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CN119569835A - 呼吸道合胞病毒f蛋白及其应用 - Google Patents

呼吸道合胞病毒f蛋白及其应用 Download PDF

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CN119569835A
CN119569835A CN202411255920.8A CN202411255920A CN119569835A CN 119569835 A CN119569835 A CN 119569835A CN 202411255920 A CN202411255920 A CN 202411255920A CN 119569835 A CN119569835 A CN 119569835A
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CN
China
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rsv
polypeptide
recombinant rsv
protein
recombinant
Prior art date
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Pending
Application number
CN202411255920.8A
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English (en)
Inventor
刘德生
姜璐
齐冬梅
岳亮
张岩
张月潇
吕哲
胡雅灵
王祥喜
付望骏
冯瑞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sinovac Research & Development Co ltd
Institute of Biophysics of CAS
Original Assignee
Sinovac Research & Development Co ltd
Institute of Biophysics of CAS
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Publication date
Application filed by Sinovac Research & Development Co ltd, Institute of Biophysics of CAS filed Critical Sinovac Research & Development Co ltd
Publication of CN119569835A publication Critical patent/CN119569835A/zh
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Abstract

本公开涉及呼吸道合胞病毒F蛋白及其应用。本公开特别涉及了重组呼吸道合胞病毒(RSV)F多肽，该重组RSV F多肽稳定处于融合前构象，且所述重组RSV F多肽包括F1结构域和F2结构域。本公开还涉及包括编码该重组RSV F多肽的核酸分子、载体、免疫组合物及其应用。

Description

呼吸道合胞病毒F蛋白及其应用
技术领域
本公开涉及生物技术领域，特别涉及能够诱导和检测针对呼吸道合胞病毒(RSV)的免疫反应的多肽、核酸分子、组合物及其使用方法。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科(Pneumoviridae)肺病毒属(Pneumovirus)中的包膜非节段性负链RNA病毒。RSV感染对婴儿，心脏、肺或免疫功能受损人群，以及老年人群体造成了巨大的疾病负担。几乎所有儿童在两岁之前都会感染RSV。RSV是导致婴儿和老年人住院的主要原因。中度至重度RSV疾病还可能导致后来发展为哮喘和慢性喘息。这种现象可能是由RSV免疫敏化、肺部发育、神经发育等因素导致的。但是，尚无针对RSV引起的毛细支气管炎特效治疗方法。主要还是对症治疗如氧气支持和液体疗法、抗感染治疗(可通过干扰素雾化吸入治疗)、抗炎平喘治疗(雾化及药物治疗)等，最终还是靠机体自身的免疫系统完成自愈。
通过疫苗预防感染是应对RSV最经济有效的办法。RSV病毒的三种表面蛋白(F、G和SH)中，F蛋白的特异性抗体占感染人类血清中中和活性的大部分，因此F蛋白成为许多疫苗努力的重点。
F蛋白是一种三聚体I型融合糖蛋白，负责将病毒膜与细胞膜合并，并且与许多其他病毒融合糖蛋白一样，在融合前状态(Pre-F)过渡到融合后状态(Post-F)时经历了重大的结构重排。研究发现Post-F无法刺激机体产生足够的中和抗体，而Pre-F的特异性抗体的多少决定了人血清中RSV中和活性的大小。有研究表明，针对Pre-F中和抗体不仅能中和RSV病毒还能有效避免增强型呼吸道疾病(ERD)风险。但是，Pre-F构象相对不稳定，如何稳定Pre-F的构象成为RSV疫苗研发的重点。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本公开通过比对呼吸道合胞病毒(RSV)的融合前F(Pre-F)和融合后F(Post-F)的蛋白结构发现，二者在部分区域发生了明显的结构重排。以此为指导，通过基因工程改造在F蛋白中引入氨基酸突变，使得突变后的Pre-F蛋白能够通过在氨基酸序列中形成二硫键、离子键、疏水相互作用等，抑制构象重排，从而使得F蛋白稳定在融合前Pre-F的构象。
根据本公开的一个方面，提供了一种重组的呼吸道合胞病毒(RSV)F多肽，所述重组RSV F多肽稳定处于融合前构象，且所述重组RSV F多肽包括F1结构域和F2结构域。
在一些实施方式中，所述重组RSV F多肽通过引入一个或多个非天然存在的疏水性氨基酸、至少一对非天然存在的静电相反的氨基酸、至少一对非天然存在的脯氨酸和/或至少一对非天然半胱氨酸之间的二硫键而稳定处于融合前构象。
在一些实施方式中，所述重组RSV F多肽可以具有如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽在第26、29、30、31、32、33、34、35、55、57、59、61、62、65、67、74、75、79、80、83、86、87、90、137、138、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、155、158、159、172、173、174、178、180、181、182、183、186、187、188、189、190、193、195、196、207、210、211、213、214、217、227、229、241、253、254、256、279、286、290、291、298、302、332、334、337、338、339、340、353、354、355、356、368、370、371、373、394、396、397、398、399、400、404、406、407、427、443、445、449、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、473、474、475、480、482、483、484、485、486、487、488、489、491、494、499、502、505、506、508、509、512、513、515、516、520、522和523位中的一个或多个位点处具有氨基酸突变。
在一些实施方式中，所述F2结构域包括对应于野生型RSV F蛋白的第26～109位氨基酸的8～84个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述F1结构域包括对应于野生型RSV F蛋白的第137～529位氨基酸的14～393个氨基酸残基。
在一些实施方式中，所述F1结构域和所述F2结构域之间可以直接连接或者通过连接子连接。在具体的实施方式中，所述F1结构域和所述F2结构域之间可以通过连接子连接，例如通过GSGSGR(SEQ ID NO:2)连接。
在一些实施方式中，为了提高F蛋白的表达量，将F蛋白的aa 109～136替换成连接子。
在一些实施方式中，所述重组RSV F多肽包括对应于野生型RSV F蛋白的第1～513位氨基酸；在一些实施方式中，所述重组RSV F多肽包括对应于野生型RSV F蛋白的第1～526位氨基酸；
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下一种或多种突变：
第26位的谷氨酰胺(Q)到半胱氨酸(C)的突变(Q26C)；
第29位的苏氨酸(T)到半胱氨酸(C)的突变(T29C)；
第30位的谷氨酸(E)到半胱氨酸(C)的突变(E30C)；
第31位的谷氨酸(E)到半胱氨酸(C)的突变(E31C)
第32位的苯丙氨酸(F)到半胱氨酸(C)的突变(F32C)；
第33位的酪氨酸(Y)到半胱氨酸(C)的突变(Y33C)；
第34位的谷氨酰胺(Q)到半胱氨酸(C)的突变(Q34C)；
第35位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)的突变(S35C)；
第55位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)的突变(S55C)；
第57位的异亮氨酸(I)到半胱氨酸(C)的突变(I57C)；
第59位的异亮氨酸(I)到半胱氨酸(C)的突变(I59C)；
第61位的亮氨酸(L)到半胱氨酸(C)的突变(L61C)；
第62位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)、亮氨酸(L)或脯氨酸(P)的一种突变(S62C、S62L或S62P)；
第65位的赖氨酸(K)到半胱氨酸(C)的突变(K65C)；
第67位的天冬酰胺(N)到丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、亮氨酸(L)或缬氨酸(V)的一种突变(N67A、N67C、N67L或N67V)；
第74位的丙氨酸(A)到苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)的一种突变(A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R)；
第75位的赖氨酸(K)到半胱氨酸(C)的突变(K75C)；
第79位的异亮氨酸(I)到亮氨酸(L)的突变(I79L)；
第80位的赖氨酸(K)到丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、甲硫氨酸(M)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)或半胱氨酸(C)的一种突变(K80A、K80I、K80L、K80V、K80F、K80W、K80Y、K80M、K80S、K80P或K80C)；
第83位的亮氨酸(L)到半胱氨酸(C)的突变(L83C)；
第86位的酪氨酸(Y)到半胱氨酸(C)的突变(Y86C)；
第87位的赖氨酸(K)到丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、甲硫氨酸(M)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)或半胱氨酸(C)的一种突变(K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C)；
第90位的缬氨酸(V)到半胱氨酸(C)的突变(V90C)；
第137位的苯丙氨酸(F)到半胱氨酸(C)的突变(F137C)；
第138位的亮氨酸(L)到半胱氨酸(C)的突变(L138C)；
第140位的苯丙氨酸(F)到半胱氨酸(C)的突变(F140C)；
第141位的亮氨酸(L)到半胱氨酸(C)、精氨酸(R)或赖氨酸(K)的一种突变(L141C、L141R或L141K)；
第142位的亮氨酸(L)到半胱氨酸(C)的突变(L142C)；
第143位的甘氨酸(G)到半胱氨酸(C)的突变(G143C)；
第144位的缬氨酸(V)到半胱氨酸(C)的突变(V144C)；
第145位的甘氨酸(G)到异亮氨酸(I)或半胱氨酸(C)的突变(G145I或G145C)；
第146位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)的突变(S146C)；
第147位的丙氨酸(A)到缬氨酸(V)的突变(A147V)；
第148位的异亮氨酸(I)到半胱氨酸(C)的突变(I148C)；
第149位的丙氨酸(A)到半胱氨酸(C)的突变(A149C)；
第150位的丝氨酸(S)到亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)的一种突变(S150L、S150F、S150W或S150Y)；
第151位的甘氨酸(G)到亮氨酸(L)的突变(G151L)；
第155位的丝氨酸(S)到异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)的突变(S155I或S155V)；
第158位的亮氨酸(L)到半胱氨酸(C)的突变(L158C)；
第159位的组氨酸(H)到半胱氨酸(C)的突变(H159C)；
第172位的亮氨酸(L)到脯氨酸(P)的突变(L172P)；
第173位的丝氨酸(S)到脯氨酸(P)的突变(S173P)；
第174位的苏氨酸(T)到脯氨酸(P)的突变(T174P)；
第178位的缬氨酸(V)到半胱氨酸(C)的突变(V178C)；
第180位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)的突变(S180C)；
第181位的亮氨酸(L)到脯氨酸(P)的突变(L181P)；
第182位的丝氨酸(S)到脯氨酸(P)的突变(S182P)；
第183位的天冬酰胺(N)到脯氨酸(P)或天冬氨酸(D)的突变(N183P或N183D)；
第186位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)的突变(S186C)；
第187位的缬氨酸(V)到半胱氨酸(C)的突变(V187C)；
第188位的亮氨酸(L)到半胱氨酸(C)的突变(L188C)；
第189位的苏氨酸(T)到缬氨酸(V)的突变(T189V)；
第190位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)的一种突变(S190C、S190F或S190L)；
第193位的亮氨酸(L)到半胱氨酸(C)的突变(L193C)；
第195位的亮氨酸(L)到半胱氨酸(C)或赖氨酸(K)的突变(L195C或L195K)；
第196位的赖氨酸(K)到半胱氨酸(C)的突变(K196C)；
第207位的缬氨酸(V)到半胱氨酸(C)或异亮氨酸(I)的突变(V207C或V207I)；
第210位的谷氨酰胺(Q)到脯氨酸(P)的突变(Q210P)；
第211位的丝氨酸(S)到脯氨酸(P)的突变(S211P)；
第213位的丝氨酸(S)到脯氨酸(P)的突变(S213P)；
第214位的异亮氨酸(I)到脯氨酸(P)的突变(I214P)；
第217位的异亮氨酸(I)到半胱氨酸(C)的突变(I217C)；
第227位的天冬酰胺(N)到谷氨酸(E)的突变(N227E)；
第229位的精氨酸(R)到酪氨酸(Y)或色氨酸(W)的突变(R229Y或R229W)；
第241位的丙氨酸(A)到半胱氨酸(C)的突变(A241C)；
第253位的苏氨酸(T)到亮氨酸(L)的突变(T253L)
第254位的天冬酰胺(N)到酪氨酸(Y)的突变(N254Y)；
第256位的谷氨酸(E)到苯丙氨酸(F)的突变(E256F)；
第279位的谷氨酰胺(Q)到半胱氨酸(C)的突变(Q279C)；
第286位的酪氨酸(Y)到半胱氨酸(C)的突变(Y286C)；
第290位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)、缬氨酸(V)或丙氨酸(A)的一种突变(S290C、S290P、S290V或S290A)；
第291位的异亮氨酸(I)到半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)的一种突变(I291C、I291E或I291D)；
第298位的丙氨酸(A)到赖氨酸(K)、酪氨酸(Y)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)或苯丙氨酸(F)的一种突变(A298K、A298Y、A298I、A298L或A298F)；
第302位的谷氨酰胺(Q)到亮氨酸(L)或酪氨酸(Y)的突变(Q302L或Q302V)；
第332位的异亮氨酸(I)到半胱氨酸(C)的突变(I332C)；
第334位的亮氨酸(L)到半胱氨酸(C)的突变(L334C)；
第337位的苏氨酸(T)到色氨酸(W)、亮氨酸(L)或半胱氨酸(C)的一种突变(T337W、T337L或T337C)；
第338位的天冬氨酸(D)到半胱氨酸(C)的突变(D338C)；
第339位的精氨酸(R)到半胱氨酸(C)的突变(R339C)；
第340位的甘氨酸(G)到苯丙氨酸(F)或酪氨酸(Y)的突变(G340F或G340Y)；
第353位的脯氨酸(P)到半胱氨酸(C)的突变(P353C)；
第354位的谷氨酰胺(Q)到半胱氨酸(C)或亮氨酸(L)的突变(Q354C或Q354L)；
第355位的丙氨酸(A)到亮氨酸(L)的突变(A355L)；
第356位的谷氨酸(E)到色氨酸(W)的突变(E356W)；
第368位的天冬氨酸(D)到亮氨酸(L)的突变(D368L)；
第370位的甲硫氨酸(M)到半胱氨酸(C)的突变(M370C)；
第371位的天冬酰胺(N)到半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、亮氨酸(L)或半胱氨酸(C)的一种突变(N371C、N371F、N371W、N371Y、N371L或N371C)；
第373位的亮氨酸(L)到半胱氨酸(C)的突变(L373C)；
第394位的赖氨酸(K)到半胱氨酸(C)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、或亮氨酸(L)的一种突变(K394C、K394W、K394F、K394Y或K394L)；
第396位的甲硫氨酸(M)到半胱氨酸(C)的突变(M396C)；
第397位的苏氨酸(T)到半胱氨酸(C)的突变(T397C)；
第398位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)或苯丙氨酸(F)的突变(S398C或S398F)；
第399位的赖氨酸(K)到半胱氨酸(C)的突变(K399C)；
第400位的苏氨酸(T)到缬氨酸(V)的突变(T400V)；
第404位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)或半胱氨酸(C)的一种突变(S404C、S404V、S404I、S404L或S404C)；
第406位的缬氨酸(V)到半胱氨酸(C)的突变(V406C)；
第407位的异亮氨酸(I)到半胱氨酸(C)的突变(I407C)；
第427位的赖氨酸(K)到精氨酸(R)的突变(K427R)；
第443位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)的突变(S443C)；
第445位的赖氨酸(K)到半胱氨酸(C)的突变(K445C)；
第449位的苏氨酸(T)到半胱氨酸(C)的突变(T449C)；
第458位的酪氨酸(Y)到半胱氨酸(C)或脯氨酸(P)的突变(Y458C或Y458P)；
第459位的缬氨酸(V)到脯氨酸(P)的突变(V459P)；
第460位的天冬酰胺(N)到半胱氨酸(C)或脯氨酸(P)的突变(N460C或N460P)；
第461位的赖氨酸(K)到脯氨酸(P)的突变(K461P)；
第462位的谷氨酰胺(Q)到脯氨酸(P)的突变(Q462P)；
第463位的谷氨酸(E)到半胱氨酸(C)或脯氨酸(P)的突变(E463C或E463P)；
第465位的赖氨酸(K)到半胱氨酸(C)的突变(K465C)；
第466位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)的突变(S466C)；
第467位的亮氨酸(L)到半胱氨酸(C)的突变(L467C)；
第468位的酪氨酸(Y)到半胱氨酸(C)的突变(Y468C)；
第469位的缬氨酸(V)到半胱氨酸(C)的突变(V469C)；
第470位的赖氨酸(K)到半胱氨酸(C)的突变(K470C)；
第471位的甘氨酸(G)到半胱氨酸(C)的突变(G471C)；
第473位的脯氨酸(P)到半胱氨酸(C)的突变(P473C)；
第474位的异亮氨酸(I)到半胱氨酸(C)的突变(I474C)；
第475位的异亮氨酸(I)到半胱氨酸(C)的突变(I475C)；
第480位的脯氨酸(P)到半胱氨酸(C)的突变(P480C)；
第482位的缬氨酸(V)到半胱氨酸(C)或脯氨酸(P)的突变(V482C或V482P)；
第483位的苯丙氨酸(F)到半胱氨酸(C)或脯氨酸(P)的突变(F483C或F483P)；
第484位的脯氨酸(P)到半胱氨酸(C)的突变(P484C)；
第485位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)的突变(S485C)；
第486位的天冬氨酸(D)到半胱氨酸(C)的突变(D486C)；
第487位的谷氨酸(E)到半胱氨酸(C)的突变(E487C)；
第488位的苯丙氨酸(F)到半胱氨酸(C)的突变(F488C)；
第489位的天冬氨酸(D)到半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)的一种突变(D489C、D489F或D489L)；
第491位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)的突变(S491C)；
第494位的谷氨酰胺(Q)到半胱氨酸(C)的突变(Q494C)；
第499位的异亮氨酸(I)到半胱氨酸(C)的突变(I499C)；
第502位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)的一种突变(S502C、S502F、S502W或S502Y)；
第505位的苯丙氨酸(F)到组氨酸(H)或赖氨酸(K)(F505H或F505K)；
第506位的异亮氨酸(I)到天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)的突变(I506D或I506E)；
第508位的赖氨酸(K)到半胱氨酸(C)的突变(K508C)；
第509位的丝氨酸(S)到半胱氨酸(C)的突变(S509C)；
第512位的亮氨酸(L)到半胱氨酸(C)的突变(L512C)；
第513位的亮氨酸(L)到半胱氨酸(C)的突变(L513C)；
第515位的天冬酰胺(N)到半胱氨酸(C)或天冬氨酸(D)的突变(N515C或N515D)；
第516位的缬氨酸(V)到半胱氨酸(C)的突变(V516C)；
第520位的赖氨酸(K)到精氨酸(R)的突变(K520R)；
第522位的苏氨酸(T)到半胱氨酸(C)的突变(T522C)；和
第523位的苏氨酸(T)到半胱氨酸(C)的突变(T523C)。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下任一项或多项的突变：(1)P484C和I499C；(2)V482C和I499C；(3)V482C和S502C；(4)M396C和F488C；(5)S398C和S485C；(6)S398C和D486C；(7)I148C和Y286C；(8)H159C和S290C；(9)H159C和I291C；(10)L158C和S290C；(11)Q494C和K399C；(12)D489C和S398C；(13)D489C和D486C；(14)D489C和S485C；(15)N460C和S146C；(16)A149C和Y458C；(17)I64C和K87C；(18)K65C和K87C；(19)L61C和Y86C；(20)S62C和Y86C；(21)L61C和V90C；(22)N67C和L83C；(23)N67C和K80C；(24)S62C和K196C；(25)N67C和V207C；(26)L61C和L195C；和，(27)V144C和M370C。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下各项的突变：(1)S398C；和，(2)S485C、D486C或D489C。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下各项的突变：(1)H159C；和，(2)S290C或I291C。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下各项的突变：(1)H159C或L158C；和，(2)S290C。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下各项的突变：(1)D489C；和，(2)S398C、S485C或D486C。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括在第67和80位氨基酸残基的突变。在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下各项的突变：(1)N67A；和，(2)K80A、K80I、K80L、K80V、K80F、K80W、K80Y、K80M、K80S、K80P、K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S或K87P。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下各项的突变：(1)L61C；和，(2)Y86C、V90C或L195C。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下各项的突变：(1)S62C；和，(2)Y86C或K196C。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括在第65和87位氨基酸残基上的氨基酸突变。在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括K65C和K87C。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下各项的突变：(1)N67C；和，(2)K80C、L83C或V207C。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下各项的突变：(1)F505H或F505K；和，(2)I506D或I506E。在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以第506位的突变，优选包括以下各项的突变：(1)I506D；(2)I506E；(3)F505H和I506D；(4)F505H和I506E；(5)F505K和I506D；和，(6)F505K和I506E。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括S213P和I214P。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括Q210P和S211P。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下各项的突变：(1)S173P；和，(2)L172P或T174P。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下各项的突变：(1)S182P；和，(2)L181P或N183P。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括在第144和370位氨基酸残基上的氨基酸突变。在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括V144C和M370C。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下项的突变：(1)N67A；(2)K80A；和，(3)K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S或K87P。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下各项的突变：(1)I57C；(2)S190C；(3)V178C或S180C；和，(4)S186C、V187C或L188C。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括I59C、L193C、S180C和S186C。
在一些实施方式中，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽可以包括以下各项的突变：(1)I59C；(2)S190C；(3)V178C；和，(4)V187C或L188C。
在一些实施方式中，除了K65C和K87C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以在其他氨基酸位置上具有一个或多个突变。在一些实施方式中，除了K65C和K87C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以在第62、74、141、145、150、151、155、211、254、290、291、298、337、340、458、459、460、461、462、463、482、483、489和502位中的一个或多个氨基酸残基上具有突变。
在一些实施方式中，除了K65C和K87C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括以下任一项的突变：S62L或S62P；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；L141R或L141K；G145I；S150L；G151L；S155I；S211P；N254Y；S290P；I291E或I291D；A298K、A298Y、A298I或A298L；T337W；G340F或G340Y；Y458P；V459P；N460P；K461P；Q462P；E463P；V482P；F483P；D489F；和/或，S502F、S502W或S502Y。
在一些实施方式中，除了K65C和K87C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以在第26、29、30、31、32、33、34、35、55、57、62、67、74、75、79、80、87、137、138、140、141、142、143、144、145、146、147、149、150、151、155、159、183、188、189、190、195、207、211、217、227、229、241、253、254、256、279、290、291、298、302、332、334、337、338、339、340、353、354、355、356、368、370、371、373、394、396、397、398、400、404、406、407、427、443、445、449、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、473、474、475、480、482、483、485、486、487、488、489、491、502、505、506、508、509、512、513、515、516、520、522、523位中的一个或多个位点处具有氨基酸突变。
在一些实施方式中，除了K65C和K87C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括以下任一项的突变：
(1)F505H或F505K；和，I506D或I506E，
(2)L141C、L141R或L141K；和，N371C或L373C，
(3)V144C、G145C或S146C；和，M370C，
(4)L138C；和，Q354C或D338C，
(5)L334C；和，I475C，
(6)F137C；和，T337C、D338C、R339C或P353C，
(7)I57C；和，S190C，
(8)S55C；和，L188C，
(9)H159C；和，I291C、I291E或I291D，
(10)Q34C；和，K470C或G471C，
(11)S35C；和，P473C或I474C，
(12)I332C；和，P480C或F483C，
(13)M396C；和，F488C，
(14)K394C、K394W、K394F、K394Y或K394L；和，S491C，
(15)T397C；和，S485C、D486C或E487C，
(16)F32C；和，Y468C，
(17)E30C或S443C；和，S466C，
(18)Y33C；和，V469C，
(19)E31C；和，L467C，
(20)T29C；和，K465C，
(21)Q26C或K445C；和，E463C或E463P，
(22)T449C；和，Y458C或Y458P，
(23)Q354C或Q354L；和，N371C、N371F、N371W、N371Y、N371L或N371C，
(24)G151L；和，Q302L或Q302V，
(25)K75C；和，I217C，
(26)G143C；和，V406C、N371C、N371F、N371W、N371Y、N371L或N371C，
(27)G145I或G145C；和，I407C或M370C，
(28)F140C；和，S404C，
(29)A241C；和，Q279C，
(30)T189V；和，A298K、A298Y、A298I、A298L或A298F，
(31)L195C或L195K；和，N227E，
(32)S398C或S398F；和，D489C、D489F或D489L，
(33)L142C；和，P353C、N371C、N371F、N371W、N371Y、N371L或N371C，
(34)K508C；和，S509C，或
(35)L512C；和，L513C，
(36)A149C；和，Y458C，
(37)V144C；和，N371C。
在一些实施方式中，除了K65C和K87C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括一个或多个氨基酸突变。在一些实施方式中，除了K65C和K87C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括1～10个氨基酸突变。在一些实施方式中，除了K65C和K87C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变。在一些实施方式中，除了K65C和K87C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括1～7个氨基酸突变。
在一些实施方式中，除了K65C和K87C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括以下任一项的突变：
(1)K394C、K394W、K394F、K394Y或K394L；D489C、D489F或D489L；和，T337W、T337L或T337C，
(2)S150L、S150F、S150W或S150Y；G151L；和，Q302L或Q302V，
(3)S155I或S155V；S290C、S290P、S290V或S290A；和，A298K、A298Y、A298I、A298L或A298F，
(4)N67A、N67C、N67L或N67V；I79L；和，V207C或V207I，
(5)A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K508C；和，S509C，
(6)V144C；M370C；和，A74F、A74W、A74Y、A74K、A74R、K80A、K80I、K80L、K80V、K80F、K80W、K80Y、K80M、K80S、K80P、K80C、I291C、I291E、I291D、S211P、A298K、A298Y、A298I、A298L或A298F，
(7)S190C、S190F或S190L；R229Y或R229W；T253L；和，E256F，
(8)V144C；M370C；F505H或F505K；和，I506D或I506E，
(9)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，S404C、S404V、S404I、S404L或S404C，
(10)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，S150L、S150F、S150W或S150Y，
(11)V144C；M370C；N67A、N67C、N67L或N67V；和，A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R，
(12)V144C；M370C；T189V；和，A298K、A298Y、A298I、A298L或A298F，
(13)V144C；M370C；K508C；和，S509C，
(14)V144C；M370C；L512C；和，L513C，
(15)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，N183P、N183D、N515C、N515D或K520R，
(16)V144C；M370C；N67A、N67C、N67L或N67V；I79L；和，V207C或V207I；
(17)A147V；Q354C或Q354L；A355L；D368L；和，N371F、N371W、N371Y、N371L或N371C，
(18)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K508C；和，S509C，
(19)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；L512C；和，L513C，
(20)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；T522C；和，T523C，
(21)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；N515C或N515D；和，V516C或K520R，
(22)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；N183P或N183D；和，K427R，
(23)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；G143C；和，V406C，
(24)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；G145I或G145C；和，I407C，
(25)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；F140C；和，S404C、S404V、S404I、S404L或S404C，
(26)V144C；M370C；N67A、N67C、N67L或N67V；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，K80A、K80I、K80L、K80V、K80F、K80W、K80Y、K80M、K80S、K80P或K80C，
(27)A355L；E356W；D368L；N371F、N371W、N371Y、N371L或N371C；K394C、K394W、K394F、K394Y或K394L；T400V；D489C、D489F或D489L。
在一些实施方式中，除了V144C和M370C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括一个或多个氨基酸突变。在一些实施方式中，除了V144C和M370C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括1～10个氨基酸突变。在一些实施方式中，除了V144C和M370C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变。在一些实施方式中，除了V144C和M370C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括1～5个氨基酸突变。在一些实施方式中，除了V144C和M370C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括在第65、67、74、79、80、87、140、143、145、150、183、189、207、211、291、298、404、406、407、427、505、506、508、509、512、513、515、516、520、522、523位中一个或多个氨基酸突变。
在一些实施方式中，除了V144C和M370C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括以下任一项的突变：
(1)N67A、N67C、N67L或N67V；和，K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C，
(2)K65C；和，K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C。
在一些实施方式中，除了V144C和M370C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括以下任一项的突变：
(1)N67A、N67C、N67L或N67V；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C，
(2)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；和，I291C、I291E或I291D，
(3)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；和，A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R，
(4)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；和，K80A、K80I、K80L、K80V、K80F、K80W、K80Y、K80M、K80S、K80P或K80C，
(5)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；和，S211P，
(6)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；和，A298K、A298Y、A298I、A298L或A298F。
在一些实施方式中，除了V144C和M370C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括以下任一项的突变：
(1)N67A、N67C、N67L或N67V；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K80A、K80I、K80L、K80V、K80F、K80W、K80Y、K80M、K80S、K80P或K80C；和，K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C，
(2)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；F505H或F505K；和，I506D或I506E，
(3)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，S404C、S404V、S404I、S404L或S404C，
(4)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，S150L、S150F、S150W或S150Y，
(5)K65C；N67A、N67C、N67L或N67V；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；和，A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R，
(6)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，N183P或N183D，
(7)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，K520R，
(8)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；T189V；和，A298K、A298Y、A298I、A298L或A298F，
(9)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；K508C；和，S509C，
(10)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；L512C；和，L513C，
(11)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，N515C或N515D。
在一些实施方式中，除了V144C和M370C突变之外，所述重组RSV F多肽还可以包括以下任一项的突变：
(1)K65C；N67A、N67C、N67L或N67V；I79L；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；和，V207C或V207I，
(2)K65C；N67A、N67C、N67L或N67V；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K80A、K80I、K80L、K80V、K80F、K80W、K80Y、K80M、K80S、K80P或K80C；和，K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C，
(3)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；K508C；和，S509C，
(4)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；L512C；和，L513C，
(5)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；T522C；和，T523C，
(6)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；N515C或N515D；和，V516C，
(7)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；N515C或N515D；和，K520R，
(8)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；N183P或N183D；和，K427R，
(9)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；G143C；和，V406C，
(10)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；G145I或G145C；和，I407C，
(11)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；F140C；和，S404C、S404V、S404I、S404L或S404C。
在优选的实施方式中，所述重组RSV F多肽可以具有如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且包括以下一项或多项突变：(1)K65C和K87C；(2)K65C、K87C、F505H和I506D；(3)K65C、K87C、F505K和I506E；(4)K65C、K87C，S211P；(5)K65C、K87C和A74F；(6)K65C、K87C和A74W；(7)K65C、K87C和A74Y；(8)K65C、K87C和N254Y；(9)K65C、K87C和A298Y；(10)K65C、K87C和D489F；(11)K65C、K87C和S502F；(12)K65C、K87C和S502Y；(13)S62L、K65C和K87C；(14)S62P、K65C和K87C；(15)K65C、K87C和A298I；(16)K65C、K87C和A298L；(17)K65C、K87C、L141C和N371C；(18)K65C、K87C、V144C和M370C；(19)K65C、K87C、S55C和L188C；(20)K65C、K87C、H159C和I291C；(21)K65C、K87C、I332C和F483C；(22)K65C、K87C、I332C和P480C；(23)K65C、K87C、M396C和F488C；(24)K65C、K87C、T397C和D486C；(25)K65C、K87C、T397C和S485C；(26)K65C、K87C、Q26C和E463C；(27)K65C、K87C、K445C和E463C；(28)K65C、K87C、S443C和S466C；(29)K65C、K87C、K394W、D489F和T337L；(30)K65C、K87C、K394W、D489L和T337L；(31)K65C、K87C和L141R；(32)K65C、K87C和L141K；(33)K65C、K87C、Q354L和N371F；(34)K65C、K87C、Q354L和N371W；(35)K65C、K87C、Q354L和N371Y；(36)K65C、K87C和I291D；(37)K65C、K87C、S155V、S290A和A298L；(38)K65C、K87C和Y458P；(39)K65C、K87C和V459P；(40)K65C、K87C和N460P；(41)K65C、K87C和K461P；(42)K65C、K87C和E463P；(43)K65C、K87C、K75C和I217C；(44)K65C、K87C和A74K；(45)K65C、K87C和A74R；(46)K65C、K87C、T189V和A298F；(47)K65C、K87C、S398F和D489L；(48)K65C、K87C、N67L、I79L和V207I；(49)K65C、K87C、L142C和N371C；(50)K65C、K87C、V144C和N371C；(51)K65C、K87C、G145C和M370C；(52)K65C、K87C、K508C和S509C；(53)K65C、K87C、L512C和L513C；(54)K65C、K87C、V144C、M370C和A74F；(55)K65C、K87C、V144C、M370C和A74W；(56)K65C、K87C、V144C、M370C和A74Y；(57)K65C、K87C、V144C、M370C、F505K和I506E；(58)K65C、K87C、V144C、M370C和S211P；(59)K65C、K87C、V144C、M370C和A298Y；(60)K65C、K87C、V144C、M370C、T189V和A298Y；(61)K65C、K87C、V144C、M370C、N67L、I79L和V207I；(62)N67A、K87V、V144C和M370C；(63)K65C、K87C、V144C、M370C和K80W；(64)K65C、K87C、V144C、M370C、K508C和S509C；(65)K65C、K87C、V144C、M370C、L512C和L513C；(66)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、K508C和S509C；(67)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、L512C和L513C；(68)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、T522C和T523C；(69)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、N515C和V516C；(70)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和N515D；(71)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和K520R；(72)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、N515D和K520R；(73)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和N183D；(74)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、N183D和K427R；(75)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S404V；(76)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S404I；(77)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S404L；(78)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、G143C和V406C；(79)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、F140C和S404C；(80)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150L；(81)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150F；(82)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150W；(83)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150Y；(84)K65C、K87C、V144C、M370C和A74Y；(85)K65C、K87C、A74Y、K508C和S509C；(86)K65C、K87C、V144C、M370C、N67A和A74Y；(87)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V和A74Y；(88)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80V；(89)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80F；(90)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80W；(91)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80L；和，(92)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80Y。
在优选的实施方式中，所述重组RSV F多肽可以具有如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且包括以下一项或多项突变：(1)V144C和M370C；(2)K65C、K87C、V144C、M370C和A74F；(3)K65C、K87C、V144C、M370C和A74W；(4)K65C、K87C、V144C、M370C和A74Y；(5)K65C、K87C、V144C、M370C、F505K和I506E；(6)K65C、K87C、V144C、M370C和S211P；(7)K65C、K87C、V144C、M370C和A298Y；(8)K65C、K87C、V144C、M370C、T189V和A298Y；(9)K65C、K87C、V144C、M370C、N67L、I79L和V207I；(10)N67A、K87V、V144C和M370C；(11)K65C、K87C、V144C、M370C和K80W；(12)K65C、K87C、V144C、M370C、K508C和S509C；(13)K65C、K87C、V144C、M370C、L512C和L513C；(14)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、K508C和S509C；(15)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、L512C和L513C；(16)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、T522C和T523C；(17)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、N515C和V516C；(18)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和N515D；(19)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和K520R；(20)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、N515D和K520R；(21)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和N183D；(22)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、N183D和K427R；(23)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S404V；(24)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S404I；(25)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S404L；(26)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、G143C和V406C；(27)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、F140C和S404C；(28)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150L；(29)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150F；(30)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150W；(31)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150Y；(32)K65C、K87C、V144C、M370C和A74Y；(33)N67A、A74Y、K87V、V144C和M370C；(34)K65C、K87C、V144C、M370C、N67A和A74Y；(35)N67V、A74Y、K87V、V144C和M370C；(36)N67V、A74Y、K80V、K87V、V144C和M370C；(37)N67V、A74Y、K80F、K87V、V144C和M370C；(38)N67V、A74Y、K80W、K87V、V144C和M370C；(39)N67V、A74Y、K80L、K87V、V144C和M370C；(40)N67V、A74Y、K80Y、K87L、V144C和M370C；(41)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V和A74Y；(42)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80V；(43)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80F；(44)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80W；(45)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80L；和，(46)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80Y。
在优选的实施方式中，所述重组RSV F多肽可以具有如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且包括以下一项或多项突变：(1)K65C和K87C；(2)K65C、K87C、F505K和I506E；(3)K65C、K87C和S211P；(4)K65C、K87C和A74F；(5)K65C、K87C和A74W；(6)K65C、K87C和A74Y；(7)K65C、K87C和A298Y；(8)K65C、K87C、V144C和M370C；(9)K65C、K87C、T189V和A298F；(10)K65C、K87C、N67L、I79L和V207I；(11)K65C、K87C、K508C和S509C；(12)K65C、K87C、L512C和L513C；(13)V144C和M370C；(14)K65C、K87C、V144C、M370C和A74F；(15)K65C、K87C、V144C、M370C和A74Y；(16)K65C、K87C、V144C、M370C、N67L、I79L和V207I；(17)N67A、K87V、V144C和M370C；(18)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和N515D；(19)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S404V；(20)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和V207I；(21)N67A、A74Y、K87V、V144C和M370C；(22)N67V、A74Y、K87V、V144C和M370C；(23)N67V、A74Y、K80V、K87V、V144C和M370C；(24)N67V、A74Y、K80W、K87V、V144C和M370C；(25)N67V、A74Y、K80L、K87V、V144C和M370C；和，(26)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V和A74Y。
上述突变位点是基于SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列编号的。另外，本领域技术人员应理解，对应于人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV的F蛋白的上述位点突变也可以阻止这些F蛋白的构象发生重排，从而稳定在融合前构象。在一些实施方式中，所述重组RSVF多肽可以包括1～10个氨基酸突变。在一些实施方式中，所述重组RSV F多肽可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变。
在一些实施方式中，所述重组RSV F多肽还可以包括三聚化结构域。所述三聚化结构域可以位于所述重组RSV F多肽的C端区域中。在一些实施方式中，所述三聚化结构域可以来源于噬菌体T4次要纤维蛋白折叠子。在一些实施方式中，所述三聚化结构域可以包括氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO:7)或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述重组RSV F多肽可以直接或者通过连接子与所述三聚化结构域连接。
在一些实施方式中，所述重组RSV F多肽可以展示在纳米颗粒或病毒样颗粒上。
根据本公开的又一方面，提供了一种重组蛋白，其包括本公开的上述重组RSV F多肽。
在一些实施方式中，所述重组蛋白包括本公开的上述重组RSV F多肽和骨架蛋白。在一些实施方式中，所述骨架蛋白可以形成纳米颗粒。在一些实施方式中，所述重组RSV F多肽可以被展示在纳米颗粒的表面上。根据本公开的又一方面，提供了一种核酸分子，其编码上述重组RSV F多肽或上述重组蛋白。
在一些实施方式中，所述核酸分子可以为DNA分子或RNA分子。
在一些实施方式中，所述核酸分子可以为RNA分子。在优选的实施方式中，所述核酸分子可以为mRNA分子。
在一些实施方式中，所述核酸分子可以包括至少一个化学修饰。在优选的实施方式中，所述核酸分子可以包括选自下组的化学修饰：假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4′-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2′-O-甲基尿苷。
在一些实施方式中，所述核酸分子包括至少一个5′端帽或帽类似物。适用于本公开的5′端帽或帽类似物可以是本领域已知的和/或本文描述的。在优选的实施方式中，所述5′端帽或帽类似物可以包括，例如N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸形式的帽类似物，N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5')ppp(5')G和N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3'-OG(5')ppp(5')G帽类似物，7mG(5')ppp(5')N,pN2p，7mG(5′)ppp(5′)NlmpNp，N7,2'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷，m7Gm-ppp-G，和7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp，其中N选自任意核碱基(A、G、C、T)。
在一些实施方式中，所述核酸分子可以经密码子优化以在受试者或受试者细胞中表达，例如在人类或牛的细胞中细胞。
根据本公开的又一方面，提供了一种载体，其包括本公开的上述核酸分子。在一些实施方式中，所述载体可以是病毒载体，其可用于在宿主细胞中表达上述重组RSV F多肽，或用于在受试者中进行免疫。
在一些实施方式中，本公开的载体可以具有复制能力，且编码本公开的上述重组RSV F多肽。在一些实施方式中，本公开的载体在宿主细胞中具有复制缺陷。在一些实施方式中，所述病毒载体可以经由呼吸道递送。在一些实施方式中，所述病毒载体可以选自，例如副粘病毒(PIV)载体如牛副流感病毒(BPIV)载体(例如，BPIV-1、BPIV-2或BPV-3载体)或人类PIV载体、偏肺病毒(MPV))载体、新城疫病毒载体、仙台病毒载体、麻疹病毒载体、新城疫病毒载体等。其他病毒载体，例如腺病毒、多瘤病毒(如SV40)、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒等也可用递送编码本公开的上述重组RSV F多肽的核酸分子。
根据本公开的又一方面，提供了一种宿主细胞，其包括本公开的上述核酸分子。在一些实施方式中，所述宿主细胞可以包括哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和原核细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞可以包括，但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、肿瘤细胞系、仓鼠肾(BHK)细胞、HEK293细胞、PER.C6细胞、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞、小鼠骨髓瘤SP2/0细胞、成年非洲绿猴肾(Vero)细胞等。
根据本公开的又一方面，提供了一种免疫原性组合物，其包括本公开的上述重组RSV F多肽或上述重组蛋白，以及药学上可接受的载剂。
在一些实施方式中，所述免疫原性组合物还可以包括佐剂。在一些实施方式中，所述佐剂可以包括，例如明矾、矿物盐(例如铝或钙盐)、水包油组合物、AS01B、AS01E、MF59、AS01、AS03、AS04、MPL、QS21、CpG寡核苷酸、TLR7激动剂、TLR4激动剂、TLR3激动剂或其中两种或更多种的组合。所述佐剂可以促进Th1免疫反应。
在一些实施方式中，所述载剂为脂质纳米颗粒颗粒。在一些实施方式中，所述载剂可以选自阳离子型脂质、经PEG修饰的脂质、固醇和磷脂。
在一些实施方式中，所述免疫原性组合物可以通过本领域熟知的多种方式来施用，例如可以经鼻、经肺、肌肉、皮下、静脉、腹膜内或肠胃外途径来施用。
根据本公开的又一方面，提供了一种在受试者中产生免疫反应的方法，该方法采用了本公开的上述重组RSV F多肽、上述重组蛋白或其编码核酸分子。在一些实施方式中，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的上述重组RSV F多肽、上述重组蛋白或其编码核酸分子。在一些实施方式中，所述免疫反应能够用于治疗、抑制或预防RSV感染。在一些实施方式中，该方法可以包括利用本公开的上述重组RSV F多肽或上述重组蛋白进行初免免疫和/或加强免疫。
根据本公开的又一方面，提供了本公开的上述重组RSV F多肽、上述重组蛋白或其编码核酸分子在制备用于在受试者中产生免疫反应的药物中的用途。
根据本公开的又一方面，提供了本公开的上述重组RSV F多肽或上述重组蛋白用于检测或分离感染RSV的受试者中的RSV抗体中的用途。在一些实施方式中，所述重组RSV F多肽或所述重组蛋白可以用于检测和/或定量样本中的RSV抗体。
在一些实施方式中，上述RSV感染可以包括人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV的感染。
在一些实施方式中，所述受试者可以为例如哺乳动物。在一些实施方式中，所述哺乳动物可以为人类哺乳动物，或非人类哺乳动物，例如猫、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、小鼠、大鼠、兔、沙鼠、天竺鼠和非人灵长类动物。
附图说明
图1示例性示出了本公开的RSV F蛋白的构建示意图。
图2示例性示出了根据本公开的一个突变体的层析纯化结果。
图3示出了各突变体Tm检测值。
图4示出了各突变体50℃1h处理后与AM14、D25抗体Elisa检测结果。
图5示出了各突变体60℃1h处理后与AM14、D25抗体Elisa检测结果。
图6示出了各突变体蛋白表达量。
图7示出了各突变体负染电镜照片。
图8示出了各重组突变体疫苗小鼠血清中和抗体滴度结果。
图9示出了F蛋白突变体mRNA疫苗小鼠血清中和抗体滴度。
图10示出了F蛋白突变体mRNA疫苗小鼠脾细胞IFN-γ检测结果。
图11示出了F蛋白突变体mRNA疫苗小鼠脾细胞IL4检测结果。
图12示出了F蛋白突变体mRNA疫苗小鼠肺部病毒载量结果。
图13示出了F蛋白突变体mRNA疫苗小鼠肺部病理评分结果。
图14示出了F蛋白突变体mRNA疫苗棉鼠血清中和抗体结果。
图15示出了F蛋白突变体mRNA疫苗棉鼠肺部病毒载量结果。
具体实施方式
呼吸道合胞病毒(RSV)的基因组长度约为15200nt，包含10个开放阅读框，编码11种蛋白质。这些蛋白包括两种非结构蛋白(NS1和NS2)，两种核衣壳蛋白(N和P)，一种内包膜蛋白(M1)，三种覆盖于病毒的表面的小的亲水性蛋白(SH)、附着蛋白(G)和融合蛋白(F)。M2基因包含重叠的开放阅读框，可以编码M2.1和M2.2两种蛋白以及大的(L)蛋白。G和F蛋白是主要的抗原蛋白，是RSV疫苗的主要靶点。RSV是多形性的，如其可以是球形、不对称形状和纤维状。
RSV病毒根据G蛋白序列可分为A、B两种亚型。这两种亚型的表面融合糖蛋白F的保守性很高，序列相似度高达约94％，且抗体结合位点的序列极为保守。本公开选择了流行性相对较高的A亚型RSV病毒F蛋白序列作为基础，进行突变体设计。但是，由于A亚型和B亚型RSV病毒的F蛋白序列具有高保守性，因此本领域技术人员应理解，制备出的F蛋白突变体可同时应用于两种亚型RSV病毒感染的预防和/或治疗。本公开中提及的突变位点或者氨基酸位置均是相对于A亚型RSV病毒F蛋白序列(SEQ ID NO:22)。
RSV F是三聚体I型跨膜蛋白，其跨膜区域把F蛋白铆钉在RSV病毒外膜上并起到稳定三聚体的作用。膜蛋白不适合作为疫苗的主要成分，其不溶于水的性质对疫苗生产是不可接受的。在具体的实施方式中，本公开使用RSV F蛋白的胞外可溶性区域(aa 1～513)或者(aa 1～526)做为抗原，同时为了稳定胞外三聚体状态，在其C端添加天然的三聚体结构域纤维蛋白结构域(T4 foldon)。为了提高F蛋白的表达量，将F蛋白的aa 109～136替换成连接子GSGSGR(SEQ ID NO:2)。为了后续检测和纯化，在T4-foldon后面添加了Strep-II标签。得到的F蛋白结构示意图如图1所示。
RSV在感染宿主细胞时，病毒首先与宿主细胞的细胞膜进行融合。RSV F蛋白最初折叠成一种“融合前”构象。在进行细胞的过程中，F蛋白由融合前构象进行再折叠和构象变化，形成其“融合后”构象。因此，处于融合前构象的RSV F蛋白是一种亚稳态蛋白质，其随后进行不连续/逐步的构象变化，不可逆地折叠成一种较低能量的构象(融合后构象)，从而连接到膜来驱动膜融合。随着研究的深入，人们发现融合后F蛋白(Post-F)无法刺激机体产生足够的中和抗体，而针对融合前F蛋白(Pre-F)的特异性抗体的多少决定了血清中RSV中和活性的大小，这使得人们将研究重点转移到Pre-F上。有研究表明针对Pre-F中和抗体不仅能中和RSV病毒还能有效避免疫苗增强呼吸道疾病(ERD)风险。因此如何稳定Pre-F的构象成为RSV疫苗研究的重中之重。
本公开通过对比Pre-F和Psot-F的蛋白结构发现，二者的部分区域发生了明显的结构重排。我们把发生结构重排的区域称为可变区域，没有发生结构重排的区域称为不变区域。RSV-F蛋白可以分成三个结构域：1)不变区(第1～139位和第216～459位氨基酸)，即Pre-F与Post-F结构相同的区域；2)上可变区(第140～216位氨基酸)，即Pre-F与Post-F上半部分结构发生变化的区域；3)下可变区(第460～513位氨基酸)，即Pre-F与Post-F下半部分结构发生变化的区域通。
本公开通过引入稳定化氨基酸突变或氨基酸突变的组合，在可变区与不变区之间形成一个或多个二硫键、离子键、疏水相互作用等，使可变区与不变区锁定在一起，从而阻止可变区发生构象重排，将F蛋白稳定在融合前构象。
本公开成功筛选出了能够稳定F蛋白在融合前构象、稳定性好且表达量高的融合前F蛋白的突变体。不希望受任何具体的理论束缚，本公开提供的处于融合前构象的RSV F蛋白质可以含有与在天然RSV病毒粒子上表达的RSV F蛋白质上相同的表位，因此可以提供用于引起保护性中和抗体的优点。RSV疫苗研发关键点是候选疫苗是否存在增强型呼吸道疾病(ERD)效应。福尔马林灭活疫苗引起ERD效应的原因是灭活疫苗刺激RSV血清阴性受试者产生了大量非中和抗体，这些非中和抗体和RSV病毒形成抗体病毒复合物，大量的抗体病毒复合物在受试者肺部聚集，引发强烈的Th2偏向的CD4+T细胞免疫，引起严重的肺部炎症(ERD效应)，严重的会导致受试者死亡。
在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽在所述第一结构域与所述第三结构域之间引入至少一对非天然半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSVF多肽在所述第二结构域与所述第四结构域之间引入至少一对非天然半胱氨酸之间的二硫键。
在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第65位和第87位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第144位和第370位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第484位和第499位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第482位和第499位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第482位和第502位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第396位和第488位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSVF多肽包括第398位和第485位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第398位和第486位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第148位和第286位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第159位和第290位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第159位和第291位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第158位和第290位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第494位和第399位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第489位和第398位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第489位和第486位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第489位和第485位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第460位和第146位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第149位和第458位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第L61位和第86位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第S62位和第86位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第L61位和第90位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第67位和第83位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第67位和第80位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第62位和第196位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第67位和第207位两个半胱氨酸之间的二硫键。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽包括第61位和第195位两个半胱氨酸之间的二硫键。
在一些实施方式中，所述重组RSV F多肽包括来自野生型的人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV的F1结构域和F2结构域。本公开提及RSV F多肽第“x”位氨基酸旨于指与SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的第“x”位氨基酸相对应的氨基酸。本领域技术人员应理解，人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV的F蛋白的对应氨基酸残基处的突变或取代也能实现类似的效果，能够将F蛋白稳定在融合前构象。
在具体的实施方式中，所述重组RSV F多肽具有如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，且与野生型RSV F蛋白相比，具有如下表1任一项的突变。
表1.
下表2中，示例性示出了本公开的一些突变体的序列。
表2.
F蛋白突变位点 SEQ ID NO:
K65C,K87C 10
K65C,K87C,V144C,M370C 11
K65C,K87C,K508C,S509C 12
K65C,K87C,L512C,L513C 13
K65C,K87C,V144C,M370C,A74F 14
K65C,K87C,V144C,M370C,A74Y 15
K65C,K87C,V144C,M370C,N67L,I79L,V207I 16
N67A,K87V,V144C,M370C 17
N67A,A74Y,K87V,V144C,M370C 18
N67V,A74Y,K87V,V144C,M370C 19
N67V,A74Y,K80V,K87V,V144C,M370C 20
N67V,A74Y,K80L,K87V,V144C,M370C 21
本领域技术人员理解，野生型RSV-F蛋白可来自于多种RSV分离株，并且各种分离株的F蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。本领域技术人员还应理解，尽管可能存在着序列差异，但是RSV的不同分离株(不同型别，不同种属)的F蛋白在氨基酸序列上具有极高的序列同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本文中，术语野生型“RSV-F蛋白”不仅包括SEQ ID NO：22所示的蛋白，而且应包括各种RSV分离株的F蛋白，例如来源人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV的各种RSV分离株的F蛋白。并且，当描述野生型RSV-F蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO:22的序列片段，还包括各种RSV分离株的F蛋白中的相应序列片段。例如，表述野生型RSV-F蛋白的第80位氨基酸残基”包括SEQ ID NO:22的第80位氨基酸残基，以及各种RSV分离株的F蛋白中的相应片段。
示例性的人类RSV亚型A的序列如下表3所示的Genbank或GASA的登录号。
表3.
示例性的人类RSV亚型B的序列如下表4所示的Genbank或GASA的登录号。
表4.
示例性的牛RSV F蛋白的序列如Uniport数据库示出的那些，例如Uniport登录号P29791、P22167、P23728、Q9YS24、C3UPB4等。
在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽还包括通过一个或多个氨基酸突变或取代，引入二硫键、离子键或疏水相互作用，以阻止F多肽的构象发生重排，从而稳定在融合前构象。
本公开的重组RSV F多肽的融合前构象是稳定的，在加工(例如纯化、冻融循环和/或存储等)过程中，不容易发生构象上的变化，即不会变成融合后构象。
在一些实施方式中，所述重组RSV F多肽包括连接子序列，该连接子序列包括1～10个氨基酸，连接F1结构域和F2结构域。
本公开提供了一种编码本公开的重组RSV F多肽的核酸分子。
在优选的实施方式中，对编码本公开的重组RSV F多肽的核酸分子进行密码子优化，以在哺乳动物细胞、优选在人类细胞中表达。密码子优化的方法是本领域技术人员公知的。经密码子优化的核酸分子一般可得到更高的表达量。
本领域技术人员应理解，由于遗传密码子的简并性，会存在能编码相同多肽的许多不同的核酸分子。本领域技术人员还应理解，可以使用常规的技术进行核苷酸取代，这些取代不影响由这些核酸分子编码的多肽序列。因此，除非另有说明，否则“编码一种氨基酸序列的一种核酸分子(或核苷酸序列)”包括彼此呈简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核酸分子(或核苷酸序列)。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包含或可以不包含内含子。
本公开还提供了一种包括上述核酸分子的载体。这些载体可以通过本领域技术人员公知的方法进行操作，并且可以设计成能在原核和/或真核细胞中进行复制。在一些实施方式中，载体可以转染进入真核细胞，并完全或部分地整合到这些真核细胞的基因组中，产生稳定表达其编码多肽的宿主细胞。所用的载体可以是适用于克隆DNA或者核酸转录的任何载体。适用于本公开的载体可以包括，但并不限于腺病毒载体(例如Ad26或Ad35)、α病毒、副黏液病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒载体等。
本公开的重组RSV F多肽、核酸分子或载体可用于预防和/或治疗受试者中的RSV感染。在一些实施方式中，所述受试者可以是易被RSV感染的群体，例如老年人(如≥50岁、≥60岁以及优选地≥65岁)，幼童(例如≤5岁、≤1岁)，就医患者，以及已经用其他抗病毒药物治疗但抗病毒反应不足的患者。
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
定义
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
本文中，F1结构域的片段是指截短形式的F1结构域。也就是说，截短形式的F1结构域是指非全长的F1结构域，在N-末端或C-末端可以缺失一个或多个氨基酸残基。这也适用于F2结构域的片段。
本文中提及的氨基酸通常指20种遗传编码的常规氨基酸，其缩写按照本领域已知的规则使用。遗传编码氨基酸通常分为以下家族：(1)酸性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；且(4)不带电荷的极性氨基酸是甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。氨基酸的其他家族包括(i)丝氨酸和苏氨酸，其为脂肪族羟基家族；(ii)天冬酰胺和谷氨酰胺，其为含有酰胺的家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，其为脂肪族的家族；和(iv)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其为芳香族的家族。
本文所用的术语“连接子”指天然和/或合成来源的(肽)接头，由线性氨基酸组成。连接子序列能够确保其所连接的不同结构域(例如F1结构域和F2结构域)正确折叠并合适地呈现，从而发挥其生物学活性的功能。在不同的实施方式中，连接子具有柔性构象。合适的柔性连接子包括，例如具有甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基。在一些实施方式中，所述连接子可以选自(GnS)m、(G)n、(EAAAK)n或(XP)n，其中n和m各自独立地选自0～5的整数。例如，n选自0、1、2、3、4或5，m选自1、2、3、4或5。在一些实施方式中，所述连接子还可以包括，例如GSGSGR(SEQ ID NO:2)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:3)、EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO:4)、(Gly)8(SEQ ID NO:5)，GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:6)等。
在本文中，两个多核苷酸或多肽序列之间的“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指在考虑到了为了两个序列的最佳比对而必须引入的添加或缺失(即，空位)的情况下，比较窗口内序列所共有的相同匹配位置的数量。匹配位置是其中在靶序列和参考序列中都存在相同核苷酸或氨基酸的任何位置。由于空位不是核苷酸或氨基酸，所以靶序列中存在的空位不计在内。同样，由于计入靶序列核苷酸或氨基酸，而不计来自参考序列的核苷酸或氨基酸，所以不计参考序列中存在的空位。
可以通过以下过程来计算序列同一性百分比：确定其中两个序列中都出现相同氨基酸残基或核酸碱基的位置数，以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，得到序列同一性百分比。序列的比较和两个序列之间序列同一性百分比的确定可使用易用于在线使用和下载的软件来完成。合适的软件程序可从各种来源获得，用于蛋白质和核苷酸序列的比对。确定序列同一性百分比的一个合适的程序是bl2seq，其为可从美国政府的国家生物技术信息中心BLAST网站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)上获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其它合适的程序是，例如，Needle、Stretcher、Water或Matcher、生物信息学程序的EMBOSS套件的一部分，并且也可在www.ebi.ac.uk/Tools/psa上从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得。本文中提及第一核酸或氨基酸序列与第二核酸或氨基酸序列具有至少85％序列同一性时，指该第一核酸或氨基酸序列与该第二核酸或氨基酸序列可以具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
本文所用的术语“佐剂”指用于增强抗原性的媒介物。佐剂在本领域中已知可进一步提高所施加的抗原决定簇的免疫反应。在本文中，佐剂可用于增强本公开的重组RSV F多肽的免疫反应。适合的佐剂的实例包括，但并不限于，吸附有抗原的矿物(明矾、铝佐剂或磷酸盐)的悬浮液；或油包水乳液，例如，其中抗原溶液在矿物油(弗氏不完全佐剂)中乳化，有时包括有杀灭的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性，例如抑制抗原的降解和/或造成巨噬细胞流入。免疫刺激性寡核苷酸，例如CpG基序也可以用作佐剂。佐剂还可以包括生物分子(也称为“生物佐剂”)，例如共刺激分子。示例性佐剂包括，但不限于皂苷、AS01B、AS01E、IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L、4-1BBL和toll样受体(TLR)激动剂。佐剂是本领域技术人员熟知的，可以与本公开的重组RSV F多肽组合使用。
“CpG基序”或“CpG寡核苷酸”和类似术语是指含有未甲基化的CpG部分，长度为6-50个核苷酸的核苷酸分子。在本公开的实施方式中，CpG基序指任何其他本领域可接受的对该术语的定义。CpG基序包括使用任何合成的核苷间键、修饰的碱基和/或修饰的糖的修饰的寡核苷酸。
本文所用的术语“施用”或“给药”指通过所选途径将本公开的重组RSV F多肽或含该重组RSV F多肽的组合物引入受试者中。施用可以是局部或全身的。非限制性的实例可以包括例如皮内、皮下、肌肉内、经皮或粘膜(例如鼻内)或经口施用。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽或组合物可以通过肌肉内注射来给药。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽或组合物可以通过静脉内注射来给药。
本公开的重组RSV F多肽或其编码核酸分子可以与例如聚合物、脂质体、病毒载体、病毒样颗粒、纳米颗粒组合来施用。在示例性的实施方式中，本公开的重组RSV F多肽可以在有或没有佐剂的存在下，被封装在脂质体、病毒样颗粒或纳米颗粒内进行施用。
本文所用的术语“受试者”包括例如哺乳动物。哺乳动物包括人类或者非人哺乳动物。在一些实施方式中，非人哺乳动物可以包括，例如非人灵长类动物、、猫、犬、牛、马、猪、绵羊、山羊、小鼠、兔、大鼠、沙鼠、豚鼠、天竺鼠等。
本文所用的术语“预防”是指部分或完全延迟疾病(例如RSV)、病症和/或疾患的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟从特定疾病、病症和/或疾患的进展；和/或降低发展与疾病、病症和/或疾患相关的病理的风险。
本文所用的术语“治疗”是指例如疾病或疾患(例如RSV)的严重程度的降低；病程持续时间的缩短；与疾病或疾患相关的一种或多种症状的改善或消除；向患有疾病或疾患的受试者提供有益作用，但不一定治愈所述疾病或疾患。所述术语还包括疾病或疾患或其症状的防治或预防。
本文所用的术语“抗RSV药剂”指特异性抑制RSV复制或感染细胞的药剂。抗RSV药剂的非限制性实例包括单克隆抗体帕利珠单抗，和小分子抗病毒药物例如利巴韦林(ribavirin)。
本文所用的抗体D25、MEDI8897和AM14是特异性结合于RSV F蛋白的融合前构象而非RSV F蛋白的融合后构象的中和单克隆抗体。抗体D25、MEDI8897和AM14均是已知的其氨基酸序列已分别阐述于美国专利申请公开No.2010/0239593、Joseph B Domachowske等(Safety,Tolerability and Pharmacokinetics of MEDI8897,an Extended Half-lifeSingle-dose Respiratory Syncytial Virus Prefusion F-targeting MonoclonalAntibody Administered as a Single Dose to Healthy Preterm Infants,PediatrInfect Dis J,.2018Sep；37(9):886-892)和Wayne Harshbarger等人(Improved epitoperesolution of the prefusion trimer-specific antibody AM14bound to the RSV Fglycoprotein,MABS,2021,Vol.13,No.1,e1955812)中，其以全文引用的方式并入本文中。
本文所用的Moderna mRNA-1345指的是Moderna公司制备的基于DS-CAV1优化的Pre-F RSV mRNA疫苗，其制备方法阐述于WO 2021/155243 A1。
本文的重组RSV F多肽可以通过蛋白的三级折叠，由连续或不连续的氨基酸形成抗原表位，该抗原表位构成独特的空间构象，能够被特异性识别RSV F蛋白融合前构象的抗体(例如D25、MEDI8897或AM14)识别。
本文所用的术语“三聚化结构域“是指能够形成三聚体结构的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述三聚化结构域可以是折叠子结构域(例如，T4 folden)。在一些实施方式中，本公开的重组RSV F多肽或重组蛋白能够通过三聚化结构域折叠成特定的三维结构，并且形成特定的抗原表位。
本文所用的术语“免疫反应”指：免疫系统的细胞如B细胞、T细胞或单核细胞对刺激物的反应。在一些实施方式中，所述反应对特定抗原具特异性(“抗原特异性反应”)。在一些实施方式中，免疫反应是T细胞反应，例如CD4+反应或CD8+反应。在一些实施方式中，所述反应是B细胞反应，并导致特异性抗体的产生。在一些实施方式中，“Th1”(偏向性)免疫反应的特征在于存在分泌IL-2和IFN-γ的CD4+T辅助细胞。相比之下，“Th2”(偏向性)免疫反应的特征在于产生IL-4、IL-5和IL-13的CD4+辅助细胞占优势。
本文所使用的术语“有效量”是指足以产生所需反应，例如针对RSV F蛋白的免疫反应，或减少或消除病状或疾病如RSV感染的征象或症状的药剂(如本公开的重组F抗原或其编码核酸分子或其他药剂)的量。例如，“有效量”可能是抑制病毒复制或可测量地改变病毒感染的外在症状所需的量。一般来说，这种量将足以可测量地抑制病毒(例如，RSV)复制或感染性。当施用至受试者时，通常将使用将达到目标组织浓度(例如，在呼吸组织中)的剂量，其已证明实现病毒复制的体外抑制。在一些实例中，“有效量”是预防或治疗任何病症或疾病的一种或多种症状和/或潜在病因，例如治疗RSV感染的量。
本文所用的表述“抑制”或“治疗”是指例如，在处于疾病(例如RSV感染)的风险下的受试者中，抑制疾病或病状的充分发展。“治疗”是指改善疾病或病理状况在其已开始发展后的征象或症状的治疗干预。关于疾病或病理状况的术语“改善”是指任何可观测的有益治疗作用。有益作用可例如由以下证实：易感受试者中的疾病的临床症状的延迟发作，疾病的一些或所有临床症状的严重程度的降低，疾病的较缓慢进展，受试者的总体健康或健康状况的改善，或本领域中众所周知的对特定疾病具特异性的其他参数。“预防性”治疗是出于降低患上病变的风险而向未展现疾病征象或仅展现早期征象的受试者施用的治疗。
在本文中，抗体是指在自然界中基本上由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽，其特异性结合并识别分析物(例如抗原或免疫原)，例如RSV F蛋白或其抗原片段。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、6、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。如本文所用的术语“抗体”包括例如通过完整抗体的修饰和通过使用重组DNA方法的从头合成产生的抗体片段。抗体例如以完整免疫球蛋白形式和以多种充分表征的抗体片段形式存在。例如，结合于RSV F蛋白的Fab、Fv和单链Fv(scFv)将是RSV F蛋白特异性结合剂。本文提及抗体时，包括完整免疫球蛋白和本领域中众所周知的变体和其片段，例如Fab′片段、F(ab)′2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫键稳定化Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是其中免疫球蛋白的轻链可变区与免疫球蛋白的重链可变区由连接子结合的融合蛋白，而在dsFv中，所述链已经突变以引入二硫键来稳定化链的缔合。所述术语还包括遗传工程改造形式如嵌合抗体(例如人源化鼠类抗体)或异源结合抗体(例如双特异性抗体)。抗体可以为IgM、IgD、IgG、IgA或IgE型。
本文所用的术语“药学上可接受的载剂”，其性质取决于免疫原性组合物的施用方式。例如，肠胃外组合物通常包括可注射溶液，其中药学上可接受的载剂可以例如为水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖溶液、甘油等载剂。对于固体组合物，例如散剂、丸剂、片剂或胶囊，药学上可接受的载剂可以例如为甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。在特定的实施方式中，适于施用至受试者的载剂可为无菌的和/或悬浮，或以其他方式包含在含有一个或多个适于诱导抗RSV免疫反应的单位剂型中。单位剂型可以例如在具有无菌内含物的密封小瓶中或用于注射至受试者的注射器中，或者冻干以供后续溶解和施用。
本文所用的术语“病毒样颗粒(VLP)”指源自病毒的非复制性病毒外壳。VLP通常由一种或多种病毒蛋白组成，包括但不限于衣壳、包衣、外壳、表面和/或胞膜蛋白。在适当的表达系统中重组表达后，VLP可以自发形成。本文的重组RSV F多肽可以被展示VLP的表面上，可用于诱导针对RSV的免疫反应。VLP及其制备方法是本领域公知的。例如，VLP可以来源于人类乳头状瘤病毒、HIV、Semliki-Forest病毒、人类多瘤病毒、轮状病毒、细小病毒、犬细小病毒、戊型肝炎病毒和新城疫病毒等。这些VLP的形成可以通过任何合适的技术(例如电子显微镜技术，动态光散射(DLS)，选择性色谱分离如离子交换，疏水性相互作用和/或尺排阻色谱分离，和密度梯度离心)来检测。
本文所用的术语“纳米颗粒”可以是蛋白纳米颗粒。蛋白纳米颗粒的非限制性实例包括铁蛋白纳米颗粒、封装素纳米颗粒、硫氧化还原酶(SOR)等纳米颗粒。构成蛋白纳米颗粒的多肽亚基可以与本公开的重组RSV F多肽融合在一起形成融合蛋白，在适当条件下自组装成纳米颗粒，将本公开的重组RSV F多肽展示在纳米颗粒表面或包装在纳米颗粒内部。
本领域技术人员应理解，表位可由通过蛋白质的三级折叠并置的连续氨基酸或不连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常保持暴露于变性溶剂，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常失去。表位在独特的空间构象中通常包括至少3个并且更通常至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。测定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学和核磁共振。表位也可包括氨基酸的翻译后修饰，例如N连接的糖基化。
本文提及的来自人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV的F蛋白及其编码核酸是本领域已知的。本领域技术人员应理解，虽然本文的氨基酸突变位点是基于人类RSV亚型A的F蛋白(例如如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列)，但是来自其他人类RSV亚型A(例如表3所示的人类RSV亚型A的序列)、人类RSV亚型B(例如表4所示的人类RSV亚型B的序列)或牛RSV(如Uniport数据库示出的那些，例如Uniport登录号P29791、P22167、P23728、Q9YS24、C3UPB4等)的F蛋白的对应的氨基酸位点的突变也能实现类似的效果，使得得到的重组F蛋白能够保持在融合前构象。基于RSV的F蛋白序列的保守性，本领域技术人员能够容易地获得不同来源的RSV的F蛋白的对应的氨基酸位点。
下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。实施例中使用的试剂可以通过常规方式配制或者商购获得。实施例中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的细胞生物学、生物化学、分子生物学等各个领域的常规技术。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
实施例
实施例1.RSV野生型F蛋白的制备
本实施例选择A亚型RSV病毒的F蛋白(SEQ ID NO:22)为例，将该F蛋白作为基础进行如下操作。使用F蛋白的胞外可溶性区域aa 1～513(SEQ ID NO:1)或者aa1～526(SEQ IDNO:22)做为抗原，并将F蛋白的aa 109～136区域替换成连接子GSGSGR(SEQ ID NO:2)，得到单链重组F蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:8(对应于aa 1～513)或SEQ ID NO:23(对应于aa 1～526)。同时，为了稳定胞外三聚体状态，在其C端添加了天然的三聚体结构域纤维蛋白结构域T4 foldon(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL，SEQ ID NO:7)。为了后续检测和纯化，在T4-foldon后面添加了Strep-II标签，最终得到重组F-T4-Strep蛋白(SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:24)。
实施例2.RSV F突变体的设计和构象筛选
本实施例通过对比Pre-F和Post-F蛋白的结构，根据二者在结构上的差别将F蛋白分为不变区、上可变区、下可变区三个部分。为了将F蛋白稳定在Pre-F的构象，分别在不变区与上可变区、不变区与下可变区之间的一些氨基酸对和特定氨基酸中引入了突变。
突变体初筛：设计定点突变引物，将设计好的突变位点引入RSV F基因，进行突变链合成反应，凝胶电泳回收目的片段。用限制性核酸内切酶HindIII和NotI双酶切pCDNA3.4载体，凝胶电泳回收载体片段，将RSV F蛋白突变体的回收片段连接到pCDNA3.4载体中，获得RSV F蛋白突变体表达载体。将RSV F蛋白突变体表达载体转染到50mL HEK 293F细胞中，培养5天后离心得到上清液。用上清液分别与D25、AM14、MEDI8897三种Pre-F特异性抗体进行ELISA检测。用D25、AM14、MEDI8897抗体作为包被抗体，Anti-StrepⅡ抗体作为检测抗体，羊抗小鼠-HRP作为酶标抗体。抗体D25、AM14、MEDI8897稀释到1μg/mL，100μL/孔在2～8℃过夜包被。细胞上清液100μL/孔加样室温孵育30min，弃去细胞上清液PBS洗涤酶标板，分别加入Anti-StrepⅡ抗体、羊抗小鼠-HRP抗体后，酶标仪读取酶标板450nm波长紫外吸收值。表5中示出了ELISA检测呈阳性的结果。采用已知稳定在融合前构象的F蛋白DS-Cav1(MichelleC Crank等人，Aproof of concept for structure-based vaccine design targetingRSV in humans，Science，2019Aug 2；365(6452):505-509)作为阳性对照。
表5.F蛋白突变体的293细胞上清液ELISA检测结果
注：ND:未检测；NA：未检出
表5中的突变体M123～M130是采用SEQ ID NO:23(对应于aa 1～526)为基础获得的突变体，其他突变体采用了SEQ ID NO:8(对应于aa 1～513)进行了突变。
表5结果显示，与野生型F蛋白相比，展示出的突变体均能与D25、AM14、MEDI8897三种抗体产生结合，表明这些突变体处于融合前构象。
突变体二次筛选：选取了M43、M60、M61、M62、M63、M64、M66、M75、M103、M105、M109、M110、M111、M112、M114、M119、M120、M128、M133、M142、M143、M146、M147、M149、M150和M152突变体进行扩大表达并纯化，将蛋白定量后用等量蛋白再与D25、AM14、MEDI8897三种抗体进行ELISA检测。将1mgRSV F蛋白突变体质粒转染到1L HEK 293F细胞中，培养5天后离心得到上清液。将上清液，用Strep亲和层析树脂(Strep-XT德国IBA公司)纯化，将亲和层析得到的蛋白洗脱液用分子筛层析(HiLoad supeMdex 200pg)进行二次纯化，得到F蛋白突变体(为三聚体形式)的蛋白纯化溶液。图2示例性示出了突变体M114的分子筛层析纯化结果。
用8μg F蛋白突变体分别与D25、AM14、MEDI8897三种抗体进行ELISA检测，表6为8μg M43、M60、M61、M62、M63、M64、M66、M75、M103、M105、M109、M110、M111、M112、M114、M119、M120、M128、M133、M142、M143、M146、M147、M149、M150和M152突变体分别与D25、AM14、MEDI8897三种抗体ELISA检测结果。DS-CAV1和野生型(WT)F蛋白分别作为阳性对照和阴性对照。
表6.纯化后F蛋白突变体与D25、AM14、MEDI8897三种抗体ELISA检测结果
表6显示，M43、M60、M61、M62、M63、M64、M66、M75、M103、M105、M109、M110、M111、M112、M114、M119、M120、M128、M133、M142、M143、M146、M147、M149、M150、M152突变体均表现出与三种Pre-F抗体显著的结合能力，与阳性对照DS-CAV1无显著差异。
实施例3.RSV F蛋白突变体的蛋白稳定性检测
本实施例使用了UNCLE分子表征仪器(Unchained Labs)，示例性地对突变体M43、M60、M61、M62、M63、M64、M66、M75、M103、M105、M109、M110、M111、M112、M114、M119、M120、M128、M133、M142、M143、M146、M147、M149、M150、M152进行了Tm值检测，以考察各个突变体的稳定性。分别取9μL(1mg/mL)纯化的突变体样品在UNCLE设备上进行检测，温度区间设定为25～95℃，每一样品设置一个复孔。图3为本实施例提供的各突变体Tm值检测结果。UNcle检测结果显示各突变体Tm值都大于55℃，与DS-CAV1Tm值无显著差异，均具有较好的热稳定性，适合作为疫苗抗原。突变体M111的UNcle检测结果显示其Tm值大于55℃，与DS-CAV1 Tm值无显著差异，具有较好的热稳定性，适合作为疫苗抗原。
实施例4.加速热稳定性研究
本实施例使用了热加速法，示例性地对一些突变体的热稳定性进行更深入的评价。分别取100μL(5μg)纯化的突变体样品，分别在50℃、60℃下处理1h，用Elisa法检测热处理后的突变体样品与AM14和D25抗体(Pre-F特异性抗体)的结合能力。以DS-CAV1 F蛋白作为阳性对照。图4为突变体M43、M60、M61、M62、M63、M64、M66、M75、M103、M105、M109、M110、M112、M114、M119、M120、M128、M133、M142、M143、M146、M147、M149、M150、M152在50℃处理1h，分别与AM14和D25抗体Elisa检测结果。图5为突变体M43、M60、M61、M62、M63、M64、M66、M75、M103、M105、M109、M110、M112、M114、M119、M120、M128、M133、M142、M143、M146、M147、M149、M150、M152在60℃处理1h，分别与AM14和D25抗体Elisa检测结果。结果显示各突变体经50℃处理1h后与AM14、D25抗体结合能力略高于60℃处理1h，无论50℃处理1h和60℃处理1h，各突变体与AM14、D25抗体结合能力均与阳性对照DS-CAV1无显著差别。
综上所述各突变体的Tm均大于55℃，显示出良好的稳定性。热加速研究结果均与阳性对照DS-CAV1无显著差别。对突变体M111的热加速研究结果与阳性对照DS-CAV1也无显著差别。说明各突变体经高温处理后仍能部分维持在Pre-F构象，符合设计预期，符合疫苗生产要求。
实施例5.RSV F蛋白突变体表达量的检测
本实施例示例性地检测了突变体M43、M60、M61、M62、M63、M64、M66、M75、M103、M105、M109、M110、M111、M112、M114、M119、M120、M128、M133、M142、M143、M146、M147、M149、M150、M152的表达量。将1mg含F蛋白突变体编码序列的载体转染到1L HEK 293F细胞中进行表达，然后按照实施例2的方法进行层析纯化。并通过nanodrop仪器检测了各突变体的表达量，图6为突变体M43、M60、M61、M62、M63、M64、M66、M75、M103、M105、M109、M110、M112、M114、M119、M120、M128、M133、M142、M143、M146、M147、M149、M150、M152的表达量的检测结果。结果显示各突变体的表达量差异较大但都高于2mg/ml，部分突变体的表达量将近10mg/ml。突变体M111的表达量也高于2mg/mL。本发明实施例提供的表达量检测结果均基于瞬转细胞表达量检测结果，用于大规模生产用的稳转细胞系表达量预计能达到现有表达量的十倍。因此本实施例展示的突变体表达量均符合工业生产要求，可以用于疫苗生产。
实施例6.RSV F蛋白突变体的蛋白构象的确认
本实施例使用负染电镜，对突变体M43、M60、M61、M62、M63、M64、M66、M75、M103、M105、M109、M110、M111、M112、M114、M119、M120、M128、M133、M142、M143、M146、M147、M149、M150、M152的构象进行了确认。将400目微栅铜网做亲水化处理，取4μL蛋白样品置于铜网上静置1min，用滤纸置于铜网边缘将蛋白样品吸走，将4μL 5％醋酸铀置于铜网上静置1min，用滤纸置于铜网边缘将醋酸铀吸走，再将4μL 5％醋酸铀置于铜网上静置1min，用滤纸置于铜网边缘将醋酸铀吸走，静置1min让醋酸铀自然风干。最后将铜网置于负染电镜样品台上，对蛋白样品进行观察，图7中为所检测的上述突变体的负染电镜照片。
图7的负染电镜照片显示，这些突变体均呈椭圆形的Pre构象，明显区别于Post F的长条状结构。同时，为了进一步看清这些突变体蛋白的形状细节，又对这些负染照片中的蛋白颗粒做了2D分类分析，分析结果(未示出)也可以看出，蛋白颗粒特征形状为“椭圆形”和“逗号”，符合Pre-F构象的结构特征。突变体M111的负染电镜照片及其2D分类分析表明，M111也符合Pre-F构象的结构特征。也进一步说明这些突变体能够稳定F蛋白在融合前构象上。
实施例7.RSV F蛋白突变体重组蛋白与不同佐剂混合的免疫原性的检测
本实施例检测了F蛋白突变体M43、M60、M61、M62、M63、M64、M66、M75、M103、M105、M109、M110、M111、M112、M114、M119、M120、M128、M133、M142、M143、M146、M147、M149、M150、M152的免疫原性。用BALB/c小鼠，随机分成78组，每组5只。每三组小鼠组成一个大组。给每个大组中的三组小鼠分别注射6μg纯化的突变体蛋白、6μg纯化的突变体蛋白含铝佐剂、6μg纯化的突变体蛋白含AS01E佐剂。用DS-CAV1和PBS分别作为阳性对照和阴性对照组，阳性对照组免疫方式和突变体蛋白组相同。分别在第0、14天进行2次免疫，第28天处死小鼠，取小鼠血清。将血清与携带荧光素酶报告基因的RSV病毒亚型A(Bouillier C等.Generation,Amplification,and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses.JVis Exp.2019Apr 4；(146))中和后，感染293T细胞。然后用Bio-Lite荧光素酶检测试剂(Vazyme)，评定血清中的中和抗体水平。
图8为上述F蛋白突变体的小鼠血清中和抗体滴度。结果显示，对于小鼠而言使用AS01E佐剂的蛋白疫苗能诱导小鼠产生更高水平的中和抗体，其次为铝佐剂疫苗组，无佐剂组蛋白疫苗诱导小鼠血清中和抗体能力较弱。无论是AS01E佐剂疫苗组、铝佐剂疫苗组还是无佐剂疫苗组，各突变体疫苗诱导小鼠血清中和抗体的能力与DS-CVA1阳性对照组无显著差别，个别突变体疫苗组中和抗体水平还略优于阳性对照组。针对M111突变体，佐剂疫苗组、铝佐剂疫苗组还是无佐剂疫苗组，诱导小鼠血清中和抗体的能力与DS-CVA1阳性对照组无显著差别，AS01E佐剂的蛋白疫苗能诱导小鼠产生更高水平的中和抗体，其次为铝佐剂疫苗组，无佐剂组蛋白疫苗诱导小鼠血清中和抗体能力较弱。
实施例8.mRNA疫苗制备及中和抗体效价评定
1)F蛋白突变体M43、M60、M61、M62、M63、M64、M66、M75、M103、M105、
M109、M110、M111、M112、M114、M119、M120、M128、M133、M142、M143、
M146、M147、M149、M150、M152的核酸序列经密码子优化后构建到pcDNA3.1载体上。
2)构建好的载体转化到Top10感受态细胞中，37℃培养12-16h，离心收集菌体。
3)收集到的菌体用天根无内毒素质粒大提试剂盒(型号：DP117)提取大肠杆菌中的质粒DNA。质粒DNA纯度和超螺旋比例经琼脂糖电泳鉴定。
4)质粒线性化：将符合要求的质粒，按照2U/1μg的比例加入BsaI限制性内切酶，在37℃恒温条件下孵育3hr，即可得到符合要求的DNA转录模板，取样送检琼脂糖凝胶电泳。
5)线性化质粒磁珠纯化：用DNA分选磁珠(HieffDNA Selection Beads)对线性化质粒进行纯化。
6)mRNA体外转录：向反应体系中加入T7 RNA聚合酶(终浓度5U/μl)、焦磷酸酶(终浓度0.005U/μl)、RNase抑制剂(终浓度4U/μl)、四种核苷酸碱基(终浓度25mmol/L)、线性化模板质粒(终浓度0.25μg/μl)、帽类似物m7GpppAmG(终浓度30mmol/L)
均匀混合，37℃孵育3hr，而后在反应液中加入DNaseI(终浓度5U/μg)37℃孵育30min消化DNA转录模板，即可得到转录反应液。
7)mRNA纯化：用DNA分选磁珠(HieffDNA Selection Beads)对体外反转录得到的mRNA进行纯化。
8)mRNA-LNP制备：LNP配方与Moderna mRNA-1345一致。mRNA稀释在pH 4.0不含RNase的50mM柠檬酸盐缓冲液中。分别用注射器吸取水相和油相，使用纳米药物快速制备系统制备mRNA-LNP，以总流速12mL/min的混合速率将水相溶液和乙醇溶液以3：1的体积比混合。将制备的mRNA-LNP转移至分子截流量为10K的透析卡中，在10mM Tris-HCl缓冲液中透析过夜。透析后得到的mRNA-LNP保存于-80℃超低温冰箱中。
9)用BALB/c小鼠，随机分成29组，每组10只。给每组中的小鼠注射5ug实施例6中制备的突变体F蛋白的mRNA疫苗。用mRNA-1345(WO 2021/155243 A1)和福尔马林灭活疫苗作为阳性对照，用PBS作为阴性对照组。分别在第0、14天进行2次免疫，第28天处死小鼠，取小鼠血清，按照实施例7的方法检测血清对RSV病毒亚型A的中和抗体水平。图9为经各F蛋白突变体mRNA疫苗免疫后的小鼠血清中和抗体滴度。
图9显示：阳性对照组和各突变体蛋白mRNA疫苗均能诱导小鼠产生高水平中和抗体，且无显著差异，部分突变体蛋白mRNA疫苗中和抗体水平高于阳性对照组。mRNA1345和各突变体蛋白mRNA疫苗组中和抗体水平都显著高于福尔马林灭活疫苗组。M111突变体蛋白mRNA疫苗能诱导小鼠产生高水平中和抗体，且其他突变体无显著差异。
实施例9.mRNA疫苗ERD效应评价(细胞因子检测)
疫苗能否引发Th2偏向的CT4细胞免疫是判断疫苗是否有ERD风险的重要指标。本实施例选择IFN-γ作为Th1细胞免疫标志物，IL4作为Th2细胞免疫标志物。用这两种细胞因子相对比例判断候选疫苗是否有ERD风险。
用BALB/c小鼠，随机分成29组，每组5只。给每组中的小鼠注射5μg实施例8中制备的突变体F蛋白的mRNA疫苗。用mRNA-1345和福尔马林灭活RSV疫苗(F1-RSV)作为阳性对照，用PBS作为阴性对照组。分别在第0、14天进行2次免疫，第33天处死小鼠，取小鼠脾脏。采用流式细胞仪筛选法，利用抗IFN-γ抗体(Biolegend)和抗IL4抗体(Biolegend)检测IFN-γ、IL4细胞因子，结果示于图10和图11中。
图10、图11为经各F蛋白突变体M43、M60、M61、M62、M63、M64、M66、M75、M103、M105、M109、M110、M112、M114、M119、M120、M128、M133、M142、M143、M146、M147、M149、M150、M152的mRNA疫苗免疫的小鼠脾细胞IFN-γ、IL4细胞因子检测结果。细胞因子检测结果显示，福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)的Th2细胞因子水平(IL4)显著高于Th1细胞因子水平(IFN-γ)，说明福尔马林灭活疫苗容易引发小鼠产生Th2偏向的CT4细胞免疫，有ERD风险，与临床试验结果吻合。各突变体mRNA疫苗组和阳性对照组都是Th1细胞因子水平(IFN-γ)显著高于Th2细胞因子水平(IL4)，能引发小鼠产生Th1偏向的细胞免疫，而且都能诱导小鼠产生高水平中和抗体，发生ERD的风险较小。M111突变体mRNA疫苗组，Th1细胞因子水平(IFN-γ)也显著高于Th2细胞因子水平(IL4)，能引发小鼠产生Th1偏向的细胞免疫，能诱导小鼠产生高水平中和抗体，发生ERD的风险较小。
实施例10.mRNA疫苗攻毒保护研究
本实施例检测了各突变体mRNA疫苗对小鼠攻毒保护效果的研究。用BALB/c小鼠，随机分成29组，每组5只。给每组中的小鼠注射5μg实施例8中制备的突变体F蛋白M43、M60、M61、M62、M63、M64、M66、M75、M103、M105、M109、M110、M112、M114、M119、M120、M128、M133、M142、M143、M146、M147、M149、M150、M152的mRNA疫苗。用mRNA1345和福尔马林灭活疫苗别作为阳性对照，PBS为不打疫苗直接攻毒组。分别在第0、14天进行2次免疫，第28天对小鼠用1×106pfu RSV A2活病毒进行攻毒挑战，第33天处死小鼠，检测小鼠肺部病毒载量。
小鼠肺部病毒载量利用RT-qPCR方法检测小鼠肺部组织匀浆中RSV病毒的N蛋白基因含量。小鼠肺部匀浆用RNA提取试剂盒(TIANGEN公司)提取RNA，用Takara公司反转录试剂盒对提取得到的RNA进行反转录。将反转录得到的cDNA用以下引物对进行qPCR定量检测：
RSVA-N-F：AGATCAACTTCTGTCATCCAGCAA(SEQ ID NO:25)；
RSVA-N-R：TTCTGCACATCATAATTAGGAGTATCAAT(SEQ ID NO:26)。
同时对小鼠肺部组织做病理切片观察，进行肺部病理评分。RSV攻毒后第4天，取3只小鼠全肺，4％多聚甲醛浸泡，石蜡包埋切片。组织切片采用苏木精和伊红染色进行常规评价。其中0表示无炎症，1表示轻度炎症，2表示轻中度炎症，3表示中度炎症，4表示明显炎症。病理评分采用双盲法即送测人和病理评分人均不知道样品编号或名称。
图12、图13为经各F蛋白突变体mRNA疫苗免疫的小鼠肺部病毒载量和肺部病理评分结果。
小鼠肺部病毒载量检测结果显示，与直接攻毒组(PBS组)相比各突变体mRNA疫苗可以使小鼠肺部病毒载量下降至少1000倍，展示出良好的祛除小鼠肺部病毒的能力，且与mRNA1345疫苗组无显著差异，显著高于福尔马林灭活疫苗组(FI-RSV)。肺部病理评分结果显示福尔马林灭活疫苗组小鼠肺部评分最高，且高于直接攻毒组(PBS组)，说明打了福尔马林灭活疫苗的小鼠肺部炎症比直接攻毒组小鼠肺部炎症还严重，产生了ERD效应。各突变体mRNA疫苗组和mRNA1345疫苗组病理评分几乎相同，显著低于福尔马林灭活疫苗组，低于直接攻毒组，说明各突变体mRNA疫苗和mRNA1345疫苗都对小鼠产生了较好的保护效果并且没有产生ERD效应。与直接攻毒组(PBS组)相比，M111突变体mRNA疫苗可以使小鼠肺部病毒载量下降至少1000倍；且M111突变体mRNA疫苗组和mRNA1345疫苗组病理评分几乎相同，说明M111突变体mRNA疫苗和mRNA1345疫苗都对小鼠产生了较好的保护效果并且没有产生ERD效应。
实施例11.mRNA疫苗棉鼠模型免疫原性和保护性研究(中和抗体、肺部病毒载量)
小鼠对RSV病毒不易感，用小鼠模型研究RSV疫苗的有效性存在一定的局限性。目前普遍认可的RSV动物模型是棉鼠。为此，本实施例使用了棉鼠对各突变体mRNA疫苗的免疫原性和保护性进行了研究，包括棉鼠血清中和抗体和棉鼠肺部病毒载量的检测。棉鼠的免疫方式以及血清中和抗体和肺部病毒载量的检测方法和实施例8及实施例10相同。不同之处在于棉鼠免疫计量为10μg mRNA疫苗和第28天的攻毒计量改为1×105pfu。
图14、图15为本发明提供的F蛋白突变体M43、M60、M61、M62、M63、M64、M66、M75、M103、M105、M109、M110、M112、M114、M119、M120、M128、M133、M142、M143、M146、M147、M149、M150、M152的mRNA疫苗棉鼠血清中和抗体和肺部病毒载量结果。
棉鼠血清中和抗体结果显示阳性对照(mRNA1345)组和各突变体蛋白mRNA疫苗均能诱导棉鼠产生高水平中和抗体，部分突变体蛋白mRNA疫苗中和抗体水平高于阳性对照组。mRNA1345和各突变体蛋白mRNA疫苗组中和抗体水平都显著高于福尔马林灭活疫苗组。
棉鼠肺部病毒载量检测结果显示，与直接攻毒组(PBS组)相比各突变体mRNA疫苗可以使小鼠肺部病毒载量下降至少约1000倍，展示出良好的祛除小鼠肺部病毒的能力，显著低于福尔马林灭活疫苗组(FI-RSV)，与小鼠模型结果相一致。
M111突变体蛋白mRNA疫苗诱导棉鼠产生高水平中和抗体，棉鼠肺部病毒载量检测结果显示，与直接攻毒组(PBS组)相比，M111突变体mRNA疫苗可以使小鼠肺部病毒载量下降至少约1000倍，与小鼠模型结果相一致。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (28)

1.一种重组呼吸道合胞病毒(RSV)F多肽，其特征在于，所述重组RSV F多肽稳定处于融合前构象，且所述重组RSV F多肽包括F1结构域和F2结构域。
2.根据权利要求1所述的重组RSV F多肽，其特征在于，所述重组RSV F多肽通过引入一个或多个非天然存在的疏水性氨基酸、至少一对非天然存在的静电相反的氨基酸、至少一对非天然存在的脯氨酸和/或至少一对非天然半胱氨酸之间的二硫键而稳定处于融合前构象，
优选地，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽在第26、29、30、31、32、33、34、35、55、57、59、61、62、65、67、74、75、79、80、83、86、87、90、137、138、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、155、158、159、172、173、174、178、180、181、182、183、186、187、188、189、190、193、195、196、207、210、211、213、214、217、227、229、241、253、254、256、279、286、290、291、298、302、332、334、337、338、339、340、353、354、355、356、368、370、371、373、394、396、397、398、399、400、404、406、407、427、443、445、449、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、473、474、475、480、482、483、484、485、486、487、488、489、491、494、499、502、505、506、508、509、512、513、515、516、520、522和523位氨基酸位置中的一个或多个位置处具有氨基酸突变，其中所述突变是基于SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列编号的。
3.根据权利要求1所述的重组RSV F多肽，其特征在于，所述重组RSV F多肽包括以下任一项或多项的突变：(1)K80A、K80I、K80L、K80V、K80F、K80W、K80Y、K80M、K80S、K80P或K80C；(2)N183P或N183D；(3)Q210P；(4)S211P；(5)S213P；(6)I214P；和，(7)I506D或I506E。
4.根据权利要求1所述的重组RSV F多肽，其特征在于，所述重组RSV F多肽包括以下任一项或多项的突变：(1)P484C和I499C；(2)V482C和I499C；(3)V482C和S502C；(4)M396C和F488C；(5)S398C和S485C；(6)S398C和D486C；(7)I148C和Y286C；(8)H159C和S290C；(9)H159C和I291C；(10)L158C和S290C；(11)Q494C和K399C；(12)D489C和S398C；(13)D489C和D486C；(14)D489C和S485C；(15)N460C和S146C；(16)A149C和Y458C；(17)I64C和K87C；(18)K65C和K87C；(19)L61C和Y86C；(20)S62C和Y86C；(21)L61C和V90C；(22)N67C和L83C；(23)N67C和K80C；(24)S62C和K196C；(25)N67C和V207C；(26)L61C和L195C；和，(27)V144C和M370C。
5.根据权利要求1所述的重组RSV F多肽，其特征在于，所述重组RSV F多肽包括以下突变：(1)N67A；和，(2)K80A、K80I、K80L、K80V、K80F、K80W、K80Y、K80M、K80S、K80P、K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S或K87P。
6.根据权利要求1所述的重组RSV F多肽，其特征在于，所述重组RSV F多肽包括以下突变：(1)F505H或F505K；和，(2)I506D或I506E。
7.根据权利要求1所述的重组RSV F多肽，其特征在于，所述重组RSV F多肽包括以下任一项或多项的突变：(1)S213P和I214P；(2)Q210P和S211P；(3)S173P和T174P；(4)S182P和N183P；(5)L181P和S182P；和，(6)S173P和T174P。
8.根据权利要求1所述的重组RSV F多肽，其特征在于，所述重组RSV F多肽包括以下突变：(1)N67A；(2)K80A；和，(3)K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S或K87P。
9.根据权利要求1所述的重组RSV F多肽，其特征在于，所述重组RSV F多肽包括K65C和K87C突变，且还包括第26、29、30、31、32、33、34、35、55、57、62、67、74、75、79、80、87、137、138、140、141、142、143、144、145、146、147、149、150、151、155、159、183、188、189、190、195、207、211、217、227、229、241、253、254、256、279、290、291、298、302、332、334、337、338、339、340、353、354、355、356、368、370、371、373、394、396、397、398、400、404、406、407、427、443、445、449、458、459、460、461、462、463、465、466、467、468、469、470、471、473、474、475、480、482、483、485、486、487、488、489、491、502、505、506、508、509、512、513、515、516、520、522、523位中的一个或多个位点处具有氨基酸突变，
优选地，所述重组RSV F多肽包括K65C和K87C突变，且还包括以下任一项或多项的突变：
(1)S62L或S62P，
(2)A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R，
(3)L141R或L141K，
(4)G145I，
(5)S150L，
(6)G151L，
(7)S155I，
(8)S211P，
(9)N254Y，
(10)S290P，
(11)I291E或I291D，
(12)A298K、A298Y、A298I或A298L，
(13)T337W，
(14)G340F或G340Y，
(15)Y458P，
(16)V459P，
(17)N460P，
(18)K461P，
(19)Q462P，
(20)E463P，
(21)V482P，
(22)F483P，
(23)D489F，
(24)S502F、S502W或S502Y，
(25)F505H或F505K；和，I506D或I506E，
(26)L141C、L141R或L141K；和，N371C或L373C，
(27)V144C、G145C或S146C；和，M370C，
(28)L138C；和，Q354C或D338C，
(29)L334C；和，I475C，
(30)F137C；和，T337C、D338C、R339C或P353C，
(31)I57C；和，S190C，
(32)S55C；和，L188C，
(33)H159C；和，I291C、I291E或I291D，
(34)Q34C；和，K470C或G471C，
(35)S35C；和，P473C或I474C，
(36)I332C；和，P480C或F483C，
(37)M396C；和，F488C，
(38)K394C、K394W、K394F、K394Y或K394L；和，S491C，
(39)T397C；和，S485C、D486C或E487C，
(40)F32C；和，Y468C，
(41)E30C或S443C；和，S466C，
(42)Y33C；和，V469C，
(43)E31C；和，L467C，
(44)T29C；和，K465C，
(45)Q26C或K445C；和，E463C或E463P，
(46)T449C；和，Y458C或Y458P，
(47)Q354C或Q354L；和，N371F、N371W、N371Y、N371L或N371C，
(48)G151L；和，Q302L或Q302V，
(49)K75C；和，I217C，
(50)G143C；和，V406C、N371F、N371W、N371Y、N371L或N371C，
(51)G145I或G145C；和，I407C或M370C，
(52)F140C；和，S404C，
(53)A241C；和，Q279C，
(54)T189V；和，A298K、A298Y、A298I、A298L或A298F，
(55)L195C或L195K；和，N227E，
(56)S398C或S398F；和，D489C、D489F或D489L，
(57)L142C；和，P353C、N371F、N371W、N371Y、N371L或N371C，
(58)K508C；和，S509C，
(59)L512C；和，L513C，
(60)A149C；和，Y458C，
(61)V144C；和，N371C，
(62)K394C、K394W、K394F、K394Y或K394L；D489C、D489F或D489L；和，T337W、T337L或T337C，
(63)S150L、S150F、S150W或S150Y；G151L；和，Q302L或Q302V，
(64)S155I或S155V；S290C、S290P、S290V或S290A；和，A298K、A298Y、A298I、A298L或A298F，
(65)N67A、N67C、N67L或N67V；I79L；和，V207C或V207I，
(66)A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K508C；和，S509C，
(67)V144C；M370C；和，A74F、A74W、A74Y、A74K、A74R、K80A、K80I、K80L、K80V、K80F、K80W、K80Y、K80M、K80S、K80P、K80C、I291C、I291E、I291D、S211P、A298K、A298Y、A298I、A298L或A298F，
(68)S190C、S190F或S190L；R229Y或R229W；T253L；和，E256F，
(69)V144C；M370C；F505H或F505K；和，I506D或I506E，
(70)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，S404C、S404V、S404I、S404L或S404C，
(71)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，S150L、S150F、S150W或S150Y，
(72)V144C；M370C；N67A、N67C、N67L或N67V；和，A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R，
(73)V144C；M370C；T189V；和，A298K、A298Y、A298I、A298L或A298F，
(74)V144C；M370C；K508C；和，S509C，
(75)V144C；M370C；L512C；和，L513C，
(76)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，N183P、N183D、N515C、N515D或K520R，
(77)V144C；M370C；N67A、N67C、N67L或N67V；I79L；和，V207C或V207I；
(78)A147V；Q354C或Q354L；A355L；D368L；和，N371F、N371W、N371Y、N371L或N371C，
(79)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K508C；和，S509C，
(80)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；L512C；和，L513C，(81)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；T522C；和，T523C，(82)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；N515C或N515D；和，V516C或K520R，
(83)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；N183P或N183D；和，K427R，
(84)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；G143C；和，V406C，
(85)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；G145I或G145C；和，I407C，
(86)V144C；M370C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；F140C；和，S404C、S404V、S404I、S404L或S404C，
(87)V144C；M370C；N67A、N67C、N67L或N67V；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，K80A、K80I、K80L、K80V、K80F、K80W、K80Y、K80M、K80S、K80P或K80C，
(88)A355L；E356W；D368L；N371F、N371W、N371Y、N371L或N371C；K394C、K394W、K394F、K394Y或K394L；T400V；D489C、D489F或D489L。
10.根据权利要求1所述的重组RSV F多肽，其特征在于，所述重组RSV F多肽包括V144C和M370C突变，且还包括第65、67、74、79、80、87、140、143、145、150、183、189、207、211、291、298、404、406、407、427、505、506、508、509、512、513、515、516、520、522、523位中的一个或多个突变，
优选地，所述重组RSV F多肽包括V144C和M370C突变，且还包括以下任一项或多项的突变：
(1)N67A、N67C、N67L或N67V；和，K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C，
(2)K65C；和，K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C，
(3)N67A、N67C、N67L或N67V；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C，
(4)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；和，I291C、I291E或I291D，
(5)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；和，A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R，
(6)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；和，K80A、K80I、K80L、K80V、K80F、K80W、K80Y、K80M、K80S、K80P或K80C，
(7)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；和，S211P，
(8)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；和，A298K、A298Y、A298I、A298L或A298F，
(9)N67A、N67C、N67L或N67V；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K80A、K80I、K80L、K80V、K80F、K80W、K80Y、K80M、K80S、K80P或K80C；和，K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C，
(10)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；F505H或F505K；和，I506D或I506E，
(11)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，S404C、S404V、S404I、S404L或S404C，
(12)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，S150L、S150F、S150W或S150Y，(13)K65C；N67A、N67C、N67L或N67V；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；和，A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R，
(14)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，N183P或N183D，
(15)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，K520R，
(16)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；T189V；和，A298K、A298Y、A298I、A298L或A298F，
(17)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；K508C；和，S509C，
(18)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；L512C；和，L513C，
(19)K65C；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；和，N515C或N515D，
(20)K65C；N67A、N67C、N67L或N67V；I79L；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；和，V207C或V207I，
(21)K65C；N67A、N67C、N67L或N67V；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K80A、K80I、K80L、K80V、K80F、K80W、K80Y、K80M、K80S、K80P或K80C；和，K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C，
(22)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；K508C；和，S509C，
(23)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；L512C；和，L513C，
(24)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；T522C；和，T523C，
(25)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；N515C或N515D；和，V516C，
(26)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；N515C或N515D；和，K520R，
(27)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；N183P或N183D；和，K427R，
(28)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；G143C；和，V406C，
(29)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；G145I或G145C；和，I407C，
(30)K65C；A74F、A74W、A74Y、A74K或A74R；K87A、K87I、K87L、K87V、K87F、K87W、K87Y、K87M、K87S、K87P或K87C；F140C；和，S404C、S404V、S404I、S404L或S404C。
11.根据权利要求1所述的重组RSV F多肽，其特征在于，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽包括以下一项或多项突变：
(1)K65C和K87C；
(2)K65C、K87C、F505H和I506D；
(3)K65C、K87C、F505K和I506E；
(4)K65C、K87C，S211P；
(5)K65C、K87C和A74F；
(6)K65C、K87C和A74W；
(7)K65C、K87C和A74Y；
(8)K65C、K87C和N254Y；
(9)K65C、K87C和A298Y；
(10)K65C、K87C和D489F；
(11)K65C、K87C和S502F；
(12)K65C、K87C和S502Y；
(13)S62L、K65C和K87C；
(14)S62P、K65C和K87C；
(15)K65C、K87C和A298I；
(16)K65C、K87C和A298L；
(17)K65C、K87C、L141C和N371C；
(18)K65C、K87C、V144C和M370C；
(19)K65C、K87C、S55C和L188C；
(20)K65C、K87C、H159C和I291C；
(21)K65C、K87C、I332C和F483C；
(22)K65C、K87C、I332C和P480C；
(23)K65C、K87C、M396C和F488C；
(24)K65C、K87C、T397C和D486C；
(25)K65C、K87C、T397C和S485C；
(26)K65C、K87C、Q26C和E463C；
(27)K65C、K87C、K445C和E463C；
(28)K65C、K87C、S443C和S466C；
(29)K65C、K87C、K394W、D489F和T337L；
(30)K65C、K87C、K394W、D489L和T337L；
(31)K65C、K87C和L141R；
(32)K65C、K87C和L141K；
(33)K65C、K87C、Q354L和N371F；
(34)K65C、K87C、Q354L和N371W；
(35)K65C、K87C、Q354L和N371Y；
(36)K65C、K87C和I291D；
(37)K65C、K87C、S155V、S290A和A298L；
(38)K65C、K87C和Y458P；
(39)K65C、K87C和V459P；
(40)K65C、K87C和N460P；
(41)K65C、K87C和K461P；
(42)K65C、K87C和E463P；
(43)K65C、K87C、K75C和I217C；
(44)K65C、K87C和A74K；
(45)K65C、K87C和A74R；
(46)K65C、K87C、T189V和A298F；
(47)K65C、K87C、S398F和D489L；
(48)K65C、K87C、N67L、I79L和V207I；
(49)K65C、K87C、L142C和N371C；
(50)K65C、K87C、V144C和N371C；
(51)K65C、K87C、G145C和M370C；
(52)K65C、K87C、K508C和S509C；
(53)K65C、K87C、L512C和L513C；
(54)K65C、K87C、V144C、M370C和A74F；
(55)K65C、K87C、V144C、M370C和A74W；
(56)K65C、K87C、V144C、M370C和A74Y；
(57)K65C、K87C、V144C、M370C、F505K和I506E；
(58)K65C、K87C、V144C、M370C和S211P；
(59)K65C、K87C、V144C、M370C和A298Y；
(60)K65C、K87C、V144C、M370C、T189V和A298Y；
(61)K65C、K87C、V144C、M370C、N67L、I79L和V207I；(62)N67A、K87V、V144C和M370C；
(63)K65C、K87C、V144C、M370C和K80W；
(64)K65C、K87C、V144C、M370C、K508C和S509C；
(65)K65C、K87C、V144C、M370C、L512C和L513C；
(66)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、K508C和S509C；(67)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、L512C和L513C；(68)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、T522C和T523C；(69)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、N515C和V516C；(70)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和N515D；
(71)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和K520R；
(72)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、N515D和K520R；(73)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和N183D；
(74)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、N183D和K427R；(75)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S404V；
(76)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S404I；
(77)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S404L；
(78)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、G143C和V406C；(79)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、F140C和S404C；(80)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150L；
(81)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150F；
(82)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150W；
(83)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150Y；
(84)K65C、K87C、V144C、M370C和A74Y；
(85)K65C、K87C、A74Y、K508C和S509C；
(86)K65C、K87C、V144C、M370C、N67A和A74Y；
(87)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V和A74Y；
(88)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80V；
(89)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80F；
(90)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80W；
(91)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80L；和
(92)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80Y。
12.根据权利要求1所述的重组RSV F多肽，其特征在于，与野生型RSV F蛋白相比，所述重组RSV F多肽包括以下一项或多项突变：
(1)V144C和M370C；
(2)K65C、K87C、V144C、M370C和A74F；
(3)K65C、K87C、V144C、M370C和A74W；
(4)K65C、K87C、V144C、M370C和A74Y；
(5)K65C、K87C、V144C、M370C、F505K和I506E；
(6)K65C、K87C、V144C、M370C和S211P；
(7)K65C、K87C、V144C、M370C和A298Y；
(8)K65C、K87C、V144C、M370C、T189V和A298Y；
(9)K65C、K87C、V144C、M370C、N67L、I79L和V207I；
(10)N67A、K87V、V144C和M370C；
(11)K65C、K87C、V144C、M370C和K80W；
(12)K65C、K87C、V144C、M370C、K508C和S509C；
(13)K65C、K87C、V144C、M370C、L512C和L513C；
(14)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、K508C和S509C；
(15)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、L512C和L513C；
(16)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、T522C和T523C；
(17)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、N515C和V516C；
(18)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和N515D；
(19)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和K520R；
(20)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、N515D和K520R；
(21)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和N183D；
(22)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、N183D和K427R；
(23)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S404V；
(24)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S404I；
(25)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S404L；
(26)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、G143C和V406C；
(27)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y、F140C和S404C；
(28)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150L；
(29)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150F；
(30)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150W；
(31)K65C、K87C、V144C、M370C、A74Y和S150Y；
(32)K65C、K87C、V144C、M370C和A74Y；
(33)N67A、A74Y、K87V、V144C和M370C；
(34)K65C、K87C、V144C、M370C、N67A和A74Y；
(35)N67V、A74Y、K87V、V144C和M370C；
(36)N67V、A74Y、K80V、K87V、V144C和M370C；
(37)N67V、A74Y、K80F、K87V、V144C和M370C；
(38)N67V、A74Y、K80W、K87V、V144C和M370C；
(39)N67V、A74Y、K80L、K87V、V144C和M370C；
(40)N67V、A74Y、K80Y、K87L、V144C和M370C；
(41)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V和A74Y；
(42)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80V；
(43)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80F；
(44)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80W；
(45)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80L；和
(46)K65C、K87C、V144C、M370C、N67V、A74Y和K80Y。
13.根据权利要求1所述的重组RSV F多肽，其特征在于，所述重组RSV F多肽还包括三聚化结构域，
优选地，所述三聚化结构位于所述重组RSV F多肽的C端，
更优选地，所述三聚化结构域来源于噬菌体T4次要纤维蛋白折叠子，更优选地具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
14.根据权利要求1所述的重组RSV F多肽，其特征在于，所述野生型RSV F蛋白来源于人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV的F蛋白。
15.一种核酸分子，其编码如权利要求1至14中任一项所述的重组RSV F多肽。
16.根据权利要求15所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA分子或RNA分子。
17.根据权利要求16所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为RNA分子，优选为mRNA分子。
18.根据权利要求17所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括至少一个化学修饰，更优选包括选自下组的化学修饰：假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4′-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2′-O-甲基尿苷。
19.根据权利要求17所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括至少一个5′端帽或帽类似物。
20.一种包括如权利要求15至19中任一项所述的核酸分子的载体，优选地，所述载体为病毒载体，
更优选地，所述载体选自副粘病毒载体、人类副流感病毒载体、偏肺病毒载体、新城疫病毒载体、仙台病毒载体、麻疹病毒载体、新城疫病毒载体、腺病毒载体、多瘤病毒载体、牛痘病毒载体、腺相关病毒载体或疱疹病毒载体。
21.一种宿主细胞，其包括如权利要求20所述的载体。
22.一种免疫原性组合物，其包括如权利要求1至14中任一项所述的重组RSV F多肽，权利要求15至19中任一项所述的核酸分子、如权利要求20所述的载体或如权利要求21所述的宿主细胞；和，药学上可接受的载剂。
23.根据权利要求22所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物还包括佐剂，优选地所述佐剂包括明矾、矿物盐、水包油组合物、AS01B、AS01E、MF59、AS01、AS03、AS04、MPL、QS21、CpG寡核苷酸、TLR7激动剂、TLR4激动剂、TLR3激动剂或其中两种或更多种的组合。
24.根据权利要求22所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述载剂为脂质纳米颗粒颗粒，优选选自阳离子型脂质、经PEG修饰的脂质、固醇和磷脂。
25.根据权利要求22所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物经鼻、经肺、气管内、肌肉、皮下、静脉、玻璃体内、腹膜内或肠胃外途径来施用。
26.如权利要求22至25中任一项所述的免疫原性组合物在制备治疗或预防受试者的RSV感染的药物中的用途。
27.根据权利要求26所述的用途，其特征在于，所述RSV感染包括人类RSV亚型A、人类RSV亚型B或牛RSV的感染；和/或所述受试者包括人类哺乳动物或非人类哺乳动物。
28.根据权利要求26所述的用途，其特征在于，所述免疫原性组合物经鼻、经肺、气管内、肌肉、皮下、静脉、玻璃体内、腹膜内或肠胃外途径来施用。
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