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TW202405168A - 製造含有寡核苷酸之聚核苷酸的新穎方法 - Google Patents

製造含有寡核苷酸之聚核苷酸的新穎方法 Download PDF

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TW202405168A
TW202405168A TW112112971A TW112112971A TW202405168A TW 202405168 A TW202405168 A TW 202405168A TW 112112971 A TW112112971 A TW 112112971A TW 112112971 A TW112112971 A TW 112112971A TW 202405168 A TW202405168 A TW 202405168A
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安卓司 克雷梅里
道格拉斯 福爾斯特
喬瑟夫 荷斯佛德
大衛 張
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英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產發展有限公司
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Abstract

本發明係關於使用酶製造聚核苷酸或寡核苷酸之新穎方法，其中該等方法適用於製造經修飾之聚核苷酸或寡核苷酸，諸如用於療法中者。

Description

製造含有寡核苷酸之聚核苷酸的新穎方法
本發明係關於使用聚合酶及連接酶製造包括寡核苷酸之聚核苷酸之新穎方法，其中該等方法適合用於製造經修飾之聚核苷酸，包括經修飾之寡核苷酸，諸如用於療法中之聚核苷酸/寡核苷酸。
經由例如胺基亞磷酸酯化學方法進行聚核苷酸及經修飾之聚核苷酸，尤其寡核苷酸及經修飾之寡核苷酸之化學合成沿用已久，且數十年來為合成此等確定序列生物聚合物的首選方法。合成方法通常作為固體負載合成(通常稱為固相合成)運行，其中依序添加單一核苷酸，各核苷酸之添加需要數個化學步驟之循環來添加且將生長中的寡核苷酸(「寡核苷酸(oligo)」)脫除保護基，以為後續步驟作準備。在核苷酸依序添加結束時，寡核苷酸自固相載體釋放，進行進一步脫除保護基，且隨後粗寡核苷酸藉由管柱層析進一步純化。
雖然此方法可視為常規的且可自動化，但此方法存在若干缺點，尤其若目標為大規模地製備寡核苷酸及聚核苷酸，如寡核苷酸治療劑(諸如反義分子，包括間隔體、siRNA、miRNA及適體)及聚核苷酸治療劑(諸如治療性mRNA)所需。此等缺點包括固體負載化學方法的規模擴大侷限性限制分批大小，及使用層析純化大量寡核苷酸之實踐侷限性。此等侷限性使得規模擴大昂貴且冗長，需要多輪合成。另外，誤差隨著所合成之寡核苷酸或聚核苷酸之長度而累積，對較長寡核苷酸及聚核苷酸產物之規模擴大導致進一步實踐侷限性。
因此，需要減少或理想地消除化學合成及固體負載合成兩者，且進行可有效、有成本效益且在更大規模下運作的合成以製造寡核苷酸及較長聚核苷酸，同時使序列中之誤差降至最低。
WO2018/011067揭示一種新穎的連接方法，其中使用互補模板及連接方法以定向方式將寡核苷酸池連接在一起。WO2019/121500揭示可用於連接方法中的在製造經修飾之寡核苷酸中使用酶，尤其單股連接酶及轉移酶的新穎方法。
使用單股連接酶及轉移酶將各核苷酸添加至鏈之方法為複雜的且必須依序進行，一次添加一個核苷酸，其中各輪需要脫除保護基步驟以促進添加，此為耗時的。池中之個別寡核苷酸隨後必須使用模板各自以正確定向彼此連接以產生最終寡核苷酸產物。此方法規模擴大至較大聚核苷酸意謂有必要藉由一次添加一個核苷酸來產生多個短寡核苷酸，該等短寡核苷酸隨後必須以正確定向連接以產生最終產物。基本上，最終產物之每一個核苷酸必須一次添加一個以產生較小寡核苷酸，該等較小寡核苷酸經連接以產生最終產物，其降低效率且需要較長製造過程。引入誤差之風險因此變得更高。因此，需要提供一種替代性及/或改良方法來降低複雜度，以提高寡核苷酸及更大聚核苷酸之製造效率，同時使產物序列中之誤差降至最低。
在本發明之第一態樣中，提供一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基的單股聚核苷酸產物的方法，其中該方法包含： a)使包含與該單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸與至少兩個片段聚核苷酸之池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸以產生其上黏接有該等至少兩個片段聚核苷酸的模板聚核苷酸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個黏接之片段聚核苷酸之間； b)使用核苷三磷酸池及聚合酶延伸該等黏接之片段聚核苷酸中之至少一者，以填充該至少一個序列缺口以產生至少一個延伸片段聚核苷酸； c)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成呈雙螺旋體形式結合於該模板聚核苷酸之該單股聚核苷酸產物；及 d)改變條件以使包含該單股聚核苷酸產物及該模板聚核苷酸之該雙螺旋體變性，藉此製造該單股聚核苷酸產物。
在本發明之第二態樣中，提供一種用於製造雙股聚核苷酸產物之方法，其中該方法包含使兩個互補單股聚核苷酸產物黏接，該等產物中之至少一者已藉由依本文所揭示之用於製造單股聚核苷酸之方法製造，視情況其中兩者均已藉由依本文所揭示之用於製造單股聚核苷酸之方法製造。
在本發明之第三態樣中，提供一種用於製造雙股聚核苷酸產物之方法，其中該方法包含： a)使包含與單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸與至少兩個片段聚核苷酸之池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸以產生其上黏接有該等至少兩個片段聚核苷酸的模板聚核苷酸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個黏接之片段聚核苷酸之間； b)使用核苷三磷酸池及聚合酶延伸該等黏接之片段聚核苷酸中之至少一者，以填充該至少一個序列缺口以產生至少一個延伸片段聚核苷酸； c)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成呈雙螺旋體形式結合於該模板聚核苷酸之該單股聚核苷酸產物； d)改變條件以使包含該單股聚核苷酸產物及該模板聚核苷酸之該雙螺旋體變性，藉此製造該單股聚核苷酸產物；及 e)使用該單股聚核苷酸產物作為步驟a)中之該模板聚核苷酸且重複步驟a)至c)以製造該雙股聚核苷酸產物。
定義依本文所使用，「聚核苷酸」意謂經由共價鍵彼此連接之兩個或更多個核苷酸單體，亦即核苷酸殘基之聚合物。單一聚核苷酸分子可例如包含14個或更多個呈鏈結構之核苷酸單體。DNA及RNA為聚核苷酸之實例。聚核苷酸包括寡核苷酸。聚核苷酸可含有無限數目之核苷酸。聚核苷酸在治療學上適用於例如產生治療性mRNA (其可用作mRNA疫苗)、反義寡核苷酸、siRNA、miRNA、適體、CRISPR嚮導RNA及寡核苷酸以募集及引導DNA及RNA編輯酶，諸如A至I RNA鹼基編輯寡核苷酸(AIMer)。
依本文所使用，術語「治療性聚核苷酸」意謂具有治療性應用，例如用於預防或治療人類或動物中之病狀或疾病的聚核苷酸。此類聚核苷酸通常含有一或多個經修飾之核苷酸殘基或鍵。治療性聚核苷酸經由若干不同機制中之一者發揮作用，包括但不限於反義、剪接-轉換或外顯子-跳讀、免疫刺激、RNA干擾(RNAi) (例如經由微小RNA (miRNA)及小干擾RNA (siRNA))及募集及引導DNA及RNA編輯酶。治療性聚核苷酸可為適體。治療性聚核苷酸將通常但未必總是具有確定序列。治療性聚核苷酸包括治療性寡核苷酸。
術語「聚核苷酸」及「治療性聚核苷酸」分別涵蓋「寡核苷酸」及「治療性寡核苷酸」。
依本文所使用，術語「寡核苷酸(oligonucleotide)」或簡稱「寡核苷酸(oligo)」意謂核苷酸殘基之聚合物。術語「寡核苷酸」通常用於比術語「聚核苷酸」更短的聚核苷酸序列，一般在3至30個核苷酸範圍內。此等可為去氧核糖核苷酸(其中所得寡核苷酸為DNA)、核糖核苷酸(其中所得寡核苷酸為RNA)、經修飾之核苷酸或其混合物。
聚核苷酸或寡核苷酸可完全由自然界中發現之核苷酸殘基(亦即「天然核苷酸」或「天然存在之核苷酸」)組成，或可含有至少一個經修飾之核苷酸，或至少一個已經修飾之核苷酸之間的鍵。天然存在之核苷酸之實例包括去氧腺苷單磷酸、去氧胞苷單磷酸、去氧鳥苷單磷酸、去氧胸苷單磷酸、去氧尿苷單磷酸、腺苷單磷酸、胞苷單磷酸、鳥苷單磷酸、胸苷單磷酸及尿苷單磷酸。經修飾之核苷酸並非天然存在之核苷酸(亦即其為非天然核苷酸)。經修飾之核苷酸可為經修飾之天然存在之核苷酸，例如經化學修飾。經修飾之核苷酸可包含經修飾之主鏈、糖及/或核鹼基。已確認某些修飾在自然界中偶爾發生，亦即在天然存在之核苷酸中，諸如2'OMe或C5嘧啶修飾，然而，在本發明中，此等修飾被視為經修飾之核苷酸。包括寡核苷酸之聚核苷酸可為單股或雙股的。本發明之聚核苷酸或寡核苷酸可與另一分子結合，例如N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)或其多個(GalNAc叢集)。
依本文所使用，術語「治療性寡核苷酸鏡」意謂具有治療性應用，例如用於預防或治療人類或動物中之病狀或疾病的寡核苷酸。此類寡核苷酸通常含有一或多個經修飾之核苷酸殘基或鍵。治療性寡核苷酸經由若干不同機制中之一者發揮作用，包括但不限於反義、剪接-轉換或外顯子-跳讀、免疫刺激及RNA干擾(RNAi)，例如經由微小RNA (miRNA)及小干擾RNA (siRNA)。A 治療性寡核苷酸可為適體。治療性寡核苷酸將通常但未必總是具有確定序列。治療性寡核苷酸為治療性聚核苷酸之實例。
依本文所使用，術語「模板」意謂包含與單股聚核苷酸或寡核苷酸產物互補之序列的聚核苷酸或寡核苷酸。模板可包含與目標(或產物)聚核苷酸或寡核苷酸之序列100%互補的序列。模板可由與目標(或產物)聚核苷酸或寡核苷酸之序列100%互補的序列組成。模板相比於產物序列可為更長序列。模板可包含不用於製造聚核苷酸或寡核苷酸產物之序列。當模板序列比產物序列更長時，可使用終止子控制聚核苷酸或寡核苷酸產物之製造及/或長度。當模板序列比產物序列更長時，可使用引子控制聚核苷酸或寡核苷酸產物之製造及/或長度。當模板序列比產物序列更長時，其可包含髮夾環。髮夾環可用作引子。模板可包含髮夾環中之片段中之一者。在此類情況下，產物可經由用核酸酶、切口酶、脫氧核酶或化學方法裂解自模板釋放。模板相比於產物序列可為更短序列。當模板為比產物序列更短的序列時，當片段與模板黏接時，至少一個片段將懸垂模板。模板可包含小於100%互補之序列或由其組成。模板序列可使得各別互補核苷酸與目標序列中之經修飾之核苷酸的未經修飾之形式互補。除非另外說明，否則依本文所使用，術語「互補」意謂100%互補。
依本文所使用，術語「產物」意謂具有特定序列及一組修飾的所需聚核苷酸或寡核苷酸，在本文中亦稱為「目標聚核苷酸」或「目標寡核苷酸」。「產物序列」與「目標聚核苷酸序列」及「目標寡核苷酸序列」可互換使用且係指產物之鹼基序列。
依本文所使用，術語「聚核苷酸或寡核苷酸之池」分別係指序列可不同、可短於目標序列且可不具有與目標序列相同之序列的聚核苷酸或寡核苷酸之群。聚核苷酸或寡核苷酸之池可為聚核苷酸或寡核苷酸合成之產物。聚核苷酸或寡核苷酸之池可包含至少兩個片段聚核苷酸或寡核苷酸。至少兩個片段聚核苷酸或寡核苷酸可為非隨機的(亦即，並非一組隨機選擇之片段聚核苷酸或寡核苷酸，而是出於形成根據本發明之方法的最終聚核苷酸產物之目的而特定設計及選擇的)。至少兩個片段聚核苷酸或寡核苷酸可為聚核苷酸或寡核苷酸產物之片段。至少兩個片段聚核苷酸或寡核苷酸之序列可不同。聚核苷酸或寡核苷酸之池可包含產物序列之片段。聚核苷酸或寡核苷酸之池可由產物序列之片段組成。聚核苷酸或寡核苷酸之池可經工程改造以特定地包含聚核苷酸或寡核苷酸產物之片段。產物序列之至少一個片段可含有至少一個經修飾之核苷酸殘基。聚核苷酸或寡核苷酸之池可為使用聚合酶(諸如DNA聚合酶或RNA聚合酶)之聚核苷酸或寡核苷酸合成的產物。一或多個或所有片段聚核苷酸或寡核苷酸可使用例如化學合成，例如固體負載或液相合成，諸如經由胺基亞磷酸酯化學方法製造，或可使用酶促合成或其組合製備。酶促合成可涉及使用聚合酶、單股連接酶及/或轉移酶或其組合。聚核苷酸或寡核苷酸之池可為使用化學合成，例如固體負載或液相合成，諸如經由胺基亞磷酸酯化學方法，或使用酶促合成或其組合的聚核苷酸或寡核苷酸合成之產物。酶促合成可涉及使用聚合酶、單股連接酶及/或轉移酶或其組合。
依本文所使用，術語「黏接」意謂互補聚核苷酸或寡核苷酸以序列特異性方式雜交，例如兩個單股聚核苷酸或寡核苷酸經由沃森與克里克鹼基配對之氫鍵配對，以形成雙股聚核苷酸或寡核苷酸(「雙螺旋體」)。「允許黏接之條件」將取決於雜交互補聚核苷酸或寡核苷酸之T m且對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的。例如，黏接之溫度可低於雜交聚核苷酸或寡核苷酸之T m。或者，黏接溫度可接近雜交聚核苷酸或寡核苷酸之T m，例如+/- 1、2或3℃。黏接溫度通常比雜交聚核苷酸或寡核苷酸之T m高不超過10℃。
依本文所使用，與雙股聚核苷酸或寡核苷酸相關之術語「變性」用於意謂互補股不再黏接，亦即，沃森與克里克鹼基配對已被破壞且股已解離。變性由於改變條件而發生，例如藉由升高溫度、改變pH或改變緩衝溶液之鹽濃度。變性條件為熟習此項技術者所熟知的。使依本文中所描述之雙股聚核苷酸或寡核苷酸變性(亦即，使雙螺旋體變性)產生單股產物或雜質聚核苷酸或寡核苷酸及單股模板聚核苷酸或寡核苷酸。
依本文所使用，術語「雜質(impurity)」或「雜質(impurities)」意謂不具有所需產物序列的聚核苷酸或寡核苷酸。此等聚核苷酸或寡核苷酸可包括比產物短(例如，短1、2、3、4、5個或更多個核苷酸殘基)或比產物長(例如，長1、2、3、4、5個或更多個核苷酸殘基)之聚核苷酸或寡核苷酸。在生產過程包括在片段之間形成鍵之步驟的情況下，雜質包括若一或多種鍵無法形成時剩餘的聚核苷酸或寡核苷酸。雜質亦包括其中已併入不正確核苷酸之聚核苷酸或寡核苷酸，從而在與模板相比時導致錯配。雜質可具有上文所描述之一或多種特徵。術語「雜質」及「雜質聚核苷酸」在本文中可互換使用。
依本文所使用，術語「片段」係較長聚核苷酸或寡核苷酸之較小部分，尤其產物或目標聚核苷酸或寡核苷酸之較小部分。對於給定產物，當其所有片段與其模板黏接時，缺口藉由聚合酶延伸填充且連接在一起，形成產物。片段可用作聚合酶之引子。片段可用作聚合酶之終止子。片段可為模板中髮夾環之一部分，隨後在聚合酶延伸後自模板裂解且為產物之一部分。
依本文所使用，術語「酶促連接」意謂兩個相鄰核苷酸之間的連接係以酶促方式(亦即藉由酶)形成。此鍵可為天然存在之磷酸二酯鍵(PO)或經修飾之鍵，包括但不限於硫代磷酸酯(PS)、胺基磷酸酯(PA)或二硫代磷酸酯(PS2)。
依本文所使用，術語「酶促合成」意謂使用例如聚合酶、連接酶、轉移酶、磷酸酶及核酸酶(例如核酸內切酶)之酶製造聚核苷酸及寡核苷酸，包括片段及最終產物。此等酶可為野生型酶或突變型酶或經工程改造之酶。在本發明之範疇內的係能夠作用於經修飾之核苷酸或寡核苷酸受質的突變型酶或經工程改造之酶。
依本文所使用，術語「聚合酶」意謂例如藉由在一個核苷酸或寡核苷酸或聚核苷酸之3'端與另一核苷酸之5'端之間形成磷酸二酯鍵，催化核苷酸與另一核苷酸或寡核苷酸或聚核苷酸之3'-OH的連接(亦即共價連接)的酶。因此，聚合酶活性為5'至3'。聚合酶可包括DNA及/或RNA聚合酶。聚合酶可為野生型酶、突變型酶或經工程改造之酶。
熟習此項技術者應理解，依本發明中所使用之「核苷酸池」為聚合酶之受質。因此，在此上下文中，「核苷酸池」意謂核苷三磷酸(NTP)或其類似物之池，其在併入聚核苷酸或寡核苷酸產物中時係核苷酸。因此，「核苷酸池」及「核苷三磷酸池」在本文中可互換使用。核苷三磷酸可被視為DNA及RNA兩者之分子前驅物。核苷三磷酸池可包含以下中之一或多者：去氧腺苷三磷酸、去氧胞苷三磷酸、去氧鳥苷三磷酸、去氧胸苷三磷酸、去氧尿苷三磷酸、腺苷三磷酸、胞苷三磷酸、鳥苷三磷酸、胸苷三磷酸及尿苷三磷酸。核苷三磷酸池可包含以下中之一或多者：經修飾之去氧腺苷三磷酸、經修飾之去氧胞苷三磷酸、經修飾之去氧鳥苷三磷酸、經修飾之去氧胸苷三磷酸、經修飾之去氧尿苷三磷酸、經修飾之腺苷三磷酸、經修飾之胞苷三磷酸、經修飾之鳥苷三磷酸、經修飾之胸苷三磷酸及經修飾之尿苷三磷酸。核苷三磷酸池可包含核苷三磷酸類似物。核苷α硫代三磷酸之實例包括2'-去氧腺苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-去氧胞苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-去氧鳥苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-去氧胸苷-(α-硫基)-三磷酸、2'-去氧尿苷-(α-硫基)-三磷酸、2'-腺苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-胞苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-鳥苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-胸苷-(α-硫基)-三磷酸、2'-尿苷-(α-硫基)-三磷酸及其修飾鹼基變異體。核苷三磷酸池可包含以下中之一或多者：去氧腺苷三磷酸、去氧胞苷三磷酸、去氧鳥苷三磷酸、去氧胸苷三磷酸、去氧尿苷三磷酸、腺苷三磷酸、胞苷三磷酸、鳥苷三磷酸、胸苷三磷酸、尿苷三磷酸、經修飾之去氧腺苷三磷酸、經修飾之去氧胞苷三磷酸、經修飾之去氧鳥苷三磷酸、經修飾之去氧胸苷三磷酸、經修飾之去氧尿苷三磷酸、經修飾之腺苷三磷酸、經修飾之胞苷三磷酸、經修飾之鳥苷三磷酸、經修飾之胸苷三磷酸、經修飾之尿苷三磷酸、2'-去氧腺苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-去氧胞苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-去氧鳥苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-去氧胸苷-(α-硫基)-三磷酸、2'-去氧尿苷-(α-硫基)-三磷酸、2'-腺苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-胞苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-鳥苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-胸苷-(α-硫基)-三磷酸及2'-尿苷-(α-硫基)-三磷酸。核苷三磷酸池可包含以下中之一或多者：腺苷三磷酸、胞苷三磷酸、鳥苷三磷酸、尿苷三磷酸、經修飾之腺苷三磷酸、經修飾之胞苷三磷酸、經修飾之鳥苷三磷酸、經修飾之尿苷三磷酸、2'-腺苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-胞苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-鳥苷-5'-(α-硫基)-三磷酸及2'-尿苷-(α-硫基)-三磷酸。核苷三磷酸池可包含以下中之一或多者：去氧腺苷三磷酸、去氧胞苷三磷酸、去氧鳥苷三磷酸、去氧胸苷三磷酸、經修飾之去氧胞苷三磷酸、經修飾之去氧鳥苷三磷酸、經修飾之去氧胸苷三磷酸、2'-去氧腺苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-去氧胞苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-去氧鳥苷-5'-(α-硫基)-三磷酸及2'-去氧胸苷-(α-硫基)-三磷酸。核苷三磷酸池可包含：腺苷三磷酸、胞苷三磷酸、鳥苷三磷酸及經修飾之尿苷三磷酸。核苷三磷酸池可包含：腺苷三磷酸、胞苷三磷酸、鳥苷三磷酸及N1-甲基-假尿苷三磷酸。核苷三磷酸池可包含：2'-腺苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-胞苷-5'-(α-硫基)-三磷酸、2'-鳥苷-5'-(α-硫基)-三磷酸及2'-經修飾之尿苷-(α-硫基)-三磷酸。
在本發明之範疇內係能夠連接未經修飾之核苷酸與另一未經修飾之核苷酸的聚合酶、能夠連接未經修飾之核苷酸與經修飾之核苷酸(亦即，經修飾之5'核苷酸與未經修飾之3'核苷酸，及/或未經修飾之5'核苷酸與經修飾之3'核苷酸)的聚合酶，以及能夠連接經修飾之核苷酸與另一經修飾之核苷酸的聚合酶。視情況，聚合酶能夠連接未經修飾之核苷酸與另一未經修飾之核苷酸。可隨後修飾未經修飾之核苷酸。核苷酸修飾之實例揭示於本文中，且包括選自包含糖部分修飾、核鹼基修飾及主鏈修飾之群的修飾。
修飾可在糖部分之2'位置，視情況選自由以下組成之群：2'-F、2'-OMe、2'-MOE及2'-胺基。寡核苷酸可包含PMO、LNA、c-Et、PNA、BNA或L-核糖核酸。修飾可在核鹼基中，且視情況可選自由5-甲基嘧啶、7-去氮鳥苷及無鹼基核苷酸組成之群。修飾可在主鏈中，且視情況可選自由以下組成之群：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、胺基磷酸酯及二胺基磷酸酯。
另外，可併入經修飾之核苷酸的例示性經工程改造之DNA及RNA聚合酶包括在「Engineering and application of polymerases for synthetic genetics」, Houlihan等人, Current Opinion in Biotechnology 2017, 48; 168-179中所揭示之彼等。例如，DNA及/或RNA聚合酶可經工程改造以接受2'糖修飾，包括在 柳珊瑚嗜熱球菌( Thermococcus gogonarius，Tgo)複製性DNA聚合酶之聚合酶拇指子域中具有突變的聚合酶，該聚合酶視情況包含在E664K及Y409G處之突變。此類聚合酶提供包括例如自DNA、RNA、鎖核酸或2'-OMe RNA修飾之核苷酸或其組合預備之假尿苷、5-甲基-C、2'-氟或2-疊氮基-修飾之NTP。
經工程改造以接受2'糖修飾之其他例示性RNA聚合酶包括T7 RNA聚合酶。在Y639F處包含突變之T7 RNA聚合酶可例如提供包括例如2'氟嘧啶及2'胺基嘧啶。
Taq聚合酶(SM19)之Stoffel片段之變異體可經工程改造以接受2'糖修飾。例如，在位置614處引入帶負電之胺基酸及E615G之突變提供包括2'糖修飾。SM19可進一步進化為聚合酶SFM4-3及SFM4-9。例如，SFM4-3可轉錄經完全修飾之2'OMe 60個核苷酸序列。
來自海洋噬藍藻體Syn5的嗜熱性RNA聚合酶可經工程改造以接受2'糖修飾。
包Y409G、I521L、F545L及E664K突變的Tgo聚合酶可藉由併入3'去氧-或3'OMe核苷酸合成具有區位異構2'-5'鍵之DNA及RNA。
依本文所使用，術語「連接酶」意謂例如藉由在一個寡核苷酸或聚核苷酸(或片段)之3'端與同一或另一聚核苷酸或寡核苷酸(或片段)之5'端之間形成磷酸二酯鍵，催化兩個聚核苷酸或寡核苷酸分子之連接(亦即共價連接)的酶。此等酶通常稱為DNA連接酶或RNA連接酶且利用輔因子：ATP (真核、病毒及古細菌DNA連接酶)或NAD (原核DNA連接酶)。儘管其存在於所有生物體中，但DNA連接酶顯示胺基酸序列、分子大小及特性之廣泛多樣性(Nucleic Acids Research, 2000, 第28卷, 第21期, 4051-4058)。其通常為依國際生物化學及分子生物學聯合會(International Union of Biochemistry and Molecular Biology)所定義之酶類EC 6.5的成員，亦即用於形成磷酸酯鍵之連接酶。在本發明之範疇內的係能夠將未經修飾之聚核苷酸或寡核苷酸與另一未經修飾之聚核苷酸或寡核苷酸連接的連接酶、能夠將未經修飾之聚核苷酸或寡核苷酸與經修飾之聚核苷酸或寡核苷酸連接的連接酶(亦即經修飾之5'聚核苷酸或寡核苷酸與未經修飾之3'聚核苷酸或寡核苷酸，及/或未經修飾之5'聚核苷酸或寡核苷酸與經修飾之3'聚核苷酸或寡核苷酸)，以及能夠將經修飾之聚核苷酸或寡核苷酸與另一經修飾之聚核苷酸或寡核苷酸連接的連接酶。
依本文所使用，術語「單股連接酶」或「ssLigase」意謂能夠催化(i) 5'-磷酸化單股RNA與單股受體RNA股之3'-OH的ATP依賴性連接及(ii)單個殘基(包括經修飾之殘基)例如核苷酸-3',5'-雙磷酸、3',5'-雙硫代磷酸或3'-磷酸-5' 硫代磷酸與RNA或經修飾之聚核苷酸或寡核苷酸之3'端連接的酶，例如RNA連接酶(Modified Oligoribonucleotides: 17 (11), 2077-2081, 1978)。ssLigase之實例為T4 RNA連接酶，其亦已表明在某些條件下對DNA受質起作用(Nucleic Acids research 7(2), 453-464, 1979)。感染T4噬菌體之 大腸桿菌 (Escherichia coli)中T4 RNA連接酶之天然功能為修復由細菌抵禦病毒攻擊之防禦機制引起的細菌tRNA之單股制動。在本發明之範疇內的係能夠連接未經修飾之核苷酸與未經修飾之聚核苷酸或寡核苷酸的ssLigase、能夠連接未經修飾之核苷酸與經修飾之聚核苷酸或寡核苷酸的ssLigase、能夠連接經修飾之核苷酸與未經修飾之聚核苷酸或寡核苷酸的ssLigase，以及能夠連接經修飾之核苷酸與經修飾之聚核苷酸或寡核苷酸的ssLigase。根據本發明之ssLigase為不需要模板聚核苷酸或寡核苷酸進行連接之連接酶，亦即連接酶之連接活性與模板無關。
依本文所使用，「接合核苷酸」為存在於將與另一聚核苷酸或寡核苷酸連接之一個聚核苷酸或寡核苷酸末端的核苷酸。例如，在兩個片段(5'-片段及3'-片段)連接在一起的情況下，兩個接合核苷酸為1) 5'-片段之3'端的核苷酸及2) 3'-片段之5'端的核苷酸。
依本文所使用，「轉移酶」意謂催化一種核苷酸與另一核苷酸或寡核苷酸之不依賴模板連接之酶。依本文所描述之轉移酶包括末端核苷酸轉移酶(TdT)，亦稱為DNA核苷酸轉移酶(DNTT)或末端轉移酶。TdT為在未成熟的前B、前T淋巴細胞中表現之專業化DNA聚合酶，其中其能夠使V-D-J抗體基因接合多樣性。TdT催化向DNA分子之3'末端添加核苷酸。依本文所描述之轉移酶包括非天然存在或突變型TdT。在本發明之範疇內的係能夠連接未經修飾之核苷酸與未經修飾之寡核苷酸的轉移酶、能夠連接未經修飾之核苷酸與經修飾之寡核苷酸的轉移酶、能夠連接經修飾之核苷酸與未經修飾之寡核苷酸的轉移酶以及能夠連接經修飾之核苷酸與經修飾之寡核苷酸的轉移酶。
依本文所使用，「熱穩定連接酶」、「熱穩定聚合酶」或「熱穩定轉移酶」分別為在高溫，亦即高於人體溫度，亦即高於37℃下具有活性之連接酶、聚合酶或轉移酶。熱穩定連接酶、熱穩定聚合酶或熱穩定轉移酶可在例如40℃至65℃；或40℃至90℃等等下具有活性。
依本文所使用，術語「引子」意謂用作合成本發明之片段聚核苷酸或寡核苷酸之起點的聚核苷酸或寡核苷酸序列。聚合酶可能需要引子，例如DNA聚合酶可能需要引子。引子可包含至少3個核苷酸。使用片段聚核苷酸或寡核苷酸作為引子在本發明之範疇內。至少一個片段聚核苷酸或寡核苷酸可用作引子。引子可在聚合酶催化核苷酸連接前與模板結合。引子可不移除。引子可形成聚核苷酸或寡核苷酸模板之一部分。例如，模板可包含含有引子之髮夾環。引子可形成聚核苷酸或寡核苷酸產物之一部分。
依本文所使用，術語「終止子」亦稱為「阻斷子(block)」或「3'-側接寡核苷酸」意謂終止或阻止聚合酶連接其他核苷酸之聚核苷酸或寡核苷酸序列。終止子可終止聚合酶延伸。終止子(例如至少兩個片段聚核苷酸或寡核苷酸中之一者)可包含5'磷酸酯、5'硫代磷酸酯(其可產生硫代磷酸酯鍵)、5'胺基磷酸酯(其可產生胺基磷酸酯鍵)、5'二胺基磷酸酯(其可產生二胺基磷酸酯鍵)、5'胺基硫代磷酸酯、5'胺基二硫代磷酸酯、5'二胺基硫代磷酸酯或5'二硫代磷酸酯(其可產生二硫代磷酸酯鍵)。連接酶連接可能需要5'磷酸酯、5'硫代磷酸酯、5'胺基磷酸酯、5'二胺基磷酸酯、5'二硫代磷酸酯、5'胺基硫代磷酸酯、5'胺基二硫代磷酸酯或5'二胺基硫代磷酸酯。至少兩個片段聚核苷酸或寡核苷酸中之一或多者可用作終止子。
本發明之方法可用於產生RNA及/或DNA(包括其中之修飾)，包括非複製mRNA及病毒衍生自擴增RNA。此類RNA在例如疫苗製造中具有實用性。
術語「RNA」為核糖核酸之常見縮寫。其為核酸分子，亦即由核苷酸單體組成之聚合物。此等核苷酸通常為腺苷-單磷酸、尿苷-單磷酸、鳥苷-單磷酸及胞苷-單磷酸單體或其類似物，其沿著所謂的主鏈彼此連接。主鏈藉由第一單體之糖(亦即核糖)與第二相鄰單體之磷酸部分之間的磷酸二酯鍵形成。單體之特定次序，亦即連接至糖/磷酸主鏈之鹼基的次序稱為RNA-序列。術語「RNA」一般係指選自由以下組成之群的分子或分子物種：長鏈RNA、編碼RNA、非編碼RNA、單股RNA (ssRNA)、雙股RNA (dsRNA)、線性RNA (linRNA)、環狀RNA (circRNA)、信使RNA (mRNA)、RNA寡核苷酸、小干擾RNA (siRNA)、小髮夾RNA (shRNA)、反義RNA (asRNA)、CRISPR/Cas9嚮導RNA、核糖開關、免疫刺激RNA (isRNA)、核酶、適體、核糖體RNA (rRNA)、轉移RNA (tRNA)、病毒RNA (vRNA)、反轉錄病毒RNA或複製子RNA、小核RNA (snRNA)、小核仁RNA (snoRNA)、微小RNA (miRNA)及Piwi-相互作用RNA (piRNA)。視情況在本發明之上下文中為任何類型之治療性RNA。「治療性RNA」應理解為與適用於人類或動物身體用於醫療目的之RNA相關，例如其具有臨床等級，尤其在涉及諸如純度、完整性之參數，以及必須符合當前良好製造規範(cGMP)條件之基礎製造方法時。治療RNA可具有例如預防或治療病狀或疾病之治療應用。
術語「信使RNA」(mRNA)係指一種類型之RNA分子。活體內，DNA轉錄通常產生必須加工成所謂信使RNA之所謂未成熟RNA，通常縮寫為mRNA。未成熟RNA之加工，例如在真核生物中，包括多種不同的轉錄後修飾，諸如剪接、5'-加帽、聚腺苷酸化、自細胞核或粒線體輸出及其類似者。此等製程之總和亦稱為RNA之成熟。成熟mRNA通常提供可轉譯成特定肽或蛋白質之胺基酸序列的核苷酸序列。通常，成熟mRNA包含5'帽、5'非轉譯區(5' UTR)、開放閱讀框架、3'非轉譯區(3' UTR)及同聚物尾，例如poly-A或poly-C序列。在本發明之上下文中，mRNA可為人工分子，亦即自然界中不存在之分子。此意謂在本發明之上下文中，mRNA可包含5'UTR、開放閱讀框架、3'UTR及poly-A序列之組合，此組合在自然界中不存在。
根據由治療性mRNA編碼之蛋白質的預期治療用途，治療性mRNA之劑量及治療持續時間可變化若干數量級。對於疫苗，抗原之奈克或微克範圍之表現可足以引發所需免疫反應。然而，對於生長因子、激素或抗體，治療劑量之範圍可自微克至毫克或可能高達公克數量之蛋白質。mRNA劑量依賴性毒性可能為擴大規模以獲得此類較大蛋白質數量的限制因素，因此使得mRNA穩定性增加且不含修飾特異性毒性的修飾具有價值(Aditham等人, ACS Chem. Biol., 2021年12月, https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00569)。
對於mRNA在治療環境中之任何應用，需要使用具有可以可靠方式複製之確定序列及結構的mRNA。例如，已知mRNA之5' UTR (例如含有帽結構)及3' UTR (例如含有同聚物尾，諸如poly-A尾)涉及mRNA穩定性及轉譯效率之調節。因此，5'帽結構及3'尾為真核細胞中有效轉譯mRNA及蛋白質合成的重要特徵。因此，可針對此類關鍵功能特徵控制mRNA製造方法。已展示在poly A尾中包括3'末端PS鍵主要藉由穩定mRNA使人類希拉細胞株(HeLa cell line)中之蛋白質產量增加2-4倍。(Aditham等人, ACS Chem. Biol., 2021年12月)。
mRNA可具有經修飾之帽。mRNA可具有7mG(5')ppp(5')N,pN2p (帽0)、7mG(5')ppp(5')NImpNp (帽1)、7mG(5')-ppp(5')NImpN2mp (帽2)或m(7)Gpppm(3)(6,6,2')Apm(2')Apm(2')Cpm(2)(3,2')Up (帽4)。
此外，未加帽RNA通常含有已知刺激先天免疫系統之5'末端三磷酸基團。因此，未加帽RNA可在個體中產生不當的免疫反應。因此，必須控制醫藥mRNA產物中未加帽5'-三磷酸RNA之存在。
習知基於mRNA之疫苗編碼感興趣的抗原且含有5'及3'UTR，而自擴增RNA不僅編碼抗原，且亦編碼實現細胞內RNA擴增及大量蛋白質表現之病毒複製機制。信使RNA分子通常藉由適合DNA模板之RNA活體外轉錄產生。5'帽結構及3'同聚物尾(例如poly-A尾)通常在RNA活體外轉錄期間引入，例如可在DNA模板內編碼，或在RNA活體外轉錄後經由酶促方法編碼。
本發明之方法可用於藉由活體外轉錄來製備自我複製RNA。例如，DNA依賴性RNA聚合酶(諸如噬菌體T7、T3或SP6 RNA聚合酶)可用於自DNA模板轉錄自我複製RNA。
經由酶促方法進行之適當加帽及poly-A尾加成反應可視需要在使用本發明方法產生RNA後使用或可在DNA模板內編碼。
聚合酶對於其併入之核苷酸(亦即，其核苷三磷酸受質)可具有精確要求。彼等要求可與所編碼之複製酶的要求匹配，以確保經轉錄RNA用作其自編碼之複製酶的受質。
方法可用於製備非複製mRNA。例如，DNA或RNA聚合酶可用於自DNA或RNA模板轉錄非複製mRNA。可使用之聚合酶描述於本文中。例示性聚合酶包括DNA聚合酶I或T7 RNA聚合酶，其可依本文中所描述進一步突變。
在方法中，RNA可為經修飾及/或穩定化RNA。
「穩定化RNA」定義為顯示提高之活體內降解抗性之RNA及/或顯示提高之活體內穩定性之RNA及/或顯示提高之活體內可轉譯性之RNA。
可例如藉由所產生RNA之經修飾之磷酸酯主鏈實現穩定化。主鏈修飾為其中RNA中含有之核苷酸之主鏈之磷酸酯經化學修飾的修飾。可用於此連接之核苷酸含有例如經硫代磷酸酯修飾之磷酸酯主鏈，視情況磷酸酯主鏈中所含有之磷酸酯氧中之至少一者經硫原子置換。
穩定化RNA可進一步包括例如磷酸酯類似物，諸如烷基及芳基膦酸酯或烷基磷酸三酯。此類主鏈修飾通常包括(但不意味著任何限制)來自由甲基磷酸酯、胺基磷酸酯及硫代磷酸酯組成之群的修飾。
「經修飾之RNA」包括一或多個經修飾之核苷酸。
依本文所使用，術語「經修飾之核苷酸殘基」或「經修飾之聚核苷酸或寡核苷酸」意謂含有不同於天然存在之核苷酸殘基或聚核苷酸或寡核苷酸之其化學方法之至少一個態樣的核苷酸殘基或聚核苷酸或寡核苷酸。此類修飾可存在於核苷酸殘基之任何部分中，諸如糖部分之修飾、核鹼基之修飾及/或主鏈之修飾。經修飾之核苷酸殘基可形成經修飾之聚核苷酸或寡核苷酸之一部分。經修飾之聚核苷酸或寡核苷酸可為DNA或RNA。
熟習此項技術者將理解存在許多核苷酸之合成衍生物。
另外，不同於G、C、U、T、A之任何核苷酸可視為「經修飾之核苷酸」。核苷酸修飾之實例揭示於本文中。
聚核苷酸或寡核苷酸可包含PMO、LNA、c-Et、PNA、BNA或L-核糖核酸。
與本發明相關之主鏈修飾為核酸中所含有之核苷酸之主鏈之磷酸酯經化學修飾的修飾。與本發明相關之糖修飾為核苷酸之糖的化學修飾。與本發明相關之鹼基修飾為核苷酸之鹼基部分的化學修飾。在此情形下，核苷酸修飾係選自適用於轉錄及/或轉譯之核苷酸類似物。
此項技術中已知之經修飾之核苷三磷酸包含2-胺基-6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸、2-胺基嘌呤-核糖苷-5'-三磷酸；2-胺基腺苷-5'-三磷酸、2'-胺基-2'-去氧胞苷-三磷酸、2-硫代胞苷-5'-三磷酸、2-硫代尿苷-5'-三磷酸, 2'-氟胸苷-5'-三磷酸、2'-0-甲基-肌苷-5'-三磷酸、4-硫代尿苷-5'-三磷酸、5-胺基烯丙基胞苷-5'-三磷酸、5-胺基烯丙基尿苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸、5-溴尿苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸、5-溴-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸、5-碘胞苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸、5-碘尿苷-5'-三磷酸、5-碘-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸、5-甲基胞啶-5'-三磷酸、5-甲基尿苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-去氧胞苷-5'-三磷酸、5-丙炔基-2'-去氧尿苷-5'-三磷酸、6-阿紮胞苷-5'-三磷酸、6-氮雜尿苷-5'-三磷酸、6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸、7-去氮腺苷-5'-三磷酸、7-去氮鳥苷-5'-三磷酸、8-氮雜腺苷-5'-三磷酸、8-疊氮腺苷-5'-三磷酸、苯并咪唑-核糖苷-5'-三磷酸、N1 -甲基腺苷-5'-三磷酸、N1 -甲基鳥苷-5'-三磷酸、N6-甲基腺苷-5'-三磷酸、06-甲基鳥苷-5'-三磷酸、假尿苷-5'-三磷酸或嘌呤黴素-5'-三磷酸、黃苷-5'-三磷酸。
此項技術中已知的經鹼基修飾之核苷酸包括5-甲基胞啶-5'-三磷酸、7-去氮尿苷-5'-三磷酸、5-溴胞苷-5'-三磷酸、及假尿苷-5'-三磷酸、吡啶-4-酮核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫基-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫基-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫基-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙醯基胞苷、5-甲醯基胞苷、N4-甲基胞啶、5-羥甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假異胞苷、2-硫基-胞苷、2-硫基-5-甲基-胞苷、4-硫基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-1-去氮-假異胞苷、1 -甲基-1-去氮-假異胞苷、澤布拉林、5-氮雜-澤布拉林、5-甲基-澤布拉林、5-氮雜-2-硫基-澤布拉林、2-硫基-澤布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷、及4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮-2-胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2-胺基嘌呤、7-去氮-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲基硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘胺醯基胺甲醯基腺苷、N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、2-甲基硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫基-腺嘌呤、及2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、懷俄苷、懷俄丁苷、7-去氮-鳥苷、7-去氮-8-氮雜-鳥苷、6-硫基-鳥苷、6-硫基-7-去氮-鳥苷、6-硫基-7-去氮-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫基-7-甲基-鳥苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2,N2-二甲基鳥苷、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷、1-甲基-6-硫基-鳥苷、N2-甲基-6-硫基-鳥苷、及N2,N2-二甲基-6-硫基-鳥苷、5'-0-(1-硫代磷酸酯)-腺苷、5'-0-(1-硫代磷酸酯)-胞苷、5'-0-(1-硫代磷酸酯)-鳥苷、5'-0-(1-硫代磷酸酯)-尿苷、5'-0-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷、6-氮雜-胞苷、2-硫基-胞苷、α-硫基-胞苷、假-異-胞苷、5-胺基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氫尿苷、α-硫基-尿苷、4-硫代尿苷、6-氮雜-尿苷、5-羥基-尿苷、去氧-胸苷、5-甲基-尿苷、吡咯并-胞苷、肌苷、α-硫基-鳥苷、6-甲基-鳥苷、5-甲基-胞苷、8-側氧基-鳥苷、7-去氮-鳥苷、N1-甲基-腺苷、2-胺基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-胺基-嘌呤、假-異-胞苷、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫基-腺苷、8-疊氮-腺苷、7-去氮-腺苷、假尿苷、N1-甲基假尿苷、N1-乙基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、2'-0-甲基尿苷、假尿苷(y)、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、及5-甲氧基尿苷。
熟習此項技術者將理解活體外轉錄(IVT) mRNA在轉染時觸發強免疫反應，其抑制蛋白質產生。因此，用假尿苷或N1-甲基假尿苷100%置換尿苷廣泛用於治療性mRNA以經由阻斷鐸樣受體識別降低免疫毒性，進而提高轉譯效率。
本發明之聚核苷酸或寡核苷酸可包含至少一個編碼序列，其中至少一個編碼序列為假尿苷修飾編碼序列，亦即每個尿苷經編碼序列中之假尿苷置換。聚核苷酸或寡核苷酸可包含核酸序列，其中至少一個或多於一個或所有尿苷經假尿苷置換。聚核苷酸或寡核苷酸可包含至少一個編碼序列，其中至少一個編碼序列為N1-甲基假尿苷修飾編碼序列，亦即每個尿苷經編碼序列中之N1-甲基假尿苷置換。N1-甲基假尿苷及1-甲基假尿苷可互換使用。聚核苷酸或寡核苷酸可包含核酸序列，其中至少一個或多於一個或所有尿苷經N1-甲基假尿苷置換。聚核苷酸或寡核苷酸可包含至少一個編碼序列，其中至少一個編碼序列為經密碼子修飾之編碼序列。至少一個編碼序列可為經密碼子修飾之編碼序列，其中相比於由對應野生型編碼序列編碼之胺基酸序列，由至少一個經密碼子修飾之編碼序列編碼之胺基酸序列未經修飾，亦即胺基酸序列相同。
術語「經密碼子修飾之編碼序列」係關於與對應野生型編碼序列相比在至少一個密碼子(編碼一個胺基酸之核苷酸之三重態)方面不同的編碼序列。適當地，經密碼子修飾之編碼序列可顯示提高之活體內降解抗性及/或提高之活體內穩定性及/或提高之活體內可轉譯性。密碼子修飾可利用遺傳密碼之簡併性，其中多個密碼子可編碼相同胺基酸且可互換使用以使活體內應用之編碼序列最佳化。
糖部分中之修飾可包括糖部分、雙環糖或4'-CH(CH 3)-O-2'基團及其組合之2'位置處的修飾。例如，糖部分之2'位置處之修飾可包含2'-F、2'-OMe、2'-MOE及/或2'-胺基。
經修飾核鹼基之實例包括胞嘧啶，諸如5-甲基胞嘧啶、5-甲基嘧啶、7-去氮鳥苷及無鹼基核苷酸。經修飾核鹼基之其他實例包括m5C (5-甲基胞苷)、m5U (5-甲基尿苷)、m6A (N6-甲基腺苷)、s2U (2-硫代尿苷)、Um (2'-0-甲基尿苷)、mlA (1-甲基腺苷)；m2A (2-甲基腺苷)；Am (2'-0-甲基腺苷)；ms2m6A (2-甲基硫基-N6-甲基腺苷)；i6A (N6-異戊烯基腺苷)；ms2i6A (2-甲基硫基-N6異戊烯基腺苷)；io6A (N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷)；ms2io6A (2-甲基硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷)；g6A (N6-甘胺醯基胺甲醯基腺苷)；t6A (N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷)；ms2t6A (2-甲基硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷)；m6t6A (N6-甲基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷)；hn6A (N6.-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷)；ms2hn6A (2-甲基硫基-N6-羥基正纈胺醯基胺甲醯基腺苷)；Ar(p) (2'-0-核糖基腺苷(磷酸酯))；I (肌苷)；mi l (1-甲基肌苷)；m'lm (l,2'-0-二甲基肌苷)；m3C (3-甲基胞啶)；Cm (2T-0-甲基胞啶)；s2C (2-硫代胞苷)；ac4C (N4-乙醯基胞苷)；f5C (5-甲醯胞苷)；m5Cm (5,2-0-二甲基胞苷)；ac4Cm (N4乙醯基2TO甲基胞苷)；k2C (立西啶)；mlG (1-甲基鳥苷)；m2G (N2-甲基鳥苷)；m7G (7-甲基鳥苷)；Gm (2'-0-甲基鳥苷)；m22G (N2,N2-二甲基鳥苷)；m2Gm (N2,2'-0-二甲基鳥苷)；m22Gm (N2,N2,2'-0-三甲基鳥苷)；Gr(p) (2'-0-核糖基鳥苷(磷酸酯))；yW (懷俄丁苷)；o2yW (過氧基懷俄丁苷)；OHyW (羥基懷俄丁苷)；OHyW* (欠修飾之羥基懷俄丁苷)；imG (懷俄苷)；mimG (甲基鳥苷)；Q (Q核苷)；oQ (環氧Q核苷)；galQ (半乳糖基-Q核苷)；manQ (甘露糖基-Q核苷)；preQo (7-氰基-7-去氮鳥苷)；preQi (7-胺基甲基-7-去氮鳥苷)；G (古嘌苷)；D (二氫尿苷)；m5Um (5,2'-0-二甲基尿苷)；s4U (4-硫代尿苷)；m5s2U (5-甲基-2-硫代尿苷)；s2Um (2-硫基-2'-0-甲基尿苷)；acp3U (3-(3-胺基-3-羧基丙基)尿苷)；ho5U (5-羥基尿苷)；mo5U (5-甲氧基尿苷)；cmo5U (尿苷5-氧基乙酸)；mcmo5U (尿苷5-氧基乙酸甲酯)；chm5U (5-(羧基羥甲基)尿苷))；mchm5U (5-(羧基羥甲基)尿苷甲酯)；mcm5U (5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5Um (S-甲氧基羰基甲基-2-O-甲基尿苷)；mcm5s2U (5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷)；nm5s2U (5-胺基甲基-2-硫代尿苷)；mnm5U (5-甲基胺基甲基尿苷)；mnm5s2U (5-甲胺基甲基-2-硫代尿苷)；mnm5se2U (5-甲胺基甲基-2-硒基尿苷)；ncm5U (5-胺甲醯基甲基尿苷)；ncm5Um (5-胺甲醯基甲基-2'-0-甲基尿苷)；cmnm5U (5-羧甲基胺基甲基尿苷)；cnmm5Um (5-羧甲基胺基甲基-2-L-O甲基尿苷)；cmnm5s2U (5-羧甲基胺基甲基-2-硫代尿苷)；m62A (N6,N6-二甲基腺苷)；Tm (2'-0-甲基肌苷)；m4C (N4-甲基胞啶)；m4Cm (N4,2-0-二甲基胞苷)；hm5C (5-羥甲基胞苷)；m3U (3-甲基尿苷)；cm5U (5-羧甲基尿苷)；m6Am (N6,T-0-二甲基腺苷)；rn62Am (N6,N6,0-2-三甲基腺苷)；m2'7G (N2,7-二甲基鳥苷)；m2'2'7G (N2,N2,7-三甲基鳥苷)；m3Um (3,2T-0-二甲基尿苷)；m5D (5-甲基二氫尿苷)；£5Cm (5-甲醯基-2'-0-甲基胞啶)；mlGm (l,2'-0-二甲基鳥苷)；m'Am (1,2-O-二甲基腺苷)益利諾甲基尿苷)；tm5s2U (S-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷))；imG-14 (4-去甲基鳥苷)；imG2 (異鳥苷)；及ac6A (N6-乙醯基腺苷)、次黃嘌呤、肌苷、8-側氧基-腺嘌呤、其7-經取代衍生物、二氫尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-胺基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羥甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鳥嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤、7-去氮-7-經取代鳥嘌呤、7-去氮-7-(C2-C6)炔基鳥嘌呤、7-去氮-8-經取代鳥嘌呤、8-羥基鳥嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、8-側氧基鳥嘌呤、2-胺基嘌呤、2-胺基-6-氯嘌呤、2,4-二胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、8-氮雜嘌呤、經取代之7-去氮嘌呤、7-去氮-7-經取代嘌呤及7-去氮-8-經取代嘌呤。例如，聚核苷酸可包括一或多個經修飾之嘧啶核鹼基，諸如假尿苷及/或5-甲基胞嘧啶殘基。
主鏈中之修飾可包括硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯及二硫代磷酸酯。至少一個或各核苷間鍵可為經修飾之核苷間鍵。
本發明之聚核苷酸可僅包括核苷之間的磷酸二酯鍵，但在其他實例中可含有胺基磷酸酯、硫代磷酸酯、二胺基磷酸酯及二硫代磷酸酯及/或甲基膦酸酯鍵。
修飾可包括N1-甲基假尿苷。
假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶及5-甲氧基尿苷可用於核苷三磷酸池中而非尿苷以用於使用聚合酶併入。
依本文所使用，術語「間隔體」意謂具有側接有兩個外部「翼區」(5'-翼及3'-翼)之內部「中心區域」的寡核苷酸，其中該中心區域包含複數個支援RNA酶H裂解之核苷酸且各翼區包含一或多個在化學上與中心區域內之核苷酸不同的核苷酸。間隔體係反義聚核苷酸。間隔體包含中心區域、定位於中心區域之5'端的5'翼區及定位於中心區域之3'端的3'翼區。
依本文所使用，術語「載體材料」意謂增加聚核苷酸或寡核苷酸之分子量的高分子量化合物或材料，例如模板或引子，藉此使得其能夠保留，例如當雜質及/或產物自反應混合物分離時。
依本文所使用，查詢核酸序列與目標核酸序列之間的「百分比一致性」為「一致性」值(表示為百分比)，當在進行成對BLASTN對準後目標核酸序列具有與查詢核酸序列之100%查詢覆蓋度時，該「一致性」值藉由BLASTN演算法計算。查詢核酸序列與主題核酸序列之間的此類成對BLASTN比對係藉由使用適用於National Center for Biotechnology Institute網站(其中低複雜度區之過濾器關閉)之BLASTN演算法之預設設置執行。重要的是，查詢核酸序列可由在本文中之一或多個申請專利範圍內識別之核酸序列描述。查詢序列可與主題序列100%一致，或與主題序列相比，該查詢序列可包括至多某一整數數目個核苷酸變化，以使得%一致性小於100%。例如，查詢序列與主題序列之一致性至少為：80、85、90、95、96、97、98或99%。
依本文所使用，當參考諸如量、持續時間及其類似者之可量測值時術語「約」意欲涵蓋自指定值之±20%或±10%，包括±5%、±1%及±0.1%之變化，因為此類變化適合於進行本文中所揭示之實施例。
實施例本發明提供一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之單股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)使包含與該單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸與至少兩個片段聚核苷酸之池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸以產生其上黏接有該等至少兩個片段聚核苷酸的模板聚核苷酸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個黏接之片段聚核苷酸之間； b)使用核苷三磷酸池及聚合酶延伸該等黏接之片段聚核苷酸中之至少一者，以填充該至少一個序列缺口以產生至少一個延伸片段聚核苷酸；及 c)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成呈雙螺旋體形式結合於該模板聚核苷酸之該單股聚核苷酸產物；及 d)改變條件以使包含該單股聚核苷酸產物及該模板聚核苷酸之該雙螺旋體變性，藉此製造該單股聚核苷酸產物且視情況分離該單股聚核苷酸產物。
步驟(b)及(c)可同時進行。在某些情況下，步驟(a)、(b)及(c)可同時進行。在一實施例中，步驟b)中所述之聚合酶或核苷三磷酸池在步驟(a)期間存在。在一實施例中，步驟b)中所敍述之聚合酶存在於步驟(a)期間且一旦至少兩個片段聚核苷酸已黏接至模板聚核苷酸，則添加核苷三磷酸池以使聚合酶能夠延伸至少一個經黏接之片段聚核苷酸且填充至少一個序列缺口。在一替代實施例中，步驟b)中所敍述之核苷三磷酸池在步驟(a)期間存在且一旦至少兩個片段聚核苷酸已黏接至模板聚核苷酸，則添加聚合酶以延伸至少一個經黏接之片段聚核苷酸且填充至少一個序列缺口。
步驟d)可進一步包含改變條件以使包含雜質聚核苷酸及模板聚核苷酸之雙螺旋體變性，且在改變條件以使包含該單股聚核苷酸產物及該模板聚核苷酸之該雙螺旋體變性之前分離任何雜質聚核苷酸。
在一實施例中，至少一個片段聚核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸殘基。在一實施例中，核苷三磷酸池由以下組成：(i)天然存在之核苷三磷酸；(ii)經修飾之核苷三磷酸或(iii)天然存在之核苷三磷酸及經修飾之核苷三磷酸。
本發明提供一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之單股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)提供包含與該單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸； b)提供包含至少兩個片段聚核苷酸的聚核苷酸之池； c)使步驟(a)之該模板聚核苷酸與步驟(b)之該聚核苷酸池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個片段聚核苷酸之間； d)提供核苷三磷酸池及聚合酶，且使用該核苷三磷酸池及該聚合酶延伸至少一個經黏接之片段聚核苷酸以填充至少一個序列缺口； e)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成該單股聚核苷酸產物； f)改變條件以使該經黏接之模板及該單股聚核苷酸產物變性，且視情況分離該單股聚核苷酸產物。
本發明提供一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之單股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)提供包含與該單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸； b)提供包含至少兩個片段聚核苷酸的聚核苷酸之池； c)使步驟(a)之該模板聚核苷酸與步驟(b)之該聚核苷酸池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個片段聚核苷酸之間； d)提供核苷三磷酸池及聚合酶，且使用該核苷三磷酸池及該聚合酶延伸至少一個經黏接之片段聚核苷酸以填充至少一個序列缺口； e)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成該單股聚核苷酸產物； f)改變條件以使該經黏接之模板及該單股聚核苷酸產物變性，且視情況分離該單股聚核苷酸產物， 其中該等至少兩個片段聚核苷酸中之至少一者包含至少一個經修飾之核苷酸殘基及/或該核苷三磷酸池包含至少一個經修飾之核苷酸。
本發明提供一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之單股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)提供包含與該單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸； b)提供包含至少兩個片段聚核苷酸的聚核苷酸之池； c)使步驟(a)之該模板聚核苷酸與步驟(b)之該聚核苷酸池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個片段聚核苷酸之間； d)提供核苷三磷酸池及聚合酶，且使用該核苷三磷酸池及該聚合酶延伸至少一個經黏接之片段聚核苷酸以填充至少一個序列缺口； e)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成該單股聚核苷酸產物； f)視情況改變條件以使該經黏接之模板及任何雜質變性，且分離該等雜質；及 g)改變條件以使該經黏接之模板及該單股聚核苷酸產物變性，且視情況分離該單股聚核苷酸產物。
本發明提供一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之單股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)提供包含與該單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸； b)提供包含至少兩個片段聚核苷酸的聚核苷酸之池； c)使步驟(a)之該模板聚核苷酸與步驟(b)之該聚核苷酸池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個片段聚核苷酸之間； d)提供核苷三磷酸池及聚合酶，且使用該核苷三磷酸池及該聚合酶延伸至少一個經黏接之片段聚核苷酸以填充至少一個序列缺口； e)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成該單股聚核苷酸產物； f)視情況改變條件以使該經黏接之模板及任何雜質變性，且分離該等雜質；及 g)改變條件以使該經黏接之模板及該單股聚核苷酸產物變性，且視情況分離該單股聚核苷酸產物， 其中該等至少兩個片段聚核苷酸中之至少一者包含至少一個經修飾之核苷酸殘基及/或該核苷三磷酸池包含至少一個經修飾之核苷酸。
本發明提供一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之單股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)提供包含與該單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸； b)提供包含至少兩個片段聚核苷酸的聚核苷酸之池； c)使步驟(a)之該模板聚核苷酸與步驟(b)之該聚核苷酸池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個片段聚核苷酸之間； d)提供核苷三磷酸池及聚合酶，且使用該核苷三磷酸池及該聚合酶延伸至少一個經黏接之片段聚核苷酸以填充至少一個序列缺口； e)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成該單股聚核苷酸產物； f)改變條件以使該經黏接之模板及任何雜質變性，且分離該等雜質；及 g)改變條件以使該經黏接之模板及該單股聚核苷酸產物變性，且視情況分離該單股聚核苷酸產物。
本發明提供一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之單股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)提供包含與該單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸； b)提供包含至少兩個片段聚核苷酸的聚核苷酸之池； c)使步驟(a)之該模板聚核苷酸與步驟(b)之該聚核苷酸池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個片段聚核苷酸之間； d)提供核苷三磷酸池及聚合酶，且使用該核苷三磷酸池及該聚合酶延伸至少一個經黏接之片段聚核苷酸以填充至少一個序列缺口； e)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成該單股聚核苷酸產物； f)改變條件以使該經黏接之模板及任何雜質變性，且分離該等雜質；及 g)改變條件以使該經黏接之模板及該單股聚核苷酸產物變性，且視情況分離該單股聚核苷酸產物， 其中該等至少兩個片段聚核苷酸中之至少一者包含至少一個經修飾之核苷酸殘基及/或該核苷三磷酸池包含至少一個經修飾之核苷酸。
本發明提供一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之單股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)提供包含與該單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸； b)提供包含至少兩個片段聚核苷酸的聚核苷酸之池； c)使步驟(a)之該模板聚核苷酸與步驟(b)之該聚核苷酸池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個片段聚核苷酸之間； d)提供核苷三磷酸池及聚合酶，且使用該核苷三磷酸池及該聚合酶延伸至少一個經黏接之片段聚核苷酸以填充至少一個序列缺口； e)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成該單股聚核苷酸產物； f)視情況改變條件以使該經黏接之模板及任何雜質變性，且分離該等雜質；及 g)改變條件以使該經黏接之模板及該單股聚核苷酸產物變性且視情況分離該單股聚核苷酸產物。
核苷三磷酸池可包含至少一個經修飾之核苷三磷酸。
步驟d)可進一步分成三個獨立步驟，亦即d1)提供核苷三磷酸池，d2)提供聚合酶及d3)使用核苷三磷酸池及聚合酶延伸至少一個經黏接之片段聚核苷酸以填充至少一個序列缺口。
本發明提供一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之單股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)提供包含與該單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸； b)提供包含至少兩個片段聚核苷酸的聚核苷酸之池； c)使步驟(a)之該模板聚核苷酸與步驟(b)之該聚核苷酸池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個經黏接之片段聚核苷酸之間； d)提供核苷三磷酸池； e)提供聚合酶； f)使用該核苷三磷酸池及該聚合酶延伸至少一個經黏接之片段聚核苷酸以填充至少一個序列缺口； g)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成該單股聚核苷酸產物； h)視情況改變條件以使該經黏接之模板及任何雜質變性，且分離該等雜質；及 i)改變條件以使該經黏接之模板及該單股聚核苷酸產物變性且視情況分離該單股聚核苷酸產物。
步驟a)至i)中之兩者或更多者可同時進行，視情況步驟f)及g)可同時進行。步驟a)至i)中之兩者或更多者可依序進行，視情況步驟f)及g)可依序進行。
在上述方法中之任一者中，方法可另外包含回收模板之另一步驟(步驟j)。方法可另外包含用回收模板重複先前步驟(步驟a)至i)或步驟a)至j))之另一步驟(步驟k)。
本發明亦提供一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之單股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)提供包含與該單股聚核苷酸產物互補之序列及以下的模板聚核苷酸： i)用作聚合酶之引子的髮夾環， ii)用作聚合酶之終止子的髮夾環，或 iii)該模板聚核苷酸之兩端之髮夾環，其中一個髮夾環用作聚合酶之引子且另一個髮夾環用作聚合酶之終止子； b)使該模板聚核苷酸與至少一個片段聚核苷酸之池在允許該至少一個片段聚核苷酸黏接至該模板聚核苷酸之條件下接觸以產生模板聚核苷酸，其中該至少一個片段聚核苷酸黏接至其上，其中至少一個序列缺口形成於該經黏接之片段聚核苷酸與該髮夾環之末端之間； c)使用核苷三磷酸池及聚合酶延伸經黏接之片段聚核苷酸或髮夾環之末端，以填充至少一個序列缺口以產生至少一個延伸片段聚核苷酸或延伸髮夾聚核苷酸； d)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段/髮夾聚核苷酸以形成呈雙螺旋體形式結合於該模板聚核苷酸之單股聚核苷酸產物； e)自該模板聚核苷酸裂解該單股聚核苷酸產物；及 f)改變條件以使包含該單股聚核苷酸產物及該模板聚核苷酸之該雙螺旋體變性，藉此製造該單股聚核苷酸產物。裂解步驟可藉由核酸酶、切口酶、脫氧核酶或藉由化學方法進行。
本發明亦提供一種用於製造雙股聚核苷酸產物之方法，該方法包含使兩個互補單股聚核苷酸產物黏接，該等產物中之至少一者已藉由本發明之方法製造，視情況其中兩者均已藉由本發明之方法製造。
本發明亦提供一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之雙股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)使包含與單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸與至少兩個片段聚核苷酸之池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸以產生其上黏接有該等至少兩個片段聚核苷酸的模板聚核苷酸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個黏接之片段聚核苷酸之間； b)使用核苷三磷酸池及聚合酶延伸該等黏接之片段聚核苷酸中之至少一者，以填充該至少一個序列缺口以產生至少一個延伸片段聚核苷酸； c)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成呈雙螺旋體形式結合於該模板聚核苷酸之該單股聚核苷酸產物； d)視情況改變條件以使該包含該單股模板聚核苷酸及雜質聚核苷酸之雙螺旋體變性，及自該模板聚核苷酸分離任何雜質聚核苷酸； e)改變條件以使包含該單股聚核苷酸產物及該模板聚核苷酸之該雙螺旋體變性，藉此製造該單股聚核苷酸產物；及 f)使用該單股聚核苷酸產物作為步驟a)中之該模板聚核苷酸且重複步驟a)至c)或步驟a)至d)以製造該雙股聚核苷酸產物。
不受理論束縛，已發現此等方法藉由允許片段聚核苷酸及/或寡核苷酸製造之步驟及連接方法步驟使用相同模板來降低聚核苷酸或寡核苷酸產物之製造的複雜度。並行片段聚核苷酸及/或寡核苷酸延伸及連接可進一步在製造聚核苷酸及/或寡核苷酸產物中進行。此等方法可有助於控制最終產物之對掌性且減少連接步驟之數目，減少總反應時間。
本發明亦提供一種用於製造雙股聚核苷酸或寡核苷酸產物之方法，其中在允許黏接之條件下混合藉由本發明之方法製造的兩個互補單股聚核苷酸或寡核苷酸。
或者，本發明亦提供一種用於製造雙股聚核苷酸或寡核苷酸產物之方法，其中該單股聚核苷酸或寡核苷酸產物用作及/或用作模板。
例如，本發明提供一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之雙股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)提供包含與單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸； b)提供包含至少兩個片段聚核苷酸的聚核苷酸之池； c)使步驟(a)之該模板聚核苷酸與步驟(b)之該聚核苷酸池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個經黏接之片段聚核苷酸之間； d)提供核苷三磷酸池及聚合酶，且使用該核苷三磷酸池及該聚合酶延伸至少一個經黏接之片段聚核苷酸以填充至少一個序列缺口； e)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成該單股聚核苷酸產物； f)視情況改變條件以使該經黏接之模板及任何雜質變性，且分離該等雜質； g)改變條件以使該經黏接之模板及該單股聚核苷酸產物變性且視情況分離該單股聚核苷酸產物；及 h)使用該單股聚核苷酸產物作為步驟a)中之模板且重複步驟a)至e)或步驟a)至f)以製造雙股聚核苷酸產物。
視情況，雙股聚核苷酸產物經純化。
例如，本發明提供一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之雙股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)提供包含與單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸； b)提供包含至少兩個片段聚核苷酸的聚核苷酸之池； c)使步驟(a)之該模板聚核苷酸與步驟(b)之該聚核苷酸池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個經黏接之片段聚核苷酸之間； d)提供核苷三磷酸池及聚合酶，且使用該核苷三磷酸池及該聚合酶延伸至少一個片段聚核苷酸以填充至少一個序列缺口； e)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成該單股聚核苷酸產物； f)視情況改變條件以使該經黏接之模板及任何雜質變性，且分離該等雜質； g)改變條件以使該經黏接之模板及該單股聚核苷酸產物變性且視情況分離該單股聚核苷酸產物；及 h)使用該單股聚核苷酸產物作為步驟a)中之模板且重複步驟a)至e)或步驟a)至f)以製造雙股聚核苷酸產物， 其中至少一個片段聚核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸殘基及/或該核苷三磷酸池包含至少一個經修飾之核苷酸。
視情況，雙股聚核苷酸產物經純化。
在一些實施例中，至少一個片段聚核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸殘基。在一些實施例中，至少兩個片段聚核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸殘基。在一些實施例中，所有片段聚核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸殘基。
在某些實施例中，步驟(d)中之核苷三磷酸池中的至少一個核苷三磷酸經修飾。在某些實施例中，步驟(d)中之核苷三磷酸池中之A、T、C、G及/或U經修飾。在某些實施例中，步驟(d)中核苷三磷酸池中之全部核苷三磷酸經修飾。
在一些實施例中，步驟I中所用之連接酶用於將各片段聚核苷酸或延伸片段聚核苷酸之3'及/或5'端連接至各相鄰片段聚核苷酸或相鄰延伸片段聚核苷酸以形成產物聚核苷酸股。步驟(e)中所用之連接酶可為RNA及/或DNA連接酶。
在一些實施例中，聚核苷酸池藉由酶促合成、化學合成、視情況固體負載合成或液相合成或其組合來製造。聚核苷酸池可藉由使用單股連接酶、轉移酶、聚合酶或其組合進行酶促合成來製造。
在一些實施例中，修飾係選自由以下組成之群：經修飾之糖部分、核鹼基之修飾及主鏈之修飾。在一些實施例中，至少一個經修飾之核苷酸包含糖部分之修飾、核鹼基之修飾及/或主鏈之修飾。換言之，至少一個經修飾之核苷酸包含經修飾之糖部分、經修飾之核鹼基及/或經修飾之主鏈。
用於本發明方法之聚核苷酸或寡核苷酸可包括糖修飾，亦即核糖基部分之經修飾版本，諸如2'-O-修飾之RNA諸如2'-O-烷基或2'-O-(經取代)烷基，例如2'-O-甲基、2'-O-(2-氰基乙基)、2'-O-(2-甲氧基)乙基(2'-MOE)、2'-O-(2-硫基甲基)乙基、2'-O-丁醯基、2'-O-炔丙基、2'-O-烯丙基、2'-O-(3-胺基)丙基、2'-O-(3-(二甲胺基)丙基)、2'-O-(2-胺基)乙基、2'-O-(2-(二甲胺基)乙基)；2'-去氧(DNA)；2'-O-(鹵烷氧基)甲基(Arai K.等人Bioorg. Med. Chem. 2011, 21, 6285)例如2'-O-(2-氯乙氧基)甲基(MCEM)、2'-O-(2,2-二氯乙氧基)甲基(DCEM)；2'-O-烷氧基羰基，例如2'-O-[2-(甲氧基羰基)乙基] (MOCE)、2'-O-[2-(N-甲基胺甲醯基)乙基] (MCE)、2'-O-[2-(N,N-二甲基胺甲醯基)乙基] (DCME)；2'-鹵基，例如2'-F、FANA (2'-F 阿拉伯糖基核酸)；卡巴糖(carbasugar)及氮雜糖(azasugar)修飾；3'-O-烷基，例如3'-O-甲基、3'-O-丁醯基、3'-0-炔丙基；及其衍生物。
在本發明之一實施例中，糖修飾選自由以下組成之群：2'-氟(2'-F)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)及2'-胺基。在又一實施例中，修飾為2'-MOE。
其他糖修飾包括「橋聯」或「雙環」核酸(BNA)，例如鎖核酸(LNA)、xylo-LNA、α-L-LNA、β-D-LNA、cEt (2'-O、4'-C經約束乙基) LNA、cMOEt (2'-O、4'-C經約束甲氧基乙基) LNA、伸乙基橋聯核酸(ENA)、三環DNA；解鎖核酸(UNA)；環己烯基核酸(CeNA)；阿卓糖醇核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)、氟化HNA (F-HNA)、哌喃糖基-RNA (p-RNA)、3'-去氧哌喃糖基-DNA (p-DNA)；嗎啉基(例如在PMO、PPMO、PMOPlus、PMO-X中)；及其衍生物。
用於本發明方法之聚核苷酸或寡核苷酸可包括其他修飾，諸如基於肽之核酸(PNA)、經硼修飾之PNA、基於吡咯啶之氧基-肽核酸(POPNA)、基於乙二醇或丙三醇之核酸(GNA)、基於蘇糖之核酸(TNA)、基於非環狀蘇胺醇之核酸(aTNA)、具有整合鹼基及主鏈之寡核苷酸(ONIB)、吡咯啶-醯胺寡核苷酸(POM)；及其衍生物。
在本發明之一實施例中，經修飾之寡核苷酸包含二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚物(PMO)、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、諸如(S)-cEt-BNA之橋聯核酸(BNA)或亦稱為SPIEGELMER之L-核糖核酸。
在另一實施例中，修飾在核鹼基中。鹼基修飾包括天然嘌呤及嘧啶鹼基(例如腺嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶)之經修飾形式，諸如肌苷、次黃嘌呤、乳清酸、胍丁胺、立西啶、2-硫代嘧啶(例如2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶)、G形夾及其衍生物，5-取代嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-鹵代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-胺基甲基尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、5-胺基甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、Super T)、2,6-二胺基嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、7-去氮腺嘌呤、7-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、8-氮雜-7-去氮鳥嘌呤、8-氮雜-7-去氮腺嘌呤、8-氮雜-7-去氮-2,6-二胺基嘌呤、Super G、Super A及N4-乙基胞嘧啶或其衍生物；N2-環戊基鳥嘌呤(cPent-G)、N2-環戊基-2-胺基嘌呤(cPent-AP)及N2-丙基-2-胺基嘌呤(Pr-AP)或其衍生物；及簡併或通用鹼基，如2,6-二氟甲苯或無鹼基，如無鹼基位點(例如1-去氧核糖、1,2-二去氧核糖、1-去氧-2-O-甲基核糖；或環氧已經氮(氮雜核糖)置換之吡咯啶衍生物)。Super A、Super G及Super T之衍生物之實例可見於US6683173中。當併入siRNA時，cPent-G、cPent-AP及Pr-AP顯示降低免疫刺激作用(Peacock H.等人J. Am. Chem. Soc. (2011), 133, 9200)。
在本發明之一實施例中，核鹼基修飾係選自由以下組成之群：5-甲基嘧啶、7-去氮鳥苷及無鹼基核苷酸。在一實施例中，修飾為5-甲基胞嘧啶。
用於本發明方法之聚核苷酸或寡核苷酸可包括主鏈修飾，例如RNA中存在之磷酸二酯之經修飾形式，諸如硫代磷酸酯(PS)、二硫代磷酸酯(PS2)、膦醯基乙酸酯(PACE)、膦醯基乙醯胺(PACA)、硫代膦醯基乙酸酯、硫代膦醯基乙醯胺、硫代磷酸酯前藥、H-膦酸酯、膦酸甲酯、硫代膦酸甲酯、磷酸甲酯、硫代磷酸甲酯、磷酸乙酯、硫代磷酸乙酯、硼代磷酸酯、硼代硫代磷酸酯、硼代磷酸甲酯、硼代硫代磷酸甲酯、硼代膦酸甲酯、硼代硫代膦酸甲酯及其衍生物。其他修飾包括胺基亞磷酸酯、胺基磷酸酯、3'→P5'胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、二胺基硫代磷酸酯、胺基磺酸酯、二亞甲基亞碸、磺酸酯、三唑、草醯基、胺基甲酸酯、亞甲基亞胺基(MMI)及硫代乙醯胺基核酸(TANA)；及其衍生物。
在另一實施例中，修飾在主鏈中且選自由以下組成之群：硫代磷酸酯(PS)、胺基磷酸酯(PA)、二胺基磷酸酯及二硫代磷酸酯(PS2)。在本發明之一實施例中，經修飾之寡核苷酸為二胺基磷酸酯嗎啉基寡聚物(PMO)。PMO具有具有二胺基磷酸酯鍵之亞甲基嗎啉環的主鏈。在本發明之一實施例中，產物具有硫代磷酸酯(PS)主鏈。在本發明之一實施例中，產物在主鏈中具有至少一個硫代磷酸酯(PS)鍵。
在本發明之一實施例中，寡核苷酸包含兩個或更多個依本文所揭示之修飾的組合。熟習此項技術者將理解，存在寡核苷酸及其組成性核苷酸之許多合成衍生物。
修飾可包含糖部分、雙環糖或4'-CH(CH 3)-O-2'基團及其組合之2'位置處的修飾。糖部分之2'位置處的修飾可包含2'-MOE。經修飾之核鹼基可包含胞嘧啶，視情況5-甲基胞嘧啶。核鹼基中之修飾可選自包含5-甲基嘧啶、7-去氮鳥苷及無鹼基核苷酸之群。主鏈中之修飾可選自包含以下之群：硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯及二硫代磷酸酯。
在實施例中，各聚核苷酸片段可由連接的2'-去氧核苷酸或去氧核苷組成。在實施例中，至少一個或各核苷間鍵可為經修飾之核苷間鍵。
在實施例中，單股聚核苷酸產物可為DNA聚核苷酸產物、RNA聚核苷酸產物或其組合。RNA聚核苷酸產物可為mRNA。在實施例中，核苷酸修飾可包含一或多個尿嘧啶殘基之取代。至少一個經修飾之核苷酸可包含1-甲基-假尿苷、5-甲氧基-尿嘧啶、1-乙基-假尿嘧啶、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、5-甲基-胞苷、5-甲基-胞嘧啶、N6-甲基腺苷或7-甲基鳥苷或其組合。在一實施例中，單股聚核苷酸產物為mRNA，其中各U殘基為N1-甲基-假尿苷。在一實施例中，單股聚核苷酸產物為mRNA，其中各U殘基為N1-甲基-假尿苷且主鏈為硫代磷酸酯主鏈。
在一些實施例中，步驟(d)中所用之聚合酶缺乏5'至3'核酸外切酶活性。在一些實施例中，步驟(d)中所用之聚合酶缺乏3'至5'核酸外切酶活性。在一些實施例中，步驟(d)中所用之聚合酶缺乏5'至3'核酸外切酶活性且缺乏3'至5'核酸外切酶活性。
在實施例中，步驟(d)中所用之聚合酶可為DNA聚合酶、RNA聚合酶或其組合。
製程之步驟可按順序進行。只要並不致使技術方案無法實施，可重新排序製程之步驟。當提供核苷三磷酸池、提供聚合酶且使用核苷三磷酸池及聚合酶延伸至少一個片段聚核苷酸以填充至少一個序列缺口作為獨立步驟進行時，只要在片段聚核苷酸或寡核苷酸黏接至模板後添加聚合酶，即可在任何前述步驟中提供核苷三磷酸池。或者，只要在片段聚核苷酸或寡核苷酸黏接至模板後添加核苷三磷酸池，即可在任何前述步驟中提供聚合酶。在一些實施例中，兩個或更多個步驟同時進行。在一些實施例中，步驟a)至g)中之兩個或更多個同時進行。在一些實施例中，兩個或更多個步驟依序進行。在一些實施例中，步驟a)至g)中之兩個或更多個依序進行。在一些實施例中，製程之步驟(d)及(e)同時進行。在其他實施例中，製程之步驟(d)及(e)依序進行。
在實施例中，模板聚核苷酸或寡核苷酸可由與單股聚核苷酸或寡核苷酸產物之序列互補的序列組成。
在實施例中，模板聚核苷酸為髮夾環之一部分。術語髮夾環及莖環可互換使用。髮夾環可為不對稱的。髮夾環可為DNA髮夾環。髮夾環可為RNA髮夾環。若模板聚核苷酸包含髮夾環，則聚合酶可能不需要引子來起始聚合。使用酶在髮夾環與產物聚核苷酸股之間引入單股切割(例如使用切口酶)，接著使經黏接之模板聚核苷酸及產物聚核苷酸股變性，可使單股聚核苷酸產物自模板及髮夾環釋放。
在實施例中，單股聚核苷酸產物可為3至40個核苷酸長、3至35個核苷酸長、或3至30個核苷酸長、視情況10至35個核苷酸長、10至30個核苷酸長、3至15個核苷酸長、13至35個核苷酸長、15至35個核苷酸長、13至30個核苷酸長、15至30個核苷酸長、13至25個核苷酸長、15至25個核苷酸長、13至20個核苷酸長、15至20個核苷酸長、17至25個核苷酸長、20至25個核苷酸長、或20至30個核苷酸長。在一實施例中，產物為20個核苷酸長且包含三個片段聚核苷酸，其包含： (i) 7個核苷酸長之5'-片段、6個核苷酸長之中心片段及7個核苷酸長之3'-片段； (ii) 6個核苷酸長之5'-片段、8個核苷酸長之中心片段及6個核苷酸長之3'-片段； (iii) 5個核苷酸長之5'-片段、10個核苷酸長之中心片段及5個核苷酸長之3'-片段； (iv) 4個核苷酸長之5'-片段、12個核苷酸長之中心片段及4個核苷酸長之3'-片段；或 (v) 3個核苷酸長之5'-片段、14個核苷酸長之中心片段及3個核苷酸長之3'-片段。單股聚核苷酸產物可為間隔體反義聚核苷酸，其包含中心區域、位於中心區域之5'端的5'翼區及位於中心區域之3'端的3'翼區。此尤其適用於治療性寡核苷酸生產，其中生產高度序列特異性寡核苷酸產物至關重要。
在實施例中，至少兩個片段聚核苷酸包含： (i) 7個核苷酸長之5'-片段及7個核苷酸長之3'-片段； (ii) 6個核苷酸長之5'-片段及6個核苷酸長之3'-片段； (iii) 5個核苷酸長之5'-片段及5個核苷酸長之3'-片段； (iv) 4個核苷酸長之5'-片段及4個核苷酸長之3'-片段；或 (v) 3個核苷酸長之5'-片段及3個核苷酸長之3'-片段。
在實施例中，單股聚核苷酸產物可為30至20,000個核苷酸長，視情況30至10,000個核苷酸長、30至5,000個核苷酸長、30至4,000個核苷酸長、30至3,000個核苷酸長、30至2,000個核苷酸長、30至1,000個核苷酸長、30至500個核苷酸長、30至400個核苷酸長、30至300個核苷酸長、30至200個核苷酸長、30至100個核苷酸長、30至50個核苷酸長或30至40個核苷酸長。此等產物可用於例如治療性mRNA生產，其中生產高度序列特異性聚核苷酸產物至關重要。
在另一實施例中，單股聚核苷酸產物大於30個核苷酸長。在另一實施例中，單股聚核苷酸產物大於35個核苷酸長。在另一實施例中，長度為至少40個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少45個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少55個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少60個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少60個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少80個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少90個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少100個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少120個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少140個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少160個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少180個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少200個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少250個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少300個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少350個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少400個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少450個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少500個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少600個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少700個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少800個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少900個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少1000個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少1100個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少1200個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少1300個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少1400個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少1500個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少1600個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少1800個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少2000個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少2500個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少3000個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少4000個核苷酸。在另一實施例中，長度為至少5000個核苷酸，或超過5000個核苷酸。
在實施例中，模板具有允許其與產物分離且回收用於將來反應之特性。該製程可包含回收模板之最終步驟。該製程可包含步驟j)回收模板。該製程可包含回收模板用於將來反應之最終步驟。該製程可包含步驟j)回收模板用於將來反應。該製程可包含回收模板及重複該製程之最終步驟。該製程可包含回收模板及重複該製程之一或多個步驟的最終步驟。該製程可包含步驟j)回收模板及步驟k)重複步驟a)至i)。該製程可包含步驟j)回收模板及步驟k)重複步驟a)至k)。
本文所描述之製程可為半連續或連續的。
提供以公克級或公斤級或更大規模製造產物及/或在至少1 L之反應體積中進行製程的方法。提供以公克級、公斤級或更大規模製造產物的方法。提供在至少200 mL之反應體積中進行製程的方法。提供在至少500 mL之反應體積中進行製程的方法。提供在至少1 L之反應體積中進行製程的方法。提供在至少2 L之反應體積中進行製程的方法。提供在至少5 L之反應體積中進行製程的方法。
所得單股聚核苷酸或寡核苷酸產物可為至少90%純度、至少95%純度或至少98%純度。
方法可用於生產治療性聚核苷酸或寡核苷酸。在實施例中，方法為用於產生單股治療性聚核苷酸或寡核苷酸之方法。在實施例中，方法為用於產生雙股治療性聚核苷酸或寡核苷酸之方法。此等方法可用於例如治療性寡核苷酸生產，其中生產高度序列特異性寡核苷酸產物至關重要。該等產物亦可用於例如治療性mRNA生產，其中生產高度序列特異性聚核苷酸產物至關重要。
提供由溫度增加使模板及雜質雙螺旋體變性及/或使模板及產物雙螺旋體變性的方法。在實施例中，變性可由於pH變化而發生。在實施例中，變性可藉由改變緩衝溶液中之鹽濃度而發生。
提供片段寡核苷酸為3至15個核苷酸長之方法。在實施例中，片段可為5至10個核苷酸長。在實施例中，片段可為5至8個核苷酸長。在實施例中，片段可為4、5、6、7或8個核苷酸長。在實施例中，存在三個片段寡核苷酸：7個核苷酸長之5'-片段，6個核苷酸長之中心片段及7個核苷酸長之3'-片段，其在連接在一起時形成20個核苷酸長之寡核苷酸(「20-聚體」)。在實施例中，存在三個片段寡核苷酸：6個核苷酸長之5'-片段，8個核苷酸長之中心片段及6個核苷酸長之3'-片段，其在連接在一起時形成20個核苷酸長之寡核苷酸(「20-聚體」)。在實施例中，存在三個片段寡核苷酸：5個核苷酸長之5'-片段，10個核苷酸長之中心片段及5個核苷酸長之3'-片段，其在連接在一起時形成20個核苷酸長之寡核苷酸(「20-聚體」)。在實施例中，存在三個片段寡核苷酸：4個核苷酸長之5'-片段，12個核苷酸長之中心片段及4個核苷酸長之3'-片段，其在連接在一起時形成20個核苷酸長之寡核苷酸(「20-聚體」)。在實施例中，存在四個片段寡核苷酸：5個核苷酸長之5'-片段，5個核苷酸長之5'-中心片段、5個核苷酸長之中心-3'-片段及5個核苷酸長之3'-片段，其在連接在一起時形成20個核苷酸長之寡核苷酸(「20-聚體」)。
提供產物為3至40個核苷酸長之方法。在實施例中，產物可為13至40個核苷酸長。在實施例中，產物可為15至40個核苷酸長。在實施例中，產物可為13至35個核苷酸長。在實施例中，產物可為15至35個核苷酸長。在實施例中，產物可為15至30個核苷酸長。在實施例中，產物可為13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸長。在本發明之一實施例中，產物為20個核苷酸長，即「20-聚體」。在本發明之一實施例中，產物為21個核苷酸長，即「21-聚體」。在本發明之一實施例中，產物為22個核苷酸長，即「22-聚體」。在本發明之一實施例中，產物為23個核苷酸長，即「23-聚體」。在本發明之一實施例中，產物為24個核苷酸長，即「24-聚體」。在本發明之一實施例中，產物為25個核苷酸長，即「25-聚體」。在本發明之一實施例中，產物為26個核苷酸長，即「26-聚體」。在本發明之一實施例中，產物為27個核苷酸長，即「27-聚體」。在本發明之一實施例中，產物為28個核苷酸長，即「28-聚體」。在本發明之一實施例中，產物為29個核苷酸長，即「29-聚體」。在本發明之一實施例中，產物為30個核苷酸長，即「30-聚體」。此類產物具有實用性，例如在間隔體生產中。在一實施例中，此類3至40個核苷酸長之單股產物為治療性反義間隔體。在一實施例中，此類3至40個核苷酸長之產物為治療性雙股產物，諸如siRNA及miRNA。在一實施例中，此類3至40個核苷酸長之產物為募集且引導DNA及/或RNA編輯酶之寡核苷酸，例如RNA鹼基修飾之寡核苷酸，諸如AI聚體。
提供產物為至多10,000個核苷酸長之方法。在實施例中，單股聚核苷酸產物可為10至10,000個核苷酸長，視情況10至5,000個核苷酸長、10至1,000個核苷酸長、10至500個核苷酸長、10至400個核苷酸長、10至300個核苷酸長、10至200個核苷酸長、10至100個核苷酸長、10至50個核苷酸長或10至40個核苷酸長。此類產物具有實用性，例如作為治療性mRNA聚核苷酸。
提供其中允許模板與產物分離之特性為模板連接至載體材料的方法。在實施例中，載體材料為可溶性載體材料。在實施例中，可溶性載體材料係選自由以下組成之群：聚乙二醇、可溶有機聚合物、DNA、蛋白質、樹枝狀聚合物、多醣、寡醣及碳水化合物。在實施例中，載體材料為聚乙二醇(PEG)。在實施例中，載體材料為不溶性載體材料。在實施例中，載體材料為固體載體材料。在實施例中，固體載體材料選自由以下組成之群：玻璃珠粒、聚合物珠粒、纖維載體、膜、鏈黴抗生物素蛋白包覆之珠粒及纖維素。在實施例中，固體載體材料為經鏈黴抗生物素蛋白包覆之珠粒。在實施例中，固體載體材料為反應容器自身之一部分，例如反應壁。
提供模板之重複複本以連續方式經由單連接點連接至載體物質的方法。模板之重複複本可藉由連接子分開，例如圖2中所示。模板之重複複本可為直接重複，亦即其不藉由連接子分開。
在實施例中，模板在多個連接點連接至載體物質。
提供允許模板與產物分離之特性為模板之分子量的方法。例如，模板序列之重複複本可以或不以連接子序列存在於單一聚核苷酸或寡核苷酸上。
提供模板或模板及載體物質再循環用於未來反應中之方法，例如以下詳述。提供反應使用連續或半連續流程進行之方法。
在實施例中，方法用於聚核苷酸或寡核苷酸，視情況治療性聚核苷酸或寡核苷酸之大規模製造。在本發明中，聚核苷酸或寡核苷酸之大規模製造意謂以大於或等於1公升之規模製造，例如製程在1 L或更大反應器中進行。或者，或另外，在本發明中，聚核苷酸或寡核苷酸之大規模製造意謂以產物之公克規模製造，尤其大於或等於10公克產物之製造。在實施例中，以公克規模或公斤規模製造產物及/或在至少1 L之反應器中進行製程。在實施例中，所製造聚核苷酸或寡核苷酸產物之量為公克規模。在本發明之一個實施例中，所製造產物之量大於或等於：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100公克。在實施例中，所製造寡核苷酸產物之量大於或等於：150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950公克。在實施例中，所製造聚核苷酸或寡核苷酸產物之量為500公克或更多。在實施例中，所製造聚核苷酸或寡核苷酸產物為公斤規模。在實施例中，所製造聚核苷酸或寡核苷酸產物之量為1 kg或更多。在實施例中，所產生聚核苷酸或寡核苷酸產物之量大於或等於：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 kg。在實施例中，所產生聚核苷酸或寡核苷酸產物之量大於或等於：15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100 kg。
在實施例中，所產生產物之量在10公克與100 kg之間。在實施例中，所產生產物之量在10公克與50 kg之間。在實施例中，所產生產物之量在100公克與100 kg之間。在實施例中，所產生產物之量在100公克與50 kg之間。在實施例中，所產生產物之量在500公克與100 kg之間。在實施例中，所產生產物之量在500公克與50 kg之間。在實施例中，所產生產物之量在1 kg與50 kg之間。在實施例中，所產生產物之量在10 kg與50 kg之間。
在實施例中，聚核苷酸或寡核苷酸製造以大於或等於以下之規模：2、3、4、5、6、7、8、9、10公升，例如在2、3、4、5、6、7、8、9或10 L反應器中進行。在實施例中，聚核苷酸或寡核苷酸製造以大於或等於以下之規模：20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100公升，例如在20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 L反應器中進行。在實施例中，聚核苷酸或寡核苷酸製造以大於或等於以下之規模：150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000公升，例如在150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000 L反應器中進行。
在實施例中，反應器體積為約10,000 L、約5000 L、約2000 L、約1000 L、約500 L、約125 L、約50 L、約20 L、約10 L或約5 L。
在實施例中，反應器體積在5與10,000 L之間、在10與5000 L之間、在20與2000 L之間或在50與1000 L之間。
提供用於使用聚合酶及連接酶製造聚核苷酸之方法。使用與兩個或更多個互補聚核苷酸或寡核苷酸序列(例如片段)結合的模板聚核苷酸。聚合酶用於填充互補聚核苷酸或寡核苷酸序列之間的各缺口。相鄰序列使用連接酶融合在一起。有利地，整個製程可為完全酶促，降低複雜度且提高該製程之效率。兩個或更多個互補聚核苷酸或寡核苷酸序列可包括經修飾之核苷酸。或者或另外，藉由聚合酶引入之核苷酸可包括經修飾之核苷酸。此允許製造治療性聚核苷酸及寡核苷酸，其可為短寡核苷酸(例如，10至30個核苷酸長)或長聚核苷酸(例如，30至10,000個核苷酸長)。兩個或更多個互補聚核苷酸或寡核苷酸序列可連接至模板聚核苷酸且聚合酶可填充各互補聚核苷酸或寡核苷酸序列之間的各缺口。連接酶可隨後用於將各相鄰序列連接在一起。
最終單股產物可使用本文所描述之方法與模板分離。視情況，模板可具有依本文中所描述之特性，其允許模板回收以用於將來反應。
在一個實例中，提供用於產生間隔體之方法，該間隔體為通常具有10至30個核苷酸之長度，含有至少一個經修飾之核苷酸殘基的寡核苷酸。通常，間隔體含有含有未經修飾之核苷酸殘基的中心區域及中心區域任一側之兩個翼區(5'及3'翼)，該等翼區各自含有至少一個經修飾之核苷酸殘基。在一實施例中，聚合酶用於產生間隔體之中心區域。在一個實施例中，5'-片段可用作聚合酶之引子以產生間隔體之中心區域，且3'-片段可用作聚合酶之終止子。連接酶可隨後用於將中心片段與3'-區段融合以產生間隔體產物。在一實施例中，聚合酶用於產生間隔體之中心區域的一部分。在一個實施例中，5'-片段可用作聚合酶之引子以產生間隔體之片段，且3'-片段可用作聚合酶之終止子序列。5'-片段可包含翼區或由翼區組成。5'-片段可包括翼區之一部分。3'-片段可包含翼區或由翼區組成。3'-片段可包括翼區之一部分。以此方式，藉由減少生產輪數來顯著降低製程之複雜度。在一實施例中，中心區域包含藉由硫代磷酸酯鍵連接之去氧核苷酸或由其組成，亦即中心區域中不存在糖修飾，但主鏈為完全硫代磷酸酯主鏈，且聚合酶用於產生間隔體之中心區域。在一實施例中，5'-片段為引子且3'-片段為終止子且各片段包含藉由硫代磷酸酯鍵連接之經2'-MOE糖修飾之核苷酸或由其組成。在一實施例中，間隔體之中心區域包含藉由硫代磷酸酯鍵連接之去氧核苷酸或由其組成，聚合酶用於產生間隔體之中心區域；且5'-片段為引子且3'-片段為終止子且各片段包含藉由硫代磷酸酯鍵連接之經2'-MOE糖修飾之核苷酸或由其組成。在一實施例中，間隔體具有完全硫代磷酸酯主鏈、完全2'MOE糖修飾之5'翼、完全2'MOE糖修飾之3'翼、完全去氧核糖之中心區域，且該間隔體係使用對應於5'翼之5'-片段作為引子、對應於3'翼之3'-片段作為終止子及聚合酶及去氧核苷α-硫代三磷酸池產生中心區域而產生。在實施例中，間隔體係5-10-5間隔體。
在傳統的聚核苷酸製造方法(例如，固相合成)中，以模板獨立性方式將單一核苷酸添加至單股寡核苷酸，從而使得合成具有確定序列的寡核苷酸。此方法可用於藉由反覆添加單一鹼基製造完整寡核苷酸產物。然而，除非各合成循環以100%產率運行，否則序列缺失誤差將併入最終產物中。例如，若寡核苷酸在合成循環中延伸一個具有99%產率之核苷酸，則剩餘1%將可用於在後續合成循環中反應，但所形成之產物將比所需產物短一個核苷酸。隨著循環次數增加，隨後誤差率增加，因此，在此實例中，99%循環產率將導致形成20%單一鹼基縮短序列以產生20聚體。
嘗試僅使用通常為5至8個核苷酸長，藉由使用能夠將單一核苷酸添加至單股寡核苷酸之連接酶或轉移酶添加單一核苷酸來合成的短序列來克服此問題，已產生具有比長序列更高純度之短序列，因為其暴露於更少的誤差累積循環。此等短序列組裝於互補DNA模板上，且隨後連接在一起。互補模板與連接酶結合使用確保僅組裝具有正確長度及正確序列兩者之短寡核苷酸。然而，此類方法仍需要多輪合成以將各核苷酸添加至另一核苷酸以產生各短序列，隨後將其組合。此為耗時且複雜的。
因此，本發明之方法產生用於製造具有高總產率及高總序列保真度之單股寡核苷酸及聚核苷酸產物的更高效方法。
根據本發明，藉由使用聚合酶以及連接酶，單股寡核苷酸及聚核苷酸產物無需重複多輪化學合成即可以高效方法製備。
亦避免誤差之連續累積。首先，藉由使用產物序列之至少兩個片段，且使用聚合酶填充缺口，此允許多個較短序列組成最終產物，其例如藉由固相合成提供較少可能引入誤差之合成輪數。聚合酶亦具有高序列保真度，減少誤差併入之機會。此進一步減少對商業寡核苷酸及聚核苷酸製造製程之規模擴大的限制。
其次，最終產物在互補聚核苷酸模板上之組裝及隨後連接確保片段以正確的順序及對掌性組合，具有最終產物所需之正確長度及序列。此使得能夠產生高度精確的個性化最終產物。
在一例示性實施例中，製程為完全酶促的，其使得能夠減少合成輪數且增加效率。實際上，聚合酶與連接酶步驟可同時進行，使得最終產物可在一輪製程中製造。當聚合酶與連接酶步驟同時進行時，此可稱為「一鍋」。
在另一例示性實施例中，藉由使用(與依本文中所描述之模板聚核苷酸或寡核苷酸組合)與模板之3'端互補的聚合酶之短引子序列進一步簡化方法且產生提高之效率。聚合酶隨後沿模板延伸引子序列。與模板之5'端互補的終止子可用於終止聚合酶。當將正確量之核苷三磷酸添加至反應時，可省去終止序列。此減少所需之核苷酸添加輪數及所需之連接次數，從而產生具有高總產率及高總序列保真度之更有效製程。
在實施例中，聚合酶經修飾以移除依本文中所描述之3'至5'核酸外切酶活性及5'至3'核酸外切酶活性以減少或防止片段聚核苷酸或寡核苷酸序列之破壞。
在一實施例中，聚核苷酸產物為mRNA且編碼區包含未經修飾之核苷酸，不同之處在於尿苷殘基經假尿苷或N1-甲基-假尿苷置換。在一實施例中，聚合酶用於製造mRNA之部分或全部編碼區。在一實施例中，5'-UTR、3'-UTR或5'-UTR及3'-UTR兩者包含一或多個經修飾之核苷酸。在一實施例中，硫代磷酸酯鍵包括於胞苷或胞苷及尿苷兩者之5'-UTR中。在一實施例中，poly-A尾包含一或多個不易受3'-5'核酸外切酶影響之修飾。在一實施例中，poly-A尾包含一或多個硫代磷酸酯鍵。在一實施例中，poly-A尾在其3'端包含硫代磷酸酯鍵。在一實施例中，poly-A尾在其3'端包含至少6個硫代磷酸酯鍵。
依本文所描述，根據本發明之聚核苷酸或寡核苷酸產物可具有至少一個經修飾之糖部分、核鹼基之修飾及/或主鏈之修飾。
在實施例中，一或多個片段聚核苷酸或寡核苷酸可具有至少一個經修飾之核苷酸殘基。在實施例中，所有片段聚核苷酸或寡核苷酸具有至少一個經修飾之核苷酸殘基。在其他實施例中，一或多個片段聚核苷酸或寡核苷酸可不具有經修飾之核苷酸殘基。在實施例中，聚合酶可將至少一個經修飾之核苷酸殘基併入延伸序列中。在其他實施例中，聚合酶可將未經修飾之核苷酸殘基併入延伸序列中。
在一些實施例中，一或多個片段聚核苷酸或寡核苷酸可具有至少一個經修飾之核苷酸殘基且聚合酶可將至少一個經修飾之核苷酸殘基併入延伸序列中。在一些實施例中，一或多個片段聚核苷酸或寡核苷酸可具有至少一個經修飾之核苷酸殘基且聚合酶可將未經修飾之核苷酸殘基併入延伸序列中。在一些實施例中，一或多個片段聚核苷酸或寡核苷酸可不具有經修飾之核苷酸殘基且聚合酶可將至少一個經修飾之核苷酸殘基併入延伸序列中。在一些實施例中，一或多個片段聚核苷酸或寡核苷酸可不具有經修飾之核苷酸殘基且聚合酶可將未經修飾之核苷酸殘基併入延伸序列中。
在實施例中，產物可為間隔體。在實施例中，翼區(視情況5'-及/或3'-片段寡核苷酸)可包含主鏈及糖修飾，且中心區域可包含主鏈修飾，但無糖修飾。在實施例中，翼區可包含至少一個糖修飾或可完全由經修飾之糖組成。在實施例中，間隔體之5'及3'翼包含2'-MOE修飾之核苷酸或由其組成。在實施例中，間隔體之中心區域包含在糖部分之2'位置含有氫的核苷酸(亦即DNA樣)或由其組成。在實施例中，間隔體之5'及3'翼由2'MOE修飾之核苷酸組成，且間隔體之中心區域由在糖部分之2'位置含有氫的核苷酸(亦即去氧核苷酸)組成。在實施例中，間隔體之5'及3'翼由2'MOE修飾之核苷酸組成且間隔體之中心區域由在糖部分之2'位置含有氫的核苷酸(亦即去氧核苷酸)組成，且所有核苷酸之間的鍵為硫代磷酸酯鍵。在一個實施例中，間隔體選自由以下組成之群：巴利弗森(baliforsen)、貝匹羅韋生(bepirovirsen)、庫司替森(custirsen)、達普斯侖(daplusiran)、東達羅森(donidalorsen)、艾隆特森(eplontersen)、福侖塞生(frenlosirsen)、伊諾特森(inotersen)、拉德米森(lademirsen)、米泊美生(mipomersen)、奧列紮森(olezarsen)、托米納森(tominersen)、優來那生(ulefnersen)、沃拉內索森(volanesorsen)及澤甘那生(zilganersen)。在實施例中，間隔體係5-10-5間隔體。在實施例中，間隔體係6-8-6間隔體。在實施例中，間隔體係4-12-4間隔體。在實施例中，間隔體係7-6-7間隔體。
提供其中所得產物超過90%純度之方法。在實施例中，產物可大於95%純度。在實施例中，產物可大於96%純度。在實施例中，產物可大於97%純度。在實施例中，產物可大於98%純度。在實施例中，產物可大於99%純度。聚核苷酸或寡核苷酸之純度可使用任何適合之方法測定，例如高效液相層析(HPLC)或質譜分析(MS)，尤其液相層析-MS (LC-MS)、HPLC-MS或毛細管電泳質譜分析(CEMS)。
在一實施例中，所製造之單股聚核苷酸或寡核苷酸選自由以下組成之群：阿利卡弗森(alicaforsen)、Apc001PE、AS1411、巴利弗森、貝匹羅韋生、BIIB080、BIIB094、BIIB101、BIIB105、BIIB115、BIIB121、BIIB132、卡西美生(casimersen)、西地利生(cimdelirsen)、CpG1018、CpG7909、庫司替森、達普斯侖、東達羅森、屈沙培森(drisapersen)、艾隆特森、伊特普森(eteplirsen)、費索莫森(fesomersen)、福米韋生(fomiversen)、福侖塞生、戈洛迪森(golodirsen)、伊美司他(imetelstat)、伊諾特森、ION224、ION260、ION306、ION363、ION455、ION464、ION532、ION541、ION582、ION839、ION859、ION904、IONIS-AGT-L Rx、IONIS-FB-L Rx、IONIS-MAPT Rx、拉德米森、來卡那生(lexanersen)、米泊美生、蒙格森(mongersen)、諾西那生(nusinersen)、NOX-E36、奧列紮森、派加替尼(pegaptanib)、派拉卡森(pelacarsen)、普瑞博森(prexigebersen)、瑞納迪森(renadirsen)、RG6048、魯格那生(rugonersen)、沙帕魯生(sapablursen)、色普法生(sepofarsen)、蘇沃地森(suvodirsen)、托芬森鈉(tofersen sodium)、托米納森、優來那生、烏特沃生(ultevursen)、維來特普利森(vesleteplirsen)、維托拉森(viltolarsen)、沃拉內索森、WVE-003、WVE-004、WVE-006、WVE-N531及澤甘那生。
在實施例中，所製造之聚核苷酸或寡核苷酸為反義聚核苷酸或寡核苷酸。在一實施例中，反義寡核苷酸選自由以下組成之群：阿利卡弗森、巴利弗森、貝匹羅韋生、BIIB080、BIIB094、BIIB101、BIIB105、BIIB115、BIIB121、BIIB132、西地利生、卡西美生、庫司替森、達普斯侖、東達羅森、屈沙培森、艾隆特森、伊特普森、費索莫森、福米韋生、福侖塞生、戈洛迪森、伊美司他、伊諾特森、ION224、ION260、ION306、ION363、ION455、ION464、ION532、ION541、ION582、ION839、ION859、ION904、IONIS-AGT-L Rx、IONIS-FB-L Rx、IONIS-MAPT Rx、拉德米森、來卡那生、米泊美生、蒙格森、諾西那生、奧列紮森、派拉卡森、普瑞博森、瑞納迪森、RG6048、魯格那生、沙帕魯生、色普法生、蘇沃地森、托芬森鈉、托米納森、優來那生、烏特沃生、維來特普利森、維托拉森、沃拉內索森、WVE-003、WVE-004、WVE-N531及澤甘那生。
在實施例中，所製造聚核苷酸或寡核苷酸為適體。在一實施例中，適體為派加替尼(pegaptanib)、Apc001PE、AS1411或NOX-E36。
在實施例中，所製造聚核苷酸或寡核苷酸為mRNA，諸如Cas-9。在一個實施例中，所製造聚核苷酸或寡核苷酸為mRNA疫苗。在一實施例中，mRNA編碼一或多種免疫原。在另一實施例中，此等免疫原係選自呼吸道融合性病毒(RSV)免疫原、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)醣蛋白免疫原、細胞巨大病毒醣蛋白免疫原、冠狀病毒刺突蛋白多肽免疫原、流感病毒免疫原、水痘帶狀疱疹病毒醣蛋白免疫原、人類乳突狀瘤病毒16 (HPV16) E6免疫原、HPV 16 E7免疫原或黃病毒免疫原。在另一實施例中，彼等免疫原可選自冠狀病毒棘蛋白、流感抗原及RSV抗原，諸如蛋白f或蛋白g。
在一實施例中，mRNA係選自由以下組成之群：AZD8601、BNT111、BNT112、BNT113、BNT115、BNT116、BNT122、BNT131、BNT141、BNT142、BNT151、BNT152、BNT153、BNT161、BNT162b2、BNT163 BNT164、BNT165、LUNAR-CF、LUNAR-COV19、LUNAR-FLU、LUNAR-GSDIII、LUNAR-OTC、MEDI1191、mRNA-1273、mRNA-0184、mRNA-1010、mRNA-1020、mRNA-1030、mRNA-1011、mRNA-1012、mRNA-1045、mRNA-1073、mRNA-1189、mRNA-1195、mRNA-1215、mRNA-1230、mRNA-1273、mRNA-1273.211、mRNA-1273.213、mRNA-1273.214、mRNA-1273.222、mRNA-1273.351、mRNA-1273.529、mRNA-1273.617、mRNA-1283、mRNA-1287、mRNA-1345、mRNA-1365、mRNA-1468、mRNA-1574、mRNA-1608、mRNA-1644、mRNA-1647、mRNA-1653、mRNA-1893、mRNA2752、mRNA-3139、mRNA-3283、mRNA-3351、mRNA-3705、mRNA-3745、mRNA-3927、mRNA-4157、mRNA-4359、mRNA-5671、mRNA-6981及VX-522。在另一實施例中，mRNA係選自由以下組成之群：mRNA-1045、 mRNA-1230、mRNA-1345、mRNA-1365、EBV mRNA-1189、mRNA-1195、mRNA-1647、BNT162b2、LUNAR-COV19、mRNA-1073、mRNA-1273.213、mRNA-1273.214、mRNA-1273.222、mRNA-1273.351、mRNA-1273.529、mRNA-1273.617、mRNA-1283、mRNA-1287、mRNA-1345、BNT161、mRNA-1468、BNT113及mRNA-1893。在另一實施例中，mRNA係選自由以下組成之群：mRNA-1045、mRNA-1230、mRNA-1345、mRNA-1365、BNT162b2、LUNAR-COV19、mRNA-1073、mRNA-1273.213、mRNA-1273.214、mRNA-1273.222、mRNA-1273.351、mRNA-1273.529、mRNA-1273.617、mRNA-1283、mRNA-1287、mRNA-1345、BNT161及LUNAR-FLU。
在一實施例中，聚核苷酸或寡核苷酸產物為佐劑。在一實施例中，佐劑為CpG寡核苷酸。在一實施例中，佐劑為CpG1018或CpG7909。
在實施例中，產物為治療性聚核苷酸或寡核苷酸。
在實施例中，該方法可製造雙股聚核苷酸或寡核苷酸，其中藉由依本文中所描述之方法產生兩個互補單股聚核苷酸或寡核苷酸，且隨後在允許黏接之條件下混合，此類條件對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。在一實施例中，產物為siRNA。在一實施例中，siRNA選自由以下組成之群：ALN-AAT02、ALN-APP、ALN-TTRsc04、ALN-HBV02、ALN-HSD、ALN-KHK、ALN-PNP、ARO-AAT、ARO-ANG3、AOC 1001、AOC 1020、AOC 1044、ARO-APOC3、ARO-C3、ARO-COV、ARO-DUX4、ARO-ENaC2、ARO-MUC5AC、ARO-MMP7、ARO-PNPLA3、ARO-RAGE、貝爾賽侖(belcesiran)、西姆地侖(cemdisiran)、克多斯侖(cosdosiran)、達普斯侖、DCR-AUD、DCR-CM3、DCR-CM4、DCR-COMP1、DCR-COMP2、DCR-LIV2、DCR-LLY11、DCR-LLY12、DCR-NOVO1、DCR-NOVO2、依來司蘭(elebsiran)、法齊西蘭(fazirsiran)、菲圖司蘭(fitusiran)、吉沃西蘭(givosiran)、HZN-457、英克西蘭(inclisiran)、JNJ-3989、魯馬西蘭(lumasiran)、LY3561774、LY3819469、尼多斯侖(nedosiran)、奧帕斯侖(olpasiran)、帕替斯喃(patisiran)、萊弗斯喃(revusiran)、RG6346、RIM730、SLN124、SLN501、SLN-HAN-1、SLN-MNK-2、SLN-MNK-3、SLN-AZ-1、SLN-AZ-2、STP122G、STP125G、STP135G、STP136G、STP144G、STP145G、STP146G、STP152G、STP155G、STP237G、STP247G、STP251G、STP355、STP369、STP702、STP779、STP705、STP707、替拉賽侖(teprasiran)、替凡賽侖(tivanisiran)、烏曲斯侖(vutrisiran)、澤拉司蘭(zerlasiran)、齊貝司蘭(zilebesiran)及齊夫卡司蘭(zifcasiran)。在一實施例中，產物為miRNA或miRNA模擬物。在實施例中，miRNA模擬物為雷姆拉森(remlarsen)。
本文所揭示之本發明利用寡核苷酸結合之特性以提供用於其製造之改良方法。藉由提供與目標序列100%互補之模板寡核苷酸，且控制反應條件以使得產物可在特定條件下釋放及分離，可獲得具有高純度之產物。
使產物 ( 或雜質 ) 變性 ： 模板雙螺旋體及自模板分離產物 ( 或雜質 )自模板釋放產物(或任何雜質)需要模板聚核苷酸或寡核苷酸股與產物(或雜質)之間的沃森-克里克(Watson-Crick)鹼基配對斷裂(亦即，使雙螺旋體變性)。產物(或雜質)可隨後與模板分離，其可作為兩個單獨步驟或作為一個組合步驟進行。
若製程在塔型反應器中進行，則釋放及分離產物(或雜質)可作為一個步驟進行。在改變pH或鹽濃度或含有破壞鹼基配對(諸如甲醯胺或尿素)之化學試劑的緩衝液中運行將引起聚核苷酸或寡核苷酸股之變性，且產物(或雜質)將在緩衝液中溶離。
當製程在其他反應容器中進行時，產物(或雜質)之釋放及分離可以兩步驟方法進行。首先，沃森-克里克鹼基對被破壞以使股變性，且隨後產物(或雜質)與模板分離，例如自反應容器移出。當釋放且分離產物以兩步驟方法進行時，沃森-克里克鹼基對之斷裂可藉由改變緩衝液條件(pH、鹽)或藉由引入化學破壞劑(甲醯胺、尿素)來達成。或者，升高溫度亦將引起兩股解離，亦即變性。產物(或雜質)可隨後經由包括基於分子量之分離、基於電荷之分離、基於疏水性之分離、基於特定序列之分離或此等方法之組合的方法分離(且必要時亦自反應容器移出)。
當製程在連續或半連續流動反應器中進行時，產物(或雜質)之釋放及分離可在一個步驟或兩個步驟中進行。例如，在一個步驟中釋放及分離產物(或雜質)可受增加溫度之影響以引起兩股解離，且在用於升高溫度之反應器之同一部分中基於分子量分離所釋放之股。在兩個步驟中釋放及分離產物(或雜質)可受增加溫度之影響以引起兩股在反應器之一部分中解離且在反應器之不同部分基於分子量分離所釋放之股。
特定言之 ， 雜質自模板釋放及分離 ， 但產物保留在模板上雜質在不正確核苷酸在鏈伸長期間併入寡核苷酸股中時產生，或在鏈伸長反應提前終止時產生。當反應包括連接片段聚核苷酸或寡核苷酸之步驟且一或多個連接步驟未能發生時，亦產生雜質。
沃森-克里克鹼基配對之特性可用於在產物釋放之前特異性釋放與模板結合之任何雜質。各雙股聚核苷酸或寡核苷酸將在特定條件下解離，且當與具有100%互補性之序列相比時，彼等不具有100%互補性之序列的條件不同。判定此類條件在熟習此項技術者之技術範圍內。
使聚核苷酸或寡核苷酸變性之常用方式係藉由升高溫度。一半鹼基對解離時，亦即當50%之雙螺旋體呈單股狀態時之溫度稱為解構溫度T m。確定解構溫度之最可靠且準確的方式係憑經驗。然而，此為繁瑣的且通常並非必需的。可使用若干公式計算T m值(Nucleic Acids Research 1987, 15 (13): 5069-5083; PNAS 1986, 83 (11): 3746-3750; Biopolymers 1997, 44 (3): 217-239)，且可在線找到許多由試劑供應商及大學代管之解構溫度計算器。已知對於給定聚核苷酸或寡核苷酸序列，全部硫代磷酸酯鍵之變異體將在比全部磷酸二酯鍵之變異體更低的溫度下解構。增加聚核苷酸或寡核苷酸中硫代磷酸酯鍵之數目傾向於降低聚核苷酸或寡核苷酸針對其預期目標之T m。
為了自反應混合物特異性分離雜質，首先計算產物:模板雙螺旋體之解構溫度。隨後將反應容器加熱至第一溫度，例如低於產物:模板雙螺旋體之解構溫度，例如低於解構溫度1、2、3、4、5、6、7、8、9或10攝氏度的溫度。此加熱步驟使不為來自模板之產物，亦即不與模板100%互補的聚核苷酸或寡核苷酸變性。此等變性聚核苷酸或寡核苷酸可隨後使用上文所揭示之方法，例如基於分子量之分離、基於電荷之分離、基於疏水性之分離、基於特定順序之分離中之一者或此等方法之組合自反應容器移除。隨後，將使反應容器升高至高於所計算解構溫度，例如高於解構溫度1、2、3、4、5、6、7、8、9或10攝氏度之第二較高溫度，以引起來自模板之產物變性。產物可隨後使用上文所揭示之方法，例如基於分子量之分離、基於電荷之分離、基於疏水性之分離、基於特定序列之分離中之一者或此等方法之組合分離(且自反應容器移出)。
當破壞劑為引起pH或鹽濃度變化的試劑或為化學破壞劑時，可使用類似方法。破壞劑濃度增加直至剛好低於產物將解離之濃度，以引起不為來自模板之產物的聚核苷酸或寡核苷酸之變性。此等雜質可隨後使用上文所揭示之方法中之一者自反應容器移除。隨後將破壞劑之濃度增加至高於產物自模板解離之濃度。產物隨後可使用上文所揭示之方法中之一者自反應容器移出。
獲自諸如上文所揭示之方法的產物無需進一步純化步驟即具有高純度。例如，所獲得之產物純度大於95%。
模板之特性在一些實施例中，模板可具有允許其在移出產物時保留在反應容器中，以防止其變為產物中之雜質的特性。在本發明之一個實施例中，此保留係藉由將模板偶合至載體材料來達成。此偶合產生具有高分子量之模板-載體複合物，且因此可在例如藉由過濾移出雜質及產物時保留在反應容器中。模板可偶合至固體載體材料，諸如聚合物珠粒、纖維載體、膜、鏈黴抗生物素蛋白包覆之珠粒及纖維素。模板亦可偶合至可溶性載體材料，諸如聚乙二醇、可溶性有機聚合物、DNA、蛋白質、樹枝狀聚合物、多醣、寡醣及碳水化合物。
各載體材料可具有多個可連接模板之點，且各連接點可連接有多個模板。
模板在不連接至載體材料時自身可具有高分子量，例如，模板可為具有多個例如以圖2中所示之方式由連接子分隔開的模板複本的分子。
模板保留在反應容器中之能力亦使得模板能夠藉由回收或藉由在連續流或半連續流製程中使用而再循環以供將來反應。此可用於例如寡核苷酸製造，諸如間隔體製造及治療mRNA製造。
模板之特性可允許模板與產物之分離，或模板結合產物與雜質之分離。可使用基於分子量之分離、基於電荷之分離、基於疏水性之分離、基於特定序列之分離或此等方法之組合。
在模板連接至固體載體之情況下，自產物分離模板或自結合至模板之產物分離雜質係藉由在適當條件下洗滌固體載體來實現，其為對於熟習此項技術者顯而易見的。在模板與可溶性載體偶合或其自身由重複模板序列構成之情況下，自產物分離模板或自雜質分離模板結合產物可藉助於基於分子量之分離來達成，例如藉由使用諸如超濾或奈米過濾之技術，其中過濾材料經選擇以使得較大分子由過濾器截留且較小分子通過。在自模板產物複合物分離雜質或自模板分離產物單個步驟不夠有效之情況下，可採用多個依序過濾步驟以增加分離效率且因此產生滿足所需純度之產物。
期望提供一種高效且可應用於工業生產規模的分離此類聚核苷酸或寡核苷酸的方法。「Therapeutic oligonucleotides: The state of the art in purification technologies」Sanghvi等人Current Opinion in Drug Discovery (2004)第7卷第8期綜述用於寡核苷酸純化之方法。
WO 01/55160 A1揭示藉由與污染物形成亞胺鍵且隨後藉由層析或其他技術移除亞胺連接之雜質來純化寡核苷酸。「Size Fractionation of DNA Fragments Ranging from 20 to 30000 Base Pairs by Liquid/Liquid chromatography」Muller等人Eur. J. Biochem (1982) 128-238揭示使用其上沈積有PEG/聚葡萄糖相之微晶纖維素固體管柱來分離核苷酸序列。「Separation and identification of oligonucleotides by hydrophilic interaction chromatography.」Easter等人The Analyst (2010); 135(10)揭示使用採用固體二氧化矽載體相之HPLC變體分離寡核苷酸。「Fractionation of oligonucleotides of yeast soluble ribonucleic acids by countercurrent distribution」Doctor等人Biochemistry (1965) 4(1) 49-54揭示使用封裝有無水DEAE-纖維素之無水固體管柱。「Oligonucleotide composition of a yeast lysine transfer ribonucleic acid」Madison等人; Biochemistry, 1974, 13(3)揭示使用固相層析分離核苷酸序列。
液-液層析為已知的分離方法。「Countercurrent Chromatography The Support-Free Liquid Stationary Phase」Billardello, B.; Berthod, A; Wilson & Wilson's Comprehensive Analytical Chemistry 38; Berthod, A.編; Elsevier Science B.V.: Amsterdam (2002)第177-200頁提供對液-液層析之有用的整體描述。已知各種液-液層析技術。一種此類技術為液-液逆流層析(在本文中稱為「CCC」)。另一已知技術為離心分配層析(在本文中稱為「CPC」)。
上文所揭示之方法及WO 2013/030263中所陳述之彼等方法可用於例如自模板及/或雜質分離產物聚核苷酸或寡核苷酸。
聚合酶在實施例中，所用聚合酶可為DNA聚合酶、RNA聚合酶或其組合。聚合酶可為突變型聚合酶。聚合酶可為經工程改造之聚合酶。聚合酶可催化去氧核糖核苷酸與去氧核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸與核糖核苷酸、核糖核苷酸與去氧核糖核苷酸及/或核糖核苷酸與核糖核苷酸之連接。聚合酶可能缺乏股置換活性。聚合酶可能缺乏5'至3'核酸外切酶活性。缺乏5'至3'核酸外切酶活性可防止終止子破壞。聚合酶可缺乏3'至5'核酸外切酶活性。3'至5'核酸外切酶活性通常使聚合酶能夠移除錯誤結合之核苷酸，且藉此確保高保真合成。3'至5'核酸外切酶活性可稱為校讀能力。聚合酶可能缺乏3'至5'核酸外切酶活性。可視需要組合不同聚合酶特性，例如聚合酶可能缺乏股置換活性及/或缺乏5'至3'核酸外切酶活性及/或具有3'至5'核酸外切酶活性。例如，聚合酶可能缺乏股置換活性及/或缺乏5'至3'核酸外切酶活性及/或缺乏3'至5'核酸外切酶活性。聚合酶可包括DNA及/或RNA聚合酶。聚合酶可為DNA依賴性DNA聚合酶(亦即使用DNA模板合成DNA之聚合酶)。聚合酶可為DNA依賴性RNA聚合酶(亦即使用DNA模板合成RNA之聚合酶)。DNA聚合酶能夠連接去氧核糖核苷酸及/或核糖核苷酸。RNA聚合酶能夠連接核糖核苷酸及/或去氧核糖核苷酸。聚合酶可為引子延伸聚合酶。DNA聚合酶可為引子延伸聚合酶。RNA聚合酶可為引子延伸聚合酶。DNA及/或RNA聚合酶可為野生型聚合酶。DNA及/或RNA聚合酶可為突變型DNA及/或RNA聚合酶。DNA及/或RNA聚合酶可為經工程改造之DNA及/或RNA聚合酶。聚合酶能夠連接經修飾之核苷酸。DNA及/或RNA聚合酶能夠連接經修飾之核苷酸。聚合酶可沿模板股填充至少一個序列缺口。聚合酶可使用核苷三磷酸池延伸至少一個片段聚核苷酸。DNA聚合酶通常需要引子及模板。例示性聚合酶包括野生型 埃希氏菌噬菌體T7聚合酶、野生型 硫磺礦硫化葉菌聚合酶、突變型 嗜熱球菌(菌株9oN-7)聚合酶、野生型 腸桿菌噬菌體T4聚合酶、野生型 水生棲熱菌聚合酶及野生型 科達卡熱球菌聚合酶。
在本發明之範疇內係能夠連接未經修飾之核苷酸與另一未經修飾之核苷酸的聚合酶、能夠連接未經修飾之核苷酸與經修飾之核苷酸(亦即，經修飾之5'核苷酸與未經修飾之3'核苷酸，及/或未經修飾之5'核苷酸與經修飾之3'核苷酸)的聚合酶，以及能夠連接經修飾之核苷酸與另一經修飾之核苷酸的聚合酶。聚合酶能夠連接未經修飾之核苷酸與另一未經修飾之核苷酸。可隨後修飾各未經修飾之核苷酸。核苷酸修飾之實例揭示於本文中，且包括選自包含以下之群的修飾：經修飾之糖部分、核鹼基之修飾、主鏈之修飾、一或多個尿嘧啶殘基之取代及其組合。
另外，可併入經修飾之核苷酸的例示性經工程改造之DNA及RNA聚合酶包括在「Engineering and application of polymerases for synthetic genetics」, Houlihan等人, Current Opinion in Biotechnology 2017, 48; 168-179中所揭示之彼等。
在實施例中，DNA及/或RNA聚合酶可經工程改造以接受2'糖修飾，包括在 柳珊瑚熱球菌複製性DNA聚合酶之聚合酶拇指子域中具有突變的聚合酶，該聚合酶視情況包含在E664K及Y409G處之突變。此類聚合酶提供包括例如自DNA、RNA、鎖核酸或2'-OMe RNA修飾之核苷酸或其組合預備之假尿苷、5-甲基-C、2'-氟或2-疊氮基-修飾之NTP。
在實施例中，經工程改造以接受2'糖修飾之RNA聚合酶包括T7 RNA聚合酶。在Y639F處包含突變之T7 RNA聚合酶可例如提供包括例如2'氟嘧啶及2'胺基嘧啶。
在實施例中，使用已經工程改造以接受2'糖修飾之Taq聚合酶(SM19)之Stoffel片段的變異體。例如，在614處引入帶負電之胺基酸及E615G之突變提供包括2'糖修飾。SM19可進一步進化為聚合酶SFM4-3及SFM4-9。例如，SFM4-3可轉錄經完全修飾之2'-OMe 60個核苷酸序列。
在實施例中，使用已經工程改造以接受2'糖修飾之來自海洋噬藍藻體Syn5的嗜熱性RNA聚合酶。
在實施例中，使用包含Y409G、I521L、F545L及E664K突變之Tgo聚合酶，其可藉由併入3'-去氧-或3'-OMe核苷酸而合成具有區位異構2'-5'鍵聯的DNA及RNA。
分區自身複製方法可用於進化聚合酶以併入經修飾之核苷酸。「Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication」, Ghadessy等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001, 98:4552-4557描述例示性分區自身複製方法。
連接酶在實施例中，連接酶可為ATP依賴性連接酶。ATP依賴性連接酶之尺寸在30至＞100 kDa範圍內。在實施例中，連接酶可為NAD依賴性連接酶。NAD依賴性酶高度同源且為60至90 kDa，視情況70-80 kDa之單體蛋白質。在實施例中，連接酶可為熱穩定連接酶。熱穩定連接酶可衍生自嗜熱性細菌。
在實施例中，連接酶可為模板依賴性連接酶。在實施例中，連接發生在模板上。在實施例中，使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸係發生在模板上以形成單股聚核苷酸產物。在實施例中，連接酶可為雙螺旋體作用連接酶。雙螺旋體可為雙螺旋體DNA。雙螺旋體可為RNA:DNA雜合雙螺旋體。雙螺旋體可為雙螺旋體RNA。連接酶可為DNA連接酶。連接酶可為RNA連接酶。
在實施例中，連接酶可催化兩個片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸之連接。在實施例中，連接酶可催化兩個片段寡核苷酸之連接。連接酶可催化包含天然存在之核苷酸之一個片段聚核苷酸或延伸片段聚核苷酸與包含天然存在之核苷酸之一個片段聚核苷酸或延伸片段聚核苷酸的連接。連接酶可催化包含至少一個經修飾之核苷酸的一個片段聚核苷酸或延伸片段聚核苷酸與包含天然存在之核苷酸的一個片段聚核苷酸或延伸片段聚核苷酸的連接。包含至少一個經修飾之核苷酸的一個片段聚核苷酸或延伸片段聚核苷酸可位於連接之3'端。包含天然存在之核苷酸的一個片段聚核苷酸或延伸片段聚核苷酸可位於連接之5'端。經修飾之核苷酸可或可不位於連接處，亦即，接合核苷酸中之一或兩者或無一者為經修飾之核苷酸。連接酶可催化包含至少一個經修飾之核苷酸的一個片段聚核苷酸或延伸片段聚核苷酸與包含至少一個經修飾之核苷酸的一個片段聚核苷酸或延伸片段聚核苷酸的連接。熟習此項技術者應理解，片段聚核苷酸或延伸片段聚核苷酸內至少一個經修飾之核苷酸的定位可經調適以增加連接效率。
連接酶可為野生型連接酶。連接酶可為突變型連接酶。連接酶可為經工程改造之連接酶。DNA及/或RNA連接酶可為野生型DNA及/或RNA連接酶。DNA及/或RNA連接酶可為突變型DNA及/或RNA連接酶。DNA及/或RNA連接酶可為經工程改造之DNA及/或RNA連接酶。熟習此項技術者應理解，適合的連接酶可基於需要連接的片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸及/或該等片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸中之修飾的數目及/或類型及/或位置來選擇。
例示性連接酶包括野生型 腸桿菌 ( Enterobacteria)噬菌體T3連接酶及野生型噬菌體T4 DNA連接酶。
在實施例中，連接酶可固定於例如珠粒上。
聚核苷酸或聚核苷酸之池用於建立本發明方法之「聚核苷酸菌之池」的聚核苷酸或寡核苷酸可包含產物序列之至少兩個片段。用於建立本發明方法之池的聚核苷酸或寡核苷酸可包含產物序列之至少兩個不同片段。產物序列之至少兩個片段序列可不同。至少兩個片段各自對應於產物序列之不同區域。聚核苷酸或寡核苷酸之池可包含至少一個包含至少一個經修飾之核苷酸殘基的片段聚核苷酸或寡核苷酸。聚核苷酸或寡核苷酸之池可包含至少兩個片段聚核苷酸或寡核苷酸，其中各片段聚核苷酸或寡核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸殘基。
因此，池係非同源聚核苷酸或寡核苷酸組。至少兩個片段聚核苷酸或寡核苷酸之序列不同，可比靶序列短，且可不具有與靶序列相同的序列。
至少兩個片段聚核苷酸或寡核苷酸可藉由酶促合成、化學合成、視情況固體負載合成或液相合成或其組合來製造。酶促合成可使用單股連接酶、轉移酶、聚合酶或其組合進行。
在其他實例中，片段聚核苷酸或寡核苷酸中之一或多者或全部可使用化學合成製造。在其他實例中，片段聚核苷酸或寡核苷酸中之一或多者或全部可使用化學合成與酶促合成，例如使用聚合酶、單股連接酶或轉移酶或其組合之組合來製造。在其他實例中，片段聚核苷酸或寡核苷酸中之一或多者或全部可使用化學合成、單股連接酶及/或轉移酶與使用聚合酶結合以製造片段寡核苷酸中之一或多者來製造。在其他實例中，片段聚核苷酸或寡核苷酸中之一或多者或全部可使用單股連接酶、轉移酶、聚合酶或其組合以完全酶合成方法製造。在簡化方法中，單股連接酶及聚合酶可用於完全酶促方法中以製造片段聚核苷酸或寡核苷酸中之兩者或更多者或全部之池。
在寡核苷酸製造之實例中，寡核苷酸池可包含5'引子片段寡核苷酸，其已使用化學合成及/或酶促合成(例如使用單股連接酶、轉移酶及/或聚合酶)製造且包含至少一個經修飾之核苷酸殘基；及不同3'-片段寡核苷酸，其已使用化學合成及/或酶促合成(例如使用單股連接酶、轉移酶及/或聚合酶)製造且包含至少一個經修飾之核苷酸殘基。
片段聚核苷酸或寡核苷酸可用作引子。片段聚核苷酸或寡核苷酸可用作終止子。片段聚核苷酸或寡核苷酸可用作引子及終止子。片段聚核苷酸或寡核苷酸可用作引子及終止子，其中在片段聚核苷酸或寡核苷酸之任一側上存在序列缺口。
在一個實施例中，在本發明方法中之任一者中，可提供片段寡核苷酸，其為包含至少3個核苷酸之5'引子片段寡核苷酸。在一個實施例中，可提供片段寡核苷酸，其為包含3至50個核苷酸的5'引子片段寡核苷酸。在一個實施例中，可提供片段寡核苷酸，其為包含3至40個核苷酸的5'引子片段寡核苷酸。在一個實施例中，可提供片段寡核苷酸，其為包含3至30個核苷酸的5'引子片段寡核苷酸。在一個實施例中，可提供片段寡核苷酸，其為包含3至25個核苷酸的5'引子片段寡核苷酸。在一個實施例中，可提供片段寡核苷酸，其為包含3至20個核苷酸的5'引子片段寡核苷酸。在一些實施例中，5'引子片段寡核苷酸包含至少5個核苷酸。在一些實施例中，5'引子片段寡核苷酸包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個核苷酸，其中視情況一或多個核苷酸為經修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'引子片段寡核苷酸中之經修飾之核苷酸為假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-Me、2'-F、2'OMe或2'MOE。
在一個實施例中，可提供片段寡核苷酸，其為包含至少3個核苷酸的3'終止片段寡核苷酸。在一個實施例中，可提供片段寡核苷酸，其為包含3至50個核苷酸的3'終止片段寡核苷酸。在一個實施例中，可提供片段寡核苷酸，其為包含3至40個核苷酸的3'終止片段寡核苷酸。在一個實施例中，可提供片段寡核苷酸，其為包含3至30個核苷酸的3'終止片段寡核苷酸。在一個實施例中，可提供片段寡核苷酸，其為包含5至30個核苷酸的3'終止片段寡核苷酸。在一個實施例中，可提供片段寡核苷酸，其為包含3至20個核苷酸的3'終止片段寡核苷酸。在一些實施例中，3'終止片段寡核苷酸包含至少5個核苷酸。在一些實施例中，3'終止片段寡核苷酸包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸，其中視情況一或多個核苷酸為經修飾之核苷酸。在一些實施例中，3'終止片段寡核苷酸中之經修飾之核苷酸為假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-Me、2'-F、2'OMe或2'MOE。
在一個實施例中，可提供片段寡核苷酸，其為包含3至50個核苷酸的5'引子片段寡核苷酸，以及片段寡核苷酸，其為包含3至50個核苷酸的3'終止片段寡核苷酸。在一個實施例中，可提供片段寡核苷酸，其為包含3至25個核苷酸的5'引子片段寡核苷酸，以及片段寡核苷酸，其為包含3至30個核苷酸的3'終止片段寡核苷酸。在一個實施例中，可提供片段寡核苷酸，其為包含5至25個核苷酸的5'引子片段寡核苷酸，以及片段寡核苷酸，其為包含5至30個核苷酸的3'終止片段寡核苷酸。在一個實施例中，可提供片段寡核苷酸，其為包含5至20個核苷酸的5'引子片段寡核苷酸，以及片段寡核苷酸，其為包含5至30個核苷酸的3'終止片段寡核苷酸。
酶法生產片段聚核苷酸或寡核苷酸1) 聚合酶聚合酶可催化短寡核苷酸(引子)之末端核苷酸之3'-羥基與待添加核苷酸之5'-磷酸酯以模板依賴性方式連接。待添加之核苷酸(亦即核苷酸參磷酸池中之核苷三磷酸)可未經修飾，亦即天然存在或依本文所描述經修飾。可使用單獨模板及引子或可使用自吸式模板。聚核苷酸或寡核苷酸可隨後經修飾或進一步經修飾。
2) 單股連接酶，例如 RNA 連接酶單股連接酶催化ATP驅動之例如3',5'核苷酸雙磷酸酯、3',5'核苷酸硫代磷酸酯(例如3',5'雙磷酸酯或3'-磷酸酯-5'-硫代磷酸酯或3'-硫代磷酸酯-5'-磷酸酯)或3',5'核苷酸二硫代磷酸酯(例如3',5'雙二硫代磷酸酯或3'-磷酸酯-5'-二硫代磷酸酯或3'-二硫代磷酸酯-5'-磷酸酯)以模板獨立性方式添加至短寡核苷酸(引子)之3'-OH。A 熟習此項技術者應理解，儘管不需要額外的磷酸酯(或硫代磷酸酯)部分，但亦可在糖部分之3'位置使用二磷酸酯(或二硫代磷酸酯)或三磷酸酯(或其中一或多個氧原子已經硫取代之其他寡磷酸酯)。可使用等效地經修飾之二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸代替前述個別核苷酸。寡核苷酸引子通常為最少三個核苷酸長。此加成反應所得之聚核苷酸或寡核苷酸比起始聚核苷酸或寡核苷酸長一個核苷酸(或若分別使用二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸，則比起始聚核苷酸或寡核苷酸長兩個、三個或四個核苷酸)。所引入之核苷酸可未經修飾，亦即天然存在或依本文所描述修飾。新的3'位置現經磷酸化。為了添加後續核苷酸，藉由水解移除生長聚核苷酸或寡核苷酸之3'磷酸酯以產生3'-OH。此水解通常使用磷酸酶進行。
例如，單股連接酶可用於製造片段聚核苷酸或寡核苷酸之方法中，其中使用單股連接酶之方法包含用於片段合成之3'-延伸，該片段合成包含兩步反應：添加及脫除保護基。例示性添加步驟涉及核苷酸-3',5'-雙(硫代)磷酸酯與單股核酸引子之3'-OH的ATP依賴性連接，且隨後藉由磷酸酶使單股聚核苷酸或寡核苷酸上之3'-磷酸酯脫除保護基。在另一實例中，單股連接酶可用於製造片段聚核苷酸或寡核苷酸之方法中，其中該方法包含例示性3'-延伸(添加及脫除保護基)以製造片段序列，隨後使用部位特異性核酸酶(例如核酸內切酶V-在肌苷後，亦即在肌苷之第二個磷酸二酯鍵3'處裂解一個鹼基)進行鏈裂解以釋放該片段。
3) 轉移酶末端去氧核苷酸轉移酶(TdT)酶以獨立於模板之方式催化3'-保護之核苷酸三磷酸，例如由3'-O-疊氮基甲基、3'-胺氧基或3'-O-烯丙基保護，添加至短寡核苷酸(引子)之3'-OH。此寡核苷酸引子通常為最少三個核苷酸長。所引入之核苷酸可未經修飾，亦即天然存在或依本文所描述修飾。
適合方法陳述於例如EP2796552、US8808989、WO16128731 A1及WO16139477 A1中。
上述用於製造片段聚核苷酸或寡核苷酸之方法中所用的引子寡核苷酸可： (1)若需要，作為片段聚核苷酸或寡核苷酸之一部分保留，或 (2)自產物聚核苷酸或寡核苷酸裂解以允許分離所需產物且允許回收以製造其他片段聚核苷酸或寡核苷酸的可能性。引子自片段聚核苷酸或寡核苷酸之裂解可使用序列特異性核酸酶及適當設計之引子及片段來進行，使得裂解為有效且精確的。
藉由以下條項說明本發明： 1. 一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之單股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)提供包含與該單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸； b)提供包含至少兩個片段聚核苷酸的聚核苷酸之池； c)使步驟(a)之該模板聚核苷酸與步驟(b)之該聚核苷酸池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個片段聚核苷酸之間； d)提供核苷酸池及聚合酶，且使用該核苷酸池及該聚合酶延伸至少一個片段聚核苷酸以填充該至少一個序列缺口； e)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成該單股聚核苷酸產物； f)視情況改變條件以使該經黏接之模板及任何雜質變性，且分離該等雜質；及 g)改變條件以使該經黏接之模板及該單股聚核苷酸產物變性，且分離該單股聚核苷酸產物。 2.  如條項1之方法，其中至少一個片段聚核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸殘基。 3.  如條項1或條項2之方法，其中至少一個片段聚核苷酸包含5'磷酸酯、5'硫代磷酸酯、5'二硫代磷酸酯或5'甲基膦酸酯。 4.  根據條項1至3中任一項之方法，其中步驟(d)中之該核苷酸池包含(i)天然核苷酸；(ii)至少一個經修飾之核苷酸或(iii)經修飾之核苷酸。 5. 根據條項1至4中任一項之方法，其中該至少一個經修飾之核苷酸包含糖部分之修飾、核鹼基之修飾及/或主鏈之修飾。 6. 根據條項1至5中任一項之方法，其中該至少一個經修飾之核苷酸包含糖部分、雙環糖或4'-CH(CH3)-O-2'基團或其組合之2'位置處的修飾。 7. 如條項1至6中任一項之方法，其中該至少一個經修飾之核苷酸包含2'-F、2'-OMe、2'-MOE或2'-胺基。 8. 如條項1至7中任一項之方法，其中該至少一個經修飾之核苷酸包含經修飾之胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基嘧啶、7-去氮鳥苷或無鹼基核苷酸。 9. 根據條項1至8中任一項之方法，其中該至少一個經修飾之核苷酸包含硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯或二硫代磷酸酯。 10. 如條項1至9中任一項之方法，其中該至少一個經修飾之核苷酸包含1-甲基-假尿苷、5-甲氧基-尿嘧啶、1-乙基-假尿嘧啶、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、5-甲基-胞苷、5-甲基-胞嘧啶、N6-甲基腺苷或7-甲基鳥苷。 11. 如條項1至10中任一項之方法，其中該至少一個經修飾之核苷酸包含1-甲基-假尿苷。 12. 如條項1至4中任一項之方法，其中該至少一個經修飾之核苷酸包含PMO、LNA、c-Et、PNA、BNA或L-核糖核酸。 13.  如條項1至12中任一項之方法，其中步驟(e)中之該連接酶將各片段聚核苷酸或延伸片段聚核苷酸之3'及/或5'端連接至各相鄰片段聚核苷酸或相鄰延伸片段聚核苷酸以形成該產物聚核苷酸股。 14. 根據條項1至13中任一項之方法，其中步驟(e)中之該連接酶能夠連接RNA與RNA、DNA與DNA、RNA與DNA及/或DNA與RNA。 15. 根據條項1至14中任一項之方法，其中步驟(e)中之該連接酶為RNA及/或DNA連接酶。 16. 根據條項1至15中任一項之方法，其中步驟(d)中之該聚合酶缺乏股置換活性。 17. 根據條項1至16中任一項之方法，其中步驟(d)中之該聚合酶缺乏5'至3'核酸外切酶活性。 18. 根據條項1至17中任一項之方法，其中在步驟(d)中之該聚合酶中具有3'至5'核酸外切酶活性或缺乏3'至5'核酸外切酶活性。 19. 根據條項1至18中任一項之方法，其中該聚合酶為DNA聚合酶或RNA聚合酶。 20. 根據條項1至19中任一項之方法，其中該DNA聚合酶或該RNA聚合酶為經工程改造或突變型DNA聚合酶或RNA聚合酶。 21. 如條項1至20中任一項之方法，其中步驟a)至g)中之兩者或更多者同時進行，視情況，步驟d)及e)同時進行。 22. 如條項1至21中任一項之方法，其中步驟a)至g)中之兩者或更多者依序進行，視情況，步驟d)及e)依序進行。 23.  如條項1至22中任一項之方法，其中該模板具有允許其與該單股聚核苷酸產物分離之特性。 24. 如條項23之方法，其中允許該模板與該單股聚核苷酸產物分離之該特性為該模板連接至載體材料。 25. 如條項24之方法，其中該載體材料為可溶性載體材料，視情況其中該載體材料係選自由以下組成之群：聚乙二醇、可溶性有機聚合物、DNA、蛋白質、樹枝狀聚合物、多醣、寡醣及碳水化合物。 26. 如條項24之方法，其中該載體材料為不溶性載體材料，視情況其中該載體材料係選自由以下組成之群：玻璃珠、聚合物珠粒、纖維載體、膜、鏈黴抗生物素蛋白包覆之珠粒、纖維素及反應壁，視情況其中該反應壁為反應容器之一部分。 27. 如條項24至26中任一項之方法，其中該模板之多個重複複本經由單個連接點以連續方式連接至該載體材料。 28. 如條項23至27中任一項之方法，其中允許模板與產物分離之特性為模板之分子量。 29. 如條項1至28中任一項之方法，其中該方法另外包含步驟h)回收該模板。 30. 如條項29之方法，其中該方法另外包含步驟i)用回收模板重複步驟a)至g)或步驟a)至h)。 31. 如條項1至30中任一項之方法，其中該方法為半連續或連續的。 32.  如條項1至31中任一項之方法，其中該模板聚核苷酸由與該單股聚核苷酸產物互補之序列組成。 33. 如條項1至32中任一項之方法，其中該單股聚核苷酸產物為3至30個核苷酸長，視情況10至30個核苷酸長，3至15個核苷酸長，15至20個核苷酸長，20至25個核苷酸長，或20至30個核苷酸長。 34.  如條項1至33中任一項之方法，其中該單股聚核苷酸產物為20個核苷酸長且該等至少兩個片段聚核苷酸包含： (i) 7個核苷酸長之5'片段及7個核苷酸長之3'片段； (ii) 6個核苷酸長之5'片段及6個核苷酸長之3'片段； (iii) 5個核苷酸長之5'片段及5個核苷酸長之3'片段； (iv) 4個核苷酸長之5'片段及4個核苷酸長之3'片段；或 (v) 3個核苷酸長之5'片段及3個核苷酸長之3'片段。 35. 如條項1至34中任一項之方法，其中該單股聚核苷酸產物為間隔體。 36. 如條項1至32中任一項之方法，其中該單股聚核苷酸產物為30至20,000個核苷酸長，視情況30至10,000個核苷酸長，30至5,000個核苷酸長，30至1,000個核苷酸長，30至500個核苷酸長，30至400個核苷酸長，30至300個核苷酸長，30至200個核苷酸長，30至100個核苷酸長，30至50個核苷酸長或30至40個核苷酸長。 37.  如條項1至36中任一項之方法，其中該單股聚核苷酸產物為DNA聚核苷酸產物、RNA聚核苷酸產物或DNA及RNA雜合聚核苷酸產物。 38. 如條項37之方法，其中該RNA聚核苷酸產物為mRNA。 39. 如條項1至38中任一項之方法，其中該產物以公克、公斤或更大規模製造及/或該方法以至少1 L之反應體積進行。 40. 如條項1至39中任一項之方法，其中所得單股聚核苷酸產物為至少80%純度，視情況其中該單股聚核苷酸或寡核苷酸產物為至少90%純度，視情況其中該單股聚核苷酸或寡核苷酸產物為至少95%純度，視情況其中該單股聚核苷酸或寡核苷酸產物為至少98%純度。 41. 一種用於製造雙股聚核苷酸產物之方法，其中將藉由如條項1至40中任一項之方法製造的兩個互補單股聚核苷酸在允許黏接之條件下混合。 42. 一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之雙股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)提供包含與單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸； b)提供包含至少兩個片段聚核苷酸的聚核苷酸之池； c)使步驟(a)之該模板聚核苷酸與步驟(b)之該聚核苷酸池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個片段聚核苷酸之間； d)提供核苷酸池及聚合酶，且使用該核苷酸池及該聚合酶延伸至少一個片段聚核苷酸以填充該至少一個序列缺口； e)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成該單股聚核苷酸產物； f)視情況改變條件以使該經黏接之模板及任何雜質變性，且分離該等雜質； g)改變條件以使該經黏接之模板及該單股聚核苷酸產物變性，且分離該單股聚核苷酸產物；及 h)使用該單股聚核苷酸產物作為步驟a)中之模板且重複步驟a)至e)以製造雙股聚核苷酸產物。 43. 如條項42之方法，其中該雙股聚核苷酸產物經純化。 44. 如條項41至43中任一項之方法，其中該雙股聚核苷酸產物為siRNA。 45. 如條項1至44中任一項之方法，其中該聚核苷酸產物為治療性聚核苷酸產物。 46. 如條項37或38之方法，其中該RNA聚核苷酸產物包含編碼一或多種免疫原之序列。 47. 如條項46之方法，其中該等免疫原係選自呼吸道融合性病毒(RSV)免疫原、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)醣蛋白免疫原、細胞巨大病毒醣蛋白免疫原、冠狀病毒棘蛋白多肽免疫原、流感病毒免疫原、水痘帶狀疱疹病毒醣蛋白免疫原、人類乳突狀瘤病毒16 (HPV16) E6免疫原、HPV 16 E7免疫原或黃病毒免疫原。 48. 如條項46或47之方法，其中該等免疫原係選自冠狀病毒棘蛋白、流感抗原及RSV抗原，諸如蛋白f或蛋白g。
實例 縮寫HPLC                    高效液相層析 LCMS                    液相層析質譜分析 SEC                       尺寸排阻層析 TEAA                    乙酸三乙銨 PO                        磷酸二酯 PS                         硫代磷酸酯 *                           硫代磷酸酯 /3Phos/                  3'磷酸酯基團 /5Phos/                  5'磷酸酯基團 /Me-dC/                 5-甲基胞嘧啶 /5Biosg/                 5'生物素 EDTA                    乙二胺四乙酸 dATP                     去氧腺苷三磷酸 dCTP                     去氧胞苷三磷酸 dGTP                    去氧鳥苷三磷酸 dTTP                     去氧胸苷三磷酸 dATPαS                 2'-去氧腺苷-5'-(α-硫基)-三磷酸 dCTPαS                 2'-去氧胞苷-5'-(α-硫基)-三磷酸 dGTPαS                 2'-去氧鳥苷-5'-(α-硫基)-三磷酸 dTTPαS                 2'-去氧胸苷-5'-(α-硫基)-三磷酸 ATP                       腺苷三磷酸 MgCl 2氯化鎂 Tris                       2-胺基-2-(羥甲基)丙烷-1,3-二醇 TBuAA                  乙酸三丁銨 2'MOE                   2'-O-甲氧基-乙基 2'OMe                   2'-O-甲基 2'F                        2'氟 LNA                      鎖核酸 CTP                      胞苷三磷酸 GTP                      鳥苷三磷酸 UTP                      尿苷三磷酸 mA                        2'-O-甲基腺苷 mC                        2'-O-甲基胞苷 mG                        2'-O-甲基鳥苷 mU                        2'-O-甲基尿苷 rA                         2'-羥基腺苷 rC                         2'-羥基胞苷 rG                         2'-羥基鳥苷 rU                         2'-羥基腺苷 fA                         2'氟腺苷 fC                         2'氟胞苷 fG                         2'氟鳥苷 fU                         2'氟尿苷 eA                         2'-O-甲氧基-乙基腺苷 eC                         2'-O-甲氧基-乙基5-甲基胞嘧啶 eG                         2'-O-甲氧基-乙基鳥苷 eT                         2'-O-甲氧基-乙基胸苷 ΨTP                      假尿苷-5'-三磷酸 m1ΨTP                  N1-甲基假尿苷-5'-三磷酸 Ψ                          假尿苷 m1Ψ                      N1-甲基假尿苷 ATPαS                   腺苷-5'-(α-硫基)-三磷酸 CTPαS                   胞苷-5'-(α-硫基)-三磷酸 GTPαS                   鳥苷-5'-(α-硫基)-三磷酸 UTPαS                   尿苷-(α-硫基)-三磷酸
實例 1 ：來 自 42-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 27bp 2'H 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 10bp 2'H 寡核苷酸引子缺口填充的 5bp 2'H 寡核苷酸合成 目標 ：展現使用未經修飾之去氧核糖核苷三磷酸在未經修飾之DNA寡核苷酸片段之間進行缺口填充，以顯示該技術之普遍適用性。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 38)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 39 至 SEQ ID NO: 43)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表1設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶以開始反應。反應在25℃下培育2小時。隨後藉由添加50 µL 100 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為10 mM EDTA。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 11之存在。圖3a顯示反應起始材料之層析圖。圖3b顯示產物形成反應之層析圖。 表1.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 39 至 SEQ ID NO: 44    1.0
模板：(2'H)- SEQ ID NO: 1 0.04 12.5
5'引子(2'H) - SEQ ID NO: 2 0.04 2.0
3'阻斷子1 (2'H) - SEQ ID NO: 3 0.04 1.5
dATP 0.5 2.5
dCTP 0.5 2.5
dGTP 0.5 2.5
dTTP 0.5 2.5
Tris (pH 7.5) 50 2.5
MgCl 2 10 0.5
水    20.0
最終反應體積 (µL)    50
反應之結果： 表2.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
野生型埃希氏菌噬菌體T7聚合酶-「Pol1」 39 17.01
野生型硫磺礦硫化葉菌聚合酶-「Pol2」 40 54.42
突變型噬熱球菌(菌株9oN-7)聚合酶-「Pol3」 41 67.75
野生型腸桿菌噬菌體T4聚合酶-「Pol4」 42 81.21
野生型水生棲熱菌聚合酶-「Pol5」 43 56.57
*轉化為產物之轉化率(%) -5'-引子 SEQ ID NO: 2+ SEQ ID NO: 7 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 11峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經18分鐘運行35-71%梯度之緩衝液B，之後升至95%緩衝液B，持續7分鐘。
緩衝液A：100 mM TEAA，pH 7
緩衝液B：含100 mM TEAA，pH 7之25%乙腈/75% H 2O
結論 ：顯示遺傳多樣性的引子延伸聚合酶集在兩個側接寡核苷酸之間進行鹼基填充。最佳實例具有高產物形成(按面積大於80%)及低(按面積小於20%)不完全反應或副產物形成。
實例 2 ：來 自 42-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 27bp 2'H 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 10bp 2'H 寡核苷酸引子缺口填充的一鍋式 5bp 2'H 寡核苷酸合成及合成 42-bp 產物的連接 目標 ：展現用未經修飾之DNA寡核苷酸片段及未經修飾之去氧核糖核苷三磷酸進行缺口填充及連接以顯示該技術之普遍適用性。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 38)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 39 至 SEQ ID NO: 43)係獲自市售來源且直接使用。雙股連接酶( SEQ ID NO: 45)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表3設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶及連接酶以開始反應。反應在25℃下培育2小時。隨後藉由添加50 µL 100 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為10 mM EDTA。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 38之存在。 表3.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 39 至 SEQ ID NO: 44    1.0
連接酶- SEQ ID NO: 45    2.5
模板：(2'H)- SEQ ID NO: 1 0.04 12.5
5'引子(2'H) - SEQ ID NO: 2 0.04 2.0
3'阻斷子1 (2'H) - SEQ ID NO: 3 0.04 1.5
dATP 0.5 2.5
dCTP 0.5 2.5
dGTP 0.5 2.5
dTTP 0.5 2.5
ATP 1 5
Tris (pH 7.5) 50 2.5
MgCl 2 10 0.5
水    12.5
最終反應體積 (uL)    50
反應之結果： 表4.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
野生型埃希氏菌噬菌體T7聚合酶-「Pol1」 39 5.18
野生型硫磺礦硫化葉菌聚合酶-「Pol2」 40 81.22
突變型噬熱球菌(菌株9oN-7)聚合酶-「Pol3」 41 88.71
野生型腸桿菌噬菌體T4聚合酶-「Pol4」 42 95.16
野生型水生棲熱菌聚合酶-「Pol5」 43 41.19
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 2+ SEQ ID NO: 7 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 38峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經18分鐘運行35-71%梯度之緩衝液B，之後升至95%緩衝液B，持續7分鐘。
緩衝液A：100 mM TEAA，pH 7
緩衝液B：含100 mM TEAA，pH 7之25%乙腈/75% H 2O
結論 ：顯示遺傳多樣性的引子延伸聚合酶集在兩個側接寡核苷酸之間進行鹼基填充，且連接酶能夠進行串聯反應以獲得全長寡核苷酸。最佳實例具有高產物形成(按面積大於95%)及低(按面積小於5%)不完全反應或副產物形成。
實例 3 ：來 自 42-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'H 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 10bp 2'OH 寡核苷酸引子缺口填充的 6bp 2'H 寡核苷酸合成 目標 ：展現使用未經修飾之去氧核糖核苷三磷酸在RNA寡核苷酸片段(引子)及未經修飾之DNA寡核苷酸片段(終止子/阻斷子)之間進行缺口填充，以顯示該技術對在寡核苷酸治療劑中常見之糖基(2'OH)的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 38)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 40 、 41 及 42)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表5設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶以開始反應。反應在25℃下培育2小時。隨後藉由添加25 µL 100 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為10 mM EDTA。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 12之存在。 表5.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 40 、 41 及 42    1.3
模板：(2'H)- SEQ ID NO: 1 0.04 6.3
5'引子(2'OH) - SEQ ID NO: 2 0.04 1.0
3'阻斷子2 (2'H) - SEQ ID NO: 4 0.04 1.0
dATP 0.5 1.3
dCTP 0.5 1.3
dGTP 0.5 1.3
dTTP 0.5 1.3
Tris (pH 7.5) 50 1.3
MgCl 2 10 0.2
水    9.0
最終反應體積 (µL)    25
反應之結果： 表6.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
野生型硫磺礦硫化葉菌聚合酶-「Pol2」 40 24.44
野生型腸桿菌噬菌體T4聚合酶-「Pol4」 41 8.20
野生型科達卡熱球菌聚合酶-「Pol6」 42 11.34
*轉化為產物之轉化率(%) - SEQ ID NO: 2+ SEQ ID NO: 7 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 12峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經18分鐘運行35-71%梯度之緩衝液B，之後升至95%緩衝液B，持續7分鐘。
緩衝液A：100 mM TEAA，pH 7
緩衝液B：含100 mM TEAA，pH 7之25%乙腈/75% H 2O
結論 ：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在自2'-OH糖修飾之5'引子延伸的兩個側接寡核苷酸之間進行鹼基填充。最佳例示性聚合酶的產物形成按面積大於24%。
實例 4 ：來 自 42-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 17bp 2'H 5- 甲基胞嘧啶鹼基寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 10bp 2'H 寡核苷酸引子缺口填充的 15bp 2'H 寡核苷酸合成 目標 ：展現使用未經修飾之去氧核糖核苷三磷酸在一個經修飾之寡核苷酸片段及一個未經修飾之寡核苷酸片段之間進行缺口填充，以顯示該技術對在寡核苷酸治療劑中常見之鹼基修飾的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 38)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 40 、 42 及 44)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表7設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶以開始反應。反應在25℃下培育2小時。隨後藉由添加25 µL 100 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為10 mM EDTA。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 21之存在。 表7.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 40 、 42 及 44    1.3
模板：(2'H)- SEQ ID NO: 1 0.04 6.3
5'引子(2'H) - SEQ ID NO: 2 0.04 1.0
3'阻斷子(2'H) - SEQ ID NO: 5 0.04 1.0
dATP 0.5 1.3
dCTP 0.5 1.3
dGTP 0.5 1.3
dTTP 0.5 1.3
Tris (pH 7.5) 50 1.3
MgCl 2 10 0.2
水    9.0
最終反應體積 (µL)    25
反應之結果： 表8.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
野生型硫磺礦硫化葉菌聚合酶-「Pol2」 40 59.60
野生型腸桿菌噬菌體T4聚合酶-「Pol4」 42 76.61
野生型科達卡熱球菌聚合酶-「Pol6」 44 79.10
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 2+ SEQ ID NO: 7 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 21峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經18分鐘運行35-71%梯度之緩衝液B，之後升至95%緩衝液B，持續7分鐘。
緩衝液A：100 mM TEAA，pH 7
緩衝液B：含100 mM TEAA，pH 7之25%乙腈/75% H 2O
結論 ：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在兩個側接寡核苷酸之間進行鹼基填充，其中側接寡核苷酸內至少含有鹼基修飾。最佳例示性聚合酶的產物形成按面積大於79%。
實例 5 ：來 自 42-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'H 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 10bp 2'H 寡核苷酸引子缺口填充的 6bp 2'H 全部 PS 修飾之寡核苷酸合成 目標 ：展現用經修飾之去氧核糖核苷三磷酸在未經修飾之寡核苷酸片段之間進行缺口填充，以顯示該技術對在寡核苷酸治療劑中常見之主鏈修飾的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 38)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 40 、 41 及 42)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表9設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶以開始反應。反應在25℃下培育2小時。隨後藉由添加5 µL 500 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為水。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 12之存在。 表9.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO 40 、 41 及 42    1.0
模板：(2'H)- SEQ ID NO 1 0.04 12.5
5'引子(2'H) - SEQ ID NO 2 0.04 1.8
3'阻斷子(2'H) - SEQ ID NO 4 0.04 1.9
dATPαS 0.5 2.5
dCTPαS 0.5 2.5
dGTPαS 0.5 2.5
dTTPαS 0.5 2.5
Tris (pH 7.5) 50 2.5
MgCl 2 10 0.5
水    19.8
最終反應體積 (µL)    50
反應之結果： 表10.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
野生型硫磺礦硫化葉菌聚合酶-「Pol2」 40 8.25
突變型噬熱球菌(菌株9oN-7)聚合酶-「Pol3」 41 30.54
野生型腸桿菌噬菌體T4聚合酶-「Pol4」 42 33.58
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 2+ SEQ ID NO: 7 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 12峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經18分鐘運行35-71%梯度之緩衝液B，之後升至95%緩衝液B，持續7分鐘。
緩衝液A：100 mM TEAA，pH 7
緩衝液B：含100 mM TEAA，pH 7之25%乙腈/75% H 2O
結論：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在兩個側接寡核苷酸之間進行主鏈修飾鹼基填充。藉由合成經完全硫代磷酸酯修飾之主鏈來填充缺口。最佳例示性聚合酶的產物形成按面積大於33%。
實例 6 ：來 自 42-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'H 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 10bp 2'H 寡核苷酸引子缺口填充的 6bp 2'H 去氧鳥苷 PS 修飾之寡核苷酸合成 目標 ：展現使用經修飾之去氧鳥苷三磷酸、但未經修飾之去氧腺苷三磷酸、未經修飾之去氧胞苷三磷酸及未經修飾之去氧胸苷三磷酸在未經修飾之寡核苷酸片段之間進行缺口填充，以顯示該技術對在寡核苷酸治療劑中常見之模組主鏈修飾的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 38)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 40 、 41 及 42)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表11設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶以開始反應。反應在25℃下培育2小時。隨後藉由添加5 µL 500 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為水。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 12之存在。 表11.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 40 、 41 及 42    1.0
模板：(2'H)- SEQ ID NO: 1 0.04 12.5
5'引子(2'H) - SEQ ID NO: 2 0.04 1.8
3'阻斷子2 (2'H) - SEQ ID NO: 4 0.04 1.9
dATP 0.5 2.5
dCTP 0.5 2.5
dGTPαS 0.5 2.5
dTTP 0.5 2.5
Tris (pH 7.5) 50 2.5
MgCl 2 10 0.5
水    19.8
最終反應體積 (µL)    50
反應之結果： 表12.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
野生型硫磺礦硫化葉菌聚合酶-「Pol2」 40 59.39
突變型噬熱球菌(菌株9oN-7)聚合酶-「Pol3」 41 43.07
野生型腸桿菌噬菌體T4聚合酶-「Pol4」 42 89.77
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 2+ SEQ ID NO: 7 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 12峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經18分鐘運行35-71%梯度之緩衝液B，之後升至95%緩衝液B，持續7分鐘。
緩衝液A：100 mM TEAA，pH 7
緩衝液B：含100 mM TEAA，pH 7之25%乙腈/75% H 2O
結論 ：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在兩個側接寡核苷酸之間進行特異性主鏈修飾鹼基填充。藉由在所需鹼基之間合成經硫代磷酸酯修飾之主鏈鍵來填充缺口。產物形成按面積大於89%之最佳例示性聚合酶。
實例 7 ：來 自 42-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'H 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 10bp 2'H 寡核苷酸引子缺口填充的 6bp 2'H 去氧胸苷 PS 修飾之寡核苷酸合成 目標 ：展現使用經修飾之去氧鳥苷三磷酸、未經修飾之去氧腺苷三磷酸、未經修飾之去氧胞苷三磷酸及未經修飾之去氧胸苷三磷酸在未經修飾之寡核苷酸片段之間進行缺口填充，以顯示該技術對寡核苷酸治療劑中常見之模組主鏈修飾的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 38)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 40 、 41 及 42)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表13設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶以開始反應。反應在25℃下培育2小時。隨後藉由添加5 µL 500 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為水。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 12之存在。 表13.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 40 、 41 及 42    1.0
模板：(2'H)- SEQ ID NO: 1 0.04 12.5
5'引子(2'H) - SEQ ID NO: 2 0.04 1.8
3'阻斷子2 (2'H) - SEQ ID NO: 4 0.04 1.9
dATP 0.5 2.5
dCTP 0.5 2.5
dGTP 0.5 2.5
dTTPαS 0.5 2.5
Tris (pH 7.5) 50 2.5
MgCl 2 10 0.5
水    19.8
最終反應體積 (µL)    50
反應之結果： 表14.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
野生型硫磺礦硫化葉菌聚合酶-「Pol2」 40 53.39
突變型噬熱球菌(菌株9oN-7)聚合酶-「Pol3」 41 29.36
野生型腸桿菌噬菌體T4聚合酶-「Pol4」 42 78.44
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 2+ SEQ ID NO: 7 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 12峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經18分鐘運行35-71%梯度之緩衝液B，之後升至95%緩衝液B，持續7分鐘。
緩衝液A：100 mM TEAA，pH 7
緩衝液B：含100 mM TEAA，pH 7之25%乙腈/75% H 2O
結論：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在兩個側接寡核苷酸之間進行特異性主鏈修飾鹼基填充。藉由在所需鹼基之間合成經硫代磷酸酯修飾之主鏈鍵來填充缺口。產物形成按面積大於89%之最佳例示性聚合酶。
實例 8 ： 自 42-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 17bp 2'H 5- 甲基胞嘧啶鹼基寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 10bp 2'H 寡核苷酸引子缺口填充的一鍋式 15bp 2'H 寡核苷酸合成及合成 42-bp 產物的連接 目標 ：展現用一個經修飾之寡核苷酸片段及一個未經修飾之寡核苷酸片段及未經修飾之去氧核糖核苷三磷酸進行缺口填充及連接以顯示該技術在寡核苷酸治療劑中常見之鹼基修飾的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 38)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 40 、 42 及 44)係獲自市售來源且直接使用。雙股連接酶( SEQ ID NO: 45)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表15設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶及連接酶以開始反應。反應在25℃下培育2小時。隨後藉由添加25 µL 100 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為10 mM EDTA。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 38之存在。 表15.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 40 、 42 及 44    1.3
連接酶- SEQ ID NO: 45    0.5
模板：(2'H)- SEQ ID NO: 1 0.04 6.3
5'引子(2'H) - SEQ ID NO: 2 0.04 1.0
3'阻斷子3 (2'H) - SEQ ID NO: 5 0.04 1.0
dATP 0.5 1.3
dCTP 0.5 1.3
dGTP 0.5 1.3
dTTP 0.5 1.3
ATP 1 2.5
Tris (pH 7.5) 50 1.3
MgCl 2 10 0.2
水    6.0
最終反應體積 (µL)    25
反應之結果： 表16.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
野生型硫磺礦硫化葉菌聚合酶-「Pol2」 40 60.77
野生型腸桿菌噬菌體T4聚合酶-「Pol4」 42 81.33
野生型科達卡熱球菌聚合酶-「Pol6」 44 79.90
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 2 + SEQ ID NO: 5 + SEQ ID NO: 7 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 38峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經18分鐘運行35-71%梯度之緩衝液B，之後升至95%緩衝液B，持續7分鐘。
結論 ：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在兩個側接寡核苷酸之間進行鹼基填充，其中至少一個鹼基修飾包含於側接寡核苷酸中之一者內。此外，連接酶能夠進行串聯連接反應以自合成片段獲得全長寡核苷酸。產物形成按面積大於81%之最佳例示性聚合酶及連接酶。
實例 9 ：來 自 45-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'H 寡核苷酸 3' 阻斷子 2'H 之間的 10bp 2'H 寡核苷酸引子缺口填充的一鍋式 6bp 2'F 修飾之寡核苷酸合成及合成 42-bp 產物的連接 目標 ：展現使用未經修飾之去氧胸苷三磷酸、經修飾之去氧腺苷三磷酸、經修飾之去氧胞苷三磷酸及經修飾之去氧鳥苷三磷酸在未經修飾之寡核苷酸片段之間進行缺口填充，以顯示該技術在寡核苷酸治療劑中常見之糖修飾的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 38 及 SEQ ID NO: 46 至 SEQ ID NO: 54)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 67 、 69 、 73 、 77 及 87)係獲自市售來源且直接使用。雙股連接酶( SEQ ID NO: 45)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表17設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶及連接酶以開始反應。反應在25℃下培育4小時。隨後藉由添加60 µL 100 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為水。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 38之存在。 表17.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 67 、 69 、 73 、 77 及 87)    1.0
RNA酶抑制劑    1.0
連接酶- SEQ ID NO: 45    4.0
模板XXL：(2'H) - SEQ ID NO: 46 0.04 0.8
5'引子(2'H) - SEQ ID NO: 2 0.04 0.8
3'阻斷子2 (2'H) - SEQ ID NO: 4 0.04 0.8
2'-F-dATP 0.5 1.0
2'-F-dGTP 0.5 1.0
2'-F-dCTP 0.5 1.0
dTTP 0.5 1.0
ATP 1 2.0
Tris (pH 7.5) 50 1.0
MgCl 2 10 0.2
KCl 50 0.5
水    3.9
最終反應體積 (µL)    20
反應之結果： 表18.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
突變型科達卡熱球菌聚合酶-「Kod-V2」 67 72.16
突變型海濱嗜熱球菌聚合酶-「Vent-V1」 69 90.10
突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V5」 73 75.43
突變型嗜熱球菌聚合酶-「9n-V4」 77 77.19
突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V12」 87 71.60
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 2 + SEQ ID NO: 4 + SEQ ID NO: 7 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 38峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經25分鐘運行40-95%梯度之緩衝液B，之後降至40%緩衝液B，持續4分鐘。
緩衝劑A：含5 mM TBuAA，pH 7之90% H 2O/10%乙腈
緩衝液B：含5 mM TBuAA，pH 7之20% H 2O/80%乙腈
結論：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在兩個側接寡核苷酸之間進行特異性糖修飾鹼基填充。藉由在所需鹼基處併入2'-氟修飾來填充缺口。此外，連接酶能夠進行串聯連接反應以自合成片段獲得全長寡核苷酸。產物形成按面積大於90.1%之最佳例示性聚合酶及連接酶。
實例 10 ：來 自 45-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'H 寡核苷酸 3' 阻斷子 2'H 之間的 10bp 2'H 寡核苷酸引子缺口填充的一鍋式 6bp 2'H 去氧胞苷 Me-dC 修飾之寡核苷酸合成及合成 42-bp 產物的連接 目標 ：展現使用經修飾之去氧胞苷三磷酸、未經修飾之去氧腺苷三磷酸、未經修飾之去氧鳥苷三磷酸及未經修飾之去氧胸苷三磷酸在未經修飾之寡核苷酸片段之間進行缺口填充，以顯示該技術在寡核苷酸治療劑中常見之模組鹼基修飾的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 38 及 SEQ ID NO: 46 至 SEQ ID NO: 54)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 42 、 44 及 86)係獲自市售來源且直接使用。雙股連接酶( SEQ ID NO: 45)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表19設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶及連接酶以開始反應。反應在25℃下培育4小時。隨後藉由添加60 µL 100 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為水。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 38之存在。 表19.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 42 、 44 及 86    1.0
RNA酶抑制劑    1.0
連接酶- SEQ ID NO: 45    1.0
模板XXL：(2'H) - SEQ ID NO: 46 0.04 0.8
5'引子(2'H) - SEQ ID NO: 2 0.04 0.8
3'阻斷子2 (2'H) - SEQ ID NO: 4 0.04 0.8
dATP 0.5 1.0
dGTP 0.5 1.0
5-me-dCTP 0.5 1.0
dTTP 0.5 1.0
ATP 1 2.0
Tris (pH 7.5) 50 1.0
MgCl 2 10 0.2
KCl 50 0.5
水    6.9
最終反應體積 (µL)    20
反應之結果： 表20.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
野生型科達卡熱球菌聚合酶-「Pol6」 44 98.48
野生型腸桿菌噬菌體T4聚合酶-「Pol4」 42 91.26
野生型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo」 86 94.55
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 2 + SEQ ID NO: 4 + SEQ ID NO: 7 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 38峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經25分鐘運行40-95%梯度之緩衝液B，之後降至40%緩衝液B，持續4分鐘。
緩衝劑A：含5 mM TBuAA，pH 7之90% H 2O/10%乙腈
緩衝液B：含5 mM TBuAA，pH 7之20% H 2O/80%乙腈
結論：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在兩個側接寡核苷酸之間進行特異性修飾鹼基填充。藉由在所需鹼基處併入5-甲基胞嘧啶修飾來填充缺口。此外，連接酶能夠進行串聯連接反應以自合成片段獲得全長寡核苷酸。產物形成按面積大於98%之最佳例示性聚合酶及連接酶。
實例 11 ：來 自 45-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'H 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 10bp 2'F 修飾之寡核苷酸引子缺口填充的 6bp 2'F 全部修飾之寡核苷酸合成 目標 ：展現用經修飾之去氧核糖核苷三磷酸在經修飾及未經修飾之寡核苷酸片段之間進行缺口填充，以顯示該技術在寡核苷酸治療劑中常見之糖修飾的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 38 及 SEQ ID NO: 46 至 SEQ ID NO: 54)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 80 、 84 及 89)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表21設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶以開始反應。反應在25℃下培育4小時。隨後藉由添加60 µL 100 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為水。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 12之存在。 表21.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 80 、 84 及 89    1.0
RNA酶抑制劑    1.0
模板XXL：(2'H) - SEQ ID NO 46 0.04 0.8
5'引子(2'F) - SEQ ID NO 49 0.04 0.8
3' 阻斷子5 (2'H) - SEQ ID NO 54 0.04 0.8
2'-F-dATP 0.5 1.0
2'-F-dGTP 0.5 1.0
2'-F-dCTP 0.5 1.0
2'-F-dUTP 0.5 1.0
Tris (pH 7.5) 50 1.0
MgCl 2 10 0.2
KCl 50 0.5
水    9.9
最終反應體積 (µL)    20
反應之結果： 表22.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V4」 80 10.59
突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V5」 84 14.83
突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V6」 89 12.68
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 49+ SEQ ID NO: 7 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 12峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行，同時在260 nm監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品，且40-95%梯度之緩衝液B運行25分鐘，之後降至40%緩衝液B持續4分鐘。
緩衝劑A：5 mM TBuAA，pH 7於90% H 2O/10%乙腈中
緩衝液B：5 mM TBuAA，pH 7於20% H 2O/80%乙腈中
結論 ：驗證引子延伸聚合酶可用於進行鹼基填充於自2'-氟修飾之寡核苷酸引子延伸的兩個側接寡核苷酸之間之概念。藉由2'-氟糖修飾併入所需鹼基位置來填充缺口。最佳例示性聚合酶之產物形成按面積大於14%。
實例 12 ： 自 53-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'H 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 16bp 2'OH 寡核苷酸引子缺口填充的 8bp 2'OH 寡核苷酸合成 目標 ：展現使用核苷三磷酸在RNA寡核苷酸片段(引子)及未經修飾之DNA寡核苷酸片段(阻斷子)之間進行缺口填充，以顯示該技術在寡核苷酸治療劑中常見之糖基(2'OH)的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 38 及 SEQ ID NO: 46 至 SEQ ID NO: 54)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 95)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表23設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶以開始反應。反應在55℃培育20小時。隨後藉由添加60 µL 100 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為水。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 20之存在。 表23.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 95    1.0
RNA酶抑制劑    1.0
模板NoRXL：(2'H) - SEQ ID NO: 47 0.04 0.8
5'引子N+6 (2'OH) - SEQ ID NO: 51 0.04 0.8
3'阻斷子2 (2'H) - SEQ ID NO: 4 0.04 0.8
ATP 0.5 1.0
CTP 0.5 1.0
GTP 0.5 1.0
UTP 0.5 1.0
Tris (pH 7.5) 50 1.0
MgCl 2 10 0.2
KCl 50 0.5
水    9.9
最終反應體積 (µL)    20
反應之結果： 表24.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V8」 95 27.10
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 51 + SEQ ID NOs: 11 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 20峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經25分鐘運行40-95%梯度之緩衝液B，之後降至40%緩衝液B，持續4分鐘。
緩衝劑A：含5 mM TBuAA，pH 7之90% H 2O/10%乙腈
緩衝液B：含5 mM TBuAA，pH 7之20% H 2O/80%乙腈
結論 ：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在自RNA 5'引子延伸的兩個側接寡核苷酸之間進行缺口填充。聚合酶產生27%面積之產物形成。
實例 13 ：來 自 53-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'H 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 16bp 2'OMe 修飾之寡核苷酸引子缺口填充的 8bp 2'OH 寡核苷酸合成 目標 ：展現使用核苷三磷酸在經修飾之寡核苷酸片段(引子)及未經修飾之DNA寡核苷酸片段(阻斷子)之間進行缺口填充，以顯示該技術在寡核苷酸治療劑中常見之糖基(2'OMe)的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 38 及 SEQ ID NO: 46 至 SEQ ID NO: 54)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 60)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表25設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶以開始反應。反應在55℃下培育20小時。隨後藉由添加60 µL 100 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為水。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 20之存在。 表25.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 60    1.0
RNA酶抑制劑    1.0
模板NoRXL：(2'H) - SEQ ID NO: 47 0.04 0.8
5'引子N+6 (2'OMe+r) - SEQ ID NO: 53 0.04 0.8
3'阻斷子2 (2'H) - SEQ ID NO: 4 0.04 0.8
ATP 0.5 1.0
CTP 0.5 1.0
GTP 0.5 1.0
UTP 0.5 1.0
Tris (pH 7.5) 50 1.0
MgCl 2 10 0.2
KCl 50 0.5
水    9.9
最終反應體積 (µL)    20
反應之結果： 表26.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
突變型嗜熱球菌聚合酶-「9n-V5」 60 32.75
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 53 + SEQ ID NOs: 11 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 20峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經25分鐘運行40-95%梯度之緩衝液B，之後降至40%緩衝液B，持續4分鐘。
緩衝劑A：含5 mM TBuAA，pH 7之90% H 2O/10%乙腈
緩衝液B：含5 mM TBuAA，pH 7之20% H 2O/80%乙腈
結論 ：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在自糖修飾之5'引子延伸的兩個側接寡核苷酸之間進行缺口填充。產物形成按面積大於32%之聚合酶。
實例 14 ：來 自 100-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'H 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 16bp 2'OH 寡核苷酸引子缺口填充的 54bp 2'OH 寡核苷酸合成 目標 ：展現使用100-bp 2'H寡核苷酸模板及核苷三磷酸在RNA寡核苷酸片段(引子)及未經修飾之DNA寡核苷酸片段(阻斷子)之間進行較長缺口填充，以顯示該技術之普遍適用性。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 38 及 SEQ ID NO: 46 至 SEQ ID NO: 54)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 56 、 60 、 84 、 89 及 93)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表27設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶以開始反應。反應在55℃下培育20小時。隨後藉由添加60 µL 100 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為水。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 55之存在。 表27.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 56 、 60 、 84 、 89 及 93    1.0
RNA酶抑制劑    1.0
模板100聚體：(2'H) - SEQ ID NO: 48 0.04 0.8
5'引子N+6 (2'OH) - SEQ ID NO: 51 0.04 0.8
3'阻斷子2 (2'H) - SEQ ID NO: 4 0.04 0.8
ATP 0.5 1.0
CTP 0.5 1.0
GTP 0.5 1.0
UTP 0.5 1.0
Tris (pH 7.5) 50 1.0
MgCl 2 10 0.2
KCl 50 0.5
水    9.9
最終反應體積 (µL)    20
反應之結果： 表28.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
野生型嗜熱球菌聚合酶-「9n」 56 41.07
突變型嗜熱球菌聚合酶-「9n-V5」 60 39.81
突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V5」 84 57.59
突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V6」 89 57.58
突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V1」 93 43.54
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 51 + SEQ ID NO: 11 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 55峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經15分鐘運行60-85%梯度之緩衝液B，之後降至60%緩衝液B，持續5分鐘。
緩衝劑A：含5 mM TBuAA，pH 7之90% H 2O/10%乙腈
緩衝液B：含5 mM TBuAA，pH 7之20% H 2O/80%乙腈
結論 ：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在自RNA 5'引子延伸的兩個側接寡核苷酸之間進行較長鹼基填充。產物形成按面積大於57%之最佳例示性聚合酶。
實例 15 ：來 自 100-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'H 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 16bp 2'OMe 寡核苷酸引子缺口填充的 54bp 2'OH 寡核苷酸合成 目標 ：展現使用100-bp 2'H寡核苷酸模板及核苷三磷酸在經修飾之寡核苷酸片段(引子)及未經修飾之DNA寡核苷酸片段(阻斷子)之間進行較長缺口填充，以顯示該技術之普遍適用性。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 38 及 SEQ ID NO: 46 至 SEQ ID NO: 54)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 60 、 83 、 84 及 89)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表29設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶以開始反應。反應在55℃下培育20小時。隨後藉由添加60 µL 100 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為水。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 55之存在。 表29.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 60 、 83 、 84 及 89    1.0
RNA酶抑制劑    1.0
模板100聚體：(2'H) - SEQ ID NO: 48 0.04 0.8
5'引子N+6 (2'OMe+r) - SEQ ID NO: 53 0.04 0.8
3'阻斷子2 (2'H) - SEQ ID NO: 4 0.04 0.8
ATP 0.5 1.0
CTP 0.5 1.0
GTP 0.5 1.0
UTP 0.5 1.0
Tris (pH 7.5) 50 1.0
MgCl 2 10 0.2
KCl 50 0.5
水    9.9
最終反應體積 (µL)    20
反應之結果： 表30.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
突變型嗜熱球菌聚合酶-「9n-V5」 60 26.80
突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V9」 83 20.20
突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V5」 84 27.18
突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V6」 89 33.12
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 53 + SEQ ID NO: 11 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 55峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經15分鐘運行60-85%梯度之緩衝液B，之後降至60%緩衝液B，持續5分鐘。
緩衝劑A：含5 mM TBuAA，pH 7之90% H 2O/10%乙腈
緩衝液B：含5 mM TBuAA，pH 7之20% H 2O/80%乙腈
結論 ：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在自糖修飾之5'引子延伸的兩個側接寡核苷酸之間進行較長鹼基填充。產物形成按面積大於33%之最佳例示性聚合酶。
實例 16 ：來 自 22-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 7bp 2'MOE 寡核苷酸 3' 阻斷子 2 之間的 9bp 2'MOE 寡核苷酸引子缺口填充的一鍋式 6bp 2'H 全部 PS 修飾之寡核苷酸合成及合成 22-bp 產物的連接 目標 ：展現用PS修飾之去氧核糖核苷酸在2'MOE修飾之寡核苷酸片段之間進行缺口填充，以顯示該技術在間隔體寡核苷酸治療劑中常見之主鏈修飾及糖修飾的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 96 至 SEQ ID NO: 98)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 41)係獲自市售來源且直接使用。雙股連接酶( SEQ ID NO: 45)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表31設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶及連接酶以開始反應。反應在25℃下培育4小時。隨後藉由添加60 µL 100 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為水。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 99之存在。 表31.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 41    1.0
連接酶- SEQ ID NO: 45    1.0
模板H：(2'H) - SEQ ID NO: 96 0.04 0.8
縮短子1 (2'MOE) - SEQ ID NO: 97 0.04 0.8
縮短子3 (2'MOE) - SEQ ID NO: 98 0.04 0.8
dATPαS 0.5 1.0
dCTPαS 0.5 1.0
dGTPαS 0.5 1.0
dTTPαS 0.5 1.0
ATP 1 2.0
Tris (pH 7.5) 50 1.0
MgCl 2 10 0.2
水    8.4
最終反應體積 (µL)    20
反應之結果： 表32.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
突變型噬熱球菌(菌株9oN-7)聚合酶-「Pol3」 41 13.2
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 97 + SEQ ID NO: 98 + SEQ ID NO: 100對比 SEQ ID NO: 99峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經25分鐘運行40-95%梯度之緩衝液B，之後降至40%緩衝液B，持續4分鐘。
緩衝劑A：含5 mM TBuAA，pH 7之90% H 2O/10%乙腈
緩衝液B：含5 mM TBuAA，pH 7之20% H 2O/80%乙腈
結論：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在兩個側接2'MOE寡核苷酸之間進行特異性主鏈修飾鹼基填充。藉由在所需鹼基之間併入PS修飾來填充缺口。此外，連接酶能夠進行串聯連接反應以自合成片段獲得全長寡核苷酸。產物形成按面積大於13.2%之例示性聚合酶及連接酶。
實例 17 ：來 自 22-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 7bp 2'MOE 寡核苷酸 3' 阻斷子 2'H 之間的 9bp 2'MOE 寡核苷酸引子缺口填充的一鍋式 6bp 2'H 寡核苷酸合成及合成 22-bp 產物的連接 目標 ：展現用去氧核糖核苷三磷酸在2'MOE修飾之寡核苷酸片段之間進行缺口填充，以顯示該技術在間隔體寡核苷酸治療劑中常見之糖修飾的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 96 至 SEQ ID NO: 98)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 40 至 SEQ ID NO: 42)係獲自市售來源且直接使用。雙股連接酶( SEQ ID NO: 45)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表33設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶及連接酶以開始反應。反應在25℃下培育4小時。隨後藉由添加60 µL 100 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為水。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 99 之存在。 表33.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 40 至 SEQ ID NO: 42    1.0
連接酶- SEQ ID NO: 45    1.0
模板H：(2'H) - SEQ ID NO: 96 0.04 0.8
縮短子1 (2'MOE) - SEQ ID NO: 97 0.04 0.8
縮短子3 (2'MOE) - SEQ ID NO: 98 0.04 0.8
dATP 0.5 1.0
dCTP 0.5 1.0
dGTP 0.5 1.0
dTTP 0.5 1.0
ATP 1 2.0
Tris (pH 7.5) 50 1.0
MgCl 2 10 0.2
水    8.4
最終反應體積 (µL)    20
反應之結果： 表34.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
野生型硫磺礦硫化葉菌聚合酶-「Pol2」 40 30.1
突變型噬熱球菌(菌株9oN-7)聚合酶-「Pol3」 41 64.0
野生型腸桿菌噬菌體T4聚合酶-「Pol4」 42 52.2
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 97 + SEQ ID NO: 98 + SEQ ID NO: 100對比 SEQ ID NO: 99峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經25分鐘運行40-95%梯度之緩衝液B，之後降至40%緩衝液B，持續4分鐘。
緩衝劑A：含5 mM TBuAA，pH 7之90% H 2O/10%乙腈
緩衝液B：含5 mM TBuAA，pH 7之20% H 2O/80%乙腈
結論：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在兩個側接2'MOE寡核苷酸之間進行特異性鹼基填充。此外，連接酶能夠進行串聯連接反應以自合成片段獲得全長寡核苷酸。產物形成按面積大於64%之最佳例示性聚合酶及連接酶。
實例 18 ：來 自 53-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'H 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 16bp 2'OMe 寡核苷酸引子缺口填充的 8bp 2'OMe 寡核苷酸合成 目標 ：展現使用53-bp 2'H寡核苷酸模板在2'OMe修飾之寡核苷酸片段(引子)及未經修飾之DNA寡核苷酸片段(阻斷子)之間用2'OMe糖修飾之核苷三磷酸進行缺口填充，以顯示該技術之普遍適用性。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 4 、 47 及 52)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 62 及 87)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表35設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加聚合酶以開始反應。反應在55℃下培育20小時。隨後藉由添加60 µL 100 mM EDTA淬滅反應，隨後使用SEC將反應緩衝液更換為水。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 20之存在。 表35.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 62 及 87    1.0
模板NoRXL：(2'H) - SEQ ID NO: 47 0.04 0.8
5'引子N+6 (2'OMe) - SEQ ID NO: 52 0.04 0.8
3'阻斷子2 (2'H) - SEQ ID NO: 4 0.04 0.8
2'OMe ATP 0.5 1.0
2'OMe CTP 0.5 1.0
2'OMe GTP 0.5 1.0
2'OMe UTP 0.5 1.0
Tris (pH 7.5) 50 1.0
MgCl 2 10 0.2
KCl 50 0.5
水    10.9
最終反應體積 (µL)    20
反應之結果： 表36.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
突變型科達卡熱球菌聚合酶-「Kod-V1」 62 12.0
突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V12」 87 15.8
*轉化為產物之轉化率(%)- SEQ ID NO: 52 + SEQ ID NO: 11 至 SEQ ID NO: 38峰對比 SEQ ID NO: 20峰在260 nm波長下之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經15分鐘運行60-85%梯度之緩衝液B，之後降至60%緩衝液B，持續5分鐘。
緩衝劑A：含5 mM TBuAA，pH 7之90% H 2O/10%乙腈
緩衝液B：含5 mM TBuAA，pH 7之20% H 2O/80%乙腈
結論 ：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在自具有2'OMe糖修飾之核苷三磷酸的2'OMe糖修飾之5'引子延伸的兩個側接寡核苷酸之間進行鹼基填充。產物形成按面積大於15%之最佳例示性聚合酶。
實例 19 ：來 自 895-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'OH 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 16bp 2'OH 寡核苷酸引子缺口填充的 850bp 2'OH 寡核苷酸合成及製造 892bp 產物的連接 目標 ：展現使用核苷三磷酸在RNA寡核苷酸片段(引子)及RNA寡核苷酸片段(阻斷子)之間進行缺口填充，以顯示該技術在較長寡核苷酸治療劑中常見之糖基(2'OH)的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 51 、 76 及 101)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 95)係獲自市售來源且直接使用。雙股連接酶( SEQ ID NO: 45)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表37設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加RNA酶抑制劑。接著，隨後添加聚合酶及連接酶以開始反應。反應在25℃下培育16小時。其後添加1 μL DNA水解酶1，且將反應在25℃下進一步培育2小時。隨後藉由添加4 µL 10 mM EDTA淬滅反應，隨後藉由凝膠電泳分析反應中 SEQ ID NO: 102之存在。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 101之存在。 表37.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 95    0.25
連接酶- SEQ ID NO: 45    0.12
RNA酶抑制劑    0.12
模板-900聚體：(2'H) - SEQ ID NO: 76 0.001 1.25
5'引子N+6 (2'OH) - SEQ ID NO: 51 0.001 0.05
3' 阻斷子6 (2'OH) - SEQ ID NO: 101 0.001 0.05
ATP 0.2 0.0125
CTP 0.2 0.0125
GTP 0.2 0.0125
UTP 0.2 0.0125
Tris (pH 7.5) 50 0.12
MgCl 2 10 0.25
KCl 50 0.06
水    0.16
最終反應體積 (µL)    2.5
反應之結果： 表38.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V8」 95 18.61
*轉化為產物之轉化率(%)-反應 SEQ ID NO: 101峰對比陰性對照 SEQ ID NO: 101峰在波長260 nm處之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經25分鐘運行40-95%梯度之緩衝液B，之後降至40%緩衝液B，持續4分鐘。
緩衝劑A：含5 mM TbuAA，pH 7之90% H 2O/10%乙腈
緩衝液B：含5 mM TbuAA，pH 7之20% H 2O/80%乙腈
結論 ：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在自RNA 5'引子延伸的兩個側接寡核苷酸之間進行缺口填充。聚合酶及串聯連接產生18.6%面積之產物形成。
實例 20 ：來 自 895-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'OH 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 16bp 2'Ome 寡核苷酸引子缺口填充的 850bp 2'OH 寡核苷酸合成及製造 892bp 產物的連接 目標 ：展現使用核苷三磷酸在含有2'Ome之寡核苷酸片段(引子)及RNA寡核苷酸片段(阻斷子)之間進行缺口填充，以顯示該技術在較長寡核苷酸治療劑中常見之糖基(2'OH)的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 53 、 76 及 101)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 95)係獲自市售來源且直接使用。雙股連接酶( SEQ ID NO: 45)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表39設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加RNA酶抑制劑。接著，隨後添加聚合酶及連接酶以開始反應。反應在25℃下培育16小時。其後添加1 μL DNA水解酶1，且將反應在25℃下進一步培育2小時。隨後藉由添加4 µL 10 mM EDTA淬滅反應，隨後藉由凝膠電泳分析反應中 SEQ ID NO: 103之存在。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 101之存在。 表39.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 95    0.25
連接酶- SEQ ID NO: 45    0.12
RNA酶抑制劑    0.12
模板-900聚體：(2'H) - SEQ ID NO: 76 0.001 1.25
5'引子N+6 (2'Ome+r) - SEQ ID NO: 53 0.001 0.05
3' 阻斷子6 (2'OH) - SEQ ID NO: 101 0.001 0.05
ATP 0.2 0.0125
CTP 0.2 0.0125
GTP 0.2 0.0125
UTP 0.2 0.0125
Tris (pH 7.5) 50 0.12
MgCl 2 10 0.25
KCl 50 0.06
水    0.16
最終反應體積 (µL)    2.5
反應之結果： 表40.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V8」 95 36.52
*轉化為產物之轉化率(%)-反應 SEQ ID NO: 101峰對比陰性對照 SEQ ID NO: 101峰在波長260 nm處之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經25分鐘運行40-95%梯度之緩衝液B，之後降至40%緩衝液B，持續4分鐘。
緩衝劑A：含5 mM TbuAA，pH 7之90% H 2O/10%乙腈
緩衝液B：含5 mM TbuAA，pH 7之20% H 2O/80%乙腈
結論 ：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在自含有2'Ome之5'引子延伸的兩個側接寡核苷酸之間進行缺口填充。聚合酶及串聯連接產生36.52%面積之產物形成。
實例 21 ：來 自 895-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'OH 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 16bp 2'OH PS 寡核苷酸引子缺口填充的 850bp 2'OH 寡核苷酸合成及製造 892bp 產物的連接 目標 ：展現使用核苷三磷酸在含有RNA硫代磷酸酯之寡核苷酸片段(引子)及RNA寡核苷酸片段(阻斷子)之間進行缺口填充，以顯示該技術在較長寡核苷酸治療劑中常見之糖基(2'OH)的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 76 、 101 及 104)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 95)係獲自市售來源且直接使用。雙股連接酶( SEQ ID NO: 45)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表41設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加RNA酶抑制劑。接著，隨後添加聚合酶及連接酶以開始反應。反應在25℃下培育16小時。其後添加1 μL DNA水解酶1，且將反應在25℃下進一步培育2小時。隨後藉由添加4 µL 10 mM EDTA淬滅反應，隨後藉由凝膠電泳分析反應中 SEQ ID NO: 105之存在。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 101之存在。 表41.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 95    0.25
連接酶- SEQ ID NO: 45    0.12
RNA酶抑制劑    0.12
模板-900聚體：(2'H) - SEQ ID NO: 76 0.001 1.25
5'引子N+6_2'OH_PS (2'OH)- SEQ ID NO: 104 0.001 0.05
3' 阻斷子6 (2'OH) - SEQ ID NO: 101 0.001 0.05
ATP 0.2 0.0125
CTP 0.2 0.0125
GTP 0.2 0.0125
UTP 0.2 0.0125
Tris (pH 7.5) 50 0.12
MgCl 2 10 0.25
KCl 50 0.06
水    0.16
最終反應體積 (µL)    2.5
反應之結果： 表42.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V8」 95 10.78
*轉化為產物之轉化率(%)-反應 SEQ ID NO: 101峰對比陰性對照 SEQ ID NO: 101峰在波長260 nm處之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經25分鐘運行40-95%梯度之緩衝液B，之後降至40%緩衝液B，持續4分鐘。
緩衝劑A：含5 mM TbuAA，pH 7之90% H 2O/10%乙腈
緩衝液B：含5 mM TbuAA，pH 7之20% H 2O/80%乙腈
結論 ：概念驗證引子延伸聚合酶可用於在自含有2'OH硫代磷酸酯之5'引子延伸的兩個側接寡核苷酸之間進行缺口填充。聚合酶及串聯連接產生10.78%面積之產物形成。
實例 22 ：來 自 895-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'OH 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 16bp 2'OH 寡核苷酸引子缺口填充的含有假尿苷之 850bp 2'OH 寡核苷酸合成及製造 892bp 產物的連接 目標 ：展現使用假尿苷核苷三磷酸及核苷三磷酸在RNA寡核苷酸片段(引子)及RNA寡核苷酸片段(阻斷子)之間進行缺口填充，以顯示該技術在寡核苷酸治療劑中常見之鹼基修飾(Ψ)的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 51 、 76 及 101)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 95)係獲自市售來源且直接使用。雙股連接酶( SEQ ID NO: 45)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表43設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加RNA酶抑制劑。接著，隨後添加聚合酶及連接酶以開始反應。反應在25℃下培育16小時。其後添加1 μL DNA水解酶1，且將反應在25℃下進一步培育2小時。隨後藉由添加4 µL 10 mM EDTA淬滅反應，隨後藉由凝膠電泳分析反應中 SEQ ID NO: 106之存在。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 101之存在。 表43.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 95    0.25
連接酶- SEQ ID NO: 45    0.12
RNA酶抑制劑    0.12
模板-900聚體：(2'H) - SEQ ID NO: 76 0.001 1.25
5'引子N+6 (2'OH) - SEQ ID NO: 51 0.001 0.05
3'阻斷子6 (2'OH) - SEQ ID NO: 101 0.001 0.05
ATP 0.2 0.0125
CTP 0.2 0.0125
GTP 0.2 0.0125
ΨTP 0.2 0.0125
Tris (pH 7.5) 50 0.12
MgCl 2 10 0.25
KCl 50 0.06
水    0.16
最終反應體積 (µL)    2.5
反應之結果： 表44.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V8」 95 24.4
*轉化為產物之轉化率(%)-反應 SEQ ID NO: 101峰對比陰性對照 SEQ ID NO: 101峰在波長260 nm處之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經25分鐘運行40-95%梯度之緩衝液B，之後降至40%緩衝液B，持續4分鐘。
緩衝劑A：含5 mM TBuAA，pH 7之90% H 2O/10%乙腈
緩衝液B：含5 mM TBuAA，pH 7之20% H 2O/80%乙腈
結論 ：概念驗證引子延伸聚合酶可用於進行缺口填充以形成含有假尿苷之序列。聚合酶及串聯連接產生24.4%面積之產物形成。
實例 23 ：來 自 895-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'OH 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 16bp 2'OH 寡核苷酸引子缺口填充的含有 N1- 甲基假尿苷之 850bp 2'OH 寡核苷酸合成及製造 892bp 產物的連接 目標 ：展現使用N1-甲基假尿苷核苷三磷酸及核苷三磷酸在RNA寡核苷酸片段(引子)及RNA寡核苷酸片段(阻斷子)之間進行缺口填充，以顯示該技術在寡核苷酸治療劑中常見之鹼基修飾(m1Ψ)的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 51 、 76 及 101)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 95)係獲自市售來源且直接使用。雙股連接酶( SEQ ID NO: 45)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表45設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加RNA酶抑制劑。接著，隨後添加聚合酶及連接酶以開始反應。反應在25℃下培育16小時。其後添加1 μL DNA水解酶1，且將反應在25℃下進一步培育2小時。隨後藉由添加4 µL 10 mM EDTA淬滅反應，隨後藉由凝膠電泳分析反應中 SEQ ID NO: 107之存在。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 101之存在。 表45.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 95    0.25
連接酶- SEQ ID NO: 45    0.12
RNA酶抑制劑    0.12
模板-900聚體：(2'H) - SEQ ID NO: 76 0.001 1.25
5'引子N+6 (2'OH) - SEQ ID NO: 51 0.001 0.05
3'阻斷子6 (2'OH) - SEQ ID NO: 101 0.001 0.05
ATP 0.2 0.0125
CTP 0.2 0.0125
GTP 0.2 0.0125
m1ΨTP 0.2 0.0125
Tris (pH 7.5) 50 0.12
MgCl 2 10 0.25
KCl 50 0.06
水    0.16
最終反應體積 (µL)    2.5
反應之結果： 表46.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V8」 95 21.64
*轉化為產物之轉化率(%)- 反應 SEQ ID NO: 101峰對比陰性對照 SEQ ID NO: 101峰在波長260 nm處之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經25分鐘運行40-95%梯度之緩衝液B，之後降至40%緩衝液B，持續4分鐘。
緩衝劑A：含5 mM TBuAA，pH 7之90% H 2O/10%乙腈
緩衝液B：含5 mM TBuAA，pH 7之20% H 2O/80%乙腈
結論 ：概念驗證引子延伸聚合酶可用於進行缺口填充以形成含有N1-甲基假尿苷之序列。聚合酶及串聯連接產生21.64%面積之產物形成。
實例 24 ：來 自 895-bp 2'H 寡核苷酸模板上之 26bp 2'OH 寡核苷酸 3' 阻斷子 之間的 16bp 2'OH 寡核苷酸引子缺口填充的 850bp 2'OH PS 修飾之寡核苷酸合成及製造 892bp 產物的連接 目標 ：展現使用經修飾之核苷三磷酸在RNA寡核苷酸片段(引子)及RNA寡核苷酸片段(阻斷子)之間進行缺口填充，以顯示該技術在寡核苷酸治療劑中常見之主鏈修飾的應用。
寡核苷酸( SEQ ID NO: 51 、 76 及 101)係獲自市售來源。引子延伸聚合酶( SEQ ID NO: 95)係獲自市售來源且直接使用。雙股連接酶( SEQ ID NO: 45)係獲自市售來源且直接使用。
反應根據表47設定。反應內所含有之寡核苷酸藉由加熱至95℃且以0.1℃/秒冷卻至15℃黏接。隨後添加RNA酶抑制劑。接著，隨後添加聚合酶及連接酶以開始反應。反應在25℃下培育16小時。其後添加1 μL DNA水解酶1，且將反應在25℃下進一步培育2小時。隨後藉由添加4 µL 10 mM EDTA淬滅反應，隨後藉由凝膠電泳分析反應中 SEQ ID NO: 108之存在。隨後藉由HPLC分析反應中 SEQ ID NO: 101之存在。 表47.
   反應中之最終濃度 (mM) 每次反應的體積 (µL)
聚合酶- SEQ ID NO: 95    0.25
連接酶- SEQ ID NO: 45    0.12
RNA酶抑制劑    0.12
模板-900聚體：(2'H) - SEQ ID NO: 76 0.001 1.25
5'引子N+6 (2'OH) - SEQ ID NO: 51 0.001 0.05
3'阻斷子6 (2'OH) - SEQ ID NO: 101 0.001 0.05
ATPαS 0.2 0.0125
CTPαS 0.2 0.0125
GTPαS 0.2 0.0125
UTPαS 0.2 0.0125
Tris (pH 7.5) 50 0.12
MgCl 2 10 0.25
KCl 50 0.06
水    0.16
最終反應體積 (µL)    2.5
反應之結果： 表48.
基因名稱 SED ID NO: 轉化為產物之轉化率 (%) *
突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V8」 95 4.95
*轉化為產物之轉化率(%) -反應 SEQ ID NO: 101峰對比陰性對照 SEQ ID NO: 101峰在波長260 nm處之面積%
HPLC分析使用Waters XBridge Peptide BEH C18管柱(300 Å，3.5 µm，2.1 mm×150 mm)進行，以0.5 ml/min運行同時在260 nm下監測吸光度。將管柱維持在50℃。注入5 µl樣品且歷經25分鐘運行40-95%梯度之緩衝液B，之後降至40%緩衝液B，持續4分鐘。
緩衝劑A：含5 mM TBuAA，pH 7之90% H 2O/10%乙腈
緩衝液B：含5 mM TBuAA，pH 7之20% H 2O/80%乙腈
結論 ：概念驗證引子延伸聚合酶可用於進行缺口填充以形成硫代磷酸酯修飾序列。聚合酶及串聯連接產生21.64%面積之產物形成。
總體結論本發明人已展示，可藉由在互補模板上組裝聚核苷酸或寡核苷酸片段，使用聚合酶延伸片段以填充缺口且將該等片段連接在一起，且在可擴展且適用於大規模治療性聚核苷酸及寡核苷酸製造之有效方法中自雜質及其互補模板分離產物聚核苷酸或寡核苷酸來合成聚核苷酸或寡核苷酸，包括具有各種治療相關修飾之聚核苷酸或寡核苷酸。
在使用核酸(例如DNA或RNA)之固有特性來特異性識別互補序列且以反映互補序列之保真度及互補序列之長度兩者的親和力結合互補序列，本發明人已能夠在無需層析之情況下生製造高純度聚核苷酸及寡核苷酸，其既提高製造方法之效率，又提高該方法之可擴展性。藉由在分離製程期間以不變狀態回收模板，本發明人能夠再使用模板進行更多輪合成且因此避免必須為所形成之每一當量產物寡核苷酸製造一個當量模板的經濟後果。在一些實施例中，亦有可能在溶液中合成寡核苷酸，避免由固相方法強加之放大限制。
最後，儘管野生型聚合酶係有效的，但聚合酶之修飾(產生突變型或經工程改造之聚合酶)可用於提高效率、模板回收或併入經修飾之核苷酸。類似地，儘管野生型連接酶係有效的，但在連接酶之適當突變及進化下，連接效率可增加且經適當修飾之連接酶為用於合成含有多種修飾之寡核苷酸的有效催化劑。 序列表
SEQ ID NO: 序列識別符
1 /5Biosg/GCTAATGGCTTTGGTGCGAAGCAGACTGAGGCACCGAGGAGT - 「模板」
2 ACTCCTCGGT - 「5'引子N」
3 /5phos/AGTCTGCTTCGCACCAAAGCCATTAGC - 「3'阻斷子1」
4 /5phos/GTCTGCTTCGCACCAAAGCCATTAGC - 「3'阻斷子2」
5 /5Phos/GCACCAAAGC/Me-dC/ATTAGC - 「3'阻斷子3」
6 /5Phos/GC/Me-dC/ATTAGC - 「3'阻斷子4」
7 ACTCCTCGGTG - 「引子N+1」
8 ACTCCTCGGTGC - 「引子N+2」
9 ACTCCTCGGTGCC - 「引子N+3」
10 ACTCCTCGGTGCCT - 「引子N+4」
11 ACTCCTCGGTGCCTC - 「引子N+5」
12 ACTCCTCGGTGCCTCA - 「引子N+6」
13 ACTCCTCGGTGCCTCAG - 「引子N+7」
14 ACTCCTCGGTGCCTCAGT - 「引子N+8」
15 ACTCCTCGGTGCCTCAGTC - 「引子N+9」
16 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCT - 「引子N+10」
17 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTG - 「引子N+11」
18 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGC - 「引子N+12」
19 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCT - 「引子N+13」
20 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTT - 「引子N+14」
21 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTC - 「引子N+15」
22 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCG - 「引子N+16」
23 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGC - 「引子N+17」
24 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGCA - 「引子N+18」
25 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGCAC - 「引子N+19」
26 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGCACC - 「引子N+20」
27 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGCACCA - 「引子N+21」
28 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGCACCAA - 「引子N+22」
29 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGCACCAAA - 「引子N+23」
30 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGCACCAAAG - 「引子N+24」
31 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGCACCAAAGC - 「引子N+25」
32 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGCACCAAAGCC - 「引子N+26」
33 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGCACCAAAGCCA - 「引子N+27」
34 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGCACCAAAGCCAT - 「引子N+28」
35 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGCACCAAAGCCATT - 「引子N+29」
36 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGCACCAAAGCCATTA - 「引子N+30」
37 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGCACCAAAGCCATTAG - 「引子N+31」
38 ACTCCTCGGTGCCTCAGTCTGCTTCGCACCAAAGCCATTAGC - 「引子N+32」
39 野生型埃希氏菌噬菌體T7聚合酶-「Pol1」
40 野生型硫磺礦硫化葉菌聚合酶-「Pol2」
41 突變型噬熱球菌(菌株9oN-7)聚合酶-「Pol3」
42 野生型腸桿菌噬菌體T4聚合酶-「Pol4」
43 野生型水生棲熱菌聚合酶-「Pol5」
44 野生型科達卡熱球菌聚合酶-「Pol6」
45 野生型 腸桿菌噬菌體 T3 連接酶 - 「 Lig1 」
46 /5Biosg/GCTAATGGCTTTGGTGCGAAGCAGACTGAGGCACCGAGGAGT*T*T*T- 「模板XXL」
47 CTAATGGCTTTGGTGCGAAGCAGACCTGATGACTGAGGCACCGAGGAGT*T*T*T*T- 「模板NoRXL」
48 C*T*A*A*T*GGCTTTGGTGCGAAGCAGACCTCTTCACCTTTGCTCACCATTTGTAGTCCATCGGATATATCTCCTTCGGATCCTGAGGCACCGAGGAG*T*T*T*T*T - 「模板-100聚體」
49 ACTCCfUfCfGfGfU - 「5'引子N_2'F」
50 ACTCCTCGGTGCCTCA - 「5'引子N+6_2'H」
51 rArCrUrCrCrUrCrGrGrUrGrCrCrUrCrA - 「5'引子N+6_2'OH」
52 mAmCmUmCmCmUmCmGmGmUmGmCmCmUmCmA - 「5'引子N+6_2'OMe」
53 mAmCmUmCmCmUmCmGmGmUmGmCmCrUrCrA - 「5'引子N+6_2'OMe+r」
54 GTCTGCTTCGCACCAAAGCCATTAGC - 「3'阻斷子5」
55 ACTCCTCGGTGCCTCAGGATCCGAAGGAGATATATCCGATGGACTACAAATGGTGAGCAAAGGTGAAGAG - 「引子N+60」
56 野生型嗜熱球菌聚合酶-「9n」
57 突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V2」
58 突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V16」
59 突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V9」
60 突變型嗜熱球菌聚合酶-「9n-V5」
61 突變型嗜熱球菌聚合酶-「9n-V1」
62 突變型科達卡熱球菌聚合酶-「Kod-V1」
63 突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V3」
64 野生型海濱嗜熱球菌聚合酶-「Vent」
65 突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V2」
66 突變型嗜熱球菌聚合酶-「9n-V2」
67 突變型科達卡熱球菌聚合酶-「Kod-V2」
68 突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V4」
69 突變型海濱嗜熱球菌聚合酶-「Vent-V1」
70 突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V10」
71 突變型嗜熱球菌聚合酶-「9n-V3」
72 突變型科達卡熱球菌聚合酶-「Kod-V3」
73 突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V5」
74 突變型海濱嗜熱球菌聚合酶-「Vent-V2」
75 突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V3」
76 CTAATGGCTTTGGTGCGAAGCAGACTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCTCGAGTTACTTATACAGTTCATCCATACCACCGGTACTATGGCGACCTTCTGCACGTTCATACTGTTCAACAATGGTATAATCCTCGTTGTGGCTGGTGATATCCAGTTTGATATTAACATTATATGCACCAGGCAGCTGAACCGGCTTTTTGGCTTTGTAGGTGGTTTTAACTTCTGCATCATAATGACCGCCATCTTTCAGCTTCAGACGCTGTTTAATTTCACCTTTCAGTGCGCCATCTTCCGGATACATACGTTCGCTGCTTGCTTCCCAACCCATGGTCTTTTTCTGCATAACCGGACCATCACTCGGAAAATTCGTGCCACGCAGTTTAACTTTATAGATAAATTCACCATCCTGCAGGCTGCTATCCTGTGTAACGGTAACAACACCACCATCTTCAAAATTCATCACACGTTCCCATTTAAAACCTTCCGGAAAGCTCAGTTTCAGATAATCCGGGATATCTGCCGGATGTTTAACATAGGCTTTGCTACCATACATAAACTGCGGACTCAGAATATCCCATGCAAACGGCAGCGGACCACCTTTGGTAACTTTCAGTTTTGCGGTCTGGGTGCCTTCATACGGACGACCTTCGCCTTCACCTTCAATTTCAAATTCGTGGCCATTAACGCTACCTTCCATATGAACTTTGAAGCGCATGAATTCTTTGATGATGGCCATATTATCCTCTTCACCTTTGCTCACCATGCTAGCCATATGGCTGCCGCGCGGCACCAGGCCGCTGCTGTGATGATGATGATGATGGCTGCTGCCCATTGAGGCACCGAGGAGTTTTT - 「模板-900聚體」
77 突變型嗜熱球菌聚合酶-「9n-V4」
78 突變型科達卡熱球菌聚合酶-「Kod-V5」
79 突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V6」
80 突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V4」
81 突變型嗜熱球菌聚合酶-「9n-V7」
82 野生型激烈熱球菌聚合酶- Pfu
83 突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V9」
84 突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V5」
85 突變型嗜熱球菌聚合酶-「9n-V8」
86 野生型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo」
87 突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V12」
88 突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V8」
89 突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V6」
90 突變型嗜熱球菌聚合酶-「9n-V9」
91 突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V1」
92 突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V14」
93 突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V1」
94 突變型水生棲熱菌聚合酶-「KT-V7」
95 突變型柳珊瑚熱球菌聚合酶-「Tgo-V8」
96 /5Biosg/GCA CTT CGC TTC ACC TCT CTG C*T*T* T - 「模板H」
97 eGeCeAeGeAeGeAGG - 「縮短子1 (2'MOE)」
98 /5phos/GAeAeGeTeGeC - 「縮短子3 (2'MOE)」
99 eGeCeAeGeAeGeAGGTGAAGCGAeAeGeTeGeC - 「產物(2'MOE)」
100 eGeCeAeGeAeGeAGGTGAAGC - 「縮短子1+2 (2'MOE)」
101 /5Phos/rGrU rCrUrG rCrUrU rCrGrC rArCrC rArArA rGrCrC mA*mU*mU* mA*mG*mC - 「3'阻斷子6」
102 rArCrUrCrCrUrCrGrGrUrGrCrCrUrCrArArUrGrGrGrCrArGrCrArGrCrCrArUrCrArUrCrArUrCrArUrCrArUrCrArCrArGrCrArGrCrGrGrCrCrUrGrGrUrGrCrCrGrCrGrCrGrGrCrArGrCrCrArUrArUrGrGrCrUrArGrCrArUrGrGrUrGrArGrCrArArArGrGrUrGrArArGrArGrGrArUrArArUrArUrGrGrCrCrArUrCrArUrCrArArArGrArArUrUrCrArUrGrCrGrCrUrUrCrArArArGrUrUrCrArUrArUrGrGrArArGrGrUrArGrCrGrUrUrArArUrGrGrCrCrArCrGrArArUrUrUrGrArArArUrUrGrArArGrGrUrGrArArGrGrCrGrArArGrGrUrCrGrUrCrCrGrUrArUrGrArArGrGrCrArCrCrCrArGrArCrCrGrCrArArArArCrUrGrArArArGrUrUrArCrCrArArArGrGrUrGrGrUrCrCrGrCrUrGrCrCrGrUrUrUrGrCrArUrGrGrGrArUrArUrUrCrUrGrArGrUrCrCrGrCrArGrUrUrUrArUrGrUrArUrGrGrUrArGrCrArArArGrCrCrUrArUrGrUrUrArArArCrArUrCrCrGrGrCrArGrArUrArUrCrCrCrGrGrArUrUrArUrCrUrGrArArArCrUrGrArGrCrUrUrUrCrCrGrGrArArGrGrUrUrUrUrArArArUrGrGrGrArArCrGrUrGrUrGrArUrGrArArUrUrUrUrGrArArGrArUrGrGrUrGrGrUrGrUrUrGrUrUrArCrCrGrUrUrArCrArCrArGrGrArUrArGrCrArGrCrCrUrGrCrArGrGrArUrGrGrUrGrArArUrUrUrArUrCrUrArUrArArArGrUrUrArArArCrUrGrCrGrUrGrGrCrArCrGrArArUrUrUrUrCrCrGrArGrUrGrArUrGrGrUrCrCrGrGrUrUrArUrGrCrArGrArArArArArGrArCrCrArUrGrGrGrUrUrGrGrGrArArGrCrArArGrCrArGrCrGrArArCrGrUrArUrGrUrArUrCrCrGrGrArArGrArUrGrGrCrGrCrArCrUrGrArArArGrGrUrGrArArArUrUrArArArCrArGrCrGrUrCrUrGrArArGrCrUrGrArArArGrArUrGrGrCrGrGrUrCrArUrUrArUrGrArUrGrCrArGrArArGrUrUrArArArArCrCrArCrCrUrArCrArArArGrCrCrArArArArArGrCrCrGrGrUrUrCrArGrCrUrGrCrCrUrGrGrUrGrCrArUrArUrArArUrGrUrUrArArUrArUrCrArArArCrUrGrGrArUrArUrCrArCrCrArGrCrCrArCrArArCrGrArGrGrArUrUrArUrArCrCrArUrUrGrUrUrGrArArCrArGrUrArUrGrArArCrGrUrGrCrArGrArArGrGrUrCrGrCrCrArUrArGrUrArCrCrGrGrUrGrGrUrArUrGrGrArUrGrArArCrUrGrUrArUrArArGrUrArArCrUrCrGrArGrArGrArUrCrCrGrGrCrUrGrCrUrArArCrArArArGrCrCrCrGrArArArGrGrArArGrCrUrGrArGrUrUrGrGrCrUrGrCrUrGrCrCrArCrCrGrCrUrGrArGrCrArArUrArArGrUrCrUrGrCrUrUrCrGrCrArCrCrArArArGrCrCmA*mU*mU*mA*mG*mC - 「產物-892聚體1」
103 mAmCmUmCmCmUmCmGmGmUmGmCmCrUrCrArArUrGrGrGrCrArGrCrArGrCrCrArUrCrArUrCrArUrCrArUrCrArUrCrArCrArGrCrArGrCrGrGrCrCrUrGrGrUrGrCrCrGrCrGrCrGrGrCrArGrCrCrArUrArUrGrGrCrUrArGrCrArUrGrGrUrGrArGrCrArArArGrGrUrGrArArGrArGrGrArUrArArUrArUrGrGrCrCrArUrCrArUrCrArArArGrArArUrUrCrArUrGrCrGrCrUrUrCrArArArGrUrUrCrArUrArUrGrGrArArGrGrUrArGrCrGrUrUrArArUrGrGrCrCrArCrGrArArUrUrUrGrArArArUrUrGrArArGrGrUrGrArArGrGrCrGrArArGrGrUrCrGrUrCrCrGrUrArUrGrArArGrGrCrArCrCrCrArGrArCrCrGrCrArArArArCrUrGrArArArGrUrUrArCrCrArArArGrGrUrGrGrUrCrCrGrCrUrGrCrCrGrUrUrUrGrCrArUrGrGrGrArUrArUrUrCrUrGrArGrUrCrCrGrCrArGrUrUrUrArUrGrUrArUrGrGrUrArGrCrArArArGrCrCrUrArUrGrUrUrArArArCrArUrCrCrGrGrCrArGrArUrArUrCrCrCrGrGrArUrUrArUrCrUrGrArArArCrUrGrArGrCrUrUrUrCrCrGrGrArArGrGrUrUrUrUrArArArUrGrGrGrArArCrGrUrGrUrGrArUrGrArArUrUrUrUrGrArArGrArUrGrGrUrGrGrUrGrUrUrGrUrUrArCrCrGrUrUrArCrArCrArGrGrArUrArGrCrArGrCrCrUrGrCrArGrGrArUrGrGrUrGrArArUrUrUrArUrCrUrArUrArArArGrUrUrArArArCrUrGrCrGrUrGrGrCrArCrGrArArUrUrUrUrCrCrGrArGrUrGrArUrGrGrUrCrCrGrGrUrUrArUrGrCrArGrArArArArArGrArCrCrArUrGrGrGrUrUrGrGrGrArArGrCrArArGrCrArGrCrGrArArCrGrUrArUrGrUrArUrCrCrGrGrArArGrArUrGrGrCrGrCrArCrUrGrArArArGrGrUrGrArArArUrUrArArArCrArGrCrGrUrCrUrGrArArGrCrUrGrArArArGrArUrGrGrCrGrGrUrCrArUrUrArUrGrArUrGrCrArGrArArGrUrUrArArArArCrCrArCrCrUrArCrArArArGrCrCrArArArArArGrCrCrGrGrUrUrCrArGrCrUrGrCrCrUrGrGrUrGrCrArUrArUrArArUrGrUrUrArArUrArUrCrArArArCrUrGrGrArUrArUrCrArCrCrArGrCrCrArCrArArCrGrArGrGrArUrUrArUrArCrCrArUrUrGrUrUrGrArArCrArGrUrArUrGrArArCrGrUrGrCrArGrArArGrGrUrCrGrCrCrArUrArGrUrArCrCrGrGrUrGrGrUrArUrGrGrArUrGrArArCrUrGrUrArUrArArGrUrArArCrUrCrGrArGrArGrArUrCrCrGrGrCrUrGrCrUrArArCrArArArGrCrCrCrGrArArArGrGrArArGrCrUrGrArGrUrUrGrGrCrUrGrCrUrGrCrCrArCrCrGrCrUrGrArGrCrArArUrArArGrUrCrUrGrCrUrUrCrGrCrArCrCrArArArGrCrCmA*mU*mU*mA*mG*mC -「產物-892聚體2」
104 rA*rC*rU*rC*rC*rU*rC*rG*rG*rU*rG*rC*rC*rU*rC*rA - 「5'引子N+6_2'OH_PS」
105 rA*rC*rU*rC*rC*rU*rC*rG*rG*rU*rG*rC*rC*rU*rC*rArArUrGrGrGrCrArGrCrArGrCrCrArUrCrArUrCrArUrCrArUrCrArUrCrArCrArGrCrArGrCrGrGrCrCrUrGrGrUrGrCrCrGrCrGrCrGrGrCrArGrCrCrArUrArUrGrGrCrUrArGrCrArUrGrGrUrGrArGrCrArArArGrGrUrGrArArGrArGrGrArUrArArUrArUrGrGrCrCrArUrCrArUrCrArArArGrArArUrUrCrArUrGrCrGrCrUrUrCrArArArGrUrUrCrArUrArUrGrGrArArGrGrUrArGrCrGrUrUrArArUrGrGrCrCrArCrGrArArUrUrUrGrArArArUrUrGrArArGrGrUrGrArArGrGrCrGrArArGrGrUrCrGrUrCrCrGrUrArUrGrArArGrGrCrArCrCrCrArGrArCrCrGrCrArArArArCrUrGrArArArGrUrUrArCrCrArArArGrGrUrGrGrUrCrCrGrCrUrGrCrCrGrUrUrUrGrCrArUrGrGrGrArUrArUrUrCrUrGrArGrUrCrCrGrCrArGrUrUrUrArUrGrUrArUrGrGrUrArGrCrArArArGrCrCrUrArUrGrUrUrArArArCrArUrCrCrGrGrCrArGrArUrArUrCrCrCrGrGrArUrUrArUrCrUrGrArArArCrUrGrArGrCrUrUrUrCrCrGrGrArArGrGrUrUrUrUrArArArUrGrGrGrArArCrGrUrGrUrGrArUrGrArArUrUrUrUrGrArArGrArUrGrGrUrGrGrUrGrUrUrGrUrUrArCrCrGrUrUrArCrArCrArGrGrArUrArGrCrArGrCrCrUrGrCrArGrGrArUrGrGrUrGrArArUrUrUrArUrCrUrArUrArArArGrUrUrArArArCrUrGrCrGrUrGrGrCrArCrGrArArUrUrUrUrCrCrGrArGrUrGrArUrGrGrUrCrCrGrGrUrUrArUrGrCrArGrArArArArArGrArCrCrArUrGrGrGrUrUrGrGrGrArArGrCrArArGrCrArGrCrGrArArCrGrUrArUrGrUrArUrCrCrGrGrArArGrArUrGrGrCrGrCrArCrUrGrArArArGrGrUrGrArArArUrUrArArArCrArGrCrGrUrCrUrGrArArGrCrUrGrArArArGrArUrGrGrCrGrGrUrCrArUrUrArUrGrArUrGrCrArGrArArGrUrUrArArArArCrCrArCrCrUrArCrArArArGrCrCrArArArArArGrCrCrGrGrUrUrCrArGrCrUrGrCrCrUrGrGrUrGrCrArUrArUrArArUrGrUrUrArArUrArUrCrArArArCrUrGrGrArUrArUrCrArCrCrArGrCrCrArCrArArCrGrArGrGrArUrUrArUrArCrCrArUrUrGrUrUrGrArArCrArGrUrArUrGrArArCrGrUrGrCrArGrArArGrGrUrCrGrCrCrArUrArGrUrArCrCrGrGrUrGrGrUrArUrGrGrArUrGrArArCrUrGrUrArUrArArGrUrArArCrUrCrGrArGrArGrArUrCrCrGrGrCrUrGrCrUrArArCrArArArGrCrCrCrGrArArArGrGrArArGrCrUrGrArGrUrUrGrGrCrUrGrCrUrGrCrCrArCrCrGrCrUrGrArGrCrArArUrArArGrUrCrUrGrCrUrUrCrGrCrArCrCrArArArGrCrCmA*mU*mU*mA*mG*mC -「產物-892聚體3」
106 rArCrUrCrCrUrCrGrGrUrGrCrCrUrCrArAΨrGrGrGrCrArGrCrArGrCrCrAΨrCrAΨrCrAΨrCrAΨrCrAΨrCrArCrArGrCrArGrCrGrGrCrCΨrGrGΨrGrCrCrGrCrGrCrGrGrCrArGrCrCrAΨrAΨrGrGrCΨrArGrCrAΨrGrGΨrGrArGrCrArArArGrGΨrGrArArGrArGrGrAΨrArAΨrAΨrGrGrCrCrAΨrCrAΨrCrArArArGrArAΨΨrCrAΨrGrCrGrCΨΨrCrArArArGΨΨrCrAΨrAΨrGrGrArArGrGΨrArGrCrGΨΨrArAΨrGrGrCrCrArCrGrArAΨΨΨrGrArArAΨΨrGrArArGrGΨrGrArArGrGrCrGrArArGrGΨrCrGΨrCrCrGΨrAΨrGrArArGrGrCrArCrCrCrArGrArCrCrGrCrArArArArCΨrGrArArArGΨΨrArCrCrArArArGrGΨrGrGΨrCrCrGrCΨrGrCrCrGΨΨΨrGrCrAΨrGrGrGrAΨrAΨΨrCΨrGrArGΨrCrCrGrCrArGΨΨΨrAΨrGΨrAΨrGrGΨrArGrCrArArArGrCrCΨrAΨrGΨΨrArArArCrAΨrCrCrGrGrCrArGrAΨrAΨrCrCrCrGrGrAΨΨrAΨrCΨrGrArArArCΨrGrArGrCΨΨΨrCrCrGrGrArArGrGΨΨΨΨrArArAΨrGrGrGrArArCrGΨrGΨrGrAΨrGrArAΨΨΨΨrGrArArGrAΨrGrGΨrGrGΨrGΨΨrGΨΨrArCrCrGΨΨrArCrArCrArGrGrAΨrArGrCrArGrCrCΨrGrCrArGrGrAΨrGrGΨrGrArAΨΨΨrAΨrCΨrAΨrArArArGΨΨrArArArCΨrGrCrGΨrGrGrCrArCrGrArAΨΨΨΨrCrCrGrArGΨrGrAΨrGrGΨrCrCrGrGΨΨrAΨrGrCrArGrArArArArArGrArCrCrAΨrGrGrGΨΨrGrGrGrArArGrCrArArGrCrArGrCrGrArArCrGΨrAΨrGΨrAΨrCrCrGrGrArArGrAΨrGrGrCrGrCrArCΨrGrArArArGrGΨrGrArArAΨΨrArArArCrArGrCrGΨrCΨrGrArArGrCΨrGrArArArGrAΨrGrGrCrGrGΨrCrAΨΨrAΨrGrAΨrGrCrArGrArArGΨΨrArArArArCrCrArCrCΨrArCrArArArGrCrCrArArArArArGrCrCrGrGΨΨrCrArGrCΨrGrCrCΨrGrGΨrGrCrAΨrAΨrArAΨrGΨΨrArAΨrAΨrCrArArArCΨrGrGrAΨrAΨrCrArCrCrArGrCrCrArCrArArCrGrArGrGrAΨΨrAΨrArCrCrAΨΨrGΨΨrGrArArCrArGΨrAΨrGrArArCrGΨrGrCrArGrArArGrGΨrCrGrCrCrAΨrArGΨrArCrCrGrGΨrGrGΨrAΨrGrGrAΨrGrArArCΨrGΨrAΨrArArGΨrArArCΨrCrGrArGrArGrAΨrCrCrGrGrCΨrGrCΨrArArCrArArArGrCrCrCrGrArArArGrGrArArGrCΨrGrArGΨΨrGrGrCΨrGrCΨrGrCrCrArCrCrGrCΨrGrArGrCrArAΨrArArGrUrCrUrGrCrUrUrCrGrCrArCrCrArArArGrCrCmA*mU*mU*mA*mG*mC - 「產物-892聚體4」
107 rArCrUrCrCrUrCrGrGrUrGrCrCrUrCrArAm1ΨrGrGrGrCrArGrCrArGrCrCrAm1ΨrCrAm1ΨrCrAm1ΨrCrAm1ΨrCrAm1ΨrCrArCrArGrCrArGrCrGrGrCrCm1ΨrGrGm1ΨrGrCrCrGrCrGrCrGrGrCrArGrCrCrAm1ΨrAm1ΨrGrGrCm1ΨrArGrCrAm1ΨrGrGm1ΨrGrArGrCrArArArGrGm1ΨrGrArArGrArGrGrAm1ΨrArAm1ΨrAm1ΨrGrGrCrCrAm1ΨrCrAm1ΨrCrArArArGrArAm1Ψm1ΨrCrAm1ΨrGrCrGrCm1Ψm1ΨrCrArArArGm1Ψm1ΨrCrAm1ΨrAm1ΨrGrGrArArGrGm1ΨrArGrCrGm1Ψm1ΨrArAm1ΨrGrGrCrCrArCrGrArAm1Ψm1Ψm1ΨrGrArArAm1Ψm1ΨrGrArArGrGm1ΨrGrArArGrGrCrGrArArGrGm1ΨrCrGm1ΨrCrCrGm1ΨrAm1ΨrGrArArGrGrCrArCrCrCrArGrArCrCrGrCrArArArArCm1ΨrGrArArArGm1Ψm1ΨrArCrCrArArArGrGm1ΨrGrGm1ΨrCrCrGrCm1ΨrGrCrCrGm1Ψm1Ψm1ΨrGrCrAm1ΨrGrGrGrAm1ΨrAm1Ψm1ΨrCm1ΨrGrArGm1ΨrCrCrGrCrArGm1Ψm1Ψm1ΨrAm1ΨrGm1ΨrAm1ΨrGrGm1ΨrArGrCrArArArGrCrCm1ΨrAm1ΨrGm1Ψm1ΨrArArArCrAm1ΨrCrCrGrGrCrArGrAm1ΨrAm1ΨrCrCrCrGrGrAm1Ψm1ΨrAm1ΨrCm1ΨrGrArArArCm1ΨrGrArGrCm1Ψm1Ψm1ΨrCrCrGrGrArArGrGm1Ψm1Ψm1Ψm1ΨrArArAm1ΨrGrGrGrArArCrGm1ΨrGm1ΨrGrAm1ΨrGrArAm1Ψm1Ψm1Ψm1ΨrGrArArGrAm1ΨrGrGm1ΨrGrGm1ΨrGm1Ψm1ΨrGm1Ψm1ΨrArCrCrGm1Ψm1ΨrArCrArCrArGrGrAm1ΨrArGrCrArGrCrCm1ΨrGrCrArGrGrAm1ΨrGrGm1ΨrGrArAm1Ψm1Ψm1ΨrAm1ΨrCm1ΨrAm1ΨrArArArGm1Ψm1ΨrArArArCm1ΨrGrCrGm1ΨrGrGrCrArCrGrArAm1Ψm1Ψm1Ψm1ΨrCrCrGrArGm1ΨrGrAm1ΨrGrGm1ΨrCrCrGrGm1Ψm1ΨrAm1ΨrGrCrArGrArArArArArGrArCrCrAm1ΨrGrGrGm1Ψm1ΨrGrGrGrArArGrCrArArGrCrArGrCrGrArArCrGm1ΨrAm1ΨrGm1ΨrAm1ΨrCrCrGrGrArArGrAm1ΨrGrGrCrGrCrArCm1ΨrGrArArArGrGm1ΨrGrArArAm1Ψm1ΨrArArArCrArGrCrGm1ΨrCm1ΨrGrArArGrCm1ΨrGrArArArGrAm1ΨrGrGrCrGrGm1ΨrCrAm1Ψm1ΨrAm1ΨrGrAm1ΨrGrCrArGrArArGm1Ψm1ΨrArArArArCrCrArCrCm1ΨrArCrArArArGrCrCrArArArArArGrCrCrGrGm1Ψm1ΨrCrArGrCm1ΨrGrCrCm1ΨrGrGm1ΨrGrCrAm1ΨrAm1ΨrArAm1ΨrGm1Ψm1ΨrArAm1ΨrAm1ΨrCrArArArCm1ΨrGrGrAm1ΨrAm1ΨrCrArCrCrArGrCrCrArCrArArCrGrArGrGrAm1Ψm1ΨrAm1ΨrArCrCrAm1Ψm1ΨrGm1Ψm1ΨrGrArArCrArGm1ΨrAm1ΨrGrArArCrGm1ΨrGrCrArGrArArGrGm1ΨrCrGrCrCrAm1ΨrArGm1ΨrArCrCrGrGm1ΨrGrGm1ΨrAm1ΨrGrGrAm1ΨrGrArArCm1ΨrGm1ΨrAm1ΨrArArGm1ΨrArArCm1ΨrCrGrArGrArGrAm1ΨrCrCrGrGrCm1ΨrGrCm1ΨrArArCrArArArGrCrCrCrGrArArArGrGrArArGrCm1ΨrGrArGm1Ψm1ΨrGrGrCm1ΨrGrCm1ΨrGrCrCrArCrCrGrCm1ΨrGrArGrCrArAm1ΨrArArGrUrCrUrGrCrUrUrCrGrCrArCrCrArArArGrCrCmA*mU*mU*mA*mG*mC - 「產物-892聚體5」
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圖1為顯示使用聚合酶製造寡核苷酸或聚核苷酸產物之示意性實例，其包括連接片段寡核苷酸或聚核苷酸以形成產物及改變條件以移除雜質的步驟。
圖2為多個模板組態之示意性實例。
圖3a繪示顯示缺口填充反應起始材料，即模板及兩個片段寡核苷酸(用作聚合酶之引子的引子N及用作終止子(stopper)之3'阻斷子(3'block) 1)之HPLC跡線。
圖3b繪示顯示在缺口填充反應之後產物形成的HPLC跡線。引子N+5指示使用聚合酶及核苷三磷酸填充5 bp缺口而成功延伸引子N。
圖4為分別顯示具有經黏接之5'引子之模板及具有用作5'引子之髮夾環之模板的示意性實例。
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Claims (15)

  1. 一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之單股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)使包含與該單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸與至少兩個片段聚核苷酸之池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接(annealing)之條件下接觸，以產生其上黏接(annealed)該等至少兩個片段聚核苷酸的模板聚核苷酸，其中至少一個序列缺口(gap)形成於該等至少兩個黏接片段聚核苷酸之間； b)使用核苷三磷酸池及聚合酶延伸該等黏接片段聚核苷酸中之至少一者，以填充於該至少一個序列缺口中以產生至少一個延伸片段聚核苷酸； c)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成該單股聚核苷酸產物結合於該模板聚核苷酸之雙螺旋體；及 d)改變該等條件以使包含該單股聚核苷酸產物及該模板聚核苷酸之雙螺旋體變性，藉此製造該單股聚核苷酸產物。
  2. 如請求項1之方法，其中步驟d)進一步包含改變該等條件以使包含雜質(impurity)聚核苷酸及模板聚核苷酸之雙螺旋體變性，且在改變該等條件以使包含該單股聚核苷酸產物及該模板聚核苷酸之雙螺旋體變性之前分離任何雜質聚核苷酸。
  3. 如請求項1或請求項2之方法，其進一步包含分離該單股聚核苷酸產物。
  4. 如請求項1或2之方法，其中至少一個片段聚核苷酸包含至少一個經修飾之核苷酸殘基。
  5. 如請求項1或2之方法，其中至少一個片段聚核苷酸包含5'磷酸酯、5'硫代磷酸酯、5'二硫代磷酸酯或5'甲基磷酸酯，視情況其中在該序列缺口之3'端該片段聚核苷酸包含5'磷酸酯、5'硫代磷酸酯、5'二硫代磷酸酯或5'甲基磷酸酯。
  6. 如請求項1或2之方法，其中該核苷三磷酸池由以下組成：(i)天然存在之核苷三磷酸；(ii)經修飾之核苷三磷酸，或(iii)天然存在之核苷三磷酸及經修飾之核苷三磷酸。
  7. 如請求項1或2之方法，其中該至少一個經修飾之核苷酸包含糖部分之修飾、核鹼基之修飾及/或主鏈之修飾，視情況其中該至少一個經修飾之核苷酸為N1-甲基-假尿苷。
  8. 如請求項1或2之方法，其中該連接酶將該片段聚核苷酸或該延伸片段聚核苷酸之3'端及/或5'端連接至相鄰片段聚核苷酸或相鄰延伸片段聚核苷酸以形成該單股聚核苷酸產物。
  9. 如請求項1或2之方法，其中步驟(c)中之該連接酶能夠將兩個寡核苷酸連接在一起，其中欲連接之接合核苷酸中之一或兩者為經修飾之核苷酸。
  10. 如請求項1或2之方法，其中該模板具有允許其與該單股聚核苷酸產物分離之特性。
  11. 如請求項1或2之方法，其中該方法另外包含再循環該模板聚核苷酸之步驟。
  12. 如請求項1或2之方法，其中該模板聚核苷酸為再循環模板聚核苷酸。
  13. 如請求項1或2之方法，其中該方法為半連續或連續的。
  14. 一種用於製造雙股聚核苷酸產物之方法，該方法包含使兩個互補單股聚核苷酸產物黏接，其中之至少一者已藉由如前述請求項中任一項之方法製造，視情況其中兩者均已藉由如前述請求項中任一項之方法製造。
  15. 一種用於製造具有至少一個經修飾之核苷酸殘基之雙股聚核苷酸產物的方法，該方法包含： a)使包含與單股聚核苷酸產物互補之序列的模板聚核苷酸與至少兩個片段聚核苷酸之池在允許該等至少兩個片段聚核苷酸與該模板聚核苷酸黏接之條件下接觸，以產生其上黏接該等至少兩個片段聚核苷酸的模板聚核苷酸，其中至少一個序列缺口形成於該等至少兩個黏接片段聚核苷酸之間； b)使用核苷三磷酸池及聚合酶延伸該等黏接片段聚核苷酸中之至少一者，以填充於該至少一個序列缺口中以產生至少一個延伸片段聚核苷酸； c)使用連接酶連接片段聚核苷酸及/或延伸片段聚核苷酸以形成該單股聚核苷酸產物結合於該模板聚核苷酸之雙螺旋體； d)改變該等條件以使包含該單股聚核苷酸產物及該模板聚核苷酸之雙螺旋體變性，藉此製造該單股聚核苷酸產物；及 e)使用該單股聚核苷酸產物作為步驟a)中之該模板聚核苷酸且重複步驟a)至c)以製造該雙股聚核苷酸產物。
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