CN119462803A - 核苷单体类似物、寡核苷酸的合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种核苷单体类似物、寡核苷酸的合成方法和应用。该核苷单体上的R为碱基；R₁包括甲氧基、甲氧乙基、氟、羟基或氢中的一种或多种；R₂包括羟基、单磷酸、二磷酸、三磷酸或硫代修饰的磷酸中的一种或多种；R₃包括甲基、乙基、丙基或异丙基中的一种或多种。能够解决现有技术中的寡核苷酸可逆封端活性低的问题，适用于寡核苷酸合成领域。

Description

核苷单体类似物、寡核苷酸的合成方法和应用

技术领域

本发明涉及寡核苷酸合成领域，具体而言，涉及一种核苷单体类似物、寡核苷酸的合成方法和应用。

背景技术

寡核苷酸是生物医学和生命科学研究中调节基因表达的基本工具，作为基因靶向治疗药物，用于治疗遗传病、病毒、肿瘤等多种疾病。寡核苷酸药物主要包括反义寡核苷酸、小干扰核糖核酸、微小核糖核酸、核酸适配体等。天然的寡核苷酸在体内很容易被降解，成药性低，因此，药物寡核苷酸通常带有特定的修饰基团，如硫代磷酸二酯键、氟代、甲基以及锁核酸等，以增强寡核苷酸在体内的稳定性，提高特异性，并降低其毒副作用。

寡核苷酸主要采用的合成方式是亚磷酰胺法，但存在初产物纯度低，化学溶剂用量大，大规模放大较难等缺点，因此新兴的酶法合成寡核苷酸的方式因其绿色的合成工艺、较高的偶联效率、易于放大等众多优势而备受关注。

携带可逆阻断基团的核苷酸类似物是酶法合成寡核苷酸的关键原材料，利用可逆的封端基团实现寡核苷酸的特异性合成，防止错误序列的引入，同时在合成完成后可以无痕去除阻断基团以实现目标寡核苷酸的合成。

但是现有技术中寡核苷酸的可逆阻断基团种类较少，而且活性相对较低，导致与寡核苷酸链的偶联效率低下，使得目标寡核苷酸的合成受阻。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种核苷单体类似物、寡核苷酸的合成方法和应用，以解决现有技术中的寡核苷酸的可逆封端活性低的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种核苷单体类似物，该核苷单体类似物的结构式如式I所示；

式I；

其中，R为碱基；R1包括甲氧基、甲氧乙基、氟、羟基或氢中的一种或多种；

R2包括羟基、单磷酸、二磷酸、三磷酸或硫代修饰的磷酸中的一种或多种；R3包括甲基、乙基、丙基或异丙基中的一种或多种。

进一步地，碱基包括天然碱基或非天然碱基；天然碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；非天然碱基包括3-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-叠氮腺嘌呤、2-硫代胸苷、5-羧酰胺尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、C7修饰的脱氮腺嘌呤、C7修饰的脱氮鸟嘌呤、C5修饰的胞嘧啶或C5修饰的尿嘧啶中的一种或多种，其中，修饰包括甲基修饰、H修饰、Cl修饰或F修饰中的一种或多种。

根据本发明的第二个方面，提供了一种核苷酸单体类似物，该核苷酸类似物的结构式如式II所示：

式II；

其中，R为碱基；R4包括甲氧基、甲氧乙基、氟、羟基或氢中的一种或多种；R5包括甲基、乙基、丙基或异丙基中的一种或多种；R6包括羟基或巯基。

进一步地，碱基包括天然碱基或非天然碱基；天然碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；非天然碱基包括3-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-叠氮腺嘌呤、2-硫代胸苷、5-羧酰胺尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、C7修饰的脱氮腺嘌呤、C7修饰的脱氮鸟嘌呤、C5修饰的胞嘧啶或C5修饰的尿嘧啶中的一种或多种，其中，修饰包括甲基修饰、H修饰、Cl修饰或F修饰中的一种或多种。

根据本申请的第三个方面提供了一种具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的合成方法，该合成方法包括，a）当寡核苷酸链底物为单条时，将上述核苷单体类似物，或上述的核苷酸单体类似物，连接至寡核苷酸链底物的3’端，获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；

或b）当寡核苷酸链底物为两条时，寡核苷酸链底物包括第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物；其中，第一寡核苷酸链底物的3’端连接有上述的核苷单体类似物，或上述的核苷酸单体类似物；将第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物连接，获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。

进一步地，寡核苷酸链底物包括由天然核苷酸组成的天然寡核苷酸链，或含有非天然核苷酸的非天然寡核苷酸链。

进一步地，非天然寡核苷酸链由非天然核苷酸组成。

进一步地，当核苷单体类似物的R2为羟基、单磷酸、二磷酸或硫代修饰的磷酸时，合成方法包括：a-1）将核苷单体类似物和多聚磷酸盐混合，利用磷酸激酶催化，形成R2为三磷酸的核苷单体类似物；当寡核苷酸链底物为单条时，利用聚合酶催化R2为三磷酸的核苷单体类似物，连接至寡核苷酸链底物的3’端，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；b-1）当寡核苷酸链底物为两条时，其中，第一寡核苷酸链底物的3’端上连接有上述的核苷单体类似物，利用连接酶催化第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物连接，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；其中，磷酸激酶包括乙酸激酶、丙酮酸激酶、腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶、核苷激酶或核苷二磷酸激酶中的一种或多种。

进一步地，当核苷单体类似物的R2为三磷酸时，合成方法包括：a-2）当寡核苷酸链底物为单条时，利用聚合酶催化R2为三磷酸的核苷单体类似物连接至寡核苷酸链底物的3’端，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；b-2）当寡核苷酸链底物为两条时，其中，第一寡核苷酸链底物的3’端上连接有的核苷单体类似物，利用连接酶催化第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物连接，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。

进一步地，合成方法包括：a-3）当寡核苷酸链底物为单条时，利用聚合酶催化核苷酸单体类似物连接至寡核苷酸链底物的3’端，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；

b-3）当寡核苷酸链底物为两条时，其中，第一寡核苷酸链底物的3’端上连接有上述核苷酸单体类似物，利用连接酶催化第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物连接，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。

进一步地，聚合酶包括PUP聚合酶；连接酶包括T4连接酶。

根据本申请的第四个方面，提供了一种寡核苷酸的制备方法，该制备方法包括：脱除上述任一种的合成方法合成的具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的3’端的可逆修饰端，获得寡核苷酸。

进一步地，脱除包括：将具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸和第一溶液混合，获得混合体系，利用混合体系实现3’端可逆修饰端的脱除。

进一步地，混合体系的pH为4~6，将混合体系在温度为20~40℃下维持5~10min，从而实现3’端可逆修饰端的脱除。

进一步地，第一溶液包括如下任意一种或多种：盐酸、硫酸、磷酸、磷酸氢二钠，磷酸氢二钾、柠檬酸或硼酸。

进一步地，第一溶液中的溶质的浓度为0.01mM~10M。

根据本申请的第五个方面，提供了一种上述任一种核苷单体类似物，或上述任一种核苷酸单体类似物，或上述任一种的具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的合成方法，或上述任一种的寡核苷酸的制备方法，在制备寡核苷酸中的应用。

应用本发明的技术方案，利用具有式I结构的核苷单体类似物，能够使得3’可逆修饰端连接至寡核苷酸链中，成功合成具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸，且相较于现有技术中常用的可逆封端，活性更高，底物转化率更高，进一步脱除该可逆修饰后合成目标寡核苷酸。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明实施例11的反应体系1连接磷酸的两种产物UPLC检测结果示意图。

图2示出了根据本发明实施例12的连接核苷单体的产物UPLC检测结果示意图。

图3示出了根据本发明实施例12的脱除3’端可逆封闭端的产物UPLC检测结果示意图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

术语解释：

核苷：碱基（嘌呤或嘧啶碱）与五碳糖（包括但不限于核糖或脱氧核糖）缩合而成的化合物，核苷中不含有磷酸。

核苷酸：碱基（嘌呤或嘧啶碱）、五碳糖（包括但不限于核糖或脱氧核糖）和磷酸组合形成的，包括核苷一磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸。

核苷单体：本申请中指长度为1nt的单核苷。

核苷酸单体：本申请中指长度为1nt的单核苷酸。

如背景技术所提到的，在现有技术中寡核苷酸的3’端可逆阻断基团活性较低，导致与寡核苷酸链的连接效率低下，使得目标寡核苷酸的合成受阻。因而，在本申请中发明人尝试开发一种新的核苷单体，能够通过酶法将3’端可逆阻断基团与寡核苷酸连接，底物的转化率得到了提高，与现有技术的可逆阻断封端相比活性更高，提出了本申请的一系列保护方案。

在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种核苷单体类似物，该核苷单体类似物的结构式如式I所示；

式I；

其中，R为碱基；R1包括甲氧基、甲氧乙基、氟、羟基或氢中的一种或多种；R2包括羟基、单磷酸、二磷酸、三磷酸或硫代修饰的磷酸中的一种或多种；R3包括甲基、乙基、丙基或异丙基中的一种或多种。

核苷单体类似物包括核苷单体类似物以及核苷酸单体类似物；当R2处的基团为单磷酸、二磷酸、三磷酸或硫代修饰的磷酸时，该核苷单体为核苷酸单体类似物；当R2处的基团为羟基时，该核苷单体为核苷单体类似物。

现有技术中酶法合成的寡核苷酸的体系中，在本申请的前期研究发现对于某些特定的反应，反应的效率与3’端可逆封端有关联现象，导致常用的封端活性较差，底物转化率较低，后续难以合成目标寡核苷酸。

本申请利用式I所示的结构式的核苷单体类似物能够在酶法合成寡核苷酸的体系中与寡核苷酸链底物偶联，使其3’端成功连接可逆封闭端，且底物的转化率高。在合成寡核苷酸时发挥作用，防止错误序列的连接，且后续利用简单的酸解法即可去除，脱除了基团的寡核苷酸产物可作为下一轮偶联核苷单体的寡核苷酸链底物，实现了酶法特异性合成特定序列的目标寡核苷酸。

即本申请开发了一种与现有技术不同的新的可逆封端，当反应中存在上述的与3’端可逆封端存在关联而导致的底物转化率低的现象时，本申请提供了多种可逆封端的选择，能够克服该种关联现象，有助于合成各种类型的目标寡核苷酸。当上述核苷单体类似物的R2基团为三磷酸基团时，该核苷单体为核苷酸单体类似物，其结构式如式III所示。在聚合酶的催化作用下，以单条寡核苷酸链底物为模板，式III所示的核苷酸单体能够直接与寡核苷酸链底物偶联，合成具有3’端可逆封闭端的寡核苷酸。

式III。

在一种优选的实施例中，碱基包括天然碱基或非天然碱基。天然碱基包括天然腺嘌呤、天然鸟嘌呤、天然胞嘧啶、天然胸腺嘧啶或天然尿嘧啶；非天然碱基包括3-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-叠氮腺嘌呤、2-硫代胸苷、5-羧酰胺尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、C7修饰的脱氮腺嘌呤、C7修饰的脱氮鸟嘌呤、C5修饰的胞嘧啶或C5修饰的尿嘧啶中的一种或多种，其中，所述修饰包括甲基修饰、H修饰、Cl修饰或F修饰中的一种或多种。

在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种核苷酸单体类似物，该核苷酸类似物的结构式如式II所示：

式II；

其中，R为碱基；R4包括甲氧基、甲氧乙基、氟、羟基或氢中的一种或多种；R5包括甲基、乙基、丙基或异丙基中的一种或多种；R6包括羟基或巯基。

利用本申请中如式II所示的核苷酸单体类似物，能够合成具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。在单条寡核苷酸链底物的情况下，将上述核苷酸单体类似物与聚合酶混合，以该寡核苷酸链为合成链，催化该核苷酸单体偶联至寡核苷酸链上，即可获得3’端具有可逆修饰端的寡核苷酸，继而进一步合成目标寡核苷酸。

或是在两条寡核苷酸链底物的情况下，其中一条底物的3’端连接有上述的核苷酸单体类似物，另一条3’端不含上述的核苷酸单体，利用连接酶可催化两条底物之间形成磷酸二酯键连接，最终能够形成一条3’端具有可逆修饰端的寡核苷酸，继而进一步合成目标寡核苷酸。上述两种方法操作简单，均能够一步合成3’端带有可逆修饰基团的寡核苷酸，且容易脱除，有利于进行目标寡核苷酸的合成。

在一种优选的实施例中，碱基包括天然碱基或非天然碱基；天然碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；非天然碱基包括3-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-叠氮腺嘌呤、2-硫代胸苷、5-羧酰胺尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、C7修饰的脱氮腺嘌呤、C7修饰的脱氮鸟嘌呤、C5修饰的胞嘧啶或C5修饰的尿嘧啶中的一种或多种，其中，修饰包括甲基修饰、H修饰、Cl修饰、F修饰。

在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的合成方法，该合成方法包括，a）当寡核苷酸链底物为单条时，将上述核苷单体类似物，或上述的核苷酸单体类似物，连接至寡核苷酸链底物的3’端，获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；

或b）当寡核苷酸链底物为两条时，寡核苷酸链底物包括第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物；其中，第一寡核苷酸链底物的3’端连接有上述的核苷单体类似物，或上述的核苷酸单体类似物；将第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物连接，获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。

当寡核苷酸链底物为两条时，其中一条寡核苷酸链底物的3’端的最后一个核苷单体连接有可逆封端，即上述的第一寡核苷酸链底物，该核苷单体与其前面剩余部分的寡核苷酸链通过磷酸酯键相连，其可逆封端可通过本申请的方法或化学合成法等或其他本领域技术人员知悉的手段连接至寡核苷酸链底物的3’端均可，本领域技术人员可根据实际需求灵活选用。

在连接酶的催化作用下，上述的3’端连接有可逆封端的第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物连接，获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。

在一种优选的实施例中，寡核苷酸链底物包括由天然核苷酸组成的天然寡核苷酸链，或含有非天然核苷酸的非天然寡核苷酸链。

在一种优选的实施例中，非天然寡核苷酸链由非天然核苷酸组成。

非天然核苷酸（xeno-nucleic acid，XNA）是一类具有非天然骨架或核酸碱基的核酸分子，优选地，非天然核苷酸包括：具有如下一种或多种修饰的核糖核苷酸：核糖2’位修饰、核糖骨架修饰、碱基修饰或磷酸骨架修饰；优选地，核糖2’位修饰包括2’-甲氧基修饰、2’-氟修饰、2’-氢修饰、2’-甲氧乙基修饰、2’-FANA修饰、锁核酸修饰或己糖醇核酸修饰；优选地，核糖骨架修饰包括将核苷酸中的核糖替换为ribuloNA、TNA、tPhoNA或dXNA；优选地，碱基修饰包括脱氮腺嘌呤C7修饰、脱氮鸟苷C7修饰、胞嘧啶C5修饰或尿苷C5修饰；磷酸骨架修饰包括PS修饰。

在一种优选的实施例中，当核苷单体类似物的R2为羟基、单磷酸、二磷酸或硫代修饰的磷酸时，合成方法包括：将核苷单体类似物和多聚磷酸盐混合，利用磷酸激酶催化，形成R2为三磷酸的核苷单体类似物；a-1）当寡核苷酸链底物为单条时，利用聚合酶催化R2为三磷酸的核苷单体类似物，连接至寡核苷酸链底物的3’端，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；b-1）当寡核苷酸链底物为两条时，其中，第一寡核苷酸链底物的3’端上连接有上述的核苷单体类似物，利用连接酶催化第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物连接，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；磷酸激酶包括乙酸激酶、丙酮酸激酶、腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶、核苷激酶或核苷二磷酸激酶中的一种或多种。当上述核苷单体类似物的R2为羟基、单磷酸，二磷酸或硫代修饰的磷酸中的一种或多种时，利用多聚磷酸激酶，使得该核苷单体类似物的R2端与磷酸连接，形成R2具有三个磷酸的核苷单体类似物。

寡核苷酸链底物上述的合成方法包括：将上述R2为羟基、单磷酸，二磷酸或硫代修饰的磷酸中的一种或多种的核苷单体类似物与磷酸供体、Tris-HCl、MgCl2混合，反应体系的pH值维持在6~9，并加入激酶，在0~80℃下反应0.1~100h，反应结束后加入反应体系1倍体积的乙腈失活酶，离心后的上清液中含有R2具有三个磷酸的核苷单体。

将该含有R2具有三个磷酸的核苷单体的体系、寡核苷酸链底物、Tris-HCl、MnCl2、NaCl混合，反应体系的pH值维持在6~9，加入聚合酶，在0~100℃下反应0.1~100h，反应结束后加入反应体系1倍体积的乙腈失活酶，离心后的上清液中含有具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。

在一种优选的实施例中，当核苷单体类似物的R2为三磷酸时，合成方法包括：a-2）当寡核苷酸链底物为单条时，利用聚合酶催化R2为三磷酸的核苷单体类似物连接至寡核苷酸链底物的3’端，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；b-2）当寡核苷酸链底物为两条时，其中，第一寡核苷酸链底物的3’端上连接有上述的核苷单体类似物，利用连接酶催化第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物连接，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。

当上述核苷单体类似物的R2为三磷酸，该核苷单体能够直接与聚合酶、寡核苷酸链底物混合发生反应，偶联至寡核苷酸链底物上，一步实现具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的合成。

一些优选的实施例中，合成方法包括：当寡核苷酸链底物为单条时，将R2具有三个磷酸的核苷单体类似物、寡核苷酸链底物、Tris-HCl、MnCl2、NaCl混合，反应体系的pH值维持在6~9，加入聚合酶，在1~100℃下反应0.1~100h，反应结束后加入反应体系1倍体积的乙腈失活酶，离心后的上清液中含有具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。

当寡核苷酸链底物为两条时，其中，第一寡核苷酸链底物的3’端连接有上述的R2具有三个磷酸的核苷单体类似物；将第一寡核苷酸链底物、第二寡核苷酸链底物、RNA连接酶、MgCl2，ATP，Tris-HCl混合，反应体系pH维持在7~7.8，1~50℃温育1~50h：反应结束后加入反应体系1倍体积的乙腈失活酶，离心后的上清液中含有具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。

在一种优选的实施例中，合成方法包括：

a-3）当寡核苷酸链底物为单条时，利用聚合酶催化核苷酸单体类似物连接至寡核苷酸链底物的3’端，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；

b-3）当寡核苷酸链底物为两条时，其中，第一寡核苷酸链底物的3’端上连接有上述核苷酸单体类似物，利用连接酶催化第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物连接，从而获得具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。

本申请中核苷酸单体类似物参与的具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的合成方法，如上述的本申请核苷单体类似物的R2为三磷酸时的合成方法。

在一种优选的实施例中，聚合酶包括PUP聚合酶；连接酶包括T4连接酶。

上述PUP聚合酶来源于裂殖酵母NCBI登录号为NP_594901.1；上述T4连接酶来源于Escherichia phage T4，NCBI登录号为NP_049790.1。

聚合酶是将带有封端的核苷单体添加至核酸链的3’端，从而使延长后的核酸链具有3‘可逆封端。连接酶是将带有封端的寡核苷酸短链添加至核酸链的3’端，形成延长后的寡核酸链具有3’可逆封端。

在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种寡核苷酸的制备方法，该制备方法包括：将利用上述的合成方法，合成的具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的3’端的可逆修饰端脱除，获得寡核苷酸。

利用本申请的合成方法，合成的具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸，能在后续通过简单的酸解进行脱除，从而实现可逆的修饰。脱去3’端修饰端的寡核苷酸还可用作下一轮与核苷单体偶联的底物。利用本申请的核苷单体类似物或核苷酸单体类似物能够实现寡核苷酸3’端的可逆修饰，够实现酶法特异性合成特定序列的目标寡核苷酸。

在一种优选的实施例中，脱除包括：将具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸和第一溶液混合，获得混合体系，利用混合体系实现3’端可逆修饰端的脱除。

在一种优选的实施例中，混合体系的pH为4~6，将混合体系在温度为20~40℃下维持5~10min，从而实现3’端可逆修饰端的脱除。脱除的条件包括pH为4~6，包括但不限于4、5、或6；温度为20~40℃，包括但不限于20℃、25℃、30℃、35℃或40℃，时间为5~10min，包括但不限于5、6、7、8、9或10min。

在一种优选的实施例中，第一溶液包括如下任意一种或多种：盐酸、硫酸、磷酸、磷酸氢二钠，磷酸氢二钾、柠檬酸或硼酸。

在一种优选的实施例中，第一溶液中的溶质的浓度为0.01mM~10M。

本申请利用简单的酸解即可实现寡核苷酸链上偶联的核苷单体3’端可逆修饰端脱除，通过控制脱除的酸解反应的条件，能够促进该可逆修饰端的有效脱除，便于后续目标寡核苷酸的合成。

在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种上述任一种核苷单体，或上述任一种具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的合成方法，或上述任一种的寡核苷酸的制备方法，在制备寡核苷酸中的应用。

下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。

除特殊说明外，本申请实施例中的试剂均为常规市售产品。

实施例1

在干净的容器中加入反应体系，使得寡核苷酸链底物为50 µM，加入PUP聚合酶（来源于裂殖酵母PUP聚合酶，NCBI登录号为NP_594901.1）使其浓度为0.2mg/mL，加入10mMMnCl2，50mM NaCl，50mM Tris-HCl，调节pH为8.0，加入核苷单体类似物使其浓度为700µM，本实施例的核苷单体类似物的结构式如下所示：

；

于37℃反应2h后，加入反应体系的1倍体积的乙腈失活酶，并于12000rpm离心去除变性的蛋白，上清液进行UPLC检测。

本实施例的寡核苷酸链底物分别为底物1、底物2和底物3（SEQ ID NO：1），其序列和其经过合成连接核苷单体类似物的上清液经UPLC检测的结果如表1所示。

本实施例UPLC检测结果显示，不同的寡核苷酸链底物的3’端均偶联了1个核苷单体类似物，表明上述结构式所示的核苷单体类似物能够应用于酶法合成寡核苷酸。

表1

表1中，“++++”表示检测到产物，转化率为0.1%~30%；“+++++”表示检测到产物，转化率为30%~90%。

本申请A、C、G或U后的“m”表示对于该核糖核苷酸的2’甲氧基修饰，“f”表示对于该核糖核苷酸的2’氟代修饰，“s”表示对于该核糖核苷酸的5’磷酸的硫代修饰。

实施例2

在干净的容器中加入反应体系，使得2个寡核苷酸链底物片段为50 mM，本实施例的2个寡核苷酸底物链底物片段如下结构式所示，其中，第一寡核苷酸链底物片段的3’OH端连接有本申请的可逆封闭修饰端（核苷单体类似物），即以下结构式中框起的部分：

第一寡核苷酸链底物片段：

；

第二寡核苷酸链底物片段：

。

加入RNA连接酶（来源于Escherichia phage T4，NCBI登录号为NP_049790.1）使其浓度为0.2mg/mL，加入10mM MgCl2，250mM ATP，50mM Tris-HCl，调节pH为7.5，16℃温育16h：加入反应体系的1倍体积的乙腈失活酶，并于12000rpm离心去除变性的蛋白，上清液进行LCMS检测。

由于第一寡核苷酸片段的3’OH端带有可逆封端修饰，因此理论上仅能检测到2618.83±2的分子量，而不能检测到2个至多个一寡核苷酸片段相连产品的分子量。经过质谱的检测，仅检测到了2618.79的分子量，表明‘连接成功。

实施例3

在干净的容器中加入反应体系，使得寡核苷酸链底物（5’HO-Cms-Ams-Gm-Am-3’OH，即实施例1中的底物1）为50 µM，加入PUP聚合酶使其浓度为0.2mg/mL，加入10mM MnCl2，50mM NaCl，50mM Tris-HCl，调节pH为8.0，加入核苷酸单体类似物使其浓度为700µM，本实施例的核苷单体类似物的结构式如下所示：

；

于37℃反应4h后，加入反应体系的1倍体积的乙腈失活酶，并于12000rpm离心去除变性的蛋白，上清液进行UPLC检测。检测到3’端偶联了1个核苷单体的寡核苷酸的产物，转化率20%，表明本实施例的核苷单体类似物能应用于酶法合成寡核苷酸。

实施例4

在干净的容器中加入反应体系，使得寡核苷酸链底物（5’HO-Cms-Ams-Gm-Am-3’OH，即实施例1中的底物1）为50 µM，加入PUP聚合酶使其浓度为0.2mg/mL，加入10mM MnCl2，50mM NaCl，50mM Tris-HCl，调节pH为8.0，加入核苷酸单体类似物使其浓度为700µM，本实施例的核苷单体类似物的结构式如下所示：

；

于37℃反应4h后，加入反应体系的1倍体积的乙腈失活酶，并于12000rpm离心去除变性的蛋白，上清液进行UPLC检测。检测到3’端偶联了1个核苷单体类似物的寡核苷酸的产物，转化率9%，表明本实施例的核苷单体类似物能应用于酶法合成寡核苷酸。

实施例5

在干净的容器中加入反应体系，使得寡核苷酸链底物（5’HO-Cms-Ams-Gm-Am-3’OH，即实施例1中的底物1）为50 µM，加入PUP聚合酶使其浓度为0.2mg/mL，加入10mM MnCl2，50mM NaCl，50mM Tris-HCl，调节pH为8.0，加入核苷酸单体类似物使其浓度为700µM，本实施例的核苷单体类似物的结构式如下所示：

；

于37℃反应4h后，加入反应体系的1倍体积的乙腈失活酶，并于12000rpm离心去除变性的蛋白，上清液进行UPLC检测。检测到3’端偶联了1个核苷单体类似物的寡核苷酸的产物，转化率1%，表明本实施例的核苷酸单体类似物能应用于酶法合成寡核苷酸。

实施例6

在干净的容器中加入反应体系，使得寡核苷酸链底物（SEQ ID NO: 1）为50 µM，加入PUP聚合酶使其浓度为0.2mg/mL，加入10mM MnCl2，50mM NaCl，50mM Tris-HCl，调节pH为8.0，加入核苷酸单体类似物使其浓度为700µM，本实施例的核苷单体类似物的结构式如下所示：

；

于37℃反应2h后，加入反应体系的1倍体积的乙腈失活酶，并于12000rpm离心去除变性的蛋白，上清液进行UPLC检测。检测到3’端偶联了1个核苷单体类似物的寡核苷酸的产物，转化率43%，表明本实施例的核苷单体类似物能应用于酶法合成寡核苷酸。

实施例7

在干净的容器中加入反应体系，使得寡核苷酸链底物（5’HO-Cms-Ams-Gm-Am-3’OH，即实施例1中的底物1）为50 µM，加入PUP聚合酶使其浓度为0.2mg/mL，加入10mM MnCl2，50mM NaCl，50mM Tris-HCl，调节pH为8.0，加入核苷酸单体类似物使其浓度为700µM，本实施例的核苷单体类似物的结构式如下所示：

；

于37℃反应16h后，加入反应体系的1倍体积的乙腈失活酶，并于12000rpm离心去除变性的蛋白，上清液进行UPLC检测。检测到3’端偶联了1个核苷单体类似物的寡核苷酸的产物，转化率0.6%，表明本实施例的核苷单体类似物能应用于酶法合成寡核苷酸。

实施例8

在干净的容器中加入反应体系，使得寡核苷酸链底物（SEQ ID NO: 1）为50 µM，加入PUP聚合酶使其浓度为0.2mg/mL，加入10mM MnCl2，50mM NaCl，50mM Tris-HCl，调节pH为8.0，加入核苷酸单体类似物使其浓度为700µM，本实施例的核苷单体类似物的结构式如下所示：

；

于37℃反应1h后，加入反应体系的1倍体积的乙腈失活酶，并于12000rpm离心去除变性的蛋白，上清液进行UPLC检测。检测到3’端偶联了1个核苷单体类似物的寡核苷酸的产物，转化率83%，表明本实施例的核苷单体类似物能应用于酶法合成寡核苷酸。

实施例9

在干净的容器中加入反应体系，使得寡核苷酸链底物（5’HO-Cms-Ams-Gm-Am-3’OH，即实施例1中的底物1）为50 µM，加入PUP聚合酶使其浓度为0.2mg/mL，加入10mM MnCl2，50mM NaCl，50mM Tris-HCl，调节pH为8.0，加入核苷单体类似物使其浓度为700µM，本实施例的核苷单体类似物的结构式如下所示：

；

于37℃反应2h后，加入反应体系的1倍体积的乙腈失活酶，并于12000rpm离心去除变性的蛋白，上清液进行MS检测，结果能检测到1693.3的产品分子量，为寡核苷酸链底物偶联1分子的核苷单体类似物，未检测到偶联2个或多个核苷单体的产物。如式所示的核苷单体进行了有效的封端。

实施例10

本实施例的核苷单体包括如下所示的三种核苷酸单体类似物：

第一核苷单体类似物；

第二核苷单体类似物；

第三核苷单体类似物；

分别在三个干净的容器中加入反应体系，使得寡核苷酸链底物（5’HO-Cms-Ams-Gm-Am-3’OH，即实施例1中的底物1）为50 µM，加入聚合酶使其浓度为0.2mg/mL，加入10mMMnCl2，50mM NaCl，50mM Tris-HCl，调节pH为8.0，分别加入上述三种核苷酸单体类似物使其浓度为700µM。

于37℃反应16h后，加入反应体系的1倍体积的乙腈失活酶，并于12000rpm离心去除变性的蛋白，上清液进行质谱检测。

三个反应体系合成的寡核苷酸的理论产物分子量分别为1706.53，1720.37，1720.37，经过质谱检测分别检测到了1705.17，1719.42，1719.40的分子量的峰，表明上述结构式所示的三种核苷单体能够应用于酶法合成寡核苷酸。

实施例11

在干净的容器中，加入核苷单体类似物，使其浓度为2000µM，即反应体系1，本实施例的核苷单体类似物如下式所示：

；

在反应体系1中继续加入15mM MnCl2，0.5mg/ml (NaPO3)6，100mM Tris-HCl，调节pH为8.0，加入多聚磷酸激酶（该多聚磷酸激酶来源于Meiothermus ruber，PDB: 5LC9），使其浓度为0.5mg/mL，于30℃反应16h后，反应样品加入1倍体积的乙腈失活酶，并于12000rpm离心去除变性的蛋白，使用UPLC检测转化情况，UPLC结果示意图如图1所示，检测到本体系产生的两种产物1和产物2以及本申请的核苷单体类似物。

在干净的容器中加入反应体系2，使得寡核苷酸链底物（5’HO-Cms-Ams-Gm-Am-3’OH，即实施例1中的底物1）为50 µM，加入PUP聚合酶使其浓度为0.2mg/mL，加入10mM MnCl2，50mM NaCl，50mM Tris-HCl，调节pH为8.0，加入上述的反应体系1，使得反应体系2浓度为700µM，于37℃反应2h后，加入反应体系的1倍体积的乙腈失活酶，并于12000rpm离心去除变性的蛋白，上清液进行UPLC检测，检测到偶联了一个产物2的寡核苷链的目标产品的生成，表明本实施例的核苷单体能应用于酶法合成寡核苷酸。

实施例12

在干净的容器中加入反应体系，使得寡核苷酸链底物（5’HO-Cms-Ams-Gm-Am-3’OH，即实施例1中的底物1）为50 µM，加入PUP聚合酶使其浓度为0.2mg/mL，加入10mM MnCl2，50mM NaCl，50mM Tris-HCl，调节pH为8.0，加入结构式如下所示的35µM第四核苷单体类似物和665µM第五核苷单体类似物（现有封端，3’端为-NH2）：

第四核苷单体类似物；

第五核苷单体类似物；

于37℃反应16h后，加入反应体系的1倍体积的乙腈失活酶，并于12000rpm离心去除变性的蛋白，上清液进行UPLC检测。检测到寡核苷酸链底物仅剩余6%，生成了28%的偶联一个第五核苷单体类似物的寡核苷酸产物，生成了36%偶联一个第四核苷单体类似物的寡核苷酸产物，UPLC检测结果图如图2所示。聚合酶PUP对第四核苷单体类似物的偶联效率更高，远超过对现有封端的第五核苷单体类似物的偶联效率。

在以上反应体系中加入1M NaOAc和0.7M NaNO2，调节pH为4~6，30℃温育5~10min，以脱去核苷单体类似物上的3’端的修饰基团，反应后溶液送UPLC检测，结果如图3所示。表明第四修饰单体具有较好的聚合酶催化活性，同时可有效的进行脱除，实现寡核苷酸的可逆修饰。脱除了可逆修饰基团的寡核苷酸可作为下一轮偶联核苷单体的寡核苷酸链底物。

实施例13

在干净的容器中加入反应体系，使得寡核苷酸链底物（5’HO-Ams-Cfs-Am-Af-Af-3’OH，即实施例1中的底物2）为50 µM，加入PUP聚合酶使其浓度为0.2mg/mL，加入10mMMnCl2，50mM NaCl，50mM Tris-HCl，调节pH为8.0，加入第五核苷单体类似物（现有封端，3’端为-NH2）使其浓度为300µM，加入第四核苷单体类似物使其浓度为300µM，结构式如下所示：

第四核苷单体类似物；；

第五核苷单体类似物；；

于37℃反应2h后，加入反应体系的1倍体积的乙腈失活酶，并于12000rpm离心去除变性的蛋白，上清液进行UPLC检测，结果能检测到67%的第四核苷单体类似物2的产品生成，30%的偶联第五核苷单体类似物的产品生成。聚合酶PUP对第四核苷单体类似物的偶联效率更高，远超过对现有封端的第五核苷单体类似物的偶联效率。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：利用本申请的核苷单体，在酶法合成的体系下能够使得寡核苷酸链底物的3’端连接可逆封闭端，且在后续利用简单的酸解便能够将该可逆封闭端有效脱除，该脱除了可逆修饰基团的寡核苷酸可作为下一轮偶联核苷单体的寡核苷酸链底物，证明利用本申请的核苷单体可以实现酶法特异性合成特定序列的目标寡核苷酸。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种核苷单体类似物，其特征在于，所述核苷单体类似物的结构式如式I所示；

式I；

其中，R为碱基；

R₁包括甲氧基、甲氧乙基、氟、羟基或氢中的一种或多种；

R₂包括羟基、单磷酸、二磷酸、三磷酸或硫代修饰的磷酸中的一种或多种；

R₃包括甲基、乙基、丙基或异丙基中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的核苷单体类似物，其特征在于，所述碱基包括天然碱基或非天然碱基；

所述天然碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；

所述非天然碱基包括3-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-叠氮腺嘌呤、2-硫代胸苷、5-羧酰胺尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、C7修饰的脱氮腺嘌呤、C7修饰的脱氮鸟嘌呤、C5修饰的胞嘧啶或C5修饰的尿嘧啶中的一种或多种；

其中，所述修饰包括甲基修饰、H修饰、Cl修饰或F修饰中的一种或多种。

3.一种核苷酸单体类似物，其特征在于，所述核苷酸类似物的结构式如式II所示：

式II；

其中，R为碱基；

R₄包括甲氧基、甲氧乙基、氟、羟基或氢中的一种或多种；

R₅包括甲基、乙基、丙基或异丙基中的一种或多种；

R₆包括羟基或巯基。

4.根据权利要求3所述的核苷酸单体类似物，其特征在于，所述碱基包括天然碱基或非天然碱基；

所述天然碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶；

所述非天然碱基包括3-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-叠氮腺嘌呤、2-硫代胸苷、5-羧酰胺尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、C7修饰的脱氮腺嘌呤、C7修饰的脱氮鸟嘌呤、C5修饰的胞嘧啶或C5修饰的尿嘧啶中的一种或多种；

其中，所述修饰包括甲基修饰、H修饰、Cl修饰或F修饰中的一种或多种。

5.一种具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括：

a）当寡核苷酸链底物为单条时，将权利要求1~2中任一项所述的核苷单体类似物，或权利要求3~4中任一项所述的核苷酸单体类似物，连接至所述寡核苷酸链底物的3’端，获得所述具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；

或

b）当所述寡核苷酸链底物为两条时，所述寡核苷酸链底物包括第一寡核苷酸链底物和第二寡核苷酸链底物；其中，所述第一寡核苷酸链底物的3’端连接有权利要求1~2中任一项所述的核苷单体类似物，或权利要求3~4中任一项所述的核苷酸单体类似物；

将所述第一寡核苷酸链底物和所述第二寡核苷酸链底物连接，获得所述具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。

6.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述寡核苷酸链底物包括由天然核苷酸组成的天然寡核苷酸链，或含有非天然核苷酸的非天然寡核苷酸链。

7.根据权利要求5中任一项所述的合成方法，其特征在于，当所述核苷单体类似物的R₂为羟基、单磷酸、二磷酸或硫代修饰的磷酸时，所述合成方法包括：

a-1）将所述核苷单体类似物和多聚磷酸盐混合，利用磷酸激酶催化，形成R₂为三磷酸的所述核苷单体类似物；

当所述寡核苷酸链底物为单条时，利用聚合酶催化所述R₂为三磷酸的核苷单体类似物，连接至所述寡核苷酸链底物的3’端，从而获得所述具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸；

其中，所述磷酸激酶包括乙酸激酶、丙酮酸激酶、腺苷酸激酶、多聚磷酸激酶、核苷激酶或核苷二磷酸激酶中的一种或多种。

8.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，当所述核苷单体类似物的R₂为三磷酸时，所述合成方法包括：

a-2）当所述寡核苷酸链底物为单条时，利用聚合酶催化所述R₂为三磷酸的所述核苷单体类似物连接至所述寡核苷酸链底物的3’端，从而获得所述具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。

9.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括：

a-3）当所述寡核苷酸链底物为单条时，利用聚合酶催化权利要求3~4中任一项所述的核苷酸单体类似物连接至所述寡核苷酸链底物的3’端，从而获得所述具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸。

10.根据权利要求7~9中任一项所述的合成方法，其特征在于，所述聚合酶包括PUP聚合酶；

所述连接酶包括RNA连接酶或DNA连接酶。

11.一种寡核苷酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：脱除权利要求5~10中任一项所述的合成方法合成的具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的3’端的所述可逆修饰端，获得所述寡核苷酸。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述脱除包括：

将所述具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸和第一溶液混合，得到混合体系，

利用所述混合体系实现所述3’端可逆修饰端的脱除。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述混合体系的pH为4~6，将所述混合体系在温度为20~40℃下维持5~10min，从而实现所述3’端可逆修饰端的脱除。

14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述第一溶液包括如下任意一种或多种溶液：盐酸、硫酸、磷酸、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、柠檬酸或硼酸。

15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述第一溶液中的溶质的浓度为0.01mM~10M。

16.权利要求1~2中任一项所述的核苷单体类似物、或权利要求3~4中任一项所述的核苷酸单体类似物、或权利要求5~10中任一项所述的具有3’端可逆修饰端的寡核苷酸的合成方法、或权利要求11~15中任一项所述的寡核苷酸的制备方法在制备寡核苷酸中的应用。