白质印迹分析，证实NS4E1E2蛋白能与KHCV抗体特异性反应。
3)NS5-1.2蛋白的制备
利用KHCV cDNA核苷酸序列(见韩国专利公开93-683)合成PCR引物，该引物对应于编码NS5-1.2蛋白cDNA片段5′端和3′端。其中一引物于其cDNA 5′端设计有内切酶位点，连接在遍在蛋白的3′端，另一cDNA 3′端引物设计有些终止密码子和内切酶位点，因此，所述引物使得融合蛋白合成始于遍在蛋白的起始密码子，止于插入的终止密码子，简化了融合基因克隆在表达载体中的过程。
由所述引物和KHCV-LBC1基因(于1991年5月14日保藏于ATCC，保藏号ATCC 75008；参见韩国专利公开文献第93-683号)模板进行PCR扩增NS5-1.2基因，用内切酶消化所述的NS5-1.2基因，所得基因片段代替KHCV-Core14基因插入ptrp-UB-CORE14质粒，完成表达载体的构建，表达载体转化大肠杆菌等合适宿主，转化宿主细胞生产的多肽由15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后以丙型肝炎患者血清进行蛋白质印迹分析，证实NS5-1.2蛋白与KHCV抗体起特异性反应。
3、包含混合型HCV抗原多肽的诊断丙型肝炎的诊断试剂的制备
根据本发明的诊断试剂包含一个或多个HCV抗原表位，包括KHCV NS4E，KHCV E1G，KHCV E2A，KHCV E2E，COREEPI，KHCV 518和KHCV NS5-1.2，和/或包含一个或多个所述表位的重组蛋白。
而且，本发明提供了包含完成上述程序所必需试剂的诊断试剂盒，其主要由携带KHCV一个或多个表位的含KHCV多肽的诊断试剂组成。
优选的是，所述的诊断试剂包括含KHCV核心蛋白和NS3蛋白表位的重组CORE518融合蛋白，含KHCV E1、E2和NS4蛋白表位的重组NS4E1E2融合蛋白，和/或NS5-1.2重组蛋白。
当诊断试剂为含HCV表位的多个重组蛋白混合物时，其蛋白比例可以任意调整，通常每一组分蛋白为相等摩尔数时是优选的。
根据本发明的新的诊断方法包括下列步骤：
(i)将包含一个或多个KHCV多肽的诊断试剂加在固体支持物上，例如微量滴定板孔，以使所述KHCV抗原吸附于微量滴定板孔的表面；
(ii)将用稀释剂稀释的一种待测样品加到抗原复盖的孔上，若血清中存在HCV抗体，则会形成抗原-抗体复合体；
(iii)向孔中加入一种酶，例如HRP(辣根过氧化物酶)缀合的抗人IgG，以使抗人IgG-HRP与在(ii)中形成的复合体中的抗体结合；以及
(iv)向孔中加入酶的底物，例如过氧化物酶的底物邻苯二胺二盐酸(OPD)和过氧化氢以出现显色反应。当被测血清中含有HCV抗体时，由于酶与底物的反应而会出现特定的颜色。
颜色深度可用微孔阅读器测量，以测定结果为基础可确定HCV抗体的存在。诊断方法所用的固相支持物可以是聚苯乙烯珠或硝酸纤维素滤膜条。
当以本发明的含多个KHCV表位的重组蛋白制备诊断试剂时，其比用只有一个表位的现存HCV抗原的诊断更为经济，准确，而且，本发明的包括含KHCV表位的混合重组蛋白的诊断试剂和试剂盒具有理想的诊断结果。
下列实施例进一步描述而不是限制本发明，实施例中所用的实验方法除另说明外，皆按照下述参考例进行。
另外，除非另有说明，下述的固固混合物的百分比、液液百分比和固液百分比分别以重量/重量、体积/体积和重量/体积为基础。参考例1：用限制性内切酶酶切DNA
在一灭菌的1.5ml eppendorf管中加入限制性内切酶和反应缓冲液，使反应体积在50-100μl之间，反应在37℃进行1-2小时。反应完成后，将反应混合物在65℃热处理15分钟(或在耐热内切酶情况下用苯酚抽提并用乙醇沉淀)以失活限制性内切酶。
本参考例中所用的限制性酶和反应缓冲液购自NEB(New Engand Biolabs，Jolla，MA，U.S.A.)。
用于限制性内切酶反应的10倍反应缓冲液的组成如下：
10×NEB反应缓冲液1：100mMbisTris丙烷-HCl，100mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇(DTT)，pH7.0
10×NEB反应缓冲液2：100mMTris-HCl，100mM MgCl2，500mMNaCl，10mM DTT，pH7.0
10×NEB反应缓冲液3：100mMTris-HCl，100mM MgCl2，1000mMNaCl，10mM DTT，pH7.0
10×NEB反应缓冲液4：200mM Tris-乙酸，100mM乙酸镁，500mM乙酸钾，10mM DTT，pH7.0参考例2：苯酚抽提和乙醇沉淀
酶与DNA反应完成后，反应混合物用苯酚抽提以失活酶或回收反应混合物中的DNA，其中所用的苯酚预先用含10mM Tris-HCl(pH8.0)和1mM EDTA的缓冲液平衡。
苯酚抽提是如下进行的：通过剧烈振荡混合等体积的样品和苯酚；在15000rpm离心混合物5分钟；将水相转移至一新管中。重复上述步骤三次。
然后用等体积的氯仿(氯仿∶异丁醇＝24∶1)抽提上述水相并再分离出水相；向水相中加入0.1体积的3M乙酸钠和2.5体积的无水乙醇；在-70℃存放30分钟或-20℃存放12小时以上后在15000rpm、4℃下离心混合物20分钟以回收核酸。参考例3：连接反应
用购自NEB的T4DNA连接酶和10×连接反应缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH7.0，0.1M MgCl2，0.2M DTT，10mMATP，0.5mg/ml小牛血清白蛋白(BSA))进行DNA的连接反应。反应体积通常为20μl，DNA粘性末端连接用10单位T4连接酶，DNA平末端连接用100单位T4 DNA连接酶。
反应在16℃进行5小时或在4℃进行14小时以上，反应完成后，将反应混合物在65℃加热15分钟以失活T4DNA连接酶。参考例4 转化E.coli
E.coli菌株(例如E.coli HB101(ATCC 33694)，E.coli W3110(ATCC27325)成E.coli JM10.5(ATCC 47016))的转化是采用现有技术中公知的方法，例如，Maniatis等人在Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，N.Y.(1982)中所述，或Cohen在Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A69，2110(1972)中所述。参考例5：寡核苷酸的合成
使用自动固相亚磷酰胺化学法利用一DNA合成仪(Applied Biosystems Inc.，型号：380B，U.S.A.)合成寡核苷酸。
用变性聚丙烯酰胺凝胶(2M尿素，12％丙烯酰胺和bis(29∶1)，50mM Tris，，50mM硼酸，1mM EDTA-Na2)电泳和采用乙腈∶水(50∶50)作洗脱剂的C18 SEP-PAK(Waters Inc.U.S.A)柱色谱纯化合成的寡核苷酸；通过在260nm测量O.D.确定核苷酸的量。参考例6：聚合酶链反应(PCR)
在10-100ng模板DNA、10μl 10×Taq聚合酶反应缓冲液(10mm Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mMMgCl2，0.1％(w/v)明胶)、10μldNTP的混合物(dGTP、dATP、TTP和dCTP备为10mM)、2μg每个引物(通常反应中使用2个引物，当使用3个引物时位于中间的引物的用量为0.02μg)和0.5μl Ampli Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，U.S.A.)组成的混合物中加入适量的蒸馏水以使总体积为100μl，向其中加入50μl矿物油以保护反应混合物不被蒸发。
采用一种热循环仪(Perkin ElmerCetus，U.S.A.)进行PCR，热循环被设成重复25次或更多；所述的循环为：95℃1分钟→55℃1分钟→72℃2分钟，最后在72℃反应10分钟。
反应完成后用酚抽提混合物，用乙醇沉淀回收PCR产物，并将沉淀物溶于20μl TE缓冲溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5)。参考例7：HRP缀合的抗人IgG抗体的制备
用人IgG吸附的sepharose CL-4B亲和柱和蛋白G柱(Pharmacia LKB，Sweden)色谱纯化抗人IgG Fc区(Immunovision Inc.，Arizona，U.S.A.，Cat.No.GHF-1001)的抗体以使所述抗体的纯度超过90％。根据Nakane等在J.Histochemcytochem.22，1084(1974)中所述的高碘酸钠方法用辣根过氧化物酶标记所获得的抗体，方法如下：
在溶于1.2ml蒸馏水(DW)的5mg辣根过氧化物酶(Boehringer Mannheim，Germany，Cat.No.814，393)的溶液中加入0.3ml溶于100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)的0.1M高碘酸钠溶液，混合物在室温下反应20分钟。得到的溶液对1mM乙酸钠缓冲液透析16小时。
1.5ml得到的过氧化物酶溶液与以10mg/ml浓度溶有纯化抗体的1ml 20mM碳酸钠溶液(pH9.5)混合，混合物在室温下反应2小时。随后加入10μl溶于DW的硼酸氢钠溶液(4mg/ml)以通过一还原反应除去未反应的席夫斯碱。由此得到的溶液对磷酸盐缓冲的生理盐水透析过夜，随后过sephadex G-200柱以除去自由抗体或过氧化物酶。实施例1：非结构3蛋白表位的确定<步骤1>部分KHCV 897 DNA片段的扩增(1-1)引物制备
欲扩增编码非结构3蛋白的部分KHCV 897DNA片段，并将其克隆入trp启动子控制下的含遍在蛋白基因的表达载体，需合成下列引物。引物P897T2：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGCGGTGGAATTCATACCCGTT-3′含一个Sac II位点和KHCV-LBC1第3916至3936位核苷酸；引物P518T2：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTATCACCACAGGFCGCCCCTATC-3′含一个Sac II位点和KHCV-LBC1第4195至4216位核苷酸；引物P365T2：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGCGGAGACGGCTGGAGCGCGG-3′含一个Sac II识别位点和KHCV-LBC1第4348至4369位核苷酸；引物P257T2：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTAACATTGGAGAGATTCCTTTC-3′含一个Sac II识别位点和KHCV-LBC1第4447至4468位核苷酸；引物P150T2：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTTTGTCCCTCGGAGTCAATGCT-3′含一个Sac II识别位点和KHCV-LBC1第4564至4585位核苷酸；引物P897SAL：5′-GACTGGACTATTAACACGTATTACAGTCGATCAC-3′含位于KHCV-LBC1第4712位核苷酸后的翻译终止密码子和SalI识别位点；引物P652SAL：5′-GACTGGACTATTACAGCTTTGCAGCGAGCTCGTC-3′含位于KHCV-LBC1第4562位核苷酸后的翻译终止密码子和Sal位点；引物P570SAL：5′-GACTGGACTATTAGAGGGGGATGGCTTTGCCATA-3′含位于KHCV-LBC1第4487位核苷酸后的翻译终止密码子和SalI位点；引物P430SAL：5′-GACTGGACTATTATTGGTCCAGGACCGTGCCAAT-3′含位于KHCV-LBC1第4346位核苷酸后的翻译终止密码子和SalI位点；以及引物P290SAL：5′-GACTGGACTATTAGGCGCCTGTGGTGATGGTCCT-3′含位于KHCV-LBC1第4208位核苷酸后的翻译终止密码子和SalI位点。(1-2)聚合酶链式反应
准备8只试管，每一管装入下列引物：
试管A：引物P897T2 2μg，引物P652SAL 2μg
试管B：引物P897T2 2μg，引物P570SAL 2μg
试管C：引物P897T2 2μg，引物P430SAL 2μg
试管D：引物P897T2 2μg，引物P290SAL 2μg
试管E：引物P150T2 2μg，引物P897SAL 2μg
试管F：引物P257T2 2μg，引物P897SAL 2μg
试管G：引物P365T2 2μg，引物P897SAL 2μg
试管H：引物P518T2 2μg，引物P897SAL 2μg
每一试管加入50ng含KHCV 897 DNA的质粒ptrp-UB-KHCV897(ATCC68640)，10μl 10×聚合酶缓冲液，10μl 2mM dNTP(2mM dGTP，2mMdATP，2mM TTP，2mM dCTP)，2.5单位Taq聚合酶，以蒸馏水调至总体积100μl。
向所述反应混合物中加入50μl矿物油以防液体挥发，重复15次如参考例6所述相同的热循环以进行PCR。(1-3)分离、纯化PCR产物
(1-2)所得的PCR产物以5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，结果为，试管A DNA约为650bp，试管B DNA约为580bp，试管C DNA约为440bp，试管D DNA约为300bp，试管EDNA约为160bp，试管F DNA约为260bp，试管G DNA约为370bp，试管H DNA约为520bp。DNA通过所述聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，分别命名为区段652，区段570，区段430，区段290，区段150，区段257，区段365和区段518。图4指示出每一片段在KHCV897 DNA和所用引物中的位置。<步骤2>表达载体的制备(2-1)内切酶消化区段和载体DNA
2μg<步骤1>所获每一DNA区段在参考例1的NEB缓冲液3中用SacII、SalI酶完全消化，所得片段分别命名为652-T2/L，570-T2/L，430-T2/L，290-T2/L。150-T2/L，257-T2/L，365-T2/L，和518-T2/L。
另一方面，2μg质粒ptrp-UB-CORE14(ATCC68642，见韩国专利公开第93-683)在NEB缓冲液3中用SacII，SacI完全消化，再以7％琼脂糖凝胶电泳分离2.7kb片段，命名为ptrpH-UB-T2/L片段。
上述片段用于下述连接反应：
连接反应A管加入100ng 652-T2/L片段；
连接反应B管加入100ng 570-T2/L片段；
连接反应C管加入100ng 430-T2/L片段；
连接反应D管加入100ng 290-T2/L片段；
连接反应E管加入100ng 150-T2/L片段；
连接反应F管加入100ng 257-T2/L片段；
连接反应G管加入100ng 365-T2/L片段；
连接反应H管加入100ng 518-T2/L片段。每一连接反应管再加入50ng ptrpH-UB-T2/L片段，2μl 10×连接缓冲液，10单位T4DNA连接酶，以蒸馏水调整终体积20μl，于16℃连接12小时。
以连接混合物转化大肠杆菌HB101(ATCC33694)，按参考例4筛选重组表达载体。
含652片段的载体命名为ptrpH-UB-KHCV652；含570片段的载体命名为ptrpH-UB-KHCV570；含430片段的载体命名为ptrpH-UB-KHCV430；含290片段的载体命名为ptrpH-UB-KHCV290；含150片段的载体命名为ptrpH-UB-KHCV150，含257片段的载体命名为ptrpH-UB-KHCV257，含365片段的载体命名为ptrpH-UB-KHCV365；含518片段的载体命名为ptrpH-UB-KHCV518(见图5)。<步骤3>KHCV897部分DNA片段的表达
用<步骤2>制备的每一种载体转化大肠杆菌W3110(ATCC37339)。
转化的大肠杆菌于含50μg/ml氨苄青霉素的液体Luria培养基(6％蛋白胨，0.5％酵母浸出液，1％NaCl)在37℃振荡培养12小时；再将3ml培养液转入300毫升M9培养基中(40mM K2HPO4，22mM KH2PO4，8.5mM NaCl，18.7mM NH4Cl，1％葡萄糖，0.1mM MgSO4，0.1mMCaCl2，0.4％酪蛋白水解氨基酸，10μg/ml维生素B1，40μg/ml氨苄青霉素)；37℃振荡培养4小时，当650nm O.D.值达到0.3时，加入终浓度为50μg/ml的吲哚丙烯酸(IAA)，5小时后，培养液11000转/分离心25分钟，收集大肠杆菌沉淀。<步骤4>KHCV 897蛋白表位的鉴定
上述<步骤3>所得的细胞沉淀按Laemmli法以15％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(《(自然》227期，680页，1970年)；以考马斯亮蓝R250染色确定重组蛋白的表达，结果见图6A。
在图6A中，泳道M代表标准分子量标记，泳道1指具有不含KHCV DNA片段质粒的大肠杆菌产物；泳道2指转化ptrpH-UB-KHCV897大肠杆菌产物；泳道3指转化PtrpH-UB-KHCV290大肠杆菌产物；泳道4指转化ptrpH-UB-KHCV430大肠杆菌产物；泳道5指转化ptrpH-UB-KHCV570大肠杆菌产物；泳道6指转化ptrpH-UB-KHCV652大肠杆菌产物；泳道7指转化ptrpH-UB-KHCV518大肠杆菌产物；泳道8指转化ptrpH-UB-KHCV365大肠杆菌产物；泳道9指转化ptrpH-UB-KHCV257大肠杆菌产物；泳道10指转化ptrpH-UB-KHCV150大肠杆菌产物。
采用Towbin的方法(Towbin等，美国科学院进度，76期，4750页，1979年)，将凝胶中的分离蛋白质转印至硝酸纤维素滤膜(Bio-Rad Lab，孔经0.22μm，U.S.A)，滤膜浸入含0.5％吐温20的PBS中(10mM磷酸盐，pH7.0，0.15M NaCl)，室温轻轻摇动2小时，封闭IgG蛋白质的非特异性结合部位。从KHCV患者血清中纯化的IgG溶解于含0.5％明胶和0.05％吐温20的PBS中，配成终浓度为16μg/ml的IgG溶液，再将所述滤膜浸入其中；室温轻轻摇动1小时，使蛋白质和IgG反应。然后滤膜以含0.2％吐温20的PBS洗涤4次，每次5分钟。山羊抗人IgG辣根过氧化物酶标抗体(山羊抗人IgG-HRP，Bio-Rad Lab.，CA，USA)用500倍体积PBS(含0.5％明胶和0.05％吐温20)稀释，再将洗涤过的滤膜浸入其中；室温摇动1小时，滤膜以PBS(含0.2％吐温20)洗涤四次，每次5分钟，再以50mM Tris缓冲液(pH7.0)洗涤两次。将滤膜浸入含400μg/ml 4-氯-1-萘酚和0.03％过氧化氢的50mM Tris缓冲液进行显色反应。蛋白质印迹分析结果见图6B，在图6B，泳道M和泳道1至10与图6A所指一样；泳道5至10代表阳性结果，泳道3和4代表阴性结果。
因此，从图6A、图6B可以看出KHCV 897蛋白表位存在于KHCV 897蛋白的羧基端(KHCV365蛋白)，即是由KHCV-LBC1第4348至4713核苷酸(366对碱基)编码。然而，KHCV365蛋白比KHCV897蛋白的免疫反应性低，基于这一点，可推测出当KHCV365蛋白的N端氨基酸从N端表达时不能作为表位，因此，包含KHCV365蛋白和延伸的N端氨基酸的KHCV518蛋白与KHCV897蛋白具有相似的免疫反应性，在本文中用作HCV诊断试剂。实施例2 HCV包膜蛋白表位的鉴定<步骤1>部分HCV包膜蛋白基因的扩增(1-1)引物的制备
欲将扩增KHCV包膜基因片段，并将其克隆入trp启动子控制的含遍在蛋白基因的表达载体，需要合成下列引物。引物PE1T2：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTTATGAAGTGGGCAACGCGTCC-3′含SacII识别位点和KHCV-LBC1的第916至937核苷酸；引物PE1DT2：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGACTTGCTCGTTGGGGTAGCT-3′含SacII识别位点和KHCV-LBC1的第1129至1149核苷酸；引物PE1EGT2：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGTTTCCCAGCTGTTCACCTTC-3′含SacII识别位点和KHCV-LBC1的第1201至1221核苷酸；引物PE1FT2：5 ′-TGAGACTCCGCGGTGGTACAACAGCCCTAGTGGTATCG-3′含SacII识别位点和KHCV-LBC1的第1327至1347核苷酸；引物PE1AXHO：5′-AAAAAACTCGAGTTAGACATGGCGTCGCAATGTCGT-3′包含在KHCV-LBC1第1128核苷酸后的翻译终止密码子，和XhoI位点；引物PE1BXHO：5′-AAAAAACTCGAGTTAAAGGAAAACAGATCCGCAGAG-3′包含在KHCV-LBC1第1200核苷酸后的翻译终止密码子，和XhoI位点；引物PE1CDEXHO：5′-AAAAAACTCGAGTTAAGGCGACCAGTTCATCATCAT-3′包含在KHCV-LBC1第1326位核苷酸后的翻译终止密码子，和XhoI位点；引物PE1XHO：5′-AAAAAACTCGAGTTACCCTGTCACGTGGGTGGTTCC-3′包含在KHCV-LBC1第2853位核苷酸后的翻译终止密码子，和XhoI位点；引物PE2T2：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGGGGCGCAAGGTCGGGCCGCT-3′含SacII位点和KHCV-LBC1的第1509至1529位核苷酸；引物PE2BT2：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGGTCCCATCACTTACACTGAG-3′含SacII位点和KHCV-LBC1的第1749至1769位核苷酸；引物PE2DFT2：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGGCACTGGGTTCACCAAGACA-3′含SacII位点和KHCV-LBC1的第2010至2030位核苷酸；引物PE2ET2：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTACTCGGGGAGAGCGTTGTGAC-3′含SacII位点和KHCV-LBC1的第2280至2300位核苷酸；引物PE2AXHO：5′-AAAAAACTCGAGTTACCACCCCTGCGCGAATGTATC-3′包含在KHCV-LBC1的第1748位核苷酸后的翻译终止密码子，和XhoI位点；引物PE2BCXHO：5′-AAAAAACTCGAGTTAATTCATCCAGGTACAACCGAA-3′包含在KHCV-LBC1的第2009位核苷酸后的翻译终止密码子，和XhoI位点；引物PE2DXHO：5′-AAAAAACTCGAGTTACCAGTTGCATGCGGCGTCGAG-3′包含在KHCV-LBC1的第2279位核苷酸后的翻译终止码，和XhoI位点；以及引物PE2XHO：5′-AAAAAACTCGAGTTACGCGTCCGCCAGAAGAAGGAAGAG-3′包含在KHCV-LBC1的第2528位核苷酸后的翻译终止密码子和XhoI位点。(1-2)聚合酶链式反应
准备14只试管，分别加入下列引物：
试管A：引物PE1T2 2μg，引物PE1XHO 2μg
试管B：引物PE1T2 2μg，引物PE1AXHO 2μg
试管C：引物PE1T2 2μg，引物PE1BXHO 2μg
试管D：引物PE1T2 2μg，引物PE1CDEXHO 2μg
试管E：引物PE1DT2 2μg，引物PE1CDEXHO 2μg
试管F：引物PE1EGT2 2μg，引物PE1CDEXHO 2μg
试管G：引物PE1FT2 2μg，引物PE1XHO 2μg
试管H：引物PE1EGT2 2μg，引物PE1XHO 2μg
试管I：引物PE2T2 2μg，引物PE2AXHO 2μg
试管J：引物PE2BT2 2μg，引物PE2BCXHO 2μg
试管K：引物PE2T2 2μg，引物PE2BCXHO 2μg
试管L：引物PE2DFT2 2μg，引物PE2DXHO 2μg
试管M：引物PE2T2 2μg，引物PE2XHO 2μg
试管N：引物PE2DFT2 2μg，引物PE2XHO 2μg
试管A至H加入50ng含包膜1基因的ptrpH-UB-E1载体(ATCC 68878)为模板；试管I至N加入50ng含包膜2基因的pYLBC-A/G-UB-E2N和pYLBC-A/G-UB-E2C载体(ATCC69886和74117)为模板，10μl 10×多聚酶缓冲液，10μl 2mM dNTP(2mM dGTP，2mM dATP，2mM TTP，2mM dCTP)，2.5μl10单位的Taq酶，以蒸馏水调终体积为100μl。
每套反应混合物中加入50μl矿物油以防液体蒸发；按参考例6，PCR热循环反应25次。(1-3)PCR产物的分离与纯化
上述(1-2)所得PCR产物以5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，结果确认试管A DNA约600bp，试管B DNA约220bp，试管C DNA约300bp，试管D DNA约410bp，试管E DNA约200bp，试管F DNA约110bp，试管G DNA约190bp，试管H DNA约300bp，试管I DNA约210bp，试管J DNA约300bp，试管K DNA约505bp，试管LDNA约290bp，试管M DNA约240bp，试管N DNA约520bp被扩增，DNA以同样聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，分别命名为区段E1，区段E1A，区段E1B，区段E1C，区段E1D，区段E1E，区段E1F，区段E1G，区段E2A，区段E2B，区段E2C，区段E2D，区段E2E，区段E2F。所用区段和引物在包膜基因中的位置见图7。<步骤2>表达载体的制备
取<步骤1>中(1-3)所得的DNA片段2μg，以参考例1的NEB缓冲液3和SacII、XhoI酶完全消化。
14只连接反应试管，每一管加入100ng上述消化后的DNA区段，再加入实施例1<步骤2>所得的50ng ptrpH-UB-T2/L片段，2μ110倍连接反应缓冲液，10单位T4DNA连接酶，以蒸馏水调至终体积为20μl，16℃连接反应12小时。
分别用14管大肠杆菌W3110(ATCC37339)进行连接混合物的转化反应。
筛选含区段E1的载体，命名为ptrpH-UB-E1；筛选含区段E1A的载体，命名为ptrpH-UB-E1A；筛选含区段E1B的载体，命名为ptrpH-UB-E1B；筛选含区段E1C的载体，命名为ptrpH-UB-E1C；筛选含区段E1D的载体，命名为ptrpH-UB-E1D；筛选含区段E1E的载体，命名为ptrpH-UB-E1E；筛选含区段E1F的载体，命名为ptrpH-UB-E1F；筛选含区段E1G的载体，命名为ptrpH-UB-E1G；筛选含区段E2A的载体，命名为ptrpH-UB-E2A；筛选含区段E2B的载体，命名为ptrpH-UB-E2B；筛选含区段E2C的载体，命名为ptrpH-UB-E2C；筛选含区段E2D的载体，命名为ptrpH-UB-E2D；筛选含区段E2E的载体，命名为ptrpH-UB-E2E；筛选含区段E2F的载体，命名为ptrpH-UB-E2F(见图8)。<步骤3>包膜基因的表达
以<步骤2>制备的含包膜基因片段的质粒转化的大肠杆菌W3110(ATCC37339)以实施例1<步骤3>同样方式培养细菌，然后离心收集细菌沉淀。<步骤4>包膜蛋白表位的鉴定
按实施例1<步骤4>相同的方式鉴定上述<步骤3>沉淀菌体中的包膜蛋白表位，结果见图9，图9A是SDS-PAGE结果，图9B为蛋白质印迹分析结果。
图9中，泳道1代表具有无包膜基因区段质粒的大肠杆菌产物；泳道2指ptrpH-UB-E1质粒转化的大肠杆菌产物；泳道3指ptrpH-UB-E1A质粒转化的大肠杆菌产物；泳道4指ptrpH-UB-E1B质粒转化的大肠杆菌产物；泳道5指ptrpH-UB-E1C质粒转化的大肠杆菌产物；泳道6指ptrpH-UB-E1D质粒转化的大肠杆菌产物；泳道7指ptrpH-UB-E1E质粒转化的大肠杆菌产物；泳道8指ptrpH-UB-E1F质粒转化的大肠杆菌产物；泳道9指ptrpH-UB-E1G质粒转化的大肠杆菌产物；泳道10指ptrpH-UB-E2A质粒转化的大肠杆菌产物；泳道11指ptrpH-UB-E2B质粒转化的大肠杆菌产物；泳道12指ptrpH-UB-E2C质粒转化的大肠杆菌产物；泳道13指ptrpH-UB-E2D质粒转化的大肠杆菌产物；泳道14指ptrpH-UB-E2E质粒转化的大肠杆菌产物；泳道15指ptrpH-UB-E2F质粒转化的大肠杆菌产物。
以丙型肝炎患者血清进行蛋白质印迹分析，证实不同包膜基因片段质粒转化的大肠杆菌产物与KHCV抗体反应的特异性，结果见下表1和图9B。
表1  KHCV包膜蛋白片段的蛋白质印迹分析结果泳道               蛋白片段           位置(氨基酸序号)      蛋白质印迹分析
                                                             信号2                  UBE1                   E1  1-198             +3                  UBE1A                  E1  1-72              -4                  UBE1B                  E1  1-99              -5                  UBE1C                  E1  1-136             (+)6                  UBE1D                  E1  72-136            (+)7                  UBE1E                  E1  100-136           ((+))8                  UBE1F                  E1  136-198           +9                  UBE1G                  E1  100-198           +10                  UBE2A                  E2  1-67              (+)11                  UBE2B                  E2  68-167            -12                  UBE2C                  E2  1-167             (+)13                  UBE2D                  E2  168-262           -14                  UBE2E                  E2  263-340           +15                  UBE2F                  E2  168-340           +*蛋白质印迹分析信号  +：阳性
                (+)弱((+))很弱
                 -：阴性
从表1和图9B可以看出，分别代表用含E1G、E2A、E2E包膜基因区段的质粒转化的大肠杆菌产物的泳道9，10和14显示阳性结果，而代表含E1A、E1B、E2B、E2D等包膜基因区段的质粒转化的大肠杆菌产物的其它泳道显示阴性结果。
因此，发现包膜蛋白表位存在于，KHCV包膜1蛋白羧基端，从KHCV-LBC1的第1201至1509核苷酸(309对碱基)表达而得(E1G蛋白)：KHCV包膜2蛋白的氨基端，由KHCV-LBC1的第1510至1749核苷酸(240对碱基)表达而得(E2A蛋白)；KHCV包膜2蛋白的羧基端，由KHCV-LBC1的第2281至2529核苷酸(249对碱基)表达而得(E2E蛋白)(参见图2所示E1G，E2A，E E蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列。)
下面实施例3至实施例5显示含一个以上HCV表位的重组蛋白的制备。实施例3  KHCV UB CORE518蛋白的制备<步骤1>KHCV 518 DNA的扩增(1-1)引物制备
为扩增KHCV 518 DNA(其由KHCV-LBC1的第4196-4713核苷酸区组成)并将其克隆至一在色氨酸启动子控制下的含遍在蛋白基因的表达载体中，合成下列引物：PK5.18T2引物：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTGGAGGAGGAGGAGGAGGAATCACCACAG
GCGCCCCTATC-3′包含SacII识别位点，6个甘氨酸密码子和KHCV-LBC1的第4195-4215核苷酸；以及PK518SAL引物：5′-AAAAAAGTCGACTATTAACACGTATTACAGTCGATCAC-3′包含位于KHCV-LBC1第4713核苷酸后的翻译终止密码子，和一个SalI识别位点。(1-2)聚合酶链反应
在一试管中加入2μg PK518T2引物和2μg PK518SAL引物，再加入50ng KHCV-LBC1 DNA (ATCC 75008)，10μl 10×聚合酶缓冲液，10μl 2mMdNTP(2mM dGTP，2mM dATP，2mMTTP，2mM dCTP)，2.5单位Taq聚合酶，加蒸馏水调节总体积为100μl。
向反应混合物中加入50μl矿物油以防止蒸发，重复25次与参考例6相同的热循环以进行PCR。(1-3)分离和纯化PCR产物
将上述(1-2)中获得的PCR产物进行5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果证实约520bp DNA被扩增。如(1-2)所述用相同的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化DNA并命名为GLYK518片段。<步骤2>制备表达载体
在参考例1所述的NEB缓冲液3中用SalI完全消化2μg ptrpH-UB-CORE14(ATCC 68642，见韩国专利公开93-683)，然后在相同条件下用SalII部分消化，得到的混合物进行7％琼脂糖凝胶电泳以分离3.0kb片段，其被命名为ptrpH-UB-CORE(T2)/L片段。
另外，如参考例1所述在NEB缓冲液3中用SacII和SalI充分消化2μg上述<步骤1>的(1-3)中获得的GLYK518片段。
在一连接试管中加入100ng上述得到的DNA片段，同时加入50ngptrpH-UB-CORE(T2)/L片段、2μl 10×连接缓冲液、10单位T4 DNA连接酶，加入蒸馏水使总体积调至20μl，在16℃进行连接反应12小时。
用连接混合物转化E.coli W3110(ATCC 37339)以获得含有包含在一开放读框与遍在蛋白基因和KHCV CORE14 DNA连接的GLYK518片段(图10)的ptrpH-UB-NS4E质粒的重组E.coli细胞(“CORE 518 DNA”)。<步骤3>表达CORE518 DNA
用上述<步骤2>制备的质粒ptrpH-UB-CORE518转化的E.coli W3110(ATCC 37339)以与实施例1<步骤3>相同的方式培养；然后离心收集E.coli细胞沉淀。
以与实施例1<步骤4>相同的方式用丙型肝炎患者的血清确定上述细胞沉淀物中表达的CORE518蛋白的反应性；结果见图11，图11A是SDS-PAGE结果，图11B为蛋白质印迹分析结果。
在图11中，泳道1和4显示了不带ptrpH-UB-CORE518质粒的E.coli产物；泳道2和5示出了用质粒ptrpH-UB-CORE518转化的E.coli产物；泳道3代表标准分子量标记物，即从凝胶上部至下依次为70、43、29、18和14千道尔顿。<步骤4>纯化UBCORE518蛋白(4-1)破碎细胞及除去可溶性蛋白
将3g在上述<步骤3>中得到的E.coli细胞沉淀物悬浮于40ml缓冲液1(20mM Tris，pH8.0，1mM EDTA，10mMβ-巯基乙醇，1mM苯甲基磺酰氟，1μg/ml抑胃酶肽A)中，向悬浮液中加入溶菌酶使终浓度为0.2mg/ml，将得到的溶液置于冰上30分钟。得到物在冰浴中用功率输出为80％和能率循环为50％的超声处理器(HEAT SYSTEMS ULTRASONICS INC.，W225，U.S.A.)进行15分钟超声处理以破碎细胞，得到E.coli细胞匀浆。
将上述得到的细胞匀浆在一离心机(Beckman J2-21，Rotor JA20)中以15000rpm离心25分钟以除去溶解蛋白，获得不溶性沉淀物。(4-2)不溶性沉淀的洗涤
(4-1)所得沉淀悬浮于4ml含1％TritonX-100的缓冲液2(20mM Tris，pH8.0，1mM EDTA，10mMβ-巯基乙醇)，将悬液室温搅拌30分钟，再15000转/分离心25分钟(Beckman J2-21，JA20转头)除去可溶性蛋白，保留不溶性沉淀物。(4-3)不溶性沉淀的溶解
(4-2)的沉淀悬浮于100ml含4M尿素的缓冲液3(50mM Tris，pH9.0，1mM EDTA，10mMβ-硫基乙醇)，悬液室温搅拌2小时，再离心除去不溶性沉淀，保留上清。
(4-4)DEAE-Sepharose离子交换层析
将(4-3)中得到的上清以4ml/分钟流速通过用上述缓冲液3平衡的DEAE-Sepharose柱(Pharmacia，1.25cm×4cm)，以同样缓冲液洗去柱中的游离蛋白质。随后以4ml/分钟的流速加入200m含有浓度梯度为0-0.3M的NaCl的缓冲液3以洗脱结合蛋白，每2ml组分收集洗脱液。将蛋白组分进行15％SDS-PAGE以收集含UBCORE518蛋白的组分。
(4-5)FPLC-MONO S层析
(4-4)收集的含UBCORE518蛋白的组分由YM10超滤膜(Amicon，U.S.A)浓缩至20ml，G-25柱(Pharmacia，2.5cm×90cm)先用含4M尿素的缓冲液4(50mM磷酸盐，pH6.0，1mM EDTA，10mMβ-巯基乙醇)平衡，再将浓缩液过柱，洗脱液依次以流速0.7毫升/分钟通过按相同缓冲液平衡的FPLC-MONO S柱(Pharmacia，HR5/5，0.5cm×5cm)，加入相同缓冲液洗去柱内游离蛋白质。然后加入含0.2M NaCl的相同缓冲液洗去结合蛋白质。再以200ml含0.2至0.4M NaCl线性梯度浓度缓冲液5(10mM磷酸盐，pH7.0)过柱，洗去结合蛋白质，按0.7ml每份收集。含UBCORE518蛋白的组分由15％SDS-PAGE收集，纯度在95％以上，纯化蛋白的抗原特性由蛋白质印迹分析证实。实施例4 KHCV UB NS4E1E2蛋白的制备<步骤1>KHCV NS4E DNA的表达载体(1-1)引物制备
欲制备KHCV NS4E DNA(由KHCV-LBC1的第5422至5547位核苷酸组成)，并将其克隆在trp启动子控制的含遍在蛋白基因的表达载体，需合成下列引物：引物PNS4ET2：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTATCATCCCCGATAGGGAAGTT-3′含SacII位点和KHCV-LBC1的第5422至5422位核苷酸；以及引物PNS4ESAL：5′-AAAAAAGTCGACTATTACAACCCGAGCGCCTTCTGTTT-3′含在KHCV-LBC1第5547位核苷酸后的翻译终止密码子，和SalI位点。(1-2)聚合酶链式反应
在反应管中加入2μg PNS4ET2引物和2μg PNS4ESAL引物，再加50ng KHCV-LBC1 DNA(ATCC75008)，10μl 10×聚合酶缓冲液，10μl 2mM dNTP(2mM dGTP，2mM dATP，2mM TTP，2mM dCTP)，2.5单位Taq聚合酶，以蒸馏水调至终体积为100μl。
反应混合物加入50μl矿物油以防液体蒸发，PCR按参考例6进行25次热循环反应。(1-3)PCR产物的分离和纯化
上述(1-2)所获PCR产物由5％聚丙烯酰胺凝电泳分离，结果发现扩增的DNA为130bp，以同样的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化DNA，命名为NS4E片段。<步骤2>表达载体的制备
上述(1-3)所获2μg NS4E片段以参考例1的NEB缓冲液3和SacII、SalI完全消化。
连接反应管加入100ng上述消化DNA，再加入实施例1<步骤2>的50ng ptrpH-UB-T2/L，2μl 10倍连接缓冲液，10单位T4DNA连接酶，以蒸馏水调至终体积为20μl，16℃连接反应12小时。
连接混合物转化大肠杆菌W3110(ATCC37339)，筛选包含含NS4E片段的ptrpH-UB-NS4E质粒的重组大肠杆菌转化子(图12)。<步骤3>KHCV E1E2蛋白的制备(3-1)引物制备
欲扩增编码HCV包膜蛋白表位的KHCV E1E2基因，并将其克隆在trp启动子控制的含遍在蛋白基因的表达载体，需合成下列引物：引物PE2ET2：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTACTCGGGGAGAGCGTTGTGAC-3′含SacII位点和KHCV-LBC1的第2281至2298位核苷酸；引物PE2EGE1G：5′-TTCCTTCTTCTGGCGGACGCGGTTTCCCAGCTGTTCACCTTC-3′含KHCV-LBC1第2509至2529位核苷酸，为E2E DNA的3’端；和KHCV-LBC1第1201至1221位核苷酸，是E1G基因的5’端；以及引物PE2AXHO：5′-AAAAAACTCGAGTTACCACCCCTGCGCGAATGTATC-3′含在KHCV-LBC1第1749位核苷酸后的终止密码子和XhoI识别位点。(3-2)聚合酶链式反应
在反应管中加入2μg PE2EGE1G引物和2μg PE2AXHO引物，再加50ng KHCV-LBC1 DNA (ATCC75008)为模板，10μl 10倍聚合酶缓冲液，10μl  2mMdNTP(2mM dGTP，2mM dATP，2m MTTP，2mM dCTP)，2.5单位Taq酶，以蒸馏水调至终体积为100μl。
反应混合物中加入50μl矿物油以防液体蒸发，PCR按参考例6进行25次热循环反应。(3-3)PCR产物的分离和纯化
上述(3-2)所获PCR产物通过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，结果发现扩增的DNA片段为550bp，DNA由相同的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，命名为GE1GE2A片段。(3-4)第二次聚合酶链式反应
在反应管中加入2μg PE2ET2引物和2μg PE2AXHO引物，再加50ng  pYLBC-A/G-UBE2C质粒(ATCC74117，见韩国专利公开第93-683号)和上述(3-3)所获GE1GE2A片段为模板，10μl 10×聚合酶缓冲液，10μl 2mM dNTP(2mM dGTP，2mMdATP，2mM TTP，2mM dCTP)，2.5单位Taq酶，以蒸馏水调至反应终体积为100μl。
反应混合物加入50μl矿物油以防液体蒸发，PCR按参考例6进行25次热循环反应。(3-5)PCR产物的分离与纯化
上述(3-4)所获PCR产物通过5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，结果发现扩增的DNA为800bp，由同样的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化此片段，命名为E1E2片段。(3-6)表达载体的制备
(3-5)所获2μg DNA片段按参考例1以缓冲液3和SacII、XhoI完全消化。
反应管中加入上述100ng DNA，加入实施例1<步骤2>获得的ptrpH-UB-T2/L片段50ng，2μl 10×连接缓冲液，10单位T4DNA连接酶，以蒸馏水调至总体积为20μl，于16℃连接反应12小时。
连接混合物转化大肠杆菌W3110(ATCC37339)筛选包含含E1E2片段的ptrpH-UB-E1E2质粒的重组大肠杆菌转化子(图13)。(3-7)E1E2 DNA的表达
(3-6)制备的ptrpH-UB-E1E2质粒重组大肠杆菌W3110(ATCC37339)转化子，按实施例1<步骤3>同样方法培养，然后离心收集大肠杆菌沉淀。(3-8)用丙型肝炎患者血清证实UBE1E2蛋白的表达及其反应性
按实施例1<步骤4>同样方法，用丙型肝炎患者血清对(3-7)细胞沉淀进行UBE1E2蛋白的表达鉴定及反应性的鉴定，结果见图14，其中A是SDS-PAGE结果，B是蛋白质印迹分析结果。
在图14A和14B，泳道1和4指不含ptrpH-UB-E1E2质粒的大肠杆菌产物；泳道2和5指含ptrpH-UB-E1E2质粒的大肠杆菌产物；泳道3指标准分子量，从凝胶上至下依次为43，29，18和14千道尔顿。<步骤4>KHCV NS4E1E2蛋白的制备<步骤4-A>NS4E1E2基因的扩增
欲扩增HCV包膜蛋白表位基因和部分KHCVNS4E DNA，并将其克隆在trp启动子控制的含遍在蛋白基因的表达载体，需合成下列引物。引物PNS4ET2：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTATCATCCCCGATAGGGAAGTT-3′含SacII位点和KHCV-LBC1的第5422至5422位核苷酸。引物PNS4EGE2C3：5′-CAGAAGGCGCTCGGGTTGCCAGGAGGAGGAGGTGGTA
CTCGGGGAGAGCGTTGT-3′依次含KHCV-LBC1第5530至5547位核苷酸，是NS4E DNA的3’端；一个脯氨酸密码子；6个甘氨酸密码子；含KHCV-LBC1的第2218至2298位核苷酸，是E2E基因的5’端；以及引物PE2AXHO：5′-AAAAAACTCGAGTTACCACCCCTGCGCGAATGTATC-3′含在KHCV-LBC1第1749位核苷酸后的翻译终止密码子，和XhoI识别位点。(4-A-2)聚合酶链式反应
反应管加入2μg PNS4EGE2C3引物和2μg PE2AXHO引物，再加50ng ptrpH-UB-E1E2(<步骤3>(3-6))为模板，10μl 10倍聚合酶缓冲液，10μl 2mM dNTP(2mM dGTP，2mM dATP，2mM TTP，2mM dCTP)，2.5μg Taq聚合酶，以蒸馏水调至总体积为100μl。
混合物覆盖50μl矿物油以防液体蒸发，PCR按参考例6进行25次热循环反应。(4-A-3)PCR产物的分离与纯化
上述(4-A-2)所获PCR产物以5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，结果发现扩增的DNA约800bp，用同样的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化DNA，命名为GENVEPI-III片段。(4-A-4)第二次聚合酶链式反应
反应管中加入2μg PNS4ET2引物和2μgPE2AXHO引物，加入上述<步骤1>所获50ng ptrpH-UB-NS4E质粒为模板，加入上述(4-A-2)的50ng GENVEPI-III10μl 10倍多聚酶缓冲液，10μl 2mMdNTP(2mM dGTP，2mM dATP，2m MTTP，2mM dCTP)，2.5单位Taq酶，以蒸馏水调至总体积为100μl。
反应混合物覆盖50μl矿物油以防液体蒸发，PCR按参考例6进行25次热循环反应。(4-A-5)PCR产物的分离与纯化
上述(4-A-4)所获PCR产物以5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。结果发现扩增的DNA约920bp，由同样的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化DNA，命名为NS4E1E2片段。<步骤4-B>表达载体的制备
<步骤4-A>的(4-A-5)所获2μg DNA片段以参考例1的NEB缓冲液3和SacII、XhoI完全消化。
反应管中加入上述消化后的DNA片段100ng，加入实施例1<步骤2>获得的50ng ptrpH-UB-T2/L片段，2μl 10倍连接缓冲液，10单位T4 DNA连接酶，以蒸馏水调至总体积为20μl，于16℃连接反应12小时。
连接混合物转化大肠菌W3110(ATCC37339)，筛选含包含NS4E1E2片段的ptrpH-UB-NS4E1E2质粒的大肠杆菌重组子(图15)。<步骤4-C>NS4E1E2 DNA片段的表达
上述<步骤4-B>的ptrpH-UB-E1E2质粒转化的大肠杆菌W3110(ATCC37339)重组子，按实施例1<步骤3>同样方法培养，离心收集大肠杆菌沉淀。<步骤4-D>UBNS4E1E2蛋白的表达鉴定及与丙型肝炎患者血清反应性鉴定
按实施例1<步骤4>同样方法，鉴定<步骤4-C>大肠杆菌沉淀中UBNS4E1E2蛋白的表达及与丙型肝炎患者血清的反应性，结果见图16，16A是SDS-PAGE结果，16B是蛋白质印迹分析结果。
在图16A和16B，泳道1和4指示不含ptrpH-UB-NS4E1E2质粒的大肠杆菌产物；泳道2和泳道5指含ptrpH-UB-NS4E1E2质粒的大肠杆菌产物；泳道3是标准分子量，从凝胶上至下依次是92，70，43，29，18千道尔顿。<步骤4-E>UBNS4E1E2蛋白的纯化(4-E-1)细胞破碎和可溶性蛋白的去除
按实施例3<步骤4>之(4-1)处理上述<步骤4-C>所获的2g大肠杆菌沉淀，保留不溶性沉淀物。(4-E-2)不溶性沉淀物的洗涤
按实施例3的<步骤4>之(4-2)处理上述(4-E-1)所获沉淀，除去可溶性蛋白，保留沉淀。(4-E-3)4M尿素洗涤
(4-E-2)沉淀物悬浮于30ml含4M尿素的缓冲液2，室温搅拌2小时，再15000转/分离心(Beckman，J2-21，RA20转头)除去可溶性蛋白质，保留沉淀。(4-E-4)6M盐酸胍洗涤
(4-E-3)的沉淀悬浮于30ml含6M盐酸胍的缓冲液2，室温搅拌2小时，再15000转/分离心(Beckman，J2-21，JA20转头)除去可溶性蛋白，保留沉淀。(4-E-5)1％SDS溶解沉淀
(4-E-4)的沉淀悬浮于10ml含1％SDS的PBS(10mM磷酸盐，pH7.0，150mM NaCl)，室温搅拌12小时，再15000转/分离心(Beckman J2-21，JA20转头)除去不溶性沉淀，保留上清。(4-E-6)S-300凝胶过滤层折
(4-E-5)所获10ml上清由YM10超滤膜(Amicon，U.S.A)浓缩至4ml，再15000转/分离心25分钟(Beckman J2-21，RA20转头)除去不溶性沉淀，保留上清。S-300凝胶过滤树酯柱(Pharmacia LKB，2.5cm×90cm)预先以含0.1％SDS的PBS平衡，再将上述所得上清液以40毫升/小时过柱，按每组分2ml收集，通过15％SDS-PAGE收集含UBNS4E1E2蛋白质的组分，纯度90％以上，由蛋白质印迹分析鉴定提纯蛋白质的抗原性。实施例5  制备KHCV NS5-1.2蛋白<步骤1>扩增NS5-1.2DNA(1-1)制备引物
为了扩增KHCV NS5-1.2DNA(其由KHCV-LBC1的第6649-7824核苷酸组成)并将其克隆至一在色氨酸启动子控制下的含遍在蛋白基因的表达载体中，合成下列引物。PNS5T2引物：5′-TGAGACTCCGCGGTGGTACGGGCATGACCACTGACAAC-3′包含一个SacII识别位点和KHCV-LBC1的第6649-6669核苷酸；以及PNS5-1.2SAL引物：5′-AAAAAAGTCGACTATTACGCCTTCCCCTTCATCTCCTT-3′包含位于KHCV-LBC1第7824核苷酸之后的翻译终止密码子，以及一个SalI识别位点。(1-2)聚合酶链反应
在一试管中加入2μg PNS5T2引物和2μgPNS5-1.2SAL引物，同时加入50ngKHCV-LBC1 DNA (ATCC75008)作为模板，10μl 10×聚合酶缓冲液，10μl 2mMd NTP(2mMd GTP，2mMd ATP，2mM TTP，2mMd CTP)，2.5单位Taq聚合酶，加蒸馏水使总体积调至100μl。
向反应混合物中加入50μl矿物油以防止蒸发，重复25次与参考例6所述相同的热循环以进行PCR。(1-3)分离和纯化PCR产物
将上述(1-2)中得到的PCR产物进行5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果证实有约1.3kb DNA被扩增。用上述相同的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化该DNA并命名为NS5-1.2片段。<步骤2>制备表达载体
根据参考例1在NEB缓冲液3中用SacII和SalI完全消化2μg<步骤1>(1-3)中得到的DNA片段。
在一试管中放入100ng上述得到的DNA片段，再加入50ng在实施例1的<步骤2>中得到的ptrpH-UB-T2/L片段，2μl 10×连接缓冲液，10单位T4 DNA连接酶，加蒸馏水调整总体积为20μl，在16℃进行连接反应12小时。
用连接混合物转化E.coli W3110(ATCC 37339)获得含有包含NS5-1.2片段的质粒ptrpH-UB-NS5-1.2的重组E.coli细胞(图17)。<步骤3>表达NS5-1.2DNA片段
用上述<步骤2>制备的质粒ptrpH-UB-NS5-1.2转化的E.coli W3110(ATCC37339)细胞以实施例1<步骤3>相同的方式进行培养，然后离心收集E.coli细胞沉淀物。<步骤4>用丙型肝炎患者的血清确定UBNS5-1.2蛋白的表达及其反应性
以实施例1的<步骤4>相同的方式用上述<步骤3>的细胞沉淀物用丙型肝炎患者的血清证实了UBNS5-1.2蛋白的表达及其反应性，结果示于图18，其中A是SDS-PAGE结果，B是蛋白质印迹分析结果。
在图18A和B中，泳道1为具有不带任何KHCV DNA片段的质粒的E.coli产物；泳道2和3示出用ptrpH-UBNS5-1.2转化的E.coli产物。<步骤5>KHCV UBNS5-1.2蛋白、KHCV403蛋白与丙型肝炎患者血清反应性的比较
按实施例1<步骤4>同样的方法鉴定<步骤3>大肠杆菌沉淀中UBNS5-1.2蛋白与丙型肝炎患者血清的反应性，其结果与一酵母细胞沉淀表达的KHCV403蛋白(韩国专利公开第93-12017号)和丙型且炎患者血清的反应性进行比较，结论见图19，其中A指SDS-PAGE结果，B指蛋白质印迹分析结果。
在图19A和19B，泳道1指啤酒酵母DCO4-UB-KHCV403(ATCC74709)的产物；泳道2指ptrpH-UB-NS5-1.2大肠杆菌转化子的产物。从结果可以看出，UBNS5-1.2蛋白与丙型肝炎患者血清的反应性比KHCV403蛋白强。<步骤6>纯化UBNS5-1.2蛋白(6-1)破碎细胞和除去可溶性蛋白
将3g上述<步骤3>中获得的E.coli细胞沉淀物如实施例3<步骤4>(4-1)所述进行处理以破碎细胞并从中获得不溶性沉淀物。(6-2)洗涤不溶性沉淀物
如实施例3的<步骤4>(4-2)所述处理(6-1)中得到的沉淀物以除去溶解蛋白，获得不溶性沉淀物。(6-3)溶解不溶性沉淀物
将(6-2)的不溶性沉淀物悬浮于100ml含8M尿素的缓冲液3(50mM Tris，pH9.0，1mM EDTA，10mMβ-巯基乙醇)中，室温搅拌悬浮液1小时并离心除去不溶性沉淀物，得到上清。
(6-4)DEAE-Sepharose离子交换层析
(6-3)中获得的上清以2ml/分钟流速通过用上述缓冲液3平衡的DEAE-Sepharose柱(Pharmacia，2.5cm×3cm)，用同样的缓冲液洗脱存留在柱中的自由蛋白。随后以8m1/分钟的流速加入300ml含有浓度梯度为0-0.3M的NaCl的缓冲液3以洗脱结合蛋白，每4ml组分收集洗脱液。将蛋白组分进行15％SDS-PAGE以收集含UBNS5-1.2蛋白的组分。(6-5)S-300凝胶过滤层析
用YM10超滤膜(Amicon，U.S.A.)浓缩(6-4)中收集的蛋白组分至体积为3ml，然后以10ml/小时的流速通过用含8M尿素的缓冲液3平衡的S-300树脂柱(Pharmacia，1.2cm×120cm)，以0.5ml组分收集洗脱下来的蛋白并进行15％SDS-PAGE以收集含高纯度UBNS5-1.2蛋白的组分。(6-6)FPLC-phenyl-superose层析
将(6-5)中收集的蛋白组分过YM10超滤膜(Amicon，U.S.A.)以浓缩其体积至4ml。用一透折膜(Spectrum MedicalIndustries，Inc.M.W.截断值6000-8000)将浓缩液对PBS(10mM磷酸盐，pH7.0，15mM NaCl)透析以除去尿素。向溶液中加入NaCl至终浓度为1.5M，得到物以0.7ml/分钟的流速通过用相同缓冲液平衡的FPLC-phenyl superose柱(Pharmacia，HR5/5，0.5cm×5cm)；加入相同的缓冲液以洗脱保留在柱中的自由蛋白。然后加入含线性浓度梯度为1.5M-0M的NaCl的PBS洗脱结合蛋白，并每0.7ml为一组收集洗脱物。将蛋白组分进行15％SDS-PAGE以收集包含纯度至少为95％的UBNS5-1.2蛋白的组分；纯化蛋白的抗原特异性用蛋白质印迹分析得以确证。实施例6  通过ELISA(酶联免疫吸附试验)方法用本发明单个KHCV蛋白和重组蛋白检测HCV抗体
用50mM硼酸钠缓冲液(pH9.0)分别稀释KHCV CORE14，KHCV403和KHCVNS5-1.2蛋白使其浓度为0.3μg/ml；KHCV E2C和KHCV E1蛋白以同样缓冲液稀释，使其浓度分别为0.2μg/ml和0.1μg/ml。稀释后蛋白质溶液按每孔200μl加入微量滴定板孔内(Dynatech，Immulon 1型微量滴定板)，37℃孵育2小时。
滴定板以含0.05％(v/v)Tween-20的PBS(pH7.0，此后称“洗涤液”)洗涤一次。将含0.1％(w/v)明胶的PBS按250μl/孔加入滴定板，37℃孵育1小时以封闭剩余蛋白位点，从而阻止非特异性反应的发生，滴定板孔用洗涤液清洗两次，每孔加入190μl含0.25％明胶，1.0％(v/v)Triton X-100，1mMEDTA和0.02％Thimerosal的PBS，然后加入10μl HCV患者血清和正常血清，轻轻混合数秒钟。
37℃孵育1小时，再以洗涤液清洗5次，每孔加入200μl辣根过氧化物酶(HRP)标抗人IgG抗体(Bio-Rad Company，Richmond，CA 94804，U.S.A，0.1mg蛋白/ml)，此酶标抗体以含10％小牛血清(v/v)，1％Ficoll(Sigma，v/v)、0.05％Tween-20和0.02％Thimerosal的PBS稀释成1μg/ml。
再37℃孵育1小时，以洗涤液清洗5次。然后每孔加入200μl邻苯二胺二盐酸底物溶液。室温避光反应30分钟。该底物溶液由邻苯二胺二盐酸片(OPD片，Sigma)以50mM柠檬酸盐缓冲液配成10mg/ml，用磷酸盐调pH至5.5。显色完毕以每孔50μl 4N硫酸终止，每孔的OD值由Multiscan titertek(Flow Lab)在492nm波长下测得。
另外，由每毫升含250ng KHCV CORE518蛋白、125ng KHCV NS4E1E2蛋白和125ng KHCV NS5-1.2蛋白的50mM硼酸钠缓冲液(pH9.0)的混合抗原溶液也重复了上述ELISA检测过程。
上述用单个KHCV抗原及KHCV混合抗原检测KHCV抗体的结果见下表2。
表2  以本发明KHCV单抗原及混合抗原检测H
     CV抗体
抗原样品     KHCVCORE14  KHCV897  KHCV403  KHCVNS5-1.2   KHCVE1   KHCVE2 混合抗原
    1     7.98   7.35   1.28   5.83   6.08   0.50     10.12
    2     7.77   7.29   6.43   5.81   4.19   0.84     10.0
    3     3.31   6.98   6.77   5.06   0.68   0.18     5.70
    4     7.89   7.06   0.86   0.23   5.32   0.83     9.08
    5     7.71   7.21   0.96   2.35   4.48   2.19     8.41
阳性对照     7.53   7.35   7.44   5.87   5.95   8.89     8.83
阴性对照     0.25   0.26   0.25   0.41   0.43   0.11     0.17
注：1、每一数字代表吸收/截断值
2、阳性对照：HIV(-)，HBV(-)，HCV(+)
阴性对照：HIV(-)，HBV(-)，HCV(-)
3、阳性及阴性对照血清样品由韩国红十字会血液中心提供。
上述试验的截断值(cutoff)按下述计算：
按上述诊断方法测试了以RIBA诊断试剂盒(Ortho Diagnostic System，U.S.A)利用斑点免疫试验确认的509份HCV阴性血清样品和76份HCV阳性血清样品，其结果如下表3。
                           表3
样品数     OD490平均值   标准偏差
    阴性样品 509     0.098     0.095
    阳性样品 76     1.791     0.809
按下列方程式校正截断值：
截断值＝阴性样品平均OD490+3×阴性样品
        OD490的标准偏差
据此，如果算出的截断值为0.383，通过阴性样品OD490的分布校正，截断值可达到0.4。
从上表2可以看出，单抗原或混合抗原都可作为HCV抗体的诊断试剂，但是，混合抗原在区别阴性与阳性样品时更为敏感、严格。实施例7 用含KHCV表位的单个重组蛋白与混合KHCV抗原检测KHCV抗体
KHCV E2E2蛋白和KHCV NS4E1E2蛋白分别以50mM硼酸钠缓冲液(pH9.0)稀释成0.2μg/ml；KHCV CORE518蛋白、KHCV NS4E1E2蛋白和NS5-1.2蛋白以50mM硼酸盐缓冲液(pH9.0)配成每毫升分别含250ng、125ng、和125ng的抗原溶液。稀释后的蛋白质溶液按每孔200μl加入微量滴定板(Dynatech，Immulon1型微量滴定板)，重复实施例6相同的反应过程，结果见表4：
                      表4：用混合抗原检测HCV抗体
抗原样品     KHCV E1E2     KHCVNS4E1E2 混合抗原
    123456789101112131415161718阳性对照阴性对照     0.2227.8344.5540.2550.5730.2550.4780.4460.0320.5100.4780.3507.5487.6750.5730.6690.4140.3827.1970.280     0.2338.107.0670.2337.7000.3000.7000.5330.0670.4330.4600.6677.9008.1330.0600.5670.4330.4607.5100.250     0.1808.3018.140.1907.4700.2170.6400.3140.0900.3030.4670.7378.7558.5020.2940.3770.2570.3048.0650.193
注：1、每一数字代表吸收/截断值
2、阳性对照：HIV(-)，HBV(-)，HCV(+)
阴性对照：HIV(-)，HBV(-)，HCV(-)
从上表4可以看出，KHCV NS4E1E2蛋白在检测丙型肝炎患者血清中KHCV抗体时比KHCVE1E2蛋白更有效，而混合抗原比KHCV NS4E1E2还有效可能与其含有其它附加抗原有关。
另外，KHCV COREEPI，KHCV518和KHCV CORE518蛋白分别以50mM硼酸钠缓冲液(pH9.0)稀释成每毫升125ng，按每孔200μl加入微量滴定板(Dynatech，Immulon1型微量滴定板)，用136份丙型肝炎患者血清(取自韩国汉城的Hyundai中心医院)重复实施例6的反应步骤，其结果与PCR法比较，见下表5：
                           表5
 KHCV COREEPI     KHCV 518   KHCV CORE518     PCR
119(+) 83(+) 123(+) 123(+)
    13(-)     11(-)     12(-)     13(-)
从上表5可以看出，在用作诊断试剂时KHCVCOREEPI和KHCV518蛋白没有包含这两种蛋白表位的KHCV CORE518敏感。实施例8  本发明与现有技术诊断方法的比较
定期从输血后人HCV血清转化名薄中取得样品(Serological Inc.，780 Park North Blud，Clarkston，GA30021，USA)重复实施例6的过程以检测样品中的HCV抗体，并与用Ortho及Abbott第一代HCV诊断试剂盒诊断结果进行比较，其结果见下表6：
             表6  血清转化样品中HCV抗体的检测
输血后天数     HCV诊断试剂盒   确证试验
ALTmU/ml ASTmU/ml     Ortho第1代    Abbott第1代 混合抗原 RIBAII
    1     11     -     0.29     0.263     0.49     -
    11     24     -     0.33     0.253     0.44     -
    15     36     -     0.26     0.267     0.45     -
    18     36     -     0.27     0.255     0.50     -
    22     40     -     0.28     0.251     0.52     -
25 24 - 0.18 0.220 0.45 -
    29     32     -     0.16     0.265     0.44     -
    32     27     27     0.20     0.259     0.45     -
36 32 - 0.23 0.270 0.50 -
    39     78     -     0.14     0.275     0.47     -
    43     180     121     0.23     0.303     0.40     -
    74     401     352     0.80     0.495     5.32     +
    114     72     70     6.21     4.356     6.73     +
    127     42     37     6.21     4.356     7.71     +
    141     27     24     6.21     4.356     9.24     +
    155     68     69     6.21     4.356     9.11     +
    175     78     97     6.21     4.356     7.99     +
    238     41     39     6.21     4.356     10.15     +
    270     119     102     6.21     4.356     8.77     +
    297     49     35     6.21     4.356     8.56     +
    365     157     128     6.21     4.356     9.72     +
    399     46     19     6.21     4.356     9.45     +
注  1、每一数字代表吸收/截断值。
2、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的活性通常为0～50mU/ml。
3、Ortho第1代HCV诊断试剂盒购自Ortho Diagnostic Systems，U.S.A.
4、Abbott第1代HCV诊断试剂盒购自Abbott Lab.，U.S.A.
上述结果显示本发明的诊断试剂盒比其它第一代诊断试剂盒更早检测出HCV抗体(大约早5-6周)，与RIBAII试剂盒效果相似，但是本发明所用的ELISA方法比RIBAII试剂盒的斑点免疫试验更常规。实施例9  诊断的准确性
为证实本发明诊断结果的准确性，由OrthoDiagnostic System制造与销售的丙型肝炎诊断试剂盒诊断为阳性的18份血清样品，按实施例7步骤重新用本发明的试剂盒诊断，并且以作为HCV确证试验(Van der poel，C.L.et al.，Lancet 337期，317-319页，1991)的Ortho第二代斑点免疫试剂盒(Ortho Diagnostic Systems，U.S.A.，产品编号933491)依厂家说明进行诊断，其结果列于表7，可以看出，本发明的丙型肝炎诊断试剂盒假阳性错误率比Ortho诊断试剂盒低。
       表7  本发明的诊断结果与Ortho第二代诊断
               试剂盒的比较
样品   Ortho第2代重组免疫印迹试剂盒的抗原5-1-1 C100-3 C33C C22-3 SOD  判断 本发明混合抗原
    123456789101112131415161718     +/-   +/-    -     -    -    -+4    +4    +4    +4    -    ++1    +4    +4    +4    -    +-     -     -     -     -    -+1    +4    +4    +4    -    +-     -     -     -     -    --     -     -     -     -    --     -     -     -     -    --     -     -     -     -    --     -     -     -     -    --     -     -     -     -    --     -     -     -     -    -+2    +1    +3    +4    -    ++/-   +/-   +4    +4    -    +-     -     -     -     -    --     -     -     -     -    --     -     -     -     -    --     +/-   -     -     -    -     0.1808.3018.1410.1907.4700.2170.6400.3140.0900.3030.4670.7378.7558.5020.2940.3770.2570.304
注：如果在样品中发现除SOD对照抗原外多于1个抗原，至少两个抗原者，定为阳性。实施例10 诊断试剂盒的特异性
为了证实本发明诊断试剂的特异性和敏感性，被LuckyI(Lucky有限公司的诊断试剂盒，韩国专利公开第93-683号)、Abbott第二代诊断试盒(AbbottII)和UBI(UBI公司，U.S)诊断为丙型肝炎阳性的94份血清样品，由本发明诊断试剂盒按实施例7方法重新诊断，结果列于表8。
从表8可以看出，所有的诊断试剂盒的敏感性相似，但是本发明的试剂盒(LuckyII)比其它诊断试剂盒更具特异性。
                              表8
  确证试验(RIBA II ) Abbott-II   UBI   LuckyI   LuckyII
    阳性51     +-    492    501    483    492
    未定8     +-     62     44     53     26
    阴性35     +-     629    1916    1025     233
*由RIBAII确证试验结果为真阳性、真阴性或假阳性、假阴性。
另外，随机选出由上述四种试剂盒(AbbottII，UBI，LuckyI，LuckyII)的任意一种诊断为阴性的278份血精样品，计算其平均吸收值(OD490)；同样选择以LuckyI、或AbbottII或UBI诊断为阳性的94份血清样品，计算其平均吸收值。
阳性样品的平均吸收值和阴性样品的平均吸收值分别除以平均截断值，以获得阳性样品与阴性样品的平均信号/截断值(S/C)，结果列于下表9，从表9可以看出，LuckyII、UBI的阳性样品与阴性样品的S/C值差异最大，表示它们比其它诊断试剂盒显示的信号清晰；然而，UBI的S/C高并不明显，因为它在某种程度上依赖低的截断值，从而可能出现较高的假阳性率。
 表9
                    AbbottII         UBI        LuckyI     LuckyII阳性样品平均吸收值         1.805        1.366       1.344      2.053阴性样品平均吸收值         0.096        0.021       0.058      0.037
截断值                 0.52         0.25        0.44       0.42
阳性样品S/C            3.471        5.464       3.055      4.888
阴性样品S/C            0.185        0.084       0.132      0.088
尽管本发明已结合上述具体实施方案加以描述，但应理解的是对于本发明所作出的各种改进和变化对本领域人员来说是显而易见的，并也包含在所附权利要求书限定的范围内。

Claims (21)

1、一种丙型肝炎病毒的抗原蛋白，选自由KHCVCOREEPI，KHCU 518，KHCV NS4E，KHCV E1G，KHCVE2A，KHCV E2E和KHCV NS5-1.2组成的一组，其氨基酸序列如下：KHCV COREEPI：MetSerThrAsnProLysProGlnArgLysThrLysArgAsnThrAsnArgArgProGlnAspIleLysPheProGlyGlyGlyGlnIleValGlyGlyValTyrLeuLeuProArgArgGlyProArgLeuGlyValArgAlaThrArgLysThrSerGluArgSerGlnProArgGlyArgArgGlnProIleProLysAlaArgArgProGluGlyArgAlaTrpAlaGlnProGlyTyrProTrpProLeuTyrGlyAsnGluGlyLeuGlyTrpAlaGlyTrpLeuLeuSerProArgGly；KHCV 518：IleThrThrGlyAlaProIleThrTyrSerThrTyrGlyLysPheLeuAlaAspGlyGlyGlySerGlyGlyAlaTyrAspIleIleMetCysAspGluCysHisSerThrAspSerThrThrIleTyrGlyIleGlyThrValLeuAspGlnAlaGluThrAlaGlyAlaArgLeuValValLeuSerThrAlaThrProProGlySerValThrValProHisLeuAsnIleGluGluValAlaLeuSerAsnThrGlyGluIleProPheTyrGlyLysAlaIleProIleGluAlaIleLysGlyGlyArgHisLeuIlePheCysHisSerLysLysLysCysAspGluLeuAlaAlaLysLeuSerGlyLeuGlyLeuAsnAlaValAlaTyrTyrArgGlyLeuAspValSerValIleProThrSerGlyAspValValValValAlaThrAspAlaLeuMetThrGlyPheThrGlyAspPheAspSerValIleAspCysAsnThrCys；KHCV NS4E：IleIleProAspArgGluValLeuTyrGlnGluPheAspGluMetGluGluCysAlaSerHisLeuProTyrPheGluGlnGlyMetGlnLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeu；KHCV E1G：ValSerGlnLeuPheThrPheSerProArgArgHisGluThrValGlnAspCysAsnCysSerIleTyrProGlyArgValSerGlyHisArgMetAlaTrpAspMetMetMetAsnTrpSerProThrThrAlaLeuValValSerGlnLeuLeuArgIleProGlnAlaValValAspMetValThrGlySerHisTrpGlyIleLeuAlaGlyLeuAlaTyrTyrSerMetValGlyAsnTrpAlaLysValLeuIleAlaMetLeuLeuPheAlaGlyValAspGlyThrThrHisValThrGly；KHCV E2A：GlyAlaGlnGlyArgAlaAlaSerSerLeuThrSerLeuPheSerProGlyProValGlnHisLeuGlnLeuIleAsnThrAsnGlySerTrpHisIleAsnArgThrAlaLeuSerCysAsnAspSerLeuAsnThrGlyPheValAlaAlaLeuPheTyrLysTyrArgPheAsnAlaSerGlyCysProGluArgLeuAlaThrCysArgProIleAspThrPheAlaGlnGlyTrp；KHCV E2E：ThrArgGlyGluArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSerGluLeuSerProLeuLeuLeuSerThrThrGluTrpGlnValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeuSerThrGlyLeuIleHisLeuHisGlnAsnIleValAspIleGlnTyrLeuTyrGlyIleGlySerAlaValValSerPheAlaIleLysTrpGluTyrIleValLeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAspAla；andKHCV NS5-1.2：ThrGlyMetThrThrAspAsnValLysCysProCysGlnValProAlaProGluPhePheThrGluValAspGlyValArgLeuHisArgTyrAlaProAlaCysArgProLeuLeuArgGluGluValValPheGlnValGdyLeuHisGlnTyrLeuValGlySerGlnLeuProCysGluProGluProAspValAlaValLeuThrSerMetLeuThrAspProSerHisIleThrAlaGluThrAlaLysArgArgLeuAlaArgGlySerProProSerLeuAlaSerSerSerAlaSerGlnLeuSerAlaProSerLeuLysAlaThrCysThrThrHisHisAspSerProAspAlaAspLeuIleGluAlaAsnLeuLeuTrpArgGlnGluMetGlyGlyAsnIleThrArgValGluSerGluAsnLysValValIleLeuAspSerPheAspProLeuArgAlaGluAspAspGluGlyGluIleSerValProAlaGluIleLeuArgLysSerArgLysPheProProAlaLeuProIleTrpAlaProProAspTyrAsnProProLeuLeuGluSerTrpLysAspProAspTyrValProProValValHisGlyCysProLeuProProThrLysAlaProProIleProProProArgArgLysArgThrValValLeuThrGluSerThrValSerSerAlaLeuAlaGluLeuAlaThrLysThrPheGlySerSerGlySerSerAlaIleAspSerGlyThrAlaThrAlaProProAspGlnAlaSerGlyAspGlyAspArgGluSerAspValGluSerPheSerSerMetProProLeuGluGlyGluProGlyAspProAspLeuSerAspGlySerTrpSerThrValSerGluGluAlaSerGluAspValValCysCysSerMetSerTyrThrTrpThrGlyAlaLeuIleThrProCysAlaAlaGluGluSerLysLeuProIleAsnProLeuSerAsnSerLeuLeuArgHisHisAsnMetValTyrAlaThrThrSerArgSerAlaGlyLeuArgGlnLysLysValThrPheAspArgLeuGlnValLeuAspAspHisTyrArgAspValLeuLysGluMetLysAlaLysAla.
2、包含一或多种如权利要求1所述的丙型肝炎病毒的抗原蛋白的重组蛋白。
3、如权利要求2所述的重组蛋白，包含KHCVCOREEPI和KHCV 518。
4、如权利要求2所述的重组蛋白，包含KHCV E1G、KHCV E2A和KHCV E2E。
5、如权利要求4所述的重组蛋白，进一步包含KHCV NS4E。
6、如权利要求2-5任一项所述的重组蛋白，进一步包含遍在蛋白。
7、一种编码如权利要求1所述的丙型肝炎病毒的抗原蛋白的核苷酸序列。
8、如权利要求7所述的核苷酸序列，编码KHCVCOREEPI和KHCV 518。
9、如权利要求7所述的核苷酸序列，编码KHCVNS4E和KHCV 518。
10、如权利要求7所述的核苷酸序列，编码KHCV NS4E，KHCV E1G，KHCV E2A和KHCV E2E。
11、如权利要求7所述的核苷酸序列，编码KHCV E1G，KHCV E2A和KHCV E2E。
12、一种在trp启动子控制下的、包含如权利要求7-11任一项所述的核苷酸序列的表达载体。
13、如权利要求12所述的表达载体，其选自由ptrpH-UB-CORE 518，ptrpH-UB-NS4E1E2，ptrpH-UB-NS5-1.2，和ptrpH-UB-E1E2组成的一组。
14、一种用如权利要求12或13所述的表达载体转化的大肠杆菌细胞。
15、一种制备丙型肝炎病毒的抗原蛋白的方法，包含培养如权利要求14所述的大肠杆菌转化子以及从培养物中回收所述的抗原蛋白。
16、如权利要求15所述的方法，其中KHCV 518是采用用ptrpH-UB-CORE 518转化的大肠杆菌细胞制备的。
17、如权利要求15所述的方法，其中KHCVNS4E1E2是采用用ptrpH-UB-NS4E1E2转化的大肠杆菌细胞制备的。
18、如权利要求15所述的方法，其中KHCVNS5-1.2是采用用ptrpH-UB-NS5-1.2转化的大肠杆菌细胞制备的。
19、一种用于检测待测血清样品中抗丙型肝炎病毒抗原的抗体的诊断试剂，包含一或多种选自由KHCUCORE-518，KHCV NS4E1E2和KHCV NS5-1.2组成的一组的抗原蛋白。
20、一种用于检测待测样品中抗丙型肝炎病毒抗原的抗体的诊断试剂盒，其包括权利要求19的诊断试剂。
21、如权利要求20所述的诊断试剂盒，其用于酶联免疫吸附测定(ELISA)。
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