CN119403824A

CN119403824A - 单链胰岛素及其Fc缀合物

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Publication number: CN119403824A
Application number: CN202380048737.8A
Authority: CN
Inventors: T·勃姆; O·博什宁; W·迪特里希; M·H·科恩; T·兰格; J·里德尔; G·蒂瓦里; U·沃纳
Original assignee: Sanofi Aventis France
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 2022-06-23
Filing date: 2023-06-21
Publication date: 2025-02-07
Also published as: EP4543909A1; WO2023247640A1; TW202417519A

Abstract

本文提供了包含单链胰岛素和Fc区多肽的胰岛素‑Fc融合多肽。进一步提供了两个胰岛素‑Fc融合多肽的缀合物，其中这两个胰岛素‑Fc融合多肽通过在融合多肽的C末端处的至少一个共价键连接。还提供了对胰岛素受体的结合亲和力降低的单链胰岛素。进一步提供了该胰岛素‑Fc融合多肽、该缀合物或该单链胰岛素在药物中的用途。

Description

单链胰岛素及其Fc缀合物

技术领域

本文提供了包含单链胰岛素和Fc区多肽的胰岛素-Fc融合多肽。进一步提供了两个胰岛素-Fc融合多肽的缀合物，其中这两个胰岛素-Fc融合多肽通过在融合多肽的C末端处的至少一个共价键连接。还提供了对胰岛素受体的结合亲和力降低的单链胰岛素。进一步提供了该胰岛素-Fc融合多肽、该缀合物或该单链胰岛素在药物中的用途。

背景技术

糖尿病(DM)是由胰岛素缺乏、胰岛素抵抗或两者引起的慢性代谢疾病。存在两种主要类型的DM，称为1型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)。在T1DM中，产生胰岛素的胰岛β细胞已被免疫系统破坏，因此T1DM可被认为是自身免疫疾病。其结果是，T1DM患者不能产生胰岛素并且绝对依赖于施用胰岛素。T2DM是一种复杂的代谢疾病，可能需要数年时间的发展。T2DM主要与其他健康问题有关，例如肥胖、非酒精性脂肪肝病和高血压。不同病症的组合也称为代谢综合征。在T2DM中，胰腺仍能够产生胰岛素，但是胰岛素水平可能随着疾病的进展而下降(Sapra和Bhandari2020；Godoy-Matos等人,2020)。

胰岛素的主要生理学功能是调节血糖。血糖水平由胰腺中的β细胞感测，当达到一定阈值时，胰岛素就会分泌在循环中。处于循环中的胰岛素导致血液中的葡萄糖被摄取，主要进入肝脏、肌肉和脂肪组织中。胰岛素的不存在或胰岛素抵抗会导致血糖水平升高(高血糖症)，当在较长时间段内未得到治疗时，会导致微血管系统和大血管系统中的异常，最终引起器官功能障碍。最容易受到微血管系统和大血管系统影响的是肾、眼睛、神经和心脏(Kahn等人,2014；Taylor等人,2021)。

胰岛素受体(IR)是由两个细胞外α亚基和两个跨膜β亚基组成的异四聚体。α亚基和β亚基通过二硫键连接。在细胞内位点内存在酪氨酸激酶结构域。在胰岛素结合后，IR二聚化并且使细胞内酪氨酸激酶结构域紧密接近，这允许自磷酸化和细胞内信号传导级联启动。在人中存在两种IR同种型，称为IR-A和IR-B。这些同种型之间的差异是IR-B同种型中存在A亚基的C末端12个氨基酸的延伸。两种IR同种型在其表达模式以及针对胰岛素与胰岛素样生长因子1和2(IGF1和IGF2)的结合参数方面均不同。例如，IR-A相比IR-B对胰岛素和IGF2具有更高的亲和力。IR-A和IR-B之间也存在生理学差异。IR-B主要在胰岛素靶组织中以高水平表达，并且被认为介导代谢效应和细胞生长，而IR-A被认为促进细胞增殖(Belfiore等人,2017)。

胰岛素样生长因子(IGF)具有跟胰岛素相似的结构。它们的生物学功能是诱导生长或细胞分化。IGF的信号传导由IGF-1受体介导，该IGF-1受体也具有与胰岛素受体相似的结构。由于配体和受体在结构上相似，IGF1和IGF2实际上可以结合并激活IR，尽管是在较高浓度下。胰岛素可以相同的方式结合并激活IGF-1受体。这些信号传导途径之间的串扰由于IGF-1R和IR形成功能性异二聚体的可能性而进一步缠绕(Denley等人,2007；Hakuno等人,2018)。

胰岛素被胰腺中的β细胞合成为前激素原。信号序列引导胰岛素分泌到内质网(ER)的内腔中。在分泌过程中，信号序列被切割。所得胰岛素原由三个部分组成：N末端B链、连接肽(C肽)和C末端A链(Dodson和Steiner1998)。在细胞内转运期间，胰岛素原被进一步加工。C肽被切除，并且B链处的两个C末端精氨酸残基被切掉(Steiner 2011)。成熟胰岛素由通过两个二硫键连接的两条链(A链和B链)构成。

与成熟胰岛素相比，胰岛素原是单链蛋白。胰岛素原能够折叠成三维结构，尽管C肽以及与A链和B链的接合点是柔性的(Yang等人,2010)。胰岛素原在细胞测定中具有生物活性(Jehle等人,1996)，并且在人血液中是稳定的(Bright等人,2017)。有证据表明，胰岛素原在胚胎发育期间也具有生理学作用(Hernández-Sánchez等人,2006)。

单链胰岛素(scI)是胰岛素变体，其中胰岛素B链和胰岛素A链通过短肽接头连接。此类变体可以重组方式容易地产生，并且取决于接头的长度和序列，仍然具有活性。可替代地，胰岛素a链和b链可以通过化学接头连接。scI优于天然胰岛素的优点是其稳定性有改进(Hua等人,1998；Glidden等人,2018)。这些特征使得单链胰岛素具有像替代性的胰岛素替代物一样的吸引力。

胰岛素替代疗法的目标是模拟天然胰岛素分泌曲线。对于人胰岛素，作用的起效在施用后约30min，并且作用可以持续超过5hr。如果在下午施用，这些特性可能导致夜间低血糖；因此，敦促患者在就寝时间吃些小吃食，以避免低血糖。为了允许更精确地控制胰岛素作用，已经开发了具有不同药代动力学特性的不同胰岛素配制品和胰岛素类似物。可以将胰岛素类似物分类为速效、短效、中效或长效。速效和短效胰岛素类似物(例如赖脯胰岛素、门冬胰岛素、谷赖胰岛素)可以在餐前不久或甚至餐后施用。使用长效或基础胰岛素类似物(例如地特胰岛素、德谷胰岛素、甘精胰岛素)，可以实现更扁平且持久的胰岛素曲线。长效胰岛素类似物具有高达24hr的作用时间。结果表明，使用长效胰岛素可以显著降低夜间低血糖的风险(Sharma等人,2019；Mathieu 2021)。仅需要每周一次施用基础胰岛素类似物，即依柯胰岛素(insulin icodec)，就与每日施用甘精胰岛素在降低血糖水平方面一样有效(Rosenstock等人,2020)。此类超长效胰岛素类似物需要较低频率的注射，并且因此可以帮助改进患者的生活质量。

基于该结构，可以将长效胰岛素类似物分为两组：具有改变的氨基酸序列的胰岛素(例如甘精胰岛素)和具有化学修饰的胰岛素类似物(例如地特胰岛素)。对于长效胰岛素类似物，作用模式可以是不同的。与天然胰岛素相比，甘精胰岛素的等电点移位。其结果是，甘精胰岛素在施用后沉淀并且从此贮库缓慢释放到血流中。地特胰岛素用能够结合白蛋白的14碳脂肪酸乙酰化。人白蛋白具有约20天的长血浆半衰期。回收机制是此长半衰期的原因。潜在的回收机制使用与免疫球蛋白G(IgG)类抗体所使用的回收机制相同的途径，这些抗体的血浆半衰期也为约20天。白蛋白和IgG两者均使用基于新生儿Fc受体的回收机制(Sand等人,2015)。

IgG经由Fc结构域结合FcRn。在肽或蛋白质与Fc结构域融合或缀合后，可以实现相应Fc融合蛋白的延长血浆半衰期，并且若干Fc融合蛋白已经进入药物市场(Rath等人,2015)。

IgG是多功能蛋白。抗体的正常功能是在抗原结合后唤起体液和细胞免疫系统。虽然抗原被Fab结构域结合，但抗体的效应子功能由Fc结构域介导。介导IgG的生理学功能的受体被称为Fc-γ受体(FcyR)。与FcyR结合激活所谓的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)应答(Bruhns和2015)。抗体的另一种效应子功能由蛋白C1q介导。C1q属于称为补体系统的防御机制。在C1q与抗体结合时，触发蛋白水解级联，即补体级联。此级联最终引起所谓的膜攻击复合物的组装，该膜攻击复合物穿过靶细胞的膜。此免疫防御机制也被称为补体依赖性细胞毒性(CDC)(West等人,2018)。

对于许多治疗性抗体，例如用于治疗癌症的治疗性抗体，效应子功能是实现治疗目标所必需的。实际上，增加这种抗体的效力可以通过Fc工程来实现，以增强抗体与FcyR或C1q的结合。Fc结构域在位置N297处被糖基化。此位点的糖基化是引发完全效应子功能所必需的(Wang等人,2018)。另一方面，许多治疗性抗体和Fc融合蛋白被设计成结合特异性靶标或捕获不想要的过量存在的信使(像促炎细胞因子)。在这些情况下，Fc介导的效应子功能是不希望的；尤其是在长时间段内施用Fc融合蛋白的情况。

对于Fc融合蛋白，通常不旨在损害与FcRn的结合。与此相反，Fc结构域的效应子功能的降低在某些情况下是令人希望的。已经描述了Fc结构域内的若干点突变，以降低效应子功能。糖基化位点也属于这些位点，因为去糖基化抗体或Fc融合蛋白表现出降低的效应子功能。对于Fc融合蛋白，可以通过在细菌(例如大肠杆菌(E.coli))中表达蛋白质来获得去糖基化蛋白质。然而，去糖基化变体可能表现出降低的溶解度或稳定性(Schlothauer等人,2016；Jacobsen等人,2017；Dumet等人,2019)。

WO 2016/178905 A1披露了包含通过使用肽接头与人IgG Fc区融合的胰岛素受体激动剂的融合蛋白，以及此类融合蛋白在治疗糖尿病中的用途。

对如下超长效胰岛素类似物仍然存在需要，这些胰岛素类似物需要较低频率的注射并且因此可以帮助改进糖尿病患者的生活质量。

在本文所述的研究中，将突变引入胰岛素B链和A链中的某些位置处，以生成与人胰岛素相比对人胰岛素受体的结合亲和力降低的单链胰岛素类似物。不受理论的束缚，假设对胰岛素受体的亲和力降低对于超长效胰岛素而言是有益的，因为这将降低与胰岛素受体结合的胰岛素衍生物的清除率。由于寻求激活IR-A受体来负责胰岛素的促有丝分裂特性，因此产生了与野生型胰岛素相比对IR-A的活性降低比对IR-B的活性降低更多的变体。测试处于单链胰岛素Fc融合多肽的形式的胰岛素。这些序列提供于实例部分的表A中。受体活化的结果示于实例部分的表1中。与IR-B相比，对IR-A的活性降低且有超长活性的此类胰岛素的实例是INS009(SEQ ID NO:10)、INS011(SEQ ID NO:12)、INS013(SEQ ID NO:14)和INS018(SEQ ID NO:19)。这些融合物中存在的单链胰岛素类似物具有如SEQ ID NO:50(INS009)、SEQ ID NO:52(INS011)、SEQ ID NO:53(INS014)和SEQ ID NO:58(INS018)中所示的氨基酸序列。

在本文所述的研究中，生成的单链胰岛素类似物与IgG Fc结构域融合。由于胰岛素的施用通常在长时间段内发生，因此选取了无效应子Fc结构域。在所选的无效应子Fc结构域中，存在于Fc区的N末端处的铰链结构域缺失。铰链结构域的缺失降低了效应子功能，因为负责抗体效应子功能的FcγR与C1q的结合位点部分地位于抗体铰链区中，而FcRn与蛋白A的结合位点位于Fc区的更C末端的部分中。因此，铰链区的去除消除了抗体效应子功能而不损害所希望的Fc功能。此外，本发明的两个C末端共价键克服了对普通无铰链抗体变体观察到的限制(受损的FcRn结合、降低的稳定性)。

SEQ ID NO:34显示了其中铰链区缺失的无效应子IgG1 Fc区的氨基酸序列。然而，铰链区(SEQ ID NO:41)经由接头肽(GGGGSA，SEQ ID NO:42)与Fc区的C末端融合。通过将铰链序列融合至C末端来实现两条Fc链的共价连接。有利地，如果抗体铰链区的序列位于Fc部分的C末端，则也形成链间二硫键。由于抗体铰链区的序列可以衍生自人内源抗体铰链区，因此可以避免使用外源序列，这降低了抗药物抗体(ADA)形成的风险。

将单链胰岛素与Fc结构域连接的接头序列(图8中的接头2)衍生自C肽，存在于天然胰岛素原中。C肽是30个氨基酸长的肽(SEQ ID NO:31)，主要由小的且亲水的氨基酸组成。它在血液中是稳定的并且可能对胰岛素具有伴侣样作用(Landreh等人2013)。溶液中的C肽没有完全折叠，也并不具有随机结构(Munte等人,2005)。由小的且亲水的氨基酸组成、在血液中是稳定的并且在结构上是柔性的预先确定了一种或多种C肽，该一种或多种C肽衍生自用作接头的C肽。为了进一步增加第二接头的序列中小的亲水的氨基酸的量，使来自SEQ ID NO:31的氨基酸Leu26Ala27Leu28缺失并且将Gly放置在N末端处，得到SEQ ID NO:29的接头序列。因此，生成的接头例如用于被指定为INS003至INS025的构建体中(参见表A)。

出人意料地，同其中胰岛素变体与常用的沉默IgG Fc骨架融合的蛋白质构建体相比，胰岛素变体与无效应子Fc结构域的组合导致超长作用模式。这由具有如SEQ ID NO:50中所示的序列的单链胰岛素变体所例示。当与铰链缺失的无效应子Fc结构域(SEQ ID NO:10，INS009)融合时，观察到与INS024(SEQ ID NO:25)相比更加长的血糖降低作用(参见图4和7，以及实例部分中的表2)。INS009(SEQ ID NO:10)在小型猪模型中的血糖降低活性持续至少216hr，这比在小型猪中血糖降低活性具有高达120hr的作用时间的INS024(SEQ ID NO 25)的情况长得多。INS024在正常位置具有铰链。

在小型猪模型中同样针对变体INS013(SEQ ID NO:14)和INS011(SEQID NO:12)观察到非常长的血糖降低活性，作用时间长达216hr(INS013，SEQ ID NO:14)(图4)和264hr(INS011，SEQ ID NO:12)(实例部分中的图5和表2)。

向胰岛素序列中引入的突变、连接胰岛素A链与B链的肽(图8中的接头2)以及连接胰岛素与Fc结构域的接头序列积聚成在大鼠模型(高达168hr的作用时间)和小型猪模型(高达264hr的作用时间[INS011[SEQ ID NO:12]))中具有超长作用的稳定胰岛素衍生物。此外，在食蟹猴中测得长达69hr的血浆半衰期(参见表3和图11)。

发明内容

本文提供了对胰岛素受体的亲和力降低的胰岛素类似物，如实例部分的表B中所示的胰岛素类似物。进一步提供了包含单链胰岛素(scI)的超长效胰岛素类似物，该单链胰岛素与Fc结构域融合，有利地与没有N末端铰链区的IgG Fc结构域融合。可以在不需要进一步化学修饰的情况下以重组方式产生scI-Fc融合蛋白。

第一方面：胰岛素类似物

本文提供了包含胰岛素B链和胰岛素A链的胰岛素类似物，其中该胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPKT(SEQ ID NO:73)或由其组成，并且该胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ ID NO:74)或由其组成。

进一步提供了包含胰岛素B链和胰岛素A链的胰岛素类似物，其中该胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFAYTPKT(SEQ ID NO:70)或由其组成，并且该胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ ID NO:74)或由其组成。

进一步提供了包含胰岛素B链和胰岛素A链的胰岛素类似物，其中该胰岛素B链包含氨基酸序列FVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFHYTPKT(SEQ ID NO:71)或由其组成，并且该胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLSQLEDYCG(SEQ ID NO:75)或由其组成。

进一步提供了包含胰岛素B链和胰岛素A链的胰岛素类似物，其中该胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPKT(SEQ ID NO:73)或由其组成，并且该胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLSQLEDYCG(SEQ ID NO:75)或由其组成。

进一步提供了包含胰岛素B链和胰岛素A链的胰岛素类似物，其中该胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO:65)或由其组成，并且其中该胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ ID NO:74)或由其组成。

进一步提供了包含胰岛素B链和胰岛素A链的胰岛素类似物，其中该胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFAYTDKT(SEQ ID NO:66)或由其组成，并且其中该胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ ID NO:74)或由其组成。

进一步提供了包含胰岛素B链和胰岛素A链的胰岛素类似物，其中该胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFAYTDKT(SEQ ID NO:67)或由其组成，并且其中该胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ ID NO:74)或由其组成。

典型地，胰岛素类似物作为单链胰岛素提供。在单链胰岛素中，胰岛素B链典型地经由第一接头肽连接到胰岛素A链。

第二方面：胰岛素-Fc融合多肽以及两个胰岛素-Fc融合多肽的缀合物

进一步提供了胰岛素-Fc融合多肽，该胰岛素-Fc融合多肽从N末端至C末端包含：胰岛素和Fc区多肽(本文也称为“Fc区”)。

典型地，存在于融合蛋白中的胰岛素是与人胰岛素相比对人胰岛素受体的结合亲和力降低的胰岛素类似物。在实施例中，胰岛素是单链胰岛素，如本文提供的单链胰岛素(参见例如表B)。

典型地，单链胰岛素经由第二接头肽连接到Fc区多肽。

因此，所述胰岛素-Fc融合多肽典型地从N末端至C末端包含：

a)胰岛素B链，

b)第一接头肽，

c)胰岛素A链，

d)第二接头肽，以及

e)Fc区多肽。

在一些实施例中，该胰岛素-Fc融合多肽进一步包含

f)第三接头肽，

g)C末端肽。

所述C末端肽应允许在两个胰岛素-Fc融合多肽之间形成至少两个共价键，从而稳定本文提供的缀合物。

典型地，该C末端肽包含允许在缀合物中存在的两个胰岛素-Fc融合多肽之间形成至少两个二硫键的至少两个半胱氨酸残基。

在实施例中，该C末端肽包含抗体铰链区的氨基酸序列(或高度相似的序列)，该抗体铰链区的氨基酸序列包含允许在两个胰岛素-Fc融合多肽之间形成至少两个二硫键的至少两个半胱氨酸残基。

在一些实施例中，该C末端肽包含如SEQ ID NO:36、39、40或41中所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施例中，该Fc区多肽包含IgG、IgM、IgA、IgD或IgE抗体的恒定文档的恒定结构域。

在一些实施例中，该Fc区多肽包含IgG抗体(如IgG1抗体或IgG4抗体)的抗体重链的恒定结构域CH2和CH3。

在一些实施例中，该Fc区多肽包含以下或由以下组成：

a)如SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列，或

b)与SEQ ID NO:34至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的氨基酸序列。

有利地，该Fc区多肽在N末端处缺少抗体铰链区。因此，这两个胰岛素-Fc融合多肽典型地未通过每个Fc区多肽的N末端之间的一个或多个二硫键共价连接。

在一些实施例中，该胰岛素-Fc融合多肽包含如SEQ ID NO:2至25以及77和78的任一个中所示的序列。这些序列示于实例部分的表A中。

在一些实施例中，该胰岛素-Fc融合多肽包含如SEQ ID NO:4(内部名称：“INS003”，参见表A)中所示的序列。

在一些实施例中，该胰岛素-Fc融合多肽包含如SEQ ID NO:5(INS004)中所示的序列。

在一些实施例中，该胰岛素-Fc融合多肽包含如SEQ ID NO:6(INS005)中所示的序列。

在一些实施例中，该胰岛素-Fc融合多肽包含如SEQ ID NO:7(INS006)中所示的序列。

在一些实施例中，该胰岛素-Fc融合多肽包含如SEQ ID NO:10(INS009)中所示的序列，

在一些实施例中，该胰岛素-Fc融合多肽包含如SEQ ID NO:12(INS011)中所示的序列，

在一些实施例中，该胰岛素-Fc融合多肽包含如SEQ ID NO:14(INS013)中所示的序列，

在一些实施例中，该胰岛素-Fc融合多肽包含如SEQ ID NO:19(INS018)中所示的序列。

在一些实施例中，该胰岛素-Fc融合多肽包含如SEQ ID NO:77中所示的序列。

在一些实施例中，该胰岛素-Fc融合多肽包含如SEQ ID NO:78中所示的序列。

本文进一步提供了包含本文提供的至少两个胰岛素-Fc融合多肽的胰岛素-Fc缀合物，其中这些胰岛素-Fc融合多肽中的每一个从N末端至C末端包含：胰岛素(如本文提供的单链胰岛素)和Fc区多肽。

典型地，该缀合物是本文提供的两个胰岛素-Fc融合多肽的同源二聚体。因此，两个胰合多肽典型地具有相同的序列，即它们是相同的。

在所提供的胰岛素-Fc缀合物的一个实施例中，所述胰岛素是与人胰岛素相比对人胰岛素受体的结合亲和力降低的胰岛素类似物。典型地，该胰岛素是本文提供的胰岛素(参见例如表B)，如本文提供的单链胰岛素。

典型地，该缀合物是两个胰岛素-Fc融合多肽的缀合物，其中这两个胰岛素-Fc融合多肽通过在该融合多肽的C末端处的至少两个共价键连接。因此，这两个融合多肽通过位于该Fc区多肽的C末端处的至少两个共价键连接。

在实施例中，至少两个共价键位于每个融合多肽上的CH2、CH3和CH4结构域的C末端。

在替代性实施例中，至少两个共价键位于每个融合多肽上CH2和CH3结构域的C末端。

典型地，这些共价键是二硫键。

典型地，所述两个胰岛素-Fc融合多肽未通过每个Fc区多肽的N末端之间的一个或多个二硫键共价连接。

典型地，第一胰岛素-Fc融合多肽和第二胰岛素Fc融合多肽各自在C末端包含C末端肽，其中所述C末端肽包含允许在第一融合多肽和第二融合多肽之间形成两个二硫键的至少两个半胱氨酸残基。典型地，所述C末端肽包含抗体铰链区的氨基酸序列(或高度相似的序列)。

其他方面

进一步提供了编码本文提供的单链胰岛素或本文提供的胰岛素-Fc融合多肽的多核苷酸。

进一步提供了宿主细胞，该宿主细胞包含本文提供的胰岛素-Fc缀合物、本文提供的单链胰岛素、或提供的胰岛素-Fc融合多肽、和/或本文提供的多核苷酸。

进一步提供了产生本文提供的胰岛素-Fc缀合物、本文提供的单链胰岛素、或本文提供的胰岛素-Fc融合多肽的方法，该方法包括在允许表达该单链胰岛素或该胰岛素-Fc融合多肽的条件下孵育本文提供的宿主细胞。该胰岛素-Fc融合多肽的表达可导致形成如本文定义的胰岛素-Fc缀合物。

进一步提供了药物组合物，该药物组合物包含药学有效量的本文提供的胰岛素-Fc缀合物、本文提供的单链胰岛素、或本文提供的胰岛素-Fc融合多肽。

进一步提供了本文提供的胰岛素-Fc缀合物、本文提供的胰岛素(如本文提供的单链胰岛素)、或本文提供的胰岛素-Fc融合多肽，用于作为药物使用。

进一步提供了本文提供的胰岛素-Fc缀合物、本文提供的胰岛素(如本文提供的单链胰岛素)或本文提供的胰岛素-Fc融合多肽，用于作为用于治疗选自由妊娠糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病和高血糖组成的组的疾病和/或用于降低血糖水平的药物使用。

附图说明

图1在血糖正常大鼠中INS007(SEQ ID NO:8)的药效动力学活性(血糖降低活性)分析。观察到血糖降低活性持续至少168hr。

图2在血糖正常大鼠中INS009(SEQ ID NO:10)和INS013(SEQ ID NO:14)的药效动力学活性(血糖降低活性)分析。观察到血糖降低活性持续至少144hr(INS013，SEQ ID NO:14)和至少168hr(INS009，SEQ ID NO:10)。

图3在血糖正常大鼠中INS011(SEQ ID NO:12)、INS018(SEQ ID NO:19)和INS019(SEQ ID NO:20)的药效动力学活性(血糖降低活性)分析。观察到血糖降低活性持续至少144hr(INS018[SEQ ID NO:19]、INS019[SEQ ID NO:20])和至少168hr(INS011，SEQ ID NO:12)。

图4在健康雌性小型猪中，在血糖正常Goettingen小型猪中INS007(SEQ ID NO:08)、INS009(SEQ ID NO:10)和INS013(SEQ ID NO:14)的药效动力学活性(血糖降低活性)分析。对于所有变体，观察到血糖降低活性持续至少216hr。变体INS009(SEQID NO:10)的单链胰岛素与INS024(SEQ ID NO:25)中的相同(参见图7)。这两种变体之间的差异是Fc结构域的架构。在INS009(SEQ ID NO:10)中，单链胰岛素(SEQ ID NO:50)与Fc结构域(SEQ ID NO:34)融合，该Fc结构域在N末端处缺少铰链，在C末端含有接头序列(SEQ IDNO:42)和铰链序列(SEQ ID NO:41)。

图5在血糖正常Goettingen小型猪中INS011(SEQ ID NO:12)的药效动力学活性(血糖降低活性)分析。观察到血糖降低活性持续至少264hr。

图6在血糖正常Goettingen小型猪中INS019(SEQ ID NO:20)和INS020(SEQ IDNO:21)的药效动力学活性(血糖降低活性)分析。对于两种变体，都观察到血糖降低活性持续至少192hr。

图7在血糖正常Goettingen小型猪中的药效动力学活性(血糖降低活性)分析。该单链胰岛素变体是与INS009(SEQ ID NO:10)中相同的单链胰岛素变体(参见图4)。唯一的差异是所使用的Fc结构域的结构。在INS024(SEQ ID NO:25)中，单链胰岛素(SEQ ID NO:50)经由接头序列(SEQ ID NO:29)与IgG1-Fc结构域(SEQ ID NO:37)的铰链结构域融合。观察到血液降低活性持续至少120hr。

图8本文提供的胰岛素-Fc融合蛋白的示意图。A)胰岛素B链用接头1与胰岛素A链连接。该单链胰岛素经由接头2与缺少铰链区的IgG Fc结构域连接。铰链区重新定位到Fc结构域的C末端。两条Fc链经由C末端铰链中的二硫桥连接。B)与IgG的铰链区融合的单链胰岛素的示意性结构。两条Fc蛋白链经由N末端铰链中的二硫桥连接。

图9在血糖正常大鼠中INS011(SEQ ID NO:10)和INS026(SEQ ID NO:78)降低血糖的时程。观察到血糖降低活性持续至少180hr(INS011)和至少168hr(INS026)。在两种构建体中，Fc结构域(SEQ ID NO:29)和Fc结构域(SEQ ID NO:34)的接头序列与C末端“铰链”序列SEQ ID NO:42和SEQ ID 41相同。

图10在血糖正常大鼠中INS007(SEQ ID NO:6)和INS027(SEQ ID NO:79)降低血糖的时程。对于两种变体，都观察到血糖降低活性持续至少168hr。

图11在向雄性食蟹猴皮下施用1nmol/kg单剂量后，INS009(SEQ ID NO:10)、INS011(SEQ ID NO:12)和INS013(SEQ ID NO:14)的平均值+SD血浆浓度。

图12单链胰岛素-Fc融合多肽INS009(SEQ ID NO:10)的序列。该融合多肽从N末端至C末端包含：

a)胰岛素B链(SFVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPKT(SEQ ID NO:73))，

b)第一接头肽(GSYPGGV，SEQ ID NO:26)，

c)胰岛素A链(GIVEQCCTSICSLEQLENYCG，SEQ ID NO:74)，

d)第二接头(GEAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPEGSLQ，SEQ ID NO:29)，

e)没有处于正常位置的铰链的IgG区(斜体，SEQ ID NO:34)，

f)第三接头肽(GGGGSA，SEQ ID NO:42)，

g)C末端肽，抗体铰链区的氨基酸序列包含两个半胱氨酸残基(SEQ ID NO:41，ESKYGPPCPPCPA)。

两个单链胰岛素-Fc融合多肽经由在C末端铰链区中存在的两个半胱氨酸残基之间形成两个二硫键而形成胰岛素Fc缀合物(参见图8A)。

定义

如在本说明书和所附权利要求书中所使用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物。

如本文所用，术语“包含/包括”应被解释为指定所提及的所述特征、整数、步骤或组成部分的存在，但不排除存在或添加一个或多个特征、整数、步骤或组成部分或其组。因此，例如，包含氨基酸的序列的蛋白质可以包含比实际引用的蛋白质更多的氨基酸，即，被嵌入更大的蛋白质中。

如本文所用，“多肽”是通过肽键共价连接的10个或更多个氨基酸的链。因此，术语“多肽”可以代表多链蛋白的链，不论此类链的长度如何。在一些实施例中，多肽是多链蛋白的链。

如本文所用，“接头”或“接头肽”是连接分子的两个区域的短且柔性的氨基酸序列。例如，接头可以将胰岛素的B链与A链连接。此接头在本文中称为“第一接头肽”。此外，接头可以将单链胰岛素与Fc区连接。此接头在本文中称为“第二接头肽”。此外，接头肽可以将包含至少两个链间共价键的分子的Fc区与C末端区连接。此接头在本文中称为“第三接头肽”。

如本文所用，表述“胰岛素类似物”是指具有如下分子结构的肽，该分子结构形式上可衍生自天然存在的胰岛素(本文也称为“亲本胰岛素”，例如人胰岛素)的结构。

如本文所用，表述“亲本胰岛素”是指天然存在的胰岛素，即指未突变的野生型胰岛素。在一些实施例中，亲本胰岛素是动物胰岛素，如哺乳动物胰岛素。例如，亲本胰岛素可以是人胰岛素、猪胰岛素或牛胰岛素。典型地，亲本胰岛素是人胰岛素。

人胰岛素B链包含以下序列：

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO:32)

人胰岛素的A链包含以下序列：

GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO:33)

在实施例中，本文提供的胰岛素类似物或本文提供的胰岛素-Fc融合多肽所包含的胰岛素类似物是单链胰岛素。单链胰岛素是如下的单多肽链，其中胰岛素B链经由连接肽(本文称为第一接头肽)与胰岛素A链连续地连接。

典型地，相对于亲本胰岛素，本文提供的胰岛素类似物或本文提供的胰岛素-Fc融合多肽所包含的胰岛素类似物包含至少一个突变(氨基酸取代、缺失或增添)。如本文所用，术语“至少一个”意指一个或多于一个，如“至少两个”、“至少三个”、“至少四个”、“至少五个”等。在一些实施例中，本文提供的胰岛素类似物包含B链中的至少一个突变和A链中的至少一个突变。在另一实施例中，本文提供的胰岛素类似物包含B链中的至少两个突变和A链中的至少一个突变。

典型地，本文提供的胰岛素类似物或本文提供的胰岛素-Fc融合多肽所包含的胰岛素类似物包含两条肽链，即A链和B链。典型地，两条链通过半胱氨酸残基之间的二硫桥连接。例如，在至少一个实施例中，人胰岛素类似物包含三个二硫桥：在位置A6和A11处的半胱氨酸之间的一个二硫桥、在A链的位置A7处的半胱氨酸与B链的位置B7处的半胱氨酸之间的一个二硫桥、以及在A链的位置A20处的半胱氨酸与B链的位置B19处的半胱氨酸之间的一个二硫桥。

典型地，本文提供的胰岛素类似物或本文提供的胰岛素-Fc融合多肽所包含的胰岛素类似物的胰岛素受体结合亲和力与相应亲本胰岛素(例如人胰岛素)的胰岛素受体结合亲和力相比降低。因此，胰岛素类似物具有非常低的清除率，即非常低的胰岛素受体介导的清除率。

胰岛素受体可以是任何哺乳动物胰岛素受体，例如牛、猪或人胰岛素受体。在一些实施例中，胰岛素受体是人胰岛素受体，例如人胰岛素受体同种型A或人胰岛素受体同种型B。

典型地，与人胰岛素相比，本文提供的胰岛素类似物或本文提供的胰岛素-Fc融合多肽所包含的胰岛素类似物对人胰岛素受体同种型B的结合亲和力小于25％，如小于15％。在实施例中，与人胰岛素相比，胰岛素类似物对人胰岛素受体同种型B的结合亲和力为10％-25％。

典型地，与人胰岛素相比，本文提供的胰岛素类似物或本文提供的胰岛素-Fc融合多肽所包含的胰岛素类似物对人胰岛素受体同种型a的结合亲和力小于15％，如小于8％。在实施例中，与人胰岛素相比，胰岛素类似物对人胰岛素受体同种型A的结合亲和力为1％-15％，如3％-10％。

用于确定胰岛素类似物对胰岛素受体的结合亲和力的方法是本领域熟知的。例如，胰岛素受体结合亲和力可以通过闪烁邻近测定法来确定，该闪烁邻近测定法基于[125I]-标记的亲本胰岛素(如[125I]-标记的人胰岛素)和(未标记的)胰岛素类似物与胰岛素受体之间的竞争性结合的评估。胰岛素受体可以存在于细胞(例如过表达重组胰岛素受体的CHO(中国仓鼠卵巢)细胞)的膜中。在实施例中，胰岛素受体结合亲和力是如WO2020/120463 A1(关于全部披露内容，将其并入本文)的实例部分中所述确定的。

天然存在的胰岛素或胰岛素类似物与胰岛素受体的结合激活胰岛素信号传导途径。胰岛素受体具有酪氨酸激酶活性。胰岛素与其受体的结合诱导构象变化，该构象变化刺激受体在酪氨酸残基上的自磷酸化。胰岛素受体的自磷酸化刺激了受体的酪氨酸激酶对参与信号转导的细胞内底物的活性。因此，由胰岛素类似物进行的对胰岛素受体的自磷酸化被认为是对由所述缀合物引起的信号转导的量度。在一些实施例中，相对于人胰岛素，本文提供的胰岛素类似物能够诱导10％-25％的人胰岛素受体同种型B自磷酸化，和/或相对于人胰岛素诱导1％-15％的人胰岛素受体同种型A自磷酸化。此外，在一些实施例中，本文提供的胰岛素类似物能够诱导相对于亲本胰岛素(如人胰岛素)3％-7％(如5％-7％)的胰岛素受体自磷酸化。相对于亲本胰岛素的胰岛素受体自磷酸化可以如实例部分中所述来确定。

在本文提供的胰岛素-Fc融合多肽中，胰岛素(如单链胰岛素)应可操作地连接到Fc区多肽。在抗体中，Fc(片段可结晶)区是与被称为Fc受体的细胞表面受体相互作用，从而激活免疫系统的区域。已知IgG的Fc区带有高度保守的N-糖基化位点，该位点对于Fc受体介导的活性是必需的。

存在于本文提供的缀合物中的两个胰岛素-Fc融合多肽形成抗体Fc区。

如本文所用，“Fc区”是由两个多肽的若干恒定重链(CH)免疫球蛋白结构域形成的免疫球蛋白分子的片段。在天然抗体中，Fc区介导与Fc受体和补体系统组分的结合。对于IgG、IgA和IgD，Fc区由两条重链的CH2和CH3恒定结构域形成。对于IgM和IgE，Fc区由两条重链的CH2、CH3和CH4恒定结构域形成。本发明的Fc区可以由与天然抗体的Fc区相同的CH结构域形成，即CH2和CH3结构域或者CH2、CH3和CH4结构域。本发明的Fc区包含CH结构域，这些CH结构域与天然免疫球蛋白的CH结构域相同或衍生自天然免疫球蛋白的CH结构域，例如通过插入一个或若干个点突变。

术语“Fc区多肽”是抗体重链的片段，所述片段包含抗体重链的恒定结构域。因此，Fc区多肽典型地包含IgG、IgM、IgA、IgD或IgE抗体重链的恒定结构域。例如，如果抗体是IgG抗体，则Fc区多肽包含(抗体重链的)CH2和CH3结构域。在实施例中，Fc区多肽包含以下或由以下组成：a)如SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列，或b)与SEQ ID NO:34至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。典型地，两个Fc区多肽在本文提供的缀合物中形成抗体Fc区。

所述Fc区多肽可以包含另外的元件，如第三接头肽，即允许在所述两个胰岛素Fc融合多肽之间形成所述至少两个共价键的C末端肽。然而，典型地，所述Fc区多肽在N末端处缺少抗体铰链区。

如本文所用，术语“铰链区”涉及位于Fc区与Fab区之间的抗体序列的一部分。它提供区段柔性，并且可以稳定抗体分子。可以基于结构数据清楚地定义铰链区，例如IgG1铰链区包含残基221-237(R.Nezlin,“The Immunoglobulins[免疫球蛋白]”,学术出版社(Academic Press),1998,第23-26页)。在IgG抗体中，铰链区包含连接抗体的两条重链的二硫键。IgG1和IgG4包含2个此类二硫键，而IgG2包含4个，并且IgG3包含11个(Liu和May,2012MAbs[单克隆抗体].2012年1-2月；4(1):17-23)。

在本文中，如果区域位于Fc区的N末端，则该区域典型地仅被指定为“铰链区”，如所有天然抗体的情况。如果与铰链区相同或高度相似的氨基酸序列位于Fc区的C末端(如在本发明的分子的一些实施例中的情况)，则将其指定为“包含(抗体)铰链区氨基酸序列的氨基酸序列”等。高度相似意指与抗体铰链区的序列具有至少70％同一性和/或包含抗体铰链区序列的至少7个连续氨基酸。

如本文所用，“共价键”是涉及在原子之间共享电子对的化学键。共价键不同于非共价相互作用，如静电相互作用或疏水作用。

共价键(例如二硫键)“位于(Fc区的)C末端”的指示意指在形成所述Fc区的两个多肽上，参与形成所述共价键的氨基酸残基(例如半胱氨酸残基)位于形成Fc区的多肽的一部分的C末端。

无共价键(例如二硫键)“位于(Fc区的)N末端”的指示意指在形成所述Fc区的两个多肽上，无参与形成此类共价键的氨基酸残基(例如半胱氨酸残基)位于形成Fc区的多肽的一部分的N末端。

关于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并引入空位(如果必要)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。典型地，应用标准参数来确定两个序列的序列同一性的程度。在一些实施例中，在两个序列的整个长度上计算出的序列同一性程度。在一些实施例中，同一性程度是通过在比较窗上比较两个最佳比对序列而确定的，其中在与参考序列(其不含增添或缺失)相比时，比较窗中的氨基酸序列的片段可以包含增添或缺失(例如空位或悬突)以进行最佳比对。可以通过以下方法计算百分比：确定在这两个序列中出现相同氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置数，将该匹配位置数除以该比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，从而得到序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可通过Smith和Waterman Add.APL.Math.[应用数学进展]2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的相似性研究方法，通过这些算法的计算机化实现方式(GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA和TFASTA，威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)，遗传学计算机小组(Genetics Computer Group，GCG)，威斯康星州麦迪逊科学街575号(575Science Dr.,Madison,WI))，或者通过目视检查来进行。鉴于已经鉴定了用于比较的两个序列，典型地采用GAP和BESTFIT来确定它们的最佳比对，并且因此确定同一性程度。典型地，使用空位权重5.00和空位权重长度0.30的默认值。在实施例中，使用以下来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比：Needleman和Wunsch算法(Needleman 1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志](48):444-453，其已被并入EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software Suite[欧洲分子生物学开放软件套件],Rice,P.,Longden,I.,和Bleasby,A.,Trends in Genetics[遗传学趋势]16(6),276-277,2000)的尼德尔(needle)程序中)，BLOSUM62评分矩阵，以及空位开放罚分10和空位延伸罚分0.5。使用尼德尔程序比对两个氨基酸序列所用的参数的优选非限制性实例是默认参数，包括EBLOSUM62评分矩阵、空位开放罚分10和空位延伸罚分0.5。

关于两个序列的术语“至少80％相同”意指两个序列具有80％或更高的序列同一性。在一些实施例中，这些序列是至少85％或87％相同的。在一些实施例中，这些序列是至少90％相同的。在一些实施例中，这些序列是至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的。在一些实施例中，这些序列是相同的，即100％相同的。

如本文所用，术语“细胞”或“宿主细胞”是指完整的细胞，即，细胞具有完整的膜，未曾释放其正常细胞内组分(如酶、细胞器或遗传物质)。在某些示例性实施例中，完整的细胞是活细胞，即，能够执行其正常代谢功能的活着的细胞。在某些示例性实施例中，细胞或宿主细胞是可以用外源核酸转染或转化的任何细胞。在某些示例性实施例中，当用外源核酸转染或转化并转移给受者时，该细胞可以在受者中表达该核酸。

术语“细胞”包括原核细胞(如细菌细胞)和真核细胞(如酵母细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞)。合适的细菌细胞包括但不限于来自革兰氏阴性细菌菌株(如大肠杆菌(Escherichia coli)、变形杆菌属(Proteus)和假单胞菌属(Pseudomonas)的菌株)和革兰氏阳性细菌菌株(如芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和乳球菌属(Lactococcus)的菌株)的细胞。合适的真菌细胞包括但不限于来自木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)和曲霉属(Aspergillus)物种的细胞。适合的酵母细胞包括但不限于来自酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)(例如，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、毕赤酵母属(Pichia)(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica))、以及汉逊酵母属(Hansenula)物种的细胞。合适的哺乳动物细胞包括但不限于例如CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、BHK细胞、HeLa细胞、COS细胞、HEK-293等。在一个实施例中，使用HEK-293细胞。在另一个实施例中，使用CHO细胞。然而，也可以使用两栖动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、以及本领域中用于表达异源蛋白的任何其他细胞。在某些示例性实施例中，使用哺乳动物细胞(例如，来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊或灵长类动物的细胞)进行过继转移。

在一些实施例中，宿主细胞包含编码本文提供的胰岛素、融合蛋白或胰岛素-Fc缀合物的多核苷酸，和/或包含所述多核苷酸的载体。典型地，所述载体是表达载体。

细胞或宿主细胞可以是分离的或者是组织或生物体(如“非人生物体”)的一部分。如本文所用，术语“非人生物体”意指包括非人灵长类动物或其他动物，例如哺乳动物，如母牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔或啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠)。在一些实施例中，非人生物体是食蟹猴。

如本文所述的药物组合物典型地包含本文提供的胰岛素或胰岛素-Fc缀合物以及药学上可接受的载剂和/或药学上可接受的赋形剂。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在某些示例性实施例中不与药物组合物的活性剂(即胰岛素或胰岛素-Fc缀合物)的作用相互作用的材料无毒性。

如本文所用，术语“载剂”是指天然或合成性质的有机或无机组分，将活性组分在其中组合以促进、增强或实现应用。典型地，术语“载剂”还包括适合于施用给受试者的一种或多种相容性的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。

用于肠胃外施用的合适载剂物质包括但不限于无菌水、林格氏溶液、乳酸林格氏溶液、生理盐水、抑菌盐水(例如，含有0.9％苯甲醇的盐水)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、汉克氏溶液(Hank’s solution)、聚亚烷基二醇、氢化萘以及特别地生物相容性的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。

如本文所用，术语“赋形剂”旨在包括可以存在于药物组合物中并且不是活性成分的所有物质，如盐、粘合剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露糖醇)、填充剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲物质、调味剂或着色剂。

药物组合物的形式、施用途径、剂量和方案自然取决于患者的待治疗的病症、疾病的严重程度、年龄、体重和性别等。

药物组合物可以被配制用于局部、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下或眼内施用等。在一些实施例中，组合物被配制用于静脉内施用。在一些实施例中，组合物被配制用于皮下施用。

在一些实施例中，药物组合物含有对于能够被肠胃外(如静脉内或皮下)施用的配制品而言药学上可接受的媒介物。这些可以特别是等渗的无菌盐溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或者干燥的、尤其是冷冻干燥的组合物，其在添加无菌水或生理盐水后根据情况，允许构成可注射溶液。

本文描述的胰岛素或胰岛素-Fc缀合物可以经由任何常规途径施用，例如口服、肺部施用(通过吸入)或肠胃外(包括通过注射或输注)。在一些实施例中，使用肠胃外施用，如静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内施用。在一些实施例中，皮下施用本文提供的胰岛素或胰岛素-Fc缀合物。

通常以治疗有效量施用胰岛素或胰岛素-Fc缀合物，或本文所述的药物组合物。术语“治疗有效量”是技术人员所理解的。在一些实施例中，该术语是指单独或与另外的剂量一起实现所希望的治疗反应或所希望的治疗效果、任选地不引起或仅最小程度地引起不可接受或不想要的副作用的量。

典型地，胰岛素类似物的活性是以人胰岛素的单位提供的，该单位是患者胰岛素给药的当前标准。世界卫生组织当前将一个单位的人胰岛素(EP/US/IU)定义为0.0347mg人胰岛素(Burns C,Morris T,Jones B等人World Health Organization.Proposal toInitiate a Project to Evaluate a Candidate International Standard for HumanRecombinant Insulin[世界卫生组织关于发起用以评估人重组胰岛素候选国际标准的项目的提议],WHO/BS/10.2143–工作文件QAS/10.381,2010)。典型地，一个单位的胰岛素类似物在生物学上等同于一个单位的人胰岛素。

在实施例中，本文提供的胰岛素类似物或本文提供的胰岛素-Fc缀合物以对应于200至1500U人胰岛素的量施用，如400U至1000U，如400U、450U、500U、600U、700U、800U、900U、或1000U。

在实施例中，每周一次施用本文提供的胰岛素-Fc缀合物。

例如，本文提供的胰岛素类似物或本文提供的胰岛素-Fc缀合物以0.01-100U/kg体重，如1-20U/kg体重，如1-10U/kg体重的量每周一次施用。

术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。“受试者”或“患者”可以是脊椎动物。该术语包括人和其他动物，特别是哺乳动物和其他生物体。因此，在本文中，受试者可以是动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、雪貂、猫、狗、鸡、羊、牛物种、马、骆驼或灵长类动物。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。在一些实施例中，受试者是灵长类动物。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者是16岁或以上。

在一些实施例中，受试者患有如本文所提及的疾病或障碍。例如，受试者可以是肥胖受试者。在一些实施例中，患者处于罹患如本文所提及的疾病或障碍的风险中。

典型地，术语“疾病或障碍”是指可通过施用胰岛素或胰岛素-Fc缀合物或本文提供的药物组合物来治疗的任何病理或不健康状态，特别是糖尿病(如妊娠糖尿病、1型糖尿病或2型糖尿病)和/或高血糖症。

如本文所用，“糖尿病(Diabetes mellitus)”(也简称为“糖尿病(diabetes)”)是指一组代谢性疾病，其特征在于由胰岛素产生、胰岛素作用或两者的缺陷引起的高水平血糖。在一个实施例中，糖尿病选自由1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病组成的组。目前WHO对糖尿病的诊断标准如下：空腹血浆葡萄糖≥7.0mmol/l(126mg/dL)或2小时血浆葡萄糖≥11.1mmol/l(200mg/dL)。

在一些实施例中，糖尿病是1型糖尿病。如本文所用，“1型糖尿病”是特征在于由完全缺乏胰岛素引起的高血糖水平的病症。这在当身体的免疫系统攻击胰腺中产生胰岛素的β细胞并破坏它们时发生。然后胰腺几乎不产生胰岛素。胰腺的去除或疾病还可能导致产生胰岛素的β细胞的损失。1型糖尿病占糖尿病病例的5％-10％。

在一些实施例中，糖尿病是2型糖尿病。如本文所用，“2型糖尿病”是特征在于尽管可利用胰岛素但葡萄糖产生过量的病症，并且由于葡萄糖清除率不足(胰岛素作用)，循环葡萄糖水平仍然过高。

在一些实施例中，糖尿病是妊娠糖尿病。如本文所用，“妊娠糖尿病”是如下的病症，其中先前没有诊断出糖尿病的妇女在妊娠期间(尤其是在妊娠末三个月期间)表现出高血糖水平。妊娠糖尿病影响3％-10％的妊娠，这取决于所研究的群体。

如本文所用，术语“高血糖症”是指血液中的糖(葡萄糖)过量。

如本文所用，术语“治疗(treating或treatment)”是指向受试者施用化合物或组合物或者化合物或组合物的组合，以：预防、改善或消除受试者的本文所提及的疾病和/或障碍，如糖尿病。因此，该术语涵盖对本文所提及的现有疾病或障碍的治疗，或者对疾病或障碍的预防(prevention)，即预防(prophylaxis)。因此，将认识到，在一些实施例中，本文所提及的治疗可以是预防性的。在一些实施例中，该术语是指对本文所提及的现有疾病或障碍的治疗。因此，受试者患有所述疾病或障碍。

具体实施方式

第一方面：胰岛素

本文提供了包含胰岛素B链和相应的胰岛素A链的胰岛素类似物，如在实例部分中表B所示。胰岛素类似物典型地作为单链胰岛素提供。

本文提供了包含胰岛素B链和胰岛素A链的胰岛素类似物，其中该胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPKT(SEQ ID NO:69)或由其组成，并且该胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ ID NO:74)或由其组成。

进一步提供了包含胰岛素B链和胰岛素A链的胰岛素类似物，该胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPKT(SEQ ID NO:73)或由其组成，并且该胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLSQLEDYCG(SEQ ID NO:75)或由其组成。

典型地，本文提供的胰岛素类似物作为单链胰岛素提供。在单链胰岛素中，胰岛素B链典型地经由第一接头肽连接到胰岛素A链。

因此，所述单链胰岛素从N末端至C末端包含：

a)胰岛素B链，

b)第一接头肽，以及

c)胰岛素A链。

在实施例中，第一接头肽的长度为1至50个氨基酸。在另一个实施例中，第一接头肽的长度为5至15个氨基酸。在另一个实施例中，第一接头肽的长度为5至10个氨基酸。在另一个实施例中，第一接头肽的长度为7个氨基酸。

典型地，第一接头肽包含氨基酸序列EEYPGDV(SEQ ID NO:27)或由其组成。还典型地，第一接头肽包含氨基酸序列GSYPGGV(SEQ ID NO:26)或由其组成。

在实施例中，单链胰岛素包含以下氨基酸序列或由其组成：

SFVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPKTGSYPGGVGIVEQCCTS ICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:50)。

在另一个实施例中，单链胰岛素包含以下氨基酸序列或由其组成：

SFVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFAYTPKTGSYPGGVGIVEQCCT SICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:52)。

FVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFHYTPKTGSYPGGVGIVEQCCTSI CSLSQLEDYCG(SEQ IDNO:53)。

FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPKTGSYPGGVGIVEQCCTSI CSLSQLEDYCG(SEQ IDNO:58)。

SFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTEEYPGDVGIVEQCCTS ICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:45)。

SFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTGSYPGGVGIVEQCCTS ICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:81)。

SFVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFAYTDKTEEYPGDVGIVEQCCT SICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:82)。

SFVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTDKTEEYPGDVGIVEQCCT SICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:47)。

第二方面：胰岛素Fc融合多肽及其缀合物

本文进一步提供了胰岛素-Fc融合多肽，该胰岛素-Fc融合多肽从N末端至C末端包含：胰岛素和Fc区多肽。

还提供了本文提供的两个胰岛素-Fc融合多肽的胰岛素-Fc缀合物。所述两个胰岛素-Fc融合多肽应形成抗体Fc区(经由Fc区)。

典型地，该缀合物是本文提供的两个胰岛素-Fc融合多肽的同源二聚体。因此，这两个胰岛素-Fc融合多肽典型地具有相同的氨基酸序列。

典型地，本文提供的胰岛素-Fc融合多肽所包含的胰岛素是与人胰岛素相比对人胰岛素受体的结合亲和力降低的胰岛素类似物。

典型地，胰岛素-Fc融合多肽从N末端至C末端包含：

a)胰岛素B链，

b)第一接头肽，

c)胰岛素A链，

d)第二接头肽，

e)Fc区(本文也称为Fc区多肽)。

在胰岛素-Fc融合多肽的实施例中，所述胰岛素是单链胰岛素，如实例部分中表B所示的单链胰岛素中的任一种。典型地，所述胰岛素是单链胰岛素，该单链胰岛素从N末端至C末端包含胰岛素B链、第一接头肽和胰岛素A链。

在胰岛素-Fc融合多肽的实施例中，该单链胰岛素包含以下氨基酸序列或由其组成：SFVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPKTGSYPGGVG IVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ ID NO:50)，

SFVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFAYTPKTGSYPGGVGIVEQCCT SICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:52)，

FVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFHYTPKTGSYPGGVGIVEQCCTSI CSLSQLEDYCG(SEQ IDNO:53)，

FVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPKTGSYPGGVGIVEQCCTSI CSLSQLEDYCG(SEQ IDNO:58)，

SFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTEEYPGDVGIVEQCCTS ICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:45)

SFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTGSYPGGVGIVEQCCTS ICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:81)

SFVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFAYTDKTEEYPGDVGIVEQCCT SICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:82)，或

SFVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTDKTEEYPGDVGIVEQCCT SICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:47)

典型地，单链胰岛素经由第二接头肽连接到Fc区多肽。所述第二接头肽典型地长度为1至100个氨基酸，如5至40个氨基酸。在胰岛素-Fc融合多肽的实施例中，第二接头是人胰岛素C肽，或是其片段。

人C肽具有以下氨基酸序列：

EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ(SEQ ID NO:31)。

人C肽的片段是例如，具有如SEQ ID NO:31中所示的序列的人C肽的长度为至少5、10、15、20或22个氨基酸的片段。

在实施例中，C肽中的氨基酸Leu26Ala27Leu28(在上文的SEQ ID NO:31中以粗体指示)在接头中缺失。因此，所述第二接头包含氨基酸序列EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPEGSLQ(SEQ ID NO:8)或由其组成。

可以将一个或多个氨基酸添加至第二接头，如N末端处的甘氨酸残基，以便增加从第二接头到胰岛素的距离。因此，所述第二接头可包含氨基酸序列GEAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPEGSLQ(SEQ ID NO:29)或由其组成。

另外，设想第二接头包含氨基酸序列EAEDLQVGQVELGG(SEQ ID NO:28)或由其组成。

在实施例中，存在于本发明的Fc区多肽中的Fc区是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE抗体的Fc区。因此，Fc区多肽典型地包含重链恒定结构域，如IgG抗体的CH2和CH3。

在实施例中，Fc区是IgG抗体的Fc区。因此，这两个多肽形成IgG抗体的Fc区。例如，Fc区可以是IgG1抗体的Fc区。可替代地，Fc区可以是IgG4抗体的Fc区。

在实施例中，存在于本文提供的融合多肽中的Fc区不包含(即缺少)位于Fc区N末端的抗体铰链区。因此，形成缀合物的两个胰合多肽未通过位于N末端的一个或多个二硫键连接到形成Fc区的每个融合多肽的一部分。

典型地，胰岛素Fc融合多肽通过融合多肽的C末端处的至少两个共价键共价连接。例如，它们通过融合多肽的C末端处的两个共价键共价连接。

表述“在融合多肽的C末端处”涵盖例如融合多肽的20个C末端氨基酸。

在一些实施例中，至少两个共价键位于每个融合多肽上的CH2、CH3和/或CH4结构域的C末端。

在一些实施例中，至少两个共价键位于每个融合多肽上的CH2和/或CH3结构域的C末端。

在一些实施例中，至少两个共价键位于每个多肽上的CH2和CH3结构域的C末端。

典型地，两个或更多个共价键位于形成Fc区的每个融合多肽的一部分的C末端。

在所提供的胰岛素-Fc缀合物的实施例中，共价键是二硫键。此类二硫键可以在两个半胱氨酸残基的硫醇基团之间形成。因此，如本文所提及的胰岛素Fc融合多肽典型地包含至少一个半胱氨酸残基，如两个半胱氨酸残基。在实施例中，一个或多个半胱氨酸残基存在于融合多肽的C末端区内，例如在融合多肽的20个C末端氨基酸内。

典型地，两个融合多肽未通过每个IgG Fc区多肽的N末端之间的一个或多个二硫键共价连接。

典型地，第一胰岛素-Fc融合多肽和第二胰岛素Fc融合多肽各自在C末端包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含允许在第一融合多肽和第二融合多肽之间形成两个二硫键的至少两个半胱氨酸残基(本文也称为“C末端肽”)。在这种情况下，至少两个C末端共价键是此序列内的至少两个二硫键。

C末端肽的长度例如可以为7至20个氨基酸，如10至20个氨基酸。

本文提供的融合多肽(即C末端肽)的C末端处的氨基酸序列可以是天然存在的抗体铰链区的氨基酸序列或与所述序列高度相似的序列，例如IgG1或IgG4抗体的铰链区的序列(或与所述序列高度相似的序列)。

IgG1重链恒定区的氨基酸序列示于SEQ ID NO:35中。此抗体的铰链区可以在此序列的位置99至110处发现，并且具有以下氨基酸序列：EPKSCDKTHTCP(SEQ ID NO:36)。

IgG4重链恒定区的氨基酸序列示于SEQ ID NO:38中。铰链区可以在此序列的位置99至110处发现，并且具有以下氨基酸序列：ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:39)。此外，铰链区可以在此序列的位置99至111处发现，并且具有以下氨基酸序列：ESKYGPPCPSCPA(SEQ ID NO:40)。

因此，存在于C末端的C末端肽可以包含如SEQ ID NO:36、39或40中所示的氨基酸序列或由其组成。

然而，在一些实施例中，存在于C末端的C末端肽与抗体铰链区(即天然存在的抗体铰链区)的序列具有至少70％同一性(即高度相似)。在一些实施例中，该序列与抗体铰链区的序列具有至少75％同一性。在一些实施例中，该序列与抗体铰链区的序列具有至少80％同一性。在一些实施例中，该序列与抗体铰链区的序列具有至少90％同一性。在一些实施例中，该序列包含抗体铰链区的序列的至少7个连续氨基酸。在一些实施例中，该序列包含抗体铰链区的序列的至少10个连续氨基酸。在一些实施例中，该序列包含抗体铰链区的序列的至少15个连续氨基酸。典型地，抗体铰链区包含两个或更多个半胱氨酸残基(以在两个融合多肽之间形成二硫键)。

由于抗体铰链区的序列可以衍生自人内源抗体铰链区，因此可以避免使用外源序列，这降低了抗药物抗体(ADA)形成的风险。

在本文所述的研究中，使用以下肽作为C末端肽ESKYGPPCPPCPA(SEQ ID NO:41)。此肽的序列与天然存在的抗体铰链区高度相似。因此，存在于C末端的C末端肽可以包含如SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列或由其组成。

在一个实施例中，Fc区和C末端区通过第三接头肽连接。所述第三接头典型地长度为1至10个氨基酸，如长度为6个氨基酸。在实施例中，第三接头肽包含如GGGGSA(SEQ IDNO:42)中所示的序列或由其组成。

因此，在一些实施例中，本文提供的胰岛素-Fc融合多肽从N末端至C末端包含：

a)胰岛素B链，

b)第一接头肽，

c)胰岛素A链，

d)第二接头肽，

e)Fc区，

d)第三接头肽，以及

e)C末端肽。

所述C末端肽应允许与另外的胰岛素-Fc融合多肽(典型地为具有相同序列的融合多肽)形成至少两个共价键，即链间共价键。由此，归因于C末端的至少两个链间共价键，形成稳定的二聚体。在一些实施例中，至少两个共价键是至少两个二硫键。在一些实施例中，至少两个共价键是两个二硫键。

典型地，所述C末端肽包含抗体铰链区的氨基酸序列(或是与其高度相似的序列)。在一些实施例中，所述C末端肽具有如SEQ ID NO:36、39、40或41中所示的氨基酸序列。

如上所述，在一些实施例中，Fc区在N末端处缺少抗体铰链区。因此，融合多肽(在本文提供的缀合物内)未通过位于N末端的二硫键连接到形成缀合物的Fc区的每个多肽的一部分。

因此，两个融合多肽形成抗体Fc区，

其中所述两个多肽通过位于C末端的至少两个共价键连接到形成Fc区的每个多肽的一部分，

其中所述两个多肽未通过位于N末端的二硫键连接到形成Fc区的每个多肽的一部分。

在实施例中，缺少抗体铰链区的Fc区包含以下或由以下组成：

a)如SEQ ID NO:34(GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG)中所示的氨基酸序列，或

b)与SEQ ID NO:34至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的序列。

SEQ ID NO:34是人IgG1抗体的Fc区(不具有铰链和C末端Lys)，并且用于表A中描述的许多构建体中。它包括人IgG1的从位置119至329的区域。不包括位置330处的铰链以及C末端Lys。

在另一个实施例中，缺少抗体铰链区的Fc区包含以下或由以下组成：

a)如SEQ ID NO:37中所示的序列，或

b)与SEQ ID NO:37至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的序列。

在一些实施例中，存在于本文提供的融合多肽内的Fc区包含以下氨基酸序列：

在实例部分中使用包括第三接头肽和C末端铰链区的序列。第三接头肽的序列加了下划线。C末端铰链区以粗体突出显示。

GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAESKYGPPCPPCPA(SEQ ID NO:84)。

GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGPPCPPCPA(SEQ ID NO:85)。

其他方面(宿主细胞、多核苷酸、医学用途)

进一步提供了产生本文提供的胰岛素-Fc缀合物、本文提供的单链胰岛素、或本文提供的胰岛素-Fc融合多肽的方法，该方法包括在允许表达该胰岛素-Fc缀合物、该单链胰岛素、或该胰岛素-Fc融合多肽的条件下孵育本文提供的宿主细胞。

实施例

在所提供的缀合物的以下实施例中，披露了融合多肽和胰岛素。上文给出的定义和解释经过适当的修改后适用于以下。

1.一种具有两个胰岛素-Fc融合多肽的胰岛素-Fc缀合物，其中所述两个胰岛素-Fc融合多肽中的每一个从N末端至C末端包含：胰岛素和Fc区多肽。

2.如实施例1所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述两个胰岛素-Fc融合多肽通过在所述融合多肽的C末端处的至少两个共价键连接，例如其中所述至少两个共价键是二硫键。

3.如实施例1或2所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述缀合物是所述两个胰岛素-Fc融合多肽的同源二聚体，和/或其中所述两个胰岛素-Fc融合多肽形成抗体Fc区。

4.如前述实施例中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述胰岛素是单链胰岛素。

5.如前述实施例中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述两个胰岛素-Fc融合多肽中的每一个从N末端至C末端包含：

a)胰岛素B链，

b)第一接头肽，

c)胰岛素A链，

d)第二接头肽，

e)Fc区多肽。

6.如实施例5所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述两个胰岛素-Fc融合多肽中的每一个进一步包含

f)第三接头肽，

g)C末端肽，所述C末端肽允许在所述两个胰岛素-Fc融合多肽之间形成所述至少两个共价键。

7.如实施例6所述的胰岛素-Fc缀合物，其中g)下的所述C末端肽包含允许在所述两个胰岛素-Fc融合多肽之间形成至少两个二硫键的至少两个半胱氨酸残基(如两个半胱氨酸残基)，例如其中所述C末端肽包含抗体铰链区的氨基酸序列(或高度相似的序列)，所述抗体铰链区的氨基酸序列包含允许在所述两个胰岛素-Fc融合多肽之间形成至少两个二硫键的至少两个半胱氨酸残基。

8.如实施例7所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述C末端肽的氨基酸序列包含如SEQID NO:36、39、40或41中所示的氨基酸序列或由其组成。

9.如前述实施例中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述两个胰岛素-Fc融合多肽未通过每个Fc区多肽的N末端之间的一个或多个二硫键共价连接。

10.如前述实施例中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述Fc区多肽在N末端处缺少抗体铰链区。

11.如前述实施例中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述Fc区多肽包含IgG、IgM、IgA、IgD或IgE抗体重链的恒定结构域。

12.如实施例12所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述Fc区多肽包含IgG1抗体或IgG4抗体的抗体重链的恒定结构域CH2和CH3。

13.如前述实施例中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述第一接头肽的长度为1至50个氨基酸，如5至15个氨基酸，如5至10个氨基酸，如7个氨基酸。

14.如实施例13所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述第一接头肽包含氨基酸序列GSYPGGV(SEQ ID NO:26)或EEYPGDV(SEQ ID NO:27)或由其组成。

15.如前述实施例中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述第二接头肽的长度为1至100个氨基酸，如5至40个氨基酸。

16.如实施例15所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述第二接头肽是人胰岛素C肽或其片段。

17.如实施例16所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述第二接头包含SEQ ID NO:28或29中所示的氨基酸序列或由其组成。

18.如前述实施例中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述第三接头的长度为1至10个氨基酸，如长度为6个氨基酸。

19.如实施例18所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述第三接头肽包含如GGGGSA(SEQID NO:42)中所示的氨基酸序列或由其组成。

20.如前述实施例中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述胰岛素是与人胰岛素对人胰岛素受体的结合亲和力相比对所述人胰岛素受体的结合亲和力降低的胰岛素。

21.如前述实施例中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述胰岛素是表B中所示的胰岛素，如表B中所示的单链胰岛素。

22.如实施例21所述的胰岛素-Fc缀合物，其中

i)所述胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPKT(SEQ IDNO:69)或由其组成，并且所述胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:74)或由其组成；

ii)所述胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFAYTPKT(SEQ IDNO:70)或由其组成，并且所述胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:74)或由其组成；

iii)所述胰岛素B链包含氨基酸序列FVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFHYTPKT(SEQ IDNO:71)或由其组成，并且所述胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLSQLEDYCG(SEQ IDNO:75)或由其组成；

iv)所述胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPKT(SEQ IDNO:73)或由其组成，并且所述胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLSQLEDYCG(SEQ IDNO:75)或由其组成；

v)所述胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ IDNO:65)或由其组成，并且所述胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:74)或由其组成；

vi)所述胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFAYTDKT(SEQ IDNO:66)或由其组成，并且所述胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:74)或由其组成；或

vii)所述胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFAYTDKT(SEQ IDNO:67)或由其组成，并且其中所述胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQID NO:74)或由其组成。

23.如实施例21或22所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述胰岛素是包含SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:81、或SEQ ID NO:82中所示的氨基酸序列的单链胰岛素。

24.如前述实施例中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述两个胰岛素-Fc融合多肽中的每一个包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。

25.一种胰岛素，其是根据实施例22或23中胰岛素的定义，如根据实施例23中胰岛素的定义的单链胰岛素。

26.一种胰岛素-Fc融合多肽，其是根据实施例1至24中任一项中胰岛素-Fc融合多肽的定义。

27.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学有效量的如实施例1至24中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物、如实施例25所述的胰岛素、或如实施例26所述的胰岛素-Fc融合多肽。

28.如实施例1至24中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物、如实施例25所述的胰岛素、或如实施例26所述的胰岛素-Fc融合多肽，用于作为药物使用。

29.如实施例1至24中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物、如实施例25所述的胰岛素、或如实施例26所述的胰岛素-Fc融合多肽，用于作为用于治疗选自由妊娠糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病和高血糖组成的组的疾病和/或用于降低血糖水平的药物使用。

30.一种多核苷酸，其编码如实施例25所述的胰岛素或如实施例26所述的胰岛素-Fc融合多肽。

31.一种宿主细胞，其包含如实施例1至24中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物、如实施例25所述的胰岛素、或如实施例26所述的胰岛素-Fc融合多肽、和/或如实施例20所述的多核苷酸。

32.一种产生如实施例1至24中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物、如实施例25所述的胰岛素、或如实施例26所述的胰岛素-Fc融合多肽的方法，所述方法包括在允许表达如实施例1至24中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物、如实施例25所述的胰岛素、或如实施例26所述的胰岛素-Fc融合多肽的条件下，孵育如实施例21所述的宿主细胞。

实例

方法：

蛋白质表达和纯化

将scI-Fc蛋白INS001-INS027(SEQ ID NO:2至25、77至79，还参见表A)与指导蛋白质表达到培养上清液中的前导序列(SEQ ID NO:1)融合。通过瞬时转染在HEK293或CHO细胞中产生scI-Fc蛋白。使用蛋白A(mab select sure，通用电气医疗集团(GE Healthcare))亲和色谱从培养上清液中纯化蛋白质。在蛋白A纯化后，使用在磷酸盐缓冲盐水(PBS，吉博科公司(Gibco))中平衡的凝胶过滤柱(Superdex 200，通用电气医疗集团)进一步纯化scI-Fc蛋白。收集含有所希望的蛋白质的级分，合并浓缩并储存在-80℃下直至进一步使用。

体外胰岛素受体磷酸化测定

使产生的scI-Fc蛋白经受胰岛素受体磷酸化测定。基本上按照Sommerfeld等人(Sommerfeld等人,2010)描述的方案测量受体磷酸化(本文也称为“自磷酸化”)。在细胞Wester技术中，使用表达相应胰岛素受体的CHO细胞。将CHO-IR细胞在含有以下的哈氏F12-营养混合物/GlutaMax培养基(吉博科公司/赛默飞世尔科技公司)中培养：10％(v/v)胎牛血清(PAN-Biotech)、1x非必需氨基酸(吉博科公司/赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisherscientific))以及足够用于选择的抗生素。为了确定胰岛素刺激后的受体磷酸化，将细胞接种到96孔板中并使其生长44h。将细胞用无血清哈氏营养混合物F12培养基血清饥饿2h，并且随后在37℃下用渐增浓度的胰岛素或scI-Fc变体处理20min。孵育后，弃去培养基，并将细胞在3.75％新鲜制备的多聚甲醛中固定20min。将细胞用在PBS(吉博科公司)中的0.1％ Triton X-100透化20min，随后在环境温度下用Odyssey封闭缓冲液(LI-COR生物科学公司)封闭1hr。抗磷酸酪氨酸抗体4G10(密理博公司(Millipore))用作一级抗体。在环境温度下孵育2h后，将细胞用PS+0.1％ Twen 20洗涤3次。添加细胞数目归一化所需的二级抗小鼠IgG G-800-CW和DNA染色剂DRAQ5(细胞信号传导公司(Cell Signaling))并将其孵育1h。将细胞用PBS+0.1％ Tween 20洗涤3次，并且用LI-COR红外成像系统(Odyssey，LI-COR生物科学公司)确定700和800nm下的荧光信号。获得以相对荧光单位(RFU)计的数据。

测试了表A中所示的构建体中存在的单链胰岛素。表B中也显示了单链胰岛素的序列，使用人胰岛素(B链：SEQ ID NO:32，A链：SEQ ID NO:33)作为对照。

体内大鼠PK/PD

基本上如Faust等人(Faust等人,2020)所述收集药效动力学数据。将在研究开始时重320-400g的雄性Sprague-Dawly大鼠(查尔斯河公司(Charles River))随机分配到8个治疗组，使其自由随意获取自来水和食物。将蛋白质溶解于PBS(吉博科公司)中并皮下施用。使用仅PBS作为安慰剂对照。由在指示时间点从尾尖采集的全血确定血糖。将血液用溶血液(haemolysate)(溶血试剂H，葡萄糖己糖激酶流体5+1，亨格勒分析公司(Hengleranalytic))溶血，使用Gluco-quant葡萄糖/己糖激酶试剂盒(罗氏诊断公司(RocheDagnostics))用Beckman Coulter AU640化学分析仪进行定量。

体内小型猪PK/PD

使用健康的雌性小型猪(Ellegaard小型猪)(15-18月龄，体重约20-25kg)评估长效scI-Fc蛋白的药效动力学和药代动力学效应。将动物保持在标准动物房条件下，并且每天喂食一次，随意获取自来水。

对禁食过夜的动物给予含有安慰剂(PBS)或相应的scI-Fc变体的单次皮下注射。经由植入前的中央静脉导管收集血液。在第一次施用之前采集第一血液样品，用作基线。在给定的时间点收集血液(在研究时间中每天1-4次，含有K-EDTA的样品管)，立即储存在冰上，并且在离心后将血浆储存在-80℃直至进一步使用。使用酶UV测试(己糖激酶法)(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))，在Olympus AU680自动分析仪装置(贝克曼库尔特公司)上，由溶血的样品(将5μl毛细血管血添加到250μl溶血试剂(亨格勒分析公司(HenglerAnalytik))中)定量血糖。定期处理所有动物，并且按每天至少两次(治疗日)和每天一次(剩余研究时间)记录临床体征。仔细监测动物的任何低血糖症临床体征，包括行为、皮毛、尿排泄和粪排泄、身体孔口的状况以及任何疾患的体征。在严重低血糖症的情况下，根据需要，提供食物或静脉内(i.v.)施用葡萄糖溶液。

体内cyno PK/PD

对于猴实验，在到达(Nveprim公司，毛里求斯)后使雄性食蟹猴(cynomolgusmonkey/Macaca fascicularis)适应至少4周。每天给动物喂食200gr的NHP-Pellet(Ssniff，德国)，并通过自动饮水器自由获取食物和受控自来水。将动物在大小和物种适合的笼子中分组圈养，空间为260x 200x220cm。在受控环境条件(温度20℃至24℃，相对湿度40％至75％)下，将猴圈养在12h/12的光照/黑暗循环下。在施用化合物之前，动物并未禁食过夜。使用Venoflux微型注入器(23G)iv施用到隐静脉中。注射后，用0.9％NaCl冲洗微型注入器中的剩余溶液。使用26G针直接在肩胛内区域进行sc化合物施用。使用2ml注射器用21G针从隐静脉抽取血液。每天至少一次并且在每个血液收集时间点观察动物。在实验期间，没有观察到副作用。用Accu-Check Active血糖仪(罗氏诊断公司)收集后立即由全血确定葡萄糖浓度。没有观察到低血糖症。

使用LC-MS/MS在血浆中进行scI-Fc检测

将50μL血浆样品用含有IS(500ng/mL)的250μL PBS(磷酸盐缓冲盐水)稀释，并使用MSIA链霉亲和素D.A.R.T.’S吸头在Thermo MSIA^TM平台上免疫富集。用65μL水/乙腈/TFA(66/33/0.4v/v/v)洗脱分析物和胰岛素标准品(IS)。此后，将100μL消化缓冲液(100mM的碳酸氢铵，pH 8.5)、2μL 0.1N氢氧化钠和3μL DDT(在消化缓冲液中的二硫苏糖醇500mM)添加到管中，以在60℃下在ThermoMixer上以500rpm孵育0.5h。将5μL的IAA(在消化缓冲液中碘乙酰胺500mM)添加到管中，混合，并且在室温下在黑暗中在500rpm下放置45min。此后，将2μL DDT(在消化缓冲液中二硫苏糖醇500mM)添加到管中以在室温下以500rpm孵育0.5h。将10μL的在消化缓冲液中的100μg/mL TCPK-胰蛋白酶(赛默公司(Thermo))添加到管中，以在ThermoMixer上在500rpm和37℃消化1.5h。通过添加10μL 10％甲酸水溶液终止反应，混合并通过LC-MS/MS分析。

使用ELISA在血浆中进行scI-Fc检测

将MaxiSorp平底板(能肯公司(Nunc))用1μg/mL的抗His-Tag单克隆抗体(诺瓦根公司(Novagen))在+4℃下涂布过夜，使用PBS/0.05％Tween-20洗涤三次，然后在室温(RT)下用150μL的1％奶粉封闭1小时，并且使用PBS/0.05％ Tween-20洗涤三次。以在PBS/0.05％ Tween-20中1.0μg/mL应用捕获工具，即50μL的重组胰岛素受体(R&D系统公司(R&DSystems))，50μL/孔，并在室温下孵育1小时，同时以600rpm振荡。将板用PBS/0.05％Tween-20洗涤三次。然后将MRD稀释的样品(包括标准品、QC和PK样品)装载到板上，并将板在室温下孵育1.5小时。然后将板用PBS/0.05％ Tween-20洗涤三次，并且施加在PBS/0.05％ Tween-20中的HRP缀合的检测抗体(小鼠抗人IgG-Fc，南方生物技术公司(SouthernBiotech))的1:20000稀释液，100μL/孔，持续1小时，同时以600rpm振荡，以允许检测工具与scI之间的络合。将板用PBS/0.05％ Tween-20洗涤三次，并且然后将板用100μL TMB孵育20分钟，然后添加100μL终止溶液(0.3M HCl)。用Infinity 1000系列Tecan酶标仪获得450nm 下的OD信号。

表1：胰岛素受体磷酸化。

表2在雌性小型猪中选择的scI-Fc变体的药代动力学参数。

雌性小型猪中的PK数据

平均血浆药代动力学参数(n＝3)

为了计算平均浓度，将低于定量下限的值设置为零。通过程序Phoenix WinNonlin6.4(Certara USA公司，新泽西州普林斯顿)，使用非房室模型和线性梯形内插计算来计算药代动力学参数。

如在血浆中测量的定量下限(LLOQ)。

Tmax：观察到的最大药物血浆浓度的时间

Cmax：观察到的最大血浆药物浓度

C0：初始血浆药物浓度

Tlast：最后可测量浓度的时间

AUClast：自给药时到最后可测量浓度的血浆药物浓度-时间曲线下面积

AUCinf：自给药时到最后可测量浓度并外推至无穷大的AUC

AUCextr：估计为(AUCinf–AUClast/AUCinf)的外推AUC

T1/2：消除时间

CL：血浆清除率

Vss：表观稳态分布容积

F(％)：估计为sc和iv施用之间的AUCinf比率的生物利用度

MRT：平均停留时间

表3在雄性食蟹猴中选择的scI-Fc变体的药代动力学参数

LLOQ＝血浆中50ng/mL

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Claims

1.一种具有两个胰岛素-Fc融合多肽的胰岛素-Fc缀合物，其中所述两个胰岛素-Fc融合多肽中的每一个从N末端至C末端包含：胰岛素和Fc区多肽，并且

其中所述两个胰岛素-Fc融合多肽通过在所述融合多肽的C末端处的至少两个共价键连接。

2.如权利要求1所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述至少两个共价键是二硫键。

3.如权利要求1或2所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述缀合物是所述两个胰岛素-Fc融合多肽的同源二聚体，和/或其中所述两个胰岛素-Fc融合多肽形成抗体Fc区。

4.如前述权利要求中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述胰岛素是单链胰岛素。

5.如前述权利要求中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述两个胰岛素-Fc融合多肽中的每一个从N末端至C末端包含：

a)胰岛素B链，

b)第一接头肽，

c)胰岛素A链，

d)第二接头肽，

e)Fc区多肽。

6.如权利要求5所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述两个胰岛素-Fc融合多肽中的每一个进一步包含

f)第三接头肽，

7.如权利要求6所述的胰岛素-Fc缀合物，其中g)下的所述C末端肽包含抗体铰链区的序列，所述抗体铰链区的序列包含允许在所述两个胰岛素-Fc融合多肽之间形成至少两个二硫键的至少两个半胱氨酸残基，例如其中所述抗体铰链区的序列包含如SEQ ID NO:36、39、40或41中所示的氨基酸序列或由其组成。

8.如前述权利要求中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述两个胰岛素-Fc融合多肽未通过每个Fc区多肽的N末端之间的一个或多个二硫键共价连接，和/或其中所述Fc区多肽在N末端处缺少抗体铰链区。

9.如前述权利要求中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述Fc区多肽包含IgG、IgM、IgA、IgD或IgE抗体的重链的恒定结构域，例如其中所述Fc区多肽包含IgG1抗体或IgG4抗体的抗体重链的恒定结构域CH2和CH3。

10.如前述权利要求中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，

其中所述第一接头肽的长度为1至50个氨基酸，如5至15个氨基酸，如5至10个氨基酸，如7个氨基酸，例如其中所述第一接头肽包含氨基酸序列GSYPGGV(SEQ ID NO:26)或EEYPGDV(SEQ ID NO:27)或由其组成，和/或

其中所述第二接头肽的长度为1至100个氨基酸，如5至40个氨基酸，例如其中所述第二接头肽是人胰岛素C肽或其片段，例如其中所述第二接头包含SEQ ID NO:28或29中所示的氨基酸序列或由其组成，

和/或

其中所述第三接头的长度为1至10个氨基酸，如长度为6个氨基酸，例如其中所述第三接头肽包含如GGGGSA(SEQ ID NO:42)中所示的氨基酸序列或由其组成。

11.如前述权利要求中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述胰岛素是与人胰岛素对人胰岛素受体的结合亲和力相比对所述人胰岛素受体的结合亲和力降低的胰岛素，

和/或其中所述胰岛素是表B中所示的胰岛素，如表B中所示的单链胰岛素，例如其中

i)所述胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPKT(SEQ ID NO:69)或由其组成，并且所述胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ ID NO:74)或由其组成；

ii)所述胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFAYTPKT(SEQ ID NO:70)或由其组成，并且所述胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ ID NO:74)或由其组成；

iii)所述胰岛素B链包含氨基酸序列FVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFHYTPKT(SEQ ID NO:71)或由其组成，并且所述胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLSQLEDYCG(SEQ ID NO:75)或由其组成；

iv)所述胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALELVCGERGFHYTPKT(SEQ ID NO:73)或由其组成，并且所述胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLSQLEDYCG(SEQ ID NO:75)或由其组成；

v)所述胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO:65)或由其组成，并且所述胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ ID NO:74)或由其组成；

vi)所述胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFAYTDKT(SEQ ID NO:66)或由其组成，并且所述胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ ID NO:74)或由其组成；或

vii)所述胰岛素B链包含氨基酸序列SFVNQHLCGSHLVEALHLVCGERGFAYTDKT(SEQ ID NO:67)或由其组成，并且其中所述胰岛素A链包含氨基酸序列GIVEQCCTSICSLEQLENYCG(SEQ IDNO:74)或由其组成。

12.如权利要求11所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述胰岛素是包含SEQ ID NO:50、SEQID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:81、或SEQ ID NO:82中所示的氨基酸序列的单链胰岛素。

13.如前述权利要求中任一项所述的胰岛素-Fc缀合物，其中所述两个胰岛素-Fc融合多肽中的每一个包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。

14.一种胰岛素，其是根据权利要求11或12中胰岛素的定义。

15.一种胰岛素-Fc融合多肽，其是根据权利要求1至14中任一项中胰岛素的定义。