CN1194270A

CN1194270A - 修饰的引物

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Publication number: CN1194270A
Application number: CN98105627A
Authority: CN
Inventors: 斯蒂芬·G·威尔; 杨国英
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1997-03-20
Filing date: 1998-03-19
Publication date: 1998-09-30
Anticipated expiration: 2018-03-19
Also published as: PL325439A1; BR9801878A; UA49843C2; EP0866071A2; IL123694A0; BR9801878B1; AU5840498A; CA2229766C; CZ291525B6; EP0866071B1; HUP9800581A3; CN1065873C; HUP9800581A2; NO981239D0; NO981239L; DK0866071T3; CA2229766A1; KR19980080494A; ES2230631T3; DE69827060T2

Abstract

本发明提出了用于核酸序列扩增的修饰寡核苷酸。用这种修饰过的寡核苷酸进行扩增的结果非特异扩增产物少,具体说,引物二聚体少,并且与未修饰的寡核苷酸用作引物进行比较,能得到更高产率的扩增产物。

Description

修饰的引物

本发明涉及分子生物学和核酸化学领域，特别涉及提高核酸扩增反应产量的方法和试剂。因此本发明可应用于任何有关核酸扩增的领域。

聚合酶链反应(PCR)的发明使在体外扩增核酸序列成为可能，有关PCR的资料可见美国专利号4,683,195；4,683,202；和4,965,188；Saiki等，1985，科学(Science)230：1350-1354；Mullis等，1986，Cold SpringsHarbor，Symp.Quant.Biol.51：263-273；以及Mullis和Faloona，1987，酶学方法(Methods Enzymol)，155：335-350。PCR技术的发展和应用已广泛见于本学科文献，例如，PCR相关课题范围见于PCR技术-DNA扩增原理和应用，1989，(HA.Erlich编)stockton press，New York；PCR方案：方法和应用指南，1990，(M.A.Znnis等编)，Academic press，San Diego；以及PCR策略，1995，(M.A.Znnis等编)，Academc press，San Diego；销售商例如PerkinElmer(Norwalk，CT)，出售PCR反映试剂并出版PCR手册。

自从最初核酸扩增方法公布以来，各种以引物为基础的核酸扩增方法包括(但并不仅限于这些)连接酶链反应(LCR，Wuand Wallace，1989，基因学(Genomics)4：560-569；Barany，1991，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88：189-193)；聚合酶、连接酶链反应(Barany，1991，PCR方法和应用、1：5-16)；间隙连接酶链反应(PCT专利申请公布号WO90/01069)，修复链反应(欧洲专利申请公布号439,182A2)，3SR(kwoh等，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86：1173-1177；Guatelli等，1990，美国国家科学院院刊USA87：1874-1878；PCT专利申请公布号WO 92/0880A)。以及NASBA(美国专利号5,132,238)；Abramson和Myers，在1993当前生物技术(Current Opinon in Biotechnology)4；41-47中概括了各种扩增体系。

以引物为基础的扩增反应特异性依赖于引物杂交的特异性，在高于常规扩增的温度下，引物只与延伸的目的序列杂交。但扩增反应混合物通常在室温下制备，因此会降低引物杂交特异性所需要的温度，在非严谨条件下，引物可能会非特异性的与只有部分互补的核酸序列结合，或与其他引物结合，并引发非目的延伸产物的合成而伴随目的序列扩增。非特异引物延伸产物的扩增可与目的序列扩增竞争并显著降低所需序列的扩增效率。

常见的一种非特异扩增产物类型是模板非依赖性扩增反应的人工产物，称之为“引物二聚体”。引物二聚体是一双链片段，长度通常接近于两个引物长度的总和，一般发生于一个引物在另一个引物之上延伸时，产生的多联体可作为非目的模板，由于该模板长度比较短，因此能有效扩增。

可以通过在反应开始前减少引物延伸产物的形成来降低非特异扩增。在一种称为热起动法的方案中，从反应混合物中去除一种或多种反应物直到温度升至足以产生特异杂交时。在该方法中，反应混合物在反应条件不能保证特异引物杂交期间不支持引物延伸。

在手工热起动方法中，由于反应管在最初的高温孵育后是打开的，以便加入缺失的反应物，因此工作强度大而且增加反应混合物污染的危险。但可以用热敏感物质(例如，石蜡)隔离反应成分。见美国专利号5,411,876及Chou等，1992，核酸研究(Nud.Acids.Res.)20(7)：1717-1723。该方法中反应前的高温孵育可以融化热敏感物质，从而使反应物得以混合。

另一种在反应开始前降低引物延伸产物形成的方法是依据DNA聚合酶特异抗体对DNA聚合酶的热可逆性阻滞作用，见美国专利号5,338,671。在制备反应混合物之前将抗体和DNA聚合酶在缓冲液中室温下孵育，以形成抗体-DNA聚合酶复合物。抗体对DNA聚合酶活性的阻止作用可被反应前孵育时的高温失活。该方法的一个缺点是DNA聚合酶特异抗体的生产昂贵而费时，特别是大剂量应用时。而且反应混合物中抗体的加入要求重新设计扩增反应。

反应开始前延伸产物的形成也可通过加入一种单链结合蛋白来抑制，该蛋白以热可逆方式与引物非共价结合并防止杂交从而阻滞引物延伸。

非特异扩增也可通过酶降解反应开始前形成的延伸产物而降低，该法详见美国专利号5,418,149。新合成延伸物的降解可通过脱氧尿苷三磷酸(dUTP)和软膏(UNG)加入到反应混合物中并在进行扩增反应前45-60℃孵育反应混合物的方法实现。引物延伸形成的含尿嘧啶的DNA在扩增前用UNG降解。该方法的缺点是延伸产物的降解竞争延伸产物的形成，而且非特异引物的消除可能会不完全。该方法的优点是介入到反应混合物中的含尿嘧啶的DNA作为前面反应的污染剂也被降解，因此该方法也减少了由于前一反应的扩增核酸造成的PCR污染问题。

现有技术中的分子生物学和核酸生化技术可在本学科内完全得到解释，例如，Sambrook等，1989，分子克隆-实验手册，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York；寡核苷酸合成(M.J.Gait编，1984)；核酸杂交(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)；以及一系列酶学方法(AcademicPress，Inc.)。

本发明为体外核酸序列扩增提供了共价修饰的寡核苷酸引物。应用本发明的修饰引物可减少非特异扩增，特别是引物二聚体的形成，和/或与非修饰引物的扩增相比，同时增加目的片段的产量。

本发明一方面涉及一用于核酸序列扩增的寡核苷酸引物，具有以下一般结构：

其中S₁代表大约5和大约50个核苷酸长度之间的第一个核苷酸序列；

其中S₂代表1和3个核苷酸长度之间的第二个序列；

其中N代表一个含有嘌呤或嘧啶碱基的核苷酸，该碱基含有一环外胺；

其中R代表一修饰物基团，R通过环外胺与N共价结合，R具有以下结构：

其中R₁、R₂各自代表氢、C₁-C₁₀烷基、烷氧基、苯基、苯氧基、取代苯基、萘基或取代萘基。烷基可以是支链或非支链。

优选实施方案中，N是一修饰的常规核苷酸，比如N为修饰后的腺苷、胞苷或鸟苷，修饰成分与腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶碱基的环外胺共价结合，N更优选为修饰的腺苷。

优选实施方案中，R为2-萘甲基，苄基、或取代苄基。优选取代的苄基具有如下结构：

其中R₃代表一C₁-C₆支链或直链烷基，更优选C₁-C₄支链或直链烷基、甲氧基或硝基，R₃优选对位连接。

更优选实施方案中，R为苄基、对一甲基苄基、对叔丁基苄基、对甲氧苄基、或2-萘甲基。

本发明另一方面涉及由光敏共价结合的修饰基团修饰的扩增引物，该修饰基团会部分或全部阻滞引物延伸。该光敏修饰物可以结合环外胺(如在前述修饰的核苷酸中的)也可结合环氮。在一实施方案中，至少有一个硝基苄基结合到3′末端核苷酸的腺嘌呤、鸟嘌呤、或胞嘧啶碱基的环外胺。

本发明另一方面涉及一对或一系列引物，其中至少有一个引物按上面所述修饰过。优选实施方案中，一对或全部的一系列引物都被修饰。

本发明另一方面涉及扩增核酸的方法，包括用本发明的修饰引物进行扩增反应。

本发明另一方面涉及扩增目的核酸的方法，包括用本发明的光敏修饰引物进行扩增反应，其中反应混合物用光照射，该光应足以消除修饰基团并形成引物延伸产物。本发明的一个实施方案中，照射在扩增反应开始前，反应混合物被加热到高于50℃后，作为独立的一步进行。另一实施方案中，照射是伴随扩增过程的初始阶段一起进行的，例如，伴随RNA扩增反应的反转录阶段，或DNA扩增反应的初始变性阶段。

本发明另一方面涉及核苷酸序列体外扩增的试剂盒，其中包含一对引物，该引物中至少有一个是按本文所述修饰过的。本发明的试剂盒也包含一个或多个扩增反应物，例如核酸聚合酶或连接酶、核苷三磷酸酶、以及适当的缓冲液。

附图概述：

图1显示用苄基化的引物进行HIV-1RNA扩增的结果，如实施例5所述。

图2显示用苄基化的引物进行HCVRNA扩增的结果，如实施例6所述。

图3显示用分别用三种修饰基团之一修饰后的引物进行HCV RNA扩增的结果，如实施例7所述。

图4显示用光敏修饰后引物进行HCV RNA扩增的结果，如实施例8所述。

图5显示用苄基修饰的引物和用对叔丁基苄基修饰的引物扩增分枝杆菌DNA的结果，如实施例10所述。

图6显示适用于苄基或取代苄基修饰的脱氧腺苷(dA)可控孔度玻璃(CPG)合成的常用反应体系。

为帮助理解本发明，对有关术语定义如下：

“核酸”、“寡核苷酸”指的是多聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)及其它类型的多核苷酸：嘌呤或嘧啶碱基的N糖甙或修饰后的嘌呤或嘧啶碱基的N糖基。“核酸”和“寡核苷酸”之间没有长度上的区别，可以互换使用。这些术语仅指分子的一级结构，可以包括双股、单股DNA以及双股、单股RNA。

“常规的”在表示核酸碱基、核苷或核苷酸时是指所述的多核苷酸中自然产生的那些。四种常规的(即主要的)构成DNA的脱氧核糖核苷酸包括嘌呤碱基(腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶碱基(胞嘧啶和胸腺嘧啶)。四种常规的RNA核糖核苷酸包括嘌呤碱基(腺嘌呤和鸟嘌呤)及嘧啶碱基(胞嘧啶和尿嘧啶)。除了上述常规的或通用的碱基，一些其它的嘌呤和嘧啶衍生物(称为稀有或少数碱基)也少量出现于某些核酸中。在本文中“非常规的”表示核酸碱基、核苷或核苷酸时是指稀有或少数核酸碱基、核苷或核苷酸以及常规碱基、核苷或核苷酸的修饰物、衍生物或类似物，也包括含有修饰碱基成份和/或修饰糖成份的合成的核苷酸(见寡核苷酸缀合物方案，分子生物学方法，26卷(SudhirAgrawal编，Humana Press，Totowa，NJ，(1994))；寡核苷酸和类似物，实施方法(Fritz Eckstrin编，IRL Press，牛津大学出版，Oxford)。

寡核苷酸可用适当的方法制备，如克隆并限制适当序列以及直接化学合成，例如应用Narang等的磷酸三酯法，1979，酶学方法(Meth.Enzymol.)68：90-99。Brown等的磷酸二酯法1979酶学方法，(Meth.Enzymol.)68：109-151；Beaucage等的二乙基磷酸酰胺法，1981，四面体通讯(TetrahedonLett.)22：1859-1862；美国专利号4,458,066的固相载体法。这些合成方法在goodchild，1990，生物结合化学(Bioconjugate Chemistry)1(3)：165-187中有综述。

“碱基配对”，本领域中称为“Waston-crick碱基配对”，是指众所周知的在双链DNA结构中碱基对腺嘌呤-胸腺嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶之间，以及RNA/DNA杂合分子中的腺嘌呤-鸟嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶，之间互补的氢键成键，以及非常规核苷酸对之间的类似结合。

“杂交”指的是应用两个单链核酸通过碱基互补配对形成双链结构。杂交可发生于完全互补的核酸链间或存在少量错配区的“基本上互补的”核酸链间。只能在完全互补核酸链间发生杂交的条件称为“严格杂交条件”或“序列特异杂交条件”。基本互补序列的稳定双螺旋体可在非严格杂交条件下获得。耐受的错配程度可通过适当调节杂交条件控制。核酸领域的技术人员通过考虑一些变量能凭经验可以确定双螺旋的稳定性。这些变量包括：寡核苷酸的长度和碱基对的浓度、离子强度、碱基对错配率。可以按技术指南(Sambook 1989，分子克隆-实验手册，(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)Cold Spring Harbor，New York；Wetmur，1991，生物化学和分子生物学评论26(3/4)：227-259)进行。

“引物”指的是在诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物条件下，在4种不同的核苷三磷酸和延伸试剂(例如DNA聚合酶或反转录酶)及适宜缓冲液和适宜温度下，能作为DNA合成的起始点的寡核苷酸。本文中的“引物”包括用于连接介导扩增反应中的寡核苷酸，此反应过程中一个寡核苷酸通过与在相邻位置杂交的第二个寡核苷酸连接而“延伸”。因此本文中的“引物延伸”是指应用作为DNA合成起始点的引物进行的单个核苷三磷酸的聚合反应，也指两个引物形成一个延伸产物的连接反应。

引物优选单链的DNA。引物的适宜长度取决于该引物所要求的用途，一般在6-50个核苷酸之间。短的引物分子一般要求较低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不需要反应模板核酸的准确序列，但必须与模板充分互补杂交。用于扩增给定目的序列的适宜引物设计在现有技术中是已知的，可参考本文文献。

引物可以为检测或固定而添加一些特征，但不能改变引物的基本特征即作为DNA合成起始点。例如引物可以在5末端增加一核酸序列，它不与目的核酸杂交，但有助于克隆扩增产物。引物与模板充分互补杂交的区域在本文中称为杂交区域。

“目的序列”、“目的区域”、及“目的核酸”指的是用于扩增的核酸区域或序列。

按本文所指，如果引物序列与目的序列之间的错配数少于引物序列与样品中存在的非目的序列间的错配数，则该引物对于目的序列来说就是“特异的”。只有当错配数不超过引物与目的序列间的错配数时才能选择形成稳定双链的杂交条件。在该条件下目的特异引物只与目的序列形成稳定双链。因此在稳定严格扩增条件下应用目的特异性引物能特异扩增含有目的引物结合位点的序列。应用序列特异扩增条件能特异扩增那些含有精确互补引物结合位点的目的序列。

“非特异扩增”是指由于引物与非目的序列杂交并作为引物延伸底物而产生的该非目的序列的核酸扩增。引物与非目的序列的杂交称为“非特异杂交”，可发生于温度较低、低严格性和预扩增条件下。

“引物二聚体”指模板非依赖性的来自引物在另一引物作为模板时延伸产生的非特异扩增产物。尽管引物二聚体经常是两个引物的串联体，即一种二聚体，但也可能出现超过两个引物的串联体。“引物二聚体”在本文中一般包括模板非依赖性的非特异扩增产物。

“反应混合物”指的是含有进行一种给定反应所必须试剂的溶液。“扩增反应混合物”是指进行扩增反应所必须试剂的溶液，一般含有寡核苷酸引物和DNA聚合酶或适宜缓冲液中的连接酶。“PCR反应混合物”一般含有寡核苷酸引物、热稳定性DNA聚合酶、脱氧三磷酸核苷(dNTPS)、和适宜缓冲液中的二价金属阳离子。若反应混合物含有进行反应所必须的全部试剂则为完全的，若只含有一部分试剂则为不完全混合物。熟悉本科学领域的人都明白，反应成份常规单独保存，各含有一种成份，以利于方便、稳定储存或便于调节所用化合物浓度；也知道在反应之前合并各反应物以形成完全反应混合物。而且反应物单独包装出售，适用的商品试剂盒含有包括本发明修饰引物在内的任何一种反应组分。修饰的引物

本发明的扩增引物是通过在引物3’末端的四种核苷酸中的一种上共价结合一基团进行修饰的。实施方案中本发明的修饰引物包括具有以下一般结构的核酸序列：其中S₁代表大约5和大约50个核苷酸长度之间的第一个核苷酸序列；

S₂代表1和3个核苷酸长度之间的第二个序列；

N代表一个含有嘌呤或嘧啶碱基的核苷酸，该碱基含有一环外胺。

R代表一修饰剂基团，R通过环外胺与N共价结合，R如下述结构。

按实施例所示，当修饰发生在3’末端核苷酸上时修饰效率最大，因此引物优选包含修饰的3’末端核苷酸。

修饰的核苷酸选自那些碱基中含有环外胺的，环外胺通过其互补核苷酸而进入核苷酸碱基配对中。引物一般是只含常规核苷酸的DNA。DNA中常规核苷酸碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶含有一环外伯胺，其通过互补碱基进入碱基配对。本发明的优选的一方面在于引物的修饰是通过将单个的修饰基团结合到环外胺上代替胺基中的两个氢之一(其在未修饰的碱基中能进入碱基配对)而实现的。修饰核苷酸的结构中分别含有一修饰的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶碱基，如下所示：其中S代表糖成份，R代表修饰基团。

本发明不局限于常规核苷酸构成的引物，任何碱基成份中与互补碱基配对的含有环外伯胺的核苷酸类似物都可按本文所示修饰。非常规核苷酸的例子包括3-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、3-甲基鸟嘌呤、5-甲基胞嘧啶以及5-羟甲基胞嘧啶。

由于修饰物取代了一个氢原子使修饰基团限制了修饰碱基形成氢键的能力。剩余的氢原子仍能参与氢键形成。修饰物因此影响了杂交的动力学和热动力学。各种预计的修饰基团具有如下特性：

1、干扰但不阻滞修饰的碱基与互补的碱基的Waston-Crick碱基配对；

2、干扰但不阻滞修饰引物的延伸；

3、允许与修饰引物延伸产物互补的单股DNA的合成。

修饰基团在空间上干扰碱基配对从而干扰引物延伸，因此修饰物的体积影响干扰杂交的程度。当修饰的腺嘌呤或胞嘧啶核苷酸构成双股核酸时，修饰基团会插入到大沟的中间区，因此即使相当大的修饰基团也几乎不会造成双螺旋结构的空间紊乱，但适宜的修饰物不能太大以致阻滞氢键形成或阻滞引物3’-羟基的酶促延伸。当修饰的鸟嘌呤核苷酸进入双股核酸时，修饰基团会插入到小沟中，该小沟只能为应顺修饰基团提供较小的空间，因此优选较小的修饰基团结合鸟嘌呤碱基。

作为下一扩增循环模板的引物延伸产物含有来自引物的修饰碱基，选择该修饰碱基要使模板中修饰碱基的存在不会终止引物延伸或抑制引物延伸。修饰碱基的性质不能提高突变的发生，否则修饰碱基本身会在引物产生的模板复制中丢失。模板中修饰碱基对引物延伸的影响可用现有技术指南检测到(例如Gniazdowski和Cera，1996，化学杂志(Chem.Rev.)96：619-634)。

满足上述特性的修饰基团R适用于本发明的方法。优选具有以下结构的修饰基团：

其中R₁、R₂各自代表氢、C₁-C₁₀烷基、苯基、取代苯基、萘基或取代萘基，烷基可以是支链或直链，也可使用大于C₂₀的烷基。

优选实施方案中R为2-萘甲基、苄基或取代苄基，优选的取代苄基具有如下结构：

其中R₃代表一C₁-C₆支链或直链烷基团，更优选C₁-C₄支链或直链烷基，甲氧基、硝基。C₁-C₄支链或直链烷基为甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、异丙烷、异丁烷等。甲烷和对丁烷为优选烷基，R₃优选对位。特别优选的修饰基团R如下所示：

一些特殊的修饰基团可见实施例。一般来说，本领域的技术人员可以按本文提供指南从一类化合物中凭经验选择适宜的修饰基团。特殊基团的适宜性最好通过在扩增反应中应用修饰引物来确定。成功的扩增表明修饰碱基不会完全阻止引物延伸，而且引物衍生模板中的修饰碱基也不会终止引物延伸。引物二聚体的减少可按实施例中所述确定。光敏修饰的引物

本发明的另一实施方案中，引物用一个或多个光敏基因修饰，该光敏基因可以在反应达到确保特异性的高温反应条件后通过光照去除。因为该修饰物在引物延伸之前去除，修饰的引物在修饰基团去除前不需要有延伸性。可用于本发明方法中的光敏修饰物的例子，见Pillai，1980，＂有机合成中的光消除性保护基团＂，合成：1-26。

本发明的光敏引物修饰优选在3′末端核苷酸上加上一个或两个邻硝基苄基团：

通过在碱基成分的环外的伯胺上加上单个硝基苄基而修饰的引物，如果胺基能旋转以使保留的氢朝向互补碱基，则形成的仲胺仍能参与碱基配对。如实施例中所述，这些引物可用于伴或不伴紫外光照清除的扩增。

用两个硝基苄基结合碱基的环外胺而修饰的引物不能延伸。这种抑制作用可能是由于修饰的碱基在进行碱基配对时因环外胺的两个氢被大体积的硝基苄基取代而失活。用两个硝基苄基修饰的引物在扩增中的应用见实施例，在该扩增中反应混合物需暴露于紫外线下一段时间以充分去除硝基苄基，从而产生引物延伸。

在另一实施方案中，修饰基团结合到环氮上。将一个硝基苄基结合到碱基的环氮上修饰的引物，由于修饰碱基进行碱基配对时失活而不能延伸。通过紫外线照射去除硝基苄基可以使引物延伸。

应用去除修饰基因才能延伸的光敏引物可以进行热起动扩增。引物延伸在反应前非特异条件下被抑制，只有当反应温度升至能确保反应特异性后，照射反应物使引物解除抑制。修饰引物的合成

修饰引物的合成是用现有技术中的标准化学方法进行的。修饰物引入的方法分4种：

1.通过应用修饰的核苷作为DNA合成的支持体而引入该修饰物。

2.通过应用修饰的核苷作为亚磷酰胺引入修饰物。

3.通过应用DNA合成过程中的试剂引入修饰物。(例如加到DNA序列中的用苄基胺处理可转化的亚酰胺盐)

4.合成后修饰。修饰物可以在与合成的DNA接触时作为反应试剂引入。

特殊修饰引物的合成见实施例。其它的修饰引物可按类似方式用标准方法合成。

修饰引物优选用衍生的可控孔度玻璃(CPG)载体来合成。合成衍生的dACPG的常规反应方案见图6。特殊的修饰基团可通过应用适当的烷基卤化物、苄基卤化物、取代的苄基卤化物、萘甲基卤化物或取代的萘甲基卤化物等烷基化剂加入。苄基和对叔丁基苄基dACPG的合成见实施例1和2，按图6的方案进行。

环外氨基的烷化可用类似甲基化的方式进行。见Grittin和Reese，1963，生物化学杂志(Biochim.Acta)68：185-192。其它的合成方法见Aritoma等，1995，J.Chem.Soc.Perkin.Trans.1：1837-1849.用修饰的引物扩增

本发明的方法包括应用本发明的修饰引物进行以引物为基础的扩增。修饰引物一般可以取代含有相同核苷酸序列的未修饰引物，而不需改变扩增反应条件。当然，本领域技术人员认识到反应条件略作调整对某些反应有利。

优选实施方案中，本发明的修饰引物用于聚合酶链反应(PCR)。但本发明不限于任何具体的扩增体系。本发明的修饰引物可用于任何以引物为基础的形成引物二聚体或非特异扩增产物的扩增体系。实施例中包括了上述文献中的扩增方法。如同其它体系的发展，这些体系也会通过实施本发明受益。

本发明的方法适用于DNA和RNA的扩增。例如现有技术中，用反转录/聚合酶链反应(RT-PCR)进行RNA扩增，见美国专利号5,322,770和5,310,652,Myers和Gelfand，1991，生物化学(Biochemistry)30(31)：7661-7666；Young等，1993，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)32(2)：292-300。

以引物为基础的扩增中，引物延伸通常是在高温度下用耐热酶(例如用耐热DNA聚合酶)进行的。酶首先在引物的3′末端启动合成并向模板的5′末端方向前进直到合成终止。用于扩增反应的纯的热稳定DNA聚合酶在现有技术中是已知的；包括(但不限于)美国专利号4,889,818；5,079,352；5,325,600；5,491,086；W091/09950；WO92/03556；W092/06200；W092/06202；W092/09689；以及美国专利号5,210,036中提及的那些酶。对热稳定DNA聚合酶的评述见Abramson，1995，PCR策略(M.A.Znnis等编)，39-57页，AcademicPress，SanDiego。

优选实施方案中(特别针对DNA扩增)，应用一可逆失活酶进行扩增，该可逆失活酶在高温反应条件下能复活，它的应用通过抑制反应开始前的引物延伸而进一步降低了非特异扩增。可逆失活的热稳定DNA聚合酶由Hoffmann-La Roche(Nutley，NJ)开发制造，PerkinElmer(Norwalk，CT)销售，见Birch等，1996，自然(Nature)381(6581)：445-446。

修饰基团对酶延伸引物能力的影响，部分地取决于所用的具体的酶，而部分取决于选择的反应条件。例如用TthDNA聚合酶在某些RNA扩增中，用Mn²⁺作二阶阳离子比Mg²⁺好。现有技术表明常规选择适宜修饰基团时要考虑酶和反应条件。

用于扩增反应的样品制备方法在现有技术中是已知的，在本文所引文献中有详细说明，特殊方法的应用不是本发明的关键，本专业人员能按已知的样品制备方法优化反应条件。

分析扩增核酸的方法在现有技术中是已知的，在本文文献中有详细叙述。特殊方法的应用不是本发明的关键，可按应用来选择适宜的分析方法。

分析扩增反应的优选方法是通过监测反应混合物中双链DNA总量的增加来分析，见Higuchi等，1992，生物/技术(Bio/Technology)10：413-417；Higuchi等，1993，Bio/Technologyl1：1026-1030；欧洲专利公布号512,334和640,828。该方法本文中称为＂动力PCR＂.双链DNA的检测依赖于当溴化乙锭(EtBr)和其它DNA结合标记与双链DNA结合时增加的荧光度。扩增在标记物存在下进行。由目的序列合成而增加的双链DNA会使扩增过程中检测的荧光度增加。因此，该方法能监测扩增反应的进程。

在动力PCR中，测得的荧光度依赖于双链DNA存在的总量，不管双链DNA是来自非特异扩增还是来自目的片段的扩增。监测荧光度能测量双链DNA总量的增加，但测量目的序列扩增的增加不能与非特异扩增产物的增加分开。本发明的修饰引物特别适用于动力PCR，因为这些引物不仅降低了形成引物二聚体的数量，也延缓了可检测量的引物二聚体的形成。使引物二聚体的形成延缓到目的序列显著增加后才发生，从而能独立监测目的序列扩增的情况，并减少引物二聚体的干扰。试剂盒

本发明也涉及试剂盒，即实施本方法所需化合物的多包装单位。试剂盒包括用于核酸扩增的引物(至少一个引物是如本文所述修饰过的)。其它可选成分包括：催化引物延伸产物合成的试剂、底物三磷酸核苷、适宜的反应缓冲液、以及实施本方法的有关说明。

本发明的以下这些实施例只是用于说明本发明，而不是要限制本发明的范围。本专业的普通技术人员从上面的说明书内容和以下的实施例将会清楚地了解本申请权利要求范围之内的本发明许多实施方案。

实施例1

苄基修饰引物的合成

用下述两种方法之一合成了由苄基修饰的引物。在3′末端碱基上修饰的引物是采用N⁶-苄基脱氧腺苷的可控孔度玻璃(CPG)载体来引发DNA而合成的。合成在内碱基上修饰的引物是用一种N⁶-苄基脱氧腺苷亚磷酰胺。

在该实施例中使用以下标准的缩略语：DMAP 4-二甲基氨基吡啶DMF N，N-二甲基甲酰胺TEA 三乙胺EDC 1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺，盐酸化物THF 四氢呋喃DMT 4，4′-甲氧三苯甲基LCAA-CPG 长链烷基氨基可控孔度玻璃I.N⁶-苄基脱氧腺苷CPG的合成

步骤1：合成N⁶-苄氧基，N⁶-苄基，5′-O-DMT-2′-脱氧腺苷

在N⁶-苄氧基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)2′-脱氧腺苷(657mg，1.0mmol；Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)中加吡啶(10ml)，并将该混合物真空蒸发干燥。重复此过程。将所得泡沫溶于无水DMF(15ml；Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)，冷却至5℃。在氩气氛下加氢化钠(44mg，1.1mmol，1.1当量60％的油分散液)，并在室温下搅拌45分钟。加苄基溴化物2分钟(143μl，206mg，1.2mmol.1.2当量；Aldrich ChemicalCO.，Milwaukee，WI)并在室温下将该混合物搅拌过夜。真空蒸发干燥后的残留物在乙酸乙酯和水(每次10ml)中分配和萃取。水相再用乙酸乙酯(10ml)萃取，将此合并的萃取物经无水硫酸镁干燥，过滤和蒸发。粗产物通过柱色谱用甲醇∶三乙胺∶二氯甲烷(3∶0.5∶96.5)在硅胶上提纯。将含产物的馏份合并并蒸于，得到所需的N⁶-苄氧基，N⁶-苄基，5′-O-DMT-2′-脱氧腺苷(410mg，54％)。产物的结构用NMR鉴定。

步骤2：琥珀酰化

向该N⁶-苄氧基，N⁶-苄基，5′-O-DMT-2′-脱氧腺苷(295mg，0.39mmol)加10ml吡啶并将该混合物在高真空下蒸干。重复这个步骤。将新的无水吡啶(10ml)与琥珀酸酐(200mg，2mmol，5.0当量)和DMAP(24mg)加在一起，并在室温下将该溶液在氩气氛下搅拌过夜。真空下除去大部分溶剂之后的残留物在二氯甲烷(20ml)和柠檬酸钠溶液(20ml，0.1M，pH 5.0)中分配并萃取。水相再用二氯甲烷(20ml)萃取，合并的萃取物用无水硫酸钠干燥，过滤，并蒸干。产物通过柱色谱用乙酸乙酯、三乙胺、二氯甲烷(32∶1∶67)在硅胶上提纯，得到所需的3′-琥珀酸酯，N⁶-苄氧基-N⁶-苄基-3′-O-琥珀酸-5′-O-DMT-2′-脱氧腺苷(247mg，74％)。

步骤3：CPG的衍生

酸洗的CPG制备如下。将LCAA-CPG(1.0g，LCA 00500C，500A，88.6(mol/g)；CPG Inc.，Farifield，NJ)用二氯乙酸在二氯甲烷中的溶液(2％，20ml)在室温下通过20分钟的周期性回荡进行洗涤。将该酸洗过的CPG在玻璃料上过滤之后用二氯甲烷洗至无酸为止。所得粉末经空气干燥之后在室温下真空干燥过夜。

修饰的核苷中间体与酸洗过的CPG之间进行偶联的方法如下。向上面制备的N⁶-苄氧基-N⁶-苄基-3′-O-琥珀酸-5′-O-DMT-2′-脱氧腺苷(170mg，0.2mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中加入TEA(100μl)，将该溶液浓缩(在氩气下)至大约5ml。依次加入DMAP(12mg，0.1mmol，0.5当量)，TEA(100μl)，EDL(384mg，2.0mmol，10当量)，以及以上得到的酸洗过的CPG。加入无水吡啶并将该混合物密封以及在室温下摇3天之后，真空下滤出CPG，用异丙醇充分洗涤，然后再用二氯甲烷洗，空气干燥后再真空干燥1小时。

衍生的CPG按以下方法封端。向干燥的衍生CPG中加入端A和端B溶液(每种5ml，乙酸酐/2，6-二甲基吡啶/THF以及10％N-甲基咪唑的THF溶液；Glen Research DNA合成试剂，Sterling，VA)并在室温下摇该混合物4小时。真空下滤出CPG，用异丙醇充分洗涤，然后用二氯甲烷洗，空气干燥，再在真空下干燥过夜。II.N⁶-苄基脱氧腺苷亚磷酰胺的合成

N⁶-苄氧基，N⁶-苄基，5′-O-DMT-2′-脱氧腺苷按以下方法合成。

在N⁶-苄氧基，N⁶-苄基，5′-O-DMT-2′-脱氧腺苷(196mg，0.26mmol)的无水THF(8ml)中加二异丙基乙胺(350μl，270mg，2.04mmol，7.8equiv.)和2-氰乙基N，N-二异丙基亚磷酰氯(16lmg，0.68mmol，2.6当量；Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)，将该混合物在室温和氩气氛下搅拌30分钟。真空除去溶剂，残留物在碳酸氢钠溶液(5％，20ml)和乙酸乙酯(20ml)之间分配。有机相依次用碳酸氢盐、水、和饱和盐水(每种20ml)洗涤，用硫酸镁干燥、过滤、以及蒸发。残留物通过硅胶柱色谱法用丙酮/乙烷/TEA(34∶65∶0.7)提纯，得到所需的亚磷酰胺(248mg，100％)。III.DNA合成、纯化、以及分析

将该苄基衍生的腺苷CPG(25mg，1.0mol)移至空的合成柱(Glen Research，Sterling，VA)，用这些衍生物在一个ABI 274 DNA合成器中按常用的合成方法和去保护条件来制成寡核苷酸。该合成器的生产商为Perkin Elmer，AppliedBiosystems Division，Foster City，CA。纯化此粗的DMT-DNA并转化成5′-羟基-DNA。该转化是通过标准的DMT断断续续的HPLC法在-个RaininHPLC系统(Rainin Instrument Co，Wobum，MA)的Rainin Pure-DNA柱中进行。用ABI毛细管电泳系统(Perkin Elmer，Applied Biosystems Division，FosterCity，CA)或用变性阴离子交换HPLC色谱法在Dionex Nudeopak柱(DionexCorp，Sunnyvale，CA)上对寡核苷酸作分析。

同样，内修饰的引物也用一种未修饰的CPG和如上合成的修饰过的亚磷酰胺来合成。

实施例2

叔丁基苄基修饰引物的合成

本实施例描述的是用对-叔丁基苄基在3′端腺苷上修饰的引物的合成方法。该修饰的引物基本上按实施例1的方法合成，但用的是N⁶-(对-叔-丁基苄基)脱氧腺苷CPG。该衍生的CPG合成方法如下。

步骤1：合成N⁶-苄氧基-N⁶-(对-叔-丁基苄基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧腺苷

将DMF(无水，10ml)加到N⁶-苄氧基-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧腺苷(685mg，1.0mmol)中，蒸干。重复此过程。在氩气下加新的DMF(10ml)。加氢化钠(44mg，60％油溶液，1.1mmole)，混合物在室温下搅拌0.5小时。滴加4-(叔-丁基)苄基溴(272mg，1.2mmole)并在室温下搅拌过夜。真空除去溶剂，残留物在乙酸乙酯和水(各20ml)之间分配。有机相用水洗(3次，20ml)，经无水硫酸镁干燥，过滤，蒸干。粗产物通过硅胶酸(100g)柱色谱法用＝氯甲烷∶甲醇∶三乙胺(96.5∶3∶0.5)提纯，得到N⁶-苄氧基-N⁶-(p-叔-丁基苄基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧腺苷，(229mg，28.5％)。

步骤2：琥珀酰化

用琥珀酸酐(135mg，5当量)和DMAP(17mg，0.5当量)在吡啶(10ml)中的溶液来处理N⁶-苄氧基-N⁶-(对-叔-丁基苄基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧腺苷(127mg，0.27mmol)。按上述实施例1方法操作和色谱纯化，得到N⁶-苄氧基-N⁶-(对-叔丁基苄基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧腺苷，3′-O-琥珀酸(199mg，82％)。

步骤3：CPG的衍生

上述第2步得到的琥珀酸(180mg，0.2mmol)用实施例1所述酸洗的LCAA-CPG处理。封端该CPG，真空干燥得到N⁶-苄氧基-N⁶-(对-叔-丁基苄基)-5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2′-脱氧腺苷，3′-O-琥珀酸衍生的CPG，(1.065g)。

实施例3

甲基修饰引物的合成

用甲基在3′端腺苷上修饰的引物是用N⁶-甲基脱氧腺苷(dA)CPG(22mg，1μmole，Glen Research，Sterling VA)合成的。将N⁶-甲基脱氧腺苷CPG放在一个空的合成柱中，按标准的合成和去保护条件制得引物。该引物用实施例1所述的DMT断断续续的HPLC方法提纯。

实施例4

合成光敏的修饰引物

本实施例描述用一个或两个硝基苄基在3′端腺苷上修饰引物的合成方法。该修饰的引物基本上按实施例1所述的方法来合成，但用的是一种单硝基苄基dACPG或一种双硝基苄基dACPG。I单硝基苄基化的引物

合成N⁶-苄氧基-N⁶-邻-硝基苄基-2′-脱氧腺苷衍生的CPG，一般应用合成N⁶-苄氧基-N⁶-苄基-2′-脱氧腺苷衍生的CPG(实施例1)所用的方法，其中用邻位硝基苄基溴作为烷基化试剂。用于该CPG的后面一些步骤与实施例1所述的相同，另外需要将中间体放在用铝箔包起来的反应烧并中来蔽光。

衍生的CPG合成之后，引物的合成如实施例1所述，但分离的方法是采用Nensorb Prep的一次性应用柱(NEN Research Products BiotechnologgSystems，Du Pont Co，Boston MA)，该厂商有使用方法的说明。II.双硝基苄基化的引物

按以下所述的方法合成双硝基苄基脱氧腺苷CPG。衍生的CPG合成之后接着合成和纯化该引物的方法如同单硝基苄基引物所用的方法。

步骤1：合成5′-O-DMT-N⁶-双-邻-硝基苄基-2′-脱氧腺苷

将2′-脱氧腺苷单水合物(538mg，2.0mmol，Aldrich Chemical，Milwaukee，WI)用无水吡啶(2次，10ml)在真空下蒸干。残留物溶于氩气保护下的无水DMF(10ml，Aldrich，Milwaukee，Wl)，加氢化钠(88mg，2.2mmol，1.1.当量，60％的油分散液)，并在室温下搅拌40分钟。加2-硝基苄溴(710mg，3.3mmol，1.5当量)并将此溶液在室温下搅拌4小时。真空蒸去DMF，残留物在乙酸乙酯与水(各20ml)之间分配。水相用乙酸乙酯(20ml)萃取。合并几次的萃取物，用水(20ml)洗涤，经硫酸镁干燥，过滤和蒸发。粗产物通过硅胶酸(50g)色谱柱提纯(用3％MeOH的CH₂Cl₂溶液)，得到2′-脱氧-N⁶-双-邻-硝基苄基脱氧腺苷(320mg，30％)。

向2′-脱氧-N⁶-邻硝基苄基脱氧腺苷(200mg，0.518mmol)中加入无水吡啶(10ml)并蒸干。加吡啶(10ml)接着加4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(900mg，2.3mmol，4.5当量)和三乙胺(280mg，2.76mmol，4.0当量)，在室温和氩气下搅拌5小时。加水(0.5ml)再搅拌20分钟。混合物在乙醚与水(各20ml)之间分配后，水相再用乙醚(20ml)萃取。合并萃取物，用水(20ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸发。混合物通过硅胶(4g，用0.7-2.5％甲醇二氯甲烷溶液)色谱柱纯化，得到5′-O-DMT-N⁶-双-邻-硝基苄基-2′-脱氧腺苷，(121mg，33％)。

步骤2：琥珀酰化

将5′-O-DMT-N⁶-双-邻-硝基苄基-2′-脱氧腺苷(121mg，0.145mmol)用无水吡啶(2次，3ml)蒸干。加入吡啶(3ml)、琥珀酸酐(58mg，0.58mmol，4当量)和DMAP(11mg，催化剂)，在室温下将该溶液搅拌3天。真空蒸发之后残留物在二氯甲烷(10ml)与柠檬酸缓冲液(0.1M，pH5.0，10ml)。有机相用无水碳酸钠干燥，过滤，蒸干。粗产物通过硅胶(2g，用EtOAc∶CH₂Cl₂∶TEA，32∶67∶1，10ml，然后用MeOH∶CH₂Cl₂，2∶97，25ml)色谱纯化，得到浅黄色泡沫5′-O-DMT-N⁶-双-邻-硝基苄基-2′-脱氧腺苷-3′-O-琥珀酸，(138mg，99.5％)。

步骤3：CPG的衍生

按实施例1所述方法制备酸洗的LCAA-CPG。

修饰的核苷中间体与酸洗的CPG之间的偶联按如下所述的进行操作。将5′-O-DMT-N⁶-双-邻-硝基苄基-2′-脱氧腺苷-3′-O-琥珀酸(37mg，0.04mmol)用在一个琥珀色玻璃管形瓶中的TEA(16μl)处理并蒸发。在该残留物中加入无水吡啶(1.5ml)、TEA(2μl)、DMAP(2.4mg)、EDC(76mg，0.04mmol)和酸洗的LCAA-CPG(200mg)，并将该混合物在一个轨道式摇动混合器中在室温下混合三天。减压滤出CPG，用异丙醇充分洗涤，再用二氯甲烷洗，空气干燥后再在真空下干燥1小时。

衍生的CPG按实施例1的方法进行封端。

实施例5

用修饰的引物扩增-修饰核苷酸位置的影响

为了证明修饰引物对形成引物二聚体的影响，同时用修饰的引物和未修饰的引物进行HIV-1RNA扩增。另外，为了评价修饰核苷酸的位置对降低引物二聚体的影响，用三种不同的上游修饰引物进行扩增，这些引物只在修饰碱基的位置上有所不同。目的核酸

HIV-1RNA模板是用HIV-1RNA转录载体合成的，见Mulder等，1994，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol)，32(2)：292-300。引物

用未修饰的和修饰的引物进行扩增，未修饰引物的核苷酸序列如下所示，方向为5′到 3′。用上游引物RAR1032MB(SEQ ID NO：1)和下游引物RAR1033 MB(SEQ ID NO：2)扩增175碱基对长的产物，相对应于HIV-1参照株HXB2(基因库号K03455)的核苷酸位置2956到3130序列。

HIV-1扩增产物引物 SeqIDNo. 序列RAR1032MB 1 CAATGAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAARAR1033MB 2 CCCTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCA

上述引物为未修饰引物，未修饰引物在5′端生物素化。修饰引物按实施例1合成，其与未修饰引物含有相同核苷酸序列，但在3′末端或离3′末端上游1-3个核苷酸的位置加上一苄基化的腺苷。引物的修饰形式如下所示：

修饰的HIV-1扩增引物引物 Seq ID No. 修饰核苷酸位置RAR1032MBA1 1 3’末端RAR1032MBA2 1 3’末端起1个RAR1032MBA4 1 3’末端起3个RAR1033MBA1 2 3’末端扩增

扩增反应在100μl反应体系中进行，含有如下反应物：

100拷贝的HIV模板RNA

50mM N-[三(羟甲基)甲基]苷氨酸(Tricine)PH 8.33；

110mM K OAc；

300μM dATP、dCTP、dGTP(每一)；

50μM dTTP；

500μM dUTP；

50μM引物(每一)；

3.5mM Mn(OAc)₂；

13％甘油；

20单位Z05 DNA聚合酶^*；和

2.0/单位 UNG^** ^*见美国专利号5,455,170^**由Hoffmann-La Roch生产制造，Perkin Elmer出售，Norwalk，CT.

扩增温度周期性变化，在TC480DNA热循环仪，(PerkinElmer，Norwalk，CT)上按如下温度设计进行：

反应前孵育 45℃ 4分钟

反转录 60℃ 20分钟

46个循环：变性 94℃ 45秒钟

退火/延伸 60℃ 45秒种

最后延伸 60℃ 7分钟

反应后保存 10℃直到分析时(较短时间)扩增产物检测

用如下凝胶电泳法检测扩增产物：用琼脂糖凝胶(100ml的3％Nusieve和0.5％Seachem)和1×TBE(0.089Mtris，0.089M硼酸，0.0025M的EDTA二钠)电泳缓冲液分级反应产物。加入溴化乙锭(0.5g/ml)使DNA染色。100伏电泳约1小时。用紫外放射仪观测溴化乙锭染色的DNA条带。结果

凝胶电泳分析结果见图1，泳道号相对应于用未修饰和修饰合并的引物扩增的结果见下表。对应于HIV产物的条带在图中用箭头标出了。凝胶上其他的条带对应于非特异扩增产物，特别是引物二聚体。引物泳道号Upstrcam DownstreamRAR1032MB RAR1033MB 1RAR1032MBA1 RAR1033MB 2RAR1032MBA2 RAR1033MB 3RAR1032MBA4 RAR1033MB 4RAR1032MB RAR1033MBA1 5RAR1032MBA1 RAR1033MBA1 6RAR1032MBA2 RAR1033MBA1 7RAR1032MBA4 RAR1033MBA1 8

由于引物二聚体的形成与目的扩增产物的形成相竞争，减少引物二聚体会相应增加目的产物产生的数量。因此，通过比较用修饰和未修饰引物扩增形成的二聚体以及目的产物的量可以看出修饰引物的作用。

将用两个非修饰引物(泳道1)扩增结果与用单个3′-修饰的引物(泳道2和5)和用两个3′-修饰引物(泳道6)扩增结果比较，可以看出用一个或两个修饰引物扩增减少了引物二聚体的形成。在用单个3′-修饰的引物扩增中，修饰哪条引物对降低引物二聚体的效果差别不大。用两条修饰引物扩增(泳道6)可使引物二聚体最大程度的降低以及目的片段量显著的增加。

比较6-8泳道可见修饰核苷酸位置的影响。用邻近3′末端核苷酸修饰的引物产生的引物二聚体的降低(泳道7)与用3′末端核苷酸修饰的引物产生的效果(泳道6)相同，而用3′末端上游3个碱基处核苷酸修饰的引物(泳道8)取得的成效较小。

实施例6

用修饰引物进一步扩增-

修饰核苷酸的位置影响

为了进一步说明修饰引物对引物二聚体形成的影响，对用修饰和未修饰引物扩增HCV RNA的效果进行了比较，如上所示。用三种只在修饰碱基部位有所不同的修饰下游引物进行扩增反应。目的核酸

HCV RNA模板是用HCV RNA转录载体按Yong等，1993，J.Clin.Microbiol.31(4)：882-886的方法合成的。引物

用修饰的和未修饰的引物分别进行扩增，未修饰引物的核苷酸序列如下所示，方向为5′到3′。上游引物ST280A(SEQ ID NO：3)和下游引物ST778AA(SEQ lD NO：4)扩增了一条HCV基因组中5′非翻译区的含240个碱基的产物。

HCV扩增引物引物 Seq ID.No：核苷酸序列ST280A 3 GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAST778AA 4 GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA

以上引物设计是针对非修饰引物的，修饰引物按实施例l合成，与未修饰引物具有相同的核苷酸序列，但在3′末端或在3′末端上游1个或3个核苷酸位置上含有一苄基化的腺苷，引物的修饰形式如下所示：

修饰的HCV扩增引物引物 Sep ID No. 修饰核苷酸位置ST280ABAl 3 3′末端ST778AABAl 4 3′末端ST778AABA2 4 3′末端起1个ST778AABA4 4 3′末端起3个扩增和分析

扩增按实施例3进行，但用100个拷贝的HCV RNA模板。扩增产物按实施例3进行凝胶分析。结果

凝胶电泳分析结果见图2。泳道号对应于用未修饰和修饰引物进行的扩增见下表。对应于目的HCV产物的条带在图中已用箭头标出。凝胶中其他的条带对应于非特异扩增产物，特别是引物二聚体。

引物泳道号上游下游ST280A ST778AA 1ST280A ST778AABAl 2ST280A ST778AABA2 3ST280ABA ST778AABA4 4ST280ABAl ST778AA 5ST280ABAl ST778AABAl 6ST280ABAl ST778AABA2 7ST280ABAl ST778AABA4 8

由于引物二聚体的形成竞争目的扩增产物，引物二聚体的减少通常会伴随目的产物量的增加。因此可以通过比较用修饰引物扩增相对于用非修饰引物扩增产生的引物二聚体的量观察到，以及通过比较用两者扩增产生的目的片段的量观察到用修饰引物的效果。

得到的结果与前例中HCV扩增结果相同。但在HCV扩增中，目的产物的增加比HIV扩增更明显。比较用两个未修饰引物扩增的结果(泳道1)与用单个3′-修饰引物扩增的结果(泳道2和5)以及用两个3′修饰的引物扩增结果(泳道6)显示，用一个或两个修饰引物扩增可以降低引物二聚体。应用两个修饰引物(泳道6)会使引物二聚体最大程度地减少并且能使扩增目的序列的量显著增加。如上例所示，用单个3′修饰引物扩增时，将哪条引物修饰对引物二聚体的降低差别不大。

通过比较泳道6-8可见修饰核苷酸位置的影响。用3′-末端核苷酸(泳道6)、邻近3′-末端核苷酸(泳道7)以及3′-末端上游3个碱基的核苷酸(泳道8)修饰的引物扩增结果基本一致。这表明修饰基团可以与引物3′末端的四个核苷酸中任一个相连。

实施例7

用修饰的引物扩增-修饰基团的作用

为了进一步说明修饰引物对引物二聚体形成的影响以及为了说明引物的变更修饰作用，比较了用修饰引物和未修饰引物扩增HCV RNA的情况，其中引物是通过加入三个不同修饰基：苄基、甲基、硝基苄基中之一来修饰的。

用两种不同的方法分析扩增结果。第一种方法是用凝胶电泳法分析反应产物，检测引物二聚体。第二种方法是通过用上文中动力PCR的方法检测引物二聚体的形成。目的核酸

HCV RNA是用HCVRNA转录载体按Young等，1993，(J.Clill.Microbiol)临床微生物杂志3l(4)：882-886的方法合成的。扩增引物

用未修饰的和修饰的二种引物进行扩增，修饰引物与未修饰引物含有相同的核苷酸序列，但在3′末端腺苷处加一甲基、苄基或硝基苄基团进行修饰。引物合成按前面一些实施例所述，引物设计如下：引物 Seq ID.No. 3′碱基的修饰ST280A 3 未修饰ST280AMEAl 3 甲基ST280ABAl 3 苄基ST280ANBAl 3 硝基苄基ST778AA 4 未修饰ST778AAMEA 4 甲基ST778AABA1 4 苄基ST778AANBA1 4 硝基苄基扩增反应

用含下列试剂的100μl反应体积进行扩增：0，20，或200拷贝的HCVRNA模板50mM Tricine，PH 8.3；110mM K OAc；3.5mM Mn(OAc)₂；300μM dATP、dCTP、dGTP(每一)；50μM dTTP；500μM dUTP；250nM每一引物；20单位rTth^*2单位 UNG^*13％甘油^*由Hoffnann-La Roche生产，Perkin Elmer Norwalk，CT.出售。

每一反应混合物的热循环是在GeneAmp PCR体系9600热循环仪(Perkin Elmer，Norwalk，CT)按如下程序进行的：

反应前孵育 45℃ 4分钟

反转录 60℃ 24分钟

46个循环变性 94℃ 30秒钟

退火/延伸 60℃ 30秒种

最后延伸 60℃ 7分钟

反应后保存 4℃扩增产物检测A.凝胶电泳法

扩增产物用凝胶电泳法按如下步骤检测：用琼脂糖凝胶(100ml的3％Nusieve，0.5％Seachem，0.5ug/ml，溴化乙锭)和1×TBE(0.089 MTris，0.089M硼酸，0.0025M乙二胺四乙酸二钠)电泳缓冲液分级反应产物。100伏电泳大约1小时，用紫外放射仪观察溴化乙锭染色的DNA条带。B.用动力PCR检测

按上文所述的动力PCR法，将嵌入染料(如溴化乙锭，当其嵌入双链DNA中时会增加荧光度)加入PCR中，通过测量反应过程中染料的荧光度来监测扩增过程中双链DNA的增加。因动力PCR法测量的只是双链DNA总量的增加，所以无法测知非特异扩增产物的形成情况。为了检测来自非模板依赖的引物二聚体的非特异扩增，不加模板核酸进行扩增。在无模板的反应中，所有双链DNA的增加都来自非模板依赖的非特异扩增产物的形成。

动力PCR反应条件如上文所述，但溴化乙锭是按1g/mg的浓度加入到反应混合物中的。通过EP640,828的方法测量反应混合物荧光度来检测反应的情况。

通过除以反应早期的循环过程中测得的初始荧光度使荧光度测量法标准化，并在循环间连续测量荧光度。初始荧光度测量的循环数在各反应中相同，以使所有测量的增加都对应于相同的反应循环。不含目的片段的扩增的反应荧光度直到引物二聚体形成时才有变化。多数反应中，若扩增循环足够，最终可测得引物二聚体。修饰引物的作用可通过比较引物二聚体开始出现的循环次数观察到。结果

凝胶电泳分析结果见图三。泳道数对应于用未修饰的和三种修饰的引物以及200拷贝、20拷贝、或0拷贝的HCVRNA扩增的情况见下表。(泳道数从左向右数，1-30是凝胶的上半，31-60泳道是凝胶的下半)。此外，分子量标记见泳道1和31(HaeIII消化的phjX 174 RF DNA，NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)以及30和60泳道(从高到低，20bp梯，GenSura，DelMar，CA)。对应于目的特异产物的条带在图中已用箭头标出(～230bp)。凝胶中其他条带对应于非特异扩增产物特别是引物二聚体。

图3所示的扩增结果泳道号模板引物泳道号200 未修饰 2-5200 甲基修饰 6-9200 苄基修饰 10-13200 硝基甲苯修饰 14-1720 未修饰 18-2120 甲基修饰 22-2520 苄基修饰 26-2920 硝基甲苯修饰 32-350 未修饰 36-410 甲基修饰 42-470 苄基修饰 48-530 硝基甲苯修饰 54-59

结果显示用修饰引物扩增比用未修饰引物扩增产生的HCV核酸量大。而且相对于未修饰的引物，用修饰引物扩增可降低引物二聚体。

动力PCR检测法中，在整个反应过程中都监测荧光度。通过观测荧光度对应于循环次数(本文未示)的曲线形状，可检测到的荧光度增加后其增加率在所有反应中几乎相同。这表明修饰引物不明显阻滞扩增开始后每个扩增步骤的效率。在可测知的荧光度增加之前所进行的循环数，各反应有显著不同。

为定量反应中的差异，用荧光度超过专有荧光水平(AFL)时的扩增循环数来表示结果。AFL选自接近基底荧光水平，但高于测量的荧光度的随机波动以使能在扩增的几何增长期测量反应动力学。后面循环中扩增产物的积累会阻碍反应进行并最终达到反应平台期。

下表概括了动力PCR的结果，除了用苄基化的引物和20拷贝的目的片段进行的扩增代表4次平均值外，其他每个扩增20或200拷贝的目的模板的值代表5次重复扩增的平均值。无模板的扩增值代表了8次重复的平均值。

用苄基化的引物进行的8次无目的片段存在的扩增中有两次在46个循环末没有产生引物二聚体。剩余的6次扩增的平均值代表引物二聚体形成的平均条件。由于是删除数据，所以此条件平均值不能与其他值比较。

达到AFL的循环数

目的片段拷贝数引物 0 20 200未修饰 35 36 34甲基 39 38 36硝基苄基 43 40 37苄基 (43^*) 41 37^*2/8表示无引物二聚体形成

该数据表明修饰引物明显延缓了目的核酸的扩增以致拖后几个循环才达到AFL。该延缓不会造成特异扩增产物的终产量减少。所有的目的核酸的扩增都在本实验中46个循环内达到平台期，而且由相应的凝胶电泳分析数据表明用修饰引物会提高终产量。

该数据表明引物二聚体形成的延缓显著大于目的扩增的延缓。比较无目的片段的扩增和200拷贝模板的扩增可明显看到该引物的优点。用未修饰的引物，在无目的的片段的扩增中只需1个循环后就使荧光度增加到AFL水平，这表明目的片段的扩增很难与引物二聚体的形成区分开。相反，用修饰引物，由于引物二聚体造成的荧光度增加至少在3个循环之后，应用苄基化的引物，该增加若发生的话，也在6个循环以后。因此，可以测到目的片段扩增，并能与引物二聚体的形成分开。

比较无目的片段的扩增和20拷贝模板的扩增，修饰引物的作用显示对引物二聚体产生的延缓大于目的扩增的延缓。用未修饰的引物，20拷贝的模板不能被检测到。用硝基苄基化和甲基化引物，引物二聚体形成明显延缓以致能在该体系中检测到20拷贝的模板。

每一扩增循环的荧光度检测数据(本文未示)表明引物二聚体形成的延缓一般足以阻止46个循环内引物二聚体达到平台期。因此，修饰引物明显延缓引物二聚体的延伸以致目的片段的扩增能完全，并使反应在引物二聚体显著形成以前停止。

实施例8

光敏引物

为说明光敏修饰引物的应用，用修饰引物和未修饰引物扩增HCVRNA。修饰引物用一个或两个硝基苄基结合到3’-末端腺嘌呤的环外胺上进行修饰。扩增引物

引物按实施例4合成，该引物的设计如下：引物 Seq ID.No. 3′碱基修饰ST280A 3 未修饰15239 3 双硝基苄基15241 3 单硝基苄基ST778AA 4 未修饰15240 4 双硝基苄基15242 4 单硝基苄基扩增反应

对每一对引物对，都用系列稀释的加入目的片段浓度进行反应。共进行两组反应，各包括所有的引物对和加入的目的片段浓度，每组反应中重复进行给定的引物对和目的片段浓度的反应。用含有下列试剂的100μl反应体积进行扩增。

0，10，10²，10³，10⁴'或10⁵拷贝的HCV RNA模板

55mM Tricine，

90mM KOAc，

3mM Mn(OAc)₂。

200μM dATP、dCTP、dGTP(每一)，

200μM dUTP，

250nM 每一引物，

10单位rTth^*，

2单位 UNG^*，和

8％甘油^*由Hoffmann-La Roche生产，Perkin Elmer Norwalk，CT出售。

每一反应混合物的热循环在GeneAmp PCR体系9600热循环仪(PerkinElmer，Norwalk，CT)上按如下温度程序进行：

反应前孵育 50℃ 5分钟

反转录 60℃ 30分钟

起始变性 95℃ 1分钟

2个循环变性 95℃ 15秒钟

退火/延伸 60℃ 20秒种46个循环变性 90℃ 15秒钟

退火/延伸 60℃ 20秒种最后延伸 72℃ 10分钟

整个反应中使用磨口盖的反应管(Perkin Elmer，Norwalk，CT)。当反转录这一步的反应温度升至60度反转录后，从热反应块中的PCR盘中除去热盖。反应管的一半(重复反应的完整部分)用铝箔覆盖，另一半用320nm波长的手提式紫外灯(UVP型号UVM-57，UVP产品，San Gabriel，CA)照射十分钟，重新放上热盖继续扩增。结果

用凝胶电泳法按上文所述分析扩增结果。结果见图4。在每一反应中所用的引物和模板拷贝数在凝胶上显示(显示拷贝数的对数)。对应于目的产物的条带在图中已标出。凝胶中的其它条带对应于非特异扩增产物，特别是引物二聚体。

比较紫外线照射一组反应显示，用修饰的引物能使引物二聚体显著减少，特别是拷贝数低。

比较无照射的一组反应显示，应用二硝基苄基化引物会完全阻滞扩增，结果与预期的一致。用单硝基苄基化的引物进行的扩增不仅可以形成产物也能使引物二聚体显著减少，这与前例中的结果一致。

实施例9

用对叔-丁基苄基团修饰的引物扩增

本实施例描述了用对-叔丁基苄基团修饰的引物进行的扩增。目的核酸

HCV RNA模板用HCV RNA转录载体，按Young等，1993，临床微生物学杂志(J.Cli.Microbiol.31(4)：882-886法合成。引物

用实施例2中方法合成的修饰引物进行扩增。未修饰引物的核酸序列如下所示，方向为5’-3’。所用引物是修饰的上游引物ST280A(SEQ ID NO：3)和下游引物ST778AA(SEQ ID NO：4)，修饰形式见下：

修饰的HCV扩增引物引物 Seq ID.No. 修饰核苷酸的位置ST280ATBU 3 3′末端ST778AATBU 4 3′末端扩增并分析

用含下列成份的100μl反应体积进行扩增：

20，5，2.5，2，或0拷贝的HIV RNA模板

50mM Tricine，PH 8.33

110mM K(OAc)

300μM dATP、dCTP、及dGTP，每种，

50μM dTTP

500μM dUTP

50nM 每一引物

3.5mM Mn(OAc)₂

13％甘油

20单位rTth DNA聚合酶

8.0单位 UNG^* ^*由Hoffmann-La Roche生产，Perkin Elmer Norwalk，CT出售。

扩增温度循环是在TC 480 DNA热循环仪(Perkin Elmer，Norwalk，CT)按如下温度程序进行的：

反应前孵育 45℃ 12分钟

UNG灭活 90℃ 30秒钟

反转录 60℃ 20分钟

47个循环变性 94℃ 45秒钟

退火/延伸 60℃ 70秒种

最后延伸 60℃ 7分钟

反应后保存 10℃至到分析(短期内)

扩增产物按上文所述的凝胶电泳法分析。结果

每一目的模板的扩增按如下所述重复进行：用20个拷贝的目的模板扩增3次，用5个拷贝的模板扩增3次，用2.5拷贝的目的模板扩增2次，用2拷贝的目的模板扩增1次，在不含目的片段时扩增23次。所有的模板扩增都在凝胶上产生一预期大小的单条带。扩增均未产生引物二聚体或其它的非特异扩增产物。

本结果可与实施例6比较，两例均用相同的引物序列扩增相同的HCV。通过与实施例6比较发现用对-叔-丁基苄基修饰的引物进行的扩增相对于用未修饰的引物进行的扩增结果有明显改善。

另一实验是用上面实施例5中对-叔-丁基苄基修饰的引物扩增HIV-1RNA，扩增基本按上述方法进行，与本文中的HCV体系相同，所有的HIV-1模板正扩增都在凝胶上见到一预期大小的单条带，扩增均未产生引物二聚体或其它的非特异扩增产物。

本结果可与实施例5比较，两例均用相同的引物扩增相同的HCV目的片段。通过比较发现用对-叔-丁基苄基修饰的引物进行的扩增相对于用未修饰的引物进行的扩增结果有明显改善。

实施例10

分枝杆菌DNA的扩增

本实施例讲述了用未修饰的和修饰的引物扩增分枝杆菌DNA的效果比较。应用在3’末端核苷酸上加上一苄基修饰的引物和用在3’末端核苷酸上加上一对-叔-丁基苄基修饰的引物。用未修饰的引物进行的反应基本按Tevere等，1996，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)34(4)：918-923的方法进行。用将已知浓度的分枝杆菌DNA加入到唾液样品中而模拟的临床感染模型进行扩增，同时用纯化的分枝杆菌DNA和不含DNA的阴性对照样本进行扩增。样品准备

将通过显微镜检测和培养显示是分枝杆菌阴性的唾液样品液化并用CDC(Kent和Kubica，1985，分枝杆菌公共卫生学-三级实验室指南，美国健康和人群服务系，疾病控制中心，Atlanta，包含在本文参考文献中)推荐的N-乙酰半胱氨酸氢氧化钠法液化和消毒。将液化的唾液(100μl)加到500μl呼吸Specimen洗液(10mMTris盐酸，1mM乙二胺四乙酸，1％(体积比)Triton X-100，0.05％NaN₃，PH8.0)中，12,500×g离心10分钟。将沉淀重悬在100μl裂解液(0.05NNaOH，1％(体积比)Triton X-100，1mM乙二胺四乙酸，0.05％NaN₃)中，60℃孵育45分钟。用100μl中和剂(0.2MTris-HCl，8mM氯化镁，0.05％NaN₃，PH7.5)中和裂解液。

将各80ul的两种唾液裂解液混合制成混合裂解液。在每8份混合裂解液(各160ul)中加入由培养的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)纯化的DNA原样(每微升含2拷贝，存在于1∶1的裂解液和中和液组成的混合液中)。

将10ul的DNA原样加到100μl1∶1的裂解液和中和剂的混合液中制备已知浓度的纯化分枝杆菌DNA的样品(不含唾液)。

阴性对照样品(不含DNA)是100ul裂解液和100ul中和剂的混合物。扩增引物

用含下列核酸序列的引物进行扩增：引物序列KY18(SEQ ID NO：5) 5’-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3’KY436(SEQ ID NO：6) 5’-TAACACATGCAAGTCGAACGGAAA-3’KY75(SEQ ID NO：7) 5’-GCCCGTATCGCCCGCACGCTCACA-3’

用以下包含连接在3’末端碱基的修饰基团的引物对进行扩增。所有的修饰引物按前面的实施例所示合成，所有的引物都在5’末端生物素化。引物对引物序列修饰A KY18(SEQ ID NO：5) 未修饰

KY75(SEQ ID NO：7) 未修饰B KY436(SEQ ID NO：6) 苄基

KY75(SEQ ID NO：7) 苄基C KY436(SEQ ID NO：6) 对-叔-丁基苄基

KY75(SEQ ID NO：7) 对-叔-丁基苄基扩增

每一样品都用未修饰的引物对KY18(5)和KY75(7)以及引物对KY436(6)和KY75(7)的修饰形式进行扩增。

扩增反应在各含50μl的上述三种样品之一和50ul的2x反应混合物的100μl反应体积中进行，反应混合物包括以下试剂：

100mM Tris-HCl，pH8.9；

500nM引物；

各200μM dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dUTP)

20％(体积比)甘油

10单位Amp Taq ^*

6单位 AmpErase^* ^*由Hoffmann-La Roche生产，Perkin Elmer Norwalk，CT，出售。

每一反应混合物的热循环在GeneAmp PCR体系9600热循环仪(PerkinElmer，Norwalk，CT)上按如下温度程序进行：反应前孵育 50℃ 5分钟2个循环变性 98℃ 20秒钟

退火 62℃ 20秒种

延伸 72℃ 45秒种41个循环变性 94℃ 20秒钟

退火 62℃ 20秒种

延伸 72℃ 45秒种最后延伸 72℃ 约12小时(过夜)

扩增产物用电泳法通过2％Nusiev^，0.5％的琼脂糖凝胶显现，然后用溴化乙锭染色。结果

电泳分析结果见图5。对每一样品的用未修饰的引物(“A”)和用修饰引物(“B”、“C”)的扩增产物在相邻的泳道进行电泳。对应于分枝杆菌目的序列的条带已用箭头标出。其它条带对应于非特异扩增产物。凝胶最下面的条带是引物二聚体，标有“M”的泳道含有分子量标记(HaeIII消化的PHiX174DNA)。

用未修饰的引物扩增纯化的分枝杆菌DNA都产生引物二聚体，修饰引物对的应用增加了目的片段的量并基本消除了可测量的引物二聚体的形成。

与纯化的DNA扩增相反，用未修饰的引物，扩增的反应中唾液裂解液的存在降低了扩增效率，而且增加了非特异产物的形成，表示形成外来产物条带。考虑到唾液裂解液中含有显著数量的人类DNA，所以非特异扩增产物的增加并不奇怪，但该非特异产物不存在于纯化的分枝杆菌DNA扩增中。在唾液存在时进行的扩增中应用两种修饰引物对均可以显著增加目的产物的量，并均能显著降低非特异扩增。

实施例11

其他苄基修饰引物的合成

通过苄基加到末端胞嘧啶上而修饰的引物，其合成方法基本上如实施例1所述，但用的是如下制备的连接N⁴-乙酰基，N⁴-苄基-5′-O-DMT-2′脱氧胞苷的LCAA-CPG。

步骤1：N⁴-苄基-2′-脱氧胞苷的合成

将苄基胺(20ml)加到2′-脱氧胞苷盐酸(5.28g，20mmol，U.S.BiochemicalCorp.，Cleveland，OH)中，并将该混合物在氩气下150℃加热3小时。真空浓缩溶液，得到粘性黄色油，将其在水(100ml)与乙酸乙酯(100ml)之间分配。水相用乙酸乙酯洗涤并分离。真空浓缩该水相后得到黄色的浆(13g)，通过硅胶柱色谱提纯(用15∶1的二氯甲烷∶甲醇作为洗脱液)，得到所需的产物(58g，91.5％)，一种无色的浆。

步骤2：N⁴-乙酰基，N⁴-苄基-2′脱氧胞苷的合成

将N⁴-苄基-2′脱氧胞苷(2.5mg，7.9mmol)溶于15ml干燥的二甲基甲酰胺中，加入乙酸酐(8g，79mmol，10当量)，混合物在室温下搅拌过夜。真空除去溶剂和过量的乙酸酐。产物通过硅酸胶柱色谱提纯(用20∶1的二氯甲烷∶甲醇作为洗脱液)，得到标题化合物(1.3g，48％)。该化合物是高收湿的，将其在-20℃下干燥贮存。

步骤3：N⁴-乙酰基，N⁴-苄基，5′-O-DMT-2′-脱氧胞苷的合成

将N⁴-乙酰基，N⁴-苄基-2′-脱氧胞苷(76mg，0.2mmol)溶于1ml干燥的吡啶中，加入DMT-Cl(122mg，0.2mmol，1.0当量)。将该反应混合物搅拌3小时。经TLC分析表明有些原料已反应除去，所以再加上述一半量的DMT-Cl(61mg，0.5当量)并再将所得的混合物搅拌一直到用TLC分析显示出反应完成为止。用15ml盐水使该反应停止，水相用二氯甲烷(3×15ml)萃取。合并的有机层用盐水(2×15ml)洗涤后用无水硫酸镁干燥。蒸去溶剂并将该混合物通过硅酸胶色谱提纯(用50∶1的二氯甲烷∶甲醇)，得到N⁴-乙酰基，N⁴-苄基，5′-O-DMT-2′-脱氧胞苷(96mg，65％产率)。

步骤4：琥珀酰化

将N⁴-乙酰基，N⁴-苄基，5′-O-DMT-2′-脱氧胞苷(96mg，0.13mmol)溶解在2ml的干吡啶中。加琥珀酸酐(100mg，1.0mmol)和二甲基氨基吡啶(20mg)，所得混合物在室温下搅拌三天。蒸去溶剂后残留物用甲苯(3×10ml)共沸。加氯仿(50ml)使该残留物溶解(用超声法帮助溶解)。用盐水(3×15ml)洗氯仿层，再用水(3×15ml)洗。有机层用无水硫酸镁干燥。蒸去溶剂得到108mg纯的N⁴-乙酰基，N⁴-苄基，5′-O-DMT-2′-脱氧胞苷-3′-O-琥珀酸(97％产率)。

步骤5：连接5′- O-DMT-N⁴-乙酰基，N⁴-苄基2′-脱氧胞苷-3′-O-琥珀酸的LCAA-CPG的制备

活化的CPG制备如下：将LCAA-CPG(1.0g，LCA00500C，CPG Inc.，FairField，NJ)用三氯乙酸在二氯甲烷中的溶液(3％，10ml)处理并在旋转式蒸发器上(旋转式蒸发器，Buchi，Flawil，Switgerland)(无真空)旋转混合4小时。滤出溶剂，CPG依次用9∶1的三乙胺∶乙基二异丙基胺(3×5ml)，二氯甲烷(3×10ml)，及乙醚(3×10ml)洗涤，然后真空干燥。

修饰过的核苷中间体与酸洗过的CPG之间的偶联按如下方法进行。在1g活化的LCAA-CPG中加入上面制备的N⁴-乙酰基，N⁴-苄基，5′-O-DMT-2′脱氧胞苷-3′-O-琥珀酸(108mg，0.13mmol)，二甲基氨基吡啶(20mg)，和5ml干吡啶。反应混合物在旋转蒸发器(无真空)旋转三天。滤出上清液，偶联后的LCAA-CPG相继用吡啶(3×5ml)，二氯甲烷(3×10ml)，和乙醚(3×10ml)洗涤，然后真空干燥。

连接有N⁴-乙酰基，N⁴-苄基，5′- O-DMT-2′-脱氧胞苷-3’琥珀酸按以下方法进行封端。在衍生的CPG中加入封端用的混合试剂A(THF/二甲基吡啶/Ac₂O8∶1∶1，Glen Research DNA合成试剂，Sterling，VA)和B(10％N-甲基咪唑在THF中的溶液，Glen Research)，将该反应混合物在旋转蒸发器上(无真空)旋转过夜。滤出溶液，偶联的LCAA-CPG相继用吡啶(3×5ml)，二氯甲烷(3×10ml)，THF(3×10ml)，及乙醚(3×10ml)洗涤，然后真空干燥。

衍生的LCAA-CPG通过用3％三氯乙酸的二氯甲烷溶液对5mg该产品进行处理来测定其偶联能力，并通过UV光谱测定析出的二甲基三苯甲基碳离子的量。测得连接LCAA-CPG的核苷衍生物的量为19.5μmol/g。

序列表(1)一般信息：

(i)申请人：

(A)姓名：F.HOFFMANN-LAROCHEAG

(B)街道：Grenzacherstrasse124

(C)城市：Basle

(D)洲： BS

(E)国家：Switzerland

F)邮编：(ZIP)：CH-4070

(G)电话：061-688 2511

(H)传真：061-688 13 95

(I)电报：962292/665542 hlr ch

(ii)发明名称：修饰的引物

(iii)序列数：7

(iv)机读形式：

(A)媒介类型：软盘

(B)计算机：Apple Macintosh

(C)操作系统：System 7.1(Mactintosh)

(D)软件：Word 5.1

(v)在先申请资料：

申请号：60-041127

申请日：20.03.97(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GAATGAGACA CCAGGAATTAGATATCAGTA CAA(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：CCCTAAATCA GATCCTACAT ATAAGTCATC CA(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：GCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGTTA(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GCAAGCACCC TATCAGGCAG TACCACAA(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CACATGCAAG TCGAACGGAA AGG(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：TAACACATGC AAGTCGAACG GAAA(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：GCCCGTATCG CCCGCACGCT CACA

Claims

1.一种寡核苷酸，具有以下一般结构：

其中S₁代表长度为大约5至大约50个核苷酸的第一核苷酸序列；

其中S₂代表长度为1至3个核苷酸的第二序列；

其中R代表一修饰物基团，其中R通过环外胺与N共价结合，并且该R具有以下结构：

其中R₁和R₂各自代表氢、C₁-C₁₀烷基、烷氧基、苯基、苯氧基、取代的苯基、萘基、或取代的萘基。

2.权利要求1的寡核苷酸，其中R是2-萘基甲基；苄基；或取代的苄基。

3.权利要求1或2的寡核苷酸，其中R是取代的苄基，具有以下结构：

其中R₃代表C₁-C₆支链或直链烷基、甲氧基、或硝基。

4.权利要求1-3中任一项的寡核苷酸，其中R₃代表C₁-C₄支链或直链烷基、甲氧基、或硝基。

5.权利要求3或4的寡核苷酸，其中R₃连接在对位。

6.权利要求1-5中任一项的寡核苷酸，其中N是腺苷。

7.权利要求1-6中任一项的寡核苷酸，其中R选自苄基、对甲基苄基、对叔丁基苄基、对甲氧基苄基、邻硝基苄基、及2-萘基甲基。

8.一种扩增核酸目的序列的方法，所述方法包括用至少一种按权利要求1-7中任一项的寡核苷酸进行扩增反应。

9.权利要求8的方法，该方法是聚合酶链反应。

10.一种进行核酸扩增反应的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1-7中任一项的寡核苷酸。

11.实质上如前面所述的新的寡核苷酸、方法和试剂盒。