CN119462816A - 具有抗肿瘤活性的海柯皂苷元衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然药物及药物化学领域，涉及海柯皂苷元衍生物及其制备方法和应用。本发明具体涉及这些在海柯皂苷元母核结构的C3‑OH位点引入氨基酸、苯甲酸氮芥和苯丁酸氮芥衍生物的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明所述海柯皂苷元拼合氨基酸、苯甲酸氮芥和苯丁酸氮芥衍生物及其药学上可接受的盐结构如下通式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ所示。药理实验证明本发明的海柯皂苷元衍生物对人乳腺癌细胞系具有较好的抗肿瘤作用，且对人正常胃黏膜上皮细胞GES‑1的毒性相对较低，因此具有开发为临床抗癌药物的潜力。

Description

具有抗肿瘤活性的海柯皂苷元衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及天然药物及药物化学领域，涉及具有抗肿瘤活性的海柯皂苷元衍生物及其制备方法和应用，具体涉及在海柯皂苷元母核结构的C3-OH位点引入氨基酸、苯甲酸氮芥和苯丁酸氮芥的海柯皂苷元衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

癌症目前多采用综合治疗，以外科手术、化疗、放疗相结合为主，有需要者可结合靶向治疗、生物治疗等方法，以提高预后治疗效果。当前临床实践表明化学疗法仍然是治疗癌症最有效的方法之一，但不良的毒副作用严重限制了其临床应用。因此，迫切需要研发安全有效的抗癌新药。天然产物是药物发现的重要来源之一，基于天然产物的结构修饰来开发安全有效的抗癌药物已成为众多科研工作者的研究热点。

海柯皂苷元(Hecogenin，HG)天然存在于龙舌兰属植物叶中，是合成甾体激素的原料之一。近年来，药理研究发现海柯皂苷元具有抗肿瘤、降低血液中胆固醇含量、抗糖尿病、抗氧化、抗炎等药理活性。但其对肿瘤仅具有较弱至中等活性，这严重阻碍了其进一步的临床应用。因此有必要对其进行结构修饰，以提高其水溶性和抗肿瘤活性。

氮芥类属于生物烷化剂，是一种细胞毒类物质，从构造上看这类抗肿瘤化合物由两部分组成：烷基化部分和载体部分。烷基化部分是主体部分，也是抗肿瘤活性的功能基团，对载体部分进行化学修饰可以改善这类药物在体内的各种药物动力学性质，因此会影响药物的选择性、药物的毒性以及药物的抗肿瘤活性。目前，临床上已经有几种氮芥类衍生物，如美法仑、苯丁酸氮芥、环磷酰胺等，然而其在治疗过程中展现出一定的耐药性，因此对氮芥类药物进行化学修饰，改善其疗效和降低毒性有着很重要的价值。将天然产物与氮芥类药物进行拼合是一种常用的策略，不仅能提高活性，减少毒性，改善成药性质，而且也能改善多药耐药性。

本发明以海柯皂苷元为先导化合物，利用拼合原理，在其分子结构的C3-OH引入氨基酸、苯甲酸氮芥和苯丁酸氮芥，设计并合成了通式为I、Ⅱ及Ⅲ所示的海柯皂苷元衍生物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是设计并合成具有良好抗肿瘤活性的海柯皂苷元衍生物，并进一步提供包含该衍生物的药物组合物以及所述衍生物和药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

在第一个方面中，本发明提供了通式I、Ⅱ或Ⅲ所示的海柯皂苷元衍生物或其药学上可接受的盐：

其中，R₁和R₂选自下述基团之一：

作为可选的方式，在上述海柯皂苷元衍生物或其药学上可接受的盐中，所述海柯皂苷元衍生物选自：

在第二个方面中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述第一个方面所述的海柯皂苷元衍生物或药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

作为可选的方式，在上述药物组合物中，可以将所述药物组合物制成片剂、胶囊剂或颗粒剂。

在第三个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的海柯皂苷元衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：

(1)将海柯皂苷元1溶于溶剂中，然后加入Boc保护的氨基酸，在DCC和DMAP条件下室温反应，TLC监测反应结束，将所得产物上样至硅胶柱色谱，使用石油醚/乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，得到中间体2a-2f；

(2)将中间体2a-2f溶于溶剂中，然后加入三氟乙酸(TFA)进行脱Boc保护处理，室温反应，TLC监测反应结束，将反应液进行萃取，萃取后将所得产物上样至硅胶柱色谱，使用二氯甲烷/甲醇混合溶液梯度洗脱，得到中间体3a-3f；

(3)将中间体3a-3f溶于溶剂中，分别与苯甲酸氮芥或苯丁酸氮芥在EDCI和DMAP条件下室温反应，TLC监测反应结束，将所得产物上样至硅胶柱色谱，使用石油醚/乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，得到目标化合物4a-4f或5a-5f，

a：二环己基碳二亚胺(DCC)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)；

b：三氟乙酸(TFA)；

c：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)，DMAP；

d：EDCI，DMAP。

在第四个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的海柯皂苷元衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用。

在第五个方面中，本发明提供了上述第二个方面所述的药物组合物在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用。

作为可选的方式，在上述应用中，所述肿瘤为乳腺癌。

本发明的有益效果：

(1)本发明的海柯皂苷元衍生物或其药学上可接受的盐是以海柯皂苷元为先导化合物，利用拼合原理，在其分子结构的C3-OH引入氨基酸、苯甲酸氮芥和苯丁酸氮芥，设计并合成了通式为I、Ⅱ或Ⅲ的海柯皂苷元衍生物。拼合后的化合物及其药物组合物和制剂具有较好的抗肿瘤活性。

(2)药理实验证明本发明的海柯皂苷元衍生物对人乳腺癌细胞系具有较好的抗肿瘤作用，且对人正常胃黏膜上皮细胞GES-1的毒性相对较低，因此具有开发为临床抗癌药物的潜力。

附图说明

图1：化合物5d对MDA-MB-231细胞的形态影响。

图2：在Hoechst 33342/PI双染下的化合物5d对MDA-MB-231细胞的凋亡影响。

图3：化合物5d对MDA-MB-231细胞凋亡的影响。其中，(A)5d在不同浓度下处理48h对MDA-MB-231细胞凋亡的流式检测；(B)不同浓度组的5d处理下对MDA-MB-231细胞不同凋亡期的相对比例。^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001，与control组的相应凋亡期的细胞比较。

具体实施方式

制备实施例部分

实施例1

于50mL干燥的茄形瓶中加入海柯皂苷元(300mg，0.69mmol)和10mL CH₂Cl₂，搅拌溶解后加入DMAP(170.0mg，1.39mmol)、DCC(287.1mg，1.39mmol)和4-(Boc-氨基)-丁酸(282.9mg，1.39mmol)，室温搅拌8h，薄层色谱(石油醚：乙酸乙酯体积比＝3:1)监测反应，原料基本反应完全，经硅胶柱色谱分离纯化得目标化合物2b，白色粉末，产率81.2％。¹HNMR(600MHz,CDCl₃,δ):4.67(m,1H,H-3),4.60(s,1H,NH),4.33(dd,J＝14.5,6.8Hz,1H,H-16),3.48(d,J＝10.3Hz,1H,H-26),3.34(t,J＝11.0Hz,1H,H-26),3.14(d,J＝5.1Hz,2H,GABA-α-CH₂),2.30(t,J＝7.3Hz,2H,GABA-γ-CH₂),1.43(s,9H,Boc-CH₃,×3),1.05(d,J＝6.9Hz,3H,21-CH₃),1.03(s,3H,19-CH₃),0.91(s,3H,18-CH₃),0.78(d,J＝6.3Hz,3H,27-CH₃).¹³CNMR(150MHz,CDCl₃,δ):213.52(C-12),172.89(GABA-COO),156.05(Boc-COO),109.38(C-22),79.31(C-16),79.31(Boc-quart.-C),73.39(C-3),67.02(C-26),55.80(C-17),55.45(C-14),55.23(C-9),53.65(C-13),44.57(C-5),42.32(C-20),40.13(GABA-α-CH₂),37.87(C-11),36.37(C-4),36.21(C-1),34.44(C-10),33.92(C-7),32.10(GABA-γ-CH₂),31.59(C-15),31.54(C-8),31.26(C-23),30.32(C-25),28.91(C-24),28.54(Boc-CH₃,×3),28.29(C-2),27.34(C-6),25.46(GABA-β-CH₂),17.26(C-19),16.15(C-27),13.40(C-18),12.01(C-21).ESI-HRMS:m/z616.4187[M+H]⁺(Calcd for C₃₆H₅₈NO₇,616.4208)。

化合物2b的结构如下所示：

实施例2

于50mL干燥的茄形瓶中加入中间体2b(250mg，0.40mmol)和5mL CH₂Cl₂，搅拌溶解后加入1mL TFA，室温搅拌5h，薄层色谱(二氯甲烷：甲醇体积比＝15:1)监测反应，原料基本反应完全，向反应液中加入10mL水，用5mL二氯甲烷萃取三次，饱和食盐水洗，无水Na₂SO₄干燥、过滤、浓缩，经硅胶柱色谱分离纯化得目标化合物3b，白色粉末，产率81.2％。¹HNMR(600MHz,CDCl₃,δ):4.65(m,1H,H-3),4.33(dd,J＝14.2,7.0Hz,1H,H-16),3.48(d,J＝10.0Hz,1H,H-26),3.34(t,J＝11.0Hz,1H,H-26),3.06(m,2H,GABA-α-CH₂),2.40(m,2H,GABA-γ-CH₂),1.05(d,J＝6.9Hz,3H,21-CH₃),1.03(s,3H,19-CH₃),0.90(s,3H,18-CH₃),0.78(d,J＝6.3Hz,3H,27-CH₃).¹³C NMR(150MHz,CDCl₃,δ):213.40(C-12),172.28(GABA-COO),109.36(C-22),79.29(C-16),73.94(C-3),67.01(C-26),55.83(C-17),55.44(C-14),55.23(C-9),53.67(C-13),44.55(C-5),42.32(C-20),39.51(GABA-α-CH₂),37.86(C-11),36.33(C-4),36.19(C-1),34.43(C-10),33.88(C-7),31.66(GABA-γ-CH₂),31.59(C-15),31.54(C-8),31.26(C-23),30.32(C-25),28.91(C-24),28.30(C-2),27.31(C-6),23.02(GABA-β-CH₂),17.26(C-19),16.15(C-27),13.40(C-18),12.02(C-21).ESI-HRMS:m/z516.3658[M+H]⁺(Calcd for C₃₁H₅₀NO₅,516.3684)。

化合物3b的结构如下所示：

实施例3

参照实施例2的合成方法制备得目标化合物3c。白色粉末，产率84.7％。¹HNMR(600MHz,CDCl₃,δ):4.73(m,1H,H-3),4.32(m,1H,H-16),3.47(m,1H,H-26),3.33(t,J＝11.0Hz,1H,H-26),3.25(d,J＝4.5Hz,1H,Val-α-CH),1.05(d,J＝6.9Hz,3H,21-CH₃),1.03(s,3H,19-CH₃),0.96(d,J＝7.0Hz,3H,Val-CH₃),0.91(s,3H,18-CH₃),0.89(d,J＝6.8Hz,3H,Val-CH₃),0.78(d,J＝6.3Hz,3H,27-CH₃).¹³C NMR(150MHz,CDCl₃,δ):213.46(C-12),174.96(Val-COO),109.37(C-22),79.30(C-16),73.66(C-3),67.01(C-26),60.00(Val-α-CH),55.79(C-17),55.43(C-14),55.22(C-9),53.64(C-13),44.56(C-5),42.32(C-20),37.86(C-11),36.37(C-4),36.20(C-1),34.43(C-10),33.96(C-7),32.25(Val-β-CH),31.59(C-15),31.54(C-8),31.25(C-23),30.31(C-25),28.91(C-24),28.28(C-2),27.38(C-6),19.39(Val-CH₃),17.32(Val-CH₃),17.26(C-19),16.15(C-27),13.39(C-18),12.02(C-21).ESI-HRMS:m/z530.3803[M+H]⁺(Calcd for C₃₂H₅₂NO₅,530.3840)。

化合物3c的结构如下所示：

实施例4

参照实施例2的合成方法制备得目标化合物3d。白色粉末，产率84.7％。¹HNMR(600MHz,CDCl₃,δ):4.71(m,1H,H-3),4.33(dd,J＝13.8,6.9Hz,1H,H-16),3.77(brs,1H,Pro-α-CH),3.47(m,1H,H-26),3.33(t,J＝11.2Hz,1H,H-26),3.10(m,1H,Pro-δ-CH₂),2.95(m,1H,Pro-δ-CH₂),1.05(d,J＝6.9Hz,3H,21-CH₃),1.03(s,3H,19-CH₃),0.91(s,3H,18-CH₃),0.77(d,J＝6.3Hz,3H,27-CH₃).¹³C NMR(150MHz,CDCl₃,δ):213.44(C-12),174.49(Pro-COO),109.37(C-22),79.29(C-16),74.09(C-3),67.00(C-26),59.89(Pro-α-CH),55.78(C-17),55.41(C-14),55.21(C-9),53.63(C-13),47.06(Pro-δ-CH₂),44.53(C-5),42.31(C-20),37.85(C-11),36.33(C-4),36.19(C-1),34.42(C-10),33.82(C-7),31.57(C-15),31.53(C-8),31.25(C-23),30.30(C-25),29.82(Pro-β-CH₂),28.90(C-24),28.26(C-2),27.25(C-6),25.44(Pro-γ-CH₂),17.25(C-19),16.13(C-27),13.39(C-18),12.01(C-21).ESI-HRMS:m/z528.3678[M+H]⁺(Calcd for C₃₂H₅₀NO₅,528.3684)。

化合物3d的结构如下所示：

实施例5

参照实施例2的合成方法制备得目标化合物3f。白色粉末，产率79.3％。¹HNMR(600MHz,CDCl₃,δ):8.19(brs,1H,Trp-NH),7.62(d,J＝7.8Hz,1H,Trp-Ph),7.35(d,J＝8.2Hz,1H,Trp-Ph),7.18(t,J＝7.2Hz,1H,Trp-Ph),7.11(t,J＝7.8Hz,1H,Trp-Ph),7.06(s,1H,Trp-δ-CH),4.67(m,1H,H-3),4.34(dd,J＝14.1,7.0Hz,1H,H-16),3.77(t,J＝6.7Hz,1H,Trp-α-CH),3.48(m,1H,H-26),3.34(t,J＝11.0Hz,1H,H-26),3.25(dd,J＝14.3,7.9Hz,1H,Trp-β-CH₂),3.01(dd,J＝14.3,7.9Hz,1H,Trp-β-CH₂),1.06(d,J＝6.9Hz,3H,21-CH₃),1.04(s,3H,19-CH₃),0.88(s,3H,18-CH₃),0.78(d,J＝6.3Hz,3H,27-CH₃).¹³C NMR(150MHz,CDCl₃,δ):213.52(C-12),174.88(Trp-COO),136.37(Trp-Ph),127.69(Trp-Ph),123.05(Trp-δ-C),122.28(Trp-Ph),119.59(Trp-Ph),119.01(Trp-Ph),111.42(Trp-Ph),111.30(Trp-γ-C),109.38(C-22),79.30(C-16),73.95(C-3),67.01(C-26),55.79(C-17),55.41(C-14),55.30(C-9),55.22(Trp-α-CH),53.69(C-13),44.51(C-5),42.32(C-20),37.85(C-11),36.32(C-4),36.17(C-1),34.41(C-10),33.71(C-7),31.56(C-15),31.53(C-8),31.25(C-23),30.93(Trp-β-CH₂),30.31(C-25),28.90(C-24),28.25(C-2),27.24(C-6),17.26(C-19),16.14(C-27),13.40(C-18),11.99(C-21).ESI-HRMS:m/z617.3906[M+H]⁺(Calcd for C₃₈H₅₃N₂O₅,617.3949)。

化合物3f的结构如下所示：

实施例6

于50mL干燥的茄形瓶中加入中间体3d(60mg，0.11mmol)和5mL CH₂Cl₂，搅拌溶解后加入DMAP(20.8mg，0.17mmol)、EDCI(32.6mg，0.17mmol)和苯甲酸氮芥(35.5mg，0.14mmol)，室温搅拌8h，薄层色谱(石油醚：乙酸乙酯的体积比＝1.5:1)监测反应，原料基本反应完全，经硅胶柱色谱分离纯化得目标化合物4d，白色粉末，产率81.2％。¹HNMR(600MHz,CDCl₃,δ):7.54(brd,J＝7.3Hz,2H,Ph-H),6.65(d,J＝7.3Hz,2H,Ph-H),4.73(s,1H,H-3),4.58(s,1H,Pro-α-CH),4.32(dd,J＝12.9,6.0Hz,1H,H-16),3.76(t,J＝6.1Hz,4H,NCH₂CH₂Cl,×2),3.69(m,2H,Pro-δ-CH₂),3.63(t,J＝6.1Hz,4H,NCH₂CH₂Cl,×2),3.47(m,1H,H-26),3.33(t,J＝11.0Hz,1H,H-26),1.05(d,J＝7.0Hz,3H,21-CH₃),1.03(s,3H,19-CH₃),0.90(s,3H,18-CH₃),0.77(d,J＝6.3Hz,3H,27-CH₃).¹³CNMR(150MHz,CDCl₃,δ):213.51(C-12),172.04(Pro-COO),169.26(-CONH),147.78(Ph-C),130.08(Ph-C,×3),111.02(Ph-C,×2),109.36(C-22),79.29(C-16),74.00(C-3),66.99(C-26),59.98(Pro-α-CH),55.77(C-17),55.40(C-14),55.20(C-9),53.61(C-13),53.47(NCH₂CH₂Cl,×2),50.38(Pro-δ-CH₂),44.54(C-5),42.30(C-20),40.34(NCH₂CH₂Cl,×2),37.85(C-11),36.32(C-4),36.20(C-1),34.41(C-10),33.72(C-7),31.57(C-15),31.52(C-8),31.23(C-23),30.29(C-25),29.37(Pro-β-CH₂),28.89(C-24),28.27(C-2),27.22(C-6),25.70(Pro-γ-CH₂),17.24(C-19),16.13(C-27),13.38(C-18),12.02(C-21).ESI-HRMS:m/z771.3886[M+H]⁺(Calcd for C₄₃H₆₁Cl₂N₂O₆,771.3901)。

化合物4d的结构如下所示：

实施例7

参照实施例2的合成方法制备得目标化合物3a，而后参照实施例6的合成方法制备得目标化合物5a。白色粉末，产率84.4％。¹HNMR(600MHz,CDCl₃,δ):7.07(d,J＝8.1Hz,2H,Ph-H),6.63(d,J＝7.8Hz,2H,Ph-H),5.91(s,1H,NH),4.74(m,1H,H-3),4.33(dd,J＝13.7,6.7Hz,1H,H-16),3.98(m,2H,Gly-α-CH₂),3.69(t,J＝7.2Hz,4H,NCH₂CH₂Cl,×2),3.61(t,J＝7.2Hz,4H,NCH₂CH₂Cl,×2),3.47(m,1H,H-26),3.33(t,J＝11.0Hz,1H,H-26),1.05(d,J＝6.9Hz,3H,21-CH₃),1.03(s,3H,19-CH₃),0.90(s,3H,18-CH₃),0.78(d,J＝6.5Hz,3H,27-CH₃).¹³C NMR(150MHz,CDCl₃,δ):213.43(C-12),172.98(-CONH),169.70(Gly-COO),144.24(Ph-C),129.86(Ph-C,×3),112.46(Ph-C,×2),109.36(C-22),79.27(C-16),74.74(C-3),67.00(C-26),55.78(C-17),55.40(C-14),55.21(C-9),53.81(NCH₂CH₂Cl,×2),53.63(C-13),44.52(C-5),42.30(C-20),41.63(Gly-α-CH₂),40.54(NCH₂CH₂Cl,×2),37.84(C-11),36.28(C-4),36.15(C-1),35.61(Ph-CH₂-CH₂-CH₂),34.40(C-10),34.06(Ph-CH₂),33.79(C-7),31.55(C-15),31.52(C-8),31.24(C-23),30.30(C-25),28.89(C-24),28.24(C-2),27.30(Ph-CH₂-CH₂),27.24(C-6),17.25(C-19),16.14(C-27),13.39(C-18),11.98(C-21).ESI-HRMS:m/z773.4010[M+H]⁺(Calcd for C₄₃H₆₃Cl₂N₂O₆,773.4058)。

化合物5a的结构如下所示：

实施例8

采用化合物3c，参照实施例6的合成方法制备得目标化合物5c。白色粉末，产率84.4％。¹HNMR(600MHz,CDCl₃,δ):7.07(d,J＝8.6Hz,2H,Ph-H),6.64(d,J＝8.6Hz,2H,Ph-H),5.89(d,J＝8.8Hz,1H,NH),4.73(m,1H,H-3),4.52(dd,J＝8.5,4.6Hz,1H,Val-α-CH),4.32(m,1H,H-16),3.69(t,J＝7.2Hz,4H,NCH₂CH₂Cl,×2),3.62(t,J＝6.8Hz,4H,NCH₂CH₂Cl,×2),3.48(m,1H,H-26),3.34(t,J＝11.0Hz,1H,H-26),1.05(d,J＝6.9Hz,3H,21-CH₃),1.04(s,3H,19-CH₃),0.93(d,J＝6.9Hz,3H,Val-CH₃),0.91(s,3H,18-CH₃),0.89(d,J＝6.9Hz,3H,Val-CH₃),0.78(d,J＝6.3Hz,3H,27-CH₃).¹³C NMR(150MHz,CDCl₃,δ):213.42(C-12),172.76(-CONH),171.77(Val-COO),144.18(Ph-C),129.88(Ph-C,×3),112.54(Ph-C,×2),109.39(C-22),79.29(C-16),74.41(C-3),67.02(C-26),56.95(Val-α-CH),55.79(C-17),55.42(C-14),55.22(C-9),53.87(NCH₂CH₂Cl,×2),53.63(C-13),44.55(C-5),42.32(C-20),40.51(NCH₂CH₂Cl,×2),37.84(C-11),36.31(C-4),36.18(C-1),36.03(Ph-CH₂-CH₂-CH₂),34.42(C-10),34.14(Ph-CH₂),33.92(C-7),31.58(C-15),31.55(Val-β-CH),31.53(C-8),31.25(C-23),30.31(C-25),28.90(C-24),28.28(C-2),27.53(Ph-CH₂-CH₂),27.32(C-6),19.06(Val-CH₃),17.95(Val-CH₃),17.26(C-19),16.14(C-27),13.40(C-18),12.00(C-21).ESI-HRMS:m/z 815.4511[M+H]⁺(Calcd for C₄₆H₆₉Cl₂N₂O₆,815.4527)。

化合物5c的结构如下所示：

实施例9

采用化合物3d，参照实施例6的合成方法制备得目标化合物5d。白色粉末，产率84.4％。¹HNMR(600MHz,CDCl₃,δ):7.07(d,J＝8.2Hz,2H,Ph-H),6.61(d,J＝7.5Hz,2H,Ph-H),4.69(m,1H,H-3),4.43(dd,J＝8.6,3.6Hz,1H,Pro-α-CH),4.32(dd,J＝14.6,6.3Hz,1H,H-16),3.69(t,J＝6.8Hz,4H,NCH₂CH₂Cl,×2),3.61(t,J＝6.8Hz,4H,NCH₂CH₂Cl,×2),3.56(m,1H,Pro-δ-CH₂),3.47(m,1H,H-26),3.42(m,1H,Pro-δ-CH₂),3.33(t,J＝11.0Hz,1H,H-26),1.05(d,J＝6.9Hz,3H,21-CH₃),1.03(s,3H,19-CH₃),0.89(d,J＝17.2Hz,3H,18-CH₃),0.78(d,J＝6.3Hz,3H,27-CH₃).¹³C NMR(150MHz,CDCl₃,δ):213.50(C-12),172.17(-CONH),171.93(Pro-COO),144.33(Ph-C),129.85(Ph-C,×3),112.27(Ph-C,×2),109.37(C-22),79.30(C-16),73.99(C-3),67.00(C-26),59.09(Pro-α-CH),55.78(C-17),55.40(C-14),55.20(C-9),53.75(NCH₂CH₂Cl,×2),53.61(C-13),47.21(Pro-δ-CH₂),44.52(C-5),42.30(C-20),40.65(NCH₂CH₂Cl,×2),37.84(C-11),36.31(C-4),36.18(C-1),34.41(C-10),34.09(Ph-CH₂-CH₂-CH₂),33.72(C-7),33.68(Ph-CH₂),31.58(C-15),31.52(C-8),31.24(C-23),30.30(C-25),29.39(Pro-β-CH₂),28.89(C-24),28.26(C-2),27.20(C-6),26.48(Ph-CH₂-CH₂),24.86(Pro-γ-CH₂),17.25(C-19),16.13(C-27),13.39(C-18),11.99(C-21).ESI-HRMS:m/z 813.4328[M+H]⁺(Calcd for C₄₆H₆₇Cl₂N₂O₆,813.4371)。

化合物5d的结构如下所示：

药效学实验部分：

效果例1：本发明化合物对多种乳腺癌细胞的细胞毒性

1.1.主要实验材料

细胞株：人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和人正常胃黏膜上皮细胞GES-1。

1.2.实验方法：细胞抑制活性实验

上述4种细胞以1×10⁴个/孔，100μL/孔接种到96孔板中，过夜贴壁后，移除培养基，加上一系列浓度(1-100μM)的配制在DMSO中的待测化合物(保持DMSO的终浓度为千分之一，即按相应储备液浓度加入相应储备液至细胞培养基中(如1μL加入至999μL的细胞培养基中)。另经过48h处理后，加入10％体积的CCK-8溶液到每个96孔中培养箱孵育2h，450nm测定吸光度，根据公式计算每孔的相对抑制率及根据抑制率计算IC₅₀值。

1.3.实验结果

表1：实施例化合物对3种人类乳腺癌细胞株和1种人类正常细胞的细胞毒活性的IC₅₀值(μM)

药理结果如表1所示，与母体化合物海柯皂苷元相比，本发明的海柯皂苷元衍生物对三种乳腺癌细胞株具有更强的抗增殖活性和肿瘤细胞特异性，大多数衍生物的IC₅₀值低于30μM。其中，衍生物5a、5c和5d对MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞表现出显著的抗增殖活性，IC₅₀值均低于10μM。此外，与阳性对照药阿霉素相比，本发明的海柯皂苷元衍生物对正常细胞GES-1的细胞毒性来说均较低。尤其是衍生物5d对MDA-MB-231细胞具有最强的细胞毒活性，IC₅₀值为2.2μM。

效果例2：化合物5d对MDA-MB-231细胞的形态学影响

2.1.实验方法

取MDA-MB-231细胞，按1×10⁶个/孔接种于对应的6孔板，分别加入相应体积配制在DMSO里的化合物5d(浓度分别0.5、1.5、4μM)，另外含1‰DMSO的培养基为control对照组，继续培养24h。用显微镜观察细胞形态，对于染色，MDA-MB-231细胞以1×10⁶个/孔接种到6孔板中，过夜后，移除培养基，加上一系列浓度(0.5、1.5、4μM)的配置在DMSO里的化合物5d，细胞处理48h后，用Hoechst 33342/PI双染试剂盒对细胞进行染色，缓冲液与Hoechst33342和PI在室温染色30min后，在荧光显微镜下拍摄。

2.2实验结果

不同的浓度(0.5、1.5、4μM)的5d对MDA-MB-231细胞的形态影响如图1所示，可以看出随着化合物5d剂量的升高，MDA-MB-231细胞的形态由明亮的、边缘清晰的细胞逐渐变成浑浊的、边缘不清晰、细胞形态并且伴有少量的漂浮的死亡的细胞。用Hoechst 33342/PI双染试剂盒对各组细胞进行染色后发现，随着化合物5d剂量的升高，早期凋亡的细胞(即能被Hoechst 33342染成亮蓝色的细胞核塌缩)的数量和晚期凋亡、坏死的细胞(即能被PI染色的)数量呈上升趋势，提示随着化合物5d促进MDA-MB-231细胞的凋亡，并呈剂量依赖性(图2)。

效果例3：化合物5d对细胞凋亡的影响

3.1实验方法

取MDA-MB-231细胞，按2×10⁵个/孔接种于对应的24孔板，分别加入相应体积配制在DMSO里的化合物5d(浓度分别0.5、1.5、4μM)，另外含1‰DMSO的培养基为control对照组，继续培养48h。孵育后弃去培养基，加2mLPBS洗细胞2遍，胰酶消化，收集细胞。然后用冷PBS洗去多余的胰酶，离心去上清后，用Annexin/PI双染试剂盒(Solarbio,Beijing,CN)里的1xbinding buffer重悬细胞，然后加入一定量的Annexin孵育15min，然后加一定量的PI，并加入一定量的PBS，准备上流式细胞仪(CytoFlex,Beckman coulter,CA,USA)检测，并在上样检测前同时准备单染Annexin或单染PI或均不染的相应对照管，以调节仪器电压增益和荧光通道补偿。

3.2实验结果

化合物5d(0.5、1.5、4μM)处理48h后，各给药组对细胞凋亡的影响如图3A和图3B所示，可以看出，随着给药量的加大，凋亡细胞比例明显增多，结果显示，化合物5d在0.5、1.5、4μM浓度下均能显著降低正常细胞比例(p<0.05)。在所有剂量下，细胞的早期凋亡、晚期凋亡、坏死比例与control组比较显著升高。上述结果提示，化合物5d能引起MDA-MB-231细胞较强的凋亡效应并且对于晚期凋亡、坏死呈剂量依赖性(图3)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.通式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ所示的海柯皂苷元衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：

其中，R₁和R₂分别独立地选自下述基团之一：

2.根据权利要求1所述的海柯皂苷元衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述海柯皂苷元衍生物选自：

3.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物包含权利要求1或权利要求2所述的海柯皂苷元衍生物或药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。

4.权利要求1或权利要求2所述的海柯皂苷元衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括下述步骤：

(1)将海柯皂苷元1溶于溶剂中，然后加入Boc保护的氨基酸，在DCC和DMAP条件下室温反应，TLC监测反应结束，将所得产物上样至硅胶柱色谱，使用石油醚/乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，得到中间体2a-2f；

(2)将中间体2a-2f溶于溶剂中，然后加入三氟乙酸(TFA)进行脱Boc保护处理，室温反应，TLC监测反应结束，将反应液进行萃取，萃取后将所得产物上样至硅胶柱色谱，使用二氯甲烷/甲醇混合溶液梯度洗脱，得到中间体3a-3f；

(3)将中间体3a-3f溶于溶剂中，分别与苯甲酸氮芥或苯丁酸氮芥在EDCI和DMAP条件下室温反应，TLC监测反应结束，将所得产物上样至硅胶柱色谱，使用石油醚/乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，得到目标化合物4a-4f或5a-5f，

a：二环己基碳二亚胺(DCC)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)；

b：三氟乙酸(TFA)；

c：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)，DMAP；

d：EDCI，DMAP。

5.权利要求1或权利要求2所述的海柯皂苷元衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用。

6.权利要求3所述的药物组合物在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用。

7.根据权利要求5或权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌。